TW202325841A - 穩定擴增富潛能幹細胞的方法 - Google Patents

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Abstract

一種穩定擴增富潛能幹細胞的方法，包含以下步驟：(a) 細胞植入步驟：將富潛能幹細胞直接植入一多孔支架中，以使每個該多孔支架含有1 × 10 4個以上之該富潛能幹細胞； (b) 細胞擴增步驟：將該多孔支架浸置於無異種成分(Xeno-free，XF)的一特定培養基中，在環境溫度為35.5~39.5℃、CO 2濃度為5%的條件下進行擴增培養獲得數量擴增的富潛能幹細胞；其中該擴增後的富潛能幹細胞聚集而呈現胚胎小體的狀態。根據本發明之擴增方法，能夠容易地得到使富潛能幹細胞的擴增倍數達到約3倍以上之優異效果。

Description

穩定擴增富潛能幹細胞的方法
本發明係關於一種富潛能幹細胞（Pluripotent stem cells）之擴增培養方法，特別是關於一種能夠以無異種成分(Xeno-free，XF)培養基進行培養的富潛能幹細胞細胞之擴增培養方法。避免於培養過程中因沒有使用細胞外基質（Extracellular matrix, ECM）、餵養細胞 (feeder cells)或ROCK 抑制劑等導致細胞死亡或擴增培養失敗。
富潛能幹細胞（Pluripotent stem cells）是分化能力僅次於全能幹細胞(Totipotent stem cell)的幹細胞，其中包括胚胎幹細胞（Embryonic stem cell；ESC）和誘導性富潛能幹細胞(induced pluripotent stem cell；iPSC)，它們能提供一個無限擴展的細胞來源，並且具有潛力足以分化為三胚層以及成人體內全部的組織。於再生醫療、藥物開發、毒性測試和基因研究方面皆有極高的應用價值。
由於富潛能幹細胞具備高度分化的能力，需要在一特殊的培養基、培養環境等條件下，才能夠維持該富潛能幹細胞處於沒有分化的狀態。舉例來說，在不使用餵養細胞或細胞外基質的條件下進行培養時，則會造成富潛能幹細胞的大量或全部死亡而造成培養失敗。因此，為了避免發生此種不想見到的窘境，在目前的細胞擴增培養技術領域中，多半是利用例如餵養細胞培養系統、含有ROCK抑制劑培養系統、或細胞外基質塗層培養系統等之二維培養系統來對於該富潛能幹細胞進行擴增培養。
所謂的「餵養細胞培養系統」通常是一種利用以例如小鼠胚胎纖維母細胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF)或人類包皮層纖維細胞(foreskin fibroblasts；HFF)做為餵養細胞 (feeder cells)來對於富潛能幹細胞進行生長培養的二維培養系統。又，所謂的「細胞外基質塗層培養系統」通常是一種利用具有細胞外基質（Extracellular matrix, ECM）塗層的培養盤，在已加入適量的必需生長因子之培養基中對於富潛能幹細胞進行培養的二維培養系統。所謂的「含有ROCK抑制劑培養系統」通常是一種在添加有ROCK抑制劑的培養基中對於富潛能幹細胞進行生長培養的二維培養系統。
然而，值得注意的是，不管是餵養細胞培養系統、含有ROCK抑制劑培養系統、或細胞外基質塗層培養系統，由於經常使用異種動物材料，導致必須面對不必要的安全議題，例如，包括各批次產出細胞之間存在很大差異，異種動物帶來的病源體感染或引發異種免疫反應等等各式的風險。因此，根據良好作業規範(Good manufacturing practice, GMP)，利用如上述餵養細胞培養系統、含有ROCK抑制劑培養系統、或細胞外基質塗層培養系統培養的富潛能幹細胞，將會有不能夠使用於臨床治療目的缺陷。
因此，在細胞培養業界中，莫不期待能夠開發出一種可以解決現有技術在不使用餵養細胞或細胞外基質的條件下進行培養時容易引發細胞的大量或全部死亡而造成培養失敗的問題點，而且能夠穩定擴增富潛能幹細胞的方法。
有鑑於此，本發明人對於既有技術潛心檢討而研究開發出一種穩定擴增富潛能幹細胞的方法，其為將富潛能幹細胞填充於利用海藻酸鈣系的三維(3D)多孔支架之孔隙中，在沒有使用動物血清或異種動物材料、或者不含有任何異種動物性來源的衍生物之培養基中，於無異種成分(Xeno-free)的細胞培養環境，對於富潛能幹細胞進行立體擴增培養，具體可以應用在平面培養皿或生物反應器中；而且根據本發明之方法立體擴增培養後所得到的富潛能幹細胞能夠直接使用在以細胞治療為目的之分化培養；至此，始乃完成本發明。
從而，根據本發明之穩定擴增富潛能幹細胞的方法，不但能夠避免富潛能幹細胞在不使用餵養細胞或細胞外基質的培養環境中大量或全部死亡而造成培養失敗的問題點，而且能夠大量且穩定地擴增培養富潛能幹細胞，例如，根據本發明之富潛能幹細胞的穩定擴增方法，在一具體實施例中，富潛能幹細胞的擴增數量為接近每日3000個；增量速率可達每日30%左右。因此，本發明能夠非常適合應用於以細胞治療為目的之各種細胞培養用途。
具體而言，本發明可以提供一種富潛能幹細胞之擴增培養方法，其係包含以下步驟：(a) 細胞植入步驟：將富潛能幹細胞直接植入一多孔支架的孔隙中，以使在該多孔支架中含有1 × 10 4個或以上之富潛能幹細胞間； (b) 細胞擴增步驟：將該多孔支架浸置於無異種成分(Xeno-free，XF)的一特定培養基中，在環境溫度為35.5~39.5℃、CO 2濃度為5%的條件下進行擴增培養獲得大量的富潛能幹細胞；其中，該多孔支架主要由海藻酸鈣所構成且為具備微孔隙網絡結構的多孔隙顆粒。又，該多孔隙顆粒的型態可以是固體、非液體之凝膠、果凍膠、或半固體狀態；例如，水膠等型態。該特定培養基為E8培養基，其由DMEM/F12培養基、胰島素(Insulin)、亞硒酸鈉(sodium selenium)、運鐵蛋白(transferrin)、 抗壞血酸(L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium)、bFGF、TGFβ、及碳酸氫鈉(NaHCO 3)所組成。
根據本發明之一實施例，富潛能幹細胞的擴增數量為接近每日3000個；增量速率可達每日30%左右；又，在一具體實施例中，經培養7日後的該富潛能幹細胞之數量為擴增到2倍以上；經培養10日後的該富潛能幹細胞之數量為擴增到約3倍以上；經培養14日後的該富潛能幹細胞之數量為擴增到約5倍以上。
根據本發明之一實施例，該培養方法可以不必使用餵養細胞、細胞外基質塗層、或ROCK 抑制劑；又，在不脫離本發明的精神範圍內，也可以視情況添加餵養細胞、細胞外基質塗層、或ROCK 抑制劑。
根據本發明之一實施例，該多孔支架為由海藻酸鈣所構成。
根據本發明之一實施例，該多孔支架的製備方法如下步驟：i. 製備濃度為1.0wt%~5.0wt%的海藻酸鈉水溶液並以 1 mL/孔的體積注入 48 孔培養板，再利用冷凍乾燥移除水分而形成海綿狀結構物；ii. 將該海綿狀結構物在室溫環境中浸置於濃度為1-2wt%的氯化鈣溶液中進行交聯反應，反應完成後經過不同濃度的乙醇進行梯度脫水，獲得該固體多孔支架。該多孔支架為一種微孔隙網絡結構的多孔隙顆粒。
根據本發明之一實施例，在步驟(b)之後進一步包含(b-1)細胞釋放步驟：利用濃度為50 mM的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液將該多孔支架溶解，進而釋放出該富潛能幹細胞。
根據本發明之一實施例，該特定培養基為E8培養基，其為至少含有DMEM/F12培養基、胰島素(Insulin)、硒或硒化物(Selenium)、運鐵蛋白(transferrin)、抗壞血酸(L-ascorbic acid)、鹼性成纖維細胞生長因子[basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)，又稱為Fibroblast growth factor 2 (FGF2)、FGF-β]、乙型轉化生長因子(Transforming Growth Factor Beta, TGF-β)、及碳酸氫鈉的培養基。
根據本發明之一實施例，擴增後的該富潛能幹細胞經聚集而呈現胚胎小體(Embryoid body)的外觀型態。
根據本發明之一實施例，該富潛能幹細胞為胚胎幹細胞或誘導性富潛能幹細胞。
為了使本發明的目的、技術特徵及優點，能更為相關技術領域人員所瞭解，並得以實施本發明，在此配合所附的圖式、具體闡明本發明的技術特徵與實施方式，並列舉較佳實施例進步說明。以下文中所對照的圖式，為表達與本發明特徵有關的示意，並未亦不需要依據實際情形完整繪製。
本文中，本文所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解的相同的含義。此外，除非另外明確地與上下文相矛盾，否則本文所使用之單數術語應包括複數形式且複數術語應包括單數形式。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已儘可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實施例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對本發明實施態樣與具體實施例提出說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
首先，說明本發明的操作方法，包含有以下步驟：
細胞植入步驟S1：將富潛能幹細胞直接植入一多孔支架中，該多孔支架中的該富潛能幹細胞的數量為在1 × 10 4~1 × 10 6個之間。又，值得注意的是，根據本發明之技術思想，該多孔支架中的該富潛能幹細胞的初始數量並未特別限制，例如，可以依照實際需要而使富潛能幹細胞的初始數量為大於、等於或小於1 × 10 4個；然而，通常是使用具有富潛能幹細胞的初始數量為1 × 10 4個以上；較佳者是使用具有富潛能幹細胞的初始數量為5 × 10 4個以上；更佳者是使用具有富潛能幹細胞的初始數量為1 × 10 5個以上；特佳者是使用具有富潛能幹細胞的初始數量為5× 10 5個以上；最佳者是使用具有富潛能幹細胞的初始數量為1 × 10 6個以上。
細胞擴增步驟S2：將該多孔支架浸置於一特定培養基中，在環境溫度為35.5~39.5℃、CO 2濃度為5%的條件下進行擴增培養獲得大量的富潛能幹細胞。
在步驟S1中，該多孔支架是由海藻酸鹽與氯化鈣經交聯反應所構成，並且不需要額外施加細胞外基質塗層或是餵養細胞。
海藻酸(alginic acid)/海藻酸鹽(alginate)為一種天然陰離子多醣(anionic polysaccharide)，主要存在於褐藻(brown algae)細胞壁或細胞間隙中。從褐藻抽取純化後，以鈉鹽形式存在，稱為海藻酸鈉(sodium alginate)，由古羅醣醛酸(a-L-guluronic, G) 和甘露醣醛酸(b-D-mannuronic, M)兩種單元以(1-4)鏈結所組成的高分子聚合物。依照萃取海藻種類、位置、年齡的不同，海藻酸鈉的單元排列有所不同，如：MMM、GGG、MGM三種段落(blocks)。海藻酸鈉的G單元上的羧基(COO -)易與二價陽離子(如：Ca 2+、Ba 2+、Sr 2+、Pb 2+)發生鍵合作用，產生分子間的架橋作用(物理性固化交聯)，形成水凝膠(hydrogel)，兩者間產生蛋殼盒結構(egg-box junction)，因此，G單元的比例相對高，相對其海藻酸鈉的機械性質亦會提高；而M單元的比例相對高時，其海藻酸鈉為低黏度(low viscosity)和機械強度弱。海藻酸鈉的物理性質(physical properties)、形成凝膠能力和強度取決於分子量、醣醛酸組成(uronic acid composition)、三種段落排列(MMM、GGG、MGM)之比例、鈣離子的來源和方法製備。
美國食品和藥物管理局(Food and Drugs Administration, FDA)早在1970年批准海藻酸為公認安全(Generally recognized as safe, GRAS)，即為海藻酸安全性和無毒性的物質，可用於食品、製藥、藥物應用等。又，由於海藻酸與二價陽離子間會發生鍵合作用而引發物理性固化交聯，因此，在本發明中，當利用海藻酸鈣為主的多孔支架進行細胞培養後，可以進一步以二價陽離子釋出型化合物清洗時，將可以達到快速且容易移除海藻酸鈣系多孔支架的優異功效，同時還能夠使本發明更有利於在以細胞治療為目的細胞培養應用上，並且也相對地更為安全。又，該「二價陽離子釋出型化合物」並沒有特別限制，通常是使用例如螯合劑來做為本發明中之二價陽離子釋出型化合物；舉例來說，可以使用例如乙二胺四乙酸 (Ethylenediaminetetraacetic acid， EDTA)等之螯合劑。
海藻酸能形成多孔支架(Porous scaffolds)，多孔支架提供三維環境，可讓細胞附著、增殖和分化，同時，三維培養模式被認為可以更好模擬體內細胞生長環境及支持特殊基因和蛋白表現。如前所述，海藻酸/海藻酸鈉的物理性質不同，對於細胞培養狀態亦不相同，本發明目的在於培養過程中，多孔支架能提供環境讓細胞生長，在完成培養後，能將多孔支架解離。因此，分析以下三種不同性質的海藻酸鈉來評估何者適用於本發明的多孔支架：
海藻酸鈉P1：高分子量(250-350KDa)、M/G比例為60-70/30-40、黏度為200-450mPa·s。
海藻酸鈉P2：高分子量(90-180KDa)、M/G比例為60-70/30-40、黏度為15-45mPa·s。
海藻酸鈉P3：高分子量(20-60KDa)、M/G比例為25-35/65-75、黏度為5-7mPa·s。
在上述三種海藻酸鈉中，海藻酸鈉P3的黏度最低、分子量最低，但其解離速度太快，在未完成細胞培養其細胞支架已解離；海藻酸鈉P1的黏度最高、分子量最高，提供穩定的細胞支架讓細胞生長，然後完成細胞培養後，細胞支架其解離；海藻酸鈉P2能完成細胞培養，在完成培養後，能將多孔支架解離。在本發明之實施例中採用海藻酸鈉P2為多孔支架的原料。
又，在步驟S2中，該特定培養基為E8培養基，其為如表1所示，由至少含有DMEM/F12培養基、胰島素(Insulin)、硒或硒化物(Selenium)、運鐵蛋白(transferrin)、抗壞血酸(L-ascorbic acid)、鹼性成纖維細胞生長因子[basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)，又稱為Fibroblast growth factor 2 (FGF2)、FGF-β]、乙型轉化生長因子(Transforming Growth Factor Beta, TGF-β)、及碳酸氫鈉的培養基。
值得注意的是，該特定培養基(E8培養基)通常原則上不含有或不添加ROCK 抑制劑(ROCK inhibitor)、餵養細胞 (feeder cells)；然而，也可以視情況需要而進一步添加或含有ROCK 抑制劑、及/或餵養細胞 (feeder cells)。又，根據本發明，該餵養細胞(feeder cells)可以使用例如，小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)或人類包皮層纖維細胞(HFF)。
另外，在本發明之富潛能幹細胞之擴增培養方法的一實施例中，可以是例如在步驟(b)中之擴增培養為先在含有ROCK抑制劑的該特定培養基中培養第一時段以後，再進一步於不含有ROCK抑制劑的E8培養基中培養第二時段。 又，舉例來說，在步驟(b)中之擴增培養的第一時段為至少1天；第二時段為至少1天。
另外，值得注意的是，所使用的培養器(即多孔支架)也可以是經過表面處理過的。舉例來說，在本發明之富潛能幹細胞之擴增培養方法的一實施例中，也可以是在步驟(a)、步驟(b)之間進一步包括：(a-1)細胞外基質塗層步驟：將一細胞外基質添加在該培養器而形成一細胞外基質塗層。人類富潛能幹細胞(human pluripotent stem cell, hPSC)具有無限擴展的能力及分化為人體內全部組織的潛能，其表面標誌表現SSEA4、Oct4、Sox2、Nanog，因此，被認為是再生醫學中重要的治療策略。在過去的培養過程中必須添加特殊因子，如：Rho激酶抑製劑(Rho-kinase inhibitors, 又稱rho-associated protein kinase inhibitor 或 ROCK inhibitor)。先前研究指出ROCK 抑制劑能維持細胞的幹性(stemness)，對於hPSC的活力及細胞聚集有益，提高胚胎小體(embryoid body)形成，在人類胚胎幹細胞解離為單一細胞時，經由防止解離（dissociation）誘導細胞凋亡，提高人類胚胎幹細胞存活率，因此，增加其克隆效率（cloning efficieny），特別是ROCK 抑制劑被證明hESCs在海藻酸鹽微膠囊(microcapsules)維持活力是必需的，而本發明之方法不需使用ROCK 抑制劑可進行富潛能幹細胞的擴增。
接著，以下以具體實施例和比較例來說明本發明。 《比較例1》(二維細胞外基質塗層培養系統)
將人類iPSC使用細胞外基質塗層系統進行培養。培養前先使用細胞外基質溶液(Extracellular matrix solution, 在此使用1% Geltrex)進行培養皿(Petri dish)的塗層，每次以1毫升的Geltrex溶液灌注於60 mm 培養皿，並於37℃下進行塗層至少12小時。塗層完畢後，移除Geltrex溶液，再加入10 4/well欲培養的誘導性富潛能幹細胞，並浸置於含ROCK 抑制劑的E8培養基(構成分如表1所示)中，於37℃ 及5% CO 2的環境條件下進行擴增培養。隔天(第2天)更換為不含ROCK 抑制劑的基礎細胞培養基並培養至第14天後以光學顯微鏡觀察經擴增而得的誘導性富潛能幹細胞(如圖1(A)所示)。 《實施例1》(三維多孔支架培養系統-含ROCK inhibitor)
首先，製備多孔支架。將 1.5 wt% 醫藥級海藻酸鈉（Protanal® CR 8133, DuPont）粉末溶於去離子水中，以 1 mL/孔的體積注入 48 孔培養板。聚合物溶液通過冷凍乾燥技術製成多孔支架。該多孔支架為一種微孔隙網絡結構的多孔隙顆粒。多孔支架在室溫下在 2% 氯化鈣溶液中進行交聯30-60分鐘，然後用 75% 酒精消毒，再經過不同濃度的乙醇進行梯度脫水後，進行25-40 kGy γ-射線（Gamma ray）照射，並在室溫下儲存直到使用。
接著，以游標卡尺測量多孔支架的結果：直徑為6.88 ± 0.08mm；高為6.43 ± 0.09mm。又，值得注意的是，根據本發明之技術思想，多孔支架的外形尺寸、直徑、高度等並未特別限制，例如，可以依照實際需要而使用直徑為大於、等於或小於6.88mm左右的多孔支架；也可以使用高度為大於、等於或小於6.43mm左右的多孔支架。
其次，利用材料比表面積及孔徑分析儀分析多孔支架的孔隙之孔徑為介於50μm至200μm之間。又，值得注意的是，根據本發明之技術思想，多孔支架的孔隙大小等並未特別限制，例如，可以依照實際需要而使用直徑為大於、等於或小於50μm，或者大於、等於或小於200 μm左右的多孔支架；然而，通常是使用具有孔徑大小為25μm以上200μm以下之孔隙的多孔支架；較佳者為使用具有孔徑大小為35μm以上185μm以下之孔隙的多孔支架；更佳者為使用具有孔徑大小為45μm以上170μm以下之孔隙的多孔支架；特佳者為使用具有孔徑大小為55μm以上155μm以下之孔隙的多孔支架；最佳者為使用具有孔徑大小為65μm以上1140μm以下之孔隙的多孔支架。
又，利用水銀測孔儀分析多孔支架的孔隙度為94.69±1.06%。又，值得注意的是，根據本發明之技術思想，多孔支架的孔隙度等並未特別限制，例如，可以依照實際需要而使用直徑為大於、等於或小於90%；然而，通常是使用具有孔隙度為25%以上99%以下之多孔支架；較佳者為使用具有孔隙度為30%以上95%以下之多孔支架；更佳者為使用具有孔隙度為35%以上90%以下之多孔支架；特佳者為使用具有孔隙度為40%以上85%以下之多孔支架；最佳者為使用具有孔隙度為45%以上80%以下之多孔支架。
另一方面，也可以採用液體置換法測定多孔支架的孔隙率。首先，以量筒稱取V0體積的無水乙醇，將一定大小的多孔支架的試樣完全浸入其中，抽真空約30 min，此時體積記為V1；將取出多孔支架的試樣，剩餘乙醇體積記為V2，計算而得到一個多孔支架的議樣之孔隙率（P），公式為P=（V0－V2）/（V1－V2）×100%，共測6個多孔支架的試樣，取其平均值。根據本發明之技術思想，多孔支架的孔隙率等並未特別限制，通常是使用具有孔隙率為35%以上之多孔支架；較佳者為使用具有孔隙率為45%以上之多孔支架；更佳者為使用具有孔隙率度為55%以上之多孔支架；特佳者為使用具有孔隙率為60%以上之多孔支架；最佳者為使用具有孔隙率為65%以上之多孔支架。
接著，將多孔支架置於 24 孔培養盤內，將人類iPSC以1× 10 4/scaffold之細胞數種植於多孔支架內，並將多孔支架浸置於含ROCK 抑制劑的E8培養基(構成分如表1所示)中，於37℃及5% CO 2的環境條件下進行擴增培養。
在多孔支架中培養不同天數後，利用 50 mM EDTA 溶液中在 37℃下溶解 5 分鐘，從多孔支架中釋放出人類iPSC，並以光學顯微鏡觀察經擴增而得的誘導性富潛能幹細胞，以細胞計數器(Automated Brightfield Cell Counter Cellometer ®Auto T4)進行計算胚胎小體大小，所產生之胚胎小體落於30-50 m (如圖2(A)所示)。 《實施例2》(三維多孔支架培養系統-不含ROCK inhibitor)
首先，製備多孔支架。將 1.5 wt% 醫藥級海藻酸鈉（Protanal® CR 8133, DuPont）粉末溶於去離子水中，以 1 mL/孔的體積注入 48 孔培養板。聚合物溶液通過冷凍乾燥技術製成多孔支架。該多孔支架為一種微孔隙網絡結構的多孔隙顆粒。多孔支架為在室溫下在 2% 氯化鈣溶液中進行交聯30-60分鐘，然後用 75% 酒精消毒，再經過不同濃度的乙醇進行梯度脫水，進行25-40 kGy γ-射線（Gamma ray）照射，並在室溫下儲存直到使用。
接著，將多孔支架置於 24 孔培養盤內，將人類iPSC以1× 10 4/scaffold之細胞數種植於多孔支架內，並將多孔支架浸置於不含ROCK 抑制劑的E8培養基(構成分如表1所示)中，於37℃及5% CO 2的環境條件下進行擴增培養。
在多孔支架中培養不同天數後，利用 50 mM EDTA 溶液中在 37℃下溶解 5 分鐘，從多孔支架中釋放出人類胚胎小體，並以光學顯微鏡觀察經擴增而得的誘導性富潛能幹細胞，以細胞計數器(Automated Brightfield Cell Counter Cellometer ®Auto T4)進行計算胚胎小體大小，所產生之胚胎小體落於30-50 m (如圖2(B)所示)。
表1
組分 濃度
DMEM/F12培養基
胰島素(Insulin) 19.4 mg/l
亞硒酸鈉(sodium selenium) 14 µg/l
運鐵蛋白(transferrin) 10.7 mg/l
抗壞血酸(L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium) 64 mg/l
bFGF 100 µg/l
TGFβ 2 µg/l
碳酸氫鈉(NaHCO 3) 543 mg/l
《細胞外觀型態分析》
請參閱圖1和圖2。圖1為在40X放大倍率下比較例1(如圖1(A)所示)、和實施例2(如圖1(B)所示)中所培養而得之富潛能幹細胞外觀型態圖。
經由觀察比較圖1(A)、圖1(B)的差異可以知道：圖1(A)之比較例1所培養得到的富潛能幹細胞呈現分散的狀態；相對地，如圖1(B)之實施例2所培養得到的富潛能幹細胞則是呈現聚集的胚胎小體形態，細胞團(cell cluster)比較多，而且胚胎小體之尺寸大小皆呈現均一。
由於誘導性富潛能幹細胞在後續進行分化培養時通常是以胚胎小體的形態進行，因此，圖1(A)所示的誘導性富潛能幹細胞不能夠直接用於分化培養，也就是說，利用先前技術之二維培養系統所培養出之誘導性富潛能幹細胞必須再經過聚集的程序才能使用於分化培養。相對地，根據本發明之實施例2擴增培養所獲得如圖1(B)所示的誘導性富潛能幹細胞則可以直接利用於分化培養來得到一特定的器官組織。
其次，參閱圖2。圖2為在100X放大倍率下顯示在實施例1(如圖2(A)所示)、和實施例2(如圖2(B)所示)中利用多孔支架培養系統所培養而得之富潛能幹細胞外觀型態圖。經由觀察圖2可以知道：實施例1所培養得到的富潛能幹細胞為呈現聚集的胚胎小體形態，細胞團(cell cluster)比較多，而且胚胎小體之尺寸大小皆呈現均一。因此，與實施例2同樣地，實施例1所培養得到的富潛能幹細胞也可以直接利用來進行分化培養來得到一特定的器官組織。 《細胞增生分析》
接著，以trypan blue染色法測定實施例1、及實施例2所擴增的細胞數量。首先，將細胞以trypan blue進行染色，利用trypan blue 會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色的特性，再使用自動粒子計數器(Coulter counter)進行細胞數的計算，分別計算出實施例1、及實施例2中培養1、4、7、10、14天的細胞數量，並將結果記錄於表2。又，將結果繪製成如圖3所示的細胞數量擴增曲線圖。
表2
培養天數 細胞數量
實施例1 (含ROCK 抑制劑) 實施例2 (不含ROCK 抑制劑)
1 10,000 10,000
4 16,220 16,101
7 21,789 21,895
10 31,138 31,477
14 49,660 51,000
平均細胞擴增率(%/日) 約29.82 約30.85
平均細胞擴增量(個/日) 約2,982 約3,085
如上述表2所示，可以知道：在實施例1中，誘導性富潛能幹細胞經以含ROCK 抑制劑之無異種成分培養基以三維多孔支架擴增培養4日後的該富潛能幹細胞之數量為擴增到16,220個，擴增倍率為1.6倍以上；經培養7日後的該富潛能幹細胞之數量為擴增到21,789個，擴增倍率為2.17倍以上；經培養10日後的該富潛能幹細胞之數量為擴增到31,138個，擴增倍率為3.11倍以上；經培養14日後的該富潛能幹細胞之數量為擴增到49,660個，擴增倍率為4.96倍以上。又，平均細胞擴增率為約29.82%/日；平均細胞擴增量為約2,982個/日
又，也可以進一步知道：在實施例2中，誘導性富潛能幹細胞經以本發明之無異種成分培養基以三維多孔支架擴增培養4日後的該富潛能幹細胞之數量為擴增到16,101個，擴增倍率為1.6倍以上；經培養7日後的該富潛能幹細胞之數量為擴增到21,895個，擴增倍率為2.18倍以上；經培養10日後的該富潛能幹細胞之數量為擴增到31,477個，擴增倍率為3.14倍以上；經培養14日後的該富潛能幹細胞之數量為擴增到51,000個，擴增倍率為5.1倍以上。又，平均細胞擴增率為約30.85%/日；平均細胞擴增量為約3,085個/日。
由此可知，在傳統二維無細胞外基質塗層培養方法下，必須額外以細胞外基質進行塗層，富潛能幹細胞才能擴增。而本發明利用多孔支架培養系統則可以在無細胞外基質塗層下直接擴增富潛能幹細胞，代表本發明之培養方法在培養過程中不需使用任何異種動物性來源的衍生物。相對地，本發明之培養方法為只需要一種培養基的一階段式培養，即可使誘導性富潛能幹細胞快速擴增，能夠大量生產富潛能幹細胞，因此能夠簡化培養流程，在以細胞治療為目的的細胞培養應用上相對更簡易及安全。
又，如圖3所示之在實施例1、實施例2中富潛能幹細胞經擴增培養後之細胞數量擴增曲線圖，經由二次回歸分析經擴增培養後之細胞數量、擴增培養天數間之關係的結果，可以得到的關係符合以下的指數關係式(1)： y = 6946.9e 0.3893xR² = 0.9939 式中，y代表富潛能幹細胞經擴增培養後之數量；x代表擴增培養的天數。
又，由於指數關係式(1)的R² 高達 0.9939，因此，顯示擴增培養的天數(x)、與富潛能幹細胞經擴增培養後之數量(y)之相互關係極高度符合指數關係式(1)。綜上所述，本發明之內容已以如上之實施例舉例說明了，然而本發明並非僅限定於此等實施方式而已。本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可再進行各種之更動與修飾；例如，將前述實施例中所例示之各技術內容加以組合或變更而成為新的實施方式，此等實施方式亦當然視為本發明所屬內容之一。因此，本案所欲保護之範圍亦包括後述之申請專利範圍及其所界定之範圍。
無
圖1為顯示比較例1及實施例2中所培養而得之富潛能幹細胞外觀型態圖，其中(A)為比較例1、(B)為實施例2。 圖2為顯示實施例1和實施例2所培養而得之富潛能幹細胞外觀型態圖，其中(A)為實施例1、(B)為實施例2。 圖3為顯示實施例1、實施例2在相同天數進行培養而得的細胞數量曲線圖。

Claims (9)

  1. 一種穩定擴增富潛能幹細胞的方法，其至少包含以下步驟： (a) 細胞植入步驟：將富潛能幹細胞直接植入一多孔支架的孔隙中，以使每個該多孔支架至少含有1 × 10 4個或以上的富潛能幹細胞； (b) 細胞擴增步驟：將步驟(a)所得到的已植入有富潛能幹細胞的該多孔支架浸置於無異種成分(Xeno-free，XF)的一特定培養基中，在環境溫度為35.5~39.5℃、CO 2濃度為5%的條件下進行細胞擴增培養，以獲得數量擴增達一定倍數以上的富潛能幹細胞；其中 該多孔支架為具備微孔隙網絡結構的多孔隙顆粒，且主要由海藻酸鈣所構成； 該特定培養基為E8培養基，其由DMEM/F12培養基、胰島素(Insulin)、亞硒酸鈉(sodium selenium)、運鐵蛋白(transferrin)、 抗壞血酸(L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium)、bFGF、TGFβ、及碳酸氫鈉(NaHCO 3)所組成。
  2. 如請求項1所述之富潛能幹細胞之擴增培養方法，其中該多孔支架以液體置換法測定所得到的孔隙率為至少在65%以上。
  3. 如請求項1所述之富潛能幹細胞之擴增培養方法，其中在步驟(a)、步驟(b)之間進一步包括：(a-1)細胞外基質塗層步驟：將一細胞外基質添加在該多孔支架而形成一細胞外基質塗層。
  4. 如請求項1所述之富潛能幹細胞之擴增培養方法，其中在步驟(b)進一步包含在該特定培養基中添加ROCK抑制劑；或者在該特定培養基中先行添加ROCK抑制劑並培養一時段以後，再進一步移除該ROCK抑制劑。
  5. 如請求項1 所述之富潛能幹細胞之擴增培養方法，其中在步驟(b)中進一步在該特定培養基添加一餵養細胞 (feeder cells)；該餵養細胞(feeder cells)為使用小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)或人類包皮層纖維細胞(HFF)。
  6. 如請求項1所述之富潛能幹細胞之擴增培養方法，其中該多孔支架為對海藻酸鈉水溶液以冷凍乾燥法移除水分，經與氯化鈣進行交聯反應後，再利用乙醇進行脫水所製備而得。
  7. 如請求項1所述之富潛能幹細胞之擴增培養方法，其中在步驟(b)之後進一步包含(b-1)細胞釋放步驟：利用濃度為20-60 mM的螯合劑將該多孔支架溶解，進而釋放出該富潛能幹細胞。
  8. 如請求項1所述之富潛能幹細胞之擴增培養方法，其中擴增後的該富潛能幹細胞經聚集而呈現為胚胎小體的外觀型態。
  9. 如請求項1所述之富潛能幹細胞之擴增培養方法，其中該富潛能幹細胞為胚胎幹細胞或誘導性富潛能幹細胞。
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