JP2021508692A - プロテアーゼ活性化受容体−２の阻害剤 - Google Patents

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Abstract

本発明は、全体として、プロテアーゼ活性化受容体-2（PAR2）を阻害することができる化合物、およびその使用に関する。より詳細には、本発明は、PAR2の阻害剤、それらの調製、およびPAR2シグナル伝達によって媒介される疾患および障害の治療におけるそれらの使用に関する。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、全体として、プロテアーゼ活性化受容体-2(Protease Activated Receptor-2)(PAR2)を阻害することができる化合物、およびその使用に関する。より詳細には、本発明は、PAR2の阻害剤、それらの調製、およびPAR2シグナル伝達によって媒介される疾患および障害の治療におけるそれらの使用に関する。
発明の背景
プロテアーゼ活性化受容体(Protease-Activated Receptor)(PAR)は、PAR-1、-2、-3、および-4を含み、独特の活性化メカニズムを持つGタンパク質共役受容体（GPCR）のファミリーである。PARは内因性リガンドによって直接活性化されるのではなく、トロンビン、組織因子、カテプシンS、トリプターゼ、またはトリプシンのような酵素のタンパク質分解作用によって間接的に活性化される。典型的には、タンパク質分解酵素はPARのN末端から一部を切断し、内因性テザーリガンドとして、受容体を折りたたみ、活性化する新たなN末端を露出させる。このPARの特定の切断部位はアミノ酸配列が異なり、したがって、活性化選択性を付与する異なった酵素によって認識される。例えば、トロンビンはPAR1の活性化酵素であるが、PAR2はトリプシンまたはトリプターゼによってより容易に活性化される。PAR3を除いて、テザーリガンド配列に対応する短い合成ペプチドは、それぞれのPARを活性化できることが示されている。
PAR2は、肺、腎臓、心臓、肝臓、皮膚、平滑筋、および胃腸管を含むさまざまな器官で広く発現されている。PAR2の存在は、上皮細胞および内皮細胞、特にT細胞、単球、マクロファージ、好中球、マスト細胞、および好酸球のような炎症細胞に見られる。トリプシン、マスト細胞トリプターゼ、組織カリクレイン、凝固カスケードTF-FVIIaおよびFVa-FXaのメンバー、カテプシンS、エラスターゼ、アクロシン、HAT、TMPRSS2、キチナーゼ、細菌性ジンジパイン(gingipain)、Der P1-3、Pen C 13、およびテスチシン(testisin)を含む、広範囲の宿主および病原体由来のセリンプロテアーゼは、PAR2のN末端を認識してプロセシングすることができる。標準的な部位(R36S37)で切断されると、新たに露出したN末端は、PAR2の活性化を誘導するテザーリガンドとして機能する。非標準的な部位での切断（例えば、カテプシンSによる）は、PAR2の不活性化または異なるテザーリガンドのアンマスキング(unmasking)を引き起こし、異なるシグナル伝達プロファイルをもたらす。SLIGKV-NH2またはSLIGRL-NH2のような標準的な配列を模倣する合成ペプチドは、適度な効力でヒトPAR2を選択的に活性化できる。ペプチドの効力は、N末端セリン(S)残基の修飾によって改善でき、その顕著な例は、強力なペプチドアゴニストである2-フルオリル(fluoryl)-LIGRLO-NH2（2Fアゴニスト）である。
現在までのところ、文献データは、PAR2の活性化が、炎症、腫瘍転移、胃腸運動、痛み、かゆみのような多くの生理学的および病態生理学的プロセスに関連していることを示している。単球およびマクロファージにおけるPAR2の活性化は、IL6、IL8、およびIL1βのような炎症性サイトカインおよびケモカインの放出をもたらすことが示されている（Johansson, U. et al., Journal of Leukocyte Biology, 2005, 78(4): 967-975; Colognato, R. et al., Blood 2003, 102(7): 2645-2652; Steven, R. et al., Innate Immunity 2013, 19(6): 663-672; およびCho, N.-C. et al., Bioorg Med Chem 2015, 23(24): 7717-7727）。また、PAR2アゴニストのin vivoでの投与は、炎症反応を誘発することが示されている。特に、いくつかの研究グループが、げっ歯類にPAR2活性化プロテアーゼまたは合成アゴニストを足底内投与すると、浮腫反応と機械的痛覚過敏を誘発し、これらはPAR2アンタゴニストによる処置またはPAR2欠失により有意に減少することを実証している（例えば、Lieu, T. et al., British Journal of Pharmacology 2016, 173(18): 2752-2765）。さらなる研究では、PAR2が神経原性炎症、侵害受容、および痛みの伝達のメディエーターとして機能し得ることも示されている（例えば、Tillu, D.V. et al., Pain 2015, 156(5): 859-867; Zhao, P., et al., Journal of Biological Chemistry 2014, 289(39): 27215-27234）。また、PAR2選択的アンタゴニストであるGB88による処置は、PAR2を介した炎症および侵害作用の減少をもたらす（Lieu, T., et al., British Journal of Pharmacology, 2016, 173(18): 2752-2765）。
PAR2および活性化酵素の発現の増加は、アトピー性皮膚炎のような皮膚疾患に関与している（Steinhoff, M. et al., Journal of Neuroscience 2003, 23(15): 6176-6180; Frateschi, S. et al., Nat Commun. 2011, 2: 161)。PAR2アゴニストの病変内適用は、長期にわたる魚鱗癬のトリガーとなり、PAR2のトランスジェニック発現は、マウスの皮膚に表皮過形成を引き起こした。
PAR2の発現は、肺の上皮細胞と線維芽細胞で確認されており、下流の転写活性化の調節を介して組織の恒常性に関与していると考えられている（Adams, M.N. et al., Pharmacology & Therapeutics 2011, 130(3): 248-282）。さらに、PAR2活性化が、がん細胞の遊走、浸潤、および転移を促進することをいくつかの研究が実証している（例えば、Yau, M-K., L. Liu, and Fairlie, D.P., Journal of Medicinal Chemistry 2013, 56(19): 7477-7497; Zeeh, F. et al., Oncotarget 2016, 7(27): 41095-41109; およびYang, L. et al., Journal of Biological Chemistry 2015, 290(44): 26627-26637）。
PAR1およびPAR2は、生理学的および病理学的条件下で、胃腸管の運動と分泌の調節に関与することが示されている。PAR2アゴニストは実験の条件に応じて弛緩効果または収縮効果のいずれかを誘発できるため、PAR2は二重の役割を有するように思われる。胃腸運動の調節におけるPAR2の正確な役割とメカニズムはまだ研究中である。しかしながら、最近の文献データでは、PAR2アゴニストがげっ歯類の結腸および十二指腸の筋肉の収縮を刺激し得ることが示されている（Kawabata, A., M. Matsunami, and F. Sekiguchi, British Journal of Pharmacology 2008, 153: S230-S240; Browning, K. N., Neurogastroenterology and Motility 2010, 22(4): 361-365）。マウスの結腸全筋肉では、内因性PAR2活性化因子であるトリプシンが二相性の反応：一過性の過分極と弛緩、それに続く再分極と興奮を誘発する（Sung, T. S. et al., Journal of Physiology-London 2015, 593(5): 1169-1181）。
PAR2欠損マウスを利用した多数の実験の結果、抗体またはGB88のようなアンタゴニストによる機能の阻害により、食事誘発性肥満、脂肪炎症、喘息、関節リウマチ、歯周炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、皮膚疾患、がん、線維性疾患、代謝機能障害、慢性疼痛、神経疾患を含むさまざまな疾患の病態生理におけるPAR2活性化の重要な役割が明らかになっている（Adams, M.N. et al., Pharmacology & Therapeutics, 2011, 130(3): 248-282）。
エンドソームPAR2シグナル伝達を標的とすることが、新しい治療法を提供し得ることを示唆する証拠もある。以前は主に細胞の表面で機能すると考えられていたGタンパク質共役受容体（GPCR）がエンドソームからシグナルを送り続けることができるという認識が高まっている（Murphy, J. E. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106(42): 17615-17622）。GPCRシグナル伝達は原形質膜で始まるが、活性化された受容体はβ-アレスチン（βARR）と結合(associate)し、受容体脱感作とエンドサイトーシスを媒介する（DeWire, S. M. et al., Annu Rev Physiol 2007, 69: 483-510）。これらのプロセスは、原形質膜でのGPCRシグナル伝達を効率的に終了させる。エンドソームにおけるGPCRシグナル伝達複合体の検出、およびエンドサイトーシスの破壊がシグナル伝達を抑制することができるという発見は、GPCRがエンドソームからシグナル伝達することを示唆する（例えば、May, V. & Parsons, R. L., J Cell Physiol 2017, 232(4): 698-706）。エンドソーム中のGPCRは、細胞内コンパートメントにおいて、遺伝子転写とニューロンの興奮を制御する持続的なシグナルを生成することができる（Tsvetanova, N. G. & von Zastrow M., Nat Chem Biol 2014, 10(12): 1061-1065）。GPCRのエンドソームシグナル伝達は、痛みの伝達を含む重要な生理学的プロセスを調節することが見出されている（Yarwood, R. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2017, 114(46): 12309-12314）。
プロテアーゼおよびPAR2は、過敏性腸症候群（IBS）患者の慢性疼痛の原因となる可能性がある結腸の感覚神経の過敏性に関係している（Azpiroz, F. et al., Neurogastroenterol Motil 2007, 19(1 Suppl): 62-88）。IBS患者の結腸粘膜の生検試料は、マウスにおいて、侵害受容器のPAR2依存性興奮性亢進(heperexcitablity)と結腸の侵害受容を誘発するプロテアーゼ（トリプターゼおよびトリプシン-3を含む）を放出する（Barbara, G. et al., Gastroenterology 2007, 132(1): 26-37; Cenac, N. et al., The Journal of Clinical Investigation 2007, 117(3):636-647; およびValdez-Morales, E. E. et al., Am J Gastroenterol 2013, 108(10): 1634-1643）。PAR2アゴニストは、未知のメカニズムにより、ニューロンの著しく長期にわたる興奮性亢進を誘発する（Reed, D.E. et al., J Physiol 2003, 547(Pt 2): 531-542）。
したがって、PAR2シグナル伝達の強力かつ選択的な阻害剤の開発が非常に望ましく、炎症、侵害受容、胃腸運動、線維症、およびがん浸潤の治療を進めるための実質的な医学的進歩を提供することが明らかである。
PAR2の阻害に適した新規化合物が提供される。本発明の化合物は、この受容体によって媒介される疾患および障害の治療および予防に有用であり得る。本明細書に開示されるPAR2阻害剤は、それらの吸収を制限し、それらを胃腸管の疾患および障害の治療における使用に、また化合物の標的化送達に適するようにする部分を含む。
一態様では、本発明は、式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩を提供する：
［式中、
R1は、H、C1-C6アルキルまたはハロであり;
R2は、1〜3個のハロゲンでそれぞれ置換されていてもよい、C1-C6アルキル、C3-C6シクロアルキルまたはC1-C6アリールであり;
R3は、オキソまたはC1-C6アルキルであり;
pは、0〜3の整数であり;
R4は、-C1-C6アルキルS(O)2OH、-1,2,3-トリアゾール-1-酢酸、-NHR7、-ビシクロ[2.2.2]オクタンC(O)OR6、-C4-C8シクロアルキル-R5、-C1-C6アルキル-R5で置換された4〜6員の複素環式もしくはヘテロアリール基、または-(CH2)2C(O)NHC2-C10アルキル（ここで、該C2-C10アルキルは、2〜10個の-NH2または-OHで置換されている）であり;
R5は、-C(O)NHR7または-NHC(O)R7であり;
R6は、HまたはR7であり;
R7は、-R8、-C1-C20アルキル、-C1-C20アルキルC(O)NH2または-C1-C20アルキルC(O)NR8（ここで、該-C1-C20アルキル、-C1-C20アルキルC(O)NH2および-C1-C20アルキルC(O)NR8は、2〜10個の-NH2または-OHで置換されていてもよく、該アルキル基中の1つまたは複数の炭素原子が窒素または酸素で置き換えられていてもよい）であり;
R8は、式:
（式中、
Lは、長さ1 nm〜50 nmのリンカー部分であり;
LAは、原形質膜への化合物の挿入を促進する脂質アンカーである）
で表される］。
別の態様では、本発明は、PAR2シグナル伝達を阻害する方法であって、本明細書で定義される式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩を該受容体に接触させることを含む、方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、PAR2シグナル伝達の阻害を必要とする対象において、PAR2シグナル伝達を阻害する方法であって、有効量の本明細書で定義される式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩を対象に投与することを含む、方法を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、PAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害を予防または治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書で定義される式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。
本発明はまた、PAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害の予防または治療のための、本明細書で定義される式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩を提供する。
別の態様では、本発明は、PAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害の予防または治療用医薬の製造における、本明細書で定義される式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩の使用を提供する。
本発明はさらに、本明細書で定義される式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩を、少なくとも１つの医薬上許容される担体または希釈剤と共に含む医薬組成物を提供する。
本発明のこれらおよび他の態様は、付随する実施例、図面、および特許請求の範囲に関連して以下の詳細な説明を読むことにより、当業者にはより明らかになるであろう。
図１：プロテアーゼ誘発機械的侵害受容。A. WTまたはPar2-NaV1.8マウスからのDRGにおけるPAR2およびNaV1.8免疫反応性の局在。白い矢印の先端(arrowhead)：WTマウスでPAR2とNaV1.8を共発現しているニューロン。黄色の矢印の先端：Par2-NaV1.8マウスでNaV1.8を発現しているがPAR2を発現していないニューロン。B. WTおよびPar2-Nav1.8マウスからのDRGニューロン（<25 μm）のトータル数とトリプシン（100 nm）-応答性DRGニューロン（<25 μm）の数。C-E. トリプシン（C、Tryp）、NE（D）またはCS（E）の足底内注射後のWTおよびPar2-NaV1.8マウスにおけるvon Freyフィラメント逃避反応(withdrawal response)。F-K. Dy4またはDy4インタクト(intact)（F-H、ダイナミン阻害剤）、PS2またはPS2インタクト（J-K、クラスリン阻害剤）、またはビヒクル（Veh）の足底内注射、続いて30分後にトリプシン（F、I）、NE（G、J）またはCS（H、K）の足底内注射後のWTマウスにおけるvon Freyフィラメント逃避反応。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。括弧内の数字はマウスの数（N）を示す。 図１Ａ：プロテアーゼ誘発機械的侵害受容。A. WTまたはPar2-NaV1.8マウスからのDRGにおけるPAR2およびNaV1.8免疫反応性の局在。白い矢印の先端：WTマウスでPAR2とNaV1.8を共発現しているニューロン。黄色の矢印の先端：Par2-NaV1.8マウスでNaV1.8を発現しているがPAR2を発現していないニューロン。B-D. トリプシン（B、Tryp）、NE（C）またはCS（D）の足底内注射後のWTおよびPar2-NaV1.8マウスにおけるvon Freyフィラメント逃避反応(withdrawal response)。E-F. Dy4またはDy4インタクト(intact)（E-G、ダイナミン阻害剤）、PS2またはPS2インタクト（H-J、クラスリン阻害剤）、またはビヒクル（Veh）の足底内注射、続いて30分後にトリプシン（E、H）、NE（F、I）またはCS（G、J）の足底内注射後のWTマウスにおけるvon Freyフィラメント逃避反応。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。括弧内の数字はマウスの数（N）を示す。 図２：侵害受容器のプロテアーゼ誘発性興奮性亢進。Dy4（A、B、D、F、ダイナミン阻害剤）、PS2（C、E、およびG、クラスリン阻害剤）またはビヒクルコントロール（Con）とプレインキュベートしたマウスDRGニューロンのレオベース。ニューロンをトリプシン（A-C）、NE（D、E）またはCS（F、G）でチャレンジし、洗浄して、レオベースを0または30分後に測定した。A. 代表的なトレース。Rh、レオベース。B-G. 平均応答。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。棒中の数字はニューロン数（N）を示す。 図２Ａ：侵害受容器のプロテアーゼ誘発性興奮性亢進。Dy4（A、B、D、F、ダイナミン阻害剤）、PS2（C、E、G、クラスリン阻害剤）またはバッファーコントロール（Con）とプレインキュベートしたマウスDRGニューロンのレオベース。ニューロンをトリプシン（A-C）、NE（D、E）またはCS（F、G）でチャレンジし、洗浄して、レオベースを0または30分後に測定した。A. 代表的なトレース。Rh、レオベース。B-G. 平均応答。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。棒中の数字はニューロン数（N）を示す。 図３：侵害受容器のプロテアーゼ誘発性興奮性亢進のメカニズム。I-343（A-D、PAR2アンタゴニスト）、PD98059（E、MEK1阻害剤）、またはGF109203X（F、GFX、PKC阻害剤）とプレインキュベートしたマウスDRGニューロンのレオベース。ニューロンをトリプシン（A、E、およびF、Tryp）、NE（B、D）またはCS（C）でチャレンジし、洗浄して、レオベースを0または30分後に測定した。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.0001。棒中の数字はニューロン数（N）を示す。 図４：侵害受容器におけるPAR2エンドサイトーシス、βARR2補充(recruitment)、およびコンパートメント化されたシグナル伝達。A-C. エンドサイトーシス。A. マウスDRGニューロンにおけるmPAR2-GFPの分布に対するトリプシン（Tryp）の効果の代表的な画像（n=3実験）。矢印の先端（A、左）はエンドソーム内のPAR2-GFPを示す。B、C. トリプシン、NEまたはCSとの30分間のインキュベーション後（B）、またはDy4もしくはDy4インタクトとのプレインキュベーション、その後のトリプシンとのインキュベーション後（C）のマウスDRGニューロンにおけるmPAR2-GFPのサイトゾル/原形質膜比率。D. トリプシン、NEまたはCSに曝露されたマウスDRGニューロンにおけるPAR2-RLuc8/βARR2-YFP BRET。AUC、曲線下面積（25分）*P<0.05コントロールに対して。n、実験の反復、3回の観察。E-J. コンパートメント化されたシグナル伝達。ラットDRGニューロンの原形質膜（EおよびF）およびサイトゾル（G）でのPKC活性、およびサイトゾル（HおよびI）および核（J）でのERK活性に対するトリプシンの効果：ラットDRGニューロンの原形質膜（E、F）でのトリプシン誘発PKC活性化（サイトゾル（G）では活性化されなかった）、およびサイトゾル（H、I）および核（J）でのトリプシン誘発ERK活性化。棒中の数字はニューロン数（N）を示す。*P<0.05、**P<0.01ビヒクルと比較。 図５：HEK293細胞におけるPAR2エンドサイトーシスおよびコンパートメント化されたERKシグナル伝達。A-D. エンドサイトーシスのBRETアッセイ。PAR2-RLuc8/RIT-Venus BRET（A、C）およびPAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRET（B、D）。E-K.サイトゾル（E、G、H、J）および核（F、G、I、K）のERK活性のFRETアッセイ。AUC、曲線下面積。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.00001トリプシン単独と比較。n、実験の反復、3回の観察。 図６：侵害受容器のIBS-D誘発性興奮性亢進。A-D. HCおよびIBS-D被験者の結腸粘膜の生検からの上清への曝露から30分後のマウス侵害受容器のレオベース。A. ビヒクルまたはI-343で処理したニューロンの代表的なトレース。B-D. I-343（B、PAR2アンタゴニスト）、Dy4（C、ダイナミン阻害剤）、またはPD98059（D、MEK1阻害剤）とプレインキュベートしたニューロンの平均応答。E. HEK293細胞におけるPAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRETは、HCまたはIBS-D生検上清、またはトリプシンとの60分間のインキュベーション後に測定した。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001; ns、有意差なし。棒中の数字はニューロン数（N）を示す。 図７：侵害受容器のエンドソームにおけるPAR2ターゲティング。マウスDRGニューロンの神経細胞体(soma)（A）と神経突起(neurite)（B）へのCy5トリパータイトプローブとmPAR2-GFPのトラフィッキングの（3回の実験の）代表的な画像。明視野(bright-field)画像のスケールバー（5 μm）は、マージ(merge)されたパネルの破線のボックスの拡大であるインセット(Inset)を除いて、同じ行のすべてのパネルに適用される。矢印は、mPAR2-GFPおよびCy5-Cholを含む小胞への近接(proximity)を示す。 図８：エンドソームPAR2の拮抗作用と侵害受容器の興奮性亢進。A、B. マウスDRGニューロンのトリプシン誘発性興奮性亢進。ニューロンを化合物10またはビヒクル（コントロール、con）とともに60分間プレインキュベートし、洗浄して、170または140分間回復(recovery)させた。次に、ニューロンをトリプシンに曝露した（10分）。レオベースを、トリプシンの0または30分後、および化合物10の180分後に測定した。C. マウスDRGニューロンのIBS誘発性興奮性亢進。ニューロンを、化合物10またはビヒクル（コントロール、con）と60分間プレインキュベートし、洗浄し、60分間回復させた。次に、ニューロンをHCまたはIBS-D上清に30分間曝露し、洗浄して、レオベースを30分後（T 30分）、化合物10の120分後に測定した。*P<0.05、**P<0.01。棒中の数字はニューロン数（N）を示す。 図９：結腸の求心性神経の感作と結腸の侵害受容。A-H. 健常対照マウスにおける、基礎条件下および受容野のトリプシン（A、B、およびE-H、Tryp）、NE（CおよびE）、またはCS（DおよびE）への曝露後の2 g VFFによる結腸粘膜の刺激に対する機械感覚性応答。A. 代表的な結果。B-DおよびF-H. 平均応答。 E. 基礎のパーセントとしての応答。棒中の数字は求心性神経の数を示す。IおよびJ. 覚醒正常マウスにおけるCRDに対するVMR。括弧内の数字はマウスの数を示す。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。 図１０：プロテアーゼおよびPAR2が誘発する侵害受容器の興奮性亢進のメカニズム。標準的なメカニズムによる活性化の後、PAR2は原形質膜でシグナルを送り、PKCを活性化し、これは初期の興奮性亢進を媒介する（1）。次に、PAR2はクラスリン-、ダイナミン-、およびβARR-依存性エンドサイトーシスを受ける（2）。PAR2はβARRおよびGαqを介したメカニズムによってエンドソームからシグナルを送り続け、ERKを活性化し、これは持続的な興奮性亢進を媒介する。バイアスされたメカニズムによる活性化の後、PAR2は原形質膜からシグナルを送り、アデニル酸シクラーゼ（AC）およびPKAを活性化し、これは初期および持続的な興奮性亢進を媒介する（3）。キナーゼは、TRPチャネルおよび電位依存性イオンチャネルの活性を調節し、侵害受容器の興奮性亢進を制御する（4）。 図１１：DRGニューロンにおける機能的PAR2の発現、およびPAR2依存性炎症。A、B. WT（A）およびPar2-NaV1.8（B）マウスからのDRGニューロンにおける[Ca2+]iに対するトリプシン（100 nM）の効果の代表的なトレース。25個のニューロンからのトレースを示す；トリプシン応答性ニューロンからのトレースを赤で示す。WTマウスでは、ニューロンの20/65（31%）がトリプシンに応答した。Par2-NaV1.8マウスでは、ニューロンの3/51（6%）がトリプシンに応答した。ニューロンは1グループあたり4匹のマウスから収集した。C. WTおよびPar2-NaV1.8マウスにおける足の厚さに対するトリプシンの足底内注射の効果。***P<0.001、****P<0.0001。括弧内の数字はマウスの数を示す。D. WTおよびPar2-NaV1.8マウスにおける4時間での足への好中球浸潤に対するトリプシンの足底内注射の効果。矢印は、WTマウスにおける好中球流入を示す。 図１２：プロテアーゼが誘発する機械的侵害受容および浮腫。A、B. Dy4またはDy4インタクト（A）、PS2またはPS2インタクト（B）、またはビヒクル（Veh）、続いてNEの同側（左）足への足底内注射後の対側（右）足のVFF逃避反応。C-H. 同側の足の厚さ。Dy4またはDy4インタクト（C、E、G）、PS2またはPS2インタクト（D、F、H）、またはビヒクル（Veh）を、足底内注射によりマウスの足に投与した。30分後、トリプシン（Tryp）（C、D）、NE（E、F）またはCS（G、H）を注射した。足の厚さ（浮腫）を測定した。括弧内の数字はマウスの数を示す。 図１３：エンドサイトーシス阻害剤および侵害受容器のベースライン興奮性亢進。バッファーコントロール（Con）、ビヒクル（Veh、0.3% DMSO）、Dy4（A）またはPS2（B）とプレインキュベートしたマウスDRGニューロンのレオベース。レオベースは、洗浄後T 0分またはT 30分に測定した。棒中の数字はニューロン数を示す。 図１４：PAR2アンタゴニスト I-343の特性。A. I -343の構造。B-D. HT-29（B）、HEK293（C）、およびKNRK-hPAR2（D）細胞における2Fおよびトリプシン誘発IP1蓄積に対するI-343の効果の濃度-反応分析。E. HEK細胞におけるATP誘発IP1蓄積に対するI-343の効果。n、実験の反復、3回の観察。 図１５：侵害受容器のトリプシンおよびトロンビン誘発性興奮性亢進。I-343（A、PAR2アンタゴニスト）またはSCH79797（B、C、PAR1アンタゴニスト）とプレインキュベートしたマウスDRGニューロンのレオベース。ニューロンをトリプシン（A、C）またはトロンビン(Thrombin)（B）でチャレンジし、洗浄して、レオベースを0分後に測定した。*P<0.05、**P<0.01。棒中の数字はニューロン数を示す。 図１６：HEK293細胞におけるPAR2エンドサイトーシス。HEK293細胞におけるPAR2-RLuc8/RIT-Venus BRET（A、B、E、G）およびPAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRET（C、D、F、H）。n、実験の反復、3回の観察。 図１７：HEK293細胞におけるPAR2コンパートメント化ERKシグナル伝達。HEK293細胞におけるサイトゾル（A-C、G、I、K）および核（D-F、H、J、L）のERK活性のFRETアッセイ。B、E. センサーの局在。n、実験の反復、3回の観察。 図１８：HEK293細胞におけるPAR2、βARR1およびGαqの初期エンドソームへのトラフィッキング。A、B. HEK293細胞におけるβARR1-RLuc8/Rab5a-Venus BRET（A）およびGαq-RLuc8/Rab5a-Venus BRET（B）。*P<0.05、***P<0.001ビヒクルと比較。n、実験の反復、3回の観察。C. ビヒクルまたはトリプシンで30分間処理した後のエンドソームにおけるEEA1、Gαq、およびPAR2の局在。矢印の先端は、トリプシン処理された細胞のエンドソームにおけるEEA1、Gαq、およびPAR2の共局在を示す。 図１９：HEK293細胞におけるPAR2コンパートメント化PKCおよびcAMPシグナル伝達。HEK293細胞におけるサイトゾルPKC（A、E、およびG）、原形質膜PKC（B、E、およびG）、サイトゾルcAMP（C、F、およびH）および原形質膜cAMP（D、F、およびH）のFRETアッセイ。I-L. センサーの局在。AUC、曲線下面積。*P<0.05、**P<0.01対照と比較。n、実験の反復、3回の観察。 図２０：トリパータイトPAR2アンタゴニスト。A. トリパータイトプローブを使用してエンドソーム内のPAR2を標的とする主要な要素。B. 化合物10トリパータイトPAR2アンタゴニストの構造。C. HT-29細胞における2F誘発IP1蓄積に対するI-343および化合物10の効果の濃度-反応分析。 図２１：結腸の求心性神経の感作および結腸コンプライアンス。A-D. マウスの機械感覚性応答を、TNBSへの暴露から28日後に測定した。結腸粘膜を、基礎条件下で、および受容野をトリプシン（A、D、Tryp）、NE（B、D）またはCS（C、D）に曝露した後、2 g von Freyフィラメントで刺激した。D. 基礎のパーセントとしての応答。棒中の数字は求心性神経の数を示す。E、F。覚醒している健常対照マウスにおける結腸コンプライアンス。圧力/容量の関係は、プロテアーゼカクテル（E）によっても、またはI-343（F）によっても変化しなかった。これは、結腸のコンプライアンスが変化していないことを示す。括弧内の数字はマウスの数を示す。*P<0.05、**P<0.01。
発明の詳細な説明
阻害剤の送達を特異的に制御するための部分を含むという点で、既知のPAR2モジュレーターと最も有意に異なる新規な一連の化合物が本明細書に記載されている。この部分は、腸管腔を横切る化合物の吸収およびその後の化合物の全身曝露を制御するか、または化合物の標的化送達を可能にするように設計されている。
腸管腔内で作用する非吸収性または非全身性の薬剤は、全身性代謝障害の治療、ならびに胃腸管の疾患および障害の治療に広く使用されている（Charmot, D., Current Pharmaceutical Designs 2012, 18, 1434-1445）。非吸収性薬剤はまた、標的外の全身作用を最小化し、それにより副作用が低減された好ましい毒性プロファイルを提供するという点でも有利である。本発明の化合物は、望ましくないPAR2活性に関連する胃腸系の疾患および障害（胃腸運動、食事誘発性肥満、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群および過敏性腸症候群に伴う痛みを含むが、これらに限定されない）の治療に特に有用であり得ると考えられる。
全身性薬剤の吸収は、一般に、腸管腔を覆う腸細胞内での受動的もしくは能動的輸送、または細胞の密着結合を介した受動的傍細胞輸送によって進行する。理論により制限されることを望むものではないが、式(I)の化合物に関して：
可変基R4の位置に特定の基を付加すると、PAR2に対する阻害活性を維持しながら、得られる化合物の内腔吸収が制限されることがわかった。これらの基は、-C1-C6アルキルS(O)2OH、-1,2,3-トリアゾール-1-酢酸、-NHR7、-ビシクロ[2.2.2]オクタンC(O)OR6、-C4-C8シクロアルキル-R5、-C1-C6アルキル-R5で置換された4〜6員の複素環式もしくはヘテロアリール基、または-(CH2)2C(O)NHC2-C10アルキル（ここで、該C2-C10アルキルは、2〜10個の-NH2または-OHで置換されている）を含むが、これらに限定されない。
別の実施形態では、R4の位置の特定の基は、初期エンドソームにエンドサイトーシスされたPAR2受容体への本発明の化合物の標的送達を可能にするように作用する。
PAR2のエンドソームシグナル伝達は、過敏性腸症候群（IBS）患者の痛みにおける役割について評価されている。IBS患者の結腸粘膜および大腸炎の実験動物で活性化されるトリプシン、エラスターゼ、およびカテプシンSは、侵害受容器の持続的なPAR2依存性興奮性亢進、機械的刺激に対する結腸求心性ニューロンの感作、および体性機械的アロディニアを引き起こした。クラスリンおよびダイナミン依存性エンドサイトーシスの阻害剤およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼの阻害剤は、トリプシン誘発性の興奮性亢進、感作、およびアロディニアを予防した。しかし、それらはエラスターゼまたはカテプシンS誘発性の興奮性亢進、感作またはアロディニアには影響を与えなかった。トリプシンはPAR2のエンドサイトーシスを刺激し、PAR2はエンドソームからシグナルを伝達して細胞外シグナル調節キナーゼ（extracellular signal regulated kinase）を活性化した。エラスターゼおよびカテプシンSは、PAR2のエンドサイトーシスを刺激せず、PAR2は原形質膜からシグナルを伝達してアデニリルシクラーゼを活性化した。IBS患者の結腸粘膜の生検は、侵害受容器の持続的なPAR2依存性興奮性亢進、およびエンドサイトーシスを媒介するβ-アレスチンとのPAR2結合(PAR2 association)を誘発するプロテアーゼを放出した。コレスタノールのような脂質アンカーを組み込んだ本発明の化合物は、PAR2を含有するエンドソーム中の化合物の送達および保持を促進する。本発明の化合物は、侵害受容器の持続性トリプシン-およびIBSプロテアーゼ-誘発性興奮性亢進を阻止した。これらの結果は、エンドソームからのPAR2シグナル伝達が、IBSの慢性疼痛を媒介する侵害受容器の持続的な興奮性亢進の根底にあることを明らかにする。したがって、エンドソームPAR2シグナル伝達の阻害剤は、IBSの痛みに対する新規な治療法を提供し得る。
本明細書で使用される「エンドソームPAR2シグナル伝達」という用語は、エンドソーム、好ましくは初期エンドソームにエンドサイトーシスされた、活性化されたPAR2によって伝達されるシグナルを指す。
本明細書で使用される「エンドソームPAR2シグナル伝達を阻害する」という用語は、PAR2がエンドソームにエンドサイトーシスされた後に、該受容体に作用する（または作用し続ける）PAR2の拮抗薬（アンタゴニスト）または阻害剤を指す。
エンドソームPAR2シグナル伝達を標的とするために、本発明の化合物は、以下の部分を含む「トリパータイト(tripartite)化合物」として調製される：
（式中、
Lは、長さ1 nm〜50 nmのリンカー部分であり;
LAは、原形質膜への化合物の挿入を促進する脂質アンカーである）。
本明細書で使用される「トリパータイト化合物」という用語は、リンカー基に共有結合したPAR2の阻害剤を含む、本明細書に記載の式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩を指し、リンカー基は、PAR2の阻害剤を細胞膜の脂質二重層に固定し、最終的には、初期エンドソームの膜に固定することができる脂質アンカーに共有結合している。
本明細書で使用される「脂質アンカー」(LA)という用語は、脂質膜に分配され、それによって式(I)の化合物を脂質膜に固定することができる部分を意味する。脂質膜への分配は、細胞外もしくは小胞内腔空間から直接的に、または脂質二重層から側方的に(laterally)起こり得る。
好ましい一実施形態において、脂質アンカーは、脂質膜に分配するその能力によって特徴付けることができ、その脂質膜は、4℃での非イオン性界面活性剤への不溶性によって特徴付けられる。
適切な脂質アンカーの例には、コレステロール、コレスタノール、スフィンゴ脂質、GPIアンカーまたは飽和脂肪酸誘導体が含まれるが、これらに限定されない。多くのそのような脂質アンカーが当技術分野、例えば、WO2005/097199に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
一実施形態では、脂質アンカーは、式(IIa)、(IIIa)、(IIIa-2)、および(IVa)から選択される部分：
（式中、
R1aは、置換されていてもよいC1-12アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアルコキシ基であり;
R2aおよびR3a、R3b、R4b、R4c、R5a、R6a、R7a、R7b、R8a、R8b、R9a、R9b、R10a、R11a、R11b、R12a、R12b、R13a、R14a、R15a、R15b、R16aおよびR16bは、独立して、H、C1-3アルキル、ヒドロキシル、C1-3アルコキシまたはアミノであり;または
任意選択で、R3a、R3bおよび／またはR4b、R4cおよび／またはR7a、R7bおよび／またはR8a、R8bおよび／またはR11a、R11bおよび／またはR12a、R12bおよび／またはR15a、R15bおよびR16a、R16bは、一緒になって=O（酸素に対する二重結合）を形成し;
R4aは、C、O、NHまたはSであり;
は、単結合または二重結合を表す）;または
その医薬上許容される塩である。
他の実施形態では、脂質アンカーは、式(Va)、(VIa)、(VIIa)または(VIIIa)から選択される部分：
（式中、
R4は、上記の通りであり;
は、単結合または二重結合を表し;
は、単結合、二重結合または三重結合を表し;
それぞれR5は、独立して、-NH-、-O-、-S-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-NHCONH-、-NHC(O)O-または-NHS(O2)-であり;
それぞれR6は、独立して、フッ素、好ましくは1〜4個のフッ素原子で置換されていてもよいC14-30アルキル基であり;
それぞれR7は、独立して、NH2、NHCH3、OH、H、ハロゲンまたはOであり、ただし、R7がNH2、NHCH3、OH、Hまたはハロゲンである場合、
は単結合であり、R7がOである場合、
は二重結合である;
それぞれR8は、独立して、H、OH、または
が三重結合を表す場合は、R8は存在せず;
R9は、フッ素、好ましくは1〜4個のフッ素原子で置換されていてもよいC10-30 アルキル基であり;および
それぞれR10は、独立して、フッ素、好ましくは1〜4個のフッ素原子で置換されていてもよいC24-40アルキレン基、C24-40アルケニレン基またはC24-40アルキニレン基である）;または
その医薬上許容される塩である。
さらなる実施形態では、脂質アンカーは、式(IXa)または(Xa)から選択される部分：
（式中、
は、単結合または二重結合を表し;
は、単結合、二重結合または三重結合を表し;
それぞれR13は、独立して、-O-または-CO(CH2)a(CO)bO-（式中、aは1〜3の整数であり、bは0〜1の整数である）であり;
R14は、-O-または-OC(O)-であり;
それぞれR15は、独立して、フッ素、好ましくは1〜4個のフッ素原子で置換されていてもよいC16-30アルキル基から選択され;
R16は、-PO3 -CH2-、-SO3CH2-、-CH2-、-CO2CH2-または直接結合であり;
R17は、-NH-、-O-、-S-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-NHCONH-、-NHC(O)O-または-NHS(O2)-であり;
R18は、NH2、NHCH3、OH、H、ハロゲンまたはOであり;
R19は、フッ素、好ましくは1〜4個のフッ素原子で置換されていてもよいC16-30アルキル基であり;および
各R20は、下記式の基で置換されていてもよいC(O)C13-25アルキル基である:
（式中、
は、単結合または二重結合であり;
R21は、-PO3 -CH2-、-SO3CH2-、-CH2-、-CO2CH2-または直接結合であり;
R22は、-NH-、-O-、-S-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-NHCONH-、-NHC(O)O-または-NHS(O2)-であり;
R23は、-O-または-OC(O)-であり;
それぞれR24は、独立して、フッ素、好ましくは1〜4個のフッ素原子で置換されていてもよいC16-30アルキル基から選択され;
R25は、-CO(CH2)a(CO)bO-または-CO(CH2)a(CO)bNH-（式中、aは1〜3の整数であり、bは0〜1の整数である）であり;および
R26は、フッ素、好ましくは1〜4個のフッ素原子で置換されていてもよいC4-20アルキル基である））;または
その医薬上許容される塩である。
さらなる実施形態では、脂質アンカーは、式(XIa)、(XIIa)、(XIIIa)または(XIVa)から選択される部分：
（式中、
それぞれR27は、独立して、-NH-、-O-、-NH(CH2)cOPO3 --、-NH(CH2)cSO2NH-、-NHCONH-、-NHC(O)O-、-CO(CH2)b(CO)aNH-、-CO(CH2)b(CO)aO-、-CO(CH2)bS-、-CO(CH2)bOPO3 --、-CO(CH2)bSO2NH-、-CO(CH2)bNHCONH-、-CO(CH2)bOCONH-、-CO(CH2)bOSO3-、または-CO(CH2)bNHC(O)O-（式中、aは0〜1の整数であり、bは1〜3の整数であり、cは2〜3の整数である）から選択され;
それぞれR28は、独立して、-CH2-または-O-であり;
それぞれR29は、独立して、Hまたはフッ素、好ましくは1〜4個のフッ素原子で置換されていてもよいC16-30アルキル基から選択され;
それぞれR31は、独立して、H、またはフッ素、好ましくは1〜4個のフッ素原子で置換されていてもよいC1-15アルキル基、またはフッ素、好ましくは1〜4個のフッ素原子で置換されていてもよいC1-15アルコキシ基から選択され;および
nは1〜2の整数である）;または
その医薬上許容される塩である。
さらに別の実施形態では、脂質アンカー部分は、C10-20アルキル（例えば、C16アルキル）である。
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、PAR2阻害剤を脂質アンカーに連結する化合物の部分に関する。リンカーは、リガンド結合部位でPAR2阻害剤と競合しないように選択されるべきであることが理解される。また、リンカーは脂質膜に分配されるべきではない。
リンカー基は、脂質アンカーがエンドソーム膜に固定されるとき、PAR2の阻害剤が該受容体と相互作用することを可能にするために、1 nm〜50 nmの長さでなければならない。
一実施形態では、リンカー基は、１つ以上のポリエチレングリコール単位を含む。別の実施形態では、リンカーまたはリンカーのサブユニットは、どちらの基の機能にも干渉することなく、PAR2阻害剤と脂質アンカーとの間に適切な距離を提供するアミノ酸残基、誘導体化または官能化アミノ酸残基、ポリエーテル、尿素、カルバメート、スルホンアミドまたは他のサブユニットであり得ることが想定される。
一実施形態では、リンカーは、式(XVa)の部分で表される：
（式中、
Zは、リンカーと脂質アンカーの間の結合基であって、-C1-C10アルキル-、-C2-C10アルケニル-、-C2-C10アルキニル-、-C1-C10アルキルC(O)-、-C2-C10アルケニルC(O)-もしくは-C2-C10アルキニルC(O)-であり;または
Zは、隣接するアミンと一緒になって、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリンもしくはトレオニンから選択されるC末端がアミド化されていてもよい（例えば、C末端がアミド化されている、またはC末端がアシルヒドラジン（例えば、
）である）アミノ酸であり;ここで、該アミノ酸は、側鎖官能基を介して脂質アンカーに結合する;
mは、1または2であり;
nは、1〜20であり;および
pは、1〜8である）;または
その医薬上許容される塩。
一実施形態では、リンカーは、式(XVa)の部分で表される：
（式中、
Zは、リンカーと脂質アンカーの間の結合基であって、-C1-C10アルキル-、-C2-C10アルケニル-、-C2-C10アルキニル-、-C1-C10アルキルC(O)-、-C2-C10アルケニルC(O)-もしくは-C2-C10アルキニルC(O)-であり;または
Zは、隣接するアミンと一緒になって、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリンまたはトレオニンから選択されるC末端がアミド化されていてもよいアミノ酸であり;ここで、該アミノ酸は、側鎖官能基を介して脂質アンカーに結合する;
mは、1または2であり;
nは、1〜20であり;および
pは、1〜8である）;または
その医薬上許容される塩。
別の実施形態では、リンカーは、式(XVIa)の部分で表される：
（式中、
それぞれR11は、独立して、天然起源、誘導体化または官能化されたアミノ酸残基の任意の側鎖であり;
mは3〜80の整数であり;および
nは0〜1の整数である）;または
その医薬上許容される塩。
他の実施形態では、リンカーは、式(XVIIa)の部分で表される：
（式中、
mは、0〜40の整数であり;
nは、0〜1の整数であり;
それぞれoは、独立して、1〜5の整数であり;
それぞれR11は、独立して、天然起源、誘導体化または官能化されたアミノ酸残基の任意の側鎖であり;および
SO2末端は、脂質アンカーに結合する）。
さらなる実施形態では、リンカーは、式(XVIIIa)の部分で表される：
（式中、
mは、0〜40の整数であり;
nは、0〜1の整数であり;
それぞれoは、独立して、1〜5の整数であり;
各R12は、独立して、NHまたはOであり;
それぞれR11は、独立して、天然起源、誘導体化または官能化されたアミノ酸残基の任意の側鎖であり;および
C(O)末端は、脂質アンカーに結合し、R12末端は、エンドソームPAR2シグナル伝達の阻害剤に結合する）。
いくつかの適切なリンカー部分がWO2005/097199に記載されており、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書では、当業者によく知られているいくつかの用語が使用されている。それにもかかわらず、明確にする目的で、いくつかの用語が定義される。
本明細書で使用される場合、単独でまたは複合語で使用される「アルキル」という用語は、直鎖または分岐アルキルを意味する。「C1-12」のような接頭語は、アルキル基内の炭素原子の数（この場合は1〜12）を示すために使用される。直鎖および分岐アルキルの例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、5-メチルヘプチル、5-メチルヘキシル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルおよびドコシル（C22）が含まれる。
単独でまたは複合語で使用される「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素-炭素二重結合を含む直鎖または分岐炭化水素残基を意味し、エチレン性モノ、ジまたはポリ不飽和の先に定義されたアルキル基を含む。「C2-12」のような接頭語は、アルケニル基内の炭素原子の数（この場合は2〜12）を示すために使用される。アルケニルの例には、ビニル、アリル、1-メチルビニル、ブテニル、イソ-ブテニル、3-メチル-2-ブテニル、1-ペンテニル、1-ヘキセニル、3-ヘキセニル、1-ヘプテニル、3-ヘプテニル、1-オクテニル、1-ノネニル、2-ノネニル、3-ノネニル、1-デセニル、3-デセニル、1,3-ブタジエニル、1,4-ペンタジエニル、1,3-ヘキサジエニル、1,4-ヘキサジエニルおよび5-ドコセニル（C22）が含まれる。
単独でまたは複合語で使用される「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素-炭素三重結合を含む直鎖または分岐炭化水素残基を意味する。「C2-C10」のような接頭語は、アルケニル基内の炭素原子の数（この場合は2〜10）を示すために使用される。
本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、好ましくは環あたり５〜１２個の原子を有する、置換されていてもよい単環式または縮合多環式芳香族炭素環（すべて炭素である環原子を有する環構造）を意味する。アリール基の例には、フェニルのような単環式基、ナフチルのような縮合多環式基などが含まれる。
本明細書で使用される「ヘテロアリール」という用語は、典型的には各環に最大７個の原子の単環式または二環式環を表し、少なくとも１つの環は芳香族であり、O、NおよびSからなる群から選択される１〜４個のヘテロ原子を含む。この定義の範囲内のヘテロアリール基には、ベンゾイミダゾール、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、インドイル(indoiyl)、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、1H-1,2,3-トリアゾール、2H-1,2,3-トリアゾール、1H-1,2,4-トリアゾールおよびテトラヒドロキノリンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、単独でまたは複合語で使用される「複素環」または「ヘテロシクリル」という用語は、O、NおよびSからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含む飽和または部分不飽和の単環式、二環式または縮合多環式環系を意味する。「C4-C8」のような接頭語は、基の環状部分内の炭素原子の数（この場合は4〜8）を示すために使用される。「複素環」は、上記のヘテロアリール基のジヒドロおよびテトラヒドロ類似体を含む。適切な複素環式置換基の例には、ピロリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ピラゾリン、ピラゾリジン、イミダゾリジン、テトラヒドロフラン、ピラン、ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、ジオキサン、オキサゾリン、モルホリン、チオモルホリン、テトラヒドロチオフェン、オキサチアン、ジチアン、4H-1,2,3-トリアゾールおよびジチアジンが含まれるが、これらに限定されない。これらのそれぞれは、1〜3個の置換基でさらに置換されていてもよい。
本明細書で使用される「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを指す。
「オキソ」という用語は、隣接する炭素原子に二価で結合した酸素原子を意味する。「Ｒ」可変基がオキソである場合、オキソの二価の性質のために、環状構造内の隣接する炭素原子に結合する水素原子は存在しないことが理解される。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈上別途必要な場合を除き、「含む(comprise)」という語、および「含む(comprises)」または「含む(comprising)」のような変形は、記載された要素または要素もしくはステップのグループを含むことを意味するが、任意の他の要素または要素のグループを除外するものではないことが理解される。
本明細書において、先行出版物（またはそれに由来する情報）または公知の事項への言及は、その先行出版物（またはそれに由来する情報）または公知の事項が、本明細書が関係する努力の分野における共通の一般知識の一部を形成する承認または許可、またはいかなる形態の示唆とはみなされず、またはみなされるべきでない。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、一般式（Ｉ）を参照すると、以下の好ましい１つまたは複数が適用される：
a) R1は、H、C1-C6アルキルまたはハロである。
b) R1は、ハロである。
c) R1は、フルオロである。
d) R2は、それぞれ1〜3個のハロゲンで置換されていてもよい、C1-C6アルキル、C3-C6シクロアルキルまたはC1-C6アリールである。
e) R2は、C4アルキルである。
f) R2は、t-ブチルである。
g) R3は、オキソまたはC1-C6アルキルであり、pは、0〜3の整数である。
h) R3は、C1-C6アルキルであり、pは、2である。
i) R3は、メチルであり、pは、2である。
j) R4は、-C1-C6アルキルS(O)2OH、-1,2,3-トリアゾール-1-酢酸、-NHR7、-ビシクロ[2.2.2]オクタンC(O)OR6、-C4-C8シクロアルキル-R5、-C1-C6アルキル-R5で置換された4〜6員の複素環式もしくはヘテロアリール基、または-(CH2)2C(O)NHC2-C10アルキル（ここで、該C2-C10アルキルは、2〜10個の-NH2または-OHで置換されている）である。
k) R5は、-C(O)NHR7または-NHC(O)R7である。
i) R6は、HまたはR7である。
j) R7は、-R8、-C1-C20アルキル、-C1-C20アルキルC(O)NH2または-C1-C20 アルキルC(O)NR8（ここで、該-C1-C20アルキル、-C1-C20アルキルC(O)NH2および-C1-C20アルキルC(O)NR8は、2〜10個の-NH2または-OHで置換されていてもよく、該アルキル基中の1つまたは複数の炭素原子が窒素または酸素で置き換えられていてもよい）である。
k) R7は、-C1-C20アルキル、-C1-C20アルキルC(O)NH2または-C1-C20アルキルC(O)NR8（ここで、該-C1-C20アルキル、-C1-C20アルキルC(O)NH2および-C1-C20アルキルC(O)NR8は、2〜10個の-NH2または-OHで置換されていてもよく、該アルキル基中の1つまたは複数の炭素原子が窒素または酸素で置き換えられていてもよい）である。
l) R7は、-R8である。
m) R8は、式:
（式中、
Lは、長さ1 nm〜50 nmのリンカー部分であり;
LAは、原形質膜への化合物の挿入を促進する脂質アンカーである）
で表される。
n) LAは、コレステロール、コレスタノール、スフィンゴ脂質、GPIアンカーまたは飽和脂肪酸誘導体から選択される脂質アンカーである。
o) LAは、式(IIa)、(IIIa)、(IVa)、(Va)、(VIa)、(VIIa)、(VIIIa)、(IXa)、(Xa)、(XIa)、(XIIa)、(XIIIa)、および(XIVa)の部分から選択される脂質アンカーである。
p） LAは、式(IIa)または(IIIa)の部分から選択される脂質アンカーである。
q） Lは1つ以上のサブユニットを含むリンカー部分であり、サブユニットはポリエチレングリコール単位、アミノ酸残基、誘導体化または官能化アミノ酸残基、ポリエーテル、尿素、カルバメートおよび／またはスルホンアミドを含む。
r) Lは、式(XVa)、(XVIa)、(XVIIa)または(XVIIIa)で表されるリンカー部分である。
s) Lは、式(XVa)で表されるリンカー部分である。
好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩は、以下から選択される：
本発明の化合物は、１つ以上の立体異性体（例えば、ジアステレオマー）で存在し得ることが理解される。本発明は、その範囲内に、単離された（例えば、エナンチオマー単離で）、または組み合わせ（ラセミ混合物およびジアステレオマー混合物を含む）のこれらの立体異性体のすべてを含む。
したがって、本発明は、不斉キラル中心に関して実質的に純粋な立体異性体、例えば、約90％deを超える（例えば約95％〜97％de、または99％deを超える）化合物、ならびにそれらの混合物（ラセミ混合物を含む）に関する。そのようなジアステレオマーは、例えばキラル中間体を使用する不斉合成によって調製することができ、または混合物は、常法、例えばクロマトグラフィー、または分割剤の使用によって分割することができる。
本発明は、独立してL体およびD体から選択されるアミノ酸の使用を含む、L体およびD体の両方のアミノ酸の使用を意図し、例えば、ペプチドが2つのセリン残基を含み、各セリン残基は同じか、または反対の絶対立体化学を有していてもよい。特に明記しない限り、アミノ酸はL配置をとる。
化合物がプロトン化または脱プロトン化され得る（例えば、生理学的ｐＨで）１つ以上の官能基を含む場合、化合物は、医薬上許容される塩として調製および／または単離され得る。化合物は、所与のｐＨで両性イオン性であり得ることが理解される。本明細書で使用する場合、「医薬上許容される塩」という表現は、所与の化合物の塩を指し、その塩は、医薬品としての投与に適している。そのような塩は、例えば、それぞれアミンまたはカルボン酸基と、酸または塩基との反応によって形成され得る。
医薬上許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸から調製することができる。無機酸の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが含まれる。有機酸の例には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸などが含まれる。
医薬上許容される塩基付加塩は、無機および有機塩基から調製することができる。無機塩基に由来する対応する対イオンには、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウム塩が含まれる。有機塩基には、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2-ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、N-アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、およびN-エチルピペリジンを含む、第一級、第二級および第三級アミン、天然の置換アミンを含む置換アミン、および環状アミンが含まれる。
酸／塩基付加塩は、対応する遊離酸／塩基の形態よりも、水性溶媒中において溶解性がより高い傾向がある。
本発明の化合物は、結晶形態であっても、溶媒和物（例えば、水和物）であってもよく、両方の形態が本発明の範囲内であることが意図される。「溶媒和物」という用語は、溶質（本発明では、本発明のペプチド）と溶媒によって形成される様々な化学量論の複合体である。そのような溶媒は、溶質の生物活性を妨げてはならない。溶媒は、例として、水、エタノール、または酢酸であり得る。溶媒和の方法は、当技術分野において一般的に知られている。
本発明の化合物は、プロドラッグの形態であり得る。「プロドラッグ」という用語は、その最も広い意味で使用され、生体内で本発明の化合物に変換される誘導体を包含する。そのような誘導体は当業者に容易に理解されるであろうし、例えば、遊離ヒドロキシ基がエステル誘導体に変換されるか、または環窒素原子がN-オキシドに変換される化合物が含まれる。エステル誘導体の例には、アルキルエステル（例えば、酢酸エステル、乳酸エステル、およびグルタミン）、リン酸エステル、およびアミノ酸（例えば、バリン）から形成されるものが含まれる。本発明の化合物のプロドラッグである任意の化合物は、本発明の範囲および精神内にある。本発明による適切なプロドラッグを調製するための従来の手順は、「Design of Prodrugs」H. Bundgaard編、Elsevier、1985のような教科書に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の一実施形態では、PAR2を、本明細書で定義される式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩と接触させることを含む、PAR2シグナル伝達を阻害する方法が提供される。該化合物またはその医薬上許容される塩への細胞の曝露は、in vitro、ex vivo、またはin vivoで起こり得る。
化合物への細胞の曝露がin vitroまたはex vivoで起こる場合、例えば、本発明の方法は、生物学的研究のためのツールとして、または特定の化合物（単独または組み合わせて）の対象におけるPAR2活性を調節する有効性を決定するための診断ツールとして使用し得る。一例として、PAR2を発現する細胞を対象から分離し、本発明の１つまたは複数の化合物またはその塩に曝露することができる。該化合物（単数または複数）がPAR2の活性を調節する能力は、当業者に知られている方法を介していくつかの下流マーカーのいずれか１つを測定することによって評価することができる。したがって、ある化合物が別の化合物よりも有効であるかどうかを確認し、特定の治療計画をその対象に合わせて適応させることができる。
好ましい実施形態では、PAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害を予防または治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書で定義される式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩を投与することを含む方法が提供される。
特に好ましい実施形態では、本発明は、エンドソームPAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害を予防または治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書で定義される式(I)の化合物または医薬的にその許容できる塩を投与することを含む方法を提供する。
別の好ましい実施形態では、PAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害の予防または治療に使用するための、本明細書で定義される式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩が提供される。
さらに好ましい実施形態では、エンドソームPAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害の予防または治療に使用するための、本明細書で定義される式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩が提供される。
さらに別の好ましい実施形態では、PAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害の予防または治療用医薬の製造における、本明細書で定義される式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩の使用が提供される。
別の好ましい態様は、エンドソームPAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害の予防または治療用医薬の製造における、本明細書で定義される式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩の使用に関する。
本明細書で使用される「治療(treatment)」および「治療する(treating)」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける状態または疾患の任意の治療を含み、PAR2シグナル伝達の阻害が有益である任意の疾患または障害の治療を含む。本明細書で使用される「予防(prevention)」および「予防する(preventing)」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける状態または疾患の予防(prevention)または予防(prophylaxis)を含み、PAR2シグナル伝達の阻害が有益である任意の疾患または障害の予防を含む。
好ましい実施形態では、予防または治療方法は、本明細書に記載の望ましくないPAR2活性に関連する、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害にかかりやすい素因を有する対象に、該疾患もしくは障害、該疾患もしくは障害の症状、または該疾患もしくは障害にかかりやすい素因を治癒する(cure)、治す(heal)、軽減する(alleviate)、緩和する(relieve)、変更する(alter)、治療する(remedy)、改善する(ameliorate)、改善する(improve)、または影響を及ぼす(affect)目的で、本発明による化合物またはその医薬上許容される塩を投与するステップを含む。予防的処置(prophylactic treatment)は、望ましくないPAR2活性に関連する疾患または障害の発生率を低下させ得る。
本発明の予防または治療方法はまた、本明細書に記載の望ましくないPAR2活性に関連する、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害にかかりやすい素因を有する対象に、該疾患もしくは障害、該疾患もしくは障害の症状、または該疾患もしくは障害にかかりやすい素因を治癒する(cure)、治す(heal)、軽減する(alleviate)、緩和する(relieve)、変更する(alter)、治療する(remedy)、改善する(ameliorate)、改善する(improve)、または影響を及ぼす(affect)目的で、本発明による化合物またはその医薬上許容される塩の組み合わせを投与することを含み得る。予防的処置は、望ましくないPAR2活性に関連する疾患または障害の発生率を低下させ得る。いくつかの実施形態では、本発明の化合物またはその医薬上許容される塩の組み合わせは、本発明の化合物またはその医薬上許容される塩の１つのみを利用する予防または治療方法と比較して、PAR2活性の阻害を増強し得る。
本明細書に記載される予防または治療方法が、当技術分野で現在使用されている他の治療様式との任意の数の組み合わせで使用され得ることもまた、当業者によって理解される。
PAR2発現および／または活性が増加した状態であって、前記活性を低下させることが望ましい状態は、当技術分野で公知の診断または予後予測アッセイのいずれかまたはそれらの組み合わせによって、当業者により特定することができ、例えば、対象から得た生物学的サンプル（例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、脳脊髄液、脂肪組織、脳組織および／またはそれらに由来する細胞）は、PAR2発現および／または活性について分析され得る。このような状態には、急性および慢性の炎症性疾患、腫瘍転移、胃腸運動、痛み、かゆみ、アトピー性皮膚炎のような皮膚疾患、食事性肥満、喘息、関節リウマチ、歯周炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、がん、線維性疾患、代謝機能障害、および神経疾患が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の文脈において、「痛み(pain)」という用語は、慢性炎症性疼痛（例えば、関節リウマチ、変形性関節症、リウマチ性脊椎炎、痛風性関節炎、および若年性関節炎に伴う痛み）；筋骨格痛、腰および首の痛み、捻挫および緊張、神経障害性の痛み、交感神経依存性疼痛、筋炎、がんおよび線維筋痛症に伴う痛み、片頭痛に伴う痛み、群発性頭痛および慢性連日性頭痛に伴う痛み、インフルエンザまたは感冒などのその他のウイルス感染症に伴う痛み、リウマチ熱、非潰瘍性ディスペプシア、非心臓性胸痛および過敏性腸症候群などの機能性腸障害に伴う痛み、心筋虚血に伴う痛み、術後痛、頭痛、歯痛、月経困難症、神経痛、線維筋痛症候群、複合性局所疼痛症候群（CRPS I型およびII型）、神経因性疼痛症候群（糖尿病性ニューロパシー、化学療法誘発性神経障害性疼痛、坐骨神経痛、非特異的腰痛、多発性硬化症疼痛、HIV関連神経障害、ヘルペス後神経痛、三叉神経痛）および身体外傷、切断、がん、毒素、または慢性の炎症性状態に起因する痛みを含む。好ましい実施形態では、痛みは体性痛または内臓痛である。
好ましい実施形態では、本発明は、過敏性腸症候群に伴う痛みを予防または治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の本明細書で定義される式(I)の化合物またはその医薬上許容される塩を投与することを含む方法を提供する。
上記の方法は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ラットおよびマウスを含むすべての哺乳動物、ならびにニワトリ、鳥類、爬虫類、および細菌のような下等生物を含むが、これらに限定されない、任意の種の予防的および治療的処置に適していると考えられる。
本発明はまた、治療有効量の上記で定義される化合物またはその医薬上許容される塩を、少なくとも１つの医薬上許容される担体または希釈剤と共に含む医薬組成物を提供する。
「組成物」という用語は、担体としてのカプセル化材料と一緒の有効成分の製剤を含み、有効成分（他の担体を伴うかまたは伴わない）が担体に囲まれているカプセルが得られることを意図している。
上記の化合物またはその医薬上許容される塩は、対象に投与される唯一の有効成分であり得るが、当該化合物を伴う他の有効成分（複数可）の投与は、本発明の範囲内である。１つ以上の実施形態では、本発明の２つ以上の化合物の組み合わせが対象に投与されることが想定される。化合物（複数可）はまた、１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与され得ることが想定される。この組み合わせは、他の活性成分（複数可）との上記の化合物（複数可）の別々の、連続した、または同時の投与を可能にし得る。この組み合わせは、医薬組成物の形態で提供されてもよい。
本明細書で使用される用語「組み合わせ」は、上記で定義された組み合わせパートナーが依存的にもしくは独立して、または異なる量の組み合わせパートナーとの異なる固定組み合わせの使用によって、すなわち同時にまたは異なる時点に投与できる組成物または部品のキットを指す。次いで、組み合わせパートナーは、例えば、同時にまたは時間的にずらして（すなわち、異なる時点で、そしてキットの任意の部分について等しいまたは異なる時間間隔で）投与され得る。組み合わせにおいて投与される組み合わせパートナーの総量の比率は、変動し得る、例えば、治療されるべき患者亜集団のニーズまたは単一の患者のニーズに対処するためであり、異なるニーズは、患者の年齢、性別、体重などによるものでありえる。
当業者によって容易に理解されるように、投与ルートおよび医薬上許容される担体の種類は、治療される状態および対象の種類に依存する。特定の担体または送達系の選択、および投与ルートは、当業者によって容易に決定され得ると考えられる。活性化合物を含有するいずれかの製剤の調製において、化合物の活性が工程中に破壊されず、化合物が破壊されることなくその作用部位に到達することができるように注意を払うべきである。場合によっては、例えばマイクロカプセル化などの当技術分野で公知の手段によって化合物を保護することが必要な場合がある。同様に、選択される投与ルートは、化合物がその作用部位に到達するようなものでなければならない。
当業者は、従来のアプローチを用いて本発明の化合物のための適切な製剤を容易に決定することができる。好ましいｐＨ範囲および適切な賦形剤、例えば酸化防止剤の同定は、当技術分野ではルーティンである。緩衝液系は、所望の範囲のｐＨ値を提供するために日常的に使用され、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩およびコハク酸塩などのカルボン酸緩衝液が挙げられる。ＢＨＴまたはビタミンＥなどのフェノール化合物、メチオニンまたは亜硫酸塩などの還元剤、およびＥＤＴＡなどの金属キレート剤を含む、様々な抗酸化剤がこのような製剤に利用可能である。
本発明の化合物が腸管腔を横切る化合物の吸収およびその後の化合物の全身曝露を制御するように設計されている場合、好ましい投与経路は経口または経腸投与であろうと考えられる。本発明の経口および経腸製剤の場合、活性化合物は、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に製剤化することができ、あるいはハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入することができ、あるいは錠剤に圧縮することができ、またはダイエットの食品に直接組み込まれる。経口治療投与のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ得、摂取可能な錠剤、バッカルまたは舌下錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハースなどの形態で使用され得る。そのような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な投与量が得られるようなものである。
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下に列挙する成分を含んでもよい：ガム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；スクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリー香味などの香味剤を添加してもよい。投薬単位形態がカプセルである場合、それは、上記タイプの材料に加えて、液体担体を含有してもよい。様々な他の材料が、コーティングとして、または他の方法で投与単位の物理的形態を改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、砂糖、またはその両方でコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、チェリーまたはオレンジフレーバーなどの色素および香味料を含有してもよい。もちろん、投与単位形態を調製するのに使用される任意の物質は、薬学的に純粋であり、使用される量において実質的に非毒性でなければならない。さらに、本発明の化合物は、活性ペプチドを腸の特定領域に特異的に送達させるものを含む徐放性製剤および処方に組み込んでもよい。
液体製剤は、胃または食道管を介して経腸的に投与することもできる。経腸製剤は、乳化基剤または水溶性基剤などの適切な基剤と混合することによって坐剤の形態で調製することができる。
本発明の化合物がエンドサイトーシスされたPAR2への標的化送達を意図する場合、好ましい投与経路は非経口投与であることが想定される。上記の化合物またはその医薬上許容される塩は、静脈内、くも膜下腔内、および脳内または硬膜外送達に適したものを含む非経口剤形で調製することができる。注射用途に適した医薬形態には、無菌注射溶液または分散液、および無菌注射溶液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。それらは、製造および保管の条件下で安定であるべきであり、還元または酸化、および細菌または真菌などの微生物の汚染作用から保護され得る。
注射可能な溶液または分散液のための溶媒または分散媒は、活性化合物のための従来の溶媒または担体系のいずれかを含んでもよく、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、および植物油を含んでもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌剤および抗真菌剤を含有させることによって、必要に応じて行うことができる。多くの場合、浸透圧を調節する薬剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。好ましくは、注射用製剤は血液と等張性である。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物中での使用によってもたらされ得る。注射用に適した医薬形態は、静脈内、筋肉内、脳内、髄腔内、硬膜外注射または注入を含む任意の適切な経路によって送達することができる。
滅菌注射溶液は、本発明の化合物を、必要に応じて上に列挙したものなど種々の他の成分を含む適切な溶媒中に必要量加え、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌された有効成分を、基本的な分散媒体および上記のものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分および任意の追加の所望の成分の予め滅菌濾過された溶液の真空乾燥または凍結乾燥である。
本発明の化合物を局所、鼻腔内、膣内、眼内などに投与することも可能であるが、必須ではない。本発明の化合物はまた、二酸化炭素ガス、ジクロロジフルオロメタン、窒素、プロパンまたは他の適切なガスまたはガスの組み合わせなどの噴射剤を含む加圧ディスペンサーまたは容器からのエアロゾルスプレーの形態で吸入により投与され得る。化合物は、ネブライザーを使用して投与することもできる。
医薬上許容されるビヒクルおよび／または希釈剤には、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分と適合しない場合を除いて、治療組成物におけるその使用が企図される。補助的な有効成分も組成物に組み込むことができる。
投与の容易さおよび投与量の均一性のために投薬単位形態で組成物を処方することが特に有利である。本明細書で使用される投薬単位形態とは、治療される哺乳動物対象のための単位投薬量として適した物理的に別個の単位を意味する；各単位は、所要の医薬上許容されるビヒクルと関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。本発明の新規な投薬単位形態の詳細は、（ａ）活性物質の独特な特性および達成すべき特定の治療効果、および（ｂ）本明細書に詳細に開示されているように身体の健康が損なわれている疾患状態を有する生きている対象における疾患の治療のために配合されている活性物質の技術に固有の制限、によって決定され、それらに直接依存する。
上記のように、主な有効成分は、投薬単位形態中の適切な医薬上許容されるビヒクルを用いて、治療有効量で簡便かつ効果的に投与するために配合され得る。単位投薬形態は、例えば、主な活性化合物を０．２５μｇ〜約２０００ｍｇの範囲の量で含有することができる。比率で表せば、活性化合物は、担体１ｍＬ中に約０．２５μｇ〜約２０００ｍｇ存在し得る。補助有効成分を含有する組成物の場合、投与量は、前記成分の通常の投与量および投与様式を参照して決定される。
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」は、所望の投与計画に従って投与された場合に、所望の治療活性を提供する化合物の量を指す。投薬は、１回、または数分または数時間の間隔で、またはこれらの期間のいずれかに連続して行ってもよい。適切な投薬量は、１投薬当たり約０．１ｎｇ／ｋｇ体重〜１ｇ／ｋｇ体重の範囲内であり得る。典型的な投薬量は、１投薬当たり１ｍｇ／ｋｇ体重〜１ｇ／ｋｇ体重の範囲のような、１投薬当たり１μｇ／ｋｇ体重〜１ｇ／ｋｇ体重の範囲である。１つの実施形態において、投薬量は、１投薬当たり１ｍｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。別の実施形態において、投薬量は、１投薬当たり１ｍｇ／ｋｇ体重〜２５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。さらに別の実施形態において、投薬量は、１投薬当たり１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、例えば、１投薬当たり５０ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲であり得る。
式(I)の化合物を合成するための一般的な戦略は、以下の一般的なスキーム、以下の一般的な合成手順、および中間生成物の合成のための特定の実施形態において概説される。
一般的スキーム1
一般的な合成手順：
一般手順1：アミド形成A
適切なカルボン酸（1.0当量）をDMFまたはDMSO（0.15〜0.3M）に溶解してから、HBTUまたはHATU（1.1〜1.5当量）、対応するアミン（1.1〜1.2当量）およびDIPEA（2.5〜3.5当量）を添加する。混合物を室温で45分から16時間撹拌する。以下の後処理手順のいずれか一つを使用できる：
1) 水を加え、固形物を濾過し、洗浄して、所望の生成物を得る；または
2) 水をEtOAcと共に加え、相を分離する。有機相を水とブライン（1：1の混合物）でさらに2回洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させる。生成物をシリカゲルおよび/または分取HPLCで精製する。
一般手順2：アミド形成B
適切なカルボン酸（1.0当量）、対応するアミン（1.1〜1.2当量）およびDIPEA（2.5〜3.5当量）をDMFまたはDMSO（0.15〜0.3M）に溶解してから、PyBOPまたはPyOxim（1.1〜1.5当量）を添加する。混合物を室温で45分から16時間撹拌する。以下の後処理手順のいずれか一つを使用できる：
1) 水を加え、固形物を濾過し、洗浄して、所望の生成物を得る；または
2) 水をEtOAcと共に加え、相を分離する。有機相を1M HClでさらに2回洗浄し、次に飽和重炭酸塩溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させる。生成物をシリカゲルおよび/または分取HPLCで精製する。
一般手順3：固相A
NH 2 -PEG 12 -Asp(OChol)-レジン：スペーサー-脂質コンジュゲートの合成は、NovaSyn（登録商標）TGR Rレジン（NovaBiochemから購入、0.18 mmol/gをロード）での標準Fmoc化学による手動ペプチド合成により調製される。Fmoc-Asp(OChol)-OH（1.5当量）と（1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）（トリ-1-ピロリジニル）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（PyBOP、2当量）をジクロロメタン（DCM）中で、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA、3当量）を使用してin situで活性化することにより3時間カップリングする。Fmoc脱保護は、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）中の20%ピペリジンを使用して行われる。Fmoc-PEG12-OH（2当量）を、DCM中でPyBOP（2当量）およびDIPEA（3当量）を使用して、レジン結合NH2-Asp(OChol)に結合する。Fmoc脱保護は、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）中の20%ピペリジンを使用して行われる。最後の脱保護に続いて、アンタゴニストをレジン上のスペーサー-脂質コンジュゲートに結合する。酸（2-3当量）を、DCM中でPyBOP（2当量）およびDIPEA（3当量）を使用して、レジン結合NH2-PEG12-Asp(OChol)-レジン（250 mg）に一晩カップリングする。次に、95%トリフルオロ酢酸を使用してレジンから構造物を切断し、0.1% TFA/H2Oおよび0.1% TFA/ACNを溶媒として、逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（Phenomenex Luna C8カラム、Lane Cove、オーストラリア）で精製し、脂質付加した(lapidated)アンタゴニストを粘性オイルとして得る。
一般手順4：アンタゴニストとの脂質コンジュゲートの固相合成
アンタゴニスト-PEG-スペーサー-Asp(OChol)-レジン：アンタゴニスト、アミノ酸、およびムチン酸(mucic acid)とのスペーサー-脂質（PEG2-12）コンジュゲートの合成は、一般手順11に記載されている標準的なカップリングプロトコルを使用して調製した。次に、完成した脂質コンジュゲートを一般手順11に記載されているようにして切断および精製した。
式(I)のトリパータイト化合物の脂質アンカー(LA)基を合成するための一般的な戦略を以下に概説する。
コレステリルグリコール酸、3-コレステリルアミン、およびコレステリルグリシンの合成は、文献に記載されている（Hussey, S. L. et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 12712-12713; Hussey, S. L. et al., Org. Lett. 2002, 4, 415-418; Martin, S. E. et al., Bioconjugate Chem. 2003, 14, 67-74）。ステロイド構造の3位にアミド、スルホンアミド、尿素またはカルバメート官能基を有する式(IIIa)の脂質アンカーは、3-コレステリルアミンから調製することができ、例えば、3-コレステリルアミンを、DMAPの存在下でコハク酸無水物と反応させて、対応するスクシニル置換化合物を得ることができる。対応するスルホンアミドは、3-コレステリルアミンとクロロスルホニル酢酸との反応によって得ることができ、クロロスルホニル酢酸は、文献に記載されているように調製することができる（Hinman, R. L. and Locatell, L. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 5655-5658）。対応する尿素またはカルバメートは、対応するイソシアネートを経由して、文献の手順に従って調製することができる（Knolker, H.-J. T. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 2497; Knolker, H.-J. et al., Synlett 1996, 502; Knolker, H.-J. and. Braxmeier, T. Tetrahedron Lett. 1996, 37, 5861）。ステロイド構造の3位にホスフェートまたはカルボキシメチル化ホスフェートを有する化合物(IIIa)の中間体は、文献に記載されているように調製することができる（Golebriewski, Keyes, Cushman, Bioorg. Med. Chem. 1996, 4, 1637-1648; Cusinato, Habeler, et al., J. Lipid Res. 1998, 39, 1844-1851; Himber, Missano, et al., J. Lipid Res. 1995, 36, 1567-1585）。ステロイド構造の3位にチオールを有する式(IIIa)の脂質アンカーは、文献に記載されているように調製することができ（J. G. Parkes, J. G. et al., Biochim. Biophys. Acta 1982, 691, 24-29）、対応するカルボキシメチル化チオールは、対応するアミンおよびアルコールについて記載したような単純なアルキル化によって得ることができる。ステロイド構造の3位にジフルオロメチレンスルホン誘導体を有する式(IIIa)の脂質アンカーは、文献に記載されているように調製することができる（Lapiene, J. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 151-155）。式(IIIa)の脂質アンカーの17位の種々の側鎖の導入は、デヒドロイソアンドロステロンまたはプレグネノロンから出発する文献プロトコルの使用によって達成することができる（Bergmann, E. D. et al., J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 1239-1243およびその中の参考文献）。コレスタンに由来する式(IIIa)の脂質アンカーは、文献のプロトコル、例えば、種々の遷移金属触媒の存在下での水素化を用いて、5,6-二重結合の還元によってコレステロール由来の対応する前駆体から得ることができる。
3位に酸素由来の置換基を有する式(IIa)の脂質アンカーは、エストロンから出発する式(IIIa)の脂質アンカーについて記載したのと同様の方法で調製する。3位に窒素由来の置換基を有する式(IIa)の脂質アンカーは、3-アミノエストロンから出発する式(III)の脂質アンカーについて記載したのと同様の方法で調製することができ、3-アミノエストロンは、文献に記載されているように調製することができる（Zhang, X. and Sui, Z. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 3071-3073; Woo, L. W. L. et al., Steroid Biochem. Molec. Biol. 1996, 57, 79-88）。3位に硫黄由来の置換基を有する式(IIa)の脂質アンカーは、3-チオエストロンから出発する式(III)の脂質アンカーについて記載したのと同様の方法で調製することができ、3-チオエストロンは、文献に記載されているように調製することができる（Woo, L. W. L. et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 1996, 57, 79-88）。エストロン構造の17位に種々の側鎖を導入することは、文献（Peters, R. H. et al., J. Org. Chem. 1966, 31, 24-26）に記載されているように、得られた二重結合の水素化に続くWittigアプローチによって達成することができる。側鎖内のさらなる操作（例えば、二重結合構造、シクロアルキル装飾）は、標準的なプロトコル（鈴木カップリングなど）によって達成することができる。
異なる炭化水素基を有するセラミド、デヒドロセラミドおよびジヒドロセラミドのクラスに属する式(Va)の脂質アンカーは、文献に概説されているように得ることができる（A.H. Merrill, Jr., Y.A. Hannun (Eds.), Methods in Enzymology, Vol. 311, Academic Press, 1999; Koskinen, P.M and Koskinen, A.M.P. Synthesis 1998, 1075）。特に、スフィンゴシン塩基は、スフィンゴシン骨格の1位に酸素由来の置換を有する式（Va）の全ての脂質アンカーの重要な中間体として使用することができる。対応するアミノ誘導体は、公知のプロトコルに従ってアルコールから調製することができるスルホネートを置換することによって得ることができる。1-アミノ誘導体または1-ヒドロキシ誘導体のアルキル化およびアシル化は、それぞれブロモ酢酸およびコハク酸無水物との反応によって達成することができる。チオアセチル化誘導体は、スルホネートをメルカプト酢酸で置換することによって調製することができる。ホスフェート誘導体およびスルフェート誘導体は、文献に記載されているように得ることができる（A.H. Merrill, Jr., YA A. Hannun (Eds.), Methods in Enzymology, Vol. 311, Academic Press, 1999; Koskinen, P.M. and Koskinen, A.M.P. Synthesis 1998, 1075）。アシル化、スルホニル化、尿素、カルバメート形成は、標準的な手順によって達成することができる。式(Va)（式中、R5がアミノまたはアミノ由来の官能基である）の脂質アンカーは、標準プロトコルを用いて、Koskinen（Koskinen, P.M. and Koskinen, A.M.P. Synthesis 1998, 1075）により発表され入手可能なスフィンゴシン塩基から出発して調製することができる。対応する2-酸素置換スフィンゴ脂質は、Yamanoi（Yamanoi, T. et al., Chem. Lett. 1989, 335）によって発表された戦略によって得ることができる。両方のR8がヒドロキシ基を表す式(Va)の脂質アンカーは、公知のプロトコルを用いて対応するアルケンをビスヒドロキシル化することによって得ることができる。対応するモノヒドロキシ誘導体は、文献に記載されているように調製することができる（Howell, A.R. and Ndakala, A.J. Curr. Org. Chem. 2002, 6, 365-391）。式(Va)の脂質アンカー中の置換基R6およびR9の修飾は、種々の総説に概説されたプロトコルおよび戦略によって達成され得る（Harwood, H.J. Chem. Rev. 1962, 62, 99-154; Gensler, W.J. Chem. Rev. 1957, 57, 191-280）。
式(VIa)の脂質アンカーは、文献（Muller, S. et al., J. Prakt. Chem. 2000, 342, 779）に記載されたプロトコル、および式(Va)の脂質アンカーの調製のために記載されたプロトコルとの組み合わせによって得られる。
R4およびR5が酸素由来の置換基である式(VIIa)の脂質アンカーは、Fraser-Reid （Schlueter, U. Lu, J. and Fraser-Reid, B. Org. Lett. 2003, 5, 255-257）に概説されているように、市販の(R)-(-)-2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-メタノールから出発して、調製することができる。式(VIIa)の化合物における置換基R6の変化は、種々の総説に概説されたプロトコルおよび戦略によって達成され得る（Harwood, H. J. Chem. Rev. 1962, 62, 99-154; Gensler, W. J. Chem. Rev. 1957, 57, 191-280）。R4およびR5が窒素由来の置換基である式(VIIa)の脂質アンカーは、対応するスルホネートの求核置換および上記で概説したさらなる修飾によって、対応する酸素置換系から出発するか、または文献（Henrick, K. et al., J Chem. Soc. Dalton Trans. 1982, 225-227）に記載されているように得ることができる1,2,3-トリアミノプロパンから出発するかのいずれかによって得られる。
式(VIIIa)の脂質アンカーは、式(VIa)の脂質アンカーと同様に、あるいは式(VIIa)の脂質アンカーのω-エテニル化中間体の閉環メタセシスにより得ることができる。
式(IXa)および(Xa)の脂質アンカーは、文献（Xue, J. and Guo, Z. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12, 2015-2018; Xue, J. and Guo, Z. J. Am. Chem. Soc. 2003, 16334-16339; Xue, J. et al., J. Org. Chem. 2003, 68, 4020-4029; Shao, N., Xue, J. and Guo, Z. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 1569-1573）に記載の合成戦略により、および式(Va)および(VIIa)の脂質アンカーの調製のための上記の方法とのそれらの組み合わせによって調製することができる。
式(XIa)、(XIIa)および(XIIIa)の脂質アンカーは、文献に記載の合成戦略に従って全合成によって得ることができる（Knolker, H.-J. Chem. Soc. Rev. 1999, 28, 151-157; Knolker, H.-J. and Reddy, K. R. Chem. Rev. 2002, 102, 4303-4427; Knolker, H.-J. and Knoll, J. Chem. Commun. 2003, 1170-1171; Knolker, H.-J. Curr. Org. Synthesis 2004, 1）。
式(XIVa)の脂質アンカーは、4-メトキシ-3-メチルベンズアルデヒドから出発して6-メトキシ-5-メチルインドールを得るネニゼスク（Nenitzescu）型インドール合成によって調製することができる。エーテル開裂、トリフラート形成および薗頭カップリングは、対応する6-アルキニル置換5-メチルインドールをもたらす。Nilsmeierのホルミル化およびそれに続くニトロメタンの添加は、3-ニトロビニル置換インドール誘導体を生じさせ、これを全体的な水素化に供して、6-アルキル置換5-メチルトリプタミンの形成をもたらす。スクシニル無水物を用いたアミノ基のアシル化により、調製が完了する。
本明細書に記載のトリパータイト化合物の調製方法は、当業者には明らかであり、
ａ）ホスホリルヘッド基もしくは脂質アンカーの同等のヘッド基とエンドソームPAR2シグナル伝達の阻害剤の結合および／または相互作用部位との距離（ａ）を決定する工程；
ｂ）（ａ）で定義した距離にスパニング（spanning）しうるリンカーを選択する工程；および
ｃ）（ｂ）で選択したリンカーによる脂質アンカーとエンドソームPAR2シグナル伝達の阻害剤とを結合させる工程
を含むであろう。
そのような方法の対応する実施例を本明細書に示す。当業者は、所定のまたは潜在的なエンドソームPAR2シグナル伝達の阻害剤の関連する結合部位または相互作用部位を推定し、したがって、（ａ）ホスホリルヘッド基もしくは脂質アンカーの同等のヘッド基とエンドソームPAR2シグナル伝達の阻害剤の結合および／または相互作用部位との距離（ａ）を決定する立場にある。このような方法は、分子モデリング、インビトロおよび／または分子相互作用またはバインディングアッセイ（例えば、酵母２または３ハイブリッドシステム、ペプチドスポッティング、オーバーレイアッセイ、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、リボソームディスプレイ）、原子間力顕微鏡法、ならびに分光法およびＸ線結晶学を含むが、限定されない。さらに、部位特異的突然変異誘発のような方法を用いて、エンドソームPAR2シグナル伝達の所定の阻害剤またはエンドソームPAR2シグナル伝達の候補阻害剤およびその対応する標的の推定相互作用部位を確認することができる。
当業者は、リンカーの選択が、当該分野で公知のリンカーの選択、ならびに新規のリンカーの生成および使用（例えば、分子モデリングおよび対応する合成または当技術分野で公知のさらなる方法による）を含むことを理解するであろう。工程ｂ）に関して本明細書中で使用される用語「スパニング」は、脂質アンカーがエンドソームの脂質層の一部を形成するとき、受容体上の正しい座にエンドソームPAR2シグナル伝達の阻害剤を配置するように選択されるリンカーの長さをいう。
当業者は、所与のトリパータイト化合物ならびに本明細書に記載の個々の部分の親油性を推論し、確認および／または評価する立場にある。エンドソームGPCR標的を決定するための対応する試験アッセイを本明細書の実施例に提供する。
当業者は、リンカー部分の目的が、脂質アンカーがエンドソーム膜に固定されているとき、エンドソームPAR2シグナル伝達の阻害剤がPAR2と相互作用することを可能にするために、脂質アンカーをエンドソームPAR2シグナル伝達の阻害剤に連結することであることを理解するであろう。脂質アンカーおよびリンカーは、２つが共有結合することを可能にする官能基を含有する。脂質アンカーの官能基の性質は決して限定されず、例えば、リンカーとアミド結合を形成するアミン基、またはリンカーとエーテル結合またはエステル結合を形成するヒドロキシル基またはカルボン酸基を挙げることができる。
同様に、当業者は、エンドソームPAR2シグナル伝達の阻害剤と連結するリンカーの末端での官能基の選択が、主として選択されたエンドソームPAR2シグナル伝達の阻害剤上の任意の利用可能な官能基によって決定されることを理解するであろう。例えば、エンドソームPAR2シグナル伝達の阻害剤が遊離のアミンまたはカルボン酸基を含む場合、リンカーの官能基は、アミド結合を形成するための相補的なカルボン酸またはアミンを含むことが想定される。
本発明の化合物が精製を必要とする場合、逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などのクロマトグラフィー技術を使用することができる。ペプチドは、質量分析および／または他の適切な方法によって特徴付けられてもよい。
本発明を以下の非限定的な実施例を参照して説明する。
前駆体の合成
実施例1: エチル 6-クロロイミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボキシレートの合成(一般的な合成スキーム1の工程(a))
1L丸底フラスコで、6-クロロピリダジン-3-アミン（30 g, 0.2316 mol）をDMF（300 mL）に溶解した。続いて、エチル 3-ブロモ-2-オキソ-プロパノエート（38 mL、0.3 mol）を少しずつ加えた。混合物を50℃で1.5時間維持した 混合物を水/氷浴で室温に冷却し、水（600 mL）を2時間かけて反応混合物に滴下した。その後、室温で一晩撹拌した。形成された沈殿物をブフナー漏斗での濾過により濾別した（〜30分）。沈殿物を3 x 500 mLの水で洗浄し、真空下でブフナー漏斗で2時間、次に40℃の真空オーブンで20時間乾燥して、エチル 6-クロロイミダゾ[2,1-b]ピリダジン-2-カルボキシレート（29.9 g, 57%）を黄色の固体として得た。1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 8.85 (s, 2H), 8.27 (d, J = 9.6 Hz, 3H), 7.47 (d, J = 9.6 Hz, 3H), 4.33 (q, J = 7.0 Hz, 6H), 1.32 (t, J = 7.1 Hz, 9H).
実施例2: エチル 8-tert-ブチル-6-クロロイミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボキシレートの合成(一般的な合成スキーム1の工程(b))
滴下漏斗、N2インレットおよびコンデンサーを備えた1Lの3つ口丸底フラスコに水（98.10 mL）およびトリフルオロ酢酸（10.72 mL, 139.1 mmol）を入れた。 発熱が終了したら、エチル 6-クロロイミダゾ[2,1-b]ピリダジン-2-カルボキシレート（21 g, 92.72 mmol）、2,2-ジメチルプロパン酸（37.88 g, 21.30 mL, 370.9 mmol）およびアセトニトリル（200 mL）を添加し、続いてAgNO3（7.88 g, 46.36 mmol）を添加した。反応混合物をアルミホイルで包み、80℃に温めた。過硫酸アンモニウム（35.24 g, 166.9 mmol）の水（98.10 mL）溶液を滴下漏斗で30分かけて添加した。添加が完了したら、添加漏斗を取り外し、混合物にコンデンサーを備え付け、80℃で30分間加熱した。
次に、反応物を室温に冷却し、酢酸エチル（200 mL）で希釈した。濾液を氷/水浴で0℃に冷却し、NH4OHをpH = 8になるまで添加した。20分後、混合物をセライトで濾過し、酢酸エチルで洗浄した。層を分離し、水層を1 x 200 mLの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機抽出物を、1N NaOH/ブライン1：1の溶液（2 x 200 mL）で洗浄した。有機相を再びセライトで濾過してAg塩を除去し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して35 gの暗色泡状のガムを得た。
粗生成物をシリカゲル（ジクロロメタン）でクロマトグラフィーにかけ、エチル 8-tert-ブチル-6-クロロイミダゾ[2,1-b]ピリダジン-2-カルボキシレート(7.28 g, 28%)を明黄色の固体として得た。1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 8.81 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 4.35 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.53 (s, 9H), 1.33 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
実施例3: エチル 8-tert-ブチル-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボキシレートの合成(一般的な合成スキーム1の工程(c))
エチル 8-tert-ブチル-6-クロロイミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボキシレート（500 mg, 1.755 mmol）のDMF（7 mL）溶液に、（4-フルオロフェニル）ボロン酸（280 mg, 2.004 mmol）、PdCl2(dppf)2-DCM（30 mg, 0.03644 mmol）およびNa2CO3（2 Mを1.822 mL, 3.644 mmol）を添加した。N2を5分間バブリングして脱気した後、混合物を80℃で18時間加熱した。水を酢酸エチルと共に加え、相を分離した。有機相を水およびブライン（1:1混合物）で2回洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させて、エチル 8-tert-ブチル-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボキシレート（545 mg, 90%）を固体として得た。1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 8.79 (s, 1H), 8.20 - 8.11 (m, 2H), 7.51 (s, 1H), 7.46 - 7.38 (m, 2H), 4.36 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.60 (s, 9H), 1.34 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
実施例4: 8-tert-ブチル-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボン酸の合成(一般的な合成スキーム1の工程(d))
エチル 8-tert-ブチル-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボキシレート（8.3 g, 24.31 mmol）をメタノール（388 mL）およびNaOH（2.5 Mを49 mL）に添加した。この溶液を室温で2時間撹拌した。HCl（6N）を、酸性のpHに達するまで加えた。次に水を加えると、固体が沈殿した。固体を水で十分に洗浄し、乾燥して、8-tert-ブチル-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボン酸（6.85 g, 90%）をベージュ色の固体として得た。1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 12.97 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.21 - 8.08 (m, 2H), 7.49 (s, 1H), 7.46 - 7.34 (m, 2H), 1.60 (s, 9H).
LC-MS: 313.97 (M+H+), 保持時間: 3.06
実施例5: 4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-イウム クロリドの合成(一般的な合成スキーム1の工程(e)および(f))
8-tert-ブチル-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボン酸（5 g, 16 mmol）、DMF（120 mL）、HATU（7.3 g, 19.2 mmol）、tert-ブチル 3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボキシレート（4.l g, 1.92 mmol）およびDIPEA（10 mL, 57.4 mmol）により、tert-ブチル 4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボキシレートを得て、これを4N HClの1,4-ジオキサン（60 mL）溶液に溶解し、4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン塩酸塩（6.5 g, 97%）を固体として得た。1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 9.71 (bs, 2H), 8.57 (s, 1H), 8.17 - 8.10 (m, 2H), 7.50 (s, 1H), 7.44 - 7.36 (m, 2H), 4.16 - 4.08 (m, 2H), 3.35 - 3.27 (m, 2H), 3.23 - 3.14 (m, 2H), 1.61 (s, 6H), 1.59 (s, 9H).
実施例6: 1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-カルボン酸の合成
アジ化ナトリウム（5 mmol）およびtert-ブチル ブロモアセテート（5 mmol）をDMF（10 mL）中で室温で72時間撹拌した。プロピオール酸（5 mmol）およびCuI（0.5 mmol）を加え、さらに48時間撹拌を続けた。1M HClを加えて反応混合物のpHを4に調整し、得られた混合物をブラインに注いだ。水相をDCMで抽出し、MgSO4で乾燥し、蒸発乾固させた。粗残留物をシリカゲルで精製して、標題生成物を得た。29.5%. 1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 8.76 - 7.63 (m, 2H), 5.42 - 5.19 (m, 2H), 1.43 (s, 9H). LCMS: Rf = 2.90, m/z = 225.9 (M-H, C9H12N3O4 -).
I-343, Cy5-コレスタノール、およびCy5-エチルエステルの合成
実施例7: (8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-イル)(2,2-ジメチル-4-(5-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-カルボニル)ピペラジン-1-イル)メタノン (I-343)の合成
5-メチル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-カルボン酸（1.2当量）をDMSOに溶解し、HATU（1.2当量）、対応するアミン（1.0当量）、およびDIPEA（2.5当量）と混合した（室温、一晩）。水を添加し、固形物を濾過し、洗浄して、標題生成物（収率88%）を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.52 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.18 - 8.10 (m, 2H), 7.48 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.45 - 7.36 (m, 2H), 4.34 - 3.66 (m, 6H), 2.43 - 2.30 (m, 3H), 1.61 (s, 6H), 1.56 (s, 3H), 1.54 (s, 3H), 1.48 (s, 3H). LCMS: Rf =3.37, m/z = 519.3 (M+H, C27H31FN8O2 +).
実施例8: Cy5-コレスタノール(Cy5-Chol)の合成
シアニン5を、Fmoc-PAL-PEG-PSレジン（Life Technologies, 0.17 mmol/gレジンをロード）での標準的なFmoc固相ペプチド合成（SPPS）により、フレキシブルなPEGリンカーを介してコレスタノールにコンジュゲートした。Fmoc脱保護反応は、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）中の20% v/vピペリジンを使用して行った。カップリング反応は、Fmoc保護アミノ酸とO-(6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（HCTU）をカップリング剤として、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）を活性化剤として使用して行った。Cy5-Chol [Cy5-PEG4-PEG3-PEG4-Asp(OChol)-NH2]は、Fmoc-Asp(OChol)-OH、Fmoc-PEG4-OH、Fmoc-PEG3-OH、およびFmoc-PEG4-OHをアミノ酸として使用して手動SPPSで調製した。最後の脱保護工程の後、DMF中のCy5酸、HCTU、およびDIPEAの混合物を使用してN末端をキャッピングし、次に95:2.5:2.5トリフルオロ酢酸(TFA)/トリイソプロピルシラン(TIPS)/水を使用して、ペプチド構造体をレジンから切断した（Jensen, D.D. et al., Sci Transl Med 2017, 9(392): eaal3447）。
実施例9: Cy5-エチルエステルの合成
最初のカップリング工程でFmoc-Asp(OChol)-OHをFmoc-Asp(OEt)-OHに置き換る以外は、実施例8と同じ手順を使用して合成した（Jensen, D.D. et al., Sci Transl Med 2017, 9(392): eaal3447）。
本発明の化合物の合成
実施例10: 3-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-イル)-3-オキソプロパン-1-スルホン酸(1)の合成。
乾燥THF中、3-クロロプロピオン酸（51 mg, 0.472mmol）を、DIPEA（101 mg, 0.787 mmol）の存在下、室温で30分間、イソブチルクロロホルメート（54 mg, 0.29 mmol）で活性化した。4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル）イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-イウム クロリド（70 mg, 0.157 mmol）を加え、得られた反応混合物をさらに60分間撹拌した。LCMSにより反応が完了したと見なされたら、飽和重炭酸ナトリウムを加えることによりクエンチした。生成物をDCM（3回）で抽出し、MgSO4で乾燥し、蒸発乾固させた。粗混合物をEtOH（5 mL）および水（5 mL）に再溶解し、Na2SO3（99 mg, 0.787 mmol）を加えた。混合物を80℃で一晩加熱した。LCMSにより反応が完了したと見なされたら、TFAで酸性化し、分取HLPCで精製して、標題生成物(1)を得た。33.7mg、2工程で39.3%。1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 8.52 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 8.18 - 8.10 (m, 2H), 7.48 (s, 1H), 7.45 - 7.36 (m, 2H), 4.27 - 4.21 (m, 2H), 3.74 - 3.67 (m, 1H), 3.66 - 3.48 (m, 5H), 2.69 - 2.62 (m, 1H), 2.62 - 2.55 (m, 1H), 1.60 - 1.59 (m, 9H), 1.55 (s, 3H), 1.50 (s, 3H). LCMS (一般手順13): Rf = 3.66, m/z = 546.2 (M+H, C26H33FN5O5S+).
実施例11: 2-(4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)酢酸(2)の合成
4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-イウム クロリド(実施例5)および1-(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-カルボン酸(実施例6)を使用して、一般手順2に従って、エステル中間体（91.8％）を得て、これをTFAおよびDCMを使用して脱保護して、標題生成物を定量的収率で得た。LCMS（一般手順12）: Rf = 3.56, m/z = 562.9 (M+H, C28H32FN8O4 +). 1H NMR (401 MHz, CDCl3) δ 8.37 (s, 1H), 8.27 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 7.93 (dd, J = 8.8, 5.3 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.19 (t, J = 8.6 Hz, 2H), 5.13 - 5.07 (m, 2H), 4.60 - 4.44 (m, 4H), 3.96 - 3.89 (m, 2H), 1.70 (s, 2H), 1.66 (s, 4H), 1.63 - 1.58 (m, 9H), 1.49 - 1.47 (m, 9H). LCMS: Rf = 3.71, m/z = 619.0 (M+H, C32H40FN8O4 +).
実施例12: (1S,4R)-4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)-N-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-ペンタヒドロキシヘキシル)シクロヘキサン-1-カルボキシアミド(3)の合成
一般手順1に従って、4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-イウム クロリドを、(1S,4S)-4-(メトキシカルボニル)シクロヘキサン-1-カルボン酸にカップリングした。このエステルをメタノールに溶解してから、NaOH 2M（2当量）を加えた。加水分解が完了するまで、混合物を室温で撹拌した。メタノールを減圧下で除去し、反応混合物を1M HCl溶液の添加により中和した。固体を濾過し、洗浄して、所望の酸中間体を得た。34%. 1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 12.11 (bs, 1H), 8.51 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.20 - 8.08 (m, 2H), 7.48 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 7.46 - 7.35 (m, 2H), 4.21 - 4.11 (m, 2H), 3.84 - 3.45 (m, 4H), 2.61 - 2.52 (m, 2H), 2.08 - 1.99 (m, 2H), 1.69 - 1.42 (m, 21H). LCMS (一般手順13): Rf =3.54, m/z = 562.0 (M-H, C31H37FN5O4 -).
一般手順1に従って、この酸中間体をD-グルカミンにカップリングして、標題生成物を得た。48%. 1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 8.51 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.20 - 8.08 (m, 2H), 7.62 - 7.45 (m, 2H), 7.45 - 7.31 (m, 2H), 4.79 - 4.70 (m, 1H), 4.51 - 4.20 (m, 4H), 4.22 - 4.06 (m, 2H), 3.86 - 3.72 (m, 1H), 3.71 - 3.52 (m, 5H), 3.52 - 3.34 (m, 4H), 3.29 - 3.18 (m, 1H), 3.12 - 2.97 (m, 1H), 2.77 - 2.57 (m, 1H), 2.40 - 2.28 (m, 1H), 2.04 - 1.84 (m, 2H), 1.81 - 1.65 (m, 2H), 1.65 - 1.38 (m, 19H). LCMS: Rf =3.28, m/z = 727.0 (M+H, C37H52FN6O8 +).
実施例13: 4-(4-(7-(tert-ブチル)-5-(4-フルオロフェニル)ベンゾ[d]オキサゾール-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-イル)-4-オキソ-N-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-ペンタヒドロキシヘキシル)ブタンアミド(4)の合成
4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-イウム クロリド(120 mg, 0.27 mmol)をDCMに懸濁し、コハク酸無水物（1.5当量）およびDIPEA（2当量）を加えた。反応混合物を室温で30分間撹拌し、1N HCl溶液に注ぎ、DCMで抽出した。合わせた有機相をMgSO4で乾燥し、蒸発乾固させ、DCM:MeOHを使用してショートシリカパッド上で精製して、112.2 mg (81.7%)の4-(4-(7-(tert-ブチル)-5-(4-フルオロフェニル)ベンゾ[d]オキサゾール-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-イル)-4-オキソブタン酸を得た。一般手順1に従って、この酸中間体をD-グルカミンにカップリングして、標題生成物4を得た。66%. 1H NMR (401 MHz, DMSO) δ 8.52 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 8.19 - 8.08 (m, 2H), 7.77 (q, J = 5.8 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.45 - 7.36 (m, 2H), 4.31 - 4.10 (m, 2H), 3.72 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 3.68 - 3.54 (m, 5H), 3.54 - 3.43 (m, 2H), 3.43 - 3.33 (m, 2H), 3.26 (dt, J = 10.6, 5.7 Hz, 1H), 3.09 - 2.96 (m, 1H), 2.64 - 2.51 (m, 2H), 2.38 (dd, J = 12.8, 6.7 Hz, 2H), 1.59 (d, J = 3.5 Hz, 9H), 1.55 (s, 3H), 1.49 (s, 3H). LCMS (一般手順13): Rf =3.27, m/z = 672.9 (M+H, C27H33FN5O4 +).
実施例14: 2-(4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-N-(2-(2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ)エチル)アセトアミド(5)の合成
一般手順2により、実施例11の生成物および2-(2-(2-アミノエトキシ)エトキシ)エタン-1-オールを用いて合成し、標題生成物を粘性オイルとして得た。LCMS: Rf=3.31, m/z = 693.9 (M+H, C34H45FN9O6 +).
実施例15: 2-(4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-N-(17-ヒドロキシ-3,6,9,12,15-ペンタオキサヘプタデシル)アセトアミド(6)の合成
一般手順2により、実施例11の生成物および17-アミノ-3,6,9,12,15-ペンタオキサヘプタデカン-1-オールを用いて合成し、標題生成物を粘性オイルとして得た。LCMS: Rf =3.32, m/z = 825.8 (M+H, C40H57FN9O9 +).
実施例16: (2R,3S,4R,5S)-N1-((1s,4S)-4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)シクロヘキシル)-2,3,4,5-テトラヒドロキシヘキサンジアミド(7)の合成
一般手順2により、ムチン酸ジアセトニド-Rink AMレジンおよび(4-((1s,4s)-4-アミノシクロヘキサン-1-カルボニル)-2,2-ジメチルピペラジン-1-イル)(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-イル)メタノンを用いて合成し、標題生成物をアモルファス固体として得た。LCMS: Rf=3.36, m/z = 709.8 (M+H-NH2, C36H46FN6O8 +)
実施例17: メチル4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)ビシクロ[2.2.2]オクタン-1-カルボキシレート(8)の合成
4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-イウム クロリド（実施例5）および4-(メトキシカルボニル)ビシクロ[2.2.2]オクタン-1-カルボン酸を使用して、一般手順1に従って、82%の収率で標題生成物を得た。1H NMR (401 MHz, CDCl3) δ 8.37 (s, 1H), 7.99 - 7.89 (m, 2H), 7.26 (s, 1H), 7.24 - 7.17 (m, 2H), 4.46 - 4.31 (m, 2H), 3.92 - 3.71 (m, 4H), 3.66 (s, 3H), 2.03 - 1.79 (m, 12H), 1.64 (s, 3H), 1.61 (s, 9H), 1.56 (s, 3H). LCMS: Rf = 3.83, m/z = 603.9 (M+H, C34H43FN5O4 +).
実施例18: (3S,10S,13R,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)ヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル (14S)-1-(4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-14-カルバモイル-2,12-ジオキソ-6,9-ジオキサ-3,13-ジアザヘキサデカン-16-オエート(9)の合成
一般手順4により合成して、標題生成物を粘性オイルとして得た。
LCMS (一般手順13): Rf=3.18, m/z = 1206.56 (M+H, C66H97FN11O9 +)
実施例19: (3S,10S,13R,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)ヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル (44S)-1-(4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-44-カルバモイル-2,42-ジオキソ-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-ドデカオキサ-3,43-ジアザヘキサテトラコンタン-46-オエート(10)の合成
工程1：レジン結合NH2-PEG12-Asp(OChol)-レジンを、一般手順3に従って合成した。このアミンを、95%トリフルオロ酢酸を使用してレジンから切断し、蒸発乾固させて、粗NH2-PEG12-Asp(OChol)を得た。
工程2：実施例11の酸生成物および工程１からのNH2-PEG12-Asp(OChol)を使用して、一般手順2に従って、標題生成物（45%）を得た。1H NMR (401 MHz, CDCl3) δ 8.43 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 7.99 - 7.90 (m, 2H), 7.74 - 7.50 (m, 3H), 7.34 - 7.26 (m, 2H), 7.19 (dt, J = 19.6, 7.5 Hz, 3H), 5.22 (s, 2H), 4.95 - 4.86 (m, 1H), 4.74 - 4.64 (m, 1H), 4.62 - 4.40 (m, 4H), 4.28 - 4.17 (m, 1H), 3.97 - 3.79 (m, 3H), 3.74 - 3.54 (m, 45H), 3.49 (dd, J = 10.9, 5.7 Hz, 2H), 3.03 (dd, J = 17.2, 5.1 Hz, 1H), 2.70 (dd, J = 17.9, 5.9 Hz, 1H), 2.57 (t, J = 3.8 Hz, 2H), 1.96 (dd, J = 9.3, 3.1 Hz, 1H), 1.86 - 1.18 (m, 43H), 1.18 - 0.78 (m, 26H), 0.67 - 0.58 (m, 4H). LCMS (高分解能): m/z = 824.5132 (M+2H, C86H138FN11O19 2+).
実施例20: (3S,10S,13R,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)ヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル (20S)-1-(4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-20-カルバモイル-2,18-ジオキソ-6,9,12,15-テトラオキサ-3,19-ジアザドコサン-22-オエート(11)の合成
一般手順4により合成して、標題生成物を粘性オイルとして得た。
LCMS: Rf=3.28, m/z = 1294.66 (M+H, C70H105FN11O11 +).
実施例21: (3S,10S,13R,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)ヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル (32S)-1-(4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-32-カルバモイル-2,30-ジオキソ-6,9,12,15,18,21,24,27-オクタオキサ-3,31-ジアザテトラトリアコンタン-34-オエート(12)の合成
一般手順4により合成して、標題生成物を粘性オイルとして得た。
LCMS: Rf=2.83, m/z = 1470.878 (M+H, C78H121FN11O15 +).
実施例22: (3S,10S,13R,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)ヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル (37S)-1-(4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-37-カルバモイル-2,7,35-トリオキソ-11,14,17,20,23,26,29,32-オクタオキサ-3,8,36-トリアザノナトリアコンタン-39-オエート(13)の合成
一般手順4により合成して、標題生成物を粘性オイルとして得た。
LCMS: Rf =2.30, m/z = 1555.98 (M+H, C82H128FN12O16 +).
実施例23: (8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)ヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル (26S,51S)-1-(4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-51-カルバモイル-26-(3-グアニジノプロピル)-2,24,27,49-テトラオキソ-6,9,12,15,18,21,31,34,37,40,43,46-ドデカオキサ-3,25,28,50-テトラアザトリペンタコンタン-53-オエート(14)の合成
一般手順4により合成して、標題生成物を粘性オイルとして得た。
LCMS (一般手順13): Rf=3.44, m/z = 936.8 (M+2H, C95H155FN16O21 2+).
実施例24: (S)-3-(1-(4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-2-オキソ-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-ドデカオキサ-3-アザドテトラコンタン-42-アミド)-N1-ヘキサデシルスクシンアミド(15)の合成
Fmoc-L-Asp(OChol)-OHをFmoc-L-Asp(NH(CH2)15CH3)-OHで置き換えて、一般手順4により合成して、標題生成物を粘性オイルとして得た。
LCMS (高分解能): m/z = 750.4622 (M+2H, C75H125FN12O18 2+)
実施例25: (3S,5R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)ヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル (3S,28S,29R,30S,31R)-32-((4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)シクロヘキシル)アミノ)-3-カルバモイル-28,29,30,31-テトラヒドロキシ-5,27,32-トリオキソ-8,11,14,17,20,23-ヘキサオキサ-4,26-ジアザドトリアコンタノエート(16)の合成
一般手順4により、PAR2アンタゴニストにカップリングする前に、ムチン酸ジアセトニドをPEGスペーサーにカップリングして合成した。標題生成物をガラス状物として単離した。
LCMS (高分解能): m/z = 1547.9463 (M+H, C82H129FN9O18 2+).
実施例26: (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル ((R)-1-(4-(4-(8-(tert-ブチル)-6-(4-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-2-カルボニル)-3,3-ジメチルピペラジン-1-カルボニル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)-44-(ヒドラジンカルボニル)-2,42-ジオキソ-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-ドデカオキサ-3,43-ジアザオクタテトラコンタン-48-イル)カルバメート(17)の合成
Fmoc-D-Lys(NCOChol)-NHNH2をFmoc-L-Asp(NH(CH2)15CH3)-OHに置き換えて、一般手順4により合成して、標題生成物を粘性オイルとして得た。
LCMS (高分解能): m/z = 859.5373 (M+2H, C75H125FN12O18 2+).
実施例27：トランスフェクトされたKNRKまたはHT29細胞におけるPAR2の阻害
KNRK-hPAR2、KNRKまたはHT-29細胞を、透明なポリ-d-リジンコート96ウェル組織培養プレートに50x103細胞／ウェルの密度で播種した。37℃、5% CO2で24時間インキュベートした後、培地を取り除き、80μl IP1刺激バッファー（10mM HEPES, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2, 4.2mM KCl, 146mM NaCl, 5.5mM グルコース, 50mM LiCl）に交換した。刺激バッファーの添加後、ウェルに10μlの10xアンタゴニストまたはDMSOビヒクルを入れた。すべてのプレートをさらに37℃、5% CO2で30分間インキュベートした。10μlの2FまたはATPをプレートに加え、さらに40分間インキュベートした。インキュベーション後、刺激バッファーを吸引により速やかに除去し、25μl溶解バッファー（IP-One HTRF（登録商標）アッセイキット、Cisbio）に交換した。ライセートを37℃、5% CO2で10分間インキュベートした後、10μlのライセートを384ウェルOptiPlate（PerkinElmer）に移し、IP-One HTRF（登録商標）アッセイキット（Cisbio）を使用して検出した。
本発明の化合物（10μL容量に10×濃度で添加）を、10μM ATPまたは100nMまたは300nM PAR2アゴニスト（2F; EC80, 10μL容量に10×濃度で添加）を添加する前に30分間インキュベートし、その後さらに40分間インキュベートした。溶解後、IP-One HTRF（登録商標）アッセイキット、Cisbioでイノシトール１リン酸(inositol phosphate 1)を定量した。データをPrism、GraphPadで分析して、IC50値を計算し、以下の表１に示す。
上記の結果から明らかなように、本発明の化合物は、PAR2シグナル伝達の効果的な阻害剤である。
実施例28：PAR2を介した侵害受容
プロテアーゼは侵害受容器または他の細胞型のPAR2を活性化することにより痛みを誘発し得る。侵害受容器でのPAR2の寄与を決定するために、NaV1.8プロモーター(Scn10a)を使用して、侵害受容器を標的とするCreリコンビナーゼを発現するマウスでLoxPサイト(Par2 lox/lox)に隣接するPAR2を発現するマウスを飼育した（Stirling L.C. et al., Pain 2005, 113(1-2): 27-36）。Par2-NaV1.8マウスはNaV1.8陽性侵害受容器における免疫反応性PAR2を欠いていた（図1A）。WTマウスからの小径（<25 μm）DRGニューロンの31%(20/65)は、トリプシン（100 nM）に反応し、[Ca2+]iが増加したが、Par2-NaV1.8マウスからのニューロンの6%(3/51)のみが反応した（図1B、11A、および11B）。侵害受容は、von Freyフィラメントによる後足の足底表面の刺激に対する逃避反応(withdrawal response)を測定することによって評価した。WTマウスでは、トリプシン(80 nM)、NE(3.9 μM)またはCS(5 μM)の足底内注射(10 μl)により、30分以内に機械的アロディニアが誘発され、180分間維持された（図1B-D）。Par2-NaV1.8マウスでは、初期応答は維持されたが、120分後の応答は減少した。180分の時点で、WTマウスの機械的アロディニアが完全に維持されたとき、Par2-NaV1.8マウスの反応はベースラインに戻るか(NE)、有意に減衰した(トリプシン、CS)。WTマウスでは、足底内のトリプシンが足の厚さを増加させ（キャリパーを使用して測定）、これは1時間でピークに達し、4時間維持され、4時間後に好中球の流入を刺激し、炎症と一致していた（図11Cおよび11D）。トリプシン誘発炎症は、Par2-NaV1.8マウスで顕著に減少した。
プロテアーゼ誘発侵害受容へのエンドサイトーシスの寄与を評価するために、Dyngo4a (Dy4, ダイナミン阻害剤; Robertson M.J. et al., Nat. Protoc. 2014, 9(4): 851-870)、PitStop2 (PS2, クラスリン阻害剤; Robertson, M.J., et al., Nat. Protoc. 2014, 9(7): 1592-1606)、不活性（インタクト）アナログ(50 μM)、またはビヒクル(0.2% DMSO, 0.9% NaCl)(10 μl)を、足底内注射によってマウスに投与した。30分後、トリプシン(10 nM)、NE(1.2 μM)、またはCS(2.5 μM)(10 μl)を同じ足に注射した。コントロール（ビヒクルまたは不活性アナログ）では、トリプシン、NEおよびCSが機械的アロディニアを4時間誘発した（図1E-J）。Dy4とPS2は、1および2時間でトリプシン誘発アロディニアを抑制したが（図1E、H）、NE-（図1F、I）およびCS-（図1G、J）で誘発されたアロディニアは変化しなかったか、または最小限の影響であった。エンドサイトーシス阻害剤またはプロテアーゼは、注射されていない反対側の足の逃避反応に影響を与えなかった（図12A、B）。トリプシン、NEおよびCSは足の厚さを増加させ、浮腫と一致した（図12C-H）。ダイナミン阻害剤とクラスリン阻害剤は浮腫に影響を与えなかった。
この結果は、プロテアーゼがNaV-1.8侵害受容器でPAR2を活性化することにより持続的な侵害受容を誘導し、PAR2エンドサイトーシスがトリプシンの侵害作用に必要であるが、NEまたはCSではそうでないことを示唆する。
実施例29：侵害受容器のPAR2媒介性興奮性亢進
侵害受容器のプロテアーゼ誘発性興奮性亢進へのエンドサイトーシスの寄与を評価するために、マウス後根神経節（dorsal root ganglia; DRG）の小径ニューロンのレオベース(基電流、rheobase)（1つの活動電位を発火(fire)させる最小電流）をパッチクランプ記録法で測定した。ニューロンを、トリプシン（50 nM、10分）、NE（390 nM、30分）、CS（500 nM、60分）（強い興奮性亢進を引き起こすために選択された条件）、またはビヒクルと共にプレインキュベートし、洗浄した。レオベースは、洗浄後0分または30分で測定した。トリプシン、NEおよびCSは、レオベースを0分と30分で減少させ、少なくとも30分間維持される初期の興奮性亢進を示した（図2)。Dy4（30 μM）またはPS2（15 μM）は、トリプシン、NEまたはCSが初期の興奮性亢進（0分）を引き起こす能力に影響を与えなかった。Dy4およびPS2は、トリプシンの持続的な効果を無効にしたが（図2A-C）、NE（図2D、E）またはCS（図2F、G）（30分）の効果に対してはそうではなかった。Dy4、PS2、またはビヒクル（0.3% DMSO）は、DRGニューロンの基礎の興奮性(basal excitability)に影響を与えなかった（図13)。
公知のPAR2阻害剤I-343（図14A）によるPAR2シグナル伝達の阻害を、内因性PAR2を発現するHT-29細胞とHEK293細胞、およびヒト(h)PAR2を発現するKNRK細胞で調べた。イノシトール１リン酸(inositol phosphate-1)(IP1)の蓄積を、PAR2選択的アゴニスト2-フロイル-LIGRLO-NH2 (2F)、トリプシン暴露テザーリガンドの類似体、またはトリプシンに対する応答で測定した。I-343は、HT-29細胞における2F(300 nM)誘発IP1(pIC50 8.93±0.11, IC501.1 nM)およびKNRK-hPAR2細胞における2F(100 nM)誘発IP1(pIC506.18±0.11, IC50 666 nM; 図14B-D）を阻害した。I-343は、HEK293細胞におけるトリプシン(30 nM)誘発IP1(pIC50 9.36±0.20, IC50 0.4 nM)およびKNRK-hPAR2細胞(pIC50 5.13±0.14, IC507507 nM)におけるトリプシン(30 nM)誘発IP1を阻害した。I-343は、KNRK細胞におけるATP(10 μM)刺激IP1に影響を与えなかった（図14E）。
I-343(10 μM)は、トリプシンおよびCSの30分後のレオベースの減少を防止したが、NEでは防止しなかった（図3A-C）。しかし、I-343は、NEの0分後のレオベースの減少を防止した（図3D）。I-343（100 nM, 300 nM）もまた、トリプシンの0分後のレオベースの減少を防止した（図15A）。ニューロンをトロンビン（50 nM、20分）と共にインキュベートして洗浄すると、レオベースがすぐに減少し、これは、PAR1アンタゴニストSCH79797 (1 μM, 10分; Ahn, H.S., et al., Biochem. Pharmacol. 2000, 60(10): 1425-1434)と共にプレインキュベートすることにより防止される。SCH79797単独では効果がなく（図15B）、SCH79797はトリプシンに対する応答に影響を与えなかった（図15C）。したがって、PAR2はトリプシンとCSの持続的な作用、およびNEの初期効果を媒介するが、NEは異なるメカニズムによって持続的な興奮性亢進を引き起こす。別のPAR2アンタゴニストであるGB88もまた、侵害受容器のトリプシン、NEおよびCSによる活性化を妨げる(Lieu, T. et al. Br J Pharmacol 2016, 173(18): 2752-2765)。トリプシン活性化PAR2は、βARR-およびRaf-1-依存性プロセスによりエンドソームからシグナルを伝達し、これがERKを活性化する(DeFea, K.A. et al., J Cell Biol 2000, 148(6): 1267-1281)。マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ1（MEK1）の活性化を阻害するPD98059(50 μM) (Lieu, T. et al., Br J Pharmacol 2016, 173(18): 2752-2765)は、初期のトリプシン誘発性興奮性亢進に影響を与えなかったが、持続的なトリプシン誘発性興奮亢進を防止した（図3E）。対照的に、PKCαおよび他のキナーゼを阻害するGF109203X(Bis-1、10 μM) (Davies, S.P. et al., Biochem J 2000, 351(Pt 1): 95-105)は、トリプシンの初期の効果を妨げたが持続的な効果を妨げなかった（図3F）。
したがって、トリプシンは、原形質膜からのPAR2/PKCシグナル伝達による侵害受容器の初期の興奮性亢進、およびエンドソームからのPAR2/ERKシグナル伝達による持続性の興奮性亢進を誘導する。アデニリルシクラーゼおよびPKAは、侵害受容器のNE-およびCS-誘発性興奮性亢進を媒介するが(Zhao, P. et al., J. Biol. Chem. 2014, 289(39): 27215-27234; Zhao, P. et al., J. Biol. Chem. 2015, 290(22): 13875-13887)、これはさらに研究されていない。
実施例30：侵害受容器におけるPAR2エンドサイトーシスおよびコンパートメント化されたシグナル伝達
侵害受容器におけるPAR2のエンドサイトーシスを評価するために、マウス(m) PAR2-GFPをマウスDRGニューロンにトランスフェクトした。ビヒクルで処理されたニューロンでは、mPAR2-GFPが原形質膜およびゴルジ体のPAR2の貯蔵に対応する細胞内コンパートメントで検出された（図4A）(Jensen D.D., et al. J Biol Chem. 2016, 291(21): 11285-11299)。NEやCSではなくトリプシン（100 nM、30分）は、mPAR2-GFPエンドサイトーシスを誘導した（図4A、B）。Dy4は、mPAR2-GFPのトリプシン誘発エンドサイトーシスを阻害したが、Dy4インタクトは阻害しなかった（図4C）。PAR2が、エンドサイトーシスを媒介するβARRを補充(recruit)するかどうかを決定するために、生物発光共鳴エネルギー移動（Bioluminescence Resonance Energy Transfer; BRET）センサーをマウスDRGニューロンのPAR2-RLuc8（ドナー）およびβARR2-YFP（アクセプター）に対して発現させた。トリプシンはPAR2-RLuc8/βARR2-YFP BRETを増加させたが、NEまたはCSは増加させなかった（図4D）。
トリプシンが、侵害受容器の初期および持続性のトリプシン誘発性興奮性亢進をそれぞれ媒介するPKCおよびERKのPAR2依存性活性化を引き起こすかどうかを決定するために、遺伝的にコード化されたフェルスター共鳴エネルギー移動（Forster Resonance Energy Transfer; FRET）バイオセンサーをニューロンで発現させた。パイロット研究により、マウスニューロンよりも強力で一貫したPAR2応答が明らかになったため、原形質膜PKC（pmCKAR）、サイトゾルPKC（CytoCKAR）、サイトゾルERK（CytoEKAR）および核ERK（NucEKAR）(Halls M.L. et al., Methods Mol Biol. 2015, 1335: 131-161)のバイオセンサーを、ラットからのDRGニューロンで発現させた。トリプシン（10または100 nM）は、サイトゾルではなく原形質膜でPKCを活性化し（図4E-G）、サイトゾルおよび核でERKを活性化した（図4H-J）。PAR2アンタゴニストI-343（10 μM）は、トリプシン誘発性のPKCおよびERKの活性化を阻害したが、PAR1アンタゴニストSCH530348（100 nM）は効果がなかった（図4F、I）。実験の最後に、EKARバイオセンサー用のポジティブコントロールであるホルボール12,13-ジブチレート(PDBu)またはCKARバイオセンサー用のポジティブコントロールであるPDBu＋ホスファターゼ阻害剤混合物-2(PDBu plus phosphatase inhibitor mixture-2)でニューロンをチャレンジし、バイオセンサーの応答が飽和していないことを確認した。
この結果は、トリプシンは（NEまたはCSではなく）、βARR2補充(recruitment)と侵害受容器におけるPAR2のダイナミン依存性エンドサイトーシスを刺激することを示唆する。トリプシンは、原形質膜でのPKCのPAR2依存性活性化、およびサイトゾルと核でのERKのPAR2依存性活性化を引き起こす。
実施例31：PAR2エンドサイトーシスおよびエンドソームシグナル伝達のメカニズム
PAR2エンドサイトーシスとエンドソームシグナル伝達のメカニズムを、HEK293細胞で調べた。原形質膜からのPAR2の移動(removal)と初期エンドソームにおけるその蓄積を定量化するために、BRETを使用して、原形質膜（RIT）と初期エンドソーム（Rab5a）に存在するPAR2とタンパク質間の近接(proximity)を評価した(Jensen, D.D. et al., Sci Transl. Med. 2017, 9(392): eaal3447; Yarwood, R.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2017, 114(46):12309-12314)。このBRETの適用は、非特異的なタンパク質-タンパク質相互作用を利用して、異なるコンパートメントを通過する膜タンパク質の動きを追跡する(Lan, T.H. et al., Traffic 2012, 13(11): 1450-1456)。トリプシンは、PAR2-RLuc8/RIT-Venus BRET (EC50 2.9 nM)の減少、およびPAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRET (EC50 2.7 nM)の増加を誘発した（図5A、5B、16A-D）。NEもCSも（100 nM）、PAR2-RLuc8/RIT-VenusまたはRab5a-Venus BRETに影響を与えなかった（図5A、B）。PS2は、トリプシンによって誘発されたPAR2-RLuc8/RIT-Venus BRETの減少とPAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRETの増加を抑制したが、PS2インタクトは抑制しなかった（図5C、5D、16E、16F）。GTP結合欠損ドミナントネガティブダイナミンK44E（DynK44E）(Herskovits, J.S. et al., J Cell Biol. 1993, 122(3): 565-578)は、PAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRETの増加を抑制したが、PAR2-RLuc8/RIT-Venus BRETに影響を与えなかった（図5C、5D、16G、および16H）。野生型ダイナミン（DynWT）の影響は最小限であった。GTP結合は出芽小胞の原形質膜からの切断に必要であるため、DynK44EはおそらくPAR2を膜小胞内にトラップし、Rab5aとの相互作用を妨げるが、RITとの相互作用は妨げない。したがって、トリプシンはクラスリン依存性およびダイナミン依存性のPAR2のエンドサイトーシスを誘導するが、CSまたはNEは誘導しない。
エンドソームPAR2シグナル伝達を介したトリプシン誘導ERKシグナル伝達を、サイトゾルおよび核のERK（CytoEKAR、NucEKAR）、原形質膜およびサイトゾルのPKC（pmCKAR、CytoCKAR）、および原形質膜およびサイトゾルのcAMP（pmEpac、CytoEpac）についてのFlag-PAR2-HA11およびFRETバイオセンサーを発現するHEK293細胞で調べた。トリプシン（10 nM）は、サイトゾルおよび核（EC50、5 nM）におけるERKの急速かつ持続的な活性化を刺激したが、NEまたはCS（100 nM）は刺激しなかった（図5E、5F、17A-F）。I-343（10 μM）は、サイトゾルおよび核のERKのトリプシン活性化を阻害したが、SCH530348（100 nM）は阻害しなかった（図5G）。PS2およびDynK44Eは、PS2インタクトおよびDynWTコントロールと比較して、サイトゾルおよび核のERKのトリプシン刺激性活性化を阻害した（図5H、5I、17G-J）。AG1478（1 μM）、EGF受容体チロシンキナーゼの阻害剤(Levitzki, A. & Gazit, A. Science 1995, 267(5205): 1782-1788)、UBO-QIC（100 nM）（これはGαqおよび特定のGβγシグナルを阻害する）(Levitzki, A. et al., Science 1995, 267(5205): 1782-1788）、およびGo6983 (1 μM)（これはPKCのすべてのアイソフォームを阻害する）(Gschwendt, M, et al., FEBS Lett 1996, 392(2): 77-80)は、サイトゾルのERKのトリプシン刺激性活性化を抑制した（図5Jおよび17K）。UBO-QICおよびGo6983も核のERKの活性化を阻害した（図5Kおよび17L）。この結果は、サイトゾルと核でERKを活性化するGαq依存性メカニズムによってエンドソームからPAR2シグナルが伝達されることを示唆する。
トリプシンがβARRおよびGαqのエンドソームへの移行(translocation)を誘導するかどうかを決定するために、HEK293細胞でβARR1-RLuc8またはGαq-RLuc8とRab5a-Venusの間のBRETを測定した。トリプシン（100 nM）は、βARR1-RLuc8/Rab5a-Venus BRETおよびGαq-RLuc8/Rab5a-Venus BRETの増加を刺激した（図18A、B）。免疫蛍光法および構造化照明顕微鏡法を使用して、PAR2-HA、Gαqおよび初期エンドソーム抗原-1（EEA1）をHEK-293細胞に局在化させた。刺激されていない細胞では、PAR2は原形質膜に留まっていたが、Gαqは初期エンドソームで検出された（図18C）。トリプシン（10 nM、30分）はGαqを含有する初期エンドソームへのPAR2の移行を誘発した。この結果は、トリプシンが初期エンドソームでPAR2/βARR/Gαqシグナロソームのアセンブリを引き起こすという仮説を支持する。
トリプシン（10 nM）は、HEK293細胞の原形質膜およびサイトゾルでのPKCの急速かつ持続的な活性化とcAMPの生成を引き起こした（図19A-H）。DynK44Eはこれらのシグナルを強く阻害したが、DynWTは効果がなかった。I-343は、PKCおよびcAMPのトリプシン刺激を阻害したが、SCH530348は阻害しなかった。したがって、これはPAR2に依存する(図19GおよびH）。これらの結果は、エンドサイトーシスがPAR2シグナル伝達の複数のコンポーネントに必要であることを示唆する。原形質膜でのcAMPシグナル伝達は通常、cAMPを分解するホスホジエステラーゼのβARR送達によって脱感作される(Perry, S.J. et al., Science 2002, 298(5594): 834-836)。トリプシンに対する持続的な原形質膜cAMP応答は、持続的なPAR2シグナル伝達を可能にするメカニズムの存在を支持しており、さらなる研究が必要とされる。ポジティブコントロールのPDBu(EKAR)、PDBu＋ホスファターゼ阻害剤混合物-2(CKAR)、またはフォルスコリン＋3-イソブチル-1-メチルキサンチン(Epac)による細胞の刺激は、プロテアーゼに対する応答がFRETバイオセンサーを飽和させないことを明らかにした（図5E、5F、19A-D）。
実施例32：侵害受容器のIBS誘発性興奮性亢進
IBS患者の粘膜生検からのプロテアーゼが侵害受容器の持続性興奮性亢進を引き起こすかどうかの調査は、PAR2のエンドソームシグナル伝達を伴うメカニズムによって行われた。下痢型IBS（IBS-D）の患者または健常コントロール（HC）被験者の結腸粘膜の生検を培地に入れた（24時間、37℃）。次に、マウスDRGニューロンを生検上清に曝露し（30分、37℃）、洗浄した。レオベースを、持続性の興奮性亢進を評価するために、洗浄の30分後に測定した。IBS-D患者からの生検の上清は、HC被験者からの上清と比較したとき、レオベースの持続的な減少を引き起こし、興奮性亢進と一致していた（30分でのレオベース：HC、78.33±4.4l pA、12ニューロン、4人のHCからの上清; IBS-D、54.55±4.74 pA、11ニューロン、4人のIBS-Dからの上清、P<0.05; ANOVA、Tukeyの多重比較検定）（図6A、B）。I-343（10 μM）、Dy4（ダイナミン阻害剤、30 μM）およびPD98059（MEK1阻害剤、50 μM）は、侵害受容器のIBS-D誘発性興奮性亢進を無効にした（図6A-D）。Dy4は、HC上清に曝露されたニューロンのレオベースに有意ではない減少を引き起こしたが、I-343およびPD98059は効果がなかった。
IBS-D上清中のプロテアーゼがPAR2のエンドサイトーシスを刺激できるかどうかを調べるために、BRETを使用して、HEK293細胞で発現したPAR2-RLuc8とRab5a-Venusの間の近接性を評価した。IBS-D上清は、HC上清と比較して、60分後にPAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRETを増加させた（図6E）。トリプシン（10 nM、ポジティブコントロール）もPAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRETを増加させた。
これらの結果は、IBS-D患者の結腸粘膜の生検から放出されるプロテアーゼが、PAR2のダイナミン依存性エンドサイトーシスおよびエンドソームからのPAR2 ERKシグナル伝達を必要とするメカニズムにより、侵害受容器の長期にわたる興奮性亢進を引き起こすことを示唆する。
実施例33：エンドソームにおけるPAR2へのアンタゴニスト送達
膜貫通脂質コレスタノールへのコンジュゲートは、ニューロキニン1受容体(NK1R)およびカルシトニン受容体様受容体(CLR)のアンタゴニストのエンドソーム送達を促進し、より効果的で持続性のある抗侵害受容を提供する(Jensen, D.D. et al., Sci Transl Med, 2017, 9(392):eaal3447; Yarwood R et al., Proc Natl Acad Sci USA 2017, 114(46):12309-12314)。エンドソームにおけるPAR2が治療標的であるかどうかを評価するために、以下を含むトリパータイトプローブを合成した：プローブを膜に固定するためのコレスタノールまたは膜に組み込まれないエチルエステル；水性環境での提示を容易にするポリエチレングリコール(PEG)12リンカー；局在化のためのシアニン5(Cy5)またはPAR2アンタゴニストI-343（図20AおよびB）のカーゴ(cargo)。トリパータイトプローブがPAR2を含むエンドソームに蓄積するかどうかを判断するために、mPAR2-GFPを発現するマウスDRGニューロンをCy5-PEG-コレスタノール（Cy5-Chol）またはCy5-PEG-エチルエステル（Cy5-エチルエステル）とインキュベートした（200 nM、60分、37℃）。ニューロンを洗浄し、画像化した（37℃）。Cy5-エチルエステルはニューロンに取り込まれなかったのに対し、Cy5-Cholは原形質膜に挿入され、その後、3時間で神経細胞体および神経突起のエンドソームに蓄積された。トリプシンは、Cy5-Cholを含む小胞に近接したエンドソームへのPAR2-GFPのエンドサイトーシスを誘導した。ビデオイメージングにより、PAR2-GFPおよびCy5-Cholを含むエンドソームの頻繁な会合(frequent association)が明らかになった。I-343-PEG-コレスタノール（化合物10、図20A）は、HT-29細胞における2F刺激性IP1蓄積に拮抗したが(pIC50 6.18±0.07; IC50, 670 nM)、親化合物I-343(pIC50 8.96±0.10; IC50 1.1 nM)と比較して効力が低下していた（図20C）。
実施例34：エンドソームPAR2の拮抗作用および侵害受容器の興奮性亢進
本発明の化合物がエンドソームPAR2シグナル伝達によって誘発される侵害受容器のプロテアーゼ誘発性興奮性亢進を阻害する能力を評価するために、マウスDRGニューロンを化合物10（30 μM）またはビヒクル（60分、37℃）と共にプレインキュベートし、洗浄し、アンタゴニストを含まない培地に回収し、180分間処理して、エンドソームにアンタゴニストを蓄積させた（図8A）。トリプシンとの一時的なインキュベーションにより、0分および30分でビヒクル処理したニューロンのレオベースが減少した（図8B）。化合物10は、0分では初期の興奮性に影響を与えなかったが、30分では持続的な応答を妨げた。化合物10はベースラインのレオベースに影響を与えなかった。同様に、IBS-D上清との一時的なインキュベーションは、HC上清と比較して、30分でレオベースを減少させた（図8C）。化合物10は、侵害受容器の興奮性に対するIBS-D上清の持続的作用を完全に妨げた（30分でレオベース：ビヒクルIBS-D、40±3.89 pA、12ニューロン、4人の患者からの上清、化合物10 IBS-D、64.7±3.84 pA、17ニューロン、4人の患者からの上清; P<0.05）（図7C）。化合物10は、HC上清で処理されたニューロンの興奮性に影響を与えなかった。
実施例35：PAR2エンドソームシグナル伝達は、結腸求心性ニューロンのトリプシン誘導性感作を媒介する
機械的刺激に対する結腸求心性ニューロンの感作は、IBSの痛みの主要な仮説である(Azpiroz F. et al., Neurogastroenterol Motil. 2007, 19(1 Suppl): 62-88)。プロテアーゼが結腸侵害受容器の末梢末端でPAR2を切断して機械的過敏症を誘発するかどうかを調べるために、マウスの結腸を神経支配している求心性ニューロンからの単一ユニット記録を行った。受容野を、von Freyフィラメントによる粘膜表面の機械的刺激によって識別し、プロテアーゼを粘膜受容野に適用し、感作を評価するために機械的応答を再評価した。基礎条件の下で、繰り返される機械的刺激（2 gフィラメント）は再現可能な発火(firing)を引き起こした（図9A）。機械的刺激に対する発火の頻度を、トリプシン（10 nM、10分）は35.8±5.9%、NE（100 nM、10分）は41.0±11.8%、CS（100 nM、10分）は52.0±13.2%増幅した（図9B-E）。
マウスの一過性大腸炎は、炎症が解消された後も持続する結腸求心性ニューロンの過敏を誘発する(Azpiroz F., et al., Neurogastroenterol Motil. 2007, 19(1 Suppl): 62-88)。この慢性内臓過敏（CVH）は、感染後/炎症性IBSを模倣し得る。プロテアーゼがCVHをさらに増幅し得るかどうかを決定するために、マウスをトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS、浣腸）で処理して、大腸炎を誘発した。TNBS後28日で、炎症が検出されないとき、結腸の機械的刺激は、CVHマウスにおいてHCマウスよりも高い発火率を誘発し、慢性的な興奮性亢進と一致していた（図21A-D）。基礎反応と比較すると、トリプシンはさらに16.4±7.9%、NEは30.6±9.0%、CSは29.6±9.2%反応を増幅した。したがって、プロテアーゼは、以前の炎症の結果としてすでに感作されている場合であっても、結腸侵害受容器の興奮性亢進をさらに増幅し得る。
エンドソームPAR2シグナル伝達が正常マウスの結腸求心性ニューロンのトリプシン誘発性感作を媒介するかどうかを決定するために、I-343（10 μM）、PS2またはPS2インタクト（50 μM）を受容野に適用した。I-343とPS2は基礎の機械的感受性に影響を与えなかったが、機械的応答のトリプシン誘発性感作を無効にした（図9F、G）。PS2インタクトは、基礎の応答にもトリプシン誘発性感作にも影響を与えなかった（図9H）。この結果は、PAR2エンドサイトーシスが結腸求心性ニューロンのトリプシン誘発性感作に必要であるという仮説を支持する。
有害な結腸直腸伸展刺激（colorectal distension; CRD）は、筋電図でモニターできる腹筋の収縮からなる侵害受容性脳幹反射である内臓運動応答（visceromotor response; VMR）のトリガーとなる。このアプローチにより、覚醒マウスの内臓感受性の評価が可能になる(Castro, J. et al., Br. J. Pharmacol. 2017, 175(12): 2384-2398)。プロテアーゼ誘発性の過敏症を調べるために、健康なマウスの結腸にプロテアーゼ混合物（10 nMトリプシン + 100 nM NE + 100 nM CS）またはビヒクル（生理食塩水）（100 μL）を注入した（浣腸）。15分後、バロスタットバルーンを使用して、段階的なCRD（20-80 mm Hg）に応じてVMRを測定した。ビヒクル処理したマウスでは、CRDは段階的なVMRを誘発した（図9I)。プロテアーゼ混合物は、40〜80 mm Hgのすべての圧力でVMRを増幅した。プロテアーゼ混合物の30分前に、I-343（30 mg/kg）を結腸（100 μL浣腸）に投与すると、応答がなくなった（図9J）。結腸のコンプライアンスの変化は、CRDに対するVMRを変える可能性があるため、圧力/容積の関係をすべての膨張圧力で測定した。結腸のコンプライアンスは、プロテアーゼ混合物またはI-343の影響を受けなかった（図21EおよびF）。この結果は、PAR2エンドサイトーシスが結腸求心性ニューロンのトリプシン誘発性感作および結腸の侵害受容に必要であるという仮説を支持する。
材料および方法
ヒト被験者。クイーンズ大学人間倫理委員会はヒトの研究を承認した。すべての被験者はインフォームドコンセントを与えた。下痢型IBSのROME III基準を使用して診断された13人の成人IBS-D患者（女性12人）および12人の健常対照者の下行結腸から内視鏡生検を得た。すべてのIBS患者は1年を超える症状があり、ほとんどが5年を超えていた。セリアック病は血液検査によって除外され、40年以上毎日下痢をしている患者は、大腸内視鏡検査時に顕微鏡的大腸炎を除外するために生検された。感染後IBSを示唆する病歴のある患者はいなかった。対照生検は、胃腸症状のない結腸スクリーニングを受けた患者から得た。生検（患者１人あたり8サンプル）を、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびゲンタマイシン/アムホテリシンBを含むRPMI培地250 μl中でインキュベート（95%O2/5%CO2、24時間、37℃）した。上清を-80℃で保存した。4〜6人の患者からの上清をプールし、個々の実験で研究した。
被験動物。クイーンズ大学、モナッシュ大学、フリンダース大学、ニューヨーク大学の施設内動物管理使用委員会、および南オーストラリア州保健医療研究所は、マウスとラットの研究を承認した。マウス（C57BL/6、雄性、6-15週）とラット（Sprague-Dawley、雄性、8-12週）を研究した。動物は、12時間の明/暗のサイクルと食料と水への自由なアクセスを備えた温度制御された環境で維持された。CO2吸入または麻酔薬の過剰摂取と開胸術により動物を屠殺した。動物は処置のために無作為化され、研究から除外された動物はいなかった。
Par 2 -Na V 1.8マウス。F2rl1コンディショナルノックアウトC57BL/6マウスは、genOway（リヨン、フランス）によって作出された。F2RL1の膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン、および細胞質ドメインをコードするF2rllの最後のエクソンは、loxPサイトとイントロン1にネオマイシンカセットが隣接していた。ネオマイシンカセットは、これらのマウスをC57BL/6 Flp発現マウス系統と交配することにより切り出された。末梢ニューロンのPar2を欠失させるために、F2rl1コンディショナルノックアウトマウスを、Scn10a遺伝子プロモーター(B6.129-Scn10atm2(cre)Jnw/H)の制御下でCreリコンビナーゼを発現するマウスと交配した。NaV1.8侵害受容器のPAR2の欠失は、免疫蛍光法によって評価した。野生型およびPar2-NaV1.8マウスのDRGを10%ホルマリンで3時間固定し、70%アルコールに移し、パラフィンに包埋した。切片（5 μm）を脱パラフィンし、再水和し、クエン酸ナトリウムバッファーでマイクロ波処理し、洗浄してから、SuperBlockTM (ThermoFisher Scientific)で室温で1時間ブロックした。切片を、Alexa-488にコンジュゲートしたPAR2に対するマウス抗体（Santa Cruz Biotechnology、SC-13504、1:200、4℃、一晩）、およびNaV1.8に対するモルモット抗体（Alomone Labs、AGP-029、1:200、4℃、一晩）、続いてAlexa Fluor-594にコンジュゲートしたヤギ抗モルモット二次抗体（Life Technologies、A11076、1:500、室温、1時間）とインキュベートした。切片は、10倍の倍率でNikon Eclipse Ti顕微鏡で画像化した。画像は、Photometrics CoolSNAPカメラでキャプチャした。
体性侵害受容および炎症。研究の前に2日連続で、マウスを実験装置、部屋および研究者に1〜2時間馴化させた。研究者は試験薬剤を知らされていなかった。足底内注射のために、マウスを鎮静させた（5%イソフルラン）。Dy4a、Dy4インタクト、PS2、PS2インタクト（すべて50 μM）またはビヒクル（0.9% NaCl中に0.2% DMSO）（10 μl）を左後足に注射した。30分後、トリプシン（10または80 nM）、CS（2.5または5 μM）またはNE（1.2または3.9 μM）（すべて10 μl）を同じ後足に注射した。機械的侵害受容応答は、較正されたvon Freyフィラメントで後足の足底表面の刺激に対する足の引っ込め(withdrawal)を調べることによって評価した。von Freyスコアは、実験の前日に各動物のベースラインを確立するために3回測定し、次いでプロテアーゼ投与後4時間まで測定した。浮腫を評価するために、注射部位で足の足底表面と足背表面との間の足の厚さをデジタルキャリパーを使用して測定した。好中球浸潤の評価のために、トリプシン（10 μl、80 nM）またはビヒクルの足底内注射の4時間後に足を収集し、10%中性緩衝ホルマリンで48〜72時間固定し、二等分し、さらに12時間ホルマリンで固定した。組織を10% 0.5 M EDTAで6日間脱灰し、水で洗浄し、70%エタノールに24時間移し、パラフィンに包埋した。切片（5 μm）を好中球抗体Ly6G/6CクローンNIMP-R14（Abcam # ab2557, Lot # GR135037-1, AB_303154, 1:800, 室温, 12 時間）とインキュベートした。切片は、Ventanaの試薬を使用して、オンライン脱パラフィンを備えたVentana Medical Systems Discovery XTプラットフォームで発色免疫組織化学のために処理した。Ly6G/Ly6cをプロテアーゼ-3（Ventana Medical Systems）で8分間酵素処理した。Ly6G/Ly6cは、16分間インキュベートしたヤギ抗ラット西洋ワサビペルオキシダーゼ結合多量体で検出した。
電気生理学的研究のためのDRGニューロンの解離。結腸を支配するDRG（T9-T13）をC57BL/6マウスから収集した。神経節は、コラゲナーゼIV（1 mg/ml、Worthington）およびディスパーゼ（4 mg/ml、Roche）でのインキュベーションによって消化した（10分、37℃）。DRGをファイヤーポリッシュしたパスツールピペットで粉砕し、さらに消化した（5分、37℃）。ニューロンを洗浄し、ラミニン（0.017 mg/ml）とポリ-D-リジン（2 mg/ml）でコーティングしたガラス製カバースリップにプレーティングし、10%ウシ胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するF12培地で、電気生理学的研究のために回収するまで維持した（95%空気、5% CO2、16時間、37℃）。
パッチクランプ記録。小径（<30 pFの静電容量）のニューロンは、侵害受容器の特性を示すため研究した(Valdez-Morales E.E. et al., Am J Gastroenterol 2013, 108(10): 1634-1643)。レオベースを測定することにより、興奮性亢進の変化を定量化した。ホールセル穿孔パッチクランプ記録は、アムホテリシンB（240 μg/ml、Sigma Aldrich）を使用して、電流固定モードで室温で行った。記録チャンバーを、外部溶液で2 ml/minで灌流した。記録を、Multiclamp 700BまたはAxopatch 200B増幅器を使用して作成し、Digidata 1440 Aまたは1322Aによってデジタル化し、pClamp 10.1ソフトウェア（Molecular Devices）を使用して処理した。溶液の組成（mM）：ピペット - K-グルコン酸110、KC1 30、HEPES 10、MgCl2 1、CaCl2 2; 1 M KOHでpH 7.25; 外部 - NaCl 140、KC1 5、HEPES 10、グルコース10、MgCl21、CaCl2 2; 3 M NaOHでpHを7.3-7.4。ニューロンを、HCまたはIBS-D被験者の結腸粘膜生検の上清（200 μlの上清を500 μlのF12培地と組み合わせて、ろ過）と30分間プレインキュベートした。ニューロンをまた、トリプシン（50 nM、10分）、NE（390 nM、30分）、CS（500 nM、60分）、またはビヒクルとプレインキュベート（37℃）し、洗浄した。レオベースを、洗浄後T 0分またはT 30分に測定した。プロテアーゼ誘発効果のメカニズムを調査するために、ニューロンをI-343（100 nM、300 nM、10 μM、30分プレインキュベーション）、SCH79797（1 μM、10分）、Dy4（30 μM、30分）、PS2 （15 μM、30分）、PD98059（50 μM、30分）、GF109203X（10 μM、30分）、またはビヒクルとインキュベートした（プレインキュベーションと全体を含めて）。トリパータイトアンタゴニストを使用する実験では、ニューロンを化合物10（30 μM、60分、37℃）またはビヒクルとプレインキュベートし、洗浄した。それらをF12培地に37℃で様々な時間に回収し、HCもしくはIBS-D上清またはトリプシン（50 nM、10分）でチャレンジし、洗浄した。レオベースを洗浄後0分または30分で測定した。すべての実験において、平均レオベースを、上清、プロテアーゼまたはビヒクルに曝露されたニューロンについて計算した。
結腸求心性記録。結腸および直腸（5-6 cm）をC57BL/6マウスから切除した。求心性記録は、記載されているように内臓神経から行われた(Hughes, P.A. et al., Gut 2009, 58(10): 1333-134; Brierley, S.M. et al., Gastroenterology 2004, 127(1): 166-178)。簡単に言えば、腸を開き、臓器浴中で粘膜側を上にして平らに固定した。組織を、平滑筋活動を抑制するためのL型カルシウムチャネルアンタゴニスト ニフェジピン（1 μM）、およびプロスタグランジンの阻害作用を抑制するためのシクロオキシゲナーゼ阻害剤インドメタシン（3 μM）を含む、改変クレブス溶液(mM: 117.9 NaCl, 4.7 KCl, 25 NaHCO3, 1.3 NaH2PO4, 1.2 MgSO4 (H2O)7, 2.5 CaCl2, 11.1 D-グルコース; 95% O2, 5% CO2, 34℃)で灌流した。内臓神経をパラフィンで満たされた記録コンパートメントに広げ、そこで、結腸の受容野の機械的刺激によって生じた活動電位の単一ユニット細胞外記録のために、細かく切開された神経線維をプラチナ電極上に置いた。受容野は、すべてのタイプの機械感受性求心性神経を活性化するのに十分な硬さのブラシで粘膜表面を機械的に刺激することによって識別した。識別されたら、分類を可能にする3つの異なる機械的刺激で受容野をテストした：較正されたvon Freyフィラメントによる静的プローブ（2 gの力; 3秒間に3回）、von Freyフィラメントによる粘膜のストローク（10 mgの力; 10回）、または円形ストレッチ（5 g; 1分）。結腸侵害受容器は、機械的活性化閾値が高く、有害な伸展刺激(noxious distension)（40 mmHg）、円形ストレッチ（≧7g）、または2 gのフィラメントプローブに応答したが、細かい粘膜のストローク（10 mgフィラメント）には応答しなかった。これらのニューロンは、痛みに関与する一連のチャネルおよび受容体を発現し、慢性内臓痛のモデルにおいて機械的に過敏になり、侵害受容器の表現型を有する。したがって、これらは「結腸侵害受容器(colonic nociceptors)」と呼ばれる。機械的刺激（2 gフィラメント）に対するベースラインの結腸侵害受容器応答が確立されたら、機械的感受性を、トリプシン（10 nM）、NE（100 nM）またはCS（100 nM）の10分間適用後に再テストした。プロテアーゼは、目的の粘膜受容野上に配置された金属シリンダーに適用された。この投与経路は結腸求心性神経を活性化することが示されている(Hughes, P.A. et al., Gut 2009, 58(10): 1333-134)。活動電位は、Spike 2 wavemark関数を使用して分析され、識別可能な波形、振幅、および持続時間に基づいて単一ユニットとして識別された。
結腸内臓過敏（CVH）。CVHは、記載されているようにトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）の結腸内投与により誘発された(Hughes, P.A., et al., Gut 2009, 58(10): 1333-134; Brierley, S.M. et al., Gastroenterology 2004, 127(1): 166-178)。簡単に言えば、12週齢のマウスを5%グルコース溶液にアクセスさせて一晩絶食させた。TNBS（100 μl、30% EtOH中に4 mg TNBSを含む）を、肛門から3 cm奥に挿入されたポリエチレンカテーテルを介して鎮静マウス（5％イソフルラン）に投与した。次に、マウスを28日間回復させた。この時点で、マウスは結腸の機械的過敏、アロディニアおよび痛覚過敏を示す。したがって、それらはCVHマウスと呼ばれる。
結腸直腸伸展刺激（Colorectal Distension; CRD）に対する内臓運動応答（Visceromotor Responses; VMR）。腹筋の筋電図検査（EMG）を使用して、CRDに対するVMRをモニターした(Eichel, K. et al., Nat. Cell Biol. 2016, 18(3): 303-310)。電極をイソフルラン麻酔下でマウスの右腹筋に埋め込んだ。マウスはVMRの評価の前に少なくとも3日間回復させた。VMR評価の日に、マウスをイソフルランで鎮静させ、ビヒクル（生理食塩水）またはプロテアーゼカクテル（10 nMトリプシン、100 nM NE、100 nM CS）（100 μl）を浣腸で結腸に投与した。マウスの1つのグループでは、プロテアーゼカクテルの30分前にI-343（30 mg/kg、100 μl）を結腸に投与した。潤滑されたバルーン（2.5 cm）を肛門から0.25 cm奥の結腸直腸に導入した。バルーンカテーテルを尾の付け根に固定し、段階的に圧力制御されたバルーン拡張のためにバロスタット（Isobar 3、G&J Electronics）に接続した。CRDシーケンスの前に、マウスを麻酔から15分間回復させた。20、40、50、60、70、80 mm Hg（持続時間20秒）で4分間隔で伸展刺激を適用した。最終的な伸展刺激は、プロテアーゼまたはビヒクルの投与後30分であった。EMG信号を記録し（NL100AK headstage）、増幅し（NL104）、フィルターにかけ（NL 125/126、Neurolog、Digitimer Ltd、バンドパス50-5000 Hz）、デジタル化して（CED 1401、Cambridge Electronic Design）、Spike2（Cambridge Electronic Design）を使用してオフラインで分析した。アナログEMG信号を修正し統合した。各伸展刺激圧でのVMRの大きさを定量化するために、伸展刺激中（20秒）の曲線下面積（AUC）をベースラインアクティビティ（AUC伸展刺激前、20秒）に対して補正した。結腸コンプライアンスは、記載されているように、対応する結腸直腸圧を記録しながら、覚醒マウスのバルーンに段階的な容量（40-200 μl、持続時間20秒）を適用することにより評価した(Eichel, K. et al., Nat. Cell Biol. 2016, 18(3): 303-310; Irannejad, R. et al., Nature 2013, 495(7442): 534-538)。
シグナリングおよびトラフィッキングの研究のためのDRGニューロンの解離。DRGを、C57BL/6マウスとSprague-Dawleyラット（すべてのレベル）から収集した。DRGをコラゲナーゼIV（2 mg/ml）およびディスパーゼII（1 mg/ml）と37℃で30分間（マウス）および45分間（ラット）インキュベートした。DRGを、ファイヤーポリッシュしたパスツールピペットで粉砕することにより分散させた。Lonza 4D-Nucleofector X unitを製造元の指示に従って使用して、解離したニューロンに、mPAR2-GFP（1 μg）、FRETバイオセンサーCytoEKAR、NucEKAR、pmCKARまたはCytoCKAR（すべて1 μg）、またはBRETバイオセンサーPAR2-RLuc8（125 ng）およびβARR2-FYP（475 ng）をトランスフェクションした。ニューロンを、ラミニン（0.004 mg/ml）とポリ-L-リジン（0.1 mg/ml）でコーティングした共焦点顕微鏡用ガラス製カバースリップ、FRETアッセイ用ViewPlate-96プレート（PerkinElmer）、またはBRETアッセイ用CulturPlates（PerkinElmer）にプレーティングした。ニューロンを、10%ウシ胎児血清（FBS）、抗生物質-抗有糸分裂剤、およびN1サプリメントを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で、試験前に48時間維持した。
DRGニューロンにおけるPAR 2 トラフィッキング。mPAR2-GFPを発現するマウスDRGニューロンを、トリプシン（10 nM）、CS（100 nM）、NE（100 nM）またはビヒクルとインキュベート（30分、37℃）し、固定した（4%パラホルムアルデヒド、20分、4℃）。NeuNは、記載されているように間接免疫蛍光法によって検出した（Jensen, D.D. et al., Sci Transl Med. 2017, 9(392), eaal3447）。ニューロンを、HCX PL APO 63x（NA 1.40）油浸対物レンズを備えたLeica SP8共焦点顕微鏡を使用して観察した。NeuN陽性ニューロンにおけるPAR2インターナリゼーション(internalization)を、ImageJソフトウェアを使用して定量化した。神経細胞体の細胞質の境界は、NeuN蛍光によって定義された。境界から0.5 μm以内のmPAR2-GFP蛍光は、原形質膜関連受容体として定義された。サイトゾルのmPAR2-GFPに対する原形質膜の比率を決定した。
DRGニューロンにおけるFRETアッセイ。FRETバイオセンサーを発現するラットDRGニューロンを血清制限し(serum-restricted)（0.5% FBSで一晩）、HBSS-HEPES（10 mM HEPES、pH 7.4、30分、37℃）で平衡化した。FRETを、Operetta CLS High-Content Imaging System (PerkinElmer)またはINCell Analyzer 2000 (GE Healthcare Life Sciences)を使用して分析した。CFP/YFP発光比分析では、CFPフィルター（410-430 nm）を使用して細胞を順次励起し、YFPフィルター（520-560 nm）およびCFPフィルター（460-500 nm）を使用して発光を測定した。細胞を1または2分間隔で画像化した。ベースラインを測定し、ニューロンをトリプシン（10または100 nM）またはビヒクルでチャレンジし、応答をさらに30分間記録した。次に、EKARバイオセンサー用のホルボール12,13-ジブチレート（PDBu、200 nM、10分）またはCKARバイオセンサー用のPDBu（200 nM）とホスファターゼ阻害剤カクテル2（SigmaAldrich、10分）でニューロンをチャレンジした。データをHarmony 4.1またはImage J 1.51ソフトウェアを使用して分析した。撮影した画像を揃え、直径に基づいて細胞を選択し、FRETチャネルとCFPチャネルの両方について蛍光強度を計算した。バックグラウンド強度を差し引いて、FRET比を、各細胞のベースライン(F/F0)に対するFRET/ドナー（EKAR）またはドナー/FRET（CKAR）発光比の変化として決定した。PDBu刺激後にF/F0の変化が5%を超える細胞を分析用に選択した。ニューロンをI-343（10 μM）、SCH530348（100 nM）またはビヒクルとインキュベートした（30分、37℃ プレインキュベーションと全体を含めて）。
DRGニューロンにおけるBRETアッセイ。マウスDRGニューロンをHBSS-HEPES（30分、37℃）で平衡化し、Renillaルシフェラーゼ基質セレンテラジンh（NanoLight Technologies）（5 μM、5分）とインキュベートした。BRET比を、トリプシン（10 nM）、NE（100 nM）またはCS（100 nM）でのチャレンジの前後に、CLARIOstar Monochronometer Microplate Reader (BMG LabTech)を使用して475±30 nmおよび535±30 nmで測定した。データをBRET比として表示し、RLuc8シグナルに対するYFPの比率として計算し、ベースライン平均に正規化する。データを、25分のアッセイの曲線下面積としてプロットする。
DRGニューロンにおけるCa 2+ アッセイ。[Ca2+]iを、WTおよびPar2-NaV1.8マウスからのDRGニューロンで測定した(Tsvetanova, N.G., et al., Nat. Chem. Biol. 2014, 10(12): 1061-1065)。ニューロンに、Ca2+-およびMg2+-含有DMEM中のFura-2AM(1 μM)をロードした（45分、室温）。個々のニューロンの蛍光を、20倍の倍率のNikon Eclipse Ti顕微鏡とPhotometries CoolSNAPカメラを使用して、340 nmおよび380 nmの励起と530 nmで測定した。Nikon Ti Elementソフトウェアを使用してデータを分析した。培養物を最初にKC1（65 mM）でチャレンジし、応答性ニューロンを特定し、次いで、トリプシン（100 nM）に曝露した。直径25 μm未満の細胞を分析のために選択した。活性化閾値の決定のために、トリプシンへの曝露後の340/380比の大きさをベースライン比と比較した。340/380比がベースラインから0.1以上の場合、ニューロンはトリプシンに応答すると見なされた。
DRGニューロンにおけるトリパータイトプローブの取り込み。mPAR2-GFPを発現するマウスDRGニューロンをCy5-エチルエステル（コントロール）またはCy5-Chol（200 nM、60分、37℃）とインキュベートし、HBSS-HEPESで洗浄した。ニューロンをHBSS-HEPES中で加熱チャンバー（37℃）に移し、トリプシン（100 nM、15分）処理の前または後に共焦点顕微鏡で観察した。HCX PL APO 63x(NA 1.40)油浸対物レンズを備えたLeica TCS SP8レーザー走査共焦点顕微鏡を使用して画像を取得した。画像取得設定は、Cy5-CholおよびCy5-エチルエステル蛍光検出で一貫していた。
細胞株、トランスフェクション。HEK293細胞を、10% (v/v) FBSを添加したDMEMで培養した(5% CO2, 37℃)。必要に応じて、0.5% FBSを含むDMEMで培地を一晩交換することにより、血清制限を達成した。ポリエチレンイミン（PEI）(1:6 DNA:PEI)を使用して、細胞を一過性にトランスフェクトした。
HEK293細胞におけるFRETアッセイ。HEK293細胞を、10 cmディッシュ(〜50%コンフルエンシー)中で、Flag-PAR2-HA（2.5 μg）およびFRETバイオセンサーCytoEKARまたはNucEKAR（2.5 μg）で一過性にトランスフェクトした(Jensen, D.D. et al., Sci Transl Med. 2017, 9(392), eaal3447; Thomsen, A.R.B., et al., Cell 2016, 166(4): 907-919)。ダイナミンの役割を調べる実験では、細胞をFLAG-PAR2-HA（1.25 μg）、FRETバイオセンサー（1.25 μg）、およびDynWT-HA、DynK44E-HAまたはpcDNA3.l（2.5 μg）のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞をViewPlate-96ウェルプレート（PerkinElmer）に播種した。FRETを、トランスフェクションの72時間後に、血清を一晩制限して評価した。細胞をHBSS-HEPESで平衡化した（30分、37℃）。 FRETを、PHERAstar FSXマイクロプレートリーダー（BMG LabTech）を使用して測定した。CFP/YFP発光比分析では、CFPフィルター（425/10 nm）を使用して細胞を順次励起し、YFPフィルター（550/50 nm）およびCFPフィルター（490/20 nm）を使用して発光を測定した。FRETを、トリプシン（10 nM）、NE（100 nM）、CS（100 nM）、ホルボール12,13-ジブチレート、PDBu（陽性対照、1 μM）、またはビヒクルによる刺激の前後に測定した。FRET比（EKARのドナー/アクセプター強度、またはCKARおよびEpacのアクセプター/ドナー強度）を計算し、ベースラインおよびビヒクル処理に補正して、リガンド誘導FRET（ΔFRET）を決定した。治療効果を、曲線下面積の比較により決定した。シグナル伝達阻害剤をHBSS-HEPESに溶解した。PS2およびPS2インタクトをHBSS-HEPES + 1% DMSOに溶解した。細胞をUBO-QIC（100 nM）、AG1478（1 μM）、Go6983（1 μM）、PS2もしくはPS2インタクト（30 μM）またはビヒクルとインキュベートした（30分間プレインキュベーション、全体を含めて）。
HEK293細胞におけるBRETアッセイ。HEK293細胞を10 cmディッシュ（〜50％コンフルエンシー）中で、PAR2-RLuc8（1 μg）およびRIT-VenusまたはRab5a-Venus（どちらも4 μg）；Flag-PAR2-HA（1 μg）およびβARR1-RLuc8（1 μg）＋Rab5a-Venus（4 μg）；またはFlag-PAR2-HA（1 μg）およびGαq-RLuc8（0.5 μg）、Gb（1 μg）、Gg（1 μg）およびRab5a-Venus（4 μg）で一過性にトランスフェクトした。ダイナミンの役割を調べるために、PAR2-RLuc8（0.5 μg）、RIT-VenusまたはRab5a-Venus（2 μg）、およびDynWT-HA、DynK44E-HAまたはpcDNA3.l（2.5 μg）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞をCulturPlates（PerkinElmer）に播種した。翌日、細胞をHBSS-HEPESで平衡化し、セレンテラジンh（NanoLight Technologies）（5 μM、5分）とインキュベートした。RLuc8およびYFPの強度を、プロテアーゼ、生検上清またはビヒクルでのチャレンジの前後にLUMIstar Omegaマイクロプレートリーダー（BMG LabTech）を使用して、それぞれ475±30 nmおよび535±30 nmで測定した。データを、BRET比として示し、YFPのRLuc8シグナルに対する比として計算し、ベースライン平均に正規化した後、ビヒクルを差し引いた。治療効果を、曲線下面積の値の比較により決定した。
免疫蛍光および構造化照明顕微鏡法。Flag-PAR2-HAを一過性に発現するHEK293細胞を、ポリ-D-リジンでコーティングされた高耐性カバーグラスに播種し、一晩インキュベートした。細胞をDMEM中でトリプシン（10 nM）またはビヒクルと共に37℃で30分間インキュベートした。細胞を氷上で4% パラホルムアルデヒドで20分間固定し、PBSで洗浄した。細胞をPBS + 0.3% サポニン+ 3% NHSで室温で1時間ブロックした。細胞を、HA（ラット抗HA、1：1,000、Roche）、EEA-1（ウサギ抗EEA-1 1：100、Abeam）、Gαq（マウス抗GNAQ 1：100、Millipore）に対する一次抗体と、PBS + 0.3% サポニン+ 1% NHS中で、4℃で一晩インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、二次抗体（ヤギ抗ラットAlexa568、ロバ抗ウサギAlexa488、ヤギ抗マウスDylight405、1：1,000、Invitrogen）と室温で1時間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、prolong Diamond封入剤（ThermoFisher）を使用してスライドガラス上に封入した。細胞を、SR Apo-TIRF100x/1.49対物レンズを備えたNikon N-SIM Eclipse TiE倒立顕微鏡を使用して、超解像構造化照明顕微鏡（SIM）で観察した。画像を、Andor iXon 3 EMCCDカメラで標準の青、緑、および赤の発光用の405、488、および561 nmレーザーとフィルターセットを使用して、3D-SIMモードで取得した。Zスタックを、125 nmのz間隔で収集した。NIS-Elements ARソフトウェアを使用してSIM画像を再構築した。
cDNA。BRETセンサーPAR2-RLuc8、KRas-Venus、Rab5a-VenusおよびβARR2-YFPが記載されている(Jensen, D.D. et al., Sci Transl Med. 2017, 9(392): eaal3447; Yarwood, R. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2017, 114(46): 12309-12314)。FRETセンサーCytoEKAR、NucEKAR、CytoCKARおよびpmCKARはAddgeneからのものであった（それぞれプラスミド18680、18681、14870、14862）。
IP 1 蓄積アッセイ。KNRK-hPAR2、KNRK、HEK293、またはHT-細胞を、50x103細胞／ウェルの密度で、透明な96ウェルプレート（PerkinElmer）に播種した。24時間の培養後、培地をIP1刺激バッファー（10 mM HEPES、1 mM CaCl2、0.5 mM MgCl2、4.2 mM KCl、146 mM NaCl、5.5 mMグルコース、50 mM LiCl; 37℃、5% CO2）に交換した。細胞を、アンタゴニストまたはビヒクルと共に30分間プレインキュベートした後、アゴニストを添加した。次いで、細胞をさらに40分間インキュベートした。刺激バッファーを吸引し、細胞を溶解バッファーで10分間インキュベートした（IP-One HTRF（登録商標）アッセイキット、Cisbio）。ライセートを384ウェルOptiPlate（PerkinElmer）に移し、IP1を検出した（IP-One HTRF（登録商標）アッセイキット、Cisbio）。ホモジニアス時間分解FRETをEnvisionプレートリーダー（PerkinElmer Life Sciences）で測定した。
統計。結果は平均±SEMである。差は、Studentのt検定（2つの比較）、または一元配置もしくは二元配置ANOVA（多重比較）に続いて、Tukeyの多重比較検定（電気生理学的アッセイ）またはDunnettの多重比較検定（体性侵害受容、単一細胞FRETアッセイ）を使用して評価した。BRETアッセイとポピュレーションFRETアッセイの場合、曲線下面積データは、トリプシンのみの応答に一致するように正規化され、1サンプルのt検定を使用して100%と比較した。結腸侵害受容（CRDに対するVMR）のアッセイの場合、データは、一般化された推定方程式により、続いて、適切な場合はSPSS 23.0を使用して、フィッシャーの最小有意差事後検定により統計的に分析した。GraphPad Prism 7ソフトウェア（San Diego、CA、USA）を、統計分析とグラフの作成に使用した。

Claims (20)

  1. 式(I):

    ［式中、
    R1は、H、C1-C6アルキルまたはハロであり;
    R2は、1〜3個のハロゲンでそれぞれ置換されていてもよい、C1-C6アルキル、C3-C6シクロアルキルまたはC1-C6アリールであり;
    R3は、オキソまたはC1-C6アルキルであり;
    pは、0〜3の整数であり;
    R4は、-C1-C6アルキルS(O)2OH、-1,2,3-トリアゾール-1-酢酸、-NHR7、-ビシクロ[2.2.2]オクタンC(O)OR6、-C4-C8シクロアルキル-R5、-C1-C6アルキル-R5で置換された4〜6員の複素環式もしくはヘテロアリール基、または-(CH2)2C(O)NHC2-C10アルキル（ここで、該C2-C10アルキルは、2〜10個の-NH2または-OHで置換されている）であり;
    R5は、-C(O)NHR7または-NHC(O)R7であり;
    R6は、HまたはR7であり;
    R7は、-R8、-C1-C20アルキル、-C1-C20アルキルC(O)NH2または-C1-C20アルキルC(O)NR8（ここで、該-C1-C20アルキル、-C1-C20アルキルC(O)NH2および-C1-C20アルキルC(O)NR8は、2〜10個の-NH2または-OHで置換されていてもよく、該アルキル基中の1つまたは複数の炭素原子が窒素または酸素で置き換えられていてもよい）であり;
    R8は、式:

    （式中、
    Lは、長さ1 nm〜50 nmのリンカー部分であり;
    LAは、原形質膜への化合物の挿入を促進する脂質アンカーである）
    で表される］
    の化合物またはその医薬上許容される塩。
  2. R1がハロであり、R2がC1-C6アルキルである、請求項１に記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  3. R1がフルオロであり、R2がt-ブチル基である、請求項２に記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  4. R3がC1-C6アルキルであり、pが2である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  5. R3がメチルであり、pが2である、請求項４に記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  6. 脂質アンカー(LA)が、4℃で非イオン性界面活性剤に不溶である脂質膜に分配される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  7. 原形質膜への化合物の挿入を促進する脂質アンカー(LA)が、式(IIa)、(IIIa)、または(IVa):


    （式中、
    R1aは、置換されていてもよいC1-12アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアルコキシ基であり;
    R2aおよびR3a、R3b、R4b、R4c、R5a、R6a、R7a、R7b、R8a、R8b、R9a、R9b、R10a、R11a、R11b、R12a、R12b、R13a、R14a、R15a、R15b、R16aおよびR16bは、独立して、H、C1-3アルキル、ヒドロキシル、C1-3アルコキシまたはアミノであり;または
    任意選択で、R3a、R3bおよび／またはR4b、R4cおよび／またはR7a、R7bおよび／またはR8a、R8bおよび／またはR11a、R11bおよび／またはR12a、R12bおよび／またはR15a、R15bおよびR16a、R16bは、一緒になって=O（酸素に対する二重結合）を形成し;
    R4aは、C、O、NHまたはSであり;および

    は、単結合または二重結合を表す）
    で表される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  8. Lは、長さ1 nm〜50 nmのリンカー部分であって、Lは、式(XVa):

    （式中、
    Zは、リンカーと脂質アンカーの間の結合基であって、-C1-C10アルキル-、-C2-C10アルケニル-、-C2-C10アルキニル-、-C1-C10アルキルC(O)-、-C2-C10アルケニルC(O)-もしくは-C2-C10アルキニルC(O)-であり;または
    Zは、隣接するアミンと一緒になって、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリンもしくはトレオニンから選択されるC末端がアミド化されていてもよいアミノ酸であり;ここで、該アミノ酸は、側鎖官能基を介して脂質アンカーに結合する;
    mは、1または2であり;
    nは、1〜20であり;および
    pは、1〜8である）
    で表される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  9. 以下の化合物:
    から選択される化合物またはその医薬上許容される塩。
  10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物またはその医薬上許容される塩を、少なくとも１つの医薬上許容される担体または希釈剤と共に含む医薬組成物。
  11. PAR2シグナル伝達を阻害する方法であって、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物またはその医薬上許容される塩を該受容体に接触させることを含む、方法。
  12. PAR2シグナル伝達の阻害を必要とする対象において、PAR2シグナル伝達を阻害する方法であって、有効量の請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物またはその医薬上許容される塩を対象に投与することを含む、方法。
  13. PAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害を予防または治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物またはその医薬上許容される塩を投与することを含む、方法。
  14. 疾患または障害がエンドソームPAR2シグナル伝達によって媒介される、請求項１３に記載の方法。
  15. PAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害が、急性および慢性炎症性疾患、腫瘍転移、胃腸運動、痛み、かゆみ、アトピー性皮膚炎のような皮膚疾患、食事誘発性肥満、喘息、関節リウマチ、歯周炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、がん、線維性疾患、代謝機能障害、および神経疾患から選択される、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. PAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害が、過敏性腸症候群に伴う痛みである、請求項１３または１４に記載の方法。
  17. PAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害の予防または治療のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物またはその医薬上許容される塩。
  18. PAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害の予防または治療用医薬の製造における、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物またはその医薬上許容される塩の使用。
  19. PAR2シグナル伝達によって媒介される疾患または障害の予防または治療に使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物または請求項１０に記載の医薬組成物。
  20. 急性および慢性炎症性疾患、腫瘍転移、胃腸運動、痛み、かゆみ、アトピー性皮膚炎のような皮膚疾患、食事誘発性肥満、喘息、関節リウマチ、歯周炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、がん、線維性疾患、代謝機能障害、および神経疾患から選択される疾患または障害の予防または治療に使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物または請求項１０に記載の医薬組成物。
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