JP2021509393A - 粒子材料の製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、複数の中空無機ナノ粒子を製造する方法に関し、方法は、(a)第1モノマー及び第2モノマーを溶媒において接触して、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、(b)溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物に無機化合物前駆体を加えて、溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、(c)追加の量の第1及び第2モノマーを溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物に加えて、溶媒及び複数の複合ナノ粒子を含む組成物を製造し、並びに(d)複数の複合ナノ粒子を加熱して、複数の中空無機ナノ粒子を製造し、工程(a)において、第1モノマー及び第2モノマーは、少なくとも30℃の温度で溶媒に接触される。本発明は、また、複数の中空無機ナノ粒子及びその用途に関する。
Description
本発明は、複数の中空無機ナノ粒子の製造方法に関する。本発明は、また、複数の中空無機ナノ粒子、ナノ粒子を含む組成物及びこれらの組成物の用途に関する。
無機材料を含む中空ナノ粒子が、幅広い適用を有することが分かっている。国際公開第2015/089590(A1)号パンフレットは、シリカ小胞及び活性薬剤を送達するためのビヒクルとしてのそれらの使用を記載している。
粗メソポーラス中空シリカナノ粒子の製造方法が国際公開第2016/164987(A1)号パンフレットに記載されている。この方法は、ポリマーナノ粒子の最初の形成によって進められ、続いてシリカで被覆され、その後さらにポリマーが導入される。国際公開第2016/164987(A1)号パンフレットの方法は、焼成の後に冗長な方法を伴う。
中空無機ナノ粒子の製造についてより効率的な方法を提供することが望ましい。また、改善された形態及び/又は粒径分布を有するナノ粒子を製造する方法を提供することが望ましい。
本発明の発明者は、驚くべきことに、ポリマーナノ粒子の最初の形成が実施される温度を上昇することによって、複数の中空無機ナノ粒子の製造方法の効率が著しく改善することができることが分かった。この変化は、中空無機ナノ粒子を製造するのに要する時間を劇的に減少することができ、ナノ粒子の形態に負に影響しないことが分かった。また、驚くべきことに、改善された方法によって改善された表面形態を有するナノ粒子の製造を導くことができることが分かった。中空無機ナノ粒子の単分散性の増加も観察することができる。本発明の中空無機ナノ粒子は、治療に使用される場合アジュバント効果を有することも分かっている。
本発明は、複数の中空無機ナノ粒子の製造方法を提供し、方法は、(a)第1モノマー及び第2モノマーを溶媒において接触して、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、(b)無機化合物前駆体を溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物に加えて、溶媒及び複数の無機化合物が被覆されたポリマーナノ粒子を製造し、(c)追加の量の第1及び第2モノマーを、溶媒及び複数の複合ナノ粒子を含む無機化合物に被覆されたポリマーナノ粒子を加え、ならびに(d)複数の複合ナノ粒子を加熱して、複数の中空無機ナノ粒子を製造し、工程(a)において、第1モノマー及び第2モノマーは、少なくとも30℃の温度で溶媒において接触されることを含む。
本発明は、また、本発明に記載の方法によって得ることができる複数の中空無機ナノ粒子を提供する。
さらに、複数の中空無機ナノ粒子が本発明によって提供され、中空無機ナノ粒子のそれぞれは、無機化合物を含むシェル、無機化合物を含まないシェル内部の容量を含み、及びシェルの外部に配置され、無機化合物を含む複数の突起を含む。複数の中空無機ナノ粒子の粒径は、通常、100〜500nmである。中空無機ナノ粒子は、さらに、無機化合物に結合される複数の酸性基を含み得る。
本発明は、さらに、本発明に記載の複数の中空無機ナノ粒子及び活性薬剤を含む組成物を提供する。
また、ヒト又は動物の身体を治療するときに使用される本発明に記載の組成物が本発明によって提供される。
また、ヒト又は動物の身体を治療するときにアジュバントとして使用される本発明に記載の中空無機ナノ粒子が本発明によって提供される。
本発明は、また、ある場所の害虫を制御する方法を提供し、方法は、その場所を本発明に記載の組成物に暴露することを含む。
本発明は、複数の中空無機ナノ粒子を製造する方法を提供し、方法は、(a)第1モノマー及び第2モノマーを溶媒において接触して、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、(b)無機化合物前駆体を溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物に加えて、溶媒及び複数の無機化合物で被覆されるポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、(c)溶媒及び複数の無機化合物で被覆されるポリマーナノ粒子を含む組成物に追加の量の第1及び第2モノマーを加え、並びに(d)複数の複合ナノ粒子を加熱して、複数の中空無機ナノ粒子を製造し、工程(a)において、第1モノマー及び第2モノマーは、少なくとも30℃の温度で溶媒に接触されることを含む。
第1モノマー及び第2モノマーを接触することは、通常、第1及び第2モノマーが反応することを含む。例えば、第1モノマー及び第2モノマーは、両方とも溶媒に溶解することができる。
本発明の方法は、室温より高い温度で複数のポリマーナノ粒子を形成することを伴う。工程(a)の全体は、通常、少なくとも30℃の温度で実施される。第1モノマー及び第2モノマーは、通常、30℃〜70℃の温度で溶媒に接触される。好ましくは、第1及び第2モノマーは、通常、40.0℃〜50.0℃の温度で溶媒に接触され得る。例えば、温度は42.0℃〜48.0℃であってもよく、温度は約45℃であってもよい。
第1及び第2モノマーは、通常、たった4時間以下(すなわち240分以下)、少なくとも30℃の温度で接触され、その後、無機化合物前駆体を加える。通常、第1及び第2モノマーは、10分〜180分、例えば、30分〜150分間接触される。第1及び第2モノマーは、60分〜120分、例えば、80分〜100分間接触される。第1及び第2モノマーが特定の時間、溶媒に接触される場合、通常、工程(b)は特定の時間の後に開
始され、反応は、温度が特定の時間の後に低下され、又は反応は、(例えば、追加の量の溶媒を加えることによって)特定の時間の後停止される。
始され、反応は、温度が特定の時間の後に低下され、又は反応は、(例えば、追加の量の溶媒を加えることによって)特定の時間の後停止される。
例えば、第1及び第2モノマーは、溶媒並びに第1及び第2モノマーを含む組成物を30℃未満の温度に冷却する前に、40.0℃〜50.0℃の温度で、30分〜150分間接触することができる。
中空無機ナノ粒子は、中空であり(すなわち、材料を含まない中心の容量の周りに材料を含むシェルを含む)、(無機材料とも呼ぶことができる)無機化合物を含むナノ粒子である。無機化合物は、任意の適切な無機化合物であってもよい。例えば、無機化合物は酸化物であってもよい。無機化合物は通常、シリカ(すなわちSiO2)、チタニア(TiO2)又はアルミナ(A12O3)である。無機化合物は、好ましくはシリカであり、中空無機ナノ粒子は、好ましくは中空シリカナノ粒子である。「シリカ」という用語は、ケイ素の酸化物、通常は二酸化ケイ素を含むことが理解されるはずである。
中空無機ナノ粒子は、通常、中空無機ナノ粒子の総重量に対して、少なくとも70重量%の無機化合物を含む。例えば、中空無機ナノ粒子は、少なくとも90重量%の無機化合物又は少なくとも95重量%の無機化合物を含み得る。複数の中空無機ナノ粒子は、無機化合物から成り得る、又は本質的に成り得る。これらの重量パーセントは、活性薬剤を有する複数の中空無機ナノ粒子を充填する前である。
特定の成分から本質的に成る組成物は、特定の成分の機能に物質的に影響しない量(例えば0.5重量%未満)で、特定の成分及び任意のその他の成分を含む。
工程(a)は、例えば、第1モノマー及び第2モノマーを溶媒に混合することによって、溶媒に第1及び第2モノマーを接触することを含む。溶媒は、任意の適切な溶媒であってもよく、例えば、Stober工程(Stober等、Journal of Colloid and Interface Science.26(1):62−69;1968)を実施するのに適した溶媒であってもよい。溶媒は、極性溶媒を含んでもよい。極性溶媒は、水、アルコール若しくはカルボン酸等の極性プロトン性溶媒、又はケトン(例えば、アセトン)、ニトリル(例えば、アセトニトリル)、ハロアルカン(例えば、クロロメタン又はジクロロメタン)若しくはハロアレーン(例えばクロロベンゼン)等の極性非プロトン性溶媒であってもよい。通常、溶媒は、水及び/又はアルコールを含み、アルコールは、メタノール、エタノール、n−プロパノール又はイソプロパノールであってもよい。通常、溶媒は、エタノール及び水を含む。エタノールと水の容量比は通常、60:20〜80:5、例えば、約70:10である。
溶媒は、通常、塩基を含んでもよい(すなわち、溶媒は、溶媒として作用する不活液体及び触媒として作用する塩基を含む組成物であってもよい)。塩基は、通常、窒素、例えば、アンモニア、水酸化アンモニウム又はアルキルアミンを含む化合物である。溶媒は、通常、アンモニア又は水酸化アンモニウムを含む。溶媒は、28〜30容量%のアンモニア溶液の1.0〜10.0容量%を含み得る。
溶媒は好ましくは、水、アルコール及びアンモニアを含む。溶媒のpHは通常、少なくとも9.0、例えば、10.0〜12.0である。
複数のポリマーナノ粒子を形成するための第1及び第2モノマーの反応は、通常、第1及び第2モノマー並びに溶媒を含む組成物を攪拌することを含む。組成物は、50〜500rpm、例えば、200〜400rpmの速度で攪拌されてもよい。
第1及び第2モノマーは、複数のポリマーナノ粒子を形成するのに適した任意のモノマーであってもよい。第1モノマーは、通常、1つ以上のヒドロキシル基を含む化合物であり、第2モノマーは、通常、1つ以上のアルデヒド基を含む化合物である。より一般的には、第1モノマーはジオールであり、第2化合物はアルデヒドである。ジオールの例として、エタン−1,2−ジオール、プロパン−1,3−ジオール及びベンゼンジオールが挙げられる。例えば、第1モノマーは、式HO−Ar−OHの化合物であってもよく、第2モノマーは式HC(O)−R1の化合物であってもよく、Arは置換又は非置換アリール基であり、R1はH又は置換若しくは非置換C1−6アルキルである。
置換基は、Ci−6アルキル、ヒドロキシル、オキソ、ハロ、アミノ、ニトロ又はカルボキシレートから選択される1つ以上の置換基を含んでもよい。
C1−6アルキル基は、1〜6個の炭素原子の直鎖又は分岐鎖を含む飽和炭化水素ラジカルである。C1−6アルキルは、メチル、エチル、n−プロピル、イソ−プロピル、n−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ネオ−ペンチル及びヘキシルであってもよい。通常、R1はH又はメチルである。第1モノマーは、例えばホルムアルデヒド又はエタナールであってもよい。
Arは、置換又は非置換フェニル基であってもよい。例えば、Arはフェニル、メチルフェニル、ジメチルフェニル又はクロロフェニルであってもよい。第2モノマーは、ベンゼンジオール、例えば、レゾルシノール、カテコール又はヒドロキノンであってもよい。
好ましくは、第1モノマーはレゾルシノールであり、第2モノマーはホルムアルデヒドである。
第1モノマーは、あるいは、C1−6アルキルアミン、例えばメチルアミンであってもよい。
第1モノマーの濃度は、通常、1.0mM〜0.1Mであり、第2モノマーの濃度は、通常、1.0mM〜0.1Mである。例えば、第1モノマーの濃度は、0.01M〜0.03Mであってもよく、第2モノマーの濃度は、0.3〜0.05Mであってもよい。
溶媒中の第1モノマーの濃度(例えば、レゾルシノール)は、例えば、1.0mg/ml〜3.0mg/ml、又は1.2mg/ml〜2.0mg/mlであってもよい。例えば、レゾルシノールの0.1〜0.4gをそれぞれ80mlの溶媒に加えることができる。
溶媒中の第2モノマーの濃度(例えばホルムアルデヒド)は、例えば、溶媒の20〜50重量%の第2モノマー/mlを含む溶液の0.001〜0.005mlであってもよい。例えば、ホルムアルデヒドの37重量%の水溶液の0.1〜0.4mlをそれぞれ80mlの溶媒に加えることができる。
(第1モノマー):(第2モノマー)のモル比は、通常、3.0:1.0〜1.0:3.0、又は2.0:1.0〜1.0:2.0である。例えば、第1モノマー(例えば、レゾルシノール)のモル過剰があってもよく、(第1モノマー):(第2モノマー)のモル比は、2.0:1.0〜1.1:1.0であってもよい。
第1モノマー及び第2モノマーを接触することは、複数のポリマーナノ粒子、すなわち、第1モノマー及び第2モノマーの反応から生じるポリマーを含む複数のナノ粒子を製造する。ポリマーは、通常、第1及び第2モノマーのコポリマーである。ポリマーは、通常
、濃縮ポリマーである。例えば、ポリマーはポリエーテル、ポリエステル又はポリアミドであってもよい。ポリマーは、通常、(例えば、直線ポリマーと対照的な)架橋ポリマーである。好ましくは、ポリマーは、レゾルシノール−ホルムアルデヒドコポリマーを含む。
、濃縮ポリマーである。例えば、ポリマーはポリエーテル、ポリエステル又はポリアミドであってもよい。ポリマーは、通常、(例えば、直線ポリマーと対照的な)架橋ポリマーである。好ましくは、ポリマーは、レゾルシノール−ホルムアルデヒドコポリマーを含む。
複数のポリマーナノ粒子の平均粒径(例えば、平均粒径)は、通常、50〜500nm、例えば100〜300nmである。
本明細書の粒径の参照は、通常、動的光散乱法を使用して決定される粒径分布から測定される平均粒径に対する参照である。動的光散乱法は、例えば、Horiba SZ−100ナノ粒子アナライザーを使用して測定することができる。平均粒径は、Dv50値又はDn50値であってもよい。粒径は、通常、流体力学的径である。
平均粒径は、あるいは、走査型電子顕微鏡(SEM)によって測定することができる。例えば、平均粒径は、SEM画像の画像分析を使用して測定することができる。
無機化合物前駆体は、例えば、溶媒に溶解される場合、無機化合物を形成するのに適した化合物である。無機化合物前駆体は、通常、シリカ前駆体、チタニア前駆体又はアルミナ前駆体である。無機化合物前駆体は、好ましくは、シリカ前駆体である。
シリカ前駆体は、通常、加水分解してシリカを生成する化合物である。シリカ前駆体は、例えば、式Si(R2)x(OR3)yの化合物であってもよく、それぞれのR2及びR3は、独立してH、C1−6アルキル、アリール及びC2−6アルケニルから選択され、xは0、1又は2であり、yは2、3又は4である。x及びyの和は通常4である。それぞれのR2及びR3は、通常、独立して、C1−6アルキル、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソ−プロピル及びn−ブチルから選択される。
アリール基は、本明細書で使用される場合、環部分に6〜14個の炭素原子、通常6〜10個の炭素原子を含む単環式、二環式又は多環式芳香族環を指す。例として、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、アントレセニル及びピレニル基が挙げられる。C2−6アルケニル基は、本明細書で使用される場合、1つ以上の炭素−炭素単結合が炭素−炭素二重結合に置き換えられるC2−6アルキル基を指す。例として、エネニル、プロペニル及びブテニルが挙げられる。
無機化合物前駆体は、通常、テトラエチルオルトケイ酸塩(TEOS)、テトラメチルオルトケイ酸塩、テトラプロピルオルトケイ酸塩又はテトラブチルオルトケイ酸塩である。好ましくは、無機前駆体化合物は、テトラエチルオルトケイ酸塩である。
工程(b)において、無機化合物前駆体を溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物に加えた後に、無機化合物前駆体の濃度は、通常1.0mM〜0.1Mである。例えば、無機化合物前駆体の濃度は、0.01〜0.05Mである。無機化合物前駆体がシリカ前駆体、例えばTEOSである場合、シリカ前駆体化合物の濃度は、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物の0.002〜0.015ml/mlであってもよい。
本発明に記載の方法において、以下の試薬が工程(a):(i)0.1〜2.0gのレゾルシノール、好ましくは0.2〜0.7gのレゾルシノール、及び(ii)水中0.1〜3.0mLの37重量%のホルムアルデヒド、好ましくは水中0.5〜1.0mLの37重量%のホルムアルデヒドにおける391mlの溶媒あたりにつき使用することができる。工程(b)において、391mlの溶媒あたりの濃度は、1.0〜5.0mLのテトラメチルオルトケイ酸塩、例えば、2.0〜4.0mLのテトラメチルオルトケイ酸塩で
あってもよい。工程(c)において、以下の試薬:(i)0.2〜4.0gのレゾルシノール、好ましくは1.5〜2.0gのレゾルシノール、及び(ii)水中0.5〜6.0mLの37重量%のホルムアルデヒド、好ましくは2.0〜3.0mLの37重量%のホルムアルデヒドは、391mlの溶媒あたりにつき使用することができる。
あってもよい。工程(c)において、以下の試薬:(i)0.2〜4.0gのレゾルシノール、好ましくは1.5〜2.0gのレゾルシノール、及び(ii)水中0.5〜6.0mLの37重量%のホルムアルデヒド、好ましくは2.0〜3.0mLの37重量%のホルムアルデヒドは、391mlの溶媒あたりにつき使用することができる。
無機化合物前駆体を溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物に加えることは、溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物を製造する。それぞれの無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子は、通常、無機化合物を含むポリマー及びシェルを含むコアを含む。複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子の平均粒径は、通常、120〜400nmである。
複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子(例えば、シリカで被覆されたポリマーナノ粒子)を製造する工程(b)の条件は、Stober工程(Stober等、Journal of Colloid and Interface Science.26(1):62−69;1968)に必要とされる条件と同じであってもよい。
工程(a)は少なくとも30℃の温度で実施される。本発明の発明者は、この温度が無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子が製造される工程(b)の温度を制御するのに有利でもあることが分かった。特に、反応混合物(すなわち溶媒及びポリマーナノ粒子)を工程(a)と工程(b)との間で冷却することは利益であることが分かった。これにより粒径をより大きく制御することができる。工程(b)において温度を制御することは、また、中空無機ナノ粒子の所望の「先端の尖った」表面形態を導く。
通常、工程(b)は、30℃以下、例えば、10℃〜30℃の温度で実施される。温度は、18℃〜28℃であってもよい。
工程は、通常、工程(a)と工程(b)との間で、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物を冷却する工程をさらに含む。通常、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物は、0.5℃/分〜1.0℃/分の平均速度で冷却される。溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物は、通常、10分〜60分、例えば、20〜50分の時間、冷却される。例えば、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物は、40℃〜50℃の温度から10℃〜30℃の温度まで、20〜50分の時間で冷却されてもよい。
無機化合物前駆体を加えた後に、ポリマーナノ粒子を無機化合物で被覆することは、通常、1.0〜30分の時間進めることができる。この時間の経過後、工程(c)おいて、追加の量の第1及び第2モノマーの添加が開始される。追加の量の第1及び第2モノマーを添加した後、反応混合物は、第1及び第2モノマー並びに無機化合物前駆体を含む。結果として、ポリマー及び無機化合物は、無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子の上に同時に沈殿され、無機化合物のメソポーラス層の作製を導き、無機化合物のメソポアはポリマーで満たされる。「メソポーラス」という用語は、メソポア、すなわち、2nm〜50nmの幅(すなわち孔径)を有する孔を含む材料を指す。
工程(c)において、追加の量の第1及び第2モノマーを溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物に加えることは、通常、シリカ前駆体化合物を溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物に加える工程(b)の後に1〜30分で実施される。好ましくは、工程(c)は、工程(b)の後に2〜10分間実施される。
工程(c)は、通常、工程(b)と同じ温度で実施される。例えば、工程(c)において、溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物の温度は、通常、30℃以下、例えば、18℃〜28℃である。
通常、追加の量の第1及び第2モノマーを溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物を追加した後に、溶媒、複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子並びに第1及び第2モノマーを含む組成物中の第1モノマーの濃度は、2.0mM〜0.2Mであり、第2モノマーの濃度は、2.0mM〜0.2Mである。加えられる第1モノマー(例えば、レゾルシノール)の質量は、例えば、全体として反応混合物の容量に対して、1.5mg/ml〜6.0mg/ml又は2.0mg/ml〜4.0mg/mlであってもよい。加えられる第2モノマー(例えば、ホルムアルデヒド)の容量は、例えば、全体として反応混合物の第2モノマー/mlの20〜50重量%を含む0.02〜0.1mlの溶液であってもよい。例えば、0.2〜0.6gのレゾルシノールは、溶媒のそれぞれの80mlに加えることができ、37重量%のホルムアルデヒドの水溶液の0.2〜0.8mlは、溶媒のそれぞれの80mlに加えてもよい。
通常、追加の量の第1及び第2モノマーは、1.0〜4.0時間反応することができる。これは、無機化合物の外側のメソポーラス層が形成される時間である。無機化合物のメソポーラス層は、ポリマーを完全に除去した後に、粗の又は先端の尖っているように記載することができる表面を形成する。
工程(c)は複数の複合ナノ粒子の製造を導く。複合ナノ粒子は、通常、ポリマーを含むコア、無機化合物を含むシェル層、並びにポリマー及び無機化合物を含む外側層を含む。シェル層は、通常、ポリマーが除去されると、中空無機ナノ粒子の外側から内側に材料を移動することができるいくつかの孔を含む。
本発明の方法は、大規模に実施することができることが分かった。例えば、溶媒の合計容量は、少なくとも500mL又は少なくとも5Lであってもよい。工程(a)〜(c)は、少なくとも500mL又は少なくとも5Lの許容量を有する反応容器で実施されてもよい。反応容器は、Radley反応器であってもよい。
工程(d)は、複数の複合ナノ粒子を加熱して、ポリマー成分を除去し、それによって、複数の中空無機ナノ粒子を製造することを含む。通常、工程(d)は、ポリマーを複合ナノ粒子から取り除くのに適した温度で複数の複合ナノ粒子を加熱することを含む。
例えば、複数の複合ナノ粒子は、400℃〜700℃、又は500℃〜600℃の温度で加熱されてもよい。焼成工程の間のランプレート(すなわち工程(d)の加熱)は通常1℃/分〜20℃/分である。ランプレートは、中空無機ナノ粒子の表面形態に有害に影響することなく増加させることができることが分かった。ランプレートは、6℃/分〜15℃/分であってもよい。
ナノ粒子を加熱する(例えば焼成する)のに必要とされる時間は、以前に予想されるよりも少ないことが分かった。工程(d)は、通常、4.0時間未満の時間、複数の複合ナノ粒子を加熱することを含む。例えば、複数の複合ナノ粒子は、1.0〜3.0時間、又は90〜150分間加熱することができる。
工程(d)の前に、この方法は、通常、複数の複合ナノ粒子を分離することを含む。
これは、通常、溶媒及び複合ナノ粒子を含む組成物を、例えば、5〜20℃の温度で、1〜20分間、3000〜5000rpm遠心分離にかけることを含む。遠心分離の間、上清は、通常除去され、追加の溶媒(例えばエタノール)が加えられる。複数の複合ナノ粒子が分離されると、例えば、12〜48時間、室温で空気乾燥されてもよい。
中空無機ナノ粒子の合計収率は、通常、工程(a)〜(c)において使用される溶媒の1Lあたり1.0g以上であり、例えば、1.5g/L以上である。
複数の中空無機ナノ粒子は通常、複数のメソポーラス中空無機ナノ粒子である。中空無機ナノ粒子のそれぞれは、無機化合物を含むシェル、無機化合物を含まないシェル内部の容量を含み、及びシェルの外部に配置され、無機化合物を含む複数の突起を含む。
中空無機ナノ粒子は、通常、無機化合物を含む複数の突起を含む粗又は「先端の尖った」表面形態を有する。無機化合物の突起は、無機化合物を含むシェルから外側に伸長する無機化合物の容量である。突起は、通常、中空無機ナノ粒子の表面積を増加させる。シェルの表面の突起は、ナノ粒子のさらなる層を形成し、層は、無機化合物を含むメソポーラス層である。このメソポーラス層の厚み(すなわち、突起の長さ)は、通常、10nm〜200nm、例えば、50nm〜150nmである。無機化合物を含むメソポーラス層の多孔性は、通常、無機化合物を含むシェルに最も近いメソポーラス層の部分から、中空無機ナノ粒子の外面に最も近いメソポーラス層の部分までの移動を増加させる。
通常、中空無機ナノ粒子は、100nm〜600nm、例えば120nm〜400nmまたは150nm〜250nmの平均粒径を有する。シェルの内部の容量は、50nm〜500nm、例えば100〜300nmの平均直径を有する。無機化合物を含むシェルは、10nm〜200nmの平均厚さを有する。
中空無機ナノ粒子は、150nm〜250nmの平均粒径を有し、シェルの内部の容量は、50nm〜150nmの平均直径を有することができる。
中空無機ナノ粒子は、通常、活性薬剤を製剤化し、送達するのに有用である。方法は、適宜に、複数の中空無機ナノ粒子を薬剤で処理をして、薬剤を負荷した複数の中空無機ナノ粒子を製造する工程(e)をさらに含む。薬剤は、任意の適切な薬剤であってもよく、通常、例えば、疎水性活性薬剤である。中空無機ナノ粒子は、活性薬剤を細胞又は生物の特定の場所に輸送することを高めることができる。例えば、中空無機ナノ粒子は、細胞を通って輸送している間、核酸を保護することによって、細胞の核に核酸を輸送することを高めることができる。
複数の中空無機ナノ粒子を活性薬剤で処理する前に、中空無機ナノ粒子を電荷改質剤で処理することが望ましいことが多い。電荷改質剤は、通常、アミンポリマー、例えば、ポリアミンである。あるいは、電荷改質剤は、キトサンのアミノ基がトリアルキル化する、例えば、3つのC1−6アルキル基で、例えば、3つのメチル基(トリメチル化)でアルキル化されるキトサン又はその誘導体であってもよい。したがって、トリメチルキトサンを使用してもよい。キトサン及びその誘導体は、非ウイルス性遺伝子送達において以前から使用されている。
中空無機ナノ粒子の表面は、通常、負電荷されており、電荷改質剤は通常カチオン性ポリマーである。カチオン性ポリマーの使用は、中空ナノ粒子を核酸等の負電荷剤で負荷することができる。カチオン性ポリマーは、通常、ポリアミン、例えば、ポリエチルアミン(PEI)、ポリエチレンイミン又はポリエチレンイミンである。カチオン性ポリマーは、ポリペプチド、例えば、ポリアルギニン、ポリリジン又はポリヒスチジンであってもよい。カチオン性ポリマーは、ポリアミドアミン(PAMAM)であってもよい。
通常、電荷改質剤は、ポリエチレンイミンである。ポリエチレンイミンは、通常、分岐鎖ポリエチレンイミンである。ポリエチレンイミンは、直鎖ポリエチレンイミンであってもよい。ポリエチレンイミンは、5,000MW〜40,000MW、例えば、10,0
00MW〜25,000MWの分子量を有してもよい。ポリエチレンイミンは、通常、5,000MW〜15,000MW、例えば、約10,000MWの分子量を有し、分子量は、通常、重量平均分子量である。
00MW〜25,000MWの分子量を有してもよい。ポリエチレンイミンは、通常、5,000MW〜15,000MW、例えば、約10,000MWの分子量を有し、分子量は、通常、重量平均分子量である。
活性薬剤は、殺虫剤、除草剤、治療薬、ワクチン、トランスフェクション試薬、核酸又は染料であってもよい。殺虫剤は、例えば、スピノサドであってもよい。
治療薬は、核酸、例えば、核酸ワクチンであってもよい。核酸は、通常DNA(例えば、プラスミドDNA)又はRNA(例えば、mRNA、siRNA又はsRNA)である。そのため、核酸はDNAワクチン又はRNAワクチン(例えば、mRNAワクチン又はsiRNAワクチン)であってもよい。核酸は、例えば、オボアルブミンpDNA、オボアルブミンmRNA、HPV pDNA又はHPV mRNAであってもよい。核酸は、ルシフェラーゼをコードするRNA又はDNAであってもよい。薬剤が核酸である場合、中空無機ナノ粒子を核酸で処理することは、通常、緩衝化生理食塩水溶液で行われる。中空無機ナノ粒子を核酸で処置する前に、得られる組成物は、2〜10℃で、1〜10時間冷却されてもよい。
治療薬は、小分子、例えば、抗増殖化合物、抗菌化合物又は免疫治療化合物であってもよい。
治療薬は、タンパク質であってもよく、例えば、タンパク質を含むワクチンであってもよい。
中空無機ナノ粒子は、治療薬の活性を高めることができ、したがって、中空無機ナノ粒子はアジュバント効果を有することが分かった。例えば、中空無機粒子は、ワクチンの送達後、免疫応答を高めることによってアジュバントとして作用することができ、それによって、必要とされるワクチンの量が減少する。
前述の方法のように、中空無機ナノ粒子の表面は、通常、負に帯電させる。ナノ粒子の表面に酸性基を加える(通常、脱プロトン化される)酸性改質成分でナノ粒子を処理することによって、中空無機ナノ粒子の表面の負電荷を増強させることが望ましい場合があり、それによって、中空無機ナノ粒子の表面の負電荷を増加させる。これは、ポリエチレンイミン等のカチオン性電荷改質剤をナノ粒子の表面に結合することを改善することができる。「結合」は、共有結合及び非共有結合、例えば、イオン結合を含む。通常、電荷改質剤は、イオン相互作用又はファンデルワールス相互作用によって中空無機ナノ粒子の酸性改質された表面に結合する。
方法は、したがって、複数の中空無機ナノ粒子を(酸性リンカーとも呼ぶことができる)酸性改質成分で処理し、その後、複数の中空無機ナノ粒子を薬剤(例えば、電荷改質剤)で処理する工程を含んでもよい。
酸性改質成分は、通常、シリカより小さいpKa(例えば、4.5未満のpKa)を有する酸性基を含む。酸性基は、プロトン化又は脱プロトン化されてもよい。好ましくは、酸性基は、中空ナノ粒子の表面で負電荷を増加するため、脱プロトン化される。通常、酸性改質成分は、3.5以下のpKaとして有する酸性基を含む。例えば、酸性改質成分は、ホスホン酸塩基、リン酸基、硫酸基、カルボキシレート基、又はαα−ケトカルボン酸基(−C(O)−COO−)を含んでもよい。酸性改質成分はピルビン酸を含み得る。
酸性改質成分は、式S−R−Aの化合物であってもよく、Sがケイ素を含む基であり、Rが二価有機部分であり、Aが酸性基である。Sは通常、式−Si(alk)n(OH)
mで表される基であり、alkがC1−6アルキル基であり、nが0〜3であり、OHが0〜3である。例えば、Sは−Si(OH)3であってもよい。Rは通常、C1−6アルキレン基、例えば、−(CH2)P−であり、pが1〜6の整数である。Aは通常、ホスホン酸塩基(例えば、−0−P(Rp)(=0)0−であり、RpはH又はC1−6アルキル基)、リン酸基、硫酸基、カルボキシレート基、α−ケトカルボン酸基(−C(O)−COO−)である。Aは好ましくは、ホスホン酸塩基、例えば、メチルホスホン酸である。Aは、酸性基の塩の形態、例えば、メチルホスホン酸一ナトリウム又はピルビン酸一ナトリウムであってもよい。例えば、Sが、トリヒドロキシシリルであってもよく、Rが−(CH2)3−であってもよく、Aがホスホン酸塩基であってもよい。ケイ素含有基は、中空無機ナノ粒子の無機材料(例えば、シリカ)と反応することができ、酸性基を中空無機ナノ粒子に加えることができる。
mで表される基であり、alkがC1−6アルキル基であり、nが0〜3であり、OHが0〜3である。例えば、Sは−Si(OH)3であってもよい。Rは通常、C1−6アルキレン基、例えば、−(CH2)P−であり、pが1〜6の整数である。Aは通常、ホスホン酸塩基(例えば、−0−P(Rp)(=0)0−であり、RpはH又はC1−6アルキル基)、リン酸基、硫酸基、カルボキシレート基、α−ケトカルボン酸基(−C(O)−COO−)である。Aは好ましくは、ホスホン酸塩基、例えば、メチルホスホン酸である。Aは、酸性基の塩の形態、例えば、メチルホスホン酸一ナトリウム又はピルビン酸一ナトリウムであってもよい。例えば、Sが、トリヒドロキシシリルであってもよく、Rが−(CH2)3−であってもよく、Aがホスホン酸塩基であってもよい。ケイ素含有基は、中空無機ナノ粒子の無機材料(例えば、シリカ)と反応することができ、酸性基を中空無機ナノ粒子に加えることができる。
中空無機ナノ粒子は、通常、0.005g/mL〜0.1g/mLの濃度で、酸性改質剤で処理される。酸性改質剤と中空無機ナノ粒子との反応における温度は、通常、20〜50℃であり、例えば、35〜45℃である。反応時間が、通常1〜5時間である。
方法は、複数の中空無機ナノ粒子を薬剤で処理する前に、複数の中空無機ナノ粒子をホスホン酸塩リンカーで処理する工程を含んでもよい。この場合、酸性改質成分は、ホスホン酸塩酸性改質剤である。多くは、例えば、方法は、複数の中空無機ナノ粒子を電荷改質剤(例えば、ポリエチレンイミン)で処理する前に、複数の中空無機ナノ粒子をホスホン酸塩リンカーで処理する工程を含む。ホスホン酸塩リンカーは、通常、1,3−(トリヒドロキシシリル)プロピルメチルホスホン酸一ナトリウム塩(THPMP)である。
多くは、例えば、方法(すなわち、その工程(e))は、(el)中空無機ナノ粒子を電荷改質剤で処理し、及び(e2)中空無機ナノ粒子を活性薬剤で処理することを含む。方法、すなわち、その工程(e)は、例えば、(el)中空無機ナノ粒子を酸性改質成分で処理し、(e2)中空無機ナノ粒子を電荷改質剤で処理し、及び(e3)中空無機ナノ粒子を活性薬剤で処理することを含んでもよい。方法、すなわちその工程(e)は、例えば、(el)中空無機ナノ粒子をホスホン酸塩リンカーで処理し、(e2)中空無機ナノ粒子を電荷改質剤で処理し、及び(e3)中空無機ナノ粒子を活性薬剤で処理することを含んでもよい。中空無機ナノ粒子は、例えば、中空シリカナノ粒子であってもよい。ホスホン酸塩リンカーは、例えば、THPMPであってもよい。電荷改質剤は、例えば、さらに前に規定されるように、例えば、ポリアミン、例えば、PEI又はキトサン若しくはその誘導体であってもよい。活性薬剤は、また、さらに前に規定されるように、例えば、核酸、タンパク質又は小分子であってもよく、例えば、核酸(例えば、DNA又はRNA)ワクチン、又はタンパク質若しくはペプチドワクチンであってもよい。
中空無機ナノ粒子は、薬剤、例えば、電荷改質剤を素早く負荷することができることが分かった。複数の中空無機ナノ粒子は、したがって、薬剤、例えば、電荷改質剤で、60分未満又は15分未満、例えば、30分〜15分で処理することができる。例えば、ホスホン酸塩が結合される中空無機ナノ粒子は、1〜10分間、ポリエチレンイミンで処理されてもよい。多くは、しかしながら、少なくとも1時間、例えば、2〜10時間、中空無機ナノ粒子を電荷改質剤で処理することが好ましい。中空無機ナノ粒子は、電荷改質剤で20〜30℃の温度で処理することができる。
本発明は、また、本発明の記載の方法によって得られる複数の中空無機ナノ粒子を提供する。
本発明は、さらに、複数の中空無機ナノ粒子を提供し、中空無機ナノ粒子のそれぞれは、無機化合物を含むシェル、無機化合物を含まないシェル内部の容量を含み、及びシェル
の外部に配置され、無機化合物を含む複数の突起を含む。複数の中空無機ナノ粒子の粒径は、通常、100〜500nmである。中空無機ナノ粒子は、前述の記載の通りであってもよい。中空無機ナノ粒子は、通常、中空シリカナノ粒子である。
の外部に配置され、無機化合物を含む複数の突起を含む。複数の中空無機ナノ粒子の粒径は、通常、100〜500nmである。中空無機ナノ粒子は、前述の記載の通りであってもよい。中空無機ナノ粒子は、通常、中空シリカナノ粒子である。
本発明は、さらに、複数の中空無機ナノ粒子を提供し、中空無機ナノ粒子のそれぞれは、無機化合物を含むシェル、無機化合物を含まないシェル内部の容量を含み、及びシェルの外部に配置され、無機化合物を含む複数の突起を含み、中空無機ナノ粒子は、さらに、無機化合物に結合される複数の酸性基を含む。酸性基は通常、ホスホン酸塩基(例えば、(−0−P(Rp)(=0)O−であり、RpはH又はC1−6アルキル基)、リン酸基、硫酸基、カルボキシレート基、又はα−ケトカルボン酸基(−C(O)−COO−)である。酸性基は、例えば、メチルホスホン酸基であってもよい。表面に結合される酸性基を含む中空無機ナノ粒子は、前に規定される式S−R−Aの化合物で中空無機ナノ粒子を処理することによって得ることができる。酸性基は、通常、負に帯電させる。例えば、酸性基は塩の形態であってもよく、対イオンは、通常、ナトリウム等のアルカリ金属カチオンである。
前に検討されたように、無機ナノ粒子の表面にホスホン酸塩等の酸性基が存在することは、中空無機ナノ粒子の表面の負電荷を有利に増加し、順に、ポリエチレンイミン等の電荷改質剤をナノ粒子に結合することを改善することができる。
複数の中空無機ナノ粒子の平均粒径は、通常、150〜350nm、例えば160〜250nmである。複数の中空無機ナノ粒子の平均粒径は、160〜200nmであってもよい。粒径は、通常、前に検討されたように、動的光散乱法を使用して測定される。粒径は、SEM画像の画像分析によって測定することができる。
本発明に記載の複数の中空無機ナノ粒子は、かなり単分散性であり得る。通常、複数の中空無機ナノ粒子の多分散指数(PDI、分散指数としても知られる)は、0.3以下、0.15以下、0.1以下、又は0.05以下である。分散指数は、平方平均の比(すなわち、測定された直径の平方の平均値、d)及び測定された直径の単純平均の平方として計算することができる。分散指数の計算は、ISO規格文書13321:1996E及びISO22412:2008に規定され得る。
例えば、本発明に記載の又は本発明の方法によって製造される中空無機ナノ粒子は、約150〜200nmの平均粒径(例えば、SEMによって測定される場合)及び0.15以下の多分散指数を有することができる。中空無機ナノ粒子は、150〜250nmの平均粒径及び0.25以下の多分散指数を有することができる。
中空無機ナノ粒子は通常、大きい表面積を有する。例えば、複数の中空無機ナノ粒子は、少なくとも120cm2/g、例えば、少なくとも150cm2/gのBET表面積を有することができる。無機ナノ粒子は、少なくとも140cm2/gのBET表面積を有することができる。複数の中空無機ナノ粒子は、160〜250nmの平均粒径及び少なくとも120cm2/gのBET表面積を有することができる。
BET表面積は、例えば、ISO9277規格を使用して測定することができる。BET表面積は、窒素の吸収及び脱離に基づいて測定することができる。
本発明は、また、本発明に記載の複数の中空無機ナノ粒子及び薬剤を含む組成物を提供する。薬剤は、本明細書に規定される通りであってもよい。薬剤は、通常、例えば、ホスホン酸塩リンカーによって、中空無機ナノ粒子に結合され、これは、特に、薬剤がポリエチレンイミン等の電荷改質剤を含む場合である。ホスホン酸塩リンカーは、1,3−(ト
リヒドロキシシリル)プロピルメチルホスホン酸一ナトリウム塩(THPMP)であってもよい。
リヒドロキシシリル)プロピルメチルホスホン酸一ナトリウム塩(THPMP)であってもよい。
薬剤は、通常、疎水性活性薬剤である。例えば、薬剤は、殺虫剤、除草剤、治療薬、ワクチン、電荷改質剤、トランスフェクション試薬、DNAを含む薬剤又は染料であってもよい。
通常、薬剤は、ポリエチレンイミンである電荷改質剤である。ポリエチレンイミンは、通常、分岐鎖ポリエチレンイミンである。ポリエチレンイミンは、直鎖ポリエチレンイミンであってもよい。ポリエチレンイミンは、5,000MW〜40,000MW、例えば、10,000MW〜25,000MWの分子量を有してもよい。ポリエチレンイミンは、通常、5,000MW〜15,000MW、例えば、約10,000MWの分子量を有し、分子量は、通常、重量平均分子量である。
通常、複数の中空無機ナノ粒子は、少なくとも1.0重量%の電荷改質剤を含む。例えば、複数の中空無機ナノ粒子は、少なくとも2.0重量%又は少なくとも5.0重量%の電荷改質剤を含んでもよい。複数の中空無機ナノ粒子は、6.0〜15重量%の電荷改質剤、例えば、ポリエチレンイミンを含み得る。
複数の中空無機ナノ粒子は、ホスホン酸塩リンカー、例えば、THPMPで官能化されてもよい。
好ましくは、組成物は、電荷改質剤及び活性薬剤を含む。電荷改質剤は、通常、中空無機ナノ粒子に結合される。例えば、電荷改質剤は、ホスホン酸塩リンカー、例えば、THPMPによって中空無機ナノ粒子に結合されてもよい。電荷改質剤は、さらに本明細書に記載することができ、通常、アミンポリマー、例えば、ポリアミンである。あるいは、電荷改質剤は、キトサンのアミノ基がトリアルキル化される、例えば、3つのC1−6アルキル基で、例えば、3つのメチル基(トリメチル化)でアルキル化されるキトサン又はその誘導体であってもよい。したがって、トリメチルキトサンを使用してもよい。
キトサン及びその誘導体は、以前から非ウイルス性遺伝子送達において使用されている。電荷改質剤は、ポリヒスチジン、ポリリジン又はポリアルギニン等のポリペプチドであってもよい。
中空無機ナノ粒子の表面は、通常、負電荷されており、電荷改質剤は通常カチオン性ポリマーである。カチオン性ポリマーの使用は、中空ナノ粒子を核酸等の負電荷剤で負荷することができる。カチオン性ポリマーは、通常、ポリアミン、例えば、ポリエチルアミン(PEI)、ポリエチレンイミン又はポリエチレンイミンである。通常、電荷改質剤は、ポリエチレンイミンである。ポリエチレンイミンは、通常、分岐鎖ポリエチレンイミンである。ポリエチレンイミンは、通常、5,000MW〜15,000MW、例えば、約10,000MWの分子量を有し、分子量は、通常、重量平均分子量である。活性薬剤は、殺虫剤、除草剤、治療薬、ワクチン、トランスフェクション試薬、核酸又は染料であってもよい。殺虫剤は、例えば、スピノサドであってもよい。活性薬剤は、通常、例えば、静電気的に電荷改質剤に結合される(この例として、カチオン性ポリアミン、例えば、PEI、又はキトサン若しくはキトサンの誘導体に結合される負電荷された核酸)。したがって、治療薬は、核酸、例えば、核酸ワクチンであってもよい。核酸は、通常DNA(例えば、プラスミドDNA)又はRNA(例えば、mRNA、siRNA又はsRNA)である。そのため、核酸はDNAワクチン又はRNAワクチン(例えば、mRNAワクチン又はsiRNAワクチン)であってもよい。治療薬は、小分子、例えば、抗増殖化合物、抗菌化合物又は免疫治療化合物であってもよい。治療薬は、タンパク質であってもよく、例
えば、タンパク質を含むワクチンであってもよい。
えば、タンパク質を含むワクチンであってもよい。
中空無機ナノ粒子に対する活性薬剤(例えば、DNA又はRNA)の重量比は、通常、1:2〜1:100(活性薬剤:ナノ粒子)、例えば、1:5〜1:50、又は1:20〜1:50である。
好ましくは、組成物は、電荷改質剤及び核酸を含む。核酸は、通常DNA(例えば、プラスミドDNA)又はRNA(例えば、mRNA、siRNA又はsRNA)である。例えば、組成物は、ポリエチレンイミン(PEI)及び核酸、例えば、PEI及びプラスミドDNAを含んでもよい。
電荷改質剤、例えばPEIは、通常、ホスホン酸塩リンカー、例えば、1,3−(トリヒドロキシシリル)プロピルメチルホスホン酸一ナトリウム塩(THPMP)によって、中空無機ナノ粒子に結合される。THPMPによって中空無機ナノ粒子の表面に加えられるPEIとホスホン酸塩基との結合は、通常、イオン結合である。
本発明の組成物は、10μg/mL以上、又は40μg/mL以上、又は60μg/mL以上の濃度で、中空無機ナノ粒子を含んでもよい。
本発明の組成物は、概して、医薬組成物である。好ましい医薬組成物は、無菌でパイロジェンを含まない。本発明の組成物は、したがって、薬学的に許容される担体又は希釈剤をさらに含むことが多い。例えば、注射又は注入のための溶液は、担体として、例えば、無菌水を含んでもよく、又は例えば、無菌、水性、等張性生理食塩水溶液であってもよい。固体剤形は、他方で、活性化合物と共に、希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、ショ糖、セルロース、コーンスターチ又はジャガイモデンプン;潤滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、マグネシウム又はステアリン酸カルシウム及び/又はポリエチレングリコール;結合剤;例えば、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン;脱凝集剤、例えば、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩又はデンプングリコール酸ナトリウム;泡立ち混合物;染料:甘味料:レシチン、ポリソルベート、ラウリルサルフェート等の湿潤剤;並びに概して、医薬製剤に使用される非毒性及び薬理学的に不活性物質を含んでもよい。このような医薬調製物は、知られている方法で、例えば、混合、顆粒化、錠剤化、糖コーティング又はフィルムコーティング工程の方法によって、製造することができる。経口投与のための液体分散液は、シロップ、乳化剤及び懸濁液であってもよい。シロップは、担体として、例えば、ショ糖、又はグリセリン及び/又はマンニトール及び/又はソルビトールを有するショ糖を含んでもよい。懸濁液及び乳化剤は、担体として、例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルアルコールを含んでもよい。筋肉内注射のための懸濁液又は溶液は、活性化合物と共に、薬学的に許容される担体、例えば、無菌水、オリーブオイル、オレイン酸エチル、グリコール、例えば、プロピレングリコール、及び望まれる場合、適切な量のリドカイン塩酸塩を含んでもよい。
本発明は、また、ヒト又は動物の身体を治療法による治療に使用のための本明細書に記載の組成物を提供する。本願の明細書に係る治療は、疾患の軽減及び予防を含む。活性薬剤は、例えば、ワクチンであってもよく、組成物は、ワクチンを使用して、疾患に対する患者を免疫化することによって、患者の疾患を予防するために使用してもよい。
本発明は、また、治療を必要とする対象に、本明細書に記載の組成物を治療有効量で投与することを含む、疾患の治療方法を提供する。対象は、哺乳動物であってもよく、通常、ヒト対象である。再び、本明細書の「治療」という用語は、疾患を軽減し予防すること
を含む。組成物の活性薬剤は、例えば、ワクチンであってもよい。治療は、例えば、ワクチンを使用して疾患に対して対象を免疫化することによって、対象の疾患を予防することを含んでもよい。本発明の治療有効量の組成物は、対象に投与され、この量は、組成物に使用される特定の薬剤の活性、治療を受ける対象の年齢、体重及び病態、疾患の種類及び重症度並びに投与回数及び経路に従って、当業者によって容易に決定することができる。
を含む。組成物の活性薬剤は、例えば、ワクチンであってもよい。治療は、例えば、ワクチンを使用して疾患に対して対象を免疫化することによって、対象の疾患を予防することを含んでもよい。本発明の治療有効量の組成物は、対象に投与され、この量は、組成物に使用される特定の薬剤の活性、治療を受ける対象の年齢、体重及び病態、疾患の種類及び重症度並びに投与回数及び経路に従って、当業者によって容易に決定することができる。
ナノ粒子によって治療を行うことができる疾患として、癌、細菌感染、ウイルス感染及び免疫障害が挙げられる。治療は、例えば、免疫療法、例えば、免疫療法による癌の治療であってもよい。
本発明は、また、治療法によって、ヒト又は動物の身体を治療するときに、アジュバントとして使用される本発明に記載の複数の中空無機ナノ粒子を提供する。したがって、複数の中空無機ナノ粒子は、治療薬の効果を増加する方法に使用することができる。例えば、本発明は、治療薬を複数の中空無機ナノ粒子と共投与することによって、治療薬の効果を増加する方法を提供することができる。
治療薬は、通常、ワクチン、核酸又は化学療法薬である。複数の中空無機ナノ粒子は、したがって、ワクチンアジュバントとして作用することができる。複数の中空無機ナノ粒子は、ワクチンに対する免疫応答を増加させる方法に使用することができる。本発明は、アジュバント及びワクチン等の治療薬として、複数の中空無機ナノ粒子を含む組成物を提供することができる。複数の中空無機ナノ粒子は、活性薬剤がない場合に投与される場合、免疫応答を引き起こし得る。本発明は、したがって、免疫応答を引き起こす方法に使用ための複数の中空無機ナノ粒子を提供する。
複数の中空無機ナノ粒子は、癌、例えば、免疫療法による癌治療にアジュバントとして、使用することができる。複数の中空無機ナノ粒子は、化学療法薬を複数の中空無機ナノ粒子と共に共投与することによって、癌を治療する方法に使用することができる。
本発明は、また、核酸を細胞にトランスフェクトする方法を提供し、方法は、細胞を本発明に記載の組成物で処理することを含む。組成物は、複数の中空無機ナノ粒子及び核酸を含んでもよい。細胞は、ヒト又は非ヒト細胞であってもよい。細胞は、CT26、HCT116またはHEK293細胞株からの細胞であってもよい。核酸を細胞にトランスフェクトする方法は、例えば、記載の細胞株に、in vitroに実施することができる。本発明に記載の組成物は、あるいは、核酸をヒト又は動物の身体の細胞にトランスフェクトするために使用することができる。
本発明の中空無機ナノ粒子は、非常に成功して細胞をトランスフェクトするだけでなく、同時に、免疫系を「起こして」(すなわちアジュバントして作用する)、有利な免疫応答を刺激することが予想外に分かった。したがって、本発明は、また、核酸を細胞にトランスフェクトする方法を提供し、方法は、本発明に記載の組成物で細胞を処理することを含み、組成物は、複数の中空無機ナノ粒子及び核酸を含み、それによって、細胞を核酸でトランスフェクトし、免疫応答を刺激する。有利なこととして、これにより、活性薬剤を負荷されたSiNPを活性薬剤が送達するビヒクル(例えば、ワクチン)とアジュバントの両方として作用することができる。これは、アジュバントを含む単純化されたワクチン組成物になる。
本発明は、また、ある場所の害虫を制御する方法を提供し、方法は、ある場所を本明細書に記載の組成物に暴露することを含む。その場所は、通常、穀物又は植物である。害虫は、例えば、昆虫である。
本発明は、以下の実施例によってより詳細に記載される。
実施例1−中空シリカナノ粒子(SiNP)の合成
材料
材料
シリカナノ粒子の合成に使用される材料を、表1に示す。
方法
プロトコル:シリカナノ粒子の合成、100mLのスケール
以下のプロトコルは、以下に設定される実験の基本として使用された。このプロトコルでは、2つのモノマーが周囲温度で接触されることに留意されるべきである。
プロトコル:シリカナノ粒子の合成、100mLのスケール
以下のプロトコルは、以下に設定される実験の基本として使用された。このプロトコルでは、2つのモノマーが周囲温度で接触されることに留意されるべきである。
500mLのDuranボトルは、エタノール(70mL)、水(10mL)及び水酸化アンモニウム(3mL)で処理され、スターラーホットプレートに約350rpmで15分間、(蓋をして)攪拌された。レゾルシノール(0.2g)及びホルムアルデヒド(0.28mL)が加えられ、溶液は、周囲温度で、約350rpmで6時間、(蓋をして)攪拌された。テトラメチルオルトケイ酸塩(0.6mL)が加えられ、混合物は(蓋をして)6分間攪拌された。追加のレゾルシノール(0.4g)及びホルムアルデヒド(0.56mL)が加えられ、溶液は(蓋をして)さらに2時間攪拌された。
反応混合物は、2つの遠心分離管に移動し、4700RPMで、10℃で5分間、遠心分離が行われた。上清は除去され、新鮮なエタノールがそれぞれの管に加えられ、遠心分離が2x40mLのエタノールを使用して繰り返された。上清は、除去され、粗の試料はセラミック皿に移動した。エタノール(5mL)は、移動を補助するために使用された。粗の試料は、周囲温度で36時間乾燥された。最後に、試料は以下のように焼成された。開始温度:33℃、ランプ温度:2℃/分、目標温度:550℃、保持時間:2時間。最終的なシリカナノ粒子が白色又は灰白色の固体の形で得られた。
シリカナノ粒子の合成、500mL及び5Lのスケール
角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた500mL又は5LのいずれかのRadley反応器で反応が実施され、温度、pH及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。使用される手順は、「プロトコル:シリカナノ粒子の合成、100mLスケール」に記載され、試薬の量及び反応条件は、表2及び3に記載されるように計測され、変化された。
角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた500mL又は5LのいずれかのRadley反応器で反応が実施され、温度、pH及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。使用される手順は、「プロトコル:シリカナノ粒子の合成、100mLスケール」に記載され、試薬の量及び反応条件は、表2及び3に記載されるように計測され、変化された。
シリカナノ粒子の合成、10Lのスケール
角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた20LのRadley反応器で反応は実施され、温度、pH、伝導率、スターラーの速度及びトルクについての能力のデータはログされた。使用される手順は、「プロトコル:シリカナノ粒子の合成、100mLスケール」に記載され、したがって、試薬の量及び反応条件は、表2及び3に記載されるように計測され、変化された。10Lのスケールについて、反応付加安全基準は以下に記載の方法に適用された。
角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた20LのRadley反応器で反応は実施され、温度、pH、伝導率、スターラーの速度及びトルクについての能力のデータはログされた。使用される手順は、「プロトコル:シリカナノ粒子の合成、100mLスケール」に記載され、したがって、試薬の量及び反応条件は、表2及び3に記載されるように計測され、変化された。10Lのスケールについて、反応付加安全基準は以下に記載の方法に適用された。
可視吸収分光法を使用した溶液の濁度の分析
試料は定期的に採取され、1cmのパス長のセルのAvantes可視吸収分光測定計を使用して、200〜700nmで溶液の濁度について、希釈をせずに分析された。分析後、試料は、反応容器に戻された。
試料は定期的に採取され、1cmのパス長のセルのAvantes可視吸収分光測定計を使用して、200〜700nmで溶液の濁度について、希釈をせずに分析された。分析後、試料は、反応容器に戻された。
動的光散乱法を使用した粒径の分析
方法では、粒子の成長を観察するために、試料を定期的に採取し、希釈せずに分析した。粒径は、Horiba SZ−100ナノ粒子アナライザーを備える動的光散乱法を使用して測定された。分析後、試料は、反応容器に戻された。
方法では、粒子の成長を観察するために、試料を定期的に採取し、希釈せずに分析した。粒径は、Horiba SZ−100ナノ粒子アナライザーを備える動的光散乱法を使用して測定された。分析後、試料は、反応容器に戻された。
走査型電子顕微鏡
走査型電子顕微鏡、Hitachi SU8230を使用して、全てのバッチを画像化した。走査型電子顕微鏡を使用する場合、画像化する前に、粒子は最初に20nmのクロム層で被覆された。しかしながら、帯電を防ぐために低電圧で実行されて被覆されていない粒子の後の分析は、表面モルフォロジーのより代表的な指標を提供した。
走査型電子顕微鏡、Hitachi SU8230を使用して、全てのバッチを画像化した。走査型電子顕微鏡を使用する場合、画像化する前に、粒子は最初に20nmのクロム層で被覆された。しかしながら、帯電を防ぐために低電圧で実行されて被覆されていない粒子の後の分析は、表面モルフォロジーのより代表的な指標を提供した。
熱重量測定分析を使用したシリカナノ粒子の調製の分析
熱重量測定分析を使用して、シリカナノ粒子の例示的なバッチから質量損失を研究した。周囲温度から550℃(空気中)まで2℃/分のランプレートを使用し、次に550℃で5時間保持した。焼成工程の変化例も以下に記載されるように研究された。
熱重量測定分析を使用して、シリカナノ粒子の例示的なバッチから質量損失を研究した。周囲温度から550℃(空気中)まで2℃/分のランプレートを使用し、次に550℃で5時間保持した。焼成工程の変化例も以下に記載されるように研究された。
結果及び検討
SiNP001及びSiNP002(参照例)
2つの調製を100mLのスケールで実施し、330nmのSiNP粒径を目標にした。両方の反応をモニタリングし、工程の全体にわたって画像化した。合成SiNP00lの間に、可視吸収分光測定計を使用して濁度の測定も実施し、濁度の増加は視覚的観察と良好に相関した。
SiNP001及びSiNP002(参照例)
2つの調製を100mLのスケールで実施し、330nmのSiNP粒径を目標にした。両方の反応をモニタリングし、工程の全体にわたって画像化した。合成SiNP00lの間に、可視吸収分光測定計を使用して濁度の測定も実施し、濁度の増加は視覚的観察と良好に相関した。
走査型電子顕微鏡を使用して、クロム被覆された粒子とクロム被覆されていない粒子の両方を画像化した。被覆されていない粒子の画像化は、荷電を防ぐために低電圧で、表面モルフォロジーのより良好な代表例を提供する。クロム層の適用は、表面構造のマスキングを導く可能性があり、粒径の誤った増加が多くの場合、粒子の凝集作用を導く。SiNP00l及びSiNP002調製で生成された粒子の画像を、それぞれ図1及び図2に示す。
調製SiNP00l及びSiNP002で生成される粒子は、それぞれ、242nm及び300nmの平均粒径を有する。表面モルフォロジーは、両方の場合、先端が尖っている。
調製SiNP002における先行技術の合成の複製が成功した後に、Radley反応器を使用して反応が500mLまでスケールアップされた。スケールの他に、Radleyのセットアップは、スターラーホットプレートの準備を上回るいくつかの利点を提供し、温度及び攪拌速度の正確な制御、並びに工程条件(攪拌速度、温度及びpH)をモニタリングする能力を含む。いくつかの合成は、現在まで実施され、以下に要約される。それぞれの合成の結果は、以下の節に詳細に検討される。
SINP003−180nmの目標粒径、終始25℃、350rpmの攪拌速度(参照例)
現在の作業のプログラムの目標粒径は180nmであり、したがって、第1のスケールアップされた調製は、この面積の粒径を目標とした。反応のモニタリングは、反応温度、pH及び攪拌速度の一貫性を図3に示した。
現在の作業のプログラムの目標粒径は180nmであり、したがって、第1のスケールアップされた調製は、この面積の粒径を目標とした。反応のモニタリングは、反応温度、pH及び攪拌速度の一貫性を図3に示した。
反応混合物の試料の合成過程の間、反応混合物の粒径の分析は、動的光散乱法を使用して行われた。図4は、約4時間後に、定常の約200nmの粒径の展開を示し、続いてシリカシェルを加えたときに、粒径は急速に増加したことを示す。しかしながら、最終の焼成されたSiNPのSEM画像は、技術の間で粒径の差を示す。この差は、シリカシェルを加えると、粒子の屈折率の変化に起因し得、DLSを使用して、粒径の異常に高い値を導く。被覆された及び被覆されていない粒子の画像を、図5に示す。粒子のいくらかの凝集作用が観察され、表面トポロジーを決定するのは困難である。調製SiNP003は、レゾルシノールホルムアルデヒドコアの合成の間に、レゾルシノールの用量より僅かに低くなり、このことは、望まれる180nmに対して得られる予想される平均粒径(168nm)よりも僅かに小さいことを説明し得る。このレゾルシノールの目標重量からの小さな偏差は、この小規模なスケールでより明白になる可能性のある粒径に影響を有し、スケールが増加するにつれて、それほど重要ではなくなる。粒径及び観察される凝集作用にも影響を有する可能性のあるその他の要因は、攪拌速度及び種類である。プロペラ刃を使用する攪拌は、概して、磁気スターラーよりもかなり良好な混合をもたらし、したがって、より少ない試薬及び粒子の衝突を生じるよりゆっくりとした攪拌速度によって、より小さい粒径が好まれ得る。
SINP004−180nmの目標粒径、終始35℃、350rpmの攪拌速度(参照例)
180nmのSiNPの合成に必要とされる時間を短縮するために、SiNPの合成の温度を25から35℃に増加した。レゾルシノールは、RF(レゾルシノール−ホルムアルデヒド)コアの形成の間、僅かに過量であった。反応温度を増加した結果は2倍である。最初に得られた粒子は、かなり大きく(平均粒径367nm)であり、粒子のコアとシェルの両方の形成において、より速い反応速度論から生じる可能性がある。粒子の分布は、また二峰性であり、より小さい粒子は、シリカをRFコアに望ましく加えることの他に、シリカの自己縮合に起因して、図6における先端の尖った構造を生成する可能性がある。しかしながら、粒子の表面モルフォロジーは、以前の調製よりも「先端が尖っている」ように見え、このことはコアについてより高い温度の使用を示唆するが、シェルを形成する見込みがない。
180nmのSiNPの合成に必要とされる時間を短縮するために、SiNPの合成の温度を25から35℃に増加した。レゾルシノールは、RF(レゾルシノール−ホルムアルデヒド)コアの形成の間、僅かに過量であった。反応温度を増加した結果は2倍である。最初に得られた粒子は、かなり大きく(平均粒径367nm)であり、粒子のコアとシェルの両方の形成において、より速い反応速度論から生じる可能性がある。粒子の分布は、また二峰性であり、より小さい粒子は、シリカをRFコアに望ましく加えることの他に、シリカの自己縮合に起因して、図6における先端の尖った構造を生成する可能性がある。しかしながら、粒子の表面モルフォロジーは、以前の調製よりも「先端が尖っている」ように見え、このことはコアについてより高い温度の使用を示唆するが、シェルを形成する見込みがない。
さらに、TGAを使用した焼成の工程が観察された。図7において、550℃で保持したときに有意な質量損失は観察されなかった。さらに、粒子の焼成が、14時間実施され、短縮された焼成レジームと比較された(550℃までランプして2時間保持する)。表面モルフォロジーに明らかな差は観察されず、したがって、焼成レジームの持続時間は、粒子の形態に有害に影響することなく、短縮することができた(図8)。
SiNP005−180nmの目標粒径、35℃のRFコアの重合、25℃のシェル形成、350rpmの攪拌速度
SiNP004に観察される二峰性粒径分布は、中空の先端の尖ったナノ粒子の他に、固体のシリカナノ球体の形成から生じると考えられる。望ましくないシリカ粒子の形成を回避するために、35℃の重合温度を使用して調製が実施されて、粒子コアを形成し、その後、低温(25℃)で、先端の尖ったシリカシェルを形成した。レゾルシノールは、RFコアの形成の間、僅かに過量であった。
SiNP004に観察される二峰性粒径分布は、中空の先端の尖ったナノ粒子の他に、固体のシリカナノ球体の形成から生じると考えられる。望ましくないシリカ粒子の形成を回避するために、35℃の重合温度を使用して調製が実施されて、粒子コアを形成し、その後、低温(25℃)で、先端の尖ったシリカシェルを形成した。レゾルシノールは、RFコアの形成の間、僅かに過量であった。
結果として得られる焼成された粒子のSEM画像を図9に示す。シェルの形成の間に温度を低下することによって、336nmの平均粒径を有する単頂性粒径分布が生じる。この結果は、コアの形成の間に重合温度を増加することが、粒径分布又は表面モルフォロジーに有害に影響しないことを確認している。しかしながら、TEOSを加える前に25℃に冷却することは、特に固体のシリカ粒子の形成といった副反応を排除することを補助する。予想される粒径よりも大きいことは、コアの形成の間、より速い重合動力学に起因し得る。この工程の間に重合時間を短縮することは、粒径を減少させるはずである。レゾルシノールの僅かな過量が粒径の増加にさらに起因する可能性もある。
SiNP005V2−180nmの目標粒径、35℃のRFコアの重合、25℃のシェル形成、350rpmの攪拌速度
SiNP005合成の繰り返しがより少ない量のレゾルシノールを使用して実施されて、コア重合温度からの試薬濃度の効果を分離した。図10において、焼成された粒子のSEM画像は、調製SiNP005の間に生成される粒子に比べて、約80nmの平均粒径の減少を示し(336から258nmに減少する)、これはSiNP粒径が合成の間、試薬濃度に感受性であることを示唆する。粒径は、所望の180nmよりも依然として大きい。しかしながら、コアにおけるより速い重合動力学に起因する可能性があり、コア重合時間の短縮によって、調整されることが予想される。
SiNP005合成の繰り返しがより少ない量のレゾルシノールを使用して実施されて、コア重合温度からの試薬濃度の効果を分離した。図10において、焼成された粒子のSEM画像は、調製SiNP005の間に生成される粒子に比べて、約80nmの平均粒径の減少を示し(336から258nmに減少する)、これはSiNP粒径が合成の間、試薬濃度に感受性であることを示唆する。粒径は、所望の180nmよりも依然として大きい。しかしながら、コアにおけるより速い重合動力学に起因する可能性があり、コア重合時間の短縮によって、調整されることが予想される。
SiNP006−180nmの目標粒径、45℃のRFコアの重合、25℃のシェル形成、350rpmの攪拌速度
さらに重合時間を短縮するために、レゾルシノールホルムアルデヒドのコアの重合が45℃で実施され、次に、TEOSを加える前に、反応温度を25℃まで低下させた。類似の35/25℃の調製(SiNP0005II)に比べて、溶液の濁度のより早期の開始によって証明されるように、重合はより速い速度で生じた。図11において、得られる焼
成粒子のSEM画像は、電導性被覆材がない状態で、257nmの平均粒径を示す。粒子の表面構造が以前の実験よりも「先端が尖っている」ように見え、重合温度が増加し得る。予想される粒径よりも大きいことは、反応温度の増加によって説明することができ、コアの形成の間の反応時間を短縮することは、粒径の減少をもたらし得る。
さらに重合時間を短縮するために、レゾルシノールホルムアルデヒドのコアの重合が45℃で実施され、次に、TEOSを加える前に、反応温度を25℃まで低下させた。類似の35/25℃の調製(SiNP0005II)に比べて、溶液の濁度のより早期の開始によって証明されるように、重合はより速い速度で生じた。図11において、得られる焼
成粒子のSEM画像は、電導性被覆材がない状態で、257nmの平均粒径を示す。粒子の表面構造が以前の実験よりも「先端が尖っている」ように見え、重合温度が増加し得る。予想される粒径よりも大きいことは、反応温度の増加によって説明することができ、コアの形成の間の反応時間を短縮することは、粒径の減少をもたらし得る。
SiNP006II−180nmの目標粒径、45℃のRFコア重合、25℃のシェルの形成、350rpmの攪拌速度、短縮されるコア重合時間
反応時間の粒径に対する効果を発見するために、SiNP006調製の繰り返しが実施され、45℃の重合時間は約90分に減少された。SiNP006と一致して、反応温度は、その後、TEOSを加える前に、25℃に低下した。焼成粒子のSEM画像は、電導性被覆材がない状態で、260nmの平均粒径を示し、SiNP006において調製された粒子と一致した。図12において、表面構造もSiNP006で調製された粒子と一致し、以前の実験よりも「先端がとがっている」。
反応時間の粒径に対する効果を発見するために、SiNP006調製の繰り返しが実施され、45℃の重合時間は約90分に減少された。SiNP006と一致して、反応温度は、その後、TEOSを加える前に、25℃に低下した。焼成粒子のSEM画像は、電導性被覆材がない状態で、260nmの平均粒径を示し、SiNP006において調製された粒子と一致した。図12において、表面構造もSiNP006で調製された粒子と一致し、以前の実験よりも「先端がとがっている」。
SiNP006III−180nmの目標粒径、45℃のRFコア重合、25℃のシェル形成、250rpmの攪拌速度、短縮されるコア重合時間
SiNP006のさらなる繰り返しが実施され、攪拌速度が350rpmから250rpmに減少した。被覆されていない粒子のSEM画像、平均粒径248nmを、図13に示す。粒径と表面モルフォロジーの両方は、以前のSiNP006の合成と一致し、減少した攪拌速度は、有意差を生じない。
SiNP006のさらなる繰り返しが実施され、攪拌速度が350rpmから250rpmに減少した。被覆されていない粒子のSEM画像、平均粒径248nmを、図13に示す。粒径と表面モルフォロジーの両方は、以前のSiNP006の合成と一致し、減少した攪拌速度は、有意差を生じない。
SiNP006IV−180nmの目標粒径、45℃のRFコア重合、25℃のシェル形成、350rpmの攪拌速度、さらに短縮されるコア重合時間
コアの重合のための反応時間を90分から60分に短縮する効果を示す画像は、図14に示される。平均粒径は、248nmであると決定され、SiNP006IIIについて得られた平均粒径と同一であった。粒子は、目標の180nmより大きい。続く実験は、そのため、全体的な粒径及び形態への効果を評価するために、ポリマーコアの形成の間のモノマーの濃度を減少することに焦点を置いた。
コアの重合のための反応時間を90分から60分に短縮する効果を示す画像は、図14に示される。平均粒径は、248nmであると決定され、SiNP006IIIについて得られた平均粒径と同一であった。粒子は、目標の180nmより大きい。続く実験は、そのため、全体的な粒径及び形態への効果を評価するために、ポリマーコアの形成の間のモノマーの濃度を減少することに焦点を置いた。
SiNP0007−180nmの目標粒径45℃のRFコアの重合、25℃のシェル形成、350rpmの攪拌速度、減少した試薬の濃度
この実験において、ポリマーコアの調製に使用されるレゾルシノール及びホルムアルデヒドモノマーの濃度は、25%に減少した。図15に示されるように、平均粒径は、188nmに減少した。また、この平均粒径は、粒子の表面モルフォロジーに有害に影響することなく達成された。画像を注意深く検証すると、また、この段階において、これが測定の人工産物であるかどうか分からないが、少量の粒子凝集作用を示した。粒子が緩衝水性溶液に分散されるさらなる作業は、粒子が真に凝集されるかどうかを確立するための情報となり得る。
この実験において、ポリマーコアの調製に使用されるレゾルシノール及びホルムアルデヒドモノマーの濃度は、25%に減少した。図15に示されるように、平均粒径は、188nmに減少した。また、この平均粒径は、粒子の表面モルフォロジーに有害に影響することなく達成された。画像を注意深く検証すると、また、この段階において、これが測定の人工産物であるかどうか分からないが、少量の粒子凝集作用を示した。粒子が緩衝水性溶液に分散されるさらなる作業は、粒子が真に凝集されるかどうかを確立するための情報となり得る。
SiNP0007II−180nmの目標粒径45℃のRFコアの重合、25℃のシェル形成、350rpmの攪拌速度、減少した試薬の濃度、冷却の間の延長時間
粒径及び形態に及ぼす冷却の効果を探るために、冷却時間が30分間延長されたSiNP0007の繰り返しを実施した。図16において、被覆されていない粒子のSEM画像は、205nmの平均粒径を示す。予想されるように、粒径は、反応時間がより長くなることにより増加される。しかしながら、所望の「先端の尖った」表面モルフォロジーは、延長された冷却時間がこの工程に組み込まれる場合、依然として達成することができる。
粒径及び形態に及ぼす冷却の効果を探るために、冷却時間が30分間延長されたSiNP0007の繰り返しを実施した。図16において、被覆されていない粒子のSEM画像は、205nmの平均粒径を示す。予想されるように、粒径は、反応時間がより長くなることにより増加される。しかしながら、所望の「先端の尖った」表面モルフォロジーは、延長された冷却時間がこの工程に組み込まれる場合、依然として達成することができる。
SiNP0007V−180nmの目標粒径45℃のRFコアの重合、25℃のシェル形成、350rpmの攪拌速度、減少した試薬の濃度
図17において、SiNP0007の最終調製が実施され、189nmの平均粒径、及
び正確な表面モルフォロジーとなった。正確な大きさ及び形態の粒子は、500mLのスケールで調製することができ、次の節に示されるように、また、DNA負荷及びトランスフェクションの優れた能力を提供する。スケーリングにおいて、試薬の濃度の変化例によって存在する任意の変化例は、課題をかなり少なくすることが予想され、5Lのスケールでは、工程は再現することができ、粒子はかなり一貫している。
図17において、SiNP0007の最終調製が実施され、189nmの平均粒径、及
び正確な表面モルフォロジーとなった。正確な大きさ及び形態の粒子は、500mLのスケールで調製することができ、次の節に示されるように、また、DNA負荷及びトランスフェクションの優れた能力を提供する。スケーリングにおいて、試薬の濃度の変化例によって存在する任意の変化例は、課題をかなり少なくすることが予想され、5Lのスケールでは、工程は再現することができ、粒子はかなり一貫している。
ナノ粒子の特徴化
一連の粒子について、走査型電子顕微鏡、TEMによって試験を行った。粒径及び表面モルフォロジーは、図18において、実施されるSEM分析と一致している。粒子は、また、所望の中空構造を示す。
一連の粒子について、走査型電子顕微鏡、TEMによって試験を行った。粒径及び表面モルフォロジーは、図18において、実施されるSEM分析と一致している。粒子は、また、所望の中空構造を示す。
特徴化のデータに基づいて、本発明の方法によって調製される180nmのシリカナノ粒子が正確なサイズ及び形態であり、目的に適合し、この方法を5Lのスケールアップに進めるべきである。
5Lのスケールにおける方法の展開
正確な表面モルフォロジー及びトランスフェクションの有効性で、180nmの粒子の合成を成功に実証した後、方法は、Radley反応器を使用して5Lにスケールされた。いくつかの合成が現在まで実施されており、表2及び3に要約される。それぞれの合成の結果は、以下の節に詳細に検討される。
正確な表面モルフォロジー及びトランスフェクションの有効性で、180nmの粒子の合成を成功に実証した後、方法は、Radley反応器を使用して5Lにスケールされた。いくつかの合成が現在まで実施されており、表2及び3に要約される。それぞれの合成の結果は、以下の節に詳細に検討される。
SiNP0008−180nmの目標粒径45℃のRFコアの重合、25℃のシェル形成、250rpmの攪拌速度
この実験において、反応条件は、表2において、したがって、試薬のスケールの量と共に実験SiNP0007について保持された。容量の増加によって、攪拌速度は350〜250rpmに減少され、SiNP006IIIの結果に基づいて、攪拌速度の減少は、粒径又は形態に有害に影響しないことを示した。
この実験において、反応条件は、表2において、したがって、試薬のスケールの量と共に実験SiNP0007について保持された。容量の増加によって、攪拌速度は350〜250rpmに減少され、SiNP006IIIの結果に基づいて、攪拌速度の減少は、粒径又は形態に有害に影響しないことを示した。
被覆されていない粒子のSEM画像を、図19に示す。粒子は、かなり単分散性(PDI0.11)に見え、平均粒径は183nmであり、表面モルフォロジーは、まさに必要とされる通りであり、スケールアップの成功を示す。
SiNP0008II−180nmの目標粒径45℃のRFコアの重合、25℃のシェル形成、250rpmの攪拌速度
再現性を確認するために、同一条件下で実験SiNP0008が繰り返された。被覆されていない粒子のSEM画像化は、図20において、184nmの平均粒径、単頂性粒子分布(PDI0.10)、及び所望の表面モルフォロジーを示し、この方法が5Lのスケールで非常に再現可能であることを示す。
再現性を確認するために、同一条件下で実験SiNP0008が繰り返された。被覆されていない粒子のSEM画像化は、図20において、184nmの平均粒径、単頂性粒子分布(PDI0.10)、及び所望の表面モルフォロジーを示し、この方法が5Lのスケールで非常に再現可能であることを示す。
形態に及ぼす焼成ランプレートの効果
この実験の目的は、焼成工程に必要とされる時間を潜在的に短縮するために、表面モルフォロジーに対する焼成工程の異なるランプレートの効果を調査するためであった。この実験において、SNP0008II粗産物が使用された。被覆されていない粒子のSEM画像化は、図21において、それぞれ5℃/分では183nm、10℃/分では186nmの平均粒径を示す。シリカ粒子は「先端が尖っている」ように見え、しかしながらSiNP0008IIと比較すると、「先端が尖っている」様子はそれほど規定されず、いくらかの凝集作用が観察された。同一条件下の熱重量測定分析は、図22において、SiNP0008IIについて得られる重量の損失が同様であり、ランプレートを変化させることによって影響を受けない。
この実験の目的は、焼成工程に必要とされる時間を潜在的に短縮するために、表面モルフォロジーに対する焼成工程の異なるランプレートの効果を調査するためであった。この実験において、SNP0008II粗産物が使用された。被覆されていない粒子のSEM画像化は、図21において、それぞれ5℃/分では183nm、10℃/分では186nmの平均粒径を示す。シリカ粒子は「先端が尖っている」ように見え、しかしながらSiNP0008IIと比較すると、「先端が尖っている」様子はそれほど規定されず、いくらかの凝集作用が観察された。同一条件下の熱重量測定分析は、図22において、SiNP0008IIについて得られる重量の損失が同様であり、ランプレートを変化させることによって影響を受けない。
180nmに近い粒子を目標とする方法の開発
180nmの粒子の合成の成功の後、同様のシリカナノ粒子を目標とするために、方法に対する僅かな修正が試行された。いくつかの合成が実施され、以下の節にその結果を詳述する。
180nmの粒子の合成の成功の後、同様のシリカナノ粒子を目標とするために、方法に対する僅かな修正が試行された。いくつかの合成が実施され、以下の節にその結果を詳述する。
SiNP009−130nmの目標粒径45℃のRFコアの重合、25℃のシェル形成、350rpmの攪拌速度
実験の目的は、130nmのシリカナノ粒子を合成することであった。この実験では、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量は、52%まで減少され、その他の全ての反応条件は実験SiNP0007について保持された。図23は、135nmの平均粒径の負荷されていないSiNPを図示した。凝集作用が観察されるが、先端の尖った表面モルフォロジーは維持される。
実験の目的は、130nmのシリカナノ粒子を合成することであった。この実験では、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量は、52%まで減少され、その他の全ての反応条件は実験SiNP0007について保持された。図23は、135nmの平均粒径の負荷されていないSiNPを図示した。凝集作用が観察されるが、先端の尖った表面モルフォロジーは維持される。
さらに、ポリマーコアの形成に必要とされる時間は85から175分に増加した。この時間の増加は、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの濃度の減少、及びしたがって粒子の衝突、重合反応の速度の減少に起因する。
SiNP009II−130nmの目標粒径45℃のRFコア重合、25℃のシェルの形成、350rpmの攪拌速度、短縮される重合成長時間
この実験の目的は、ポリマーの成長時間の減少が130nmの粒子の合成の利益になるかどうかを検証することであった。図24において、被覆されていない粒子のSEM画像は、所望の「先端の尖った」表面モルフォロジーを有する162nmの平均粒径を示す。粒径は、二峰性分布を示し、粒子の凝集作用が観察される。
この実験の目的は、ポリマーの成長時間の減少が130nmの粒子の合成の利益になるかどうかを検証することであった。図24において、被覆されていない粒子のSEM画像は、所望の「先端の尖った」表面モルフォロジーを有する162nmの平均粒径を示す。粒径は、二峰性分布を示し、粒子の凝集作用が観察される。
SiNP0009III−さらなるポリマーの成長時間の減少によるSNP0009の繰り返し(RFコアの形成のみ)
この実験では、ポリマー成長時間は、45℃で200分(SiNP0009II)から120分に減少され、TEOSの添加の前に停止した。重合は、約120分で生じた。得られる被覆されていない粒子のSEM画像を図25に示す。レゾルシノールホルムアルデヒド粒子は、95nmの平均サイズを有する。
この実験では、ポリマー成長時間は、45℃で200分(SiNP0009II)から120分に減少され、TEOSの添加の前に停止した。重合は、約120分で生じた。得られる被覆されていない粒子のSEM画像を図25に示す。レゾルシノールホルムアルデヒド粒子は、95nmの平均サイズを有する。
SiNP0009IV−500mLのRadley反応器(150nmの粒子のレシピ、45℃のRFコア重合のみ、R&Fにおける16%までの減少)
実験の目的は、150nmのナノ粒子を合成することであった。レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量は、SiNP0007に比べて16%減少し、重合反応は、45℃で105分間実施された。重合及び次の沈殿は、約125分で生じた。得られる被覆されていないRF粒子のSEM画像を図26に示す。RF粒子は170nmの平均サイズを有する。
実験の目的は、150nmのナノ粒子を合成することであった。レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量は、SiNP0007に比べて16%減少し、重合反応は、45℃で105分間実施された。重合及び次の沈殿は、約125分で生じた。得られる被覆されていないRF粒子のSEM画像を図26に示す。RF粒子は170nmの平均サイズを有する。
SiNP0010−180nmの目標粒径45℃のRFコアの重合、25℃のシェル形成、350rpmの攪拌速度
この実験の目的は、この工程における水酸化アンモニウムの役割を調査することであった。重合化工程において、水酸化アンモニウムは使用されなかった(上昇した温度でアンモニアの損失に関係する)。この実験からの重要な観察は、45℃及び350rpmでの195分の反応実行時間の後に重合化が発生しなかったことであった。追加の水酸化アンモニウム(14mL)沈殿は、95分後に正常に発生した。
この実験の目的は、この工程における水酸化アンモニウムの役割を調査することであった。重合化工程において、水酸化アンモニウムは使用されなかった(上昇した温度でアンモニアの損失に関係する)。この実験からの重要な観察は、45℃及び350rpmでの195分の反応実行時間の後に重合化が発生しなかったことであった。追加の水酸化アンモニウム(14mL)沈殿は、95分後に正常に発生した。
反応温度は、また、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの第2の追加後に、20分で25℃から45℃に増加された。得られる被覆されていない粒子のSEM画像を図27に示す。シリカ粒子は、305nmの平均サイズを有し、二峰性分布を示す。さらにいくつ
かの粒子において孔が観察される。増加した粒径は、第2の重合化工程における上昇した温度の結果であり得る。さらに、この上昇した温度は、粒子構造を弱め、焼成工程の間に粒子を破壊する可能性がある。
かの粒子において孔が観察される。増加した粒径は、第2の重合化工程における上昇した温度の結果であり得る。さらに、この上昇した温度は、粒子構造を弱め、焼成工程の間に粒子を破壊する可能性がある。
10Lのスケールにおける方法の展開
正確な表面モルフォロジーで、180nmの粒子の合成の成功を実証した後、方法は、Radley反応器を使用して10Lにスケールされた。いくつかの合成が現在まで実施されており、表2及び3に要約される。それぞれの合成の結果は、以下の節に詳細に検討される。さらに、追加の安全基準が工程に適用された。
正確な表面モルフォロジーで、180nmの粒子の合成の成功を実証した後、方法は、Radley反応器を使用して10Lにスケールされた。いくつかの合成が現在まで実施されており、表2及び3に要約される。それぞれの合成の結果は、以下の節に詳細に検討される。さらに、追加の安全基準が工程に適用された。
10Lのスケールアップに導入される安全基準
10Lのスケールで、安全動作エンベロープを達成するために、いくつかの安全基準がこの工程に適用された。
1.窒素パージシステム−反応における酸素を排除して、いかなる発火の機会も最小にする。
2.静電気放電プラグ−いかなる発火の機会も最小にする。
3.反応器ジャケットの静電気放電添加剤−いかなる発火の機会も最小にする。
4.Dragerホルムアルデヒド検知−ホルムアルデヒドの暴露の任意の徴候を試験する。
10Lのスケールで、安全動作エンベロープを達成するために、いくつかの安全基準がこの工程に適用された。
1.窒素パージシステム−反応における酸素を排除して、いかなる発火の機会も最小にする。
2.静電気放電プラグ−いかなる発火の機会も最小にする。
3.反応器ジャケットの静電気放電添加剤−いかなる発火の機会も最小にする。
4.Dragerホルムアルデヒド検知−ホルムアルデヒドの暴露の任意の徴候を試験する。
SiNP001l−180nmの目標粒径45℃のRFの重合、25℃のシェル形成、160rpmの攪拌速度
この実験において、反応条件は、表2において、したがって、試薬のスケールの量と共に実験SiNP0007について保持された。容量の増加によって、攪拌速度は350〜160rpmに減少され、SiNP006IIIの結果に基づいて、攪拌速度の減少は、粒径又は形態に有害に影響しないことを示した。
この実験において、反応条件は、表2において、したがって、試薬のスケールの量と共に実験SiNP0007について保持された。容量の増加によって、攪拌速度は350〜160rpmに減少され、SiNP006IIIの結果に基づいて、攪拌速度の減少は、粒径又は形態に有害に影響しないことを示した。
被覆されていない粒子のSEM画像を、図28に示す。粒子は、かなり単分散性(PDI0.11)に見え、平均粒径は183nmであり、さらなる表面モルフォロジーは、まさに必要とされる通りであり、スケールアップの成功を示す。
SiNP00llII−SiNP011の繰り返し
再現性を確認するために、同一条件下で実験SiNP0011が繰り返された。被覆されていない粒子のSEM画像化は、図29において、181nmの平均粒径、単頂性粒子分布(PDI0.13)及び所望の表面モルフォロジーを示し、この方法が10Lのスケールで再現可能であることを示す。少ない確率の孔を有する粒子が観察され、これは、焼成工程のランプレートの予期しない変化に起因するが、変化は298℃で固定された。
再現性を確認するために、同一条件下で実験SiNP0011が繰り返された。被覆されていない粒子のSEM画像化は、図29において、181nmの平均粒径、単頂性粒子分布(PDI0.13)及び所望の表面モルフォロジーを示し、この方法が10Lのスケールで再現可能であることを示す。少ない確率の孔を有する粒子が観察され、これは、焼成工程のランプレートの予期しない変化に起因するが、変化は298℃で固定された。
TEMによる粒子構造及び形態の分析
5L及び10Lの両方のスケールアップバッチに調製される粒子の試料は、TEMを使用して分析されて、中空構造及び表面モルフォロジーも確認した。画像を図30に示す。全ての場合において、粒子は中空であり、所望の先端の尖った表面モルフォロジーを有し、約180nmの大きさであり、粒子合成のスケールアップの成功を確認する。
5L及び10Lの両方のスケールアップバッチに調製される粒子の試料は、TEMを使用して分析されて、中空構造及び表面モルフォロジーも確認した。画像を図30に示す。全ての場合において、粒子は中空であり、所望の先端の尖った表面モルフォロジーを有し、約180nmの大きさであり、粒子合成のスケールアップの成功を確認する。
工程の収率の増加
180nmの粒子の合成の成功の後、溶媒の容量あたりのシリカナノ粒子の量を増加させるために、方法に対する僅かな修正が試行された。いくつかの合成が実施され、以下の節にその結果を詳述する。
180nmの粒子の合成の成功の後、溶媒の容量あたりのシリカナノ粒子の量を増加させるために、方法に対する僅かな修正が試行された。いくつかの合成が実施され、以下の節にその結果を詳述する。
SiNP0012−500mLのRadley反応器(180nmの目的の粒径、45
℃で90分、TEOSの添加前に停止、5倍の濃度のR&F)
この実験の目的は、溶液中の高濃度の試薬で180nmのシリカナノ粒子を合成することであった。この実験では、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量は、実験SiNP0007よりも5倍に増加された。反応は、45℃で90分間実施され、実験を停止する前に、25℃に冷却された。図31は、890nmの平均粒径の負荷されていないSiNPを図示した。実験の間、約23分で重合化が生じた。増加した割合の重合化及び粒径の増加は、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの濃度の増加に起因していると予想された。より多くの数の粒子というより、より大きい粒子の形成は、試薬の濃度が過飽和であることを示唆する。
℃で90分、TEOSの添加前に停止、5倍の濃度のR&F)
この実験の目的は、溶液中の高濃度の試薬で180nmのシリカナノ粒子を合成することであった。この実験では、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量は、実験SiNP0007よりも5倍に増加された。反応は、45℃で90分間実施され、実験を停止する前に、25℃に冷却された。図31は、890nmの平均粒径の負荷されていないSiNPを図示した。実験の間、約23分で重合化が生じた。増加した割合の重合化及び粒径の増加は、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの濃度の増加に起因していると予想された。より多くの数の粒子というより、より大きい粒子の形成は、試薬の濃度が過飽和であることを示唆する。
SiNP0012II−500mLのRadley反応器(180nmの目的の粒径、10℃、TEOSの添加前に停止、5倍の濃度のR&F)(参照例)
この実験では、反応条件はSiNP0012と同様であって、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量は変化しないままであり、TEOSの添加前に反応は停止したが、反応は10℃で実施された。図32は、644nmの平均粒径の負荷されていないSiNPを図示した。10℃で、開始から120分後に重合反応は発生しなく、温度は25℃(11分)に上昇され、45分後に重合が生じた。
この実験では、反応条件はSiNP0012と同様であって、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量は変化しないままであり、TEOSの添加前に反応は停止したが、反応は10℃で実施された。図32は、644nmの平均粒径の負荷されていないSiNPを図示した。10℃で、開始から120分後に重合反応は発生しなく、温度は25℃(11分)に上昇され、45分後に重合が生じた。
SiNP0012III−減少した重合時間によるSiNP0012の繰り返し
反応は、45℃で7分間実施され、反応を停止する前に、25℃に冷却された。重合は23分で生じ、冷却段階に進んだ。図33は、412nmの平均粒径の負荷されていないRF粒子を図示した。SiNP0012に比べて、重合時間の減少は、まさに粒径の減少を生じ、しかしながら、より高い冷却力がない状態で180nmの平均粒径を達成することはできない。
反応は、45℃で7分間実施され、反応を停止する前に、25℃に冷却された。重合は23分で生じ、冷却段階に進んだ。図33は、412nmの平均粒径の負荷されていないRF粒子を図示した。SiNP0012に比べて、重合時間の減少は、まさに粒径の減少を生じ、しかしながら、より高い冷却力がない状態で180nmの平均粒径を達成することはできない。
SiNP0012IV−500mLのRadley反応器、(180nmの標的粒径、TEOSの添加の前に停止、R&Fの約24%の減少)
知られている合成手順についてRFコアのサイズを確認するために、SiNP0007バッチを繰り返したが、TEOSを添加する前に反応は停止した。図34は、180nmのコア/シェル先端の尖った粒子について観察されたコアサイズと一致する128nmの平均粒径を有する被覆されていないRF粒子を示す。
知られている合成手順についてRFコアのサイズを確認するために、SiNP0007バッチを繰り返したが、TEOSを添加する前に反応は停止した。図34は、180nmのコア/シェル先端の尖った粒子について観察されたコアサイズと一致する128nmの平均粒径を有する被覆されていないRF粒子を示す。
調製されるSiNPについての粒径の比較
表4は、CPIで実施されたシリカナノ粒子の調製のそれぞれについて得られた粒径を示す。初期、試料の多くは、250nmの領域の平均粒径を示し、ポリマーコアのサイズの発達において、反応時間は定常領域に落ち着くことを示すと思われる。モノマー濃度の減少は、SiNP0007(500mLのスケール)、SiNP0008(5Lのスケール)及びSiNP0l1(10Lのスケール)に示されるように、コアのサイズの対応する減少を導く。
表4は、CPIで実施されたシリカナノ粒子の調製のそれぞれについて得られた粒径を示す。初期、試料の多くは、250nmの領域の平均粒径を示し、ポリマーコアのサイズの発達において、反応時間は定常領域に落ち着くことを示すと思われる。モノマー濃度の減少は、SiNP0007(500mLのスケール)、SiNP0008(5Lのスケール)及びSiNP0l1(10Lのスケール)に示されるように、コアのサイズの対応する減少を導く。
結論
約300nmの平均サイズを有する粒子は、100mLのスケールで製造された。その
後、スケーリング(500mL、5L及び10L)、及びプロセスパラメータを正確に制御するために、Radley反応器を使用して、180nmのSiNPの合成の工程の改善に焦点を置いた。レゾルシノールホルムアルデヒドコアの形成のための加工時間を減少する場合に、著しい進歩がなされた。さらに、重合温度は、粒子の表面構造に有害な影響を与えることなく、コアの形成の間に、重合温度を上昇させることができ、実際のところ、これは概して有益であることが理解される。シリカシェルの形成は、好ましくは、25℃で実施されて、二峰性粒子分布の形成を回避し、所望の中空の先端の尖った粒子の他に、固体のシリカナノ球体を含みそうである。
約300nmの平均サイズを有する粒子は、100mLのスケールで製造された。その
後、スケーリング(500mL、5L及び10L)、及びプロセスパラメータを正確に制御するために、Radley反応器を使用して、180nmのSiNPの合成の工程の改善に焦点を置いた。レゾルシノールホルムアルデヒドコアの形成のための加工時間を減少する場合に、著しい進歩がなされた。さらに、重合温度は、粒子の表面構造に有害な影響を与えることなく、コアの形成の間に、重合温度を上昇させることができ、実際のところ、これは概して有益であることが理解される。シリカシェルの形成は、好ましくは、25℃で実施されて、二峰性粒子分布の形成を回避し、所望の中空の先端の尖った粒子の他に、固体のシリカナノ球体を含みそうである。
工程は、500mL、5L及び続いて10Lに成功にスケールされ、SEM及びTEMによって証明されるように、低い多分散性、正確な表面モルフォロジー及び多孔性を有する180nmの粒子が生じた。粒径の制御は、工程がスケールされるにつれて、著しく改善する。反応溶媒の1リットルにつき得られる粒子の濃度の増加も観察され、10Lのスケールで最大1.7g/Lに増加した。特徴化のデータに基づいて、10Lのスケールで調製される180nmのシリカナノ粒子が正確なサイズ及び形態であり、目的に適合する。ポリエチレンイミンによって修正された合成工程を使用して製造されたSiNPの負荷は、実施例2に考察される。
方法
実施例1で生成されたシリカナノ粒子のPEI負荷が実施された。これは、2つの工程を含み、最初に、シリカナノ粒子(SNP)を有するホスホン酸塩リンカー、3−(トリードロキシシリル)ホスホン酸プロピルメチル一ナトリウム塩溶液(THPMP)から成るリン酸塩結合を40℃で2時間実施する。2番目の工程は、ポリエチレンイミン(PEI)の負荷であり、ホスホン酸塩結合されたシリカナノ粒子をPEIと混合し、シリカに比べて5倍過剰に存在する。この工程は、室温で4時間超行われる。
実施例1で生成されたシリカナノ粒子のPEI負荷が実施された。これは、2つの工程を含み、最初に、シリカナノ粒子(SNP)を有するホスホン酸塩リンカー、3−(トリードロキシシリル)ホスホン酸プロピルメチル一ナトリウム塩溶液(THPMP)から成るリン酸塩結合を40℃で2時間実施する。2番目の工程は、ポリエチレンイミン(PEI)の負荷であり、ホスホン酸塩結合されたシリカナノ粒子をPEIと混合し、シリカに比べて5倍過剰に存在する。この工程は、室温で4時間超行われる。
前述のように、この工程は、完了するまでに4時間超との過剰な時間がかかったため、一連の実験は、各工程の混合時間を減少し、また、温度の上昇、次に各工程について異なる時間における反応の効果を検証しようとすることによって、工程を改善するために実施された。変化は、ゼータ電位及び炭素水素窒素(CHN)分析の2つの異なる方法で分析された。
PEIの負荷−ラボスケール
PEIの負荷は、実施例1において製造されたナノ粒子バッチSNP008、SNP008−II、SNP007、SNP007−VI、SNP011、及びSNP011−IIで実施された。CHN分析を実施するために得られた少量の産物によって、この工程のスケールアップは、代わりに200〜300mgのシリカを使用して行われた。成分間の比は全て同じレベルで維持された。
PEIの負荷は、実施例1において製造されたナノ粒子バッチSNP008、SNP008−II、SNP007、SNP007−VI、SNP011、及びSNP011−IIで実施された。CHN分析を実施するために得られた少量の産物によって、この工程のスケールアップは、代わりに200〜300mgのシリカを使用して行われた。成分間の比は全て同じレベルで維持された。
PEIの負荷−250mlのスケール及び100mgのSNP008
角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた250mlのRadley反応器で反応は実施され、温度、pH及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。導入されるSNPの量は、30mgから100mgに増加された。その他の反応物の量は、反応物の同比を保持するように増加された。使用される溶媒の容量は、反応器に適合するように調整され、すなわち、100mLのH2Oを使用して、THPMP及びSNPを溶解及び分散した。さらに、100mL及び50mLの炭酸塩バッファ(pH9.8)を使用して、それぞれ、PEI及びホスホン酸塩結合SNPを懸濁した。50%(53mg)の収率が得られた。使用される材料を、以下の表6に示す。
角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた250mlのRadley反応器で反応は実施され、温度、pH及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。導入されるSNPの量は、30mgから100mgに増加された。その他の反応物の量は、反応物の同比を保持するように増加された。使用される溶媒の容量は、反応器に適合するように調整され、すなわち、100mLのH2Oを使用して、THPMP及びSNPを溶解及び分散した。さらに、100mL及び50mLの炭酸塩バッファ(pH9.8)を使用して、それぞれ、PEI及びホスホン酸塩結合SNPを懸濁した。50%(53mg)の収率が得られた。使用される材料を、以下の表6に示す。
ホスホン酸塩結合の研究−500mlのスケール、500mgのSNP008
角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた500mlのRadley反応器で反応は実施され、温度、pH及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。ホスホン酸塩結合工程の反応時間の最適化に焦点が置かれた。SNP及びTHPMPを混合した後に、粒子は、最初に、10,000rpmで10分間遠心分離にかけられ、その後、上清が除去され、粒子は、H2Oに再懸濁され、同条件を使用して、再び遠心分離にかけられた。最後に、上清は再び除去され、粒子は、室温で2日間乾燥された。
角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた500mlのRadley反応器で反応は実施され、温度、pH及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。ホスホン酸塩結合工程の反応時間の最適化に焦点が置かれた。SNP及びTHPMPを混合した後に、粒子は、最初に、10,000rpmで10分間遠心分離にかけられ、その後、上清が除去され、粒子は、H2Oに再懸濁され、同条件を使用して、再び遠心分離にかけられた。最後に、上清は再び除去され、粒子は、室温で2日間乾燥された。
この吸収試験の間、40mLの試料は30分毎に採取された。実験は、3つの異なる温度(40℃、50℃、60℃)で実施されて、反応速度に対する温度の影響を探った。
SNPの量は、30mgから500mgに増加したが、反応物間の比は同じままであった。これは、充分な量の産物が確実に各試料で得られるようになされた。使用される溶媒の容量は、反応器に適合するように調整され、すなわち、220mLのH2Oを使用して、SNPを分散し、THPMPを溶解した。使用される材料を、以下の表7に示す。
PEIの負荷の研究−500mLのスケール、500mgのSNP008
角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた500mlのRadley反応器で反応は実施され、温度、pH及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。PEI負荷工程の間の反応時間の最適化に焦点が置かれた。ホスホン酸塩結合粒子の溶液を最初に調製することが決定された。結果として、異なる実験について、次にPEIが同調製溶液から負荷された。
角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた500mlのRadley反応器で反応は実施され、温度、pH及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。PEI負荷工程の間の反応時間の最適化に焦点が置かれた。ホスホン酸塩結合粒子の溶液を最初に調製することが決定された。結果として、異なる実験について、次にPEIが同調製溶液から負荷された。
この溶液の条件は以下であった。
40℃で2時間混合し、攪拌し、次に遠心分離及び洗浄を行った後に、粒子は、480mLの炭酸塩バッファ溶液に再懸濁された。この溶液の3番目(160mL)は、その後、異なる実験に使用された。この工程と並行して、2.5gのPEI−10Kが320mLの炭酸塩バッファ溶液に懸濁された。
本研究では、実験が30℃及び50℃という異なる温度下で実施された。試料は、それぞれの温度について、45分、1時間45分、2時間45分、及び4時間後に取られた。30℃で回収された試料の容量は、50℃で、40mL及び80mLであった。30℃の実験の後に得られる少量の産物(約15mg)のために、回収される容量を2倍にする決定がなされた。
最後のスケールアップ改質工程
いくつかの実験を完了した後に、窒素含有量によって示されるように良好な吸収を与える最後のスケールアップ改質工程が採用された。全ての量は、10倍された。角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた250mlのRadley反応器で、ホスホン酸塩結合反応は40℃で2時間実施され、温度、pH及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。PEIの負荷は、室温で、ホットプレートスターラー上のガラス製瓶の内部で実施された。
いくつかの実験を完了した後に、窒素含有量によって示されるように良好な吸収を与える最後のスケールアップ改質工程が採用された。全ての量は、10倍された。角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた250mlのRadley反応器で、ホスホン酸塩結合反応は40℃で2時間実施され、温度、pH及びスターラーの速度についての能力のデータはログされた。PEIの負荷は、室温で、ホットプレートスターラー上のガラス製瓶の内部で実施された。
使用される条件は、以下の通りである。
動的光散乱法ゼータ電位を使用した表面電荷の分析
動的光散乱法を使用して、粒子の表面電荷及び特に等電点(IEP)を特徴付けた。pHの関数として、ゼータ電位は、Horiba SZ−100ナノ粒子アナライザーを使用して測定された。この技術を使用することは、粒子の表面電荷についての情報を提供する。ゼータ電位が0mVに達するときにIEPが達成される。未修正及びPEI飽和粒子のIEPを知ることによって、PEI負荷の展開を追跡することができる。裸の粒子の表面において吸収が開始されると、IEPは完全飽和表面に移動する。さらに、pH<2及びpH>12について、この技術がかなり不正確であることに留意されるべきである。
動的光散乱法を使用して、粒子の表面電荷及び特に等電点(IEP)を特徴付けた。pHの関数として、ゼータ電位は、Horiba SZ−100ナノ粒子アナライザーを使用して測定された。この技術を使用することは、粒子の表面電荷についての情報を提供する。ゼータ電位が0mVに達するときにIEPが達成される。未修正及びPEI飽和粒子のIEPを知ることによって、PEI負荷の展開を追跡することができる。裸の粒子の表面において吸収が開始されると、IEPは完全飽和表面に移動する。さらに、pH<2及びpH>12について、この技術がかなり不正確であることに留意されるべきである。
試料は、固体粒子を酸性又は塩基性溶液に分散することによって調製された。この溶液は、100mLの10−3MのKCL溶液にHCl又はNaOH(10−2M)を滴下することによって、調製された。粒子は、高いIEPが予想され、逆になった場合に、酸性培地に分散された。その後、酸及び塩基の液滴が加えられて、溶液のpHを変化し、粒子の表面電荷の展開をモニタリングする。
C:H:N分析を使用したPEI濃度の分析
C:H:N分析は、PEIが粒子に負荷され、吸着される量を定量することが成功したかどうかを確認することができる。この技術は、粒子表面の炭素、窒素及び水素の割合を測定する。この研究のために、窒素含有量及びPEIの主要成分に分析の焦点を置いた。異なる時間及び異なる温度で異なる試料を分析することによって、反応及びその速度の理解に関する情報を提供した。これは、ゼータ電位分関と相補的な技術であり、両方の組の結果の相関を可能にする。単一の分析を実施するために最小30mgの試料が必要である。
C:H:N分析は、PEIが粒子に負荷され、吸着される量を定量することが成功したかどうかを確認することができる。この技術は、粒子表面の炭素、窒素及び水素の割合を測定する。この研究のために、窒素含有量及びPEIの主要成分に分析の焦点を置いた。異なる時間及び異なる温度で異なる試料を分析することによって、反応及びその速度の理解に関する情報を提供した。これは、ゼータ電位分関と相補的な技術であり、両方の組の結果の相関を可能にする。単一の分析を実施するために最小30mgの試料が必要である。
走査型電子顕微鏡
走査型電子顕微鏡を使用して、ホスホン酸塩結合又はPEIの負荷が、粒子の形態に任意の変化を誘導したかどうかが確認された。
走査型電子顕微鏡を使用して、ホスホン酸塩結合又はPEIの負荷が、粒子の形態に任意の変化を誘導したかどうかが確認された。
結果及び検討
SNP008へのPEI負荷
未変性及び変性されたシリカナノ粒子に、ゼータ電位分析が行われた。図35は、DLSを使用したゼータ電位分析の結果を示す。IEPにおいて大きな差が観察される。被覆
されていないSNP008のIEPは約pH3であり、PEIが負荷されると、IEPはpH10に増加する。これは、シリカ表面が、被覆のない場合には負電荷され、PEIが負荷されると正電荷される。被覆のない粒子はその表面にヒドロキシ基を含有し、PEIが負荷された粒子は、ジメチルアミン基を含有し、約10.5のpKaを有するために、これらの結果が予想される。
SNP008へのPEI負荷
未変性及び変性されたシリカナノ粒子に、ゼータ電位分析が行われた。図35は、DLSを使用したゼータ電位分析の結果を示す。IEPにおいて大きな差が観察される。被覆
されていないSNP008のIEPは約pH3であり、PEIが負荷されると、IEPはpH10に増加する。これは、シリカ表面が、被覆のない場合には負電荷され、PEIが負荷されると正電荷される。被覆のない粒子はその表面にヒドロキシ基を含有し、PEIが負荷された粒子は、ジメチルアミン基を含有し、約10.5のpKaを有するために、これらの結果が予想される。
SNP008−250mLのスケール−100mgのSNP
第1のスケールアップは、250mlのRadley反応器において粒子の量を100mg(対30mg)に増加することによって、実施された。図36は、スケールアップ粒子のゼータ電位分析からの結果を示す。IEPの小さな差は、観察されるが、装置の精度によって、この差は有意ではない。しかしながら、より低いpHについては、定常が達成される場合、我々は、2つの試料の間で、約20mVの強度の差があることを認めた。概して、電荷の強度が高いほど、粒子はより安定する。
第1のスケールアップは、250mlのRadley反応器において粒子の量を100mg(対30mg)に増加することによって、実施された。図36は、スケールアップ粒子のゼータ電位分析からの結果を示す。IEPの小さな差は、観察されるが、装置の精度によって、この差は有意ではない。しかしながら、より低いpHについては、定常が達成される場合、我々は、2つの試料の間で、約20mVの強度の差があることを認めた。概して、電荷の強度が高いほど、粒子はより安定する。
ホスホン酸塩が結合されたSNP008
改質工程がより早く停止することが可能であるかどうかを確立するために、ホスホン酸塩結合工程の最適化に関係する一連の実験が実施された。図37は、前述のように、得られたSNPについてpHの関数として、ゼータ電位の展開を記載する。
改質工程がより早く停止することが可能であるかどうかを確立するために、ホスホン酸塩結合工程の最適化に関係する一連の実験が実施された。図37は、前述のように、得られたSNPについてpHの関数として、ゼータ電位の展開を記載する。
未変性SNPについて観察されるように、約pH3のIEPを有する表面は負に帯電させるが、処理後に、IEPがpH2未満に僅かに減少することが観察される。pH2以下の結果は、不正確であるが、これらの粒子のIEPが、約1.5の亜リン酸のpKaになる傾向がある。この結果は、粒子がPEI負荷の間に、より負に帯電させることを確認する。異なる時間に試料を回収することによってホスホン酸塩結合をモニタリングして、工程を最適化することは、IEPが機械のpH限界値以下である場合、ゼータ電位を使用することは不可能である。
この工程を最適化する試みは、後に実施され、得られる粒子は、C:H:N分析を使用して分析された。ホスホン酸塩リンカー源は、プロピル及びメチル基を含み、表面の炭素含有量は、この工程をモニタリングするための良い試料になり得ると考えられた。しかしながら、得られた結果は、バッチ間で極めてランダムであり、環境からの汚染が存在する可能性あることを示す(低いC及び高いN含有量の両方を有するいくつかの試料が観察された)。
しかしながら、同バッチの内部において、炭素含有量は、図38に示されるように、時間と共に極めて一定である。この結果によって、我々は、30分のみの混合(第1ポイントの測定)の後にのみ、定常に達するため、この工程の間の混合時間を劇的に減少させることができると考えている。
PEI負荷工程の最適化−SNP008−500mLスケール、500mgのSNP、30℃
前述のグラフは、前述のように、得られたSNPについてpHの関数として、ゼータ電位の展開を記載する。図39は、また、異なる反応時間におけるpHを関数としてゼータ電位の展開を記載する。これらの実験は、PEI負荷混合工程の最初の4時間を減少させるために実施される。試料の多くは、100mLの酸性溶液に2mgの粒子を溶解することによって、調製された。これを行うことによって、約2(ホスホン酸塩結合粒子)から10(完全に被覆された粒子)にIEPを移行するだけでなく、おそらく全ての表面がPEIによって飽和されたことを意味する定常に到達することが予想された。しかしながら、図38に示されるように、反応を開始してからわずか45分(すなわち、第1の測定ポイント)後に、定常に到達した。これらの結果に基づいて、粒子の最大PEI負荷能力が
45分の反応の後に到達し、したがって、4時間の反応を実施する必要がないという仮説が立てられる。このことは、PEIがシリカ粒子よりも5倍過剰に導入されるという事実によって説明することができる。これを考えると、さらなる実験が実施されて、導入されるPEIの量を減少させて、そのためコストを削減することができる。
前述のグラフは、前述のように、得られたSNPについてpHの関数として、ゼータ電位の展開を記載する。図39は、また、異なる反応時間におけるpHを関数としてゼータ電位の展開を記載する。これらの実験は、PEI負荷混合工程の最初の4時間を減少させるために実施される。試料の多くは、100mLの酸性溶液に2mgの粒子を溶解することによって、調製された。これを行うことによって、約2(ホスホン酸塩結合粒子)から10(完全に被覆された粒子)にIEPを移行するだけでなく、おそらく全ての表面がPEIによって飽和されたことを意味する定常に到達することが予想された。しかしながら、図38に示されるように、反応を開始してからわずか45分(すなわち、第1の測定ポイント)後に、定常に到達した。これらの結果に基づいて、粒子の最大PEI負荷能力が
45分の反応の後に到達し、したがって、4時間の反応を実施する必要がないという仮説が立てられる。このことは、PEIがシリカ粒子よりも5倍過剰に導入されるという事実によって説明することができる。これを考えると、さらなる実験が実施されて、導入されるPEIの量を減少させて、そのためコストを削減することができる。
第2の観察は、分析中の粒子の分散に関連して行われた。図39の上部の2つのチャートは、粒子が酸性及び塩基性培地に分散れた場合の結果を示す。完全には理解されないが、曲線は、pH10の被覆された表面について、高い正電荷から予想通りに開始し、培地がより酸性になるにつれて、PEIの不安定化を示し得る。
PEI負荷速度の評価
図40に示されるように、IEPは第1ポイントの測定(45分)で定常に到達する。これらの結果に基づいて、完全負荷能力が45分の反応の後に到達し、4時間の反応を実施する必要がないという仮説が立てられる。また、最適化を実施する必要がないが、過剰に加えられるため、PEIの量が減少すると考えられる。
図40に示されるように、IEPは第1ポイントの測定(45分)で定常に到達する。これらの結果に基づいて、完全負荷能力が45分の反応の後に到達し、4時間の反応を実施する必要がないという仮説が立てられる。また、最適化を実施する必要がないが、過剰に加えられるため、PEIの量が減少すると考えられる。
以下の組の実験は、導入されるPEIの量が減少し、また、粒子表面に対する負荷速度を検証することもできるかどうかを決定するために実施された。これを行うために、SNP011及びSNP011−2に対する実験が、通常より2.5倍少ない量のPEIを使用して実施された。条件は、表10に示された。
最初に、IEPの2〜10の実際の移行を見ることができるかどうかを確認するために、30分の反応語にゼータ電位分析が実施された。結果を図41に以下に示す。
図41において、IEPは約pH10.5である。この場合では、PEIは2倍過剰に導入され(比較として、以前は5倍である)、吸収反応はたったの30分しか実施されなかったが、この値は、以前に見つけられたIEPと極めて類似している。負荷速度のより良い評価を得るために、図42において、1つ以上の分析がPEI負荷のたった5分後に実施された(過剰に2倍)。
反応から5分後に、IEPは以前と極めて類似する。しかしながら、図41では約40mVであり、ここでは約20mVになると、定常の大きさが劇的に減少する。
PEIは粒子の表面を極めて素早く被覆し、そういった理由で粒子の表面が反応からたったの5分後に、正電荷にされることが予想される。それにもかかわらず、図41及び図42の間で、pH<9の全体的なゼータ電位について大きな差が観察される。この差は、反応から5分後に負荷されるPEIの量がより低いことに起因するが、それぞれの実験について異なる試料の種類を使用することからも生じる可能性もある。さらに、図41に示される結果について(通常より2.5倍少ない量のPEI及びたったの30分の反応)、電荷の大きさのレベル及びIEPが通常の条件で変性される粒子(PEI、過剰に5倍−4時間)と同じであることに留意されたい。これらの観察を確認するために、C:H:N分析が表10に挙げられる実験の組で実施された。結果を、以下の図43に示す。
図43は、2つの異なるバッチの粒子(10Lのバッチ)及び2つの異なる時間スケールにおけるPEI負荷の間の窒素含有量の展開を示す。平均窒素含有量は、両方のグラフに記載される。
図43に示される結果は、過剰に2倍のPEIを使用して得られ(対5倍のUQの工程)、通常60%より少ないポリマーを意味する。最初に全体の窒素含有量は、経時的に両方のバッチについて一定であり、通常の工程を使用して観察される平均含有量よりも高い約2%である。このより高い値は、ここでは、ホスホン酸塩結合が、より良い温度の制御を有するRadley反応器でなされるという事実によって、次の節で説明される。第2に、混合からちょうど5分後に、窒素の値が2%に到達し、その後、同レベルにい続けることが観察された。これは、興味深い結果であり、(i)PEIの量が劇的に減少することができ、及び(ii)最初の4時間の混合を5分に減少することができる。しかしながら、この例では、混合の終わりと次の遠心分離工程との間の移行が特に制御されず、そのため、混合が終了した後に拡散によって負荷工程を連続することができた。追加の実験は、負荷レベルを確認するために、遠心分離への移行は、混合が実施された直後に実施された。同範囲(1.82%)の窒素含有量が得られ、これは、5分間の混合がPEI負荷を生じるのに充分であることを示している。
SNP07/07_VI/08/08_11/011/011_11へのPEIの負荷
PEIが以前に合成された粒子に正しく負荷されたことを確認するために、C:H:N分析が実施された。結果を、以下の前述の表11に示す。PEI負荷は第1工程によって実施された。いくつかの試料について、C:H:N分析を実施するために回収された少量の産物によって、PEI負荷が、その後、第1工程(第2工程)における量の増加変化例を使用して実施された。反応は、ホットプレートスターラーを使用して、ガラス製瓶で行われた。これらのPEI負荷された粒子の全体の窒素含有量は、クイーンズランド大学によって観察された予測レベルの2.5〜3.4%よりも低い。さらに、粒子間の僅かな差が観察される。この差の起源を理解するために、BET表面分析が異なる負荷されていない粒子に実施された。表7の結果は、08_II及び011_IIが、より高い表面積及びPEI含有量を有することを示す。さらに、前述のように、250mlのガラス製瓶及びホットプレートスターラーが、いくつかの試料の改質に使用された(第2工程)。溶液の内部の加熱が良好に分布されず、第2工程について、SNP011_2に観察される1.23%の窒素含有量等の異常及び全体的な低い窒素含有量も説明することが想定される。
PEI負荷レベルの増加
C:H:N分析の結果を以下の表11に示し、PEI負荷レベルを増加させるいくつかの試行が実施された。粒子によって組み込まれる窒素の割合は、以下に2.5〜3.5%と予想された。この値に到達するために、粒子に結合されるホスホン酸塩の量を増加させることに焦点を置いた。最初に、リン酸塩の結合工程が、ホットプレートスターラーのガラス製瓶の代わりにRadley反応器で実施されて、我々はより良い温度の制御を有した。ホスホン酸塩の結合工程は、その後、反応温度を40℃から60℃と90℃に増加させることによって実施される。
C:H:N分析の結果を以下の表11に示し、PEI負荷レベルを増加させるいくつかの試行が実施された。粒子によって組み込まれる窒素の割合は、以下に2.5〜3.5%と予想された。この値に到達するために、粒子に結合されるホスホン酸塩の量を増加させることに焦点を置いた。最初に、リン酸塩の結合工程が、ホットプレートスターラーのガラス製瓶の代わりにRadley反応器で実施されて、我々はより良い温度の制御を有した。ホスホン酸塩の結合工程は、その後、反応温度を40℃から60℃と90℃に増加させることによって実施される。
追加の実験において、炭酸塩バッファのpHは、pH9.8から10.96に増加され、より負電荷されたリンカーがポリマーの負荷を増加することができ、導入されるPEIの量は通常量の2倍であった。高い割合の窒素が表12に示されるように組み込まれたため、これらの実験をSNP008−2に実施する決定がなされた。
以下の表に、使用された条件の要約を示す。
この組の実験のC:H:N分析の結果を以下の表13に示す。
概して、窒素含有量が、表11に示される結果に比べて増加した。PEI負荷は、熱が溶液の内部により良く分布されるため、Radley反応器でより良いことが確認される。しかしながら、前述の表が示すように、温度上昇、PEI量または炭酸塩のpHの増加のいずれもPEI含有量をさらに増加させなかった。実際に、温度が上昇する場合、窒素含有量は減少するように見える。これは、合間のpHが減少し、反応が温度よりもpHに感受性があるように見えるという事実によって説明される。
結論
プロセスパラメータを正確に制御するためにRadley反応器を使用した工程の改善に焦点が当てられた。処理時間及びPEI負荷に使用される材料の量の減少において、著しい展開がなされた。PEI量は、少なくとも60%に減少することができ、必要とされる負荷工程は、たった5分間しか継続する必要がないことが示された。ホスホン酸塩結合工程が減少し得るが、この発見を確認するためにさらなる実験が必要とされることも決定された。工程が実施される温度に関連する1つのその他の重要な観察は、温度の上昇が工程の有効性を減少し、結果として、より低いポリマー含有量になることである。PEI負荷をより低い値に設定する必要がある場合、生物適合性の課題が関心事である場合、このパラメータは有用な制御パラメータになることができる。
プロセスパラメータを正確に制御するためにRadley反応器を使用した工程の改善に焦点が当てられた。処理時間及びPEI負荷に使用される材料の量の減少において、著しい展開がなされた。PEI量は、少なくとも60%に減少することができ、必要とされる負荷工程は、たった5分間しか継続する必要がないことが示された。ホスホン酸塩結合工程が減少し得るが、この発見を確認するためにさらなる実験が必要とされることも決定された。工程が実施される温度に関連する1つのその他の重要な観察は、温度の上昇が工程の有効性を減少し、結果として、より低いポリマー含有量になることである。PEI負荷をより低い値に設定する必要がある場合、生物適合性の課題が関心事である場合、このパラメータは有用な制御パラメータになることができる。
実施例3−SiNPの製造及び核酸の負荷
方法
負荷されていないシリカナノ粒子の合成及び分析
負荷されていないシリカナノ粒子の合成−10Lのスケール
角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた20LのRadley反応器で反応は実施され、温度、pH、伝導率、スターラーの速度及びトルクについての能力のデータはログされた。
方法
負荷されていないシリカナノ粒子の合成及び分析
負荷されていないシリカナノ粒子の合成−10Lのスケール
角度のある4つの刃の付いたプロペラを備えた20LのRadley反応器で反応は実施され、温度、pH、伝導率、スターラーの速度及びトルクについての能力のデータはログされた。
Radley Pilot反応器(20L)は、約−0.75barまで真空にされ、窒素で3回パージされた。一定の窒素ガスが0.1mL/分で容器に供給された。容器は、エタノール(8200mL)、水(1178mL)及び水酸化アンモニウム(350mL)を充填され、160rpmで(蓋をして)攪拌された。反応培地は、その後、45℃
まで加熱された。レゾルシノール(12.8702g)は、エタノール(130mL)に溶解された。レゾルシノール及びホルムアルデヒド(18mL)が加えられ、溶液は、(蓋をして)45℃で90分間攪拌された。温度は、35分間で、45℃から25℃に低下した。テトラメチルオルトケイ酸塩(70mL)が加えられ、混合物は(蓋をして)6分間攪拌された。追加のレゾルシノール(47.2829g)が秤量され、エタノール(100mL)に溶解された。レゾルシノール及びホルムアルデヒド(66mL)が加えられ、反応液は(蓋をして)さらに2時間攪拌された。
まで加熱された。レゾルシノール(12.8702g)は、エタノール(130mL)に溶解された。レゾルシノール及びホルムアルデヒド(18mL)が加えられ、溶液は、(蓋をして)45℃で90分間攪拌された。温度は、35分間で、45℃から25℃に低下した。テトラメチルオルトケイ酸塩(70mL)が加えられ、混合物は(蓋をして)6分間攪拌された。追加のレゾルシノール(47.2829g)が秤量され、エタノール(100mL)に溶解された。レゾルシノール及びホルムアルデヒド(66mL)が加えられ、反応液は(蓋をして)さらに2時間攪拌された。
反応混合物は15Lのカーボイに移された。4つの遠心分離瓶(Thermo Scientific Nalgene、1L)に反応混合物が充填され、4700rpmで、10℃で5分間、遠心分離が実施された。上清は取り除かれ、遠心分離の瓶により多くの反応混合物が充填され、同条件下で遠心分離が実施された。遠心分離の工程は、全ての反応混合物が遠心分離工程に供されるまで繰り返された。新鮮なエタノール(100mL)が各瓶に加えられ、同条件下で遠心分離が実施された。上清は取り除かれ、粗試料が周囲温度で約17時間、空気中で乾燥された。
乾燥された粗試料は、セラミック皿に移され、炉に置かれた。試料は、周囲温度から最大550℃まで、1分あたり2℃で加熱され、温度は、5時間保持され、その後、自然に冷却した。
負荷されていないシリカナノ粒子のSEM分析
SEM試料の調製:試料は、バイアルから抽出され、スパチュラの平坦な端を使用して、接着性カーボンタブでSEMスタッド上に圧縮された。SEM分析:走査型電子顕微鏡、Hitachi SU8230装置を使用して、SiNPの全てのバッチを画像化した。
SEM試料の調製:試料は、バイアルから抽出され、スパチュラの平坦な端を使用して、接着性カーボンタブでSEMスタッド上に圧縮された。SEM分析:走査型電子顕微鏡、Hitachi SU8230装置を使用して、SiNPの全てのバッチを画像化した。
負荷されていないシリカナノ粒子のTEM分析
以下のプロトコルを使用してTEM分析が完了した:10μlの溶液をカーボンコートされた400メッシュの銅グリッドに滴下した。余剰な溶液を一片のろ紙で取り除き、グリッドは乾燥された。試料は、100kVのPhilips CM 100 TEMで観察された。画像は、AMT40バージョン5.42のイメージキャプチャーエンジンを有するCCDカメラオプトロニクス1824x1824ピクセルを使用してキャプチャーされた。
以下のプロトコルを使用してTEM分析が完了した:10μlの溶液をカーボンコートされた400メッシュの銅グリッドに滴下した。余剰な溶液を一片のろ紙で取り除き、グリッドは乾燥された。試料は、100kVのPhilips CM 100 TEMで観察された。画像は、AMT40バージョン5.42のイメージキャプチャーエンジンを有するCCDカメラオプトロニクス1824x1824ピクセルを使用してキャプチャーされた。
銅グリッドは、Gilderグリッドによって供給され、Quorum Q 150T
ESコーティングユニットを使用してカーボンコーティングされた。
ESコーティングユニットを使用してカーボンコーティングされた。
負荷されていないシリカナノ粒子のBET分析
TriStar II Plusソフトウェアについて、Micromeritics
TriStar II Plus及びMicromeritics VacPrep 061 Sample Degas Systemで分析が行われた。
TriStar II Plusソフトウェアについて、Micromeritics
TriStar II Plus及びMicromeritics VacPrep 061 Sample Degas Systemで分析が行われた。
チューブは空のときに秤量され、バルブが半分以上になるまで、金属製の漏斗を使用して、試料がチューブに加えられた。チューブは、充填後に秤量された。チューブは、真空下に80℃で少なくとも12時間置かれた。チューブは、脱ガスされると秤量され、分析のためにセットアップされた。
PEI負荷されたシリカナノ粒子の合成及び分析
シリカナノ粒子のPEI負荷−30mgスケール
シリカナノ粒子(質量については表16を参照)は、脱イオン水(10mL)に懸濁され、10分間超音波処理された。3−(トリヒドロキシシリルプロピルホスホン酸塩)(THPMP)(0.21mL)が脱イオン水(10mL)に溶解された。溶液は合わされ、磁気スターラーで200rpm、40℃で2時間攪拌された。得られた濁った白色溶液
は、10,000rpm、25℃で10分間遠心分離にかけられた。上清は取り除かれ、粒子は脱イオン水(10mL)で懸濁された。得られた溶液は、10,000rpm、25℃で10分間遠心分離にかけられた。上清は取り除かれ、粒子は、炭酸塩バッファ溶液(脱イオン水(1000mL)中、5mL、炭酸ナトリウム(1.5926g)及び炭酸水素ナトリウム(2.9333g))で懸濁された。
シリカナノ粒子のPEI負荷−30mgスケール
シリカナノ粒子(質量については表16を参照)は、脱イオン水(10mL)に懸濁され、10分間超音波処理された。3−(トリヒドロキシシリルプロピルホスホン酸塩)(THPMP)(0.21mL)が脱イオン水(10mL)に溶解された。溶液は合わされ、磁気スターラーで200rpm、40℃で2時間攪拌された。得られた濁った白色溶液
は、10,000rpm、25℃で10分間遠心分離にかけられた。上清は取り除かれ、粒子は脱イオン水(10mL)で懸濁された。得られた溶液は、10,000rpm、25℃で10分間遠心分離にかけられた。上清は取り除かれ、粒子は、炭酸塩バッファ溶液(脱イオン水(1000mL)中、5mL、炭酸ナトリウム(1.5926g)及び炭酸水素ナトリウム(2.9333g))で懸濁された。
ポリエチレンイミン(PEI)(質量については表16参照)は、強く振盪することによって、炭酸塩バッファ(10mL)に溶解された。溶液は合わされ、磁気スターラーで200rpm、25℃で4時間攪拌された。得られた濁った白色溶液は、10,000rpm、25℃で10分間遠心分離にかけられた。上清は取り除かれ、粒子は脱イオン水(10mL)で懸濁された。得られた溶液は、10,000rpm、25℃で10分間遠心分離にかけられた。上清は除去され、粒子は、室温で乾燥されて、固体の白色産物を得た。
シリカナノ粒子のPEI負荷−5gスケール
シリカナノ粒子(質量については表17を参照)は、脱イオン水(300mL)に懸濁され、15分間超音波処理された。3−(トリヒドロキシシリルプロピルホスホン酸塩)(THPMP)(12.8mL)が脱イオン水(300mL)に溶解された。溶液は合わされ、磁気スターラーで500rpm、40℃で2時間攪拌された。得られた濁った白色溶液は(目に見える粒子を有して)、10,000rpm、25℃で10分間遠心分離にかけられた。上清は取り除かれ、粒子は脱イオン水(チューブにつき約15mL)で懸濁された。得られた溶液は、10,000rpm、25℃で10分間遠心分離にかけられた。上清は除去され、粒子は、室温で乾燥されて、固体の白色産物を得た。
シリカナノ粒子(質量については表17を参照)は、脱イオン水(300mL)に懸濁され、15分間超音波処理された。3−(トリヒドロキシシリルプロピルホスホン酸塩)(THPMP)(12.8mL)が脱イオン水(300mL)に溶解された。溶液は合わされ、磁気スターラーで500rpm、40℃で2時間攪拌された。得られた濁った白色溶液は(目に見える粒子を有して)、10,000rpm、25℃で10分間遠心分離にかけられた。上清は取り除かれ、粒子は脱イオン水(チューブにつき約15mL)で懸濁された。得られた溶液は、10,000rpm、25℃で10分間遠心分離にかけられた。上清は除去され、粒子は、室温で乾燥されて、固体の白色産物を得た。
ホスホン酸塩が負荷されたシリカナノ粒子の試料が取られ、残りの粒子は、炭酸塩バッファ溶液(200mL)で懸濁された。ポリエチレンイミン(PEI)(質量については表17参照)は、強く振盪することによって、炭酸塩バッファ(300mL)に溶解された。溶液は合わされ、磁気スターラーで500rpm、25℃で4時間攪拌された。目に見える粒子を有する濁った白色溶液は、10,000rpm、25℃で10分間遠心分離にかけられた。上清は取り除かれ、粒子は脱イオン水(チューブにつき約15mL)で懸濁された。得られた溶液は、10,000rpm、25℃で10分間遠心分離にかけられた。上清は除去され、粒子は、室温で乾燥されて、固体の白色産物を得た。
PEI負荷されたシリカナノ粒子のDLSゼータ電位分析
Horiba SZ−100ソフトウェアを使用して、Horiba、Scientific Nanopartica、Nano Particle Analyzer、SZ−100で分析を行った。水において25℃で、2回測定が行われた。
Horiba SZ−100ソフトウェアを使用して、Horiba、Scientific Nanopartica、Nano Particle Analyzer、SZ−100で分析を行った。水において25℃で、2回測定が行われた。
シリカナノ粒子試料(2mg)は、脱イオン水(1mL)に脱イオン化されて、透明な水溶液の白色固体粒子を得た。目に見える固体白色粒子のない濁った白色溶液があるまで、試料は超音波処理された。6ピペットの試料の液滴がKC1溶液(10−3M、100mL)に加えられた。シリンジ(2mL)を使用して、電極セルに得られた溶液を充填し、セルに目に見える泡がないことを確認し、ゼータ電位が記録された。
DNA/RNA及びPEI負荷されたシリカナノ粒子の合成及び分析
DNA定量化のためのPEI負荷されたシリカナノ粒子のDNA負荷
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(1000μL)のPEI−SiNP粒子のストック溶液(500μg)は、5分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに5分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。この溶液は分割された(10μL)。DNAは1μLに分割することができるストック溶液に作製された。DNA(1μg)がDNAストック溶液から加えられ、3回再ピペットされて混合された。溶液は冷蔵庫に5℃で、4時間安定した。溶液は、その後、25℃で、10,900rpm、13分間微量遠心機にかけられた。上清はピペットアウトされて、DNA定量化に使用された。
DNA定量化のためのPEI負荷されたシリカナノ粒子のDNA負荷
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(1000μL)のPEI−SiNP粒子のストック溶液(500μg)は、5分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに5分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。この溶液は分割された(10μL)。DNAは1μLに分割することができるストック溶液に作製された。DNA(1μg)がDNAストック溶液から加えられ、3回再ピペットされて混合された。溶液は冷蔵庫に5℃で、4時間安定した。溶液は、その後、25℃で、10,900rpm、13分間微量遠心機にかけられた。上清はピペットアウトされて、DNA定量化に使用された。
ポジティブコントロール:ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(10μL)のDNA(1μg)が3回再ピペットされて、混合された。溶液は冷蔵庫に5℃で、4時間安定した。溶液は、25℃で、10,900rpm、13分間微量遠心機にかけられた。上清はピペットアウトされて、DNA定量化に使用された。
ネガティブコントロール:ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(10μL)。
DNA定量化のためのDNA及びPEI負荷されたシリカナノ粒子の可視吸収分析
上清のDNA濃度は、NanoDrop8000分光光度計及び2μlの試料を使用して決定された。
上清のDNA濃度は、NanoDrop8000分光光度計及び2μlの試料を使用して決定された。
DNA及びPEI負荷されたシリカナノ粒子のDLSゼータ電位分析
Horiba SZ−100ソフトウェアを使用して、Horiba、Scientific Nanopartica、Nano Particle Analyzer、SZ−100で分析を行った。測定は、10mMのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液において、25℃で2回実施された。
Horiba SZ−100ソフトウェアを使用して、Horiba、Scientific Nanopartica、Nano Particle Analyzer、SZ−100で分析を行った。測定は、10mMのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液において、25℃で2回実施された。
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(200μL)のPEI−SiNP粒子の溶液(100μg)は、5分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに5分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。DNAは1μLに分割することができるストック溶液に作製された。DNA(10μg)がDNAストック溶液から加えられ、3回再ピペットされて混合された。溶液は冷蔵庫に5℃で、4時間安定した。溶液は、25℃で、10,900rpm、13分間微量遠心機にかけられた。得られた産物は、10mMのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液(5mL)に再懸濁された。シリンジ(2mL)を使用して、電極セルに得られた溶液を充填し、セルに目に見える泡がないことを確認し、ゼータ電位が記録された。
全てのDNA及びRNAゼータ電位分析について、全ての装置がヌクレアーゼのないことを保証することはできないが、しかしながら、できるだけヌクレアーゼのない実験を実施しようと方法が採られることに留意されるべきである。
RNA定量化のためのPEI負荷されたシリカナノ粒子のRNA負荷
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(1000μL)のPEI−SiNP粒子のストック溶液(500μg)は、5分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに5分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。この溶液は分割され(10μL)、RNA(1μg)が、原材料から直接的に加えられ、3回再ピペットされて、混合された。溶液は、冷蔵庫に5℃で、4時間安定した。溶液は、25℃で、10,900rpm、3分間微量遠心機にかけられた。上清はピペットアウトされて、RNA定量化に使用された。
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(1000μL)のPEI−SiNP粒子のストック溶液(500μg)は、5分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに5分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。この溶液は分割され(10μL)、RNA(1μg)が、原材料から直接的に加えられ、3回再ピペットされて、混合された。溶液は、冷蔵庫に5℃で、4時間安定した。溶液は、25℃で、10,900rpm、3分間微量遠心機にかけられた。上清はピペットアウトされて、RNA定量化に使用された。
ポジティブコントロール:ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(10μL)のRNA(1μg)が3回再ピペットされて、混合された。溶液は冷蔵庫に5℃で、4時間安定した。溶液は、25℃で、10,900rpm、3分間微量遠心機にかけられた。上清はピペットアウトされて、RNA定量化に使用された。
ネガティブコントロール:ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(10μL)。
RNA定量化のためのRNA及びPEI負荷されたシリカナノ粒子の蛍光分析
上清のRNA濃度は、Qubit3.0蛍光光度計及びQubit RNA BRキットを使用して決定された。試料及びキットRNA標準はQubit染料と混合され、Qubit3.0蛍光光度計のRNA Broad Range Assayプログラムを使用して分析された。
上清のRNA濃度は、Qubit3.0蛍光光度計及びQubit RNA BRキットを使用して決定された。試料及びキットRNA標準はQubit染料と混合され、Qubit3.0蛍光光度計のRNA Broad Range Assayプログラムを使用して分析された。
RNA及びPEI負荷されたシリカナノ粒子のDLSゼータ電位分析
Horiba SZ−100ソフトウェアを使用して、Horiba, Scientific Nanopartica、Nano Particle Analyzer、SZ−100で分析を行った。測定は、10mMのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液において、25℃で2回実施された。
Horiba SZ−100ソフトウェアを使用して、Horiba, Scientific Nanopartica、Nano Particle Analyzer、SZ−100で分析を行った。測定は、10mMのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液において、25℃で2回実施された。
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(200μL)のPEI−SiNP粒子の溶液(100μg)は、5分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに5分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。RNA(10μg)が、原材料から直接的に加えられ、3回再ピペットされて、混合された。溶液は冷蔵庫に5℃で、4時間安定した。得られた産物は、10mMのリン酸塩緩衝生理食塩水溶液(4.8mL)に再懸濁された。シリンジ(2mL)を使用して、電極セルに得られた溶液
を充填し、セルに目に見える泡がないことを確認し、ゼータ電位が記録された。
を充填し、セルに目に見える泡がないことを確認し、ゼータ電位が記録された。
安定性試験のためのPEI負荷されたシリカナノ粒子のin vitroのDNA負荷
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(1250μL)のPEI−SiNP粒子のストック溶液(500μg)は、5分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに5分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。この溶液は分割された(100μL)。DNAは1μLに分割することができるストック溶液に作製された。DNA(4μg)がDNAストック溶液から加えられ、3回再ピペットされて混合された。溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、550rpmで、4℃で6時間攪拌された。混合物は、DNA定量化のために、0、2及び6時間のタイムポイントで採取された。6時間で、溶液は、25℃で、10,900rpm、13分間微量遠心機にかけられた。上清はDNA定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のための6時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(1250μL)のPEI−SiNP粒子のストック溶液(500μg)は、5分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに5分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。この溶液は分割された(100μL)。DNAは1μLに分割することができるストック溶液に作製された。DNA(4μg)がDNAストック溶液から加えられ、3回再ピペットされて混合された。溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、550rpmで、4℃で6時間攪拌された。混合物は、DNA定量化のために、0、2及び6時間のタイムポイントで採取された。6時間で、溶液は、25℃で、10,900rpm、13分間微量遠心機にかけられた。上清はDNA定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のための6時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
ポジティブコントロール:ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(100μL)のDNA(4μg)が3回再ピペットされて、混合された。この処理は、2回実施され、1つの試料は、DNA定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のために直ちにスナップフリーズされた。その他の溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、550rpmで、4℃で6時間攪拌された。混合物は、DNA定量化のために、0、2及び6時間のタイムポイントで採取された。6時間で、溶液は、25℃で、10,900rpm、13分間微量遠心機にかけられた。上清はDNA定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のための6時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
ネガティブコントロール:ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(100μL)。
安定性試験のためのPEI負荷されたシリカナノ粒子のin vitroのRNA負荷
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(1250μL)のPEI−SiNP粒子のストック溶液(500μg)は、5分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに5分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。この溶液は分割され(100μL)、RNA(4μg)が、原材料から直接的に加えられ、3回再ピペットされて、混合された。溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、550rpmで、4℃で6時間攪拌された。混合物はDNA定量化のために0、2及び6時間のタイムポイントで採取され、キャピラリー電気泳動のための6時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(1250μL)のPEI−SiNP粒子のストック溶液(500μg)は、5分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに5分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。この溶液は分割され(100μL)、RNA(4μg)が、原材料から直接的に加えられ、3回再ピペットされて、混合された。溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、550rpmで、4℃で6時間攪拌された。混合物はDNA定量化のために0、2及び6時間のタイムポイントで採取され、キャピラリー電気泳動のための6時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
ポジティブコントロール:ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(100μL)のRNA(4μg)が3回再ピペットされて、混合された。この処理は、2回実施され、1つの試料は、RNA定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のために直ちにスナップフリーズされた。その他の溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、550rpmで、4℃で6時間攪拌された。混合物はRNA定量化のために0、2及び6時間のタイムポイントで採取され、キャピラリー電気泳動のための6時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
ネガティブコントロール:ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(100μL)。
安定性試験のためのPEI負荷されたシリカナノ粒子のin vivoのDNA負荷
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(100μL)の0.22μmのろ過された0.5%(w/v)のヒドロキシメチルセルロース中のPEI−S
iNP粒子の溶液(500μg)は、プレートシェーカーに500rpmで1分間攪拌された。溶液は、その後、10分間超音波処理され、再ピペットされ、さらに10分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに10分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。DNAは1μLに分割することができるストック溶液に作製された。DNA(50μg)がDNAストック溶液から加えられ、3回再ピペットされて混合された。溶液は、氷浴中、プレートシェーカーに550rpm、4℃で6時間、攪拌された。混合物は、DNAのために、0、2及び6時間のタイムポイントで採取された。6時間で、溶液は、25℃で、10,900rpm、13分間微量遠心機にかけられた。上清はDNA定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のための6時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(100μL)の0.22μmのろ過された0.5%(w/v)のヒドロキシメチルセルロース中のPEI−S
iNP粒子の溶液(500μg)は、プレートシェーカーに500rpmで1分間攪拌された。溶液は、その後、10分間超音波処理され、再ピペットされ、さらに10分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに10分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。DNAは1μLに分割することができるストック溶液に作製された。DNA(50μg)がDNAストック溶液から加えられ、3回再ピペットされて混合された。溶液は、氷浴中、プレートシェーカーに550rpm、4℃で6時間、攪拌された。混合物は、DNAのために、0、2及び6時間のタイムポイントで採取された。6時間で、溶液は、25℃で、10,900rpm、13分間微量遠心機にかけられた。上清はDNA定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のための6時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
ポジティブコントロール:ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(100μL)の0.22μmのろ過された0.5%(w/v)のヒドロキシメチルセルロース中のDNA(50μg)が3回再ピペットされて、混合された。この処理は、2回実施され、1つの試料は、DNA定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のために直ちにスナップフリーズされた。その他の溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、550rpmで、4℃で6時間攪拌された。混合物は、DNAのために、0、2及び6時間のタイムポイントで採取された。6時間で、溶液は、25℃で、10,900rpm、13分間微量遠心機にかけられた。上清はDNA定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のための6時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
ネガティブコントロール:0.22μmのろ過された0.5%(w/v)のヒドロキシメチルセルロースのヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(100μL)。
安定性試験のためのPET負荷されたシリカナノ粒子のin vivoのRNA負荷
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(100μL)の0.22μmのろ過された0.5%(w/v)のヒドロキシメチルセルロース中のPEI−SiNP粒子の溶液(500μg)は、プレートシェーカーに500rpmで1分間攪拌された。溶液は、その後、10分間超音波処理され、再ピペットされ、さらに10分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに10分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。RNA(50μg)が、原材料から直接的に加えられ、3回再ピペットされて、混合された。溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、550rpmで、4℃で6時間攪拌された。混合物はRNA定量化のために0、2及び6時間のタイムポイントで採取され、キャピラリー電気泳動のための6時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
ヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(100μL)の0.22μmのろ過された0.5%(w/v)のヒドロキシメチルセルロース中のPEI−SiNP粒子の溶液(500μg)は、プレートシェーカーに500rpmで1分間攪拌された。溶液は、その後、10分間超音波処理され、再ピペットされ、さらに10分間超音波処理され、再ピペットされ、その後、さらに10分間超音波処理されて、均一な濁った白色溶液を得た。RNA(50μg)が、原材料から直接的に加えられ、3回再ピペットされて、混合された。溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、550rpmで、4℃で6時間攪拌された。混合物はRNA定量化のために0、2及び6時間のタイムポイントで採取され、キャピラリー電気泳動のための6時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
ポジティブコントロール:0.22μmのろ過された0.5%(w/v)のヒドロキシメチルセルロースのヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(100μL)中のRNA(50μg)は、3回再ピペットされて、混合された。この処理は、2回実施され、1つの試料は、DNA定量化のために採取され、キャピラリー電気泳動のために直ちにスナップフリーズされた。その他の溶液は、プレートシェーカーで、氷浴中、550rpmで、4℃で6時間攪拌された。混合物はRNA定量化のために0、2及び6時間のタイムポイントで採取され、キャピラリー電気泳動のための6時間のタイムポイントでスナップフリーズされた。
ネガティブコントロール:0.22μmのろ過された0.5%(w/v)のヒドロキシメチルセルロースのヌクレアーゼのない10mMのリン酸塩バッファ生理食塩水溶液(100μL)。
DNA分析のためのキャピラリー電気泳動(CE)
CE分析の前に、上清のプラスミドDNA試料(オボアルブミン(OVA)pDNA及びヒトパピローマウイルス(HPV)pDNA)は、BamHI酵素で消化され、Monarch PCR&DNAクリーナップキットを使用して精製された。前処理されたプラスミドDNA試料は、その後、Lab Chip GXiiシステムで実行された。試料は、PerkinElmer社のDNA5K試薬キットを使用して分析された。低分子量及び高分子量のマーカー(キットマーカーバッファに存在する)は、それぞれの試料で実行された。分子量マーカー(DNA5K試薬キットからのDNAラダー)は、試料と共に実行された。
CE分析の前に、上清のプラスミドDNA試料(オボアルブミン(OVA)pDNA及びヒトパピローマウイルス(HPV)pDNA)は、BamHI酵素で消化され、Monarch PCR&DNAクリーナップキットを使用して精製された。前処理されたプラスミドDNA試料は、その後、Lab Chip GXiiシステムで実行された。試料は、PerkinElmer社のDNA5K試薬キットを使用して分析された。低分子量及び高分子量のマーカー(キットマーカーバッファに存在する)は、それぞれの試料で実行された。分子量マーカー(DNA5K試薬キットからのDNAラダー)は、試料と共に実行された。
RNA分析のためのキャピラリー電気泳動
上清のmRNA試料(OVA mRNA)は、Lab Chip GXiiシステムで実行された。試料は、PerkinElmer社のRNAピコアッセイ試薬キットを使用して分析された。mRNA試料は、RNAピコアッセイ試薬キットの試料バッファで前処理され、70℃で2分間加熱された。低分子量のマーカー(キット試料バッファに存在する)は、それぞれの試料と供に実行された。分子量マーカー(RNAピコアッセイ試薬キットからのRNAラダー)は、試料と共に実行された。
上清のmRNA試料(OVA mRNA)は、Lab Chip GXiiシステムで実行された。試料は、PerkinElmer社のRNAピコアッセイ試薬キットを使用して分析された。mRNA試料は、RNAピコアッセイ試薬キットの試料バッファで前処理され、70℃で2分間加熱された。低分子量のマーカー(キット試料バッファに存在する)は、それぞれの試料と供に実行された。分子量マーカー(RNAピコアッセイ試薬キットからのRNAラダー)は、試料と共に実行された。
結果及び検討
ナノ粒子の合成、特徴化及び負荷
10Lバッチのシリカナノ粒子の合成
10Lバッチのシリカナノ粒子は調製され、SiNP NUMed(バッチ11(IV))と呼ばれる。得られたブランクのシリカナノ粒子は、粒径及び外観についてSEMによって特徴付けられた。
ナノ粒子の合成、特徴化及び負荷
10Lバッチのシリカナノ粒子の合成
10Lバッチのシリカナノ粒子は調製され、SiNP NUMed(バッチ11(IV))と呼ばれる。得られたブランクのシリカナノ粒子は、粒径及び外観についてSEMによって特徴付けられた。
図44は、SiNP NUMedについてのSEM画像を示す。粒子分析はSEM画像上で実施され、計算された結果は、粒子は203±25nmの平均粒径(カウント161、標準偏差24.6nm、モード204nm)を有することを示す。均一な粒子(PDI0.12)がSEM画像に観察され、粒子は、所望の先端の尖った表面モルフォロジーを有するように見える。
図45は、SiNP NUMedについてのTEM画像を示す。195nmの平均粒径は、TEM画像の分析から計算された。平均コア径は、96nmとして計算され、シェルの平均厚は、51.35nmとして計算された。
粒子の表面積は、PEI及び続く核酸の負荷にとって重要であり、Brunauer−Emmett−Teller(BET)窒素収着によって決定される。172m2/gの表面積は、SiNP NUMedナノ粒子について決定された。
30mgスケールのシリカナノ粒子のPEI負荷
PEI SiNP NUMedのゼータ電位は1、2、3回実行され、それぞれ3.9、7.9及び22.2mVであることが分かった。これは、PEIの負荷を示す。
PEI SiNP NUMedのゼータ電位は1、2、3回実行され、それぞれ3.9、7.9及び22.2mVであることが分かった。これは、PEIの負荷を示す。
5gスケールのシリカナノ粒子のPEI負荷
PEI SiNP0011IIのゼータ電位は1及び2回実行され、それぞれ18.1及び15.8mVであることが分かった。これは、PEIの負荷を示す。
PEI SiNP0011IIのゼータ電位は1及び2回実行され、それぞれ18.1及び15.8mVであることが分かった。これは、PEIの負荷を示す。
PEI負荷されたシリカナノ粒子のDNA負荷
PEI負荷されたSiNPナノ粒子のバッチは、3回eGFP pDNAで負荷された。表18は、粒子がeGFP DNAの負荷に成功したことを示す。
PEI負荷されたSiNPナノ粒子のバッチは、3回eGFP pDNAで負荷された。表18は、粒子がeGFP DNAの負荷に成功したことを示す。
OVA及びHPV核酸(pDNA及びmRNA)の負荷及び定量化
OVA pDNA、HPV pDNA及びOVA mRNAの負荷は、溶液中のDNA/RNA濃度を分析することによって試験が行われて、粒子表面対ポジティブコントロールにおいて、濃度を逆算した。ゼータ電位分析も使用して、ポジティブ(PEI)からネガティブ(核酸)までの粒子の表面電荷の変化を確認した。
OVA pDNA、HPV pDNA及びOVA mRNAの負荷は、溶液中のDNA/RNA濃度を分析することによって試験が行われて、粒子表面対ポジティブコントロールにおいて、濃度を逆算した。ゼータ電位分析も使用して、ポジティブ(PEI)からネガティブ(核酸)までの粒子の表面電荷の変化を確認した。
PEI負荷されたシリカナノ粒子のOVA pDNA負荷
PEI負荷されたSiNPは、OVA DNAを3回負荷された。0及び4時間のタイムポイントでの100〜140ng/μgの標的範囲対ポジティブコントロールにおける負荷は、表19に示されるように達成された。
PEI負荷されたSiNPは、OVA DNAを3回負荷された。0及び4時間のタイムポイントでの100〜140ng/μgの標的範囲対ポジティブコントロールにおける負荷は、表19に示されるように達成された。
OVA DNAを負荷された粒子のゼータ電位分析は、核酸の負荷を示す予想された負表面電荷(−8.8mV)を示す。
PEI負荷されたシリカナノ粒子のHPV pDNA負荷
PEI負荷されたSiNPナノ粒子へのHPV pDNAの負荷の成功が観察された。pDNA負荷の結果を表20に示す。
PEI負荷されたSiNPナノ粒子へのHPV pDNAの負荷の成功が観察された。pDNA負荷の結果を表20に示す。
HPV DNAを負荷された粒子の対応するゼータ電位分析は、核酸の負荷を示す予想される負表面電荷(−7.8mV)を示す。
PEI負荷されたシリカナノ粒子のOVA mRNA負荷
OVA mRNAを使用して負荷実験が繰り返され、Qubit蛍光アッセイを使用して分析が実施された。周囲温度での遠心分離の間のmRNAの安定性についての関心によって、DNAについて使用された時間(13分)よりも短い時間(3分)遠心分離が実施された。
OVA mRNAを使用して負荷実験が繰り返され、Qubit蛍光アッセイを使用して分析が実施された。周囲温度での遠心分離の間のmRNAの安定性についての関心によって、DNAについて使用された時間(13分)よりも短い時間(3分)遠心分離が実施された。
OVA mRNAは、PEI−負荷SiNPへの負荷が成功したことが分かった。負荷の結果を表21に示す。
OVA mRNAについてのゼータ電位分析は、OVA及びHPV pDNAからの結果と同様であり、粒子の表面がmRNAによって改変されたことを示す負表面電荷(−6.7mV)を示す。
PEI−SiNPに負荷されるpDNA及びmRNAの安定性
PEI−SiNPに負荷されるpDNA及びmRNAの安定性は、DNA定量化及びキャピラリー電気泳動によって負荷してから6時間後に評価された。OVA pDNA、OVA mRNA及びHPV pDNAの全てが6時間後にSiNPに上手く負荷され続け、pDNA又はmRNAについて、分解は観察されなかった。
PEI−SiNPに負荷されるpDNA及びmRNAの安定性は、DNA定量化及びキャピラリー電気泳動によって負荷してから6時間後に評価された。OVA pDNA、OVA mRNA及びHPV pDNAの全てが6時間後にSiNPに上手く負荷され続け、pDNA又はmRNAについて、分解は観察されなかった。
実施例4−脾細胞の増殖に対するOVA pDNAを負荷されたSiNPの効果
免疫応答の発生における異なる量のOVA pDNA(Ram−DNA)を負荷されたSiNP中空ナノ粒子の効果がマウス脾細胞増殖において評価され、コントロール(PBS)、OVA(オボアルブミンタンパク質)、OVA−CFA(オボアルブミンタンパク質/完全Freundアジュバント)、pDNA(オボアルブミンDNA単独)、JET−DNA(オボアルブミンDNA/JET PEIトランスフェクション剤)及び負荷されていないSiNP(Ram−75mg/kg)と比較された。マウスは0、7及び14日目に免疫化され、脾細胞の単離のために脾臓が28日目に回収された。脾細胞はOVA刺激のある場合とない場合で、48時間96ウェルプレートに播種された。MTT分析が実施されて、1群につき6匹のマウスの脾細胞の相対数を3回分析した。
免疫応答の発生における異なる量のOVA pDNA(Ram−DNA)を負荷されたSiNP中空ナノ粒子の効果がマウス脾細胞増殖において評価され、コントロール(PBS)、OVA(オボアルブミンタンパク質)、OVA−CFA(オボアルブミンタンパク質/完全Freundアジュバント)、pDNA(オボアルブミンDNA単独)、JET−DNA(オボアルブミンDNA/JET PEIトランスフェクション剤)及び負荷されていないSiNP(Ram−75mg/kg)と比較された。マウスは0、7及び14日目に免疫化され、脾細胞の単離のために脾臓が28日目に回収された。脾細胞はOVA刺激のある場合とない場合で、48時間96ウェルプレートに播種された。MTT分析が実施されて、1群につき6匹のマウスの脾細胞の相対数を3回分析した。
結果を、図46に示す。SiNP中空ナノ粒子が脾細胞の増殖の刺激の増加を導くことを知ることができる。
実施例5−SiNPを使用した癌細胞株のトランスフェクション
中空SiNPにpGL4.13[luc2/SV40]プラスミドDNA(Promegaから入手)を負荷した。pGL4.13[luc2/SV40]pDNAは、ルシフェラーゼをコードし、発光によってトランスフェクションの成功を検出するために使用することができる。
中空SiNPにpGL4.13[luc2/SV40]プラスミドDNA(Promegaから入手)を負荷した。pGL4.13[luc2/SV40]pDNAは、ルシフェラーゼをコードし、発光によってトランスフェクションの成功を検出するために使用することができる。
トランスフェクションから48時間後のトランスフェクションの有効性が3つの細胞株:CT26、HCT116及びHEK293で評価された。CT26は、癌モデルとして使用されることの多いマウス結腸癌細胞株である。CT26は、アグレッシブ、未分化、難治性ヒト結腸癌細胞と分子特徴を共有する。HCT116は、治療的調査及び薬剤スクリーニングに使用されるヒト結腸癌細胞株である。HEK293は、1次胚ヒト腎細胞から確立される永久細胞株である。HEK293は、組み換えDNA又は遺伝子産物の産生及び細胞試料についてのウイルスの産生に使用される。
3つの細胞株のトランスフェクションの結果を、図47に示す。pDNAを負荷されたSiNPによるトランスフェクションは、裸pDNA及びpDNAのないSiNPと比較された。SiNPは、ルシフェラーゼ遺伝子を3つの異なる細胞種に上手くトランスフェクションすることを可能にすることが分かり、その2つは、癌治療のモデルであり、その1つは細胞治療ベクターの産生に一般的に使用される。
実施例6−SiNPの表面の改質
約330nmの直径を有するRam−SNPの合成
レゾルシノール(0.2g)及びホルムアルデヒド(37重量%、0.28mL)が、アンモニア水性溶液(28重量%、3.0mL)、脱イオン水(10mL)及びエタノール(70mL)から成る溶液に加えられた。混合物は、室温で6時間強く攪拌され、その後、0.6mLのテトラエチルオルトケイ酸塩(TEOS)が溶液に加えられ、8分間攪拌され、その後、レゾルシノール(0.4g)及びホルムアルデヒド(37重量%、0.56mL)が第2に加えられた。混合物は室温で2時間攪拌され、その後、150℃で24時間の水熱処理のためにオートクレーブに移された。RFシリカ粒子は、その後、遠心分離によって回収され、エタノールで洗浄され、50℃で乾燥された。最後に、空気中、
550℃で5時間焼成された後に、Ram−SNPは回収された(「Ram」はランブータン様構造を指す)。
約330nmの直径を有するRam−SNPの合成
レゾルシノール(0.2g)及びホルムアルデヒド(37重量%、0.28mL)が、アンモニア水性溶液(28重量%、3.0mL)、脱イオン水(10mL)及びエタノール(70mL)から成る溶液に加えられた。混合物は、室温で6時間強く攪拌され、その後、0.6mLのテトラエチルオルトケイ酸塩(TEOS)が溶液に加えられ、8分間攪拌され、その後、レゾルシノール(0.4g)及びホルムアルデヒド(37重量%、0.56mL)が第2に加えられた。混合物は室温で2時間攪拌され、その後、150℃で24時間の水熱処理のためにオートクレーブに移された。RFシリカ粒子は、その後、遠心分離によって回収され、エタノールで洗浄され、50℃で乾燥された。最後に、空気中、
550℃で5時間焼成された後に、Ram−SNPは回収された(「Ram」はランブータン様構造を指す)。
スムースシリカナノ粒子(S−SNP)、ラズベリーシリカナノ粒子(Ras−SNP)及び花様シリカナノ粒子(Flw−SNP)の合成
S−SNPの合成のために、レゾルシノール(0.2g)及びホルムアルデヒド(37重量%、0.28mL)が、アンモニア水性溶液(28重量%、3.0mL)、脱イオン水(10mL)及びエタノール(70mL)から成る溶液に加えられた。混合物は、室温で6時間強く攪拌され、その後、1.4mLのTEOSが溶液に加えられ、遠心分離を行う前に2時間攪拌されて、固体産物を回収した。Ras−SNPの合成のために、レゾルシノール(0.2g)及びホルムアルデヒド(37重量%、0.28mL)が、アンモニア水性溶液(28重量%、3.0mL)、脱イオン水(10mL)及びエタノール(70mL)から成る溶液に加えられた。混合物は、室温で18時間強く攪拌され、その後、0.6mLのTEOSが溶液に加えられ、遠心分離を行う前に2時間攪拌されて、固体産物を回収した。Flw−SNPの合成のために、プロトコルは、我々の以前の刊行物に基づく。9mLのMilli−Q水、0.3gのTEA及び1mLのCTAC溶液が60℃で1時間混合され、次に、混合物に、9.5mLのクロロベンゼン及び25μLのAPTESが加えられた。反応溶液は、60℃で1時間攪拌されて保持された。その後、0.5mLのTEOSが反応溶液に加えられ、24時間攪拌された。固体試料は、20,000rpmで10分間の遠心分離によって回収され、その後、エタノールで洗浄された。全ての試料は、さらに550℃で5時間、空気中に焼成されて、テンプレート又は界面活性薬剤を取り除いた。
S−SNPの合成のために、レゾルシノール(0.2g)及びホルムアルデヒド(37重量%、0.28mL)が、アンモニア水性溶液(28重量%、3.0mL)、脱イオン水(10mL)及びエタノール(70mL)から成る溶液に加えられた。混合物は、室温で6時間強く攪拌され、その後、1.4mLのTEOSが溶液に加えられ、遠心分離を行う前に2時間攪拌されて、固体産物を回収した。Ras−SNPの合成のために、レゾルシノール(0.2g)及びホルムアルデヒド(37重量%、0.28mL)が、アンモニア水性溶液(28重量%、3.0mL)、脱イオン水(10mL)及びエタノール(70mL)から成る溶液に加えられた。混合物は、室温で18時間強く攪拌され、その後、0.6mLのTEOSが溶液に加えられ、遠心分離を行う前に2時間攪拌されて、固体産物を回収した。Flw−SNPの合成のために、プロトコルは、我々の以前の刊行物に基づく。9mLのMilli−Q水、0.3gのTEA及び1mLのCTAC溶液が60℃で1時間混合され、次に、混合物に、9.5mLのクロロベンゼン及び25μLのAPTESが加えられた。反応溶液は、60℃で1時間攪拌されて保持された。その後、0.5mLのTEOSが反応溶液に加えられ、24時間攪拌された。固体試料は、20,000rpmで10分間の遠心分離によって回収され、その後、エタノールで洗浄された。全ての試料は、さらに550℃で5時間、空気中に焼成されて、テンプレート又は界面活性薬剤を取り除いた。
特徴化
シリカナノ粒子の形態は、100kVで動作されるJEOL1010顕微鏡を使用して走査型電子顕微鏡(TEM)によって特徴付けられた。窒素収着分析は、Micromeritics Tristar3020を使用して実施された。測定する前に、全ての試料は、真空下で、80℃で少なくとも12時間脱ガスされた。孔径分布は、吸着枝から生じるBarret− Joyner−Halenda(BJH)方法に従って計算された。シリカナノ粒子のゼータ電位は、Malvern Instrument社のZetasizer Nano−ZSを使用してPBSにおいて測定された。PE1結合ナノ粒子の窒素含有量は、Thermo Flash EA1112Seriesを使用して、CHNS−O Elemental Analyzerによって決定された。
シリカナノ粒子の形態は、100kVで動作されるJEOL1010顕微鏡を使用して走査型電子顕微鏡(TEM)によって特徴付けられた。窒素収着分析は、Micromeritics Tristar3020を使用して実施された。測定する前に、全ての試料は、真空下で、80℃で少なくとも12時間脱ガスされた。孔径分布は、吸着枝から生じるBarret− Joyner−Halenda(BJH)方法に従って計算された。シリカナノ粒子のゼータ電位は、Malvern Instrument社のZetasizer Nano−ZSを使用してPBSにおいて測定された。PE1結合ナノ粒子の窒素含有量は、Thermo Flash EA1112Seriesを使用して、CHNS−O Elemental Analyzerによって決定された。
結果
S−SNP、Ras−SNP及びRam−SNPは、合成パラメータを変化することによって、RFシリカ合成システムを使用して得ることができ、TEM画像(図48b−d)は、それらの表面トポロジーを明白に示す。これらの3つの種類のSNPの粒径は、TEMから計算されるように、310〜350nmであった。窒素収着分析の結果は図48e−fに示され、Ram−SNPは、142m2/gの表面積、0.64cm3/gの孔容積及び20nm超の孔径を示した。裸シリカナノ粒子の表面電荷は図48gに示されるように、負であった。これらのシリカナノ粒子のゼータ電位は、PEI結合後に約−20〜30mVから+10mVまで変化した。
S−SNP、Ras−SNP及びRam−SNPは、合成パラメータを変化することによって、RFシリカ合成システムを使用して得ることができ、TEM画像(図48b−d)は、それらの表面トポロジーを明白に示す。これらの3つの種類のSNPの粒径は、TEMから計算されるように、310〜350nmであった。窒素収着分析の結果は図48e−fに示され、Ram−SNPは、142m2/gの表面積、0.64cm3/gの孔容積及び20nm超の孔径を示した。裸シリカナノ粒子の表面電荷は図48gに示されるように、負であった。これらのシリカナノ粒子のゼータ電位は、PEI結合後に約−20〜30mVから+10mVまで変化した。
表面機能性の方法の選択
トランスフェクションは、細胞膜のバリアを横切る粒子が正電荷される場合、より効果的である。これは、正電荷された粒子が細胞膜の負電荷された表面と共に有するという有利な相互関係に起因する。表面改質の方法は、したがって、裸のシリカの生来負電荷の表面に正電荷する異なる方法に焦点を置いた。この薬剤の正電荷された表面を作製する能力について良く知られているため、ポリエチレンイミン(PEI)の改質の種類を変えるこ
とが発見された。
トランスフェクションは、細胞膜のバリアを横切る粒子が正電荷される場合、より効果的である。これは、正電荷された粒子が細胞膜の負電荷された表面と共に有するという有利な相互関係に起因する。表面改質の方法は、したがって、裸のシリカの生来負電荷の表面に正電荷する異なる方法に焦点を置いた。この薬剤の正電荷された表面を作製する能力について良く知られているため、ポリエチレンイミン(PEI)の改質の種類を変えるこ
とが発見された。
方法
シリカナノ粒子のPEI改質−エポキシ基によるPEIの共有結合
この基において、PEI分子がシリカの表面に付着されるエポキシ基と共有結合することによって、様々なサイズのPEI分子がシリカ粒子の表面に付着された。100mgのシリカナノ粒子は、30mLのトルエンに浸漬され、その後、攪拌及び窒素ガスブラケット保護下で、70℃で15分間還流された。その後、1.5mLの(3−グリシジルオキシプロピル)トリメトキシシラン(3−GPS)は、溶液に加えられて、エポキシ基で集合されたシリカ表面を生成し、さらに24時間還流された。固体産物は、10,000rpmで10分間遠心分離によって回収され、最初にトルエン、その後メタノールで2回洗浄された。エポキシ基を有する粒子は、その後、空気中、室温で乾燥された。50mgのエポキシ基修飾シリカナノ粒子は、250mgのPEI分子(異なる分子量:1.8k、10k及び25k)と、100mLの50mM(pH9.5)の炭酸塩バッファ溶液に混合された。混合物は、24時間攪拌され、その後、固体産物は、遠心分離及び水による洗浄によって回収された。固体産物は、その後、20mLの1g/L(pH9)のエタノールアミン溶液に再懸濁され、室温で6時間攪拌された。最終的なPEI改質粒子は、遠心分離によって回収され、水/エタノールによる洗浄によって精製され、室温で乾燥された。
シリカナノ粒子のPEI改質−エポキシ基によるPEIの共有結合
この基において、PEI分子がシリカの表面に付着されるエポキシ基と共有結合することによって、様々なサイズのPEI分子がシリカ粒子の表面に付着された。100mgのシリカナノ粒子は、30mLのトルエンに浸漬され、その後、攪拌及び窒素ガスブラケット保護下で、70℃で15分間還流された。その後、1.5mLの(3−グリシジルオキシプロピル)トリメトキシシラン(3−GPS)は、溶液に加えられて、エポキシ基で集合されたシリカ表面を生成し、さらに24時間還流された。固体産物は、10,000rpmで10分間遠心分離によって回収され、最初にトルエン、その後メタノールで2回洗浄された。エポキシ基を有する粒子は、その後、空気中、室温で乾燥された。50mgのエポキシ基修飾シリカナノ粒子は、250mgのPEI分子(異なる分子量:1.8k、10k及び25k)と、100mLの50mM(pH9.5)の炭酸塩バッファ溶液に混合された。混合物は、24時間攪拌され、その後、固体産物は、遠心分離及び水による洗浄によって回収された。固体産物は、その後、20mLの1g/L(pH9)のエタノールアミン溶液に再懸濁され、室温で6時間攪拌された。最終的なPEI改質粒子は、遠心分離によって回収され、水/エタノールによる洗浄によって精製され、室温で乾燥された。
シリカナノ粒子のPEI改質−ホスホン酸塩基による強い静電引力
PEIとの強い静電引力を使用して、シリカにPEIを付着させる代替の方法が発見された。これは、PEI分子に静電気的に結合するシリカ表面に結合されホスホン酸塩基を使用した。ホスホン酸塩表面基に付着するために、30mgのシリカナノ粒子が10mLの水に分散され、水酸化アンモニウムを使用して、pHが10に調節された。その後、10mLの粒子溶液が、40℃で2時間攪拌することによって、表面ホスホン酸塩修飾について、10mLの56mMの3−(トリヒドロキシシリル)プロピルメチルホスホン酸一ナトリウム塩(THPMP)溶液と混合された。固体産物は、遠心分離によって回収され、水で全体的に洗浄された。固体産物は、その後、150mgのPEI分子を含有する15mLの水又はエタノールに再懸濁された。室温で4時間攪拌された後、PEI改質ナノ粒子は、遠心分離、水による洗浄及び室温での乾燥によって得られた。
PEIとの強い静電引力を使用して、シリカにPEIを付着させる代替の方法が発見された。これは、PEI分子に静電気的に結合するシリカ表面に結合されホスホン酸塩基を使用した。ホスホン酸塩表面基に付着するために、30mgのシリカナノ粒子が10mLの水に分散され、水酸化アンモニウムを使用して、pHが10に調節された。その後、10mLの粒子溶液が、40℃で2時間攪拌することによって、表面ホスホン酸塩修飾について、10mLの56mMの3−(トリヒドロキシシリル)プロピルメチルホスホン酸一ナトリウム塩(THPMP)溶液と混合された。固体産物は、遠心分離によって回収され、水で全体的に洗浄された。固体産物は、その後、150mgのPEI分子を含有する15mLの水又はエタノールに再懸濁された。室温で4時間攪拌された後、PEI改質ナノ粒子は、遠心分離、水による洗浄及び室温での乾燥によって得られた。
結果
裸のシリカナノ粒子は、予想される負電荷表面電荷を有し、負電荷されたpcDNAの吸着について同一ではない。シリカナノ粒子とpcDNAとの強い結合を達成するために、PEIがシリカナノ粒子の表面に結合されて、正の表面電荷を生じた。しかしながら、共有結合及び強い静電引力を含むPEIをシリカナノ粒子上で結合する様々な方法がある。シリカナノ粒子は、これらの2つのPEI結合モードに従って、比較のために修飾された。図49に示されるように、シリカナノ粒子は、最初に3−GPSによって修飾され、エポキシ基を粒子の表面に結合し、さらに、PEI分子のアミノ基との共有結合をさらに形成することができる。あるいは、シリカナノ粒子の表面は、THPMPで改質され、多くのホスホン酸塩基をシリカ表面に付着し、さらに、シリカナノ粒子の負の表面電荷を増加し、正電荷されたPEI分子との強い静電引力を可能にする。
裸のシリカナノ粒子は、予想される負電荷表面電荷を有し、負電荷されたpcDNAの吸着について同一ではない。シリカナノ粒子とpcDNAとの強い結合を達成するために、PEIがシリカナノ粒子の表面に結合されて、正の表面電荷を生じた。しかしながら、共有結合及び強い静電引力を含むPEIをシリカナノ粒子上で結合する様々な方法がある。シリカナノ粒子は、これらの2つのPEI結合モードに従って、比較のために修飾された。図49に示されるように、シリカナノ粒子は、最初に3−GPSによって修飾され、エポキシ基を粒子の表面に結合し、さらに、PEI分子のアミノ基との共有結合をさらに形成することができる。あるいは、シリカナノ粒子の表面は、THPMPで改質され、多くのホスホン酸塩基をシリカ表面に付着し、さらに、シリカナノ粒子の負の表面電荷を増加し、正電荷されたPEI分子との強い静電引力を可能にする。
改質の間に付着されたPEIの量は、結合の後に粒子の元素分析によって分析された。裸のシリカナノ粒子又は3−GPS/THPMP修飾粒子に窒素原子が含まれないため、窒素含有量だけが、粒子に付着されるPEIから与えられる。表22に示されるように、試験対象の4種類の粒子についての窒素含有量は、Ram−SNP>Ras−SNP>S−SNPの傾向を示し、表面積の差に起因し得る。2種類のPEI結合を比較すると、ホスホン酸塩修飾後のナノ粒子が表面のPEIにより結合する。これらの2種類のPEI結合の他に、シリカナノ粒子の表面のPEIの物理的吸着も試験することができ、粒子にお
いて3.1%の窒素含有量を示した。しかしながら、物理的に吸着されたPEIは、3−GPS及びTHPMPによって付着されるPEIほど強く結合しないことが予想される。
いて3.1%の窒素含有量を示した。しかしながら、物理的に吸着されたPEIは、3−GPS及びTHPMPによって付着されるPEIほど強く結合しないことが予想される。
PEI結合モードとは別に、PEIの分子量もpcDNA結合及びトランスフェクション効率に影響する。ここで、1.8k、10k及び25kの分子量を有するPEIは、さらなる比較するために、シリカナノ粒子に共有結合された。
pcDNA負荷及びゲル電気泳動
方法
pcDNA負荷
1μgのpcDNAは、10μLのPBS溶液において、5μgのPEIと共有結合的に修飾されたシリカナノ粒子と4℃で4時間、混合された。その後、混合物は、15,000rpmで10分間遠心分離にかけられ、上清は、Nanodropによって、pcDNA残存量の定量化のために使用された。
方法
pcDNA負荷
1μgのpcDNAは、10μLのPBS溶液において、5μgのPEIと共有結合的に修飾されたシリカナノ粒子と4℃で4時間、混合された。その後、混合物は、15,000rpmで10分間遠心分離にかけられ、上清は、Nanodropによって、pcDNA残存量の定量化のために使用された。
ゲル電気泳動
0.5μgのpcDNAは、0〜5、10、20、40及び60μgの範囲のシリカ用量でシリカナノ粒子と混合された。混合物は、4℃で4時間インキュベートされ、その後、2mLの核酸試料バッファが混合物に加えられ、10μLの合計溶液量を形成した。アガロースゲルを調製するために、2.5gの高純度のアガロースが250mLのMilli−Q水に加えられ、その後、マイクロ波照射の下、ボイルされて、アガロースを完全に溶解した。アガロース溶液が冷却した後、25μLのSYBR−Safeゲル染色(10,000倍)が溶液に加えられた。溶液は、最終的に、ゲル容器に注がれ、20分間冷却されて、ゲルを形成した。ゲルを有するゲル容器は、タンクに移され、TEAバッファを充填して、ゲルを浸漬した。その後、10μLのpcDNA溶液は、ゲルの孔に1つずつ注入され、電気泳動のために電圧は80Vで50分間設定された。電気泳動の後のゲルは、1つずつ記録された。
0.5μgのpcDNAは、0〜5、10、20、40及び60μgの範囲のシリカ用量でシリカナノ粒子と混合された。混合物は、4℃で4時間インキュベートされ、その後、2mLの核酸試料バッファが混合物に加えられ、10μLの合計溶液量を形成した。アガロースゲルを調製するために、2.5gの高純度のアガロースが250mLのMilli−Q水に加えられ、その後、マイクロ波照射の下、ボイルされて、アガロースを完全に溶解した。アガロース溶液が冷却した後、25μLのSYBR−Safeゲル染色(10,000倍)が溶液に加えられた。溶液は、最終的に、ゲル容器に注がれ、20分間冷却されて、ゲルを形成した。ゲルを有するゲル容器は、タンクに移され、TEAバッファを充填して、ゲルを浸漬した。その後、10μLのpcDNA溶液は、ゲルの孔に1つずつ注入され、電気泳動のために電圧は80Vで50分間設定された。電気泳動の後のゲルは、1つずつ記録された。
結果
6.1kDの分子量のpcDNAを発現するGFPがこの研究で使用された。シリカナノ粒子のpcDNAの負荷能力は、PEIと共有結合され、観察された。図50に示されるように、異なる分子量のPEIで修飾されたRam−SNPは、約100μg/μgの最も高いDNA負荷能力を示した。しかしながら、S−SNP及びRas−SNPは、50μg/μg未満の負荷を達成することができるのみである。これは、表面積及びpcDNAを収容する孔容積の差から生じ得る。Ram−SNPのランブータン様構造は、表面
スパイクのロープ様pcDNAのもつれを支持し得、溶液においてpcDNAと容易でしっかりとした結合を可能にする。
6.1kDの分子量のpcDNAを発現するGFPがこの研究で使用された。シリカナノ粒子のpcDNAの負荷能力は、PEIと共有結合され、観察された。図50に示されるように、異なる分子量のPEIで修飾されたRam−SNPは、約100μg/μgの最も高いDNA負荷能力を示した。しかしながら、S−SNP及びRas−SNPは、50μg/μg未満の負荷を達成することができるのみである。これは、表面積及びpcDNAを収容する孔容積の差から生じ得る。Ram−SNPのランブータン様構造は、表面
スパイクのロープ様pcDNAのもつれを支持し得、溶液においてpcDNAと容易でしっかりとした結合を可能にする。
PEI修飾シリカナノ粒子とpcDNAとの間の結合親和性の差をさらに実証するために、ゲル電気泳動が比較のために使用された。全ての群において、pcDNAに対するシリカナノ粒子の比を増加することは(pcDNA負荷を減少する)、放出されるpcDNAの量を減少した。このことは、低い負荷レベルのpcDNAが、粒子の表面に密接に結合され、したがって強く結合されるという直観的な観点から分かる。負荷されるpcDNAの外層は、根底にあるpcDNA層に徐々に結合され、pcDNAに強く接着するように設計される改質されたシリカ表面には結合しないため、より多くのpcDNAが粒子に負荷されるほど、負荷されるpcDNAの追加の層がそれほど強く結合しないことが予想される。この発見は、pcDNAがシリカナノ粒子にきつく結合されすぎて、シリカ粒子に結合できず、粒子は細胞に入ると、放出することができない場合、有効なトランスフェクションが妨げられる可能性があるという意味を有し得る。トランスフェクション効率は、したがって、シリカ粒子に負荷するpcDNAを増加することによって、促進することができる。
シリカナノ粒子の表面に結合されるPEIの分子量が多いほど、測定される多くの粒子についてより強い結合親和性を達成することができる。4つの種類のシリカ粒子を比較して、製剤からのpcDNAバンドの放出は、全ての負荷レベルで、いつも識別することができる。Ras−SNPは、S−SNPに対する僅かに改善された結合親和性のみを示し、pcDNAとS−SNP表面との間の弱い結合を示した。10kのPEIで修飾されたRam−SNPは、1/10のpcDNA/SiCfi重量比で、pcDNAの放出がない状態で最も強い結合を示した。
HEK−293細胞のトランスフェクション効率について粒子ライブラリのスクリーニング
良く知られているHEK−293細胞株を使用して、前述のシリカ/pcDNA変異体及びリポフェクタミン2000市販薬とのin vitroのトランスフェクション効率を比較した。
良く知られているHEK−293細胞株を使用して、前述のシリカ/pcDNA変異体及びリポフェクタミン2000市販薬とのin vitroのトランスフェクション効率を比較した。
方法
共有結合によってPEIに結合されるシリカナノ粒子が、この試験の組に使用された。一般的なトランスフェクション工程について、HEK−293T細胞が、1ウェルにつき2x105細胞の密度で、6ウェルプレートに24時間インキュベートされ、70〜90%のコンフルエンシーを達成した。80μgのPEI修飾UQシリカ粒子は、50μLのPBSにおいて、4℃で4時間、2.5μgのeGFP−pcDNA(31μgのpcDNA/mgのシリカの負荷)と混合された。これは、比較的低いpcDNA負荷レベル(前述のRam−SNP粒子について測定された100μg/μgのレベルよりかなり低い)であるが、同負荷が異なる粒子の種類に使用されて、そのいくつかが、図50に示されるように、より高い負荷になることができないように選択されたことに留意されたい。混合物は、その後、10%のFBS及び1%のPSを含有する2mLのDMEM培地に移された。プレートの培地は、その後、粒子を含む培地に置き換えられ、その後、さらに48時間培養された。続いて、細胞は、PBSで洗浄され、その後、500μLの4%のPFAで固定された。細胞は、共焦点顕微鏡(LSM Zeiss710)を使用して見られ、又はフローサイトメトリー分析(accuri M6)を使用して見られた。
共有結合によってPEIに結合されるシリカナノ粒子が、この試験の組に使用された。一般的なトランスフェクション工程について、HEK−293T細胞が、1ウェルにつき2x105細胞の密度で、6ウェルプレートに24時間インキュベートされ、70〜90%のコンフルエンシーを達成した。80μgのPEI修飾UQシリカ粒子は、50μLのPBSにおいて、4℃で4時間、2.5μgのeGFP−pcDNA(31μgのpcDNA/mgのシリカの負荷)と混合された。これは、比較的低いpcDNA負荷レベル(前述のRam−SNP粒子について測定された100μg/μgのレベルよりかなり低い)であるが、同負荷が異なる粒子の種類に使用されて、そのいくつかが、図50に示されるように、より高い負荷になることができないように選択されたことに留意されたい。混合物は、その後、10%のFBS及び1%のPSを含有する2mLのDMEM培地に移された。プレートの培地は、その後、粒子を含む培地に置き換えられ、その後、さらに48時間培養された。続いて、細胞は、PBSで洗浄され、その後、500μLの4%のPFAで固定された。細胞は、共焦点顕微鏡(LSM Zeiss710)を使用して見られ、又はフローサイトメトリー分析(accuri M6)を使用して見られた。
結果
前述に示されるように、PEIに共有結合されるシリカナノ粒子は、高いpcDNA負荷能力及び強い結合親和性を示した。ここでは、トランスフェクション効率は、さらにH
EK−293T細胞株に観察される。共焦点顕微鏡の画像は、異なる種類のシリカナノ粒子を使用して、HEK−293T細胞のGFP発現を明白に示した。1.8kのPEIで修飾されたシリカナノ粒子と比較して、より大きい分子量のPEIで修飾されたベクターは、より明るい緑色の蛍光で改善されたpcDNAの送達効率を示した。しかしながら、25kのPEIが重度の細胞毒性を示すことが明確に記載されている。したがって、1O0kのPEIを使用した修飾が最適であると考えられる。3種類のシリカナノ粒子を比較して、Ram−SNPは、明白な強い緑色の蛍光で、非常に増強されたpcDNA送達効率を示した。この結果は、Ram−SNPのユニークな構造が、Ram−SNPのユニークな先端の尖った表面を有しない同様のシリカ粒子と比較して優れたトランスフェクション効率を提供することを明白に実証する。この比較の重要性は、前者について観察されたより強いpcDNA結合親和性によって、その他のSNPに対して有利ではなく、細胞の細胞質におけるpcDNAの不完全な放出を導く可能性があるという事実によって強調される。
前述に示されるように、PEIに共有結合されるシリカナノ粒子は、高いpcDNA負荷能力及び強い結合親和性を示した。ここでは、トランスフェクション効率は、さらにH
EK−293T細胞株に観察される。共焦点顕微鏡の画像は、異なる種類のシリカナノ粒子を使用して、HEK−293T細胞のGFP発現を明白に示した。1.8kのPEIで修飾されたシリカナノ粒子と比較して、より大きい分子量のPEIで修飾されたベクターは、より明るい緑色の蛍光で改善されたpcDNAの送達効率を示した。しかしながら、25kのPEIが重度の細胞毒性を示すことが明確に記載されている。したがって、1O0kのPEIを使用した修飾が最適であると考えられる。3種類のシリカナノ粒子を比較して、Ram−SNPは、明白な強い緑色の蛍光で、非常に増強されたpcDNA送達効率を示した。この結果は、Ram−SNPのユニークな構造が、Ram−SNPのユニークな先端の尖った表面を有しない同様のシリカ粒子と比較して優れたトランスフェクション効率を提供することを明白に実証する。この比較の重要性は、前者について観察されたより強いpcDNA結合親和性によって、その他のSNPに対して有利ではなく、細胞の細胞質におけるpcDNAの不完全な放出を導く可能性があるという事実によって強調される。
pcDNAトランスフェクション効率は、さらに、フローサイトメトリーを使用して定量的に分析された。表23に要約するように、裸のpcDNAのトランスフェクション効率は0.8%で無視することができ、10kのPEIで修飾されたRam−SNPは、27%超の最も高いトランスフェクション効率を示し、これは、同じ先端の尖ったシリカ表面を有しないその他のシリカ粒子よりも高く、S−SNPについては4.4%、Ras−SNPについては9.6%の効率性を示した。1.8k、10k及び25kの分子量のPEIを使用してPEI修飾された表面を有するRam−SNPのトランスフェクション効率の比較は、10kのPEI変異体が最も高いトランスフェクション効率を有し、1.8kの変異体については19.7%、25kの変異体については22.8%、効率性が減少することを示す。
市販品のリポフェクタミン2000は、最適化されていないRam−SNPよりも98.8%の非常に高いトランスフェクション効率を予想した通り示した。リポフェクタミン製剤は、製造者によって推奨される最適なpcDNA負荷を使用した。
共有結合されるPEI表面の改質に依存する前述のRam−SNPのトランスフェクション効率をさらに改善するために、Ram−SNPについて別のモードのPEI結合が調査された。ここでは、Ram−SNPは、シリカ表面に結合してPEIとリンカーとして作用するホスホン酸塩基を使用して、10kのPEIで修飾され、PEIと強い静電引力を可能にする。物理的に吸着されるPEIを有するRam−SNPも観察された。これらのナノ粒子は、HEK−293T細胞におけるトランスフェクションについて、同用量のpcDNA(31μg/μg)を負荷された。蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーを使用してトランスフェクション効率を分析した。図51に示されるように、リポフェクタミン2000は、80%超の細胞がトランスフェクションに成功した強い緑色の蛍光を示した。エポキシ−PEIと物理的PEI吸着の両方のトランスフェクション効率は、かなり限定され、40%未満の細胞がトランスフェクトされた。ホスホン酸塩−PEI修飾は、蛍光顕微鏡で実証されるように、非常に改善されたトランスフェクション効率を示し、51%超の細胞がトランスフェクションに成功したことを示した。したがって、ホスホン酸塩−PEI修飾は、最適なPEI修飾モードとされる。
ホスホン酸塩−l0kPEIで修飾されたRam−SNPの用量(シリカ用量)依存性トランスフェクションの振る舞いも研究された。シリカ用量を40μg(シリカ)/mLから60μg/mL及び80μg/mLに増加することによって、トランスフェクション効率が53%から60μg/mLでは77%、80μg/mLでは89%増加した。これらの実験で使用されるpcDNAの質量は、80μg/mLの製剤は、粒子の数の2倍を有し、40μg/mLの製剤については、(μg/mgで)pcDNA負荷の半分を有するように一定であり続けた。80μg/mLの用量では、Ram−SNPのトランスフェクション効率は、市販品のリポフェクタミン2000と同様である(90%)。しかしながら、留意することとして、80μg/mLの用量のRam−SNPの細胞毒性は、かなり高く、実際の製剤に使用できるシリカ粒子の最大用量のいくらかの指標を与える。市販の製剤を開発するうえで、トランスフェクション効率と細胞毒性との間で妥協が達成されなければならない。Ram−SNP粒子のpcDNAの負荷を増加することは、このトレ
ードオフを回避する魅力的な手段を提供することができるが、より高いpcDNAの負荷を使用することは、本質的により少ないシリカを使用する必要があることを意味するため、より少ない細胞毒性になると思われる。
ードオフを回避する魅力的な手段を提供することができるが、より高いpcDNAの負荷を使用することは、本質的により少ないシリカを使用する必要があることを意味するため、より少ない細胞毒性になると思われる。
トランスフェクションの実験の間、pcDNAは最初にPEI修飾されたRam−SNPに負荷され、通常、pcDNAの負荷に4時間かかる。負荷工程を調査して、90%超のpcDNAが最初の5分以内にPEI修飾されたRam−SNPに負荷されることが分かった。この結果は、pcDNAとRam−SNPとの間の強い結合親和性の以前の観察と一致する。pcDNA及びPEI修飾されたRam−SNPを4時間5分混合した後に、フローサイトメトリーによってそれらのトランスフェクション効率も研究された。5分間だけpcDNA及び粒子を混合することによって、4時間の負荷工程後に測定された53.4%の効率よりも低い43.6%のトランスフェクション効率になる。
核酸の保護
目的:Ram−SNPのpcDNAを酵素分解から保護する能力を測定し、市販のリポフェクタミン2000製品と性能を比較する。
目的:Ram−SNPのpcDNAを酵素分解から保護する能力を測定し、市販のリポフェクタミン2000製品と性能を比較する。
方法
0.5μgのpcDNAを15μgのPEI修飾Ram−SNP(ホスホン酸塩基)と混合し、その後、4℃で2時間インキュベートして、強いpcDNA及び粒子の結合を達成した。同量のpcDNAは、1μLのリポフェクタミン2000で、室温で5分間インキュベートされた。粒子又はリポフェクタミン中のpcDNAのDNase Iの消化について、1μLの2U/μLのDNase Iが混合物に加えられ、37℃で30分間インキュベートされた。分解を中断するために、1μLの500mMのEDTAが混合物に加えられ、65℃で10分間インキュベートされた。DNase Iの処理の後のpcDNAの残余をさらに識別するために、1μLの40mg/mLのヘパリンPBS溶液が混合物に加えられ、37℃で1時間インキュベートされた。pcDNA−トランスフェクション剤の複合体は、ゲル電気泳動によって分析された。pcDNAの残余を識別するために、DNase Iの処理の後のpcDNA−トランスフェクション剤の製剤は、トランスフェクション効率の測定のために、HEK−293T細胞に移された。
0.5μgのpcDNAを15μgのPEI修飾Ram−SNP(ホスホン酸塩基)と混合し、その後、4℃で2時間インキュベートして、強いpcDNA及び粒子の結合を達成した。同量のpcDNAは、1μLのリポフェクタミン2000で、室温で5分間インキュベートされた。粒子又はリポフェクタミン中のpcDNAのDNase Iの消化について、1μLの2U/μLのDNase Iが混合物に加えられ、37℃で30分間インキュベートされた。分解を中断するために、1μLの500mMのEDTAが混合物に加えられ、65℃で10分間インキュベートされた。DNase Iの処理の後のpcDNAの残余をさらに識別するために、1μLの40mg/mLのヘパリンPBS溶液が混合物に加えられ、37℃で1時間インキュベートされた。pcDNA−トランスフェクション剤の複合体は、ゲル電気泳動によって分析された。pcDNAの残余を識別するために、DNase Iの処理の後のpcDNA−トランスフェクション剤の製剤は、トランスフェクション効率の測定のために、HEK−293T細胞に移された。
結果
DNase Iに対するRam−SNPのpcDNA保護能力を実証するために、eGFP−pcDNAがPEI修飾Ram−SNPに負荷され、その後、DNase I溶液で30分間インキュベートされた。電気泳動の結果は、裸のpcDNAがDNase Iの処理の後に容易に分解されることを示した。Ram−SNPに負荷されるpcDNAは、任意の遊離pcDNAが放出されない状態で、粒子に強く結合される。DNase Iの処理の後、pcDNA分解バンドは識別することができない。pcDNAの置換のためにヘパリン処理をした後、ゲルにpcDNAバンドの放出は識別することができなかったが、ウェルに明らかなバンドシグナルが現れ、これは、pcDNAとRam−SNPとの強い結合親和性から生じ得る。pcDNA断片の不在によって、これらのデータは、Ram−SNP粒子は、ヌクレアーゼ分解からpcDNAを良好に保護することを示唆するが、Ram−SNPとpcDNAとの強い結合は、無傷のpcDNAの直接的な視覚化を妨げる。
DNase Iに対するRam−SNPのpcDNA保護能力を実証するために、eGFP−pcDNAがPEI修飾Ram−SNPに負荷され、その後、DNase I溶液で30分間インキュベートされた。電気泳動の結果は、裸のpcDNAがDNase Iの処理の後に容易に分解されることを示した。Ram−SNPに負荷されるpcDNAは、任意の遊離pcDNAが放出されない状態で、粒子に強く結合される。DNase Iの処理の後、pcDNA分解バンドは識別することができない。pcDNAの置換のためにヘパリン処理をした後、ゲルにpcDNAバンドの放出は識別することができなかったが、ウェルに明らかなバンドシグナルが現れ、これは、pcDNAとRam−SNPとの強い結合親和性から生じ得る。pcDNA断片の不在によって、これらのデータは、Ram−SNP粒子は、ヌクレアーゼ分解からpcDNAを良好に保護することを示唆するが、Ram−SNPとpcDNAとの強い結合は、無傷のpcDNAの直接的な視覚化を妨げる。
市販のトランスフェクション製品のリポフェクタミン2000について、pcDNAは、製剤から容易に放出されることを発見し、pcDNAとリポフェクタミンとの弱い結合親和性を示した。DNase Iの処理の後、弱く結合されたpcDNAは、酵素によって容易に分解され、この弱く結合されたpcDNAの生存は見られなかった。ヘパリンの置換の後、少量の保護されたpcDNAは、リポフェクタミンから放出されることが示さ
れた。
れた。
DNase Iの処理の後、活性なpcDNAがRam−SNPに依然として存在することをさらに実証するために、DNase Iの処理の前及び後のpcDNA/Ram−SNP粒子及びpcDNA−リポフェクタミン製剤は、HEK−293T細胞のin vitroのトランスフェクションの比較に使用された。蛍光顕微鏡の画像は、pcDNAの厳しい分解によって、リポフェクタミン2000のトランスフェクション効率が、DNase Iの処理の後に劇的に減少したことを示した。しかしながら、Ram−SNPのトランスフェクション効率は、相対的にDNase Iの処理の前及び後で変化しないままであり、Ram−SNPの酵素分解に対してpcDNAを保護することの成功をさらに実証する。この結果は、Ram−SNPが、分解性酵素の存在下で、リポフェクタミンによってなされる性能の著しい減少によって、リポフェクタミンを上回るトランスフェクション効率の利点を提供すると思われる。
in vitroのトランスフェクション効率
目的:異なる粒径を有するRam−SNPのトランスフェクション効率を、市販のリポフェクタミン及びin vivoのJET産物のトランスフェクション効率と比較し、細胞摂取の機構を解明することである。
目的:異なる粒径を有するRam−SNPのトランスフェクション効率を、市販のリポフェクタミン及びin vivoのJET産物のトランスフェクション効率と比較し、細胞摂取の機構を解明することである。
異なる粒径を有するRam−SNP、遊離pcDNA、リポフェクタミン及びin vivoのJETのトランスフェクション効率
方法−異なる粒径を有するRam−SNPの合成
通常のRF−シリカ合成において、最初のレゾルシノール及びホルムアルデヒドの量を0.2g/0.28mLから0.1g/0.14mL又は0.3g/0.4 2mLまで変化することによって、ポリマーのコアサイズはそれに従い変化し、最終的に、より小さい又はより大きいRam−SNP粒径になる。留意することとして、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量を減少することによって、8時間のより長い重合時間がTEOSの添加の前に必要とされる。レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量を増加することによって、TEOSの添加の前の時間は5時間に短縮することができる。RFコアの重合の後に、TEOS及び第2のRFが添加され、通常の合成工程が行われる。最終的にシリカナノ粒子は回収され、ホスホン酸塩基で修飾され、さらなるトランスフェクションの研究のために10kのPEIと結合された。
方法−異なる粒径を有するRam−SNPの合成
通常のRF−シリカ合成において、最初のレゾルシノール及びホルムアルデヒドの量を0.2g/0.28mLから0.1g/0.14mL又は0.3g/0.4 2mLまで変化することによって、ポリマーのコアサイズはそれに従い変化し、最終的に、より小さい又はより大きいRam−SNP粒径になる。留意することとして、レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量を減少することによって、8時間のより長い重合時間がTEOSの添加の前に必要とされる。レゾルシノール及びホルムアルデヒドの量を増加することによって、TEOSの添加の前の時間は5時間に短縮することができる。RFコアの重合の後に、TEOS及び第2のRFが添加され、通常の合成工程が行われる。最終的にシリカナノ粒子は回収され、ホスホン酸塩基で修飾され、さらなるトランスフェクションの研究のために10kのPEIと結合された。
結果
前述の研究で使用されたRam−SNPは、約330nmの粒径を有したが、粒径は、pcDNAのトランスフェクション効率にも影響し得る。ここでは、RF−シリカ合成においてポリマーコアサイズを変化することによって、より小さい直径(約180nm)及びより大きい直径(約500nm)を有するRam−SNPが作製された。これらの3つのRam−SNP変異体のTEM画像は、全て、先端の尖った表面トポロジーを示す。
前述の研究で使用されたRam−SNPは、約330nmの粒径を有したが、粒径は、pcDNAのトランスフェクション効率にも影響し得る。ここでは、RF−シリカ合成においてポリマーコアサイズを変化することによって、より小さい直径(約180nm)及びより大きい直径(約500nm)を有するRam−SNPが作製された。これらの3つのRam−SNP変異体のTEM画像は、全て、先端の尖った表面トポロジーを示す。
異なる粒径を有するPEI修飾されたRam−SNPは、40μg/mLのシリカ用量でHEK−293T細胞のeGFP −pcDNAトランスフェクションのために使用された。比較において、市販されるトランスフェクション剤、Invitrogen社のリポフェクタミン2000及びPolyplus社のIn−vivo JETが製造者の推奨するプロトコルに従って使用され、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーを使用して、トランスフェクション効率を分析した。リポフェクタミン及び特にIn−vivo JETは、90%超の細胞がトランスフェクションに成功した強い緑色の蛍光を示した。Ram−SNPは、40μg/mLの低用量のシリカについて予想されるように、より低い蛍光強度を示した。最も重要なこととして、Ram−SNPによって提供されるトランスフェクション効率の43%から63%の増加において、粒径が500nmから180nmに
減少される明白な傾向が示される。
減少される明白な傾向が示される。
細胞摂取及び特定のエンドサイトーシス経路の阻害剤を使用した細胞内輸送の発見
方法
180nmの粒径を有するRam−SNPがここで使用された。PEI修飾の後、2mg/mLのRITCエタノール溶液にPEI修飾粒子を4時間攪拌することによって、ローダミンイソチオシアネート(RITC)がさらに粒子に結合された。RITC標識された粒子は、上清に赤色が識別されなくなるまで、エタノールによって完全に洗浄された。RITC標識された粒子は、その後、さらなる摂取分析のために、pcDNAを負荷された。粒子を加える前に、様々な内部移行−阻害条件が、培地において、37℃の1時間のインキュベーションによって達成された。100μLの1μg/mLのショ糖が2mLの培地(5%w/v)に加えられて、クラスリン媒介エンドサイトーシスを阻害した。Dynasoreが培地に加えられ、80μMの最終濃度を達成し、ダイナミン依存性エンドサイトーシスを阻害した。細胞の低温処理(4℃)が、一般的なエンドサイトーシス経路分析のために使用された。pcDNA−ナノ粒子製剤は、その後、80〜90%のコンフルエンシーでHEK−293T細胞に加えられ、必要な場合、4℃又は37℃で4時間インキュベートされた。細胞は、4時間のインキュベーションの後に回収され、フローサイトメトリーによって分析された。実験の各群は、3回実施された。
方法
180nmの粒径を有するRam−SNPがここで使用された。PEI修飾の後、2mg/mLのRITCエタノール溶液にPEI修飾粒子を4時間攪拌することによって、ローダミンイソチオシアネート(RITC)がさらに粒子に結合された。RITC標識された粒子は、上清に赤色が識別されなくなるまで、エタノールによって完全に洗浄された。RITC標識された粒子は、その後、さらなる摂取分析のために、pcDNAを負荷された。粒子を加える前に、様々な内部移行−阻害条件が、培地において、37℃の1時間のインキュベーションによって達成された。100μLの1μg/mLのショ糖が2mLの培地(5%w/v)に加えられて、クラスリン媒介エンドサイトーシスを阻害した。Dynasoreが培地に加えられ、80μMの最終濃度を達成し、ダイナミン依存性エンドサイトーシスを阻害した。細胞の低温処理(4℃)が、一般的なエンドサイトーシス経路分析のために使用された。pcDNA−ナノ粒子製剤は、その後、80〜90%のコンフルエンシーでHEK−293T細胞に加えられ、必要な場合、4℃又は37℃で4時間インキュベートされた。細胞は、4時間のインキュベーションの後に回収され、フローサイトメトリーによって分析された。実験の各群は、3回実施された。
結果
Ram−SNPの特定のエンドサイトーシスをHEK−293T細胞に識別するために、異なる種類の阻害剤が、粒子を添加する前に、細胞処理のために使用された。Ram−SNPは、赤色蛍光を示すRITCで染色され、フローサイトメトリーを使用して、阻害剤の処理のある場合とない場合で、粒子の摂取を分析した。ショ糖を阻害剤として加えた後に著しい摂取阻害はなく、これはエンドサイトーシス経路がクラスリン媒介されないことを示す。しかしながら、低温処置及びDynasoreの添加によるHEK−293T細胞は、粒子の摂取の著しい減少を示し、Ram−SNPが通常のダイナミン依存性エンドサイトーシス経路によって取り入れられることを示す。
Ram−SNPの特定のエンドサイトーシスをHEK−293T細胞に識別するために、異なる種類の阻害剤が、粒子を添加する前に、細胞処理のために使用された。Ram−SNPは、赤色蛍光を示すRITCで染色され、フローサイトメトリーを使用して、阻害剤の処理のある場合とない場合で、粒子の摂取を分析した。ショ糖を阻害剤として加えた後に著しい摂取阻害はなく、これはエンドサイトーシス経路がクラスリン媒介されないことを示す。しかしながら、低温処置及びDynasoreの添加によるHEK−293T細胞は、粒子の摂取の著しい減少を示し、Ram−SNPが通常のダイナミン依存性エンドサイトーシス経路によって取り入れられることを示す。
pcDNA及びRam−SNP結合親和性
方法
15μgのPEI修飾されたRam−SNP(180nm)は、0.5μgのpcDNAで2時間インキュベートされ、その後、混合物は、0.5〜10mg/mLの範囲の最終濃度で、37℃で2時間、ヘパリンでさらにインキュベートされた。その後、混合物は、さらに、ゲル電気泳動によって分析されて、pcDNA及びRam−SNP粒子の結合親和性を識別した。
方法
15μgのPEI修飾されたRam−SNP(180nm)は、0.5μgのpcDNAで2時間インキュベートされ、その後、混合物は、0.5〜10mg/mLの範囲の最終濃度で、37℃で2時間、ヘパリンでさらにインキュベートされた。その後、混合物は、さらに、ゲル電気泳動によって分析されて、pcDNA及びRam−SNP粒子の結合親和性を識別した。
結果
pcDNA及びRam−SNPの結合親和性をさらに識別するために、ヘパリン競合アッセイが用量依存的に研究された。pcDNAは、高濃度のヘパリンで、pcDNA−Ram−SNP粒子から置き換えることができることが観察された。留意することとして、0.5mg/mLのヘパリン濃度では、放出されるpcDNA結合強度は、より高いヘパリン濃度で処理されたものよりもかなり低い。これは、pcDNAとRam−SNP粒子との間に、強い結合親和性が存在することを示す。
pcDNA及びRam−SNPの結合親和性をさらに識別するために、ヘパリン競合アッセイが用量依存的に研究された。pcDNAは、高濃度のヘパリンで、pcDNA−Ram−SNP粒子から置き換えることができることが観察された。留意することとして、0.5mg/mLのヘパリン濃度では、放出されるpcDNA結合強度は、より高いヘパリン濃度で処理されたものよりもかなり低い。これは、pcDNAとRam−SNP粒子との間に、強い結合親和性が存在することを示す。
Claims (55)
- (a)第1モノマー及び第2モノマーを溶媒において接触して、溶媒及び複数のポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、
(b)無機化合物前駆体を前記溶媒及び前記複数のポリマーナノ粒子を含む前記組成物に加えて、前記溶媒及び複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む組成物を製造し、
(c)前記第1及び第2モノマーの追加量を前記溶媒及び前記複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む前記組成物に加えて、前記溶媒及び複数の複合ナノ粒子を含む組成物を製造し、並びに
(d)前記複数の複合ナノ粒子を加熱して、前記複数の中空無機ナノ粒子を製造することを含む複数の中空無機ナノ粒子の製造方法であって、
前記工程(a)において、前記第1モノマー及び前記第2モノマーは、少なくとも30℃の温度で溶媒において接触される、複数の中空無機ナノ粒子の製造方法。 - 前記第1モノマー及び前記第2モノマーが30℃〜70℃の温度、好ましくは40℃〜50℃の温度で溶媒において接触される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1モノマー及び前記第2モノマーが少なくとも30℃の温度で、4時間以下、好ましくは10分〜180分間、溶媒において接触される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記無機化合物がシリカであり、前記中空無機ナノ粒子が中空シリカナノ粒子である、請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
- 工程(a)が前記溶媒において前記第1モノマー及び前記第2モノマーを混合することを含み、溶媒が好ましくは、水、アルコール及びアンモニアを含む、請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
- 前記第1モノマーが1つ以上のヒドロキシル基を含む化合物であり、前記第2モノマーが1つ以上のアルデヒド基を含む化合物であって、好ましくは前記第1モノマーがジオールであり、前記第2化合物がアルデヒドである、請求項1〜5の何れか1項に記載の方法。
- 前記第1モノマーが式HO−Ar−OHの化合物であり、前記第2モノマーが式HC(O)−R1の化合物であり、Arは置換又は非置換アリール基であり、R1はH又は置換若しくは非置換C1−6アルキルであって、好ましくは、前記第1モノマーがレゾルシノールであり、前記第2モノマーがホルムアルデヒドである、請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
- 前記第1モノマーの濃度が1.0mM〜0.1Mであり、前記第2モノマーの濃度が1.0mM〜0.1Mであり、好ましくは、前記第1モノマーの濃度が0.01M〜0.03Mであり、前記第2モノマーの濃度が0.3〜0.05Mである、請求項1〜7の何れか1項に記載の方法。
- 前記無機化合物前駆体がシリカ前駆体である、請求項1〜8の何れか1項に記載の方法。
- 前記シリカ前駆体が式Si(R2)x(OR3)yで表される化合物であり、
それぞれのR2及びそれぞれのR3が独立して、H、C1−6アルキル、アリール及びC
2−6アルケニルから選択されるものであり、
xは、0、1又は2であり、並びに
yは2、3又は4である、請求項9に記載の方法。 - 前記無機化合物前駆体がテトラエチルオルトケイ酸塩(TEOS)、テトラメチルオルトケイ酸塩、テトラプロピルオルトケイ酸塩又はテトラブチルオルトケイ酸塩であり、好ましくはテトラエチルオルトケイ酸塩である、請求項1〜10の何れか1項に記載の方法。
- 前記無機化合物前駆体を前記溶媒及び前記複数のポリマーナノ粒子を含む前記組成物に加えた後、前記無機化合物前駆体の濃度が1.0mM〜0.1M、好ましくは、0.01〜0.05Mである、請求項1〜11の何れか1項に記載の方法。
- 工程(b)が30℃以下の温度、好ましくは10℃〜30℃の温度で実施される、請求項1〜12の何れか1項に記載の方法。
- 方法は、工程(a)と工程(b)との間で、前記溶媒及び前記複数のポリマーナノ粒子を含む前記組成物を冷却する工程をさらに含み、好ましくは、前記溶媒及び前記複数のポリマーナノ粒子を含む前記組成物が、10分〜60分の時間、0.5℃/分〜1.0℃/分の平均速度で冷却される、請求項1〜13の何れか1項に記載の方法。
- 工程(c)において、追加の量の前記第1及び第2モノマーを前記溶媒及び前記複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む前記組成物に加えることは、工程(b)の後に1〜30分で実施され、シリカ前駆体化合物を前記溶媒及び前記複数のポリマーナノ粒子を含む前記組成物に加え、好ましくは、工程(c)は、工程(b)の後に、2〜10分で実施される、請求項1〜14の何れか1項に記載の方法。
- 追加の量の前記第1及び前記第2モノマーを前記溶媒及び前記複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子を含む前記組成物に追加した後に、前記溶媒及び前記複数の無機化合物で被覆されたポリマーナノ粒子、並びに前記第1及び第2モノマーを含む前記組成物中、前記第1モノマーの濃度が2.0mM〜0.2Mであり、前記第2モノマーの濃度が2.0mM〜0.2Mである、請求項1〜15の何れか1項に記載の方法。
- 前記追加の量の第1及び第2モノマーを1.0〜4.0時間反応させる、請求項1〜16の何れか1項に記載の方法。
- 工程(d)が、前記複数の複合ナノ粒子を、複合ナノ粒子から前記ポリマーを取り除くのに適した温度、好ましくは、400℃〜700℃の温度で加熱することを含む、請求項1〜17の何れか1項に記載の方法。
- 工程(d)が、前記複数の複合ナノ粒子を、4.0時間未満、好ましくは1.0〜3.0時間加熱することを含む、請求項1〜18の何れか1項に記載の方法。
- 前記複数の中空無機ナノ粒子が複数のメソポーラス中空無機ナノ粒子である、請求項1〜19の何れか1項に記載の方法。
- 前記中空無機ナノ粒子のそれぞれが
無機化合物を含むシェル、
前記無機化合物を含まない前記シェル内部の容量、並びに
前記シェルの外部に配置される前記無機化合物を含む複数の突起を含む、請求項1〜
20の何れか1項に記載の方法。 - 前記中空無機ナノ粒子が100nm〜600nmの粒径を有し、及び/又は
前記シェルの内部の容量が50nm〜500nmの平均粒径を有し、及び/又は
前記無機化合物を含む前記シェルが10nm〜200nmの平均厚さを有する、請求項21に記載の方法。 - 工程が、(e)複数の中空無機ナノ粒子を薬剤で処理して、前記薬剤を負荷された複数の中空無機ナノ粒子を製造することをさらに含む請求項1〜22の何れか1項に記載の方法。
- 前記薬剤が殺虫剤、除草剤、治療薬、ワクチン、電荷改質剤、トランスフェクション試薬、核酸、タンパク質又は染料である、請求項23に記載の方法。
- 前記薬剤が電荷改質剤であり、任意に、前記電荷改質剤がポリエチレンイミンである、請求項23又は請求項24に記載の方法。
- 前記電荷改質剤がポリペプチドであり、任意に前記ポリペプチドがポリヒスチジン、ポリアルギニン又はポリリジンである、請求項23又は請求項24に記載の方法。
- 方法が前記複数の中空無機ナノ粒子を薬剤で処理する前に、前記複数の中空無機ナノ粒子をホスホン酸塩リンカーで処理する工程を含む、請求項23〜25の何れか1項に記載の方法。
- 方法が前記複数の中空無機ナノ粒子を前記薬剤で処理する前に、前記複数の中空無機ナノ粒子を酸性改質成分で処理する工程を含み、任意に、前記酸性改質成分がホスホン酸塩基、リン酸基、カルボキシレート基、又はα−ケトカルボン酸基を含む、請求項23〜25の何れか1項に記載の方法。
- 前記複数の中空無機ナノ粒子が60分未満、好ましくは15分未満、前記薬剤で処理される、請求項23〜28の何れか1項に記載の方法。
- 工程(e)が
(el)任意に、前記中空無機ナノ粒子をホスホン酸塩リンカーで処理し、好ましくは、前記ホスホン酸塩リンカーが1,3−(トリヒドロキシシリル)プロピルメチルホスホン酸一ナトリウム塩であり、
(e2)前記中空無機ナノ粒子を電荷改質剤で処理し、任意に、前記電荷改質剤がポリエチレンイミンであり、及び、
(e3)前記中空無機ナノ粒子を活性薬剤で処理し、任意に前記活性薬剤は核酸を含む、請求項23〜29の何れか1項に記載の方法。 - 請求項1〜30の何れか1項に記載の方法によって得ることができる複数の中空無機ナノ粒子。
- 複数の中空無機ナノ粒子が
無機化合物を含むシェル、
前記無機化合物を含まない前記シェル内部の容量、並びに
前記シェルの外部に配置される前記無機化合物を含む複数の突起を含み、
前記複数の中空無機ナノ粒子の粒径が100〜500nmである、複数の中空無機ナノ粒子。 - 中空無機ナノ粒子のそれぞれが
無機化合物を含むシェル、
前記無機化合物を含まない前記シェル内部の容量、並びに
前記シェルの外部に配置される前記無機化合物を含む複数の突起を含み、
前記中空無機ナノ粒子が前記無機化合物に結合される複数の酸性基をさらに含む、複数の中空無機ナノ粒子。 - 前記酸性基がホスホン酸塩基、リン酸塩基、カルボン酸基及びα−ケトカルボン酸基から選択され、好ましくは、前記酸性基がホスホン酸塩基である、請求項33に記載の複数の中空無機ナノ粒子。
- 前記複数の中空無機ナノ粒子の粒径が150〜350nm、好ましくは160〜250nmである、請求項31〜34の何れか1項に記載の複数の中空ナノ粒子。
- 前記複数の中空無機ナノ粒子の多分散指数が0.5以下、0.2以下、又は0.1以下、又は0.05以下である、請求項31〜35の何れか1項に記載の複数の中空ナノ粒子。
- 前記ナノ粒子が少なくとも120cm2/g、好ましくは少なくとも150cm2/gのBET表面積を有する、請求項31〜36の何れか1項に記載の複数の中空無機ナノ粒子。
- 前記中空無機ナノ粒子が中空シリカナノ粒子である、請求項31〜37の何れか1項に記載の複数の中空無機ナノ粒子。
- ヒト又は動物の身体を治療法によって治療する方法において、アジュバントとして使用される請求項31〜37の何れか1項に記載の複数の中空無機ナノ粒子。
- 前記方法が前記治療薬を複数の前記複数の中空無機ナノ粒子と共投与することによって、治療薬の効果を増加することを含む、請求項39に記載の使用のための複数の中空無機ナノ粒子。
- ワクチンを使用して、疾患に対して、対象を免疫化することによって、対象の疾患の予防又は治療に使用し、前記複数の中空無機ナノ粒子が前記対象のワクチンに対して免疫応答を増加する、請求項31〜37の何れか1項に記載の複数の中空無機ナノ粒子。
- 請求項31〜37の何れか1項に記載の複数の中空無機ナノ粒子及び薬剤を含む組成物。
- 前記薬剤が前記中空無機ナノ粒子に結合される、請求項42に記載の組成物。
- 前記薬剤が疎水性活性薬剤である、請求項42又は請求項43に記載の組成物。
- 前記薬剤が殺虫剤、除草剤、治療薬、ワクチン、電荷改質剤、トランスフェクション試薬、核酸、又は染料である、請求項42〜44の何れか1項に記載の組成物。
- 前記薬剤がポリエチレンイミンである、請求項42〜45の何れか1項に記載の組成物。
- 前記複数の中空無機ナノ粒子が、ホスホン酸塩リンカーで官能化される、請求項42〜46の何れか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、電荷改質剤及び活性薬剤を含み、好ましくは、前記電荷改質剤がポリエチレンイミン(PEI)であり、前記活性薬剤が核酸、例えば、プラスミドDNAである、請求項42〜47の何れか1項に記載の組成物。
- ヒト又は動物の身体を治療法による治療に使用される、請求項42〜48の何れか1項に記載の組成物。
- 前記活性薬剤がワクチンであり、前記組成物が前記ワクチンを使用して疾患に対して対象を免疫化することによって、前記対象の前記疾患の予防又は治療に使用される、請求項49に記載の組成物。
- 方法が請求項42〜48の何れか1項に記載される組成物で細胞を処理することを含む、核酸を細胞にトランスフェクトする方法。
- ヒト又は動物の身体を治療法によって治療する方法において使用され、前記中空無機ナノ粒子が前記薬剤について、アジュバントとして作用する、請求項42〜48の何れか1項に記載の組成物。
- 前記方法が前記薬剤の前記効果を増加することを含む、請求項52に記載の使用のための組成物。
- 核酸を細胞にトランスフェクトする方法に使用され、前記薬剤が核酸であり、前記方法が前記細胞を前記複数の中空無機ナノ粒子及び前記核酸を含む前記組成物で処理することを含み、それによって、前記細胞を前記核酸でトランスフェクトし、免疫応答を刺激する、請求項42〜48の何れか1項に記載の組成物。
- ある場所の害虫を制御する方法であって、前記場所を請求項42〜48の何れか1項に記載の組成物に暴露することを含む、ある場所の害虫を制御する方法。
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