CN116286610A - 稳定扩增富潜能干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种稳定扩增富潜能干细胞的方法，包含以下步骤：(a)细胞植入步骤：将富潜能干细胞直接植入一多孔支架中，以使每个所述多孔支架含有1×104个以上的所述富潜能干细胞；(b)细胞扩增步骤：将所述多孔支架浸置于无异种成分(Xeno‑free，XF)的一特定培养基中，在环境温度为35.5～39.5℃、CO2浓度为5％的条件下进行扩增培养获得数量扩增的富潜能干细胞；其中所述扩增后的富潜能干细胞聚集而呈现胚胎小体的状态。根据本发明的扩增方法，能够容易地得到使富潜能干细胞的扩增倍数达到约3倍以上的优异效果。

Description

稳定扩增富潜能干细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种富潜能干细胞(Pluripotent stem cells)的扩增培养方法，特别是关于一种能够以无异种成分(Xeno-free，XF)培养基进行培养的富潜能干细胞细胞的扩增培养方法。避免于培养过程中因没有使用细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)、喂养细胞(feeder cells)或ROCK抑制剂等导致细胞死亡或扩增培养失败。
背景技术
富潜能干细胞(Pluripotent stem cells)是分化能力仅次于全能干细胞(Totipotent stem cell)的干细胞，其中包括胚胎干细胞(Embryonic stem cell；ESC)和诱导性富潜能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPSC)，它们能提供一个无限扩展的细胞来源，并且具有潜力足以分化为三胚层以及成人体内全部的组织。于再生医疗、药物开发、毒性测试和基因研究方面皆有极高的应用价值。
由于富潜能干细胞具备高度分化的能力，需要在一特殊的培养基、培养环境等条件下，才能够维持所述富潜能干细胞处于没有分化的状态。举例来说，在不使用喂养细胞或细胞外基质的条件下进行培养时，则会造成富潜能干细胞的大量或全部死亡而造成培养失败。因此，为了避免发生此种不想见到的窘境，在目前的细胞扩增培养技术领域中，多半是利用例如喂养细胞培养系统、含有ROCK抑制剂培养系统、或细胞外基质涂层培养系统等的二维培养系统来对于所述富潜能干细胞进行扩增培养。
所谓的“喂养细胞培养系统”通常是一种利用以例如小鼠胚胎纤维母细胞(mouseembryonic fibroblasts,MEF)或人类包皮层纤维细胞(foreskin fibroblasts；HFF)作为喂养细胞(feeder cells)来对于富潜能干细胞进行生长培养的二维培养系统。又，所谓的“细胞外基质涂层培养系统”通常是一种利用具有细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)涂层的培养盘，在已加入适量的必需生长因子的培养基中对于富潜能干细胞进行培养的二维培养系统。所谓的“含有ROCK抑制剂培养系统”通常是一种在添加有ROCK抑制剂的培养基中对于富潜能干细胞进行生长培养的二维培养系统。
然而，值得注意的是，不管是喂养细胞培养系统、含有ROCK抑制剂培养系统、或细胞外基质涂层培养系统，由于经常使用异种动物材料，导致必须面对不必要的安全议题，例如，包括各批次产出细胞之间存在很大差异，异种动物带来的病源体感染或引发异种免疫反应等等各式的风险。因此，根据良好作业规范(Good manufacturing practice,GMP)，利用如上述喂养细胞培养系统、含有ROCK抑制剂培养系统、或细胞外基质涂层培养系统培养的富潜能干细胞，将会有不能够使用于临床治疗目的缺陷。
因此，在细胞培养业界中，莫不期待能够开发出一种可以解决现有技术在不使用喂养细胞或细胞外基质的条件下进行培养时容易引发细胞的大量或全部死亡而造成培养失败的问题，而且能够稳定扩增富潜能干细胞的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明人对于现有技术潜心检讨而研究开发出一种稳定扩增富潜能干细胞的方法，其为将富潜能干细胞填充于利用海藻酸钙系的三维(3D)多孔支架的孔隙中，在没有使用动物血清或异种动物材料、或者不含有任何异种动物性来源的衍生物的培养基中，于无异种成分(Xeno-free)的细胞培养环境，对于富潜能干细胞进行立体扩增培养，具体可以应用在平面培养皿或生物反应器中；而且根据本发明的方法立体扩增培养后所得到的富潜能干细胞能够直接使用在以细胞治疗为目的的分化培养；至此，始乃完成本发明。
从而，根据本发明的稳定扩增富潜能干细胞的方法，不但能够避免富潜能干细胞在不使用喂养细胞或细胞外基质的培养环境中大量或全部死亡而造成培养失败的问题，而且能够大量且稳定地扩增培养富潜能干细胞，例如，根据本发明的富潜能干细胞的稳定扩增方法，在一具体实施例中，富潜能干细胞的扩增数量为接近每日3000个；增量速率可达每日30％左右。因此，本发明能够非常适合应用于以细胞治疗为目的的各种细胞培养用途。
具体而言，本发明可以提供一种富潜能干细胞的扩增培养方法，其系包含以下步骤：(a)细胞植入步骤：将富潜能干细胞直接植入一多孔支架的孔隙中，以使在所述多孔支架中含有至少1×104个富潜能干细胞间；(b)细胞扩增步骤：将所述多孔支架浸置于无异种成分(Xeno-free，XF)的一特定培养基中，在环境温度为35.5～39.5℃、CO2浓度为5％的条件下进行扩增培养获得大量的富潜能干细胞；其中，所述多孔支架主要由海藻酸钙所构成且为具备微孔隙网络结构的多孔隙颗粒。又，所述多孔隙颗粒的型态可以是固体、非液体的凝胶、果冻胶、或半固体状态；例如，水胶等型态。所述特定培养基为E8培养基，其由DMEM/F12培养基、胰岛素(Insulin)、亚硒酸钠(sodium selenium)、运铁蛋白(transferrin)、抗坏血酸(L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium)、bFGF、TGFβ、及碳酸氢钠(NaHCO3)所组成。
根据本发明的一实施例，富潜能干细胞的扩增数量为接近每日3000个；增量速率可达每日30％左右；又，在一具体实施例中，经培养7日后的所述富潜能干细胞的数量为扩增到2倍以上；经培养10日后的所述富潜能干细胞的数量为扩增到约3倍以上；经培养14日后的所述富潜能干细胞的数量为扩增到约5倍以上。
根据本发明的一实施例，所述培养方法可以不必使用喂养细胞、细胞外基质涂层、或ROCK抑制剂；又，在不脱离本发明的精神范围内，也可以视情况添加喂养细胞、细胞外基质涂层、或ROCK抑制剂。
根据本发明的一实施例，所述多孔支架为由海藻酸钙所构成。
根据本发明的一实施例，所述多孔支架的制备方法如下步骤：i.制备浓度为1.0wt％～5.0wt％的海藻酸钠水溶液并以1mL/孔的体积注入48孔培养板，再利用冷冻干燥移除水分而形成海绵状结构物；ii.将所述海绵状结构物在室温环境中浸置于浓度为1-2wt％的氯化钙溶液中进行交联反应，反应完成后经过不同浓度的乙醇进行梯度脱水，获得所述固体多孔支架。所述多孔支架为一种微孔隙网络结构的多孔隙颗粒。
根据本发明的一实施例，在步骤(b)之后进一步包含(b-1)细胞释放步骤：利用浓度为50mM的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液将所述多孔支架溶解，进而释放出所述富潜能干细胞。
根据本发明的一实施例，所述特定培养基为E8培养基，其为至少含有DMEM/F12培养基、胰岛素(Insulin)、硒或硒化物(Selenium)、运铁蛋白(transferrin)、抗坏血酸(L-ascorbic acid)、碱性成纤维细胞生长因子[basic Fibroblast Growth Factor(bFGF)，又称为Fibroblast growth factor 2(FGF2)、FGF-β]、乙型转化生长因子(TransformingGrowth Factor Beta,TGF-β)、及碳酸氢钠的培养基。
根据本发明的一实施例，扩增后的所述富潜能干细胞经聚集而呈现胚胎小体(Embryoid body)的外观型态。
根据本发明的一实施例，所述富潜能干细胞为胚胎干细胞或诱导性富潜能干细胞。
附图说明
图1为显示比较例1及实施例2中所培养而得的富潜能干细胞外观型态图，其中(A)为比较例1、(B)为实施例2。
图2为显示实施例1和实施例2所培养而得的富潜能干细胞外观型态图，其中(A)为实施例1、(B)为实施例2。
图3为显示实施例1、实施例2在相同天数进行培养而得的细胞数量曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术特征及优点，能更为相关技术领域人员所了解，并得以实施本发明，在此配合所附的图式、具体阐明本发明的技术特征与实施方式，并列举较佳实施例进行说明。以下文中所对照的图式，为表达与本发明特征有关的示意，并未亦不需要依据实际情形完整绘制。
本文中，本文所使用的所有技术及科学术语具有与一般熟习本发明所属技术者通常所理解的相同的含义。此外，除非另外明确地与上下文相矛盾，否则本文所使用的单数术语应包括复数形式且复数术语应包括单数形式。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％的内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考量而定。除了实施例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求书所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对本发明实施态样与具体实施例提出说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
首先，说明本发明的操作方法，包含有以下步骤：
细胞植入步骤S1：将富潜能干细胞直接植入一多孔支架中，所述多孔支架中的所述富潜能干细胞的数量为在1×104～1×106个之间。又，值得注意的是，根据本发明的技术思想，所述多孔支架中的所述富潜能干细胞的初始数量并未特别限制，例如，可以依照实际需要而使富潜能干细胞的初始数量为大于、等于或小于1×104个；然而，通常是使用具有富潜能干细胞的初始数量为1×104个以上；较佳者是使用具有富潜能干细胞的初始数量为5×104个以上；更佳者是使用具有富潜能干细胞的初始数量为1×105个以上；特佳者是使用具有富潜能干细胞的初始数量为5×105个以上；最佳者是使用具有富潜能干细胞的初始数量为1×106个以上。
细胞扩增步骤S2：将所述多孔支架浸置于一特定培养基中，在环境温度为35.5～39.5℃、CO2浓度为5％的条件下进行扩增培养获得大量的富潜能干细胞。
在步骤S1中，所述多孔支架是由海藻酸盐与氯化钙经交联反应所构成，并且不需要额外施加细胞外基质涂层或是喂养细胞。
海藻酸(alginic acid)/海藻酸盐(alginate)为一种天然阴离子多醣(anionicpolysaccharide)，主要存在于褐藻(brown algae)细胞壁或细胞间隙中。从褐藻抽取纯化后，以钠盐形式存在，称为海藻酸钠(sodium alginate)，由古罗醣醛酸(a-L-guluronic,G)和甘露醣醛酸(b-D-mannuronic,M)两种单元以(1-4)链结所组成的高分子聚合物。依照萃取海藻种类、位置、年龄的不同，海藻酸钠的单元排列有所不同，如：MMM、GGG、MGM三种段落(blocks)。海藻酸钠的G单元上的羧基(COO-)易与二价阳离子(如：Ca2+、Ba2+、Sr2+、Pb2+)发生键合作用，产生分子间的架桥作用(物理性固化交联)，形成水凝胶(hydrogel)，两者间产生蛋壳盒结构(egg-box junction)，因此，G单元的比例相对高，相对其海藻酸钠的机械性质亦会提高；而M单元的比例相对高时，其海藻酸钠为低黏度(low viscosity)和机械强度弱。海藻酸钠的物理性质(physical properties)、形成凝胶能力和强度取决于分子量、醣醛酸组成(uronic acid composition)、三种段落排列(MMM、GGG、MGM)的比例、钙离子的来源和方法制备。
美国食品和药物管理局(Food and Drugs Administration,FDA)早在1970年批准海藻酸为公认安全(Generally recognized as safe,GRAS)，即为海藻酸安全性和无毒性的物质，可用于食品、制药、药物应用等。又，由于海藻酸与二价阳离子间会发生键合作用而引发物理性固化交联，因此，在本发明中，当利用海藻酸钙为主的多孔支架进行细胞培养后，可以进一步以二价阳离子释出型化合物清洗时，将可以达到快速且容易移除海藻酸钙系多孔支架的优异功效，同时还能够使本发明更有利于在以细胞治疗为目的细胞培养应用上，并且也相对地更为安全。又，所述“二价阳离子释出型化合物”并没有特别限制，通常是使用例如螯合剂来作为本发明中的二价阳离子释出型化合物；举例来说，可以使用例如乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)等的螯合剂。
海藻酸能形成多孔支架(Porous scaffolds)，多孔支架提供三维环境，可让细胞附着、增殖和分化，同时，三维培养模式被认为可以更好模拟体内细胞生长环境及支持特殊基因和蛋白表现。如前所述，海藻酸/海藻酸钠的物理性质不同，对于细胞培养状态亦不相同，本发明目的在于培养过程中，多孔支架能提供环境让细胞生长，在完成培养后，能将多孔支架解离。因此，分析以下三种不同性质的海藻酸钠来评估何者适用于本发明的多孔支架：
海藻酸钠P1：高分子量(250-350KDa)、M/G比例为60-70/30-40、黏度为200-450mPa·s。
海藻酸钠P2：高分子量(90-180KDa)、M/G比例为60-70/30-40、黏度为15-45mPa·s。
海藻酸钠P3：高分子量(20-60KDa)、M/G比例为25-35/65-75、黏度为5-7mPa·s。
在上述三种海藻酸钠中，海藻酸钠P3的黏度最低、分子量最低，但其解离速度太快，在未完成细胞培养其细胞支架已解离；海藻酸钠P1的黏度最高、分子量最高，提供稳定的细胞支架让细胞生长，然后完成细胞培养后，细胞支架其解离；海藻酸钠P2能完成细胞培养，在完成培养后，能将多孔支架解离。在本发明的实施例中采用海藻酸钠P2为多孔支架的原料。
又，在步骤S2中，所述特定培养基为E8培养基，其为如表1所示，由至少含有DMEM/F12培养基、胰岛素(Insulin)、硒或硒化物(Selenium)、运铁蛋白(transferrin)、抗坏血酸(L-ascorbic acid)、碱性成纤维细胞生长因子[basic Fibroblast Growth Factor(bFGF)，又称为Fibroblast growth factor 2(FGF2)、FGF-β]、乙型转化生长因子(Transforming Growth Factor Beta,TGF-β)、及碳酸氢钠的培养基。
值得注意的是，所述特定培养基(E8培养基)通常原则上不含有或不添加ROCK抑制剂(ROCK inhibitor)、喂养细胞(feeder cells)；然而，也可以视情况需要而进一步添加或含有ROCK抑制剂、及/或喂养细胞(feeder cells)。又，根据本发明，所述喂养细胞(feedercells)可以使用例如，小鼠胚胎纤维母细胞(MEF)或人类包皮层纤维细胞(HFF)。
另外，在本发明的富潜能干细胞的扩增培养方法的一实施例中，可以是例如在步骤(b)中的扩增培养为先在含有ROCK抑制剂的所述特定培养基中培养第一时段以后，再进一步于不含有ROCK抑制剂的E8培养基中培养第二时段。又，举例来说，在步骤(b)中的扩增培养的第一时段为至少1天；第二时段为至少1天。
另外，值得注意的是，所使用的培养器(即多孔支架)也可以是经过表面处理过的。举例来说，在本发明的富潜能干细胞的扩增培养方法的一实施例中，也可以是在步骤(a)、步骤(b)之间进一步包括：(a-1)细胞外基质涂层步骤：将一细胞外基质添加在所述培养器而形成一细胞外基质涂层。人类富潜能干细胞(human pluripotent stem cell,hPSC)具有无限扩展的能力及分化为人体内全部组织的潜能，其表面标志表现SSEA4、Oct4、Sox2、Nanog，因此，被认为是再生医学中重要的治疗策略。在过去的培养过程中必须添加特殊因子，如：Rho激酶抑制剂(Rho-kinase inhibitors,又称rho-associated protein kinaseinhibitor或ROCK inhibitor)。先前研究指出ROCK抑制剂能维持细胞的干性(stemness)，对于hPSC的活力及细胞聚集有益，提高胚胎小体(embryoid body)形成，在人类胚胎干细胞解离为单一细胞时，经由防止解离(dissociation)诱导细胞凋亡，提高人类胚胎干细胞存活率，因此，增加其克隆效率(cloning efficiency)，特别是ROCK抑制剂被证明hESCs在海藻酸盐微胶囊(microcapsules)维持活力是必需的，而本发明的方法不需使用ROCK抑制剂可进行富潜能干细胞的扩增。
接着，以下以具体实施例和比较例来说明本发明。
《比较例1》(二维细胞外基质涂层培养系统)
将人类iPSC使用细胞外基质涂层系统进行培养。培养前先使用细胞外基质溶液(Extracellular matrix solution,在此使用1％ Geltrex)进行培养皿(Petri dish)的涂层，每次以1毫升的Geltrex溶液灌注于60mm培养皿，并于37℃下进行涂层至少12小时。涂层完毕后，移除Geltrex溶液，再加入104/well欲培养的诱导性富潜能干细胞，并浸置于含ROCK抑制剂的E8培养基(构成分如表1所示)中，于37℃及5％CO2的环境条件下进行扩增培养。隔天(第2天)更换为不含ROCK抑制剂的基础细胞培养基并培养至第14天后以光学显微镜观察经扩增而得的诱导性富潜能干细胞(如图1中(A)所示)。
《实施例1》(三维多孔支架培养系统-含ROCK inhibitor)
首先，制备多孔支架。将1.5wt％医药级海藻酸钠(
Figure BDA0003998934960000111
CR 8133,DuPont)粉末溶于去离子水中，以1mL/孔的体积注入48孔培养板。聚合物溶液通过冷冻干燥技术制成多孔支架。所述多孔支架为一种微孔隙网络结构的多孔隙颗粒。多孔支架在室温下在2％氯化钙溶液中进行交联30-60分钟，然后用75％酒精消毒，再经过不同浓度的乙醇进行梯度脱水后，进行25-40kGyγ-射线(Gamma ray)照射，并在室温下储存直到使用。
接着，以游标卡尺测量多孔支架的结果：直径为6.88±0.08mm；高为6.43±0.09mm。又，值得注意的是，根据本发明的技术思想，多孔支架的外形尺寸、直径、高度等并未特别限制，例如，可以依照实际需要而使用直径为大于、等于或小于6.88mm左右的多孔支架；也可以使用高度为大于、等于或小于6.43mm左右的多孔支架。
其次，利用材料比表面积及孔径分析仪分析多孔支架的孔隙的孔径为介于50μm至200μm之间。又，值得注意的是，根据本发明的技术思想，多孔支架的孔隙大小等并未特别限制，例如，可以依照实际需要而使用直径为大于、等于或小于50μm，或者大于、等于或小于200μm左右的多孔支架；然而，通常是使用具有孔径大小为25μm以上200μm以下的孔隙的多孔支架；较佳者为使用具有孔径大小为35μm以上185μm以下的孔隙的多孔支架；更佳者为使用具有孔径大小为45μm以上170μm以下的孔隙的多孔支架；特佳者为使用具有孔径大小为55μm以上155μm以下的孔隙的多孔支架；最佳者为使用具有孔径大小为65μm以上1140μm以下的孔隙的多孔支架。
又，利用水银测孔仪分析多孔支架的孔隙度为94.69±1.06％。又，值得注意的是，根据本发明的技术思想，多孔支架的孔隙度等并未特别限制，例如，可以依照实际需要而使用直径为大于、等于或小于90％；然而，通常是使用具有孔隙度为25％以上99％以下的多孔支架；较佳者为使用具有孔隙度为30％以上95％以下的多孔支架；更佳者为使用具有孔隙度为35％以上90％以下的多孔支架；特佳者为使用具有孔隙度为40％以上85％以下的多孔支架；最佳者为使用具有孔隙度为45％以上80％以下的多孔支架。
另一方面，也可以采用液体置换法测定多孔支架的孔隙率。首先，以量筒称取V0体积的无水乙醇，将一定大小的多孔支架的试样完全浸入其中，抽真空约30min，此时体积记为V1；将取出多孔支架的试样，剩余乙醇体积记为V2，计算而得到一个多孔支架的议样的孔隙率(P)，公式为P＝(V0－V2)/(V1－V2)×100％，共测6个多孔支架的试样，取其平均值。根据本发明的技术思想，多孔支架的孔隙率等并未特别限制，通常是使用具有孔隙率为35％以上的多孔支架；较佳者为使用具有孔隙率为45％以上的多孔支架；更佳者为使用具有孔隙率度为55％以上的多孔支架；特佳者为使用具有孔隙率为60％以上的多孔支架；最佳者为使用具有孔隙率为65％以上的多孔支架。
接着，将多孔支架置于24孔培养盘内，将人类iPSC以1×104/scaffold的细胞数种植于多孔支架内，并将多孔支架浸置于含ROCK抑制剂的E8培养基(构成分如表1所示)中，于37℃及5％ CO2的环境条件下进行扩增培养。
在多孔支架中培养不同天数后，利用50mM EDTA溶液中在37℃下溶解5分钟，从多孔支架中释放出人类iPSC，并以光学显微镜观察经扩增而得的诱导性富潜能干细胞，以细胞计数器(Automated Brightfield Cell Counter
Figure BDA0003998934960000121
T4)进行计算胚胎小体大小，所产生的胚胎小体落于30-50μm(如图2中(A)所示)。
《实施例2》(三维多孔支架培养系统-不含ROCK inhibitor)
首先，制备多孔支架。将1.5wt％医药级海藻酸钠(
Figure BDA0003998934960000131
CR 8133,DuPont)粉末溶于去离子水中，以1mL/孔的体积注入48孔培养板。聚合物溶液通过冷冻干燥技术制成多孔支架。所述多孔支架为一种微孔隙网络结构的多孔隙颗粒。多孔支架为在室温下在2％氯化钙溶液中进行交联30-60分钟，然后用75％酒精消毒，再经过不同浓度的乙醇进行梯度脱水，进行25-40kGyγ-射线(Gamma ray)照射，并在室温下储存直到使用。
接着，将多孔支架置于24孔培养盘内，将人类iPSC以1×104/scaffold的细胞数种植于多孔支架内，并将多孔支架浸置于不含ROCK抑制剂的E8培养基(构成分如表1所示)中，于37℃及5％ CO2的环境条件下进行扩增培养。
在多孔支架中培养不同天数后，利用50mM EDTA溶液中在37℃下溶解5分钟，从多孔支架中释放出人类胚胎小体，并以光学显微镜观察经扩增而得的诱导性富潜能干细胞，以细胞计数器(Automated Brightfield Cell Counter
Figure BDA0003998934960000132
T4)进行计算胚胎小体大小，所产生的胚胎小体落于30-50μm(如图2中(B)所示)。
表1
Figure BDA0003998934960000133
Figure BDA0003998934960000141
《细胞外观型态分析》
请参阅图1和图2。图1为在40X放大倍率下比较例1(如图1中(A)所示)、和实施例2(如图1中(B)所示)中所培养而得的富潜能干细胞外观型态图。
经由观察比较图1中(A)、(B)的差异可以知道：图1中(A)的比较例1所培养得到的富潜能干细胞呈现分散的状态；相对地，如图1中(B)的实施例2所培养得到的富潜能干细胞则是呈现聚集的胚胎小体形态，细胞团(cell cluster)比较多，而且胚胎小体的尺寸大小皆呈现均一。
由于诱导性富潜能干细胞在后续进行分化培养时通常是以胚胎小体的形态进行，因此，图1中(A)所示的诱导性富潜能干细胞不能够直接用于分化培养，也就是说，利用先前技术的二维培养系统所培养出的诱导性富潜能干细胞必须再经过聚集的程序才能使用于分化培养。相对地，根据本发明的实施例2扩增培养所获得如图1中(B)所示的诱导性富潜能干细胞则可以直接利用于分化培养来得到一特定的器官组织。
其次，参阅图2。图2为在100X放大倍率下显示在实施例1(如图2中(A)所示)、和实施例2(如图2中(B)所示)中利用多孔支架培养系统所培养而得的富潜能干细胞外观型态图。经由观察图2可以知道：实施例1所培养得到的富潜能干细胞为呈现聚集的胚胎小体形态，细胞团(cell cluster)比较多，而且胚胎小体的尺寸大小皆呈现均一。因此，与实施例2同样地，实施例1所培养得到的富潜能干细胞也可以直接利用来进行分化培养来得到一特定的器官组织。
《细胞增生分析》
接着，以trypan blue染色法测定实施例1、及实施例2所扩增的细胞数量。首先，将细胞以trypan blue进行染色，利用trypan blue会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色的特性，再使用自动粒子计数器(Coulter counter)进行细胞数的计算，分别计算出实施例1、及实施例2中培养1、4、7、10、14天的细胞数量，并将结果记录于表2。又，将结果绘制成如图3所示的细胞数量扩增曲线图。
表2
Figure BDA0003998934960000151
Figure BDA0003998934960000161
如上述表2所示，可以知道：在实施例1中，诱导性富潜能干细胞经以含ROCK抑制剂的无异种成分培养基以三维多孔支架扩增培养4日后的所述富潜能干细胞的数量为扩增到16,220个，扩增倍率为1.6倍以上；经培养7日后的所述富潜能干细胞的数量为扩增到21,789个，扩增倍率为2.17倍以上；经培养10日后的所述富潜能干细胞的数量为扩增到31,138个，扩增倍率为3.11倍以上；经培养14日后的所述富潜能干细胞的数量为扩增到49,660个，扩增倍率为4.96倍以上。又，平均细胞扩增率为约29.82％/日；平均细胞扩增量为约2,982个/日
又，也可以进一步知道：在实施例2中，诱导性富潜能干细胞经以本发明的无异种成分培养基以三维多孔支架扩增培养4日后的所述富潜能干细胞的数量为扩增到16,101个，扩增倍率为1.6倍以上；经培养7日后的所述富潜能干细胞的数量为扩增到21,895个，扩增倍率为2.18倍以上；经培养10日后的所述富潜能干细胞的数量为扩增到31,477个，扩增倍率为3.14倍以上；经培养14日后的所述富潜能干细胞的数量为扩增到51,000个，扩增倍率为5.1倍以上。又，平均细胞扩增率为约30.85％/日；平均细胞扩增量为约3,085个/日。
由此可知，在传统二维无细胞外基质涂层培养方法下，必须额外以细胞外基质进行涂层，富潜能干细胞才能扩增。而本发明利用多孔支架培养系统则可以在无细胞外基质涂层下直接扩增富潜能干细胞，代表本发明的培养方法在培养过程中不需使用任何异种动物性来源的衍生物。相对地，本发明的培养方法为只需要一种培养基的一阶段式培养，即可使诱导性富潜能干细胞快速扩增，能够大量生产富潜能干细胞，因此能够简化培养流程，在以细胞治疗为目的的细胞培养应用上相对更简易及安全。
又，如图3所示的在实施例1、实施例2中富潜能干细胞经扩增培养后的细胞数量扩增曲线图，经由二次回归分析经扩增培养后的细胞数量、扩增培养天数间的关系的结果，可以得到的关系符合以下的指数关系式(1)：
y＝6946.9e0.3893x
R2＝0.9939
式中，y代表富潜能干细胞经扩增培养后的数量；x代表扩增培养的天数。
又，由于指数关系式(1)的R2高达0.9939，因此，显示扩增培养的天数(x)、与富潜能干细胞经扩增培养后的数量(y)的相互关系极高度符合指数关系式(1)。综上所述，本发明的内容已以如上的实施例举例说明了，然而本发明并非仅限定于此等实施方式而已。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可再进行各种的更动与修饰；例如，将前述实施例中所例示的各技术内容加以组合或变更而成为新的实施方式，此等实施方式亦当然视为本发明所属内容之一。因此，本案所欲保护的范围亦包括权利要求书及其所界定的范围。

Claims (9)

1.一种稳定扩增富潜能干细胞的方法，其特征在于，至少包含以下步骤：
(a)细胞植入步骤：将富潜能干细胞直接植入一多孔支架的孔隙中，以使每个所述多孔支架至少含有1×104个富潜能干细胞；
(b)细胞扩增步骤：将步骤(a)所得到的已植入有富潜能干细胞的所述多孔支架浸置于无异种成分的一特定培养基中，在环境温度为35.5～39.5℃、CO2浓度为5％的条件下进行细胞扩增培养，以获得数量扩增达一定倍数以上的富潜能干细胞；其中
所述多孔支架为具备微孔隙网络结构的多孔隙颗粒，且主要由海藻酸钙所构成；
所述特定培养基为E8培养基，其由DMEM/F12培养基、胰岛素、亚硒酸钠、运铁蛋白、抗坏血酸、bFGF、TGFβ、及碳酸氢钠所组成。
2.根据权利要求1所述的富潜能干细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述多孔支架以液体置换法测定所得到的孔隙率为65％以上。
3.根据权利要求1所述的富潜能干细胞的扩增培养方法，其特征在于，在步骤(a)、步骤(b)之间进一步包括：(a-1)细胞外基质涂层步骤：将一细胞外基质添加至所述多孔支架而形成一细胞外基质涂层。
4.根据权利要求1所述的富潜能干细胞的扩增培养方法，其特征在于，步骤(b)进一步包含：在所述特定培养基中添加ROCK抑制剂；或者在所述特定培养基中先添加ROCK抑制剂并培养一时段以后，再移除所述ROCK抑制剂。
5.根据权利要求1所述的富潜能干细胞的扩增培养方法，其特征在于，在步骤(b)中进一步在所述特定培养基添加一喂养细胞；所述喂养细胞为小鼠胚胎纤维母细胞或人类包皮层纤维细胞。
6.根据权利要求1所述的富潜能干细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述多孔支架为对海藻酸钠水溶液以冷冻干燥法移除水分，经与氯化钙进行交联反应后，再利用乙醇进行脱水所制备而得。
7.根据权利要求1所述的富潜能干细胞的扩增培养方法，其特征在于，在步骤(b)之后进一步包含(b-1)细胞释放步骤：利用浓度为20-60mM的螯合剂将所述多孔支架溶解，进而释放出所述富潜能干细胞。
8.根据权利要求1所述的富潜能干细胞的扩增培养方法，其特征在于，扩增后的所述富潜能干细胞经聚集而呈现为胚胎小体的外观型态。
9.根据权利要求1所述的富潜能干细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述富潜能干细胞为胚胎干细胞或诱导性富潜能干细胞。
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