WO2023037988A1 - 腎細胞の保管方法、輸送方法、腎細胞、薬物評価系及び細胞製品 - Google Patents

腎細胞の保管方法、輸送方法、腎細胞、薬物評価系及び細胞製品 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for storing renal cells and a method for transporting renal cells.
  • the invention further relates to cell products comprising renal cells.
  • kidney-related diseases eg, kidney cancer, hyperuricemia, etc.
  • a method for stably storing or transporting cells is required.
  • cells are plated two-dimensionally in flat-bottomed culture plates.
  • a temperature control device is required to maintain the container containing the cells at the culture temperature, and there is a problem that the cost of storing or transporting the cells is high.
  • the present inventors have found that if flat-cultured renal cells are maintained at a temperature lower than the culture temperature for a certain period of time, the cell morphology changes and the cell viability decreases. Therefore, based on the findings, the present invention aims to provide a method for storing or transporting renal cells having a high cell survival rate and maintaining physiological functions of the cells at a temperature lower than the culture temperature.
  • kidney cells can be maintained at a temperature lower than the culture temperature for a certain period of time by forming aggregates.
  • One embodiment of the present invention stores or transports renal cells, comprising a step of maintaining a liquid containing aggregates of renal cells at a temperature that is below the cell culture temperature and at which the liquid does not freeze. The method.
  • a liquid containing aggregates of renal cells is stored or transported by a method comprising a maintaining step of controlling a temperature that is below the culture temperature of the cells and does not freeze the liquid. , renal cells.
  • a method for storing or transporting renal cells that have a high cell survival rate and maintain renal physiological functions at a temperature lower than the culture temperature.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of a renal cell storage/transport system
  • FIG. 4 is a flow chart showing an example of the operation of the renal cell storage/transport system
  • FIGS. 3-1(a) to 3-1(c) are optical microscope images of proximal renal tubular epithelial cell aggregates at 37° C., room temperature, and refrigeration, respectively.
  • FIG. 3-2 shows the ATP amount (cell viability) of proximal renal tubular epithelial cell aggregates after 24 hours of standing.
  • Figures 3-3 (a) to (d) show the amount of ATP (cell viability) in proximal tubular epithelial cell aggregates 48 hours, 72 hours, 144 hours, and 240 hours after standing, respectively. is.
  • FIG. 4-1 shows the results of OAT1 gene expression analysis by real-time PCR of proximal renal tubular epithelial cell aggregates after standing at room temperature for 72 hours, in comparison with human renal cortex.
  • FIG. 4-2 shows the results of OCT2 gene expression analysis by real-time PCR of proximal renal tubular epithelial cell aggregates after standing at room temperature for 72 hours, in comparison with human renal cortex.
  • FIG. 4-3 shows the results of URAT1 gene expression analysis by real-time PCR of proximal renal tubular epithelial cell aggregates after standing at room temperature for 72 hours, in comparison with human renal cortex.
  • FIG. 4-1 shows the results of OAT1 gene expression analysis by real-time PCR of proximal renal tubular epithelial cell aggregates after standing at room temperature for 72 hours, in comparison with human renal cortex.
  • FIG. 4-2 shows the results of OCT2 gene expression analysis by real-time PCR of proximal renal tubular epithelial cell aggregates after standing at room temperature for 72
  • FIGS. 4-4 shows the results of OAT1 gene expression analysis by real-time PCR of proximal renal tubular epithelial cell aggregates 24 hours after refrigeration, in comparison with human renal cortex.
  • FIG. 4-5 shows the results of OCT2 gene expression analysis by real-time PCR of proximal tubular epithelial cell aggregates after 24 hours of refrigeration, in comparison with human renal cortex.
  • FIGS. 4-6 show the results of URAT1 gene expression analysis by real-time PCR of proximal renal tubular epithelial cell aggregates after 24 hours of refrigeration, in comparison with human renal cortex.
  • FIGS. 5-1(a) to 5-1(e) are optical microscope images of proximal renal tubular epithelial cell aggregates of 125, 500, 2000, 10000 and 40000 cells, respectively.
  • FIGS. 5-2 (a) to (e) show the amount of ATP (cell viability) in proximal renal tubular epithelial cell aggregates at 125, 500, 2000, 10000 and 40000 cells, respectively.
  • FIGS. 6-1(a) to 6-1(c) are optical microscope images of proximal renal tubular epithelial cells cultured on a plane at 37° C., room temperature, and refrigeration, respectively.
  • FIGS. 6-2(a) to 6-2(c) show the amount of ATP (cell viability) of plate cultured proximal tubular epithelial cells at 24, 48 and 72 hours, respectively.
  • FIGS. 7-1(a) to 7-1(c) are optical microscope images of human iPS cell aggregates at 37° C., normal temperature, and refrigerated conditions, respectively.
  • FIGS. 7-2(a) to (c) show the ATP amount (cell viability) of human iPS cell aggregates at 24, 48 and 72 hours, respectively.
  • a method for storing or transporting renal cells includes a maintaining step of controlling a liquid containing aggregates of renal cells to a temperature that is lower than the culture temperature of the cells and that the liquid does not freeze. including.
  • the renal cells used in the present invention can be cultured, regardless of their source. Renal cells are preferably derived from mammals, preferably from primates such as humans and monkeys. In addition, depending on the purpose, it may be derived from a normal kidney or a diseased kidney. Examples of renal cells include cells that constitute epithelium, cortex, proximal renal tubules, distal renal tubules, collecting ducts, glomeruli, and the like, specifically, proximal renal tubular epithelial cells (RPTEC), mesangial cells, and the like. is mentioned. The renal cells may be primary cells or renal cells derived from stem cells such as iPS cells or ES cells.
  • stem cells such as iPS cells or ES cells.
  • renal cells include immortalized renal cells, established cell lines (HK-2 cells, etc.), cells derived from other animal species (MDCK cells, LLC-PK1 cells, JTC-12 cells, etc.), specific transporters Forcible expression cells in which genes are introduced into renal cells in order to express such proteins may be used.
  • renal cells include, for example, human proximal tubular epithelial cells, human distal tubular epithelial cells and human collecting duct epithelial cells collected and isolated from the kidney, and human iPS cells or human ES cells. Differentiation-induced proximal tubular epithelial cells, distal tubular epithelial cells and collecting duct epithelial cells are exemplified.
  • Proximal tubular epithelial cells particularly proximal tubular epithelial cells derived from normal human kidney, are preferred for use in drug discovery research.
  • Cultivation of renal cells can be performed according to a conventional method, for example, under conditions of 37° C. and 5% CO 2 using a medium and a culture vessel suitable for the cells to be cultured.
  • the culture may be static culture, shaking culture, agitation culture, or the like.
  • Cultivation may be adherent culture, but culture is preferably performed in a non-adherent state (for example, suspension culture) for at least part of the period.
  • Renal cells can form aggregates by culturing them in a culture vessel in a non-adherent state.
  • Non-adhesive state refers to a state in which all or most of the cells are not adhered to the surface of the culture vessel, and a state in which all or most of the cells are separated from the surface of the culture vessel. It includes a state in which even if it is in contact with the surface, it can be easily separated from the surface of the culture vessel due to the coating of the culture vessel or the convection of the medium without using instruments or enzymes.
  • renal cell aggregates are formed within 24 hours after initiation of renal cell culture.
  • the period for culturing the renal cells in a non-adherent state to the culture vessel is generally desirably 120 hours or more. This makes it possible to obtain cultured renal cells in a state of higher expression of physiological functions. It is preferable to replace the medium periodically during the culture period. For example, medium is changed every two days.
  • any known medium can be used as appropriate.
  • a commercially available tubular cell culture medium can be used, and examples of preferred media include REGM (registered trademark) (LONZA), EpiCM (registered trademark) ( ScienceCell), Keratinocyte SFM (registered trademark) (Thermo Fisher Scientific).
  • the medium can be supplemented with collagen I (type I collagen).
  • Collagen I has the effect of adhering renal cells to each other. Therefore, culturing renal cells in a medium containing collagen I promotes the formation of aggregates.
  • Collagen I is preferably full-length collagen I, but may be ⁇ 1 chain or ⁇ 2 chain that constitutes collagen I, or collagen peptides obtained by fragmenting each chain.
  • the source of collagen I is not particularly limited, and may be human-derived or other animal-derived.
  • Any culture vessel can be used, but in order to promote the formation of aggregates, it should be treated with cell non-(low) adhesion or made of cell non-(low) adhesion material. preferably.
  • cell non-(low) adhesion treatment include cell non-adhesion hydrogel coating treatment on the container surface, MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) coating treatment, Proteosave (registered trademark) SS coating treatment, mirror polishing treatment, and the like. .
  • Cell non-(low) adhesion materials include glass, as well as low density polyethylene, medium density polyethylene, polyvinyl chloride, polyethylene-vinyl acetate copolymer, poly(ethylene-ethyl acrylate) copolymer, poly(ethylene-methacrylate) copolymer, Polymeric materials such as poly(ethylene vinyl acetate) copolymers and mixtures of two or more of these polymers are exemplified.
  • a high-density spheroid-producing plate or dish can be used to form a large amount of aggregates.
  • a culture vessel such as a spinner flask may be used.
  • ELPLASIA registered trademark
  • EZSPHERE registered trademark
  • These culture vessels include types such as 6-well plates, 24-well plates, 96-well plates, 384-well plates, and dishes of various sizes, and the number of aggregates that can be produced differs depending on the size of the bottom area of the vessel.
  • V-bottom 96-well plate
  • U-bottom 96-well plate
  • U-bottom 384-well plate
  • Aggregates produced using a high-density spheroid-producing plate or dish can be collected and subjected to floating shaking culture.
  • suspension shaking culture it is preferable to place a dish or plate treated with non-(low) cell adhesion on a shaker to culture aggregates.
  • a shaker a reciprocating shaker and an orbital shaker can be used.
  • a "aggregate" of cells refers to a massive aggregate of several or more cells. They are also called aggregates or spheroids.
  • the number of cells forming the aggregate is, for example, 5 or more, 25 or more, 50 or more, preferably 100 or more, more preferably 125 or more, further preferably 500 or more.
  • the number of cells forming the aggregate is, for example, 40000 or less, preferably 10000 or less, more preferably 2000 or less, 1000 or less. When the number of cells forming the aggregate is within such a range, there is little variation during the production of the aggregate, and the aggregates are difficult to join together, so the size of the aggregate tends to be uniform. Furthermore, the cells tend to maintain high viability.
  • the size of aggregates can be controlled by adjusting the number of cells seeded in the culture vessel. For example, when culturing in a multiwell plate, one aggregate is formed in one well. Therefore, when the number of renal cells seeded per well is 125 or more and 10000 or less, the number of renal cells forming the aggregate is 125 or more and 10000 or less.
  • the diameter of the aggregate is preferably 100 ⁇ m or more and 800 ⁇ m or less, for example.
  • the volume of the aggregate is preferably 0.001 mm 3 or more and 0.300 mm 3 or less, for example.
  • the diameter of the aggregate is defined as the maximum width of the aggregate. That is, the diameter of an agglomerate is the length of the largest straight line connecting two points on the outer edge of the agglomerate. Also, the volume of the aggregate can be calculated from the measured diameter, since the aggregate is approximately spherical.
  • the aggregate diameter can be measured, for example, using a photograph taken with a phase-contrast microscope. A BZ-X710 (Keyence) can be used as a phase-contrast microscope, and analysis software can be used to measure the diameter.
  • the liquid used for storing or transporting renal cells is not particularly limited as long as it does not adversely affect the cells.
  • Other liquids for example, physiological saline, buffer solution, etc.
  • This liquid may contain salts, buffers, serum, vitamins, amino acids, glucose (sugar), electrolytes, antibiotics, growth factors (compounds, proteins). If storage or transportation extends over 48 hours, it is preferable to change the liquid periodically. For example, the liquid is changed every two days.
  • any container can be used in the same manner as the culture container described above, but it may be treated with cell non-(low) adhesion treatment or cell non-( low) adhesive material.
  • One embodiment of the present invention is a method for storing or transporting renal cells, wherein, when storing or transporting renal cells, a liquid containing aggregates of renal cells is added at a temperature lower than the culture temperature of the renal cells, and A maintenance step of controlling the temperature at which the liquid does not freeze (hereinafter sometimes referred to as "maintenance temperature" for convenience) is included.
  • the optimum temperature that is lower than the culture temperature of the renal cells and that does not freeze the liquid can be appropriately selected according to the cell type, application, and/or the period required for storage or transportation.
  • the culture temperature is a temperature suitable for cell survival, and the cells may or may not proliferate. Since the cell culture temperature is typically 37° C., it is desirable that the maintenance temperature be lower than this. On the other hand, if the maintenance temperature is too low, partial freezing occurs in the cells, which may reduce the viability of the cells in the aggregates. Therefore, it is desirable that the maintenance temperature is 0° C. or higher.
  • the maintenance temperature can be, for example, 0° C. or more and less than 37° C. When maintenance at a relatively high temperature is desired, it is preferably 10° C.
  • the temperature range of 10° C. or more and less than 37° C. may be called “normal temperature”, and the temperature range of 0° C. or more and less than 10° C. may be called “refrigeration”.
  • an incubator, constant temperature room, refrigerator, etc. that can be adjusted to the desired temperature can be used in the maintenance process.
  • a heat-insulating container such as Styrofoam for the maintenance process.
  • the size of the heat-insulating container is not particularly limited as long as the container for storage and transportation can be packed.
  • a cushioning material is included to prevent movement of the storage and shipping container.
  • a paper container or a cardboard container can also be used as the heat insulating container.
  • the maintenance process does not necessarily have to be performed by standing still. Therefore, it can be carried out under conditions where there is enough vibration that the aggregates do not break, such as on a shaker or during transportation.
  • the number of aggregates in the liquid can be set to 1 to prevent aggregates from joining together and becoming uneven in size.
  • the lower limit of the volume ratio of the aggregates to the liquid is preferably 0.001% or more, 0.002% or more, or 0.003% or more.
  • the upper limit of the volume ratio of aggregates to liquid is preferably 0.800% or less, 0.500% or less, or 0.200% or less.
  • the lower limit of the specific gravity of aggregates to liquid is preferably 1.00 or more.
  • the upper limit of the specific gravity of the aggregate is preferably 1.20 or less, 1.15 or less, or 1.10 or less.
  • the maintenance period of the maintenance step is the period during which the cell viability of the renal cell aggregate reaches a predetermined value or higher.
  • the cell viability is the ratio of the number of viable cells at the maintenance temperature to the number of viable cells at the culture temperature of kidney cells. Cell viability is preferably 80% or higher, more preferably 90% or higher. Kidney cells with such cell viability can be used for drug evaluation.
  • the maintainable period during which the cell viability can be maintained at a predetermined value or higher is calculated by the following formula.
  • (Maintainable period (days)) A / ⁇ (culture temperature (°C)) - (maintenance temperature (°C)) ⁇ A: coefficient determined according to the predetermined value and the number of cells of the aggregate (days/°C) From the above formula, the upper limit of the maintenance period can be calculated according to the desired maintenance temperature and cell viability.
  • the maintainable temperature at which the cell viability can be maintained at a predetermined value or higher is calculated from the following formula.
  • (maintenance period (days)) A/ ⁇ (culture temperature (°C)) - (sustainable temperature (°C)) ⁇ A: coefficient determined according to the predetermined value and the number of cells of the aggregate (days/°C) From the above formula, the lower limit of the maintenance temperature can be calculated according to the desired maintenance period and cell viability.
  • the value of A when the predetermined value is 90% and the number of cells in the aggregate is 1000, the value of A can be 34.5, the predetermined value is 80%, and the aggregate When the number of cells in is 1000, the value of A can be 69.
  • the maintainable period is 5.75 days when the predetermined value is 80%, and 5.75 days when the predetermined value is 80%. is 2.88 days when is 90%. That is, when the culture temperature is 37°C and the maintenance temperature is 25°C, the maintenance period is preferably 5.75 days or less, more preferably 2.88 days or less.
  • a renal cell which is one embodiment of the present invention, has higher renal physiological functions or is functionally equivalent to human renal cortex.
  • “Functionally equivalent compared to human renal cortex” indicates at least a level of expression equivalent to human renal cortex with respect to expression of one or more genes related to renal physiology that are expressed in human renal cortex.
  • AQP1 aquaporin 1
  • CD13 alanyl aminopeptidase
  • SGLT2 sodium glucose cotransporter 2
  • Na/K ATPase is a gene that encodes a protein involved in ion transport.
  • URAT1 (urate transporter 1) is a gene encoding a protein involved in reabsorption of uric acid.
  • PEPT1 peptide transporter 1 is a gene that encodes a protein involved in peptide transport.
  • MDR1 multiple drug resistance 1
  • OAT1 organic anion transporter 1
  • OCT2 organic cation transporter 2
  • OCTN2 organic cation transporter novel 2
  • E-cadherin and ZO-1 (zonula occludens-1) are genes encoding proteins involved in intercellular junctions.
  • the expression level of one or more of these genes can be measured by a general real-time PCR method (qPCR method) for expression levels in human renal cortex and kidney cell culture, and whether the two are equivalent or not can be determined. can be determined by comparing In addition, when using for determination, the measured value of two or more experiments is averaged and used.
  • qPCR method general real-time PCR method
  • renal cells stored or transported for a predetermined period of time are functionally equivalent to human renal cortex when the expression level of any of the above genes is 10% or more of the expression level of the gene in human renal cortex. It is determined that there is A kidney cell culture that is functionally equivalent to human renal cortex preferably has an expression level of the above one gene that is 10% or more, more preferably 25% or more, of the expression level in human renal cortex.
  • the expression levels of the above two or more genes are preferably 10% or more, more preferably 25% or more, of the expression levels in human renal cortex.
  • a kidney cell which is one embodiment of the present invention, can be provided as a drug evaluation system or cell product.
  • Drug evaluation systems include, for example, pharmacokinetics in renal cells and nephrotoxicity evaluation systems.
  • renal cells can be used for mechanism analysis of kidney-related diseases such as kidney cancer and hyperuricemia, and as a therapeutic drug discovery tool.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of a renal cell storage system 10 according to an embodiment.
  • renal cell storage system 10 includes renal cell storage device 20 and temperature control device 30 .
  • the kidney cell storage device 20 is a storage that can maintain the temperature inside the storage at a predetermined temperature, and is, for example, an incubator, a constant temperature room, a refrigerator, or the like.
  • a culture container 22 is stored in the storage of the renal cell storage device 20 .
  • Culture vessel 22 contains liquid 24 and kidney cell aggregates 26 .
  • the temperature of the liquid 24 in the culture vessel 22 can be regarded as the predetermined maintenance temperature.
  • the temperature management device 30 includes a storage information input unit 40, a temperature management unit 50, a maintenance period calculation unit 60, and a display unit 70. Note that the temperature control device 30 can be built in the renal cell storage device 20 .
  • the storage information input unit 40 stores information on the liquid 24 in the culture container 22, information on the culture temperature of the kidney cells, information on the maintenance temperature of the liquid 24, information on the storage period (maintenance period) of the kidney cells, and information on the cell viability.
  • Information such as information regarding the number of cells in the aggregate, may be entered by the user.
  • Information regarding the components and concentration (or content) of the liquid 24 in which the aggregates 26 are stored may be input to the storage information input unit 40 . For example, if the liquid is physiological saline, "sodium chloride" is entered as the component, and the concentration of "sodium chloride” is entered. Also, the temperature at which the liquid 24 freezes may be input to the storage information input unit 40 .
  • the temperature management section 50 has a maintenance temperature setting section 52 and a temperature control section 54 .
  • the maintenance temperature setting unit 52 sets the maintenance temperature in the renal cell storage device 20, that is, the maintenance temperature of the liquid 24 in the culture container 22, to be lower than the renal cell culture temperature input to the storage information input unit 40, and The temperature is set so that the liquid 24 does not freeze.
  • the temperature at which the liquid 24 does not freeze may be a temperature higher than the temperature at which the liquid 24 freezes, which is input to the storage information input unit 40, or may be calculated from the components and concentration of the liquid 24 in consideration of the freezing point depression.
  • the maintenance temperature may be set by the user through the storage information input unit 40, or may be determined according to the desired cell viability, the number of aggregate cells, the maintenance period, and the like.
  • the maintenance temperature is set to be equal to or higher than the maintainable temperature calculated by the following formula.
  • the lower limit of the maintenance temperature is determined according to the maintenance period during which the renal cells are stored.
  • (maintenance period (days)) A/ ⁇ (culture temperature (°C)) - (sustainable temperature (°C)) ⁇ A: coefficient determined according to the predetermined value and the number of cells of the aggregate (days/°C)
  • the maintainable temperature is the temperature at which the cell viability, which is the ratio of the number of viable cells at the maintenance temperature to the number of viable kidney cells at the culture temperature, can be maintained at a predetermined value or higher.
  • the temperature control unit 54 controls the temperature inside the renal cell storage device 20 so as to achieve the maintenance temperature set by the maintenance temperature setting unit 52 .
  • the temperature control unit 54 and the temperature management device 30 are communicably connected wirelessly or by wire, and the temperature control unit 54 transmits information on the maintenance temperature to the temperature management device 30 .
  • the renal cell storage device 20 that receives the information about the maintenance temperature performs temperature control so that the temperature inside the refrigerator reaches the maintenance temperature.
  • the temperature control in the renal cell storage device 20 may be started after the culture container 22 is stored in the renal cell storage device 20, but before the culture container 22 is stored in the renal cell storage device 20, Temperature control within renal cell storage device 20 may be initiated.
  • the maintenance period calculator 60 optionally sets the maintenance period during which the renal cell storage device 20 maintains the temperature of the liquid at the maintenance temperature to be less than the maintainable period (days) calculated by the following formula.
  • the upper limit of the maintenance period is determined according to the maintenance temperature.
  • (Maintainable period (days)) A / ⁇ (culture temperature (°C)) - (maintenance temperature (°C)) ⁇ A: coefficient determined according to the predetermined value and the number of cells of the aggregate (days/°C)
  • the maintainable period (days) is the period during which the cell viability, which is the ratio of the number of viable cells at the maintenance temperature to the number of viable cells at the renal cell culture temperature, can be maintained at a predetermined value or higher.
  • the display unit 70 displays necessary information on a display (not shown).
  • the information displayed by the display unit 70 includes the maintenance period (maintenance (storage) start date and time and maintenance (storage) end date and time) calculated by the maintenance period calculation unit 60, the maintenance temperature set by the maintenance temperature setting unit 52, and the like. is mentioned.
  • the kidney cell storage system 10 can be installed in transportation means such as trucks, freight cars, and ships.
  • renal cell storage system 10 can be read as renal cell transport system 10 .
  • FIG. 2 is a flow chart showing an example of the operation of the renal cell storage system 10.
  • the maintenance temperature is set according to the maintenance period of renal cells.
  • the user inputs information regarding the storage of renal cells to the storage information input unit 40 .
  • the renal cell maintenance period, renal cell culture temperature, and liquid freezing temperature are input (S10).
  • the maintenance temperature of the liquid 24 is set by the maintenance temperature setting unit 52 according to the setting method described above (S20). Note that the maintenance temperature must be lower than the renal cell culture temperature and lower than the freezing temperature of the liquid 24 .
  • the temperature control unit 54 controls the temperature in the renal cell storage device 20, that is, the temperature of the liquid 24 to the maintenance temperature.
  • the renal cell storage or transportation system includes a cell storage device that stores a liquid and a culture vessel containing aggregates of renal cells, and is capable of maintaining the temperature of the liquid at a predetermined temperature; a temperature control device that maintains the temperature of the liquid maintained by the cell storage device to a maintenance temperature that is lower than the kidney cell culture temperature and does not freeze the liquid; Prepare.
  • the lower limit of the maintenance temperature may be determined according to the maintenance period during which the renal cells are stored.
  • a renal cell storage or transport system which is another aspect of the present invention, is a cell storage device that stores a liquid and a culture vessel containing aggregates of renal cells, and is capable of maintaining the temperature of the liquid at a predetermined temperature. and, a temperature control device that maintains the temperature of the liquid maintained by the cell storage device to a maintenance temperature that is lower than the kidney cell culture temperature and does not freeze the liquid; and an upper limit value of the maintenance period may be determined according to the maintenance temperature.
  • the upper limit of the maintenance period can be calculated according to the maintenance temperature of the renal cells, or the lower limit of the maintenance temperature can be calculated according to the maintenance period. That is, one embodiment of the present invention can be used as a renal cell storage/transport system for managing maintenance temperature and maintenance period.
  • the plate containing the aggregate-containing culture medium was left at room temperature or under refrigerated conditions, or left at rest in an incubator at 37° C. under 5% CO 2 conditions.
  • normal temperature conditions specifically, the plate was placed in a styrene foam container and allowed to stand indoors (air conditioning set temperature: 25° C.).
  • refrigerating condition specifically, the plate was allowed to stand in a refrigerator (set temperature: 4°C).
  • the number of viable cells in aggregates was measured using CellTiter-Glo (registered trademark) 3D Cell Viability Assay (Promega), which measures the amount of ATP by a luminescence method.
  • aggregates were collected together with the medium, and CellTiter-Glo 3D Reagent was added in an amount equal to the volume of the medium. This mixture was incubated for 30 minutes at room temperature. After mixing well, the luminescence value was measured with a microplate reader (Perkin Elmer).
  • Fig. 3-1 shows the morphology of aggregates under each temperature condition ⁇ (a) 37°C condition; (b) room temperature condition; (c) refrigeration condition ⁇ .
  • ATP measurement after standing for 24 hours are shown in FIG. 3-2.
  • the ATP amount of the aggregates under each temperature condition is calculated according to the above 1-1. was measured in the same manner as
  • Figure 3-3 ⁇ (a) 48 hours; (b) 72 hours; (c) 144 hours (6 days); ( d) 240 hours (10 days) ⁇ .
  • Table 1 shows the cell viability (the ratio of the number of viable cells at each temperature condition to the number of viable cells at the culture temperature) at this time.
  • the numbers in parentheses represent the difference from 100% of each cell viability.
  • renal cell aggregates could be maintained at a temperature lower than the culture temperature for 24 hours or more.
  • aggregates can be stably maintained for a long period of time at a temperature (normal temperature) that is less different from the culture temperature than at a lower temperature (refrigeration).
  • human renal cortex collected from human patient donors was used to extract RNA in the same manner as above, and the gene expression levels of OAT1, OCT2, or URAT1 were measured.
  • the OAT1 gene expression level results are shown in Figure 4-1, the OCT2 gene expression level results are shown in Figure 4-2, and the URAT1 gene expression level results are shown in Figure 4-3.
  • Table 2-1 shows the culture temperature conditions at room temperature and the expression comparison with human renal cortex.
  • the OAT1 gene expression level results are shown in Figure 4-4, the OCT2 gene expression level results are shown in Figure 4-5, and the URAT1 gene expression level results are shown in Figure 4-6.
  • Table 2-2 shows culture temperature conditions under refrigeration conditions and expression comparison with human renal cortex.
  • the plate containing the aggregate-containing culture medium was left at room temperature or under refrigerated conditions, or left at rest in an incubator at 37° C. under 5% CO 2 conditions.
  • the appearance of aggregates after culture under each temperature condition was observed with an optical microscope.
  • the ATP amount of the aggregates was measured under each temperature condition after a predetermined time had elapsed from the start of standing.
  • Fig. 5-1 shows the morphology of aggregates for each cell number ⁇ (a) 125; (b) 500; (c) 2000; (d) 10000; (e) 40000 ⁇ .
  • results of time-course measurement of the ATP amount of aggregates in each cell number ⁇ (a) 125; (b) 500; (c) 2000; (d) 10000; (e) 40000 ⁇ are shown in 2.
  • proximal renal tubular epithelial cells When the number of viable aggregates of proximal renal tubular epithelial cells is 125 to 10,000, there is a significant difference between normal temperature or refrigeration conditions and culture temperature conditions during any maintenance period. I could't. From this, it was confirmed that when the number of cells in the aggregate was 125 to 10,000, survival could be maintained even after standing for 72 hours. On the other hand, when the number of cells was 40,000, a decrease in the number of viable cells was confirmed under refrigeration conditions for 48 hours after standing.
  • Table 3-1 shows the cell viability in aggregates of each cell number at this time.
  • the numbers in parentheses represent the difference from the cell survival rate (100%) at 37°C under each condition.
  • the maintenance period of 80% or more cell viability at the maintenance temperature of 25 ° C. is 144 hours (that is, 6 days).
  • the maintainable temperature at which the cell viability can be maintained at a predetermined value or higher is calculated from the following formula.
  • (maintenance period (days)) A/ ⁇ (culture temperature (°C)) - (sustainable temperature (°C)) ⁇ A: A coefficient determined according to the predetermined value and the number of cells in the aggregate (days/°C) From the above formula, the lower limit of the maintenance temperature can be calculated according to the desired maintenance period and cell viability.
  • Table 3-2 shows the diameter and volume of proximal renal tubular epithelial cell aggregates for each cell count, as well as the volume ratio and specific gravity to the medium.
  • the plate containing the culture solution containing the plate-cultured cells was allowed to stand at room temperature or under refrigerated conditions, or left at rest in an incubator at 37° C. under 5% CO 2 conditions. After standing for 24 hours, the planar cultured cells under each temperature condition were observed with an optical microscope.
  • Fig. 6-1 shows the morphology of planar cultured cells under each temperature condition ⁇ (a) 37°C condition; (b) room temperature condition; (c) refrigeration condition ⁇ . It was confirmed that, in the plate cultured proximal tubular epithelial cells, the spaces between the cells increased under normal temperature and refrigeration conditions, and the morphology of the cells changed. It was confirmed that the cell morphology of the proximal renal tubular epithelial cells was changed by lowering the culture temperature in the case of planar culture.
  • FIG. 6-2 shows the results of measuring the amount of ATP in aggregates under each temperature condition at each elapsed time ⁇ (a) 24 hours; (b) 48 hours; (c) 72 hours ⁇ .
  • Human iPS cells (strain 201B7) were used. Human iPS cells were thawed by taking out a frozen vial stored in a liquid nitrogen storage device and immersing it in a constant temperature bath at 37°C. After thawing, the cell suspension in the frozen vial was mixed with the recommended medium ⁇ StemFit®, Ajinomoto Co. ⁇ and cultured in a culture dish. The cells were cultured under conditions of 37° C. and 5% CO 2 while changing the medium once a day.
  • Cells were harvested prior to confluence and seeded into low cell adhesion treated 96-well V-bottom plates ⁇ PrimeSurface® Plate 96V, Sumitomo Bakelite ⁇ at 1000 cells per well. and cultured to form aggregates. The aggregates were cultured while exchanging the medium once every two days.
  • the plate containing the aggregate-containing culture medium was left at room temperature or under refrigerated conditions, or left at rest in an incubator at 37° C. under 5% CO 2 conditions. After standing for 24 hours, the state of the cells under each temperature condition was observed with an optical microscope.
  • the ATP amount of the aggregates was measured under each temperature condition after a predetermined time had elapsed from the start of standing.
  • Fig. 7-1 shows the morphology of human iPS cell aggregates under each temperature condition ⁇ (a) 37°C condition; (b) room temperature condition; (c) refrigeration condition ⁇ .
  • the results of measuring the amount of ATP in human iPS cell aggregates under each temperature condition at each elapsed time ⁇ (a) 24 hours; (b) 48 hours; (c) 72 hours ⁇ are shown in FIG. 7-2.
  • the liquid containing aggregates of renal cells in a method for storing or transporting renal cells, is maintained at a temperature lower than the culture temperature of the renal cells, and the liquid is frozen. It is a method including a maintenance step of controlling the temperature to a temperature that does not occur. As a result, it is possible to store or transport renal cells that have a high cell survival rate and that maintain the physiological functions of the kidney at a temperature lower than the culture temperature.
  • a second embodiment of the present invention is a method according to the first embodiment, wherein the maintaining temperature is 0°C or higher and lower than 37°C. This reinforces the effect that the cells exhibit high cell viability.
  • a third embodiment of the present invention is a method according to the first or second embodiment, wherein the number of cells in one aggregate is 125 or more and 10000 or less. This reinforces the effect that the aggregate size is uniform and the cells exhibit high cell viability.
  • a fourth embodiment of the present invention is a method according to any one of the first to third embodiments, wherein the aggregate has a diameter of 100 ⁇ m or more and 800 ⁇ m or less. This reinforces the effect that the aggregate size is uniform and the cells exhibit high cell viability.
  • a fifth aspect of the present invention is the method according to any one of the first to fourth aspects, wherein the aggregate has a volume of 0.001 mm 3 or more and 0.300 mm 3 or less. This reinforces the effect that the aggregate size is uniform and the cells exhibit high cell viability.
  • a sixth embodiment of the present invention is the method according to the first to fifth embodiments, wherein the number of aggregates in the liquid is one. As a result, there is an effect of reducing the risk of the aggregates joining together to make the sizes non-uniform.
  • a seventh embodiment of the present invention is the method according to the first to sixth embodiments, wherein the volume ratio of the aggregate to the liquid is 0.001% or more and 0.200% or less.
  • An eighth embodiment of the present invention is the method according to any one of the first to seventh embodiments, wherein the specific gravity of the aggregate with respect to the liquid is 1.00 or more and 1.20 or less. This has the effect of making the aggregates less susceptible to changes in the extracellular environment.
  • a ninth embodiment of the present invention is a method according to any one of the first to eighth embodiments, wherein the kidney cells are proximal renal tubular epithelial cells.
  • a tenth embodiment of the present invention is, in any of the first to ninth embodiments, the maintenance period of the maintenance step further comprises: is equal to or shorter than the maintainable period in which the cell viability, which is the ratio of , is maintained at a predetermined value or higher, and the maintainable period is calculated from the following formula.
  • (Maintainable period (days)) A / ⁇ (culture temperature (°C)) - (maintenance temperature (°C)) ⁇ A: coefficient determined according to the predetermined value and the number of cells of the aggregate (days/°C)
  • the upper limit of the maintenance period can be calculated according to the desired maintenance temperature and cell viability.
  • the maintenance temperature is a ratio of the number of viable cells at the maintenance temperature to the number of viable cells at the culture temperature of the kidney cells. This is a method in which a certain cell viability is equal to or higher than a maintainable temperature at which a cell survival rate can be maintained at a predetermined value or higher, and the maintainable temperature is calculated from the following formula.
  • (maintenance period (days)) A/ ⁇ (culture temperature (°C)) - (sustainable temperature (°C)) ⁇ A: coefficient determined according to the predetermined value and the number of cells of the aggregate (days/°C) As a result, it is possible to calculate the lower limit of the maintenance temperature according to the desired maintenance period and cell viability.
  • a twelfth embodiment of the present invention is the tenth or eleventh embodiment, wherein when the predetermined value is 90% and the number of cells in the aggregate is 1000, the value of A is 34.5 is the method.
  • the number of cells in the aggregate is 1000, it is possible to calculate the maintainable period at the desired maintenance temperature and the maintainable temperature at the desired maintenance period so that the cell survival rate is 90% or more.
  • a thirteenth embodiment of the present invention is the tenth or eleventh embodiment, wherein the value of A is 69 when the predetermined value is 80% and the number of cells in the aggregate is 1000.
  • the method As a result, when the number of cells in the aggregate is 1000, it is possible to calculate the maintainable period at the desired maintenance temperature and the maintainable temperature at the desired maintenance period for which the cell survival rate is 80% or more.
  • a fourteenth embodiment of the present invention is renal cells obtained according to the first to thirteenth embodiments. As a result, there is an effect that renal cells with a high cell survival rate and maintaining the physiological function of the kidney can be obtained.
  • a fifteenth embodiment of the present invention is a drug evaluation system containing renal cells obtained according to the fourteenth embodiment. As a result, there is an effect that a pharmacokinetics in renal cells and a drug evaluation system that can be used for drug discovery research on renal diseases can be obtained.
  • a sixteenth embodiment of the present invention is a cell product containing renal cells obtained according to the fifteenth embodiment. As a result, there is an effect that a cell product that can be used for pharmacokinetics in renal cells and drug discovery research on renal diseases can be obtained.
  • the present invention can be used for storing and transporting renal cell aggregates that can be used in drug evaluation systems.
  • kidney cell storage system 10 kidney cell storage system, 20 kidney cell storage device, 22 culture vessel, 24 liquid, 26 aggregate, 30 temperature control device, 40 storage information input unit, 50 temperature control unit, 52 maintenance temperature setting unit, 54 temperature control unit, 60 maintenance period calculation unit, 70 display unit

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Abstract

薬物評価系として利用し得る、細胞生存率が高く、腎臓の生理機能を維持されている腎細胞を、培養温度より低い温度で保管又は輸送する方法を提供する。本発明のある態様は、腎細胞を保管又は輸送する方法において、前記腎細胞の凝集体を含む液体を、維持温度として、前記腎細胞の培養温度未満であり、且つ前記液体が凍結しない温度に管理する維持工程を含む。

Description

腎細胞の保管方法、輸送方法、腎細胞、薬物評価系及び細胞製品
　本発明は、腎細胞の保管方法、腎細胞の輸送方法に関する。本発明は、さらに、腎細胞を含む細胞製品にも関する。
　生体に投与された薬剤は、生体内に吸収された後、腎臓において近位尿細管で血液から尿中に排出される。そのため、薬剤の腎毒性によりしばしば腎障害が引き起こされる。創薬研究においては、薬剤の作用を明らかにするために腎臓での薬物動態を調べることは非常に重要である。このことから、腎細胞を用いた薬物動態や毒性を評価可能な創薬支援デバイスの開発が望まれている。また、このような創薬支援デバイスは、腎臓に関する疾患（例えば、腎臓がん、高尿酸血症等）の治療薬開発にも有用である。
　このような細胞を用いた創薬支援デバイスを供給又は利用する際には、細胞を安定的に保管又は輸送する方法が必要となる。一般的に、細胞は平底培養プレートにおいて二次元的に平面培養する。従来、正常な細胞状態を維持するためには、細胞の入った容器を培養温度に維持する温度管理装置が必要となり、細胞の保管又は輸送のコストが高額になってしまうという課題があった。
特開２０１５－５０９９２号公報
　本発明者は、腎細胞の平面培養細胞を、一定期間、培養温度より低い温度で維持すると、細胞の形態が変化してしまい、細胞生存率が低下してしまう旨の知見を得た。そこで本発明は、該知見を踏まえ、細胞生存率が高く、且つ、細胞の生理機能が維持されている腎細胞を、培養温度より低い温度で保管又は輸送する方法の提供を目的とする。
　上記課題を解決するために種々検討を行った結果、腎細胞において、凝集体を形成させることで、一定期間、培養温度より低い温度で維持することができることを見出した。
　本発明に係る一実施態様は、腎細胞の凝集体を含む液体を、前記細胞の培養温度未満であり、且つ前記液体が凍結しない温度に管理する維持工程を含む、腎細胞を保管又は輸送する方法である。
　本発明に係る一実施態様は、腎細胞の凝集体を含む液体を、前記細胞の培養温度未満であり、且つ前記液体が凍結しない温度に管理する維持工程を含む方法で、保管又は輸送された、腎細胞である。
　本発明によれば、細胞生存率が高く、腎臓の生理機能を維持されている腎細胞を、培養温度より低い温度で保管又は輸送する方法が提供される。
腎細胞保管・輸送システムの概略構成を示すブロック図である。 腎細胞保管・輸送システムの動作の一例を示すフローチャートである。 図３－１（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、３７℃条件、常温条件、冷蔵条件における、近位尿細管上皮細胞凝集体の光学顕微鏡像である。 図３－２は、静置２４時間後における近位尿細管上皮細胞凝集体のＡＴＰ量（細胞生存率）である。 図３－３（ａ）～（ｄ）は、それぞれ、静置４８時間後、７２時間後、１４４時間後、２４０時間後における、近位尿細管上皮細胞凝集体のＡＴＰ量（細胞生存率）である。 図４－１は、常温静置７２時間後における近位尿細管上皮細胞凝集体のリアルタイムＰＣＲ法によるＯＡＴ１遺伝子発現解析の結果を、ヒト腎皮質と比較して示す。 図４－２は、常温静置７２時間後における近位尿細管上皮細胞凝集体のリアルタイムＰＣＲ法によるＯＣＴ２遺伝子発現解析の結果を、ヒト腎皮質と比較して示す。 図４－３は、常温静置７２時間後における近位尿細管上皮細胞凝集体のリアルタイムＰＣＲ法によるＵＲＡＴ１遺伝子発現解析の結果を、ヒト腎皮質と比較して示す。 図４－４は、冷蔵静置２４時間後における近位尿細管上皮細胞凝集体のリアルタイムＰＣＲ法によるＯＡＴ１遺伝子発現解析の結果を、ヒト腎皮質と比較して示す。 図４－５は、冷蔵静置２４時間後における近位尿細管上皮細胞凝集体のリアルタイムＰＣＲ法によるＯＣＴ２遺伝子発現解析の結果を、ヒト腎皮質と比較して示す。 図４－６は、冷蔵静置２４時間後における近位尿細管上皮細胞凝集体のリアルタイムＰＣＲ法によるＵＲＡＴ１遺伝子発現解析の結果を、ヒト腎皮質と比較して示す。 図５－１（ａ）～（ｅ）は、それぞれ、細胞数１２５個、５００個、２０００個、１００００個、４００００個における、近位尿細管上皮細胞凝集体の光学顕微鏡像である。 図５－２（ａ）～（ｅ）は、それぞれ、細胞数１２５個、５００個、２０００個、１００００個、４００００個における、近位尿細管上皮細胞凝集体のＡＴＰ量（細胞生存率）である。 図６－１（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、３７℃条件、常温条件、冷蔵条件における、平面培養した近位尿細管上皮細胞の光学顕微鏡像である。 図６－２（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、経過時間２４時間、４８時間、７２時間における、平面培養した近位尿細管上皮細胞のＡＴＰ量（細胞生存率）である。 図７－１（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、３７℃条件、常温条件、冷蔵条件における、ヒトｉＰＳ細胞凝集体の光学顕微鏡像である。 図７－２（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、経過時間２４時間、４８時間、７２時間における、ヒトｉＰＳ細胞凝集体のＡＴＰ量（細胞生存率）である。
　以下、本発明について詳述する。
　本発明に係る一実施態様の腎細胞を保管又は輸送する方法は、前記腎細胞の凝集体を含む液体を、前記細胞の培養温度未満であり、且つ前記液体が凍結しない温度に管理する維持工程を含む。
　本発明において使用される腎細胞は、培養可能であればよく、その供給源を問わない。腎細胞は、哺乳類由来であることが好ましく、ヒト、サルなどの霊長類由来であることが好ましい。また、目的に応じて、正常腎臓由来であってもよく、疾患を有する腎臓由来であってもよい。腎細胞としては、例えば、上皮、皮質、近位尿細管、遠位尿細管、集合管、糸球体などを構成する細胞、具体的には、近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）、メサンギウム細胞などが挙げられる。腎細胞は、初代細胞でもよく、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞などの幹細胞由来の腎細胞でもよい。また、腎細胞は、不死化された腎細胞、株化細胞（ＨＫ－２細胞など）、他動物種由来の細胞（ＭＤＣＫ細胞、ＬＬＣ－ＰＫ１細胞、ＪＴＣ－１２細胞など）、特定のトランスポーター等のタンパク質を発現させるために腎細胞に遺伝子導入した強制発現細胞であってもよい。より具体的には、腎細胞としては、例えば腎臓から採取、単離したヒト近位尿細管上皮細胞、ヒト遠位尿細管上皮細胞及びヒト集合管上皮細胞ならびに、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞から分化誘導された近位尿細管上皮細胞、遠位尿細管上皮細胞及び集合管上皮細胞が例示される。創薬研究に使用するためには、近位尿細管上皮細胞、特に、ヒト正常腎由来の近位尿細管上皮細胞が好ましい。
　腎細胞の培養は、培養しようとする細胞に適した培地及び培養容器を用いることにより、常法に従って、例えば３７℃、５％ＣＯ２条件下で、行うことができる。培養は、静置培養、振盪培養又は撹拌培養などのいずれであってもよい。培養は、接着培養であってもよいが、少なくとも一部の期間は非接着の状態で培養を行うこと（例えば浮遊培養）が好ましい。腎細胞は、培養容器に非接着の状態で培養することによって凝集体を形成させることができる。「非接着（の）状態」とは、全て又は大部分の細胞が培養容器表面に接着していない状態を指し、全て又は大部分の細胞が培養容器表面から離れて存在する状態、及び培養容器表面に接触している場合でも、器具もしくは酵素などを用いずに培養容器のコーティングや培地の対流などにより培養容器表面から容易に離れ得る状態を含む。
　例えば、ある場合には、腎細胞の凝集体は、腎細胞の培養開始後２４時間以内に形成される。そして、一部の期間は凝集体の状態で腎細胞を培養することで、脱分化して低下した腎細胞の生理機能を回復させることができる。腎細胞を培養容器に非接着の状態で培養する期間は、一般に１２０時間以上が望ましい。これにより、生理機能のより高い発現状態にある培養された腎細胞を得ることができる。培養期間中、培地は定期的に交換することが好ましい。例えば、培地は２日毎に交換される。
　培地としては、公知の任意のものを適宜使用することができる。例えば、近位尿細管上皮細胞の培養の場合、市販の尿細管細胞培養培地を使用することができ、好ましい培地の例としては、ＲＥＧＭ（登録商標）（ＬＯＮＺＡ社）、ＥｐｉＣＭ（登録商標）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）、ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＳＦＭ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）が挙げられる。
　また、細胞培養に有用な従来公知の材料及び添加剤を適宜使用することができる。例えば、培地には、コラーゲンＩ（Ｉ型コラーゲン）を添加することができる。コラーゲンＩは、腎細胞同士を接着させる作用を有する。そのため、コラーゲンＩを含む培地で腎細胞を培養することにより、凝集体の形成が促進される。コラーゲンＩは、完全長のコラーゲンＩであることが好ましいが、コラーゲンＩを構成するα１鎖又はα２鎖、さらには各鎖を断片化したコラーゲンペプチドなどであってもよい。また、コラーゲンＩの供給源は特に限定されず、ヒト由来であっても、他の動物由来であってもよい。
　培養容器は、任意のものを使用することができるが、凝集体の形成を促進するためには、細胞非（低）接着処理が施されているか、細胞非（低）接着材料で構成されていることが好ましい。細胞非（低）接着処理としては、容器表面への細胞非接着ハイドロゲルコーティング処理、ＭＰＣ（2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine)コーティング処理、プロテオセーブ（登録商標）ＳＳコーティング処理、鏡面研磨処理などが例示される。細胞非（低）接着材料としては、ガラス、ならびに、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン－ビニルアセテートコポリマー、ポリ（エチレン－エチルアクリレート）コポリマー、ポリ（エチレン－メタアクリレート）コポリマー、ポリ（エチレン酢酸ビニル）コポリマー、及びこれらのポリマーの２種以上の混合物といった高分子材料が例示される。
　凝集体を大量に形成させる場合は、高密度スフェロイド作製プレート又はディッシュを使用することができる。さらには、必要に応じてスピナーフラスコなどの培養容器を用いてもよい。例えば、ＥＬＰＬＡＳＩＡ（登録商標）シリーズの培養容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）シリーズの培養容器（ＡＧＣテクノグラス社）などを使用することが好ましい。これらの培養容器は、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、種々のサイズのディッシュなどのタイプがあり、容器の底面積の大きさにより作製できる凝集体の数が異なる。例えば、低接着処理を施された９６ウェルプレート（Ｖ底）、９６ウェルプレート（Ｕ底）、３８４ウェルプレート（Ｕ底）を用いる場合、１ウェルに１つの凝集体が形成される。
　高密度スフェロイド作製プレート又はディッシュなどを使用して作製した凝集体は、回収して浮遊振盪培養することができる。浮遊振盪培養する場合は、細胞非（低）接着処理が施されたディッシュ又はプレートなどをシェーカー上に設置して凝集体を培養することが好ましい。シェーカーとしては、往復型シェーカー及び旋回型シェーカーを使用することができる。
　本明細書において、細胞の「凝集体」は、数個以上の細胞の塊状の集合体を指す。凝集塊、スフェロイドともいう。凝集体を構成する細胞の数は、例えば５個以上、２５個以上、５０個以上、好ましくは１００個以上、より好ましくは１２５個以上、さらに好ましくは５００個以上である。凝集体を構成する細胞の数は、例えば、４００００個以下、好ましくは１００００個以下、より好ましくは２０００個以下、１０００個以下である。凝集体を構成する細胞数がこのような範囲だと、凝集体作製時のバラつきが少なく、且つ、凝集体同士が接合しにくいため、凝集体サイズが均一になる傾向がある。さらに、細胞が高い生存率を維持する傾向にある。
　凝集体の大きさは、培養容器に播種する細胞数を調整することにより、制御することができる。例えば、マルチウェルプレートで培養する場合、１つのウェルに１つの凝集体が形成される。このため、１ウェルあたりの腎細胞の播種数が１２５個以上１００００個以下のとき、凝集体を構成する腎細胞の数は、１２５個以上１００００個以下となる。
　凝集体の直径は、例えば、１００μｍ以上８００μｍ以下が好適である。また、凝集体の体積は、例えば、０．００１ｍｍ３以上、０．３００ｍｍ３以下が好適である。
　なお、凝集体の直径は、凝集体の最大幅と定義される。すなわち、凝集体の直径は、凝集体の外縁上の２点をつなぐ直線のうち最大のものの長さである。また、凝集体の体積は、凝集体は略球形であるから、測定された直径から算出できる。凝集体の直径は、例えば、位相差顕微鏡により撮影した写真を用いて計測することができる。位相差顕微鏡としてはＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ社）を使用でき、直径の計測には解析ソフトウェアを使用できる。
　腎細胞を保管又は輸送する際に用いられる液体は、細胞に悪影響を与えない限り特に限定されず、凝集体を作製した際の培地であってもよく、新鮮培地であってもよく、あるいは培地以外の液体（例えば生理食塩水や緩衝液など）であってもよい。この液体は、塩類、緩衝剤、血清、ビタミン、アミノ酸、グルコース(糖)、電解質、抗生物質、成長因子(化合物、タンパク質)を含有していてもよい。保管又は輸送が４８時間以上に及ぶ場合は、液体は定期的に交換することが好ましい。例えば、液体は２日毎に交換される。
　腎細胞の凝集体を含む液体の保管及び輸送用容器は、上述した培養容器と同様、任意のものを使用することができるが、細胞非（低）接着処理が施されているか、細胞非（低）接着材料で構成されていることが好ましい。
　本発明に係る一実施態様である腎細胞を保管又は輸送する方法は、腎細胞の保管又は輸送する際に、腎細胞の凝集体を含む液体を、前記腎細胞の培養温度未満であり、且つ前記液体が凍結しない温度（以下、便宜上「維持温度」と呼ぶことがある）に管理する維持工程を含む。
　前記腎細胞の培養温度未満であり、且つ前記液体が凍結しない温度は、細胞の種類や用途及び／又は保管若しくは輸送が必要な期間などに応じて最適温度を適宜選択することができる。なお、培養温度とは、細胞の生存に適した温度であり、当該細胞は増殖してもしなくてもよい。細胞の培養温度は、典型的には３７℃なので、維持温度はこれよりも低い温度であることが望ましい。一方、維持温度が低すぎると、細胞内で部分的な凍結が起こるなどのため、凝集体中の細胞生存率が低下する恐れがある。したがって、維持温度は０℃以上であることが望ましい。維持温度は、例えば、０℃以上３７℃未満とすることができ、比較的高温での維持が望ましい場合、好ましくは１０℃以上３７℃未満、さらに好ましくは２０℃以上２８℃未満とすることができ、比較的低温での維持が望ましい場合、好ましくは０℃以上１０℃未満、さらに好ましくは３℃以上８℃未満とすることができる。なお、本明細書においては、便宜上、１０℃以上３７℃未満の温度範囲を「常温」と、０℃以上１０℃未満の温度範囲を「冷蔵」と、それぞれ呼ぶことがある。
　保管の場合、維持工程において、所望の温度に調整可能なインキュベーター、恒温室、冷蔵庫などを使用することができる。
　輸送の場合、維持工程は、発泡スチロール等の断熱性容器を用いることが好ましい。断熱性容器の大きさは、保管及び輸送用容器を梱包できれば、特に限定されない。断熱性容器と保管及び輸送用容器との間に隙間があるときは、保管及び輸送用容器が動かないように、緩衝材が同梱されることが好ましい。また、断熱性容器として、紙製容器や段ボール製容器を使用することもできる。
　なお、維持工程は必ずしも静置により行う必要はない。したがって、シェーカー上又は輸送中など凝集体の破壊が起こらない程度の振動がある状況下で行うことができる。
　腎細胞の保管又は輸送の際、液体中の凝集体の数は、凝集体同士が接合してサイズが不均一となることを防ぐために、１個とすることができる。このとき、液体に対する凝集体の体積比の下限値を、０．００１％以上、０．００２％以上、又は０．００３％以上とすることが好ましい。また、液体に対する凝集体の体積比の上限値を、０．８００％以下、０．５００％以下、又は０．２００％以下とすることが好ましい。液体に対する凝集体の体積比がこのような範囲であることによって、保管又は輸送の際に液体が乾燥して凝集体が空気中に露出することを防ぐことができ、且つ、凝集体への酸素供給が十分に行われる。
　腎細胞の保管又は輸送の際、液体に対する凝集体の比重の下限値は、１．００以上であることが好ましい。このような比重であることによって、凝集体は液体面に浮かぶことなく、液体中に存在できるため、凝集体が細胞外環境の変化に影響を受けにくくなる。したがって、凝集体の比重の上限値は、１．２０以下、１．１５以下、又は１．１０以下であることが好ましい。
　維持工程の維持期間は、腎細胞の凝集体における細胞生存率が所定値以上となる期間である。なお、細胞生存率とは、腎細胞の培養温度における生存細胞数に対する、維持温度における生存細胞数の比である。細胞生存率は、好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。このような細胞生存率を有する腎細胞は、薬物評価に利用することができる。
　本発明者は、維持工程における維持期間と維持温度との間に以下の関係があることを見出した。すなわち、細胞生存率が所定値以上に維持できる維持可能期間は以下の式より算出される。
　（維持可能期間（日））＝Ａ／｛（培養温度（℃））－（維持温度（℃））｝
　Ａ：前記所定値及び前記凝集体の細胞数に応じて定められる係数（日・℃）
　上述の式より、所望の維持温度及び細胞生存率に応じた、維持期間の上限値を算出することができる。
　また、同様に、細胞生存率が所定値以上に維持できる維持可能温度は以下の式より算出される。
　（維持期間（日））＝Ａ／｛（培養温度（℃））―（維持可能温度（℃））｝
　Ａ：前記所定値及び前記凝集体の細胞数に応じて定められる係数（日・℃）
　上述の式より、所望の維持期間及び細胞生存率に応じた、維持温度の下限値を算出することができる。
　ここで、例えば、前記所定値が９０％、且つ前記凝集体の細胞数が１０００個のとき、前記Ａの値は３４．５とすることができ、前記所定値が８０％、且つ前記凝集体の細胞数が１０００個のとき、前記Ａの値は６９とすることができる。
　以上から、例えば、凝集体の細胞数が１０００個のとき、培養温度が３７℃、維持温度が２５℃の場合、維持可能期間はそれぞれ、所定値が８０％のとき５．７５日、所定値が９０％のとき２．８８日である。すなわち、培養温度が３７℃、維持温度が２５℃の場合、維持期間は、好ましくは５．７５日以内であり、さらに好ましくは２．８８日以内である。
　本発明に係る一実施態様である腎細胞は、腎臓の生理機能がより高い、又はヒト腎皮質と比較して機能的に同等である。
　「ヒト腎皮質と比較して機能的に同等」とは、少なくとも、ヒト腎皮質において発現される腎臓の生理機能に関連する１以上の遺伝子発現に関して、ヒト腎皮質と同等のレベルの発現を示すことを意味する。
　腎臓の生理機能に関連する遺伝子としては、ＡＱＰ１、ＣＤ１３、ＳＧＬＴ２、Ｎａ／Ｋ　ＡＴＰａｓｅ、ＵＲＡＴ１、ＰＥＰＴ１、ＭＤＲ１、ＯＡＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴＮ２、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＺＯ－１が挙げられる。ＡＱＰ１（aquaporin 1）は、水の輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ＣＤ１３（alanyl aminopeptidase）は、タンパク質のペプチド化に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ＳＧＬＴ２（sodium glucose cotransporter 2）は、ナトリウム及びグルコースの輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。Ｎａ／Ｋ　ＡＴＰａｓｅは、イオンの輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ＵＲＡＴ１（urate transporter 1）は、尿酸の再吸収に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ＰＥＰＴ１（peptide transporter 1）は、ペプチドの輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。ＭＤＲ１（multiple drug resistance 1）、ＯＡＴ１（organic anion transporter 1）、ＯＣＴ２（organic cation transporter 2）及びＯＣＴＮ２（organic cation transporter novel 2）は、薬剤の輸送に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＺＯ－１（zonula occludens-1）は、細胞間結合に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。
　これらの１以上の遺伝子の発現レベルは、ヒト腎皮質と腎臓細胞培養物における発現量を、一般的なリアルタイムＰＣＲ法（ｑＰＣＲ法）によって測定することができ、両者が同等か否かは、それらを比較することによって判定することができる。なお、判定に使用する場合は、２回以上の実験の測定値を平均して用いる。
　例えば、所定期間保管又は輸送された腎細胞において、上記のいずれかの遺伝子発現量が、ヒト腎皮質におけるその遺伝子の発現量の１０％以上である場合に、ヒト腎皮質と機能的に同等であると判定される。ヒト腎皮質と機能的に同等な腎臓細胞培養物は、上記の１つの遺伝子発現量が、好ましくはヒト腎皮質における発現量の１０％以上であり、さらに好ましくは２５％以上である。あるいは、ヒト腎皮質と機能的に同等な腎細胞は、上記の２以上の遺伝子発現量が、好ましくはいずれもヒト腎皮質における発現量の１０％以上であり、さらに好ましくは２５％以上である。
　本発明に係る一実施態様である腎細胞は、薬物評価系又は細胞製品として提供することができる。薬物評価系としては、例えば、腎細胞における薬物動態や、腎毒性の評価系が挙げられる。また、このような腎細胞は、腎臓がんや、高尿酸血症といった腎臓に関する疾患のメカニズム解析や、治療薬探索ツールとしても利用できる。
（腎細胞保管・輸送システム）
　図１は、実施形態に係る腎細胞保管システム１０の概略構成を示すブロック図である。
　図１に示すように、腎細胞保管システム１０は、腎細胞保管装置２０および温度管理装置３０を備える。
　腎細胞保管装置２０は、庫内の温度を所定の温度に維持可能な保管庫であり、例えば、インキュベーター、恒温室、冷蔵庫などである。腎細胞保管装置２０の庫内に、培養容器２２が格納される。培養容器２２には、液体２４および腎細胞の凝集体２６が収容されている。なお、腎細胞保管装置２０内の温度が所定の維持温度で恒温状態であるとき、培養容器２２内の液体２４の温度は所定の維持温度とみなすことができる。
　温度管理装置３０は、保管情報入力部４０、温度管理部５０、維持期間算出部６０および表示部７０を備える。なお、温度管理装置３０は腎細胞保管装置２０内に内蔵され得る。
　保管情報入力部４０には、培養容器２２内の液体２４に関する情報、腎細胞の培養温度に関する情報、液体２４の維持温度に関する情報、腎細胞の保管期間（維持期間）に関する情報、細胞生存率に関する情報、凝集体の細胞数に関する情報などがユーザによって入力され得る。
　また、保管情報入力部４０には、凝集体２６が保存される液体２４の成分および濃度（又は含有量）に関する情報が入力されてもよい。例えば、液体が生理食塩水の場合、成分として「塩化ナトリウム」が入力され、さらに、「塩化ナトリウム」の濃度が入力される。また、保管情報入力部４０には、液体２４が凍結する温度が入力されてもよい。
　温度管理部５０は、維持温度設定部５２および温度制御部５４を有する。
　維持温度設定部５２は、腎細胞保管装置２０内の維持温度、すなわち、培養容器２２内の液体２４の維持温度が、保管情報入力部４０に入力された腎細胞の培養温度未満であり、且つ液体２４が凍結しない温度となるように設定する。液体２４が凍結しない温度は、保管情報入力部４０に入力された液体２４が凍結する温度より高い温度としてもよく、液体２４の成分および濃度から凝固点降下を考慮して算出してもよい。
　具体的には、維持温度は、保管情報入力部４０によって、ユーザによって設定される場合と、所望の細胞生存率、凝集体の細胞数、維持期間などに従って定められる場合とがある。
　細胞生存率や凝集体の細胞数などによって、維持温度が設定される場合には、維持温度は、下記式で算出される維持可能温度以上になるように設定される。換言すると、維持温度の下限値が、腎細胞を保管する期間である維持期間に応じて定められる。
　（維持期間（日））＝Ａ／｛（培養温度（℃））―（維持可能温度（℃））｝
　Ａ：前記所定値及び前記凝集体の細胞数に応じて定められる係数（日・℃）
　ここで、維持可能温度は、腎細胞の前記培養温度における生存細胞数に対する、維持温度における生存細胞数の比である細胞生存率が所定値以上に維持できる温度である。
　温度制御部５４は、維持温度設定部５２で設定された維持温度となるように、腎細胞保管装置２０内の温度を制御する。具体的には、温度制御部５４と温度管理装置３０とが無線又は有線にて通信可能に接続されており、温度制御部５４は維持温度に関する情報を温度管理装置３０に送信する。維持温度に関する情報を受信した腎細胞保管装置２０は、庫内の温度が当該維持温度になるように温度管理を行う。
　なお、腎細胞保管装置２０内の温度制御は、腎細胞保管装置２０に培養容器２２が格納された後に開始してもよいが、腎細胞保管装置２０に培養容器２２が格納される前に、腎細胞保管装置２０内の温度制御を開始してもよい。腎細胞保管装置２０内の温度制御を予め実施した後、腎細胞保管装置２０に培養容器２２が格納することにより、培養容器２２内の液体２４の温度を速やかに所望の維持温度とすることができる。
　維持期間算出部６０は、必要に応じて、腎細胞保管装置２０によって液体の温度を維持温度に維持する維持期間を下記式で算出される維持可能期間（日）以下に設定する。換言すると、維持期間の上限値が維持温度に応じて定められる。
　（維持可能期間（日））＝Ａ／｛（培養温度（℃））－（維持温度（℃））｝
　Ａ：上記所定値及び上記凝集体の細胞数に応じて定められる係数（日・℃）
　ここで、維持可能期間（日）は、腎細胞の培養温度における生存細胞数に対する、維持温度における生存細胞数の比である細胞生存率が所定値以上に維持できる期間である。
　表示部７０は、ディスプレイ（図示せず）に必要な情報を表示する。表示部７０によって表示される情報としては、維持期間算出部６０によって算出された維持期間（維持（保管）開始日時および維持（保管）終了日時）、維持温度設定部５２によって設定された維持温度などが挙げられる。
　腎細胞保管システム１０は、トラック、貨物車、船舶などの輸送手段に設置することができる。この場合、腎細胞保管システム１０を腎細胞輸送システム１０と読み替えることができる。
　図２は、腎細胞保管システム１０の動作の一例を示すフローチャートである。以下に示す例は、腎細胞の維持期間に応じて維持温度が設定される場合である。
　まず、ユーザによって、保管情報入力部４０に腎細胞の保管に関する情報が入力される。具体的には、腎細胞の維持期間、腎細胞の培養温度および液体が凍結する温度が入力される（Ｓ１０）。
　次に、維持温度設定部５２によって、上述した設定方法にしたがって、液体２４の維持温度が設定される（Ｓ２０）。なお、維持温度は、腎細胞の培養温度未満であり、且つ液体２４の凍結温度以下であることが条件とされる。
　次に、培養容器２２が腎細胞保管装置２０に格納された状態で、温度制御部５４により、腎細胞保管装置２０内の温度、すなわち、液体２４の温度が維持温度になるように制御される（Ｓ３０）。
　次に、腎細胞保管装置２０内の温度が維持温度に設定された時点から経過した時間が、維持期間に達したか否かが判定される（Ｓ４０）。経過時間が維持期間に達した場合には（Ｓ４０のｙｅｓ）、腎細胞の保管又は温度管理を終了する。経過時間が維持期間に達していない場合には（Ｓ４０のｎｏ）、Ｓ４０の判定に戻る。
　本発明のある態様は、腎細胞保管又は輸送システムである。
　当該腎細胞保管又は輸送システムは、液体および腎細胞の凝集体を収容した培養容器を格納し、前記液体の温度を所定の温度に維持可能な細胞保管装置と、
　前記細胞保管装置によって維持される液体の温度を、腎細胞の培養温度未満であり、且つ液体が凍結しない維持温度になるように維持する温度管理装置と、
　を備える。上記態様において、維持温度の下限値が、腎細胞を保管する期間である維持期間に応じて定められてもよい。
　また、本発明の他の態様である、腎細胞保管又は輸送システムは、液体および腎細胞の凝集体を収容した培養容器を格納し、前記液体の温度を所定の温度に維持可能な細胞保管装置と、
　前記細胞保管装置によって維持される液体の温度を、腎細胞の培養温度未満であり、且つ液体が凍結しない維持温度になるように維持する温度管理装置と、
　を備え、上記維持温度に応じて維持期間の上限値を定めてもよい。
　本発明に係る一実施態様によれば、腎細胞の維持温度に応じて維持期間の上限値を算出する、又は維持期間に応じて維持温度の下限値を算出することができる。すなわち、本発明に係る一実施態様は、腎細胞の保管・輸送システムとして、維持温度及び維持期間の管理に利用することができる。
　本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、当業者の知識に基づいて各種の設計変更などの変形を加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態も本発明の範囲に含まれる。
１．　近位尿細管上皮細胞凝集体に対する温度の影響
＜１－１．　凝集体の形態及び細胞生存率＞
　腎細胞として、ＬＯＮＺＡ社から入手したヒト近位尿細管上皮細胞｛Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標）、カタログ番号ＣＣ－２５５３、ＲＰＴＥＣ－腎臓近位尿細管上皮細胞｝を使用した。液体窒素保管器に保管されてある凍結バイアルを３７℃の恒温槽に浸して解凍した。解凍後、凍結バイアル中の細胞懸濁液を推奨される培地｛ＲＥＧＭ（登録商標）、ＬＯＮＺＡ社｝と混和し、培養ディッシュ中で培養した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、２日に１回の頻度で培地交換しながら培養した。細胞を、コンフルエントになる前に回収し、細胞低接着処理された９６ウェルＶ底プレート｛ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート９６Ｖ、住友ベークライト社｝に、１ウェルあたり１０００個の細胞数となるように播種して培養することにより、凝集体を形成させた。凝集体は、２日に１回の頻度で培地交換しながら培養した。なお、「コンフルエント」とは、培養容器の培養表面全体に対して細胞の占める面積の割合が約１００％であること、すなわち培養表面いっぱいに隙間なく細胞が増殖した状態を意味する。
　２４０時間以上培養後、凝集体を含む培養液の入ったプレートを、常温又は冷蔵条件にて静置し、あるいは、３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて静置した。なお、常温条件は、具体的には、発泡スチロール製の容器内にプレートを入れて、室内（空調設定温度：２５℃）に静置した。また、冷蔵条件は、具体的には、プレートを冷蔵庫内（設定温度：４℃）で静置した。
　静置開始から２４時間後の各温度条件における凝集体の様子を、光学顕微鏡により観察した。また、凝集体の生存細胞数を、発光法によりＡＴＰ量を測定するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）　３Ｄ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定した。具体的には、凝集体を培地ごと回収し、培地の容量と等量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ　３Ｄ　Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。この混合物を、室温で３０分間インキュベートした。良く混和した後にマイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で発光値を測定した。
　図３－１に、各温度条件｛（ａ）３７℃条件；（ｂ）常温条件；（ｃ）冷蔵条件｝における凝集体の形態を示す。また、静置２４時間後におけるＡＴＰ量測定の結果を図３－２に示す。
　近位尿細管上皮細胞の凝集体は、培養温度（３７℃）より低温（常温又は冷蔵）で２４時間維持しても、形態を維持していることを確認した。ＡＴＰ量測定の結果、低温における生存細胞数は、培養温度における生存細胞数と比較して同程度であった。低温における生存細胞数はいずれも培養温度における生存細胞数の施設内データの範囲内であるため、生存維持が確認された。
＜１－２．　細胞生存率の経時変化＞
　上記１－１．と同様に凝集体を培養し、凝集体を含む培養液の入ったプレートを、常温又は冷蔵条件にて静置し、あるいは、３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて静置した。静置後も、２日に１回の頻度で培地を交換した。
　静置開始から所定時間経過後、各温度条件における凝集体のＡＴＰ量を、上記１－１．と同様に測定した。
　静置４８時間、７２時間、１４４時間及び２４０時間経過後の生存細胞数の結果を図３－３｛（ａ）４８時間；（ｂ）７２時間；（ｃ）１４４時間（６日間）；（ｄ）２４０時間（１０日間）｝に示す。
　近位尿細管上皮細胞の凝集体の生存細胞数について、常温条件の静置後４８時間及び７２時間経過においては、培養温度条件における生存細胞数とほとんど差がないことが確認された。一方、常温条件の静置後１４４時間経過後以降、及び、冷蔵条件の静置後４８時間経過後以降においては、生存細胞数の減少が確認された。このときの、細胞生存率（培養温度における生存細胞数に対する各温度条件における生存細胞数の比）を表１に示す。表１において、細胞生存率は、「Ａ」＝９０％以上、「Ｂ」＝８０％以上且つ９０％未満、「Ｃ」＝５０％以上且つ８０％未満、「Ｄ」＝５０％未満、で表す。なお、括弧内の数値は、各細胞生存率の１００％との差分を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以上の結果から、腎細胞の凝集体は、培養温度より低温で２４時間以上維持できることが確認された。また、培養温度との差が小さい温度（常温）においては、より低い温度（冷蔵）に比べて、長期間にわたって凝集体を安定的に維持できることが確認された。
２．腎細胞の遺伝子発現量の解析
＜２－１．　常温保管における遺伝子発現量＞
　常温静置後及び培養温度における近位尿細管上皮細胞凝集体の遺伝子発現を調べ、ヒト腎皮質における遺伝子発現と比較した。
　上記１－１．と同様に凝集体を培養し、凝集体を含む培養液の入ったプレートを、常温条件にて静置し、又は、３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて静置した。静置後も、２日に１回の頻度で培地を交換した。
　静置開始から７２時間経過後の各凝集体から、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｍＲＮＡを抽出及び精製した。さらに、このｍＲＮＡから、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）　Ｗｈｏｌｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。これらのｃＤＮＡを鋳型として、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　１（タカラバイオ社）を用いてリアルタイムＰＣＲ法により近位尿細管に多く発現するＯＡＴ１（有機アニオントランスポーター１）、ＯＣＴ２（有機カチオントランスポーター２）及びＵＲＡＴ１（尿酸トランスポーター１）の遺伝子発現量を測定した。なお、すべての実験について、１回の実験において各サンプルはそれぞれｎ＝３で測定した。
　比較のため、ヒトの患者ドナーより採取したヒト腎皮質を用いて、上記と同様にＲＮＡを抽出し、ＯＡＴ１、ＯＣＴ２、又はＵＲＡＴ１の遺伝子発現量を測定した。
　ＯＡＴ１の遺伝子発現量の結果を図４－１に、ＯＣＴ２の遺伝子発現量の結果を図４－２に、ＵＲＡＴ１の遺伝子発現量の結果を図４－３にそれぞれ示す。また、常温条件における培養温度条件及びヒト腎皮質との発現比較を表２－１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　培養温度における近位尿細管上皮細胞の凝集体は、ヒト腎皮質と比較して、ＯＡＴ１、ＯＣＴ２及びＵＲＡＴ１の遺伝子発現量が同等であった。また、常温条件において、培養温度条件及びヒト腎皮質と比較して、遺伝子発現量に変化はなく、常温で７２時間静置したときも、腎臓の生理機能が維持されていることが確認された。
＜２－２．　冷蔵保管における遺伝子発現量＞
　冷蔵静置後及び培養温度における近位尿細管上皮細胞凝集体の遺伝子発現を調べ、ヒト腎皮質における遺伝子発現と比較した。
　上記１－１．と同様に凝集体を培養し、凝集体を含む培養液の入ったプレートを、冷蔵条件にて静置し、又は、３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて静置した。静置後も、２日に１回の頻度で培地を交換した。
　静置開始から２４時間経過後の各凝集体、及びヒトの患者ドナーより採取したヒト腎皮質から、上記２－１．と同様にＯＡＴ１、ＯＣＴ２、又はＵＲＡＴ１の遺伝子発現量を測定した。
　ＯＡＴ１の遺伝子発現量の結果を図４－４に、ＯＣＴ２の遺伝子発現量の結果を図４－５に、ＵＲＡＴ１の遺伝子発現量の結果を図４－６にそれぞれ示す。また、冷蔵条件における培養温度条件及びヒト腎皮質との発現比較を表２－２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以上の結果から、冷蔵で２４時間静置したときも、腎臓の生理機能が維持されていることが確認された。
３．凝集体細胞数の影響
＜３－１．　凝集体細胞数＞
　上記１－１．と同様に腎細胞を培養して回収した後、細胞低接着処理された９６ウェルＶ底プレートに、１ウェルあたりの細胞数がそれぞれ１２５個、５００個、２０００個、１００００個、又は４００００個となるように播種して培養することにより、凝集体を形成させた。凝集体は、２日に１回の頻度で培地交換しながら培養した。
　２４０時間以上培養後、凝集体を含む培養液の入ったプレートを、常温又は冷蔵条件にて静置し、あるいは、３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて静置した。また、各温度条件における培養後の凝集体の様子を、光学顕微鏡により観察した。
　静置開始から所定時間経過後の各温度条件における凝集体のＡＴＰ量を測定した。
　図５－１に、各細胞数｛（ａ）１２５個；（ｂ）５００個；（ｃ）２０００個；（ｄ）１００００個；（ｅ）４００００個｝における凝集体の形態を示す。また、各細胞数｛（ａ）１２５個；（ｂ）５００個；（ｃ）２０００個；（ｄ）１００００個；（ｅ）４００００個｝における凝集体のＡＴＰ量経時測定の結果を図５－２に示す。
　近位尿細管上皮細胞の凝集体の生存細胞数は、細胞数が１２５個から１００００個のとき、いずれの維持期間においても、常温又は冷蔵条件と、培養温度条件とで、顕著な差がみられなかった。このことから、凝集体の細胞数が１２５個～１００００個のとき、静置７２時間経過後においても生存を維持できることが確認された。一方、細胞数が４００００個のときは、静置後４８時間の冷蔵条件において生存細胞数の減少が確認された。
　また、このときの、各細胞数の凝集体における細胞生存率を表３－１に示す。細胞生存率は、「Ａ」＝９０％以上、「Ｂ」＝８０％以上且つ９０％未満、「Ｃ」＝５０％以上且つ８０％未満、「Ｄ」＝５０％未満、で表す。なお、括弧内の数値は、各条件における３７℃の細胞生存率（１００％）との差分を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜３－２．維持可能期間及び維持可能温度の算出方法＞
　上記１－２．及び３－１．の結果から、培養温度と維持温度との差が小さいほど、細胞生存率が減少するまでの期間が長くなる傾向を見出した。すなわち、維持工程における維持期間と維持温度との間に以下の関係があることを見出した。すなわち、細胞生存率を所定値以上に維持できる維持可能期間は以下の式より算出される。
　（維持可能期間（日））＝Ａ／｛（培養温度（℃））－（維持温度（℃））｝
　ここで、Ａの値は所望の細胞生存率及び凝集体の細胞数に応じて、それぞれ定められる。例えば、表１より、凝集体の細胞数１０００個、培養温度３７℃のとき、維持温度２５℃における細胞生存率９０％以上の維持可能期間は７２時間（すなわち３日）であるから、Ａ’＝３６、維持温度４℃における細胞生存率９０％以上の維持可能期間は２４時間（すなわち１日）であるからＡ”＝３３となる。これらの平均値３４．５をＡと定める。
　また、例えば、表１により、凝集体の細胞数１０００個、培養温度３７℃のとき、維持温度２５℃における細胞生存率８０％以上の維持可能期間は１４４時間（すなわち６日）であるから、Ａ’＝７２、維持温度４℃における細胞生存率８０％以上の維持可能期間は４８時間（すなわち２日）であるからＡ”＝６６となる。これらの平均値６９をＡと定める。
　また、同様に、細胞生存率が所定値以上に維持できる維持可能温度は以下の式より算出される。
　（維持期間（日））＝Ａ／｛（培養温度（℃））―（維持可能温度（℃））｝
　Ａ：前記所定値及び凝集体の細胞数に応じて定められる係数（日・℃）
　上述の式より、所望の維持期間及び細胞生存率に応じた、維持温度の下限値を算出することができる。
＜３－３．　凝集体の直径及び体積の測定＞
　上記３－１．と同様に１ウェルあたりの細胞数が所定細胞数となるように腎細胞を播種して培養することにより、凝集体を形成させ、培養した。
　１０日間以上培養後、各凝集体の様子を、位相差顕微鏡ＢＺ－Ｘ７１０（Ｋｅｙｅｎｃｅ社）により観察し、撮像した。このとき、いずれの凝集体も培養液中に沈んでいる；すなわち各凝集体の培地に対する比重が１以上であることを確認した。解析ソフトウェア（Ｋｅｙｅｎｃｅ社）を用いて、形態写真から直径を計測した。さらに、得られた直径から体積を算出し、凝集体の培地に対する体積比を算出した。また、細胞数が１００００個及び４００００個の凝集体については、それぞれの凝集体を４８個ずつ回収して重量を測定し、培地に対する比重を算出した。
　各細胞数における近位尿細管上皮細胞凝集体の直径及び体積、並びに培地に対する体積比及び比重を表３－２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
４．平面培養近位尿細管上皮細胞に対する温度の影響
＜４－１．　平面培養細胞の形態＞
　上記１－１．と同様に腎細胞を培養して回収した後、１ウェルあたりの細胞数２×１０４個となるように９６ウェル平底細胞培養用プレートに播種した。播種後、コンフルエントになるまで培養した。
　培養後、平面培養細胞を含む培養液の入ったプレートを、常温又は冷蔵条件にて静置し、あるいは、３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて静置した。静置２４時間経過後、各温度条件における平面培養細胞の様子を、光学顕微鏡により観察した。
　図６－１に、各温度条件｛（ａ）３７℃条件；（ｂ）常温条件；（ｃ）冷蔵条件｝における平面培養細胞の形態を示す。平面培養した近位尿細管上皮細胞では、常温及び冷蔵条件において細胞間の隙間が多くなり、細胞の形態が変化するが確認された。近位尿細管上皮細胞は平面培養の場合、培養温度の低下によって細胞形態が変化することが確認された。
＜４－２．　細胞生存率の経時変化＞
　上記４－１．と同様に細胞をコンフルエントになるまで培養した。培養後、平面培養細胞を含む培養液の入ったプレートを、常温又は冷蔵条件にて静置し、あるいは、３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて静置した。静置後は、２日に１回の頻度で培地を交換した。
　静置開始から所定時間経過後の各温度条件における凝集体のＡＴＰ量を測定した。各経過時間｛（ａ）２４時間；（ｂ）４８時間；（ｃ）７２時間｝における各温度条件の凝集体のＡＴＰ量経時測定の結果を図６－２に示す。
　平面培養した近位尿細管上皮細胞の生存細胞数は、常温及び冷蔵条件において、静置２４時間経過後の時点で、培養温度条件における生存細胞数に比べて顕著に減少することが確認された。このときの、細胞生存率（培養温度における生存細胞数に対する各条件における生存細胞数の比）を表４に示す。細胞生存率は、「Ａ」＝９０％以上、「Ｂ」＝８０％以上且つ９０％未満、「Ｃ」＝５０％以上且つ８０％未満、「Ｄ」＝５０％未満、で表す。なお、括弧内の数値は、各条件における３７℃の細胞生存率（１００％）との差分を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
５．ヒトｉＰＳ細胞の凝集体に対する温度の影響
　ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）を使用した。ヒトｉＰＳ細胞は液体窒素保管器に保存してある凍結バイアルを取り出し、３７℃の恒温槽に浸して解凍した。解凍後、凍結バイアル中の細胞懸濁液を推奨される培地｛ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）、味の素社｝と混和し、培養ディッシュ中で培養した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、１日に１回の頻度で培地交換しながら培養した。細胞を、コンフルエントになる前に回収し、細胞低接着処理された９６ウェルＶ底プレート｛ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート９６Ｖ、住友ベークライト社｝に、１ウェルあたり１０００個の細胞数となるように播種して培養することにより、凝集体を形成させた。凝集体は、２日に１回の頻度で培地交換しながら培養した。
　２４０時間以上培養後、凝集体を含む培養液の入ったプレートを、常温又は冷蔵条件にて静置し、あるいは、３７℃のインキュベーターに５％ＣＯ２の条件下にて静置した。静置２４時間経過後、各温度条件における細胞の様子を、光学顕微鏡により観察した。
　静置開始から所定時間経過後の各温度条件における凝集体のＡＴＰ量を測定した。
　図７－１に、各温度条件｛（ａ）３７℃条件；（ｂ）常温条件；（ｃ）冷蔵条件｝におけるヒトｉＰＳ細胞凝集体の形態を示す。また、各経過時間｛（ａ）２４時間；（ｂ）４８時間；（ｃ）７２時間｝における各温度条件のヒトｉＰＳ細胞凝集体のＡＴＰ量経時測定の結果を図７－２に示す。
　ヒトｉＰＳ細胞凝集体の生存細胞数は、常温及び冷蔵条件において、静置２４時間経過後の時点で、培養温度条件における生存細胞数に比べて顕著に減少することが確認された。このときの、細胞生存率（培養温度における生存細胞数に対する各条件における生存細胞数の比）を表５に示す。細胞生存率は、「Ａ」＝９０％以上、「Ｂ」＝８０％以上且つ９０％未満、「Ｃ」＝５０％以上且つ８０％未満、「Ｄ」＝５０％未満、で表す。なお、括弧内の数値は、各条件における３７℃の細胞生存率（１００％）との差分を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　（発明の実施態様）
　本発明の第１の実施態様は、腎細胞を保管又は輸送する方法において、前記腎細胞の凝集体を含む液体を、維持温度として、前記腎細胞の培養温度未満であり、且つ前記液体が凍結しない温度に管理する維持工程を含む方法である。これにより、細胞生存率が高く、腎臓の生理機能を維持されている腎細胞を、培養温度より低い温度で保管又は輸送できるという効果を奏する。
　本発明の第２の実施態様は、第１の実施態様において、さらに、前記維持温度が、０℃以上３７℃未満である方法である。これにより、細胞が高い細胞生存率を示すという効果が強化される。
　本発明の第３の実施態様は、第１又は第２の実施態様において、さらに、凝集体１個中の細胞数が、１２５個以上１００００個以下である方法である。これにより、凝集体サイズが均一となり、さらに、細胞が高い細胞生存率を示すという効果が強化される。
　本発明の第４の実施態様は、第１～第３の実施態様において、さらに、前記凝集体の直径が、１００μｍ以上８００μｍ以下である方法である。これにより、凝集体サイズが均一となり、さらに、細胞が高い細胞生存率を示すという効果が強化される。
　本発明の第５の実施態様は、第１～第４の実施態様において、さらに、前記凝集体の体積が、０．００１ｍｍ３以上０．３００ｍｍ３以下である方法である。これにより、凝集体サイズが均一となり、さらに、細胞が高い細胞生存率を示すという効果が強化される。
　本発明の第６の実施態様は、第１～第５の実施態様において、さらに、前記液体中の前記凝集体の数が１個である方法である。これにより、凝集体同士が接合してサイズが不均一となるリスクを低減するという効果を奏する。
　本発明の第７の実施態様は、第１～第６の実施態様において、さらに、前記液体に対する前記凝集体の体積比が、０．００１％以上０．２００％以下である方法である。これにより、保管又は輸送の際に液体が乾燥して凝集体が空気中に露出することを防ぐことができ、且つ、凝集体への酸素供給が十分に行われるという効果を奏する。
　本発明の第８の実施態様は、第１～第７の実施態様において、さらに、前記液体に対する前記凝集体の比重が、１．００以上１．２０以下である方法である。これにより、凝集体が細胞外環境の変化に影響を受けにくくなるという効果を奏する。
　本発明の第９の実施態様は、第１～第８の実施態様において、さらに、前記腎細胞が、近位尿細管上皮細胞である方法である。これにより、腎細胞における薬物動態や、腎疾患に関する創薬研究に使用可能な凝集体が得られるという効果を奏する。
　本発明の第１０の実施態様は、第１～第９の実施態様において、さらに、前記維持工程の維持期間が、前記腎細胞の前記培養温度における生存細胞数に対する、前記維持温度における生存細胞数の比である細胞生存率が所定値以上に維持できる維持可能期間以下であり、前記維持可能期間が以下の計算式から算出される方法である。
　（維持可能期間（日））＝Ａ／｛（培養温度（℃））－（維持温度（℃））｝
　Ａ：前記所定値及び前記凝集体の細胞数に応じて定められる係数（日・℃）
これにより、所望の維持温度及び細胞生存率に応じた、維持期間の上限値を算出することができるという効果を奏する。
　本発明の第１１の実施態様は、第１～第９の実施態様において、さらに、前記維持温度が、前記腎細胞の前記培養温度における生存細胞数に対する、前記維持温度における生存細胞数の比である細胞生存率が所定値以上に維持できる維持可能温度以上であり、前記維持可能温度が以下の計算式から算出される方法である。
　（維持期間（日））＝Ａ／｛（培養温度（℃））―（維持可能温度（℃））｝
　Ａ：前記所定値及び前記凝集体の細胞数に応じて定められる係数（日・℃）
これにより、所望の維持期間及び細胞生存率に応じた、維持温度の下限値を算出することができるという効果を奏する。
　本発明の第１２の実施態様は、第１０又は第１１の実施態様において、さらに、前記所定値が９０％、且つ前記凝集体の細胞数が１０００個のとき、前記Ａの値が３４．５である方法である。これにより、凝集体の細胞数が１０００個の場合、細胞生存率が９０％以上となる、所望維持温度における維持可能期間及び所望維持期間における維持可能温度を算出できるという効果を奏する。
　本発明の第１３の実施態様は、第１０又は第１１の実施態様において、さらに、前記所定値が８０％、且つ前記凝集体の細胞数が１０００個のとき、前記Ａの値が６９である方法である。これにより、凝集体の細胞数が１０００個の場合、細胞生存率が８０％以上となる、所望維持温度における維持可能期間及び所望維持期間における維持可能温度を算出できるという効果を奏する。
　本発明の第１４の実施態様は、第１～第１３の実施態様により得られた腎細胞である。これにより、細胞生存率が高く、腎臓の生理機能を維持されている腎細胞を得られるという効果を奏する。
　本発明の第１５の実施態様は、第１４の実施態様により得られた腎細胞を含む薬物評価系である。これにより、腎細胞における薬物動態や、腎疾患に関する創薬研究に使用可能な薬物評価系が得られるという効果を奏する。
　本発明の第１６の実施態様は、第１５の実施態様により得られた腎細胞を含む細胞製品である。これにより、腎細胞における薬物動態や、腎疾患に関する創薬研究に使用可能な細胞製品が得られるという効果を奏する。
　本発明は、薬物評価系において使用し得る腎細胞凝集体の保管及び輸送に利用することができる。
１０　腎細胞保管システム、２０　腎細胞保管装置、２２　培養容器、２４　液体、２６　凝集体、３０　温度管理装置、４０　保管情報入力部、５０　温度管理部、５２　維持温度設定部、５４　温度制御部、６０　維持期間算出部、７０　表示部

 

Claims (16)

  1. 　腎細胞を保管又は輸送する方法において、
    　前記腎細胞の凝集体を含む液体を、維持温度として、前記腎細胞の培養温度未満であり、且つ前記液体が凍結しない温度に管理する維持工程
    を含む方法。
  2. 　前記維持温度が、０℃以上３７℃未満である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記凝集体１個中の細胞数が、１２５個以上１００００個以下である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記凝集体の直径が、１００μｍ以上８００μｍ以下である、請求項１～３いずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記凝集体の体積が、０．００１ｍｍ３以上０．３００ｍｍ３以下である、請求項１～４いずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記液体中の前記凝集体の数が１個である、請求項１～５いずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記液体に対する前記凝集体の体積比が、０．００１％以上０．２００％以下である、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記液体に対する前記凝集体の比重が、１．００以上１．２０以下である、請求項１～７いずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記腎細胞が、近位尿細管上皮細胞である、請求項１～８いずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記維持工程の維持期間が、
    　前記腎細胞の前記培養温度における生存細胞数に対する、前記維持温度における生存細胞数の比である細胞生存率が所定値以上に維持できる維持可能期間以下であり、
    　前記維持可能期間が以下の計算式から算出される、請求項１～９いずれか一項に記載の方法。
    　（維持可能期間（日））＝Ａ／｛（培養温度（℃））－（維持温度（℃））｝
    　Ａ：前記所定値及び前記凝集体の細胞数に応じて定められる係数（日・℃）
  11. 　前記維持温度が、
    　前記腎細胞の前記培養温度における生存細胞数に対する、前記維持温度における生存細胞数の比である細胞生存率が所定値以上に維持できる維持可能温度以上であり、
    　前記維持可能温度が以下の計算式から算出される、請求項１～９いずれか一項に記載の方法。
    　（維持期間（日））＝Ａ／｛（培養温度（℃））―（維持可能温度（℃））｝
    　Ａ：前記所定値及び前記凝集体の細胞数に応じて定められる係数（日・℃）
  12. 　前記所定値が９０％、且つ前記凝集体の細胞数が１０００個のとき、前記Ａの値が３４．５である、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 　前記所定値が８０％、且つ前記凝集体の細胞数が１０００個のとき、前記Ａの値が６９である、請求項１０又は１１に記載の方法。
  14. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法により得られた腎細胞。
  15. 　請求項１４に記載の腎細胞を含む薬物評価系。
  16. 　請求項１４に記載の腎細胞を含む細胞製品。

     
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