CN111698991A - 蛋白酶激活受体-2的抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及能够抑制蛋白酶激活受体‑2(PAR2)的化合物及其用途。更具体地，本发明涉及PAR2抑制剂，涉及其制备和其在治疗由PAR2信号传导介导的疾病和病症中的用途。

Description

蛋白酶激活受体-2的抑制剂
技术领域
本发明一般涉及能够抑制蛋白酶激活受体-2(PAR2)的化合物及其用途。更具体地，本发明涉及PAR2抑制剂，涉及其制备和其在治疗由PAR2信号传导介导的疾病和病症中的用途。
背景技术
包含PAR-1、-2、-3和-4的蛋白酶激活受体(PAR)是具有独特激活机制的G蛋白偶联受体(GPCR)家族。PAR并非直接由内源性配体激活，而是由酶(例如凝血酶、组织因子、组织蛋白酶S、类胰蛋白酶或胰蛋白酶)的蛋白水解作用间接激活。通常，蛋白水解酶从PAR的N-末端切割一部分，暴露出新的N-末端，后者折叠起来并激活受体作为内源性束缚配体。PAR的特异性切割位点在氨基酸序列上是不同的，因此被赋予激活选择性的不同酶所识别。例如，凝血酶是PAR1的活化酶，而PAR2更容易被胰蛋白酶或类胰蛋白酶激活。除PAR3以外，与束缚配体序列相对应的短合成肽显示能够激活各自的PAR。
PAR2在各种器官中广泛表达，包括肺、肾、心脏、肝、皮肤、平滑肌和胃肠道。已经在上皮和内皮细胞中，特别是在炎性细胞中发现了PAR2的存在，所述炎性细胞例如T细胞、单核细胞、巨噬细胞，嗜中性粒细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞。一系列宿主和病原体衍生的丝氨酸蛋白酶，包括胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶、组织激肽释放酶、凝血级联TF-FVIIa和FVa-FXa的成员、组织蛋白酶S、弹性蛋白酶、顶体蛋白、HAT、TMPRSS2，几丁质酶、细菌牙龈蛋白酶、Der P1-3、Pen C 13和睾丸素可以识别并处理PAR2的N端。当在规范位点(R36S37)切割时，新暴露的N端充当诱导PAR2激活的束缚配体。非规范位点的切割(例如，通过组织蛋白酶S进行的切割)会导致PAR2失活或不同束缚配体的解掩蔽，从而导致不同的信号传导模式。模拟规范序列的合成肽例如SLIGKV-NH2或SLIGRL-NH2可以以适度的效力选择性激活人PAR2。可以通过修饰N-端丝氨酸(S)残基来提高肽的效力，其中一个突出的例子是有效的肽类激动剂2-芴基-LIGRLO-NH2(2F激动剂)。
迄今为止，文献数据表明PAR2的激活与许多生理和病理生理过程有关，例如炎症、肿瘤转移、胃肠动力、疼痛和痒。已显示单核细胞和巨噬细胞中的PAR2激活导致炎性细胞因子和趋化因子的释放，例如IL6、IL8和IL1β((Johansson，U.等人，Journal of LeukocyteBiology，2005，78(4):967-975；Colognato，R.等人，Blood 2003，102(7):2645-2652；Steven，R.等人，Innate Immunity 2013，19(6):663-672；和Cho，N.-C.等人，Bioorg MedChem 2015，23(24):7717-7727)。另外，已经证明在体内给药PAR2激动剂会引起炎症反应。特别地，许多研究小组已证明，在啮齿动物中足底内给药PAR2激活蛋白酶或合成激动剂可引起水肿反应和机械痛觉过敏，这通过使用PAR2拮抗剂治疗或通过PAR2缺失治疗来显著减轻(例如，Lieu，T.等人，British Journal of Pharmacology 2016，173(18):2752-2765)。进一步的研究还表明，PAR2可以作为神经源性炎症、伤害感受和疼痛传递的介质(例如Tillu，D.V.等人，Pain 2015，156(5):859-867；Zhao，P.等人，Journal of BiologicalChemistry 2014，289(39):27215-27234)。再次，用GB88，一种PAR2选择性拮抗剂治疗，导致通过PAR2介导的炎症和伤害作用的减少(Lieu，T.等人，British Journal ofPharmacology，2016，173(18):2752-2765)。
PAR2和活化酶的表达增加与皮肤病症例如特应性皮炎有关(Steinhoff，M.等人，Journal of Neuroscience 2003，23(15):6176-6180；Frateschi，S.等人，NatCommun.2011，2:161)。PAR2激动剂的局部应用触发了鱼鳞癣的延长，而PAR2的转基因表达引起了小鼠皮肤的表皮增生。
已经在肺的上皮细胞和成纤维细胞中鉴定了PAR2表达，并且据信其通过调节下游转录激活而参与组织稳态(Adams，M.N.等人，Pharmacology&Therapeutics 2011，130(3):248-282)。此外，一些研究表明，PAR2激活可促进癌细胞的迁移、侵袭和转移(例如，Yau，M-K.，L.Liu，and Fairlie，D.P.，Journal of Medicinal Chemistry 2013，56(19):7477-7497；Zeeh，F.等人，Oncotarget 2016，7(27):41095-41109；和Yang，L.等人，Journal ofBiological Chemistry 2015，290(44):26627-26637)。
已证明PAR1和PAR2在生理和病理条件下参与调节胃肠道的运动性和分泌。PAR2似乎具有双重作用，因为PAR2激动剂可以根据实验条件诱导松弛或收缩作用。PAR2在调节GI动力中的确切作用和机制仍在研究中。然而，最近的文献数据表明，PAR2激动剂可刺激啮齿动物结肠和十二指肠肌肉的收缩(Kawabata，A.，M.Matsunami，and F.Sekiguchi，BritishJournal of Pharmacology 2008，153:S230-S240；Browning，K.N.，Neurogastroenterology and Motility 2010，22(4):361-365)。在小鼠结肠全肌肉胰蛋白酶中，内源性PAR2激活剂引发双相反应：短暂的超极化和松弛，然后复极化和激发(Sung，T.S.等人，Journal of Physiology-London 2015，593(5):1169-1181)。
利用PAR2缺陷型小鼠的大量实验的结果，通过抗体或拮抗剂(例如GB88)的功能抑制揭示了PAR2激活在多种疾病的病理生理中的重要作用，所述疾病包括饮食引起的肥胖、脂肪炎症、哮喘、类风湿性关节炎、牙周炎、炎性肠疾病、肠道易激综合征、皮肤疾病、癌症、纤维化疾病、代谢功能紊乱、慢性疼痛和神经疾病(Adams，M.N.等人，Pharmacology&Therapeutics，2011，130(3):248-282)。
也有证据表明，靶向内体PAR2信号传导可提供新颖的治疗方法。越来越认识到的是，以前被认为主要在细胞表面起作用的G蛋白偶联受体(GPCR)可继续从核内体发出信号(Murphy，J.E.等人，Proc Natl Acad Sci USA 2009，106(42):17615-17622)。尽管GPCR信号传导始于质膜，但激活的受体与β-抑制蛋白(βARR)结合，其介导受体脱敏和内吞作用(DeWire，S.M.等人，Annu Rev Physiol 2007，69:483-510)。这些过程有效地终止了质膜上的GPCR信号传导。对核内体中GPCR传导信号复合物的检测以及对内吞作用的破坏可以抑制信号传导的发现表明，GPCR信号来自核内体(例如，May，V.&Parsons，R.L.，J Cell Physiol2017，232(4):698-706)。核内体中的GPCR可在控制基因转录和神经元兴奋的亚细胞区室中产生持久信号(Tsvetanova，N.G.&von Zastrow M.，Nat Chem Biol 2014，10(12):1061-1065)。已发现GPCR的内体信号传导调节重要的生理过程，包括疼痛传递(Yarwood，R.等人，Proc Natl Acad Sci USA 2017，114(46):12309-12314)。
蛋白酶和PAR2参与了结肠感觉神经的超敏反应，这可导致患有肠道易激综合征(IBS)的患者出现慢性疼痛(Azpiroz，F.等人，Neurogastroenterol Motil 2007，19(1Suppl):62-88)。来自IBS患者的结肠粘膜的活检组织释放的蛋白酶，包括类胰蛋白酶和胰蛋白酶-3，可诱导小鼠体内PAR2依赖性伤害感受器的超兴奋性和结肠伤害感受(Barbara，G.等人，Gastroenterology 2007，132(1):26-37；Cenac，N.等人，The Journalof Clinical Investigation 2007，117(3):636-647；and Valdez-Morales，E.E.等人，AmJ Gastroenterol 2013，108(10):1634-1643)。PAR2激动剂通过未知机制诱导神经元明显持续的超兴奋性(Reed，D.E.等人，J Physiol 2003，547(Pt 2):531-542)。
因此，很明显迫切需要开发有效的和选择性的PAR2信号传导抑制剂，并在医学上取得实质性进展，以促进炎症、伤害感受、胃肠动力、纤维化和癌症侵袭的治疗。
发明内容
提供了适用于抑制PAR2的新化合物。本发明的化合物可用于治疗和预防由该受体介导的疾病和病症。本文公开的PAR2抑制剂包含限制其吸收的部分，使其适合用于治疗胃肠道的疾病和病症以及靶向递送化合物。
在一个方面中，本发明提供式(I)的化合物：
Figure BDA0002625731940000041
或其药学上可接受的盐，其中：
R1为H、C1-C6烷基或卤素；
R2为C1-C6烷基、C3-C6环烷基或C1-C6芳基，其各自任选地被1至3个卤素取代；
R3为氧代或C1-C6烷基；
p为整数0至3；
R4为-C1-C6烷基S(O)2OH、-1,2,3-三唑-1-乙酸、-NHR7、-双环[2.2.2]辛烷C(O)OR6、-C4-C8环烷基-R5、4-6元杂环或杂芳基基团，其被-C1-C6烷基-R5或-(CH2)2C(O)NHC2-C10烷基取代，其中所述C2-C10烷基被2至10个-NH2或-OH取代；R5为-C(O)NHR7或-NHC(O)R7；
R6为H或R7；
R7为-R8、-C1-C20烷基、-C1-C20烷基C(O)NH2或-C1-C20烷基C(O)NR8，其中所述-C1-C20烷基、-C1-C20烷基C(O)NH2和-C1-C20烷基C(O)NR8任选地被2至10个-NH2或-OH取代，且其中所述烷基基团中的一个或多个碳原子任选地被氮或氧替代；
R8表示为下式：
Figure BDA0002625731940000051
其中
L为长度为1nm至50nm的接头部分；和
LA为促进所述化合物嵌入质膜的脂质锚。
在另一个方面中，本发明提供一种抑制PAR2信号传导的方法，其包括将所述受体与如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐接触。
在其它方面中，本发明提供一种在有此需要的受试者中抑制PAR2信号传导的方法，其包括向所述受试者给药有效量的如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
在又另一个方面中，本发明提供一种预防或治疗由PAR2信号传导介导的疾病或病症的方法，其包括向有此需要的受试者给药有效量的如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明还提供如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其用于预防或治疗由PAR2信号传导介导的疾病或病症。
在另一个方面中，本发明提供如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗由PAR2信号传导介导的疾病或病症。
本发明进一步提供药物组合物，其包含如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
通过阅读下面的详细说明并结合所附的实施例、附图和权利要求书，本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员将变得更加明显。
附图说明
图1：蛋白酶引起的机械伤害感受。A.在来自WT或Par2-NaV1.8小鼠的DRG中PAR2和NaV1.8的免疫反应性的定位。白色箭头：在WT小鼠中共同表达PAR2和NaV1.8的神经元。黄色箭头：Par2-NaV1.8小鼠中表达NaV1.8但不表达PAR2的神经元。B.来自WT和Par2-Nav1.8小鼠的胰蛋白酶(100nm)-响应性DRG神经元(<25μm)的总数和数目。C-E.在WT和Par2-NaV1.8小鼠中，足底注射胰蛋白酶(C，Tryp)、NE(D)或CS(E)后的von Frey微丝退缩反应。F-K.在WT小鼠中，足底注射Dy4或Dy4无效(inact)(F-H，发动蛋白抑制剂)、PS2或PS2无效(J-K，网格蛋白抑制剂)或媒剂(Veh)，30分钟后足底胰蛋白酶(F，I)、NE(G，J)或CS(H，K)的von Frey微丝退缩反应。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。括号中的数字表示小鼠编号(N)。
图1A：蛋白酶引起的机械伤害感受。A.在来自WT或Par2-NaV1.8小鼠的DRG中，PAR2和NaV1.8的免疫反应性的定位。白色箭头：在WT小鼠中共同表达PAR2和NaV1.8的神经元。黄色箭头：Par2-NaV1.8小鼠中表达NaV1.8但不表达PAR2的神经元。B-D.在WT和Par2-NaV1.8小鼠中，足底注射胰蛋白酶(B，Tryp)、NE(C)或CS(D)后的von Frey退缩反应。E-F.在WT小鼠中，足底注射Dy4或Dy4无效(E-G，发动蛋白抑制剂)、PS2或PS2无效(H-J，网格蛋白抑制剂)，或媒剂(Veh)，30分钟后足底胰蛋白酶(E，H)、NE(F，I)或CS(G，J)的von Frey退缩反应。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。括号中的数字表示小鼠编号(N)。
图2：蛋白酶引起的伤害感受器的超兴奋性。经Dy4(A、B、D、F、发动蛋白抑制剂)、PS2(C、E和G，网格蛋白抑制剂)或媒剂对照(Con)预培育小鼠DRG神经元的基强度(rheobase)。神经元被胰蛋白酶(A-C)、NE(D，E)或CS(F，G)激发，洗涤，且在0或30分钟后测量基强度。A.代表性踪迹。Rh，基强度。B-G.平均响应。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。条形图中的数字表示神经元数(N)。
图2A：蛋白酶引起的伤害感受器的超兴奋性。经Dy4(A、B、D、F，发动蛋白抑制剂)、PS2(C、E、G，网格蛋白抑制剂)或缓冲液对照(Con)预培育的小鼠DRG神经元的基强度。神经元被胰蛋白酶(A-C)、NE(D，E)或CS(F，G)激发，洗涤，且在0或30分钟后测量基强度。A.代表性踪迹。Rh，基强度。B-G.平均响应。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。条形图中的数字表示神经元数(N)。
图3：蛋白酶引起的伤害感受器的超兴奋性的机制。经I-343(A-D，PAR2拮抗剂)、PD98059(E，MEK1抑制剂)或GF109203X(F，GFX，PKC抑制剂)预培育的小鼠DRG神经元的基强度。神经元被胰蛋白酶(A、E和F，Tryp)、NE(B，D)或CS(C)激发，洗涤，且在0或30分钟后测量基强度。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001。条形图中的数字表示神经元数(N)。
图4：伤害感受器中的PAR2内吞作用、βARR2募集和划分的信号传导A-C.内吞作用。A.胰蛋白酶(Tryp)对小鼠DRG神经元中的mPAR2-GFP分布的作用的代表性图像(n＝3次实验)。箭头(A，左)表示中核内体的PAR2-GFP。B，C.经胰蛋白酶、NE或CS(B)温育30分钟后或经Dy4或Dy4无效然后胰蛋白酶(C)预培育后的小鼠DRG神经元中mPAR2-GFP的胞质溶胶/质膜比率。D.暴露于胰蛋白酶、NE或CS的小鼠DRG神经元中的PAR2-RLuc8/βARR2-YFP BRET。AUC，曲线下面积(25min)，相对于对照*P<0.05。n，实验重复，一式三份的观察。E-J.划分的信号传导。胰蛋白酶对在质膜(E和F)和在胞质溶胶内(G)的PKC活性的影响，以及对大鼠DRG神经元的胞质溶胶(H和I)和核(J)中的ERK活性的影响：胰蛋白酶引起的质膜(E，F)处PKC的激活，但不激活胞质溶胶(G)处的PKC，以及大鼠DRG神经元的胞质溶胶(H和I)和核(J)中的ERK的激活。条形图中的数字表示神经元数(N)。与媒剂相比，*P<0.05，**P<0.01。
图5：HEK293细胞中的PAR2内吞作用和划分的ERK信号传导。A-D.内吞作用的BRET测定。PAR2-RLuc8/RIT-Venus BRET(A，C)和PAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRET(B，D)。E-K.胞质溶胶(E，G，H，J)和核(F，G，I，K)ERK活性的FRET测定。AUC，曲线下面积。相对于单独的胰蛋白酶，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.00001。n，实验重复，一式三份的观察。
图6：IBS-D引起的伤害感受器的超兴奋性。A-D.在暴露于来自HC和IBS-D受试者的结肠粘膜的活检组织的上清液后30分钟的小鼠伤害感受器的基强度。A.媒剂-或I-343-处理的神经元的代表性踪迹。B-D.经I-343(B，PAR2拮抗剂)、Dy4(C，发动蛋白抑制剂)或PD98059(D，MEK1抑制剂)预培育的神经元的平均响应。E.在HEK293细胞中的PAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRET，于经HC或IBS-D活检组织上清液或胰蛋白酶温育后60分钟测量。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns，不显著。条形图中的数字表示神经元数(N)。
图7：靶向伤害感受器核内体的PAR2。Cy5三部分的探针和mPAR2-GFP至小鼠DRG神经元的躯体(A)和神经突(B)的搬运的代表性图像(三次实验)。亮场图像中的比例尺(5μm)适用于同一行中的所有板，但“插入”除外，它是合并板中虚线框的放大倍数。箭头显示与包含mPAR2-GFP和Cy5-Chol的囊泡的接近度。
图8：内体PAR2的拮抗作用和伤害感受器的超兴奋性。A，B.小鼠DRG神经元的胰蛋白酶引起的超兴奋性。神经元经化合物10或媒剂(对照，con)预培育60分钟，洗涤，且恢复170或140分钟。将神经元随后暴露于胰蛋白酶(10min)。胰蛋白酶后0或30min和化合物10之后180min测量基强度。C.小鼠DRG神经元的IBS引起的超兴奋性。神经元经化合物10或媒剂(对照，con)预培育60分钟，洗涤，且恢复60分钟。将神经元随后暴露于HC或IBS-D上清液30分钟，洗涤并在30min(T 30min)、化合物10之后的120min测量基强度。*P<0.05，**P<0.01。形图中的数字表示神经元数(N)。
图9：结肠传入的敏化作用和结肠的伤害感受。A-H.在基线条件以及在接受域暴露于胰蛋白酶(A，B和E-H，Tryp)、NE(C和E)或CS(D和E)后，健康对照小鼠对2g VFF刺激结肠粘膜的机械感受响应。A.代表性的结果。B-D和F-H。平均响应。E.以基线百分比表示的响应。条形图中的数字表示传入数字。I和J.清醒正常小鼠中的对CRD的VMR。括号中的数字表示小鼠编号。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图10：蛋白酶和PAR2引起的伤害感受器的超兴奋性的机制。通过规范机制激活后，PAR2在质膜上发出信号以激活PKC，其介导初始的超兴奋性(1)。然后，PAR2经历网格蛋白-、发动蛋白-和βARR-依赖性的内吞作用(2)。PAR2继续通过βARR和Gαq介导的机制从核内体发出信号，以激活ERK，从而介导持续的超兴奋性。在通过偏向机制激活后，PAR2从质膜发出信号以激活腺苷酸环化酶(AC)和PKA，其介导初始和持续的超兴奋性(3)。激酶可调节TRP通道和电压门控离子通道的活性，从而控制伤害感受器超兴奋性(4)。
图11：功能性PAR2在DRG神经元和PAR2依赖性的炎症中的表达。A，B.胰蛋白酶(100nM)对WT(A)和Par2-NaV1.8(B)小鼠DRG神经元中的[Ca2+]i的作用。显示了25条神经元的踪迹；胰蛋白酶-响应性神经元的踪迹以红色显示。在WT小鼠中，神经元的20/65(31％)对胰蛋白酶作出响应。在Par2-NaV1.8小鼠中，神经元的3/51(6％)对胰蛋白酶作出响应。每组从4只小鼠中收集神经元。C.在WT和Par2-NaV1.8小鼠中，足底注射胰蛋白酶对爪子厚度的作用。***P<0.001，****P<0.0001。括号中的数字表示小鼠数。D.在WT和Par2-NaV1.8小鼠中，足底注射胰蛋白酶对嗜中性粒细胞浸润4小时的作用。箭头显示在WT小鼠中嗜中性粒细胞涌入。
图12：蛋白酶引起的机械伤害感受和水肿。A，B.足底注射Dy4或Dy4无效(A)、PS2或PS2无效(B)或媒剂(Veh)接着注射NE的同侧(左)爪后，对侧(右)爪的VFF退缩反应。C-H.同侧爪的厚度。通过足底注射进小鼠爪子将Dy4或Dy4无效(C，E，G)、PS2或PS2无效(D，F，H)或媒剂(Veh)给药。30min后，注射胰蛋白酶(Tryp)(C，D)、NE(E，F)或CS(G，H)。测量爪子厚度(水肿)。括号中的数字表示小鼠编号。
图13：内吞作用抑制剂和和基线伤害感受器的超兴奋性。经缓冲液对照(Con)、媒剂(Veh，0.3％DMSO)、Dy4(A)或PS2(B)预培育的小鼠DRG神经元的基强度。在洗涤后T 0min或T 30min测量基强度。条形图中的数字表示神经元数。
图14：PAR2拮抗剂I-343的表征。A.I-343结构。B-D.关于I-343对于2F-胰蛋白酶引起的IP1在HT-29(B)、HEK293(C)和KNRK-hPAR2(D)细胞中的的积聚的作用的浓度-响应分析。E.I-343对ATP引起的IP1 HEK细胞中的积聚的作用。n，实验重复，一式三份的观察。
图15：胰蛋白酶和凝血酶引起的伤害感受器的超兴奋性。经I-343(A，PAR2拮抗剂)或SCH79797(B，C，PAR1拮抗剂)预培育的小鼠DRG神经元的基强度。神经元被胰蛋白酶(A，C)或凝血酶(B)激发，洗涤，且0min后测量基强度。*P<0.05，**P<0.01。条形图中的数字表示神经元数。
图16：在HEK293细胞中的PAR2内吞作用。在HEK293细胞中，PAR2-RLuc8/RIT-VenusBRET(A，B，E，G)和PAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRET(C，D，F，H)。n，实验重复，一式三份的观察。
图17：在HEK293细胞中PAR2划分的ERK信号传导。在HEK293细胞中，胞质溶胶的(A-C，G，I，K)和细胞核(D-F，H，J，L)ERK活性的FRET测定。B，E.传感器定位。n，实验重复，一式三份的观察。
图18：在HEK293细胞中，PAR2、βARR1和Gαq至早期核内体的搬运。A，B.在HEK293细胞中，βARR1-RLuc8/Rab5a-Venus BRET(A)和Gαq-RLuc8/Rab5a-Venus BRET(B)。与媒剂相比*P<0.05，***P<0.001。n，实验重复，一式三份的观察。C.用媒剂或胰蛋白酶处理30分钟后的EEA1、Gαq和核内体的PAR2的定位。箭头显示胰蛋白酶处理的细胞EEA1、Gαq和核内体的PAR2的共同定位。
图19：在HEK293细胞中PAR2划分的PKC和cAMP信号传导。在HEK293细胞中，胞质溶胶的PKC(A，E和G)、质膜PKC(B，E和G)、胞质溶胶的cAMP(C，F和H)和质膜cAMP(D，F和H)的FRET测定。I-L.传感器定位。AUC，曲线下面积。与对照相比，*P<0.05，**P<0.01。n，实验重复，一式三份的观察。
图20：三部分的PAR2拮抗剂。A.使用三部分探针的靶向核内体的PAR2的主要成分。B.化合物10的三部分的PAR2拮抗剂的结构。C.关于I-343和化合物10对于2F引起的IP1在HT-29细胞内的积聚的作用的浓度-响应分析。
图21：结肠传入的敏化作用和结肠的依从性。A-D.暴露于TNBS后28天测得的小鼠的机械力学响应。在基线条件下、并在接受域暴露于胰蛋白酶(A，D，Tryp)、NE(B，D)或CS(C，D)后，用2g von Frey微丝刺激结肠粘膜。D.作为％基线的响应。条形图中的数字表示传入数字。E，F.在清醒的健康对照小鼠中的结肠依从性。压力/体积关系被蛋白酶鸡尾酒(E)或I-343(F)保持不变，这表明结肠的依从性没有变化。括号中的数字表示小鼠数。*P<0.05，**P<0.01。
具体实施方式
本文描述了与已知的PAR2调节剂最显著不同的一系列新化合物，因为它们包含特异性地控制抑制剂递送的部分。设计该部分是为了控制化合物跨肠腔的吸收以及化合物随后的全身暴露，或者是允许化合物的靶向递送。
在肠腔内起作用的非吸收性或非全身性药物已广泛用于治疗全身性代谢紊乱以及治疗胃肠道疾病和病症(Charmot，D.，Current Pharmaceutical Designs 2012，18，1434-1445)。非吸收性药剂也是有利的，因为它们使脱靶的全身作用最小化，从而提供有利的毒性特征，同时减少了副作用。可设想的是，本发明的化合物在治疗与不期望的PAR2活性有关的GI系统的疾病和病症中可能特别有用，所述疾病和病症包括但不限于胃肠动力、饮食引起的肥胖、炎性肠疾病、肠道易激综合征和与肠道易激综合征相关的疼痛。
全身性药剂的吸收通常通过在肠腔内衬的肠细胞内的被动或主动转运或通过细胞紧密连接的被动细胞旁路转运来进行。不希望受到理论的限制，并参考式(I)的化合物：
Figure BDA0002625731940000111
现已发现，在变量R4处添加某些基团限制了所得化合物的腔吸收，同时保持了对PAR2的抑制活性。这些基团包括但不限于-C1-C6烷基S(O)2OH、-1,2,3-三唑-1-乙酸、-NHR7、-双环[2.2.2]辛烷C(O)OR6、-C4-C8环烷基-R5、4-6元杂环或杂芳基基团，其被-C1-C6烷基-R5或-(CH2)2C(O)NHC2-C10烷基取代，其中所述C2-C10烷基被2至10个-NH2或-OH取代。
在另一个实施方案中，R4处的某些基团用作使本发明化合物至PAR2受体的靶向递送，所述PAR2受体已经被吞噬到早期核内体内。
已评估PAR2的内体信号传导在罹患肠道易激综合征(IBS)患者疼痛中的作用。在IBS患者的结肠粘膜和患有结肠炎的实验动物中激活的胰蛋白酶、弹性蛋白酶和组织蛋白酶S引起结肠传入的神经元持续的对机械刺激以及躯体机械触觉诱发痛的PAR2-依赖性的伤害感受器的超兴奋性、敏化作用。网格蛋白-和发动蛋白-依赖性的内吞作用的抑制剂以及有丝分裂原-活化的蛋白激酶激酶的抑制剂防止蛋白酶引起的超兴奋性、敏化作用和触诱发痛。然而，它们不影响弹性蛋白酶-或组织蛋白酶S引起的超兴奋性、敏化作用或触诱发痛。胰蛋白酶刺激PAR2内吞作用，其从核内体传导信号以激活细胞外信号调节激酶。弹性蛋白酶和组织蛋白酶S不会刺激PAR2的内吞作用，而PAR2是从质膜发出信号以激活腺苷酸环化酶。来自IBS患者的结肠粘膜的活检组织释放诱导持续PAR2-依赖性的伤害感受器的超兴奋性的蛋白酶，以及PAR2与δ-抑制蛋白的关联，其介导内吞作用。嵌入脂质锚(例如胆甾烷醇)的本发明化合物可促进化合物在含有PAR2的核内体中的递送和保留。本发明的化合物防止持续的胰蛋白酶和IBS蛋白酶引起的伤害感受器的超兴奋性。这些结果表明，来自核内体的PAR2信号传导是介导IBS慢性疼痛的持续伤害感受器的超兴奋性的基础。因此，内体PAR2信号传导抑制剂可以为IBS疼痛提供一种新颖的疗法。
如本文所用，术语“内体PAR2信号传导”是指由已经被内吞入内体、优选早期内体的激活的PAR2转导的信号。
如本文所用的术语“抑制内体PAR2信号传导”是指拮抗剂或PAR2抑制剂，其在受体被内吞进入内体后对受体起作用(或继续起作用)。
为了靶向内体PAR2信号传导，将本发明化合物制备为“三部分的化合物”，其包含以下部分：
Figure BDA0002625731940000121
其中
L为长度为1nm至50nm的接头部分；和
LA为促进所述化合物嵌入质膜的脂质锚。
如本文所用的术语“三部分的化合物”是指如本文所述的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其包含共价结合至接头基团的PAR2的抑制剂，接头基团共价结合至能够将PAR2的抑制剂锚定至细胞膜的脂质双层并最终锚定至早期内体膜的脂质锚。
如本文所用的术语“脂质锚”(LA)是指能够分割进脂质膜从而将式(I)的化合物锚定至脂质膜内的部分。脂质膜的分割可能直接发生在细胞外或囊腔空间，也可能发生在脂质双层的侧面。
在一个优选的实施方案中，脂质锚的特征壳在于其分割脂质膜的能力，从而所述脂质膜的特征在于在4℃、在非离子清洁剂中的不溶性。
适合的脂质锚的实例包括但不限于胆固醇、胆甾烷醇、鞘脂、GPI-锚或饱和脂肪酸衍生物。在本领域中已经在例如WO2005/097199中描述了许多此类脂质锚，WO2005/097199的全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，脂质锚选自式(IIa)、(IIIa)、(IIIa-2)和(IVa)的部分：
Figure BDA0002625731940000131
其中
R1a为任选取代的C1-12烷基、烯基、炔基或烷氧基基团；
R2a和R3a、R3b、R4b、R4c、R5a、R6a、R7a、R7b、R8a、R8b、R9a、R9b、R10a、R11a、R11b、R12a、R12b、R13a、R14a、R15a、R15b、R16a和R16b独立地为H、C1-3烷基、羟基、C1-3烷氧基或氨基；或
任选地，R3a、R3b和/或R4b、R4c和/或R7a、R7b和/或R8a、R8b和/或R11a、R11b和/或R12a、R12b和/或R15a、R15b和R16a、R16b一起得到＝O(通过双键与氧连接)；
R4a为C、O、NH或S；
Figure BDA0002625731940000141
表示单键或双键；或
其药学上可接受的盐。
在其它实施方案中，脂质锚选自式(Va)、(VIa)、(VIIa)或(VIIIa)的部分：
Figure BDA0002625731940000142
其中
R4如上文所述；
表示单键或双键；
Figure BDA0002625731940000144
表示单键、双键或叁键；
R5每次出现时独立地为-NH-、-O-、-S-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-NHCONH-、-NHC(O)O-或-NHS(O2)-；
R6每次出现时独立地为C14-30烷基基团，其任选地被氟取代、优选地被1至4个氟原子取代；
R7每次出现时独立地为NH2、NHCH3、OH、H、卤素或O，其前提是当R7为NH2、NHCH3、OH、H或卤素时则
Figure BDA0002625731940000145
为单键，且当R7为O时则
Figure BDA0002625731940000146
为双键；
R8每次出现时独立地为H、OH或当
Figure BDA0002625731940000147
表示叁键时R8不存在；
R9为C10-30烷基基团，其任选地被氟取代、优选地被1至4个氟原子取代；和
R10每次出现时独立地为C24-40亚烷基基团、C24-40亚烯基或C24-40亚炔基基团，其任选地被氟取代、优选地被1至4个氟原子取代；或
其药学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，脂质锚选自式(IXa)或(Xa)的部分：
Figure BDA0002625731940000151
其中
Figure BDA0002625731940000152
表示单键或双键；
Figure BDA0002625731940000153
表示单键、双键或叁键；
R13每次出现时独立地为-O-或-CO(CH2)a(CO)bO-，其中a为整数1至3，且b为整数0至1；
R14为-O-或-OC(O)-；
R15每次出现时独立地选自C16-30烷基基团，其任选地被氟取代、优选地被1至4个氟原子取代；
R16为-PO3 -CH2-、-SO3CH2-、-CH2-、-CO2CH2-或直接键；
R17为-NH-、-O-、-S-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-NHCONH-、-NHC(O)O-或-NHS(O2)-；
R18为NH2、NHCH3、OH、H、卤素或O；
R19为C16-30烷基基团，其任选地被氟取代、优选地被1至4个氟原子取代；和
R20各自为C(O)C13-25烷基基团，其任选地被以下式的基团取代：
Figure BDA0002625731940000154
其中
Figure BDA0002625731940000155
为单键或双键；
R21为-PO3 -CH2-、-SO3CH2-、-CH2-、-CO2CH2-或直接键；
R22为-NH-、-O-、-S-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-NHCONH-、-NHC(O)O-或-NHS(O2)-；
R23为-O-或-OC(O)-；
R24每次出现时独立地选自C16-30烷基基团，其任选地被氟取代、优选地被1至4个氟原子取代；
R25为-CO(CH2)a(CO)bO-或-CO(CH2)a(CO)bNH-，其中a为整数1至3，且b为整数0至1；和
R26为C4-20烷基基团，其任选地被氟取代、优选地被1至4个氟原子取代；或
其药学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，脂质锚选自式(XIa)、(XIIa)、(XIIIa)或(XIVa)的部分：
Figure BDA0002625731940000161
其中
R27每次出现时独立地选自-NH-、-O-、-NH(CH2)cOPO3 --、-NH(CH2)cSO2NH-、-NHCONH-、-NHC(O)O-、-CO(CH2)b(CO)aNH-、-CO(CH2)b(CO)aO-、-CO(CH2)bS-、-CO(CH2)bOPO3 --、-CO(CH2)bSO2NH-、-CO(CH2)bNHCONH-、-CO(CH2)bOCONH-、-CO(CH2)bOSO3-或-CO(CH2)bNHC(O)O-，其中a为整数0至1，b为整数1至3，且c为整数2至3；
R28每次出现时独立地为-CH2-或-O-；
R29每次出现时独立地选自H或C16-30烷基基团，其任选地被氟取代、优选地被1至4个氟原子取代；
R31每次出现时独立地选自H或C1-15烷基基团，其任选地被氟取代、优选地被1至4个氟原子取代，或C1-15烷氧基基团，其任选地被氟取代、优选地被1至4个氟原子取代；和
n为整数1至2；或
其药学上可接受的盐。
在更进一步的实施方案中，脂质锚部分为C10-20烷基(例如，C16烷基)。
如本文所用，术语“接头”涉及将PAR2抑制剂连接至脂质锚的化合物的部分。应当理解的是，应当选择接头，使得其在配体结合位点不与PAR2抑制剂竞争。接头也不应分隔该脂质膜。
接头基团的长度应在1nm至50nm之间，以使脂质锚在锚定于内体膜中时与PAR2抑制剂相互作用。
在一个实施方案中，接头基团将包含一个或多个聚乙二醇单元。在另一个实施方案中，设想接头接头的亚单元可为氨基酸残基、衍生化或官能化的氨基酸残基、聚醚，脲、氨基甲酸酯、磺酰胺或在PAR2抑制剂和脂质锚之间提供足够距离而不会干扰任何基团的功能的其它亚单元。
在一个实施方案中，所述接头表示为式(XVa)的部分：
Figure BDA0002625731940000171
其中
Z为所述接头和所述脂质锚之间的连接基团，且为-C1-C10烷基-、-C2-C10烯基-、-C2-C10炔基-、-C1-C10烷基C(O)-、-C2-C10烯基C(O)-或-C2-C10炔基C(O)-；
或
Z与其相邻的胺一起为任选地C-末端改性的(例如，C-端被酰胺化或C-端为酰基肼(例如，
Figure BDA0002625731940000181
)氨基酸，所述氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸；其中所述氨基酸通过其侧链官能团连接至所述脂质锚；
m为1或2；
n为1至20；和
p为1至8；或
其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述接头表示为式(XVa)的部分：
Figure BDA0002625731940000182
其中
Z为所述接头和所述脂质锚之间的连接基团，且为-C1-C10烷基-、-C2-C10烯基-、-C2-C10炔基-、-C1-C10烷基C(O)-、-C2-C10烯基C(O)-或-C2-C10炔基C(O)-；或
Z与其相邻的胺一起为任选地C-末端酰胺化的氨基酸，所述氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸；其中所述氨基酸通过其侧链官能团连接至所述脂质锚；
m为1或2；
n为1至20；和
p为1至8；或
其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，所述接头表示为式(XVIa)的部分：
Figure BDA0002625731940000183
其中
R11每次出现时独立地为为天然存在的、衍生化或功能化的氨基酸残基的任何侧链；
m为整数3至80；和
n为整数0至1；或
其药学上可接受的盐。
在其它实施方案中，所述接头表示为式(XVIIa)的部分：
Figure BDA0002625731940000191
其中
m为整数0至40；
n为整数0至1；
o每次出现时独立地为整数1至5；
R11每次出现时独立地为为天然存在的、衍生化或功能化的氨基酸残基的任何侧链；和
其中所述SO2末端与脂质锚连接。
在进一步的实施方案中，所述接头表示为式(XVIIIa)的部分：
Figure BDA0002625731940000192
其中
m为整数0至40；
n为整数0至1；
o每次出现时独立地为整数1至5；
R12各自独立地为NH或O；
R11每次出现时独立地为天然存在的、衍生化或功能化的氨基酸残基的任何侧链；以及
其中所述C(O)-末端与脂质锚连接，且R12-末端与内体PAR2信号传导的抑制剂连接。
WO2005/097199中已经描述了许多适合的接头部分，其全部内容通过引用并入本文。
在本说明书中，使用了本领域技术人员众所周知的许多术语。然而，为了清楚起见，将定义许多术语。
单独使用或在复合词中使用的如本文所用的术语“烷基”表示直链或支链烷基。前缀例如“C1-12”用于表示烷基基团内的碳原子数(在这种情况下为1至12)。直链和支链烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、己基、庚基、5-甲基庚基、5-甲基己基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基和二十二烷基(C22)。
单独使用或在复合词中使用的术语“烯基”，表示含有至少一个碳碳双键的直链或支链烃残基，包括先前定义的烯键式单、双或多不饱和烷基基团。前缀例如“C2-12”用于表示烯基基团内的碳原子数(在这种情况下为2至12)。烯基的实例包括乙烯基、烯丙基、1-甲基乙烯基、丁烯基、异丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、1-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基、3-壬烯基、1-癸烯基、3-癸烯基、1,3-丁二烯基、1,4-戊二烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基和5-二十二烯基(C22)。
单独使用或在复合词中使用的术语“炔基”表示含有至少一个碳碳叁键的直链或支链烃残基。前缀例如“C2-C10”用于表示烯基基团内的碳原子数(在这种情况下为2至10)。
如本文所用，术语“芳基”表示任选取代的单环或稠合多环芳族碳环(具有环原子均为碳的环结构)，每个环优选具有5至12个原子。芳基基团的实例包括单环基团例如苯基，稠合多环基团例如萘基等。
如本文所用，术语“杂芳基”表示单环或双环，通常每个环中最多具有7个原子，其中至少一个环是芳族的并且含有1-4个选自O、N和S的杂原子。在该定义范围内的杂芳基基团包括但不限于：苯并咪唑、吖啶基、咔唑基、噌啉基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、异噁唑基、吲哚基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、1H-1,2,3-三唑、2H-1,2,3-三唑、1H-1,2,4-三唑和四氢喹啉。
如本文所用，单独使用或在复合词中使用的术语“杂环”或“杂环基”表示含有至少一个选自O、N和S的杂原子的饱和或部分不饱和的单环、双环或稠合多环体系。前缀例如“C4-C8”用于表示基团的环状部分内的碳原子数(在这种情况下为4至8)。“杂环”包括上述杂芳基基团的二氢和四氢类似物。适合的取代基的实例包括但不限于吡咯啉、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吡唑啉、吡唑烷、咪唑烷、四氢呋喃、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、二噁烷、噁唑啉、吗啉、硫代吗啉、四氢噻吩、氧硫杂环己烷、二噻烷、4H-1,2,3-三唑和二噻嗪，它们各自可进一步被1-3个取代基取代。
本文所用的术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
术语“氧代”表示与相邻碳原子二价键合的氧原子。将理解的是，当“R”变量为氧代时，由于氧代的二价性质，在环状结构中隐含于相邻碳原子的氢原子将不存在。
在整个本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”和变体例如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”将被理解为暗示包括所陈述的整数或整数组或步骤，但并非排除任何其它整数或整数组。
在本说明书中，对任何先前的出版物(或从其衍生的信息)的引用，或对已知的任何事物的引用，都不是也不应该被视为承认、接受或以任何形式暗示该先前的出版物(或从其衍生的信息)或已知事物形成本说明书所涉及投身领域中的公知常识的一部分。
在本发明的一些优选的实施方案中，并参考通式(I)，适用以下一种或多种优选方案：
a)R1为H、C1-C6烷基或卤素。
b)R1为卤素。
c)R1为氟。
d)R2为C1-C6烷基、C3-C6环烷基或C1-C6芳基，其各自任选地被1至3个卤素取代。
e)R2为C4烷基。
f)R2为叔丁基。
g)R3为氧代或C1-C6烷基，且p为整数0至3。
h)R3为C1-C6烷基且p为2。
i)R3为甲基且p为2。
j)R4为-C1-C6烷基S(O)2OH、-1,2,3-三唑-1-乙酸、-NHR7、-双环[2.2.2]辛烷C(O)OR6、-C4-C8环烷基-R5、4-6元杂环或杂芳基基团，其被-C1-C6烷基-R5或-(CH2)2C(O)NHC2-C10烷基取代，其中所述C2-C10烷基被2至10个-NH2或-OH取代。
k)R5为-C(O)NHR7或-NHC(O)R7；
i)R6为H或R7
j)R7为-R8、-C1-C20烷基、-C1-C20烷基C(O)NH2或-C1-C20烷基C(O)NR8，其中所述-C1-C20烷基、-C1-C20烷基C(O)NH2和-C1-C20烷基C(O)NR8任选地被2至10个-NH2或-OH取代，且其中所述烷基基团中的一个或多个碳原子任选地被氮或氧替代。
k)R7为-C1-C20烷基、-C1-C20烷基C(O)NH2或-C1-C20烷基C(O)NR8，其中所述-C1-C20烷基、-C1-C20烷基C(O)NH2和-C1-C20烷基C(O)NR8任选地被2至10个-NH2或-OH取代，且其中所述烷基基团中的一个或多个碳原子任选地被氮或氧替代。
l)R7为-R8。
m)R8表示为下式：
Figure BDA0002625731940000221
其中
L为长度为1nm至50nm的接头部分；和
LA为促进所述化合物嵌入质膜的脂质锚
n)LA为选自以下的脂质锚：胆固醇、胆甾烷醇、鞘脂、GPI-锚或饱和脂肪酸衍生物。
o)LA为选自以下的脂质锚：式(IIa)、(IIIa)、(IVa)、(Va)、(VIa)、(VIIa)、(VIIIa)、(IXa)、(Xa)、(XIa)、(XIIa)、(XIIIa)和(XIVa)的部分。
p)LA为选自以下的脂质锚：式(IIa)或(IIIa)的部分。
q)L为包含1个或多个亚单元的接头部分，所述亚单元包含聚乙二醇单元、氨基酸残基、衍生化或功能化的氨基酸残基、聚醚、尿素、氨基甲酸酯和/或磺酰胺。
r)L为接头部分，其表示为式(XVa)、(XVIa)、(XVIIa)或(XVIIIa)。
s)L为接头部分，其表示为式(XVa)。
在优选的实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐选自：
Figure BDA0002625731940000231
Figure BDA0002625731940000241
Figure BDA0002625731940000251
应该理解，本发明化合物可以一种或多种立体异构形式(例如，非对映异构体)存在。本发明在其范围内包括所有这些立体异构体形式，它们是分离的(例如，于对映异构体分离中)或组合的形式(包括外消旋混合物和非对映异构混合物)。
因此，本发明还涉及相对于不对称手性中心为基本上纯的立体异构形式的化合物，例如大于约90％的非对映异构体过量(de)，例如约95％至97％的de，或大于99％的de，及其混合物，包括其外消旋的混合物。这样的非对映异构体可以通过不对称合成来制备，例如使用手性中间体，，或者可以通过常规方法，例如色谱法或使用拆分剂来拆分混合物。
本发明考虑使用L和D形式的氨基酸，包括使用独立地选自L和D形式的氨基酸，例如，当肽包含两个丝氨酸残基时，每个丝氨酸残基可以具有相同或相反的绝对立体化学。除非另有说明，否则氨基酸被认为是L-构型。
当化合物包含一个或多个可以被质子化或去质子化(例如在生理pH下)的官能团时，该化合物可以被制备和/或分离为药学上可接受的盐。应当理解的是，该化合物在给定的pH下可以是两性离子的。如本文所用，表述“药学上可接受的盐”是指给定化合物的盐，其中所述盐适合作为药物给药。这样的盐可以例如通过酸或碱分别与胺或羧酸基团的反应形成。
药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸和有机酸制备。无机酸的实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。有机酸的实例包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
药学上可接受的碱加成盐可以由无机和有机碱制备。衍生自无机碱的相应抗衡离子包括钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。有机碱包括伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)和环胺，包括异丙胺、三甲基胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、三甲胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶和N-乙基哌啶。
酸/碱加成盐倾向于比相应的游离酸/碱形式更易溶于水性溶剂。
本发明化合物可以是晶体形式或作为溶剂合物(例如水合物)，且目的是这两种形式均在本发明的范围内。术语“溶剂合物”是由溶质(在本发明中，本发明的肽)和溶剂形成的可变化学计量的复合物。此类溶剂不应干扰溶质的生物活性。溶剂可为例如水、乙醇或乙酸。溶剂化方法是本领域公知的。
本发明化合物可以是前药形式。术语“前药”以其最广泛的含义使用，并且包括在体内转化为本发明化合物的那些衍生物。这样的衍生物对于本领域技术人员而言将是容易想到的，并且包括例如其中游离羟基被转化成酯衍生物或环氮原子被转化成N-氧化物的化合物。酯衍生物的实例包括烷基酯(例如乙酸盐，乳酸盐和谷氨酰胺)、磷酸酯和由氨基酸形成的那些(例如缬氨酸)。作为本发明化合物的前药的任何化合物都在本发明的范围和精神内。用于制备根据本发明的适合的前药的常规方法在教科书中描述，例如"Design ofProdrugs"Ed.H.Bundgaard，Elsevier，1985，其全部内容引入本文作为参考。
在本发明的一个实施方案中，提供一种抑制PAR2信号传导的方法，其包括将PAR2与如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐接触。将系统暴露于所述化合物或其药学上可接受的盐可在体外、离体或体内发生。
例如，在细胞暴露于体外或离体的情况下，本发明的方法可用作生物学研究的工具或确定某些化合物(单独或组合使用)调节受试者的PAR2活性的功效的诊断工具。例如，可从受试者中去除表达PAR2的细胞，并将其暴露于一种或多种本发明的化合物或其盐。通过本领域技术人员已知的方法，(一种或多种)化合物调节PAR2活性的能力可通过测量许多下游标记中的任何一种来评估。因此，可能能够确定某种化合物是否比另一种更有效，并针对该受试者调整具体的治疗方案。
在优选的实施方案中，提供一种预防或治疗由PAR2信号传导介导的疾病或病症的方法，其包括向有此需要的受试者给药有效量的如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
在特别优选的实施方案中，本发明提供预防或治疗由内体PAR2信号传导介导的疾病或病症的方法，其包括向有此需要的受试者给药有效量的如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一个优选的实施方案中，提供如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其用于预防或治疗由PAR2信号传导介导的疾病或病症。
在进一步的优选的实施方案中，提供如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其用于预防或治疗由内体PAR2信号传导介导的疾病或病症。
在另一个优选的实施方案中，提供如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗由PAR2信号传导介导的疾病或病症。
另一种优选涉及如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗由内体PAR2信号传导介导的疾病或病症。
本文所用的术语“治疗”(treatment)和“治疗的”(treating)涵盖对动物，优选哺乳动物，更优选对人的病况或疾病的任何治疗，并且包括其中对PAR2信号传导的抑制是有益的任何疾病或病症的治疗。本文所用的术语“预防”(prevention)和“预防的”(preventing)包括预防动物，优选哺乳动物，更优选人的病况或疾病，并且包括其中对PAR2信号传导的抑制是有益的任何疾病或病症的预防。
在优选的实施方案中，预防或治疗方法包括对患有疾病或病症、具有疾病或病症的症状、易患疾病或病症的受试者给药根据本发明化合物或其药学上可接受的盐的步骤，所述疾病或病症与本文所述的不期望的PAR2活性相关，所述方法的目的是为了治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、增进或影响疾病或病症、疾病或病症的症状或对疾病或病症的易感性。预防性治疗可以减少与不良PAR2活性相关的疾病或病症的发生。
本发明的预防或治疗方法还可包括向患有疾病或病症、具有疾病或病症的症状、易患疾病或病症的受试者给药根据本发明化合物或其药学上可接受的盐的组合，所述疾病或病症与本文所述的不期望的PAR2活性相关，所述方法的目的是为了治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、增进或影响疾病或病症、疾病或病症的症状、或对疾病或病症的易感性。预防性治疗可以减少与不良PAR2活性相关的疾病或病症的发生。在一些实施方案中，与仅利用本发明化合物或其药学上可接受的盐之一的预防或治疗方法相比，本发明化合物或其药学上可接受的盐的组合可提供对PAR2活性的增强抑制。
本领域技术人员还应理解，本文所述的预防或治疗方法可以与本领域目前采用的其它治疗方式以多种组合使用。
本领域技术人员可通过本领域已知的诊断或预后测定的任何一项或组合来鉴定其中PAR2表达和/或活性增加以及希望降低所述活性的病况。可分析从受试者获得的生物样品(例如，血液、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊髓液、脂肪组织、脑组织和/或源自其的细胞)的PAR2表达和/或活性。这些病况包括但不限于，急性和慢性炎性病症、肿瘤转移、胃肠动力、疼痛、痒、皮肤病症例如特应性皮炎、饮食引起的肥胖、哮喘、类风湿性关节炎、牙周炎、炎性肠疾病、肠道易激综合征、癌症、纤维化疾病、代谢功能紊乱和神经疾病。
在本发明的上下文中，术语“疼痛”包括慢性炎症性疼痛(例如，与类风湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风性关节炎和青少年关节炎相关的疼痛)；肌肉骨骼疼痛、下背部和颈部疼痛，扭伤和劳损、神经性疼痛、交感神经维持性疼痛、肌炎、与癌症和纤维肌痛相关的疼痛、与偏头痛相关的疼痛、与丛集性和慢性每日头痛相关的疼痛、与流感或其它病毒感染相关的疼痛，例如普通感冒、风湿热，与功能性肠病相关的疼痛，例如非溃疡性消化不良、非心脏性胸痛和肠道易激综合征，与心肌缺血相关的疼痛、术后疼痛、头痛、牙痛、痛经、神经痛、纤维肌痛综合征、复杂的区域性疼痛综合征(I型和II型CRPS)、神经性疼痛综合征(包括糖尿病性神经病变、化疗法诱发的神经性疼痛、坐骨神经痛、非特异性下背部疼痛、多发性硬化症疼痛、HIV相关的神经病、疱疹后神经痛、三叉神经痛)和因身体外伤、截肢、癌症、毒素或慢性炎症引起的疼痛。在优选的实施方案中，所述疼痛是躯体疼痛或内脏疼痛。
在优选的实施方案中，本发明提供预防或治疗与肠道易激综合征相关的疼痛的方法，其包括向有此需要的受试者给药有效量的如本文所定义的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。
应认为上述方法适用于任何物种的预防和治疗，所述物种包括但不限于所有哺乳动物，包括人类、犬科、猫科、牛、马、猪、绵羊、大鼠和小鼠，以及鸡、鸟类、爬行动物和低等生物，例如细菌。
本发明还提供药物组合物，其包含治疗有效量的如上所定义的化合物或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
术语“组合物”旨在包括以包封材料作为载体的活性成分的制剂，以形成胶囊，其中活性成分(具有或不具有其它载体)被载体包围。
尽管上文描述的化合物或其药学上可接受的盐可为在临床上给药受试者的的唯一活性成分，但是将其它活性成分与该化合物一起给药也在本发明的范围内。在一个或多个实施方案中，设想将两种或更多种本发明化合物的组合向受试者给药。设想化合物还可以与一种或多种其它治疗剂组合给药。组合可允许将上文所述的化合物与其它活性成分分开、依次或同时给药。该组合可以以药物组合物的形式提供。
如本文所用，术语“组合”是指组合物或试剂盒，其中如上定义的组合伴侣可不独立地或独立地给药，或通过使用不同量的固定组合以及不同量的组合伴侣来给药，即同时或在不同的时间点给药。然后可以将组合伴侣同时或按时间顺序交错给药，即对于试剂盒的任何部分，可在不同的时间点以相等或不同的时间间隔进行给药。例如，为了应付待治疗的患者亚群的需求或满足单个患者的需求(不同的需求可取决于患者的年龄、性别、体重等)，可以改变组合中要给药的组合伴侣的总量的比率。
如本领域技术人员将容易理解的，给药途径和药学上可接受的载体的性质将取决于病况的性质和待治疗的受试者。据信，本领域技术人员可以容易地确定特定载体或递送系统的选择以及给药途径。在制备含有活性化合物的任何制剂时，应注意确保化合物的活性在过程中不被破坏，并且该化合物能够在不被破坏的情况下达到其作用部位。在某些情况下，可能有必要通过本领域已知的方法(例如微囊化)来保护化合物。同样，选择的给药途径应使化合物达到其作用部位。
本领域技术人员可以使用常规方法容易地确定用于本发明化合物的适合制剂。优选的pH范围和适合的赋形剂(例如抗氧化剂)的鉴定是本领域常规的。缓冲液体系通常用于提供所需范围的pH值，并包括羧酸缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐和琥珀酸盐。多种抗氧化剂可用于这种制剂，包括酚类化合物例如BHT或维生素E，还原剂例如甲硫氨酸或亚硫酸盐，以及金属螯合剂例如EDTA。
设想当本发明化合物被设计成控制化合物在肠腔中的吸收以及随后化合物的全身暴露时，优选的给药途径是口服或肠内给药。对于本发明的口服和肠内制剂，可将活性化合物与稀释剂或与可同化的食用载体一起配制，或者可以将其封入硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可以将其压制成片剂，或者可以将其直接与饮食中的食物结合。对于口服治疗性给药，可将活性化合物与赋形剂结合并以可摄入片剂、颊或舌下片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、薄片剂等形式使用。在此类治疗有用的组合物中活性化合物的量使得将获得适合的剂量。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可包含以下所列的成分：粘合剂，例如树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；还可添加甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精，或调味剂，例如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当剂量单位形式为胶囊时，除上述类型的材料外，它还可包含液体载体。各种其它材料可以作为包衣存在或以其它方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者包衣。糖浆或酏剂可包含活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂，例如樱桃或橙子调味剂。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应是药学上纯的，并且在使用量上基本上是无毒的。另外，可以将本发明化合物掺入持续释放的制剂和剂型中，包括允许将活性肽特异性递送至肠道的特定区域的制剂。
液体制剂也可以通过胃或食道管经肠内给药。肠溶制剂可以通过与适当的基质，例如乳化基质或水溶性基质混合而制成栓剂形式。
设想当打算将本发明化合物靶向递送至内吞的PAR2时，优选的给药途径是肠道外给药。上文所述的化合物或其药学上可接受的盐可以以肠道外剂型制备，包括适合用于静脉内、鞘内和脑内或硬膜外递送的剂型。适用于注射用途的药物形式包括无菌注射溶液或分散液，以及用于临时制备无菌注射溶液的无菌粉末。它们在生产和储存条件下应该是稳定的，且可保存下来以防还原或氧化以及微生物例如细菌或真菌的污染作用。
用于注射溶液或分散液的溶剂或分散介质可以包含用于活性化合物的任何常规溶剂或载体体系，且可包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物以及植物油。例如，可以通过使用包衣卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。必要时可以通过添加各种抗菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用，所述抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括调节渗透压的试剂，例如糖或氯化钠。优选地，用于注射的制剂将与血液等渗。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可使可注射组合物的吸收延长。适用于注射用途的药物形式可通过任何适合的途径递送，包括静脉内、肌内、脑内、鞘内、硬膜外注射或输注。
无菌注射溶液是通过将所需量的本发明化合物与适当的溶剂以及各种其它成分(例如以上列举的那些成分)掺合而制得的，然后根据需要进行过滤灭菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒剂中来制备分散体，所述无菌媒剂含有基本分散介质和以上列举的那些所需的其它成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥或冻干活性成分和任何其它所需成分的先前无菌过滤的溶液。
本发明化合物也可能但不是必须地以局部、鼻内、阴道内、眼内等方式给药。本发明化合物还可以通过从加压的分配器或容器中以喷雾形式吸入来给药，所述分配器或容器中包含推进剂，例如二氧化碳气体、二氯二氟甲烷、氮气、丙烷或其它适合的气体或气体组合。化合物也可以使用喷雾器给药。
药学上可接受的媒剂和/或稀释剂包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充活性成分也可以掺入组合物中。
为了易于给药和剂量均匀，以剂量单位形式配制组合物是特别有利的。本文所用的剂量单位形式是指物理上离散的单位，其适合作为待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量；每个单位均包含预定量的活性物质，经计算可产生所需的治疗效果，并与药学上可接受的媒剂结合。本发明的新颖剂量单位形式的规范由以下决定并直接取决于：(a)活性物质的独特特性和要实现的特定治疗效果，以及(b)如本文所详细公开的，在患有其中身体健康受损的疾病病况的活体受试者中，用于治疗疾病的复合活性材料领域中固有的局限性。
如上所述，主要活性成分可以以适合的剂量单位形式、以治疗有效量与药学上可接受的媒剂复合以方便和有效地给药。单位剂型可以例如包含范围为0.25μg至约2000mg的量的主要活性化合物。以比例表示，活性化合物可以以载体的约0.25μg至约2000mg/mL存在。在含补充活性成分的组合物的情况下，所述剂量通过参考所述成分的常规剂量和给药方式来确定。
如本文所用，术语“有效量”是指当根据期望的给药方案给药时，提供期望的治疗活性的化合物的量。在这些期间中的任何一个期间内，给药可以进行一次，或间隔数分钟或数小时，或连续进行。适合的剂量可以在以下范围内：每剂量约0.1ng/kg体重至1g/kg体重。典型的剂量范围为每剂量1μg至1g/kg体重，例如范围为每剂量1mg至1g/kg体重。在一个实施方案中，剂量的范围可为每剂量1mg至500mg/kg体重。在另一个实施方案中，剂量的范围可为每剂量1mg至250mg/kg体重。在另一个实施方案中，剂量的范围可为每剂量1mg至100mg/kg体重，例如多至每剂量50mg/体重。
在以下通用方案、以下通用合成程序以及合成中间产物的具体实施方案中概述了合成式(I)的化合物的通用策略。
Figure BDA0002625731940000321
通用方案1
通用合成程序：
通用程序1：酰胺的形成A
在添加HBTU或HATU(1.1至1.5当量)、相应的胺(1.1-1.2当量)和DIPEA(2.5至3.5当量)之前，将适当的羧酸(1.0当量)溶解在DMF或DMSO(0.15至0.3M)中。在室温搅拌混合物45分钟至16小时。可采用以下任何一种后处理程序：
1)添加水，将固体过滤并洗涤，得到所需产物；或
2)将水与EtOAc一起添加，并分离各相。将有机相用水和盐水(1:1混合物)另洗涤两次，用MgSO4干燥，过滤并减压蒸发。产物在硅胶和/或制备型HPLC上提纯。
通用程序2：酰胺的形成B
在添加PyBOP或PyOxim(1.1至1.5当量)之前，将适当的羧酸(1.0当量)、相应的胺(1.1-1.2当量)和DIPEA(2.5至3.5当量)溶解在DMF或DMSO(0.15至0.3M)中。在室温搅拌混合物45分钟至16小时。
1)添加水，将固体过滤并洗涤，得到所需产物；或
2)将水与EtOAc一起添加，并分离各相。将有机相用1M HCl洗涤两次，然后用饱和碳酸氢盐溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤并减压蒸发。产物在硅胶和/或制备型HPLC上提纯。
通用程序3：固相A
NH2-PEG12-Asp(OChol)-树脂：通过在
Figure BDA0002625731940000331
TGR R树脂(NovaBiochem，载量为0.18mmol/g)上采用标准Fmoc化学方法手动肽合成，制备间隔基-脂质缀合物。在二氯甲烷(DCM)中的Fmoc-Asp(OChol)-OH(1.5当量)与(1H-苯并三唑-1-基氧基)(三-1-吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyBOP，2当量)的偶联用二异丙基乙胺(DIPEA，3当量)原位活化3小时。使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％哌啶实现Fmoc脱保护。Fmoc-PEG12-OH(2当量)通过DCM中的PyBOP(2当量)和DIPEA(3当量)与树脂结合的NH2-Asp(OChol)偶联。使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％哌啶实现Fmoc脱保护。最终脱保护后，将拮抗剂偶联至树脂上的间隔基-脂质缀合物。用DCM中的PyBOP(2当量)和DIPEA(3当量)，将酸(2-3当量)与树脂结合的NH2-PEG12-Asp(OChol)-树脂(250mg)偶联过夜。然后使用95％的三氟乙酸从树脂上切割构建体，并通过反相高效液相色谱(HPLC)(Phenomenex Luna C8柱，Lane Cove，澳大利亚)提纯，其中0.1％TFA/H2O和0.1％TFA/ACN为溶剂，得到脂化的拮抗剂，为粘稠油状物。
通用程序4：固相合成与拮抗剂的脂质缀合物
拮抗剂-PEG-间隔基-Asp(OChol)-树脂：使用通用程序11中所述的标准偶联方案，合成与拮抗剂、氨基酸和粘酸缀合的间隔基-脂质(PEG2-12)。然后按照通用程序11中所述的方法切割和提纯完成的脂质缀合物。
下面概述了合成三部分式(I)化合物的脂质锚(LA)基团的一般策略。
在文献中描述了合成胆甾醇基乙醇酸、3-胆甾醇基胺和胆甾醇基甘氨酸(Hussey，S.L.等人，J.Am.Chem.Soc.2001，123，12712-12713；Hussey，S.L.等人，Org.Lett.2002，4，415-418；Martin，S.E.等人，Bioconjugate Chem.2003，14，67-74)。在类固醇结构的3位具有酰胺、磺酰胺、脲或氨基甲酸酯官能团的式(IIIa)的脂质锚可由3-胆甾醇基胺制备，例如，可以使3-胆甾醇基胺与琥珀酸酐在DMAP的存在下反应得到相应的琥珀酰基取代的化合物。相应的磺酰胺可通过使3-胆甾醇基与氯磺酰基乙酸反应而获得，氯磺酰基乙酸可如文献(Hinman，R.L.and Locatell，L.J.Am.Chem.Soc.1959，81，5655-5658)所述进行制备。可根据文献程序通过相应的异氰酸酯制备相应的脲或氨基甲酸酯(Knolker，H.-J.T.等人，Angew.Chem.Int.Ed.1995，34，2497；Knolker，H.-J.等人，Synlett 1996，502；Knolker，H.-J.and.Braxmeier，T.Tetrahedron Lett.1996，37，5861)。可如文献中所述制备在类固醇结构的3位上具有磷酸酯或羧基甲基化的磷酸酯的化合物(IIIa)的中间体(Golebriewski，Keyes，Cushman，Bioorg.Med.Chem.1996，4，1637-1648；Cusinato，Habeler等人，J.LipidRes.1998，39，1844-1851；Himber，Missano等人，J.Lipid Res.1995，36，1567-1585)。可如文献(J.G.Parkes，J.G.等人，Biochim.Biophys.Acta 1982，691，24-29)中所述制备在类固醇结构的3位具有硫醇的式(IIIa)的脂质锚，相应的羧基甲基化的硫醇可通过对相应的胺和醇所述的简单的烷基化而获得。可如文献(Lapiene，J.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2004，14，151-155)中所述制备在类固醇化合物结构的3位具有二氟亚甲基砜衍生物的式(IIIa)的脂质锚。可以通过使用文献方法从脱氢异雄素酮或孕烯醇酮开始在式(IIIa)的脂质锚的17位引入各种侧链(Bergmann，E.D.等人，J.Am.Chem.Soc.1959，81，1239-1243，及其中的引用文献)。源自胆甾烷的式(IIIa)的脂质锚可通过使用文献方案，例如在各种过渡金属催化剂的存在下氢化，通过将5,6-双键还原而从源自胆固醇的相应前体获得。
可以与对从雌素酮起始的式(IIIa)的脂质锚所述类似的方式制备在3位具有氧衍生取代基的式(IIa)的脂质锚。可以与对3-氨基雌素酮起始的式(III)的脂质锚所述类似的方式制备在3位具有氮衍生取代基的式(IIa)的脂质锚，其所述3-氨基雌素酮可如文献所述进行制备(Zhang，X.and Sui，Z.Tetrahedron Lett.2003，44，3071-3073；Woo，L.W.L.等人，Steroid Biochem.Molec.Biol.1996，57，79-88)。可以与对3-硫代雌素酮起始的式(III)的脂质锚所述类似的方式制备在3位具有硫衍生取代基的式(IIa)的脂质锚，所述3-硫代雌素酮可以按照文献(Woo，L.W.L.等人，J.Steroid Biochem.Molec.Biol.1996，57，79-88)所述制备。可以通过Wittig方法在雌素酮结构的17位引入各种侧链，然后如文献(Peters，R.H.等人，J.Org.Chem.1966，31，24-26)所述进行所得双键的氢化。侧链内的进一步操作(例如，双键构造、环烷基修饰)可通过标准方案(Suzuki偶联等)来实现。
如文献所述，可得到属于具有不同烃基的神经酰胺、脱氢神经酰胺和二氢神经酰胺的类别的式(Va)的脂质锚(A.H.Merrill，Jr.，Y.A.Hannun(Eds.)，Methods inEnzymology，Vol.311，Academic Press，1999；Koskinen，P.M and Koskinen，A.M.P.Synthesis 1998，1075)。特别地，鞘氨醇碱可以用作在鞘氨醇主链的1位具有氧衍生的取代的所有式(Va)的脂质锚的关键中间体。相应的氨基衍生物可通过取代磺酸酯而获得，所述磺酸酯可根据已知方案由醇制备。1-氨基或1-羟基衍生物的烷基化和酰化可分别通过与溴乙酸和琥珀酸酐反应来实现。硫代乙酰化衍生物可以通过用巯基乙酸取代磺酸酯来制备。如文献所述，可获得磷酸酯和硫酸酯衍生物(A.H.Merrill，Jr.，YA A.Hannun(Eds.)，Methods in Enzymology，Vol.311，Academic Press，1999；Koskinen，P.M.andKoskinen，A.M.P.Synthesis 1998，1075)。酰化、磺酰化、脲和氨基甲酸酯的形成可以通过标准程序来实现。式(Va)的脂质锚，其中R5是可从鞘氨醇碱开始制备的氨基或氨基衍生的官能团，该鞘氨醇碱可以由Koskinen(Koskinen，P.M.and Koskinen，A.M.P.Synthesis1998，1075)所公开的、使用标准方案获得。相应的2-氧取代的鞘脂可通过Yamanoi(Yamanoi，T.等人，Chem.Lett.1989，335)公开的策略获得。式(Va)的脂质锚，其中两个R8表示羟基，可通过使用已知方案、通过相应烯烃的双羟基化而获得。可以按照文献(Howell，A.R.and Ndakala，A.J.Curr.Org.Chem.2002，6，365-391)中所述制备相应的单羟基衍生物。式(Va)的脂质锚中取代基R6和R9的改性可以通过各种综述文章中概述的方案和策略来实现(Harwood，H.J.Chem.Rev.1962，62，99-154；Gensler，W.J.Chem.Rev.1957，57，191-280)。
式(VIa)的脂质锚可通过综述文章(
Figure BDA0002625731940000361
S.等人，J.Prakt.Chem.2000，342，779)中概述的方案来获得，以及通过与关于制备式(Va)的脂质锚所述的方案组合来获得。
式(VIIa)的脂质锚，其中R4和R5是氧衍生的取代基，可以从商业上可得到的(R)-(-)-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇制备，如Fraser-Reid(Schlueter，U.Lu，J.andFraser-Reid，B.Org.Lett.2003，5，255-257)所述。式(VIIa)化合物中取代基R6的变化可通过各种综述文章中概述的方案和策略来实现(Harwood，H.J.Chem.Rev.1962，62，99-154；Gensler，W.J.Chem.Rev.1957，57，191-280)。式(VIIa)的脂质锚，其中R4和R5是氮衍生的取代基，可以通过相应的磺酸酯的亲核取代从相应的氧取代的体系开始，并如上所述进行进一步的修饰，或者从1,2,3-三氨基丙烷开始，其可如文献(Henrick，K.等人，JChem.Soc.Dalton Trans.1982，225-227)所述获得。
式(VIIIa)的脂质锚可以通过与式(VIa)的脂质锚类似的方式获得，也可以通过式(VIIa)的脂质锚的ω-乙烯基化中间体的闭环复分解获得。
式(IXa)和(Xa)的脂质锚可通过文献中描述的合成策略来获得(Xue，J.and Guo，Z.Bioorg.Med.Chem.Lett.2002，12，2015-2018；Xue，J.and Guo，Z.J.Am.Chem.Soc.2003，16334-16339；Xue，J.等人，J.Org.Chem.2003，68，4020-4029；Shao，N.，Xue，J.and Guo，Z.Angew.Chem.Int.Ed.2004，43，1569-1573)，并通过其与以上所述的制备式(Va)和(VIIa)的脂质锚的方法的组合来获得。
式(XIa)、(XIIa)和(XIIIa)的脂质锚可从根据文献中描述的合成策略的总合成来获得(Knolker，H.-J.Chem.Soc.Rev.1999，28，151-157；Knolker，H.-J.and Reddy，K.R.Chem.Rev.2002，102，4303-4427；Knolker，H.-J.and Knoll，J.Chem.Commun.2003，1170-1171；Knolker，H.-J.Curr.Org.Synthesis 2004，1)。
可以通过从4-甲氧基-3-甲基苯甲醛开始的Nenitzescu-型吲哚合成，得到6-甲氧基-5-甲基吲哚，来制备式(XIVa)的脂质锚。醚裂解、三氟甲磺酸酯形成和Sonogashira偶联，得到相应的6-炔基取代的5-甲基吲哚。Nilsmeier甲酰化和随后添加的硝基甲烷产生3-硝基乙烯基取代的吲哚衍生物，对其进行全面氢化，从而形成6-烷基取代的5-甲基色胺。使用琥珀酸酐将氨基基团酰化完成制备。
如本文所述的制备三部分化合物的方法对于本领域技术人员而言将是明显的，并将包括以下步骤：a)限定(一个或多个)磷酰基头基团或脂质锚的等效头基团和内体PAR2信号传导的抑制剂的结合和/或相互作用位点之间的距离；b)选择能够跨越(a)中定义的距离的接头；以及c)用(b)中选定的接头连接脂质锚和内体PAR2信号传导的抑制剂。
本文给出了这种方法的相应工作实施例。本领域技术人员能够推断出给定的或潜在的内体PAR2信号传导抑制剂的相关结合位点或相互作用位点，并因此确定(一个或多个)磷酰基头基团或等效的脂质锚头基团和内体PAR2信号传导的抑制剂的结合和/或相互作用位点。此类方法包括但不限于分子建模、体外和/或分子相互作用或结合测定(例如酵母二或三个杂交系统、肽点、覆盖测定、噬菌体展示、细菌展示、核糖体展示)、原子力显微镜以及光谱法和X射线晶体学。此外，可使用例如定点诱变的方法来验证推定的内体PAR2信号传导抑制剂或内体PAR2信号传导候选抑制剂及其对应靶标的相互作用位点。
本领域技术人员将理解，接头的选择包括本领域已知的接头的选择以及新型接头的产生和使用，例如通过分子建模和相应合成或本领域已知的其它方法。
如本文中关于步骤b)所用的术语“跨越”是指当脂质锚形成内体脂质层的一部分时，被选择用来将内体PAR2信号传导的抑制剂置于受体上正确位点的接头的长度。
本领域技术人员很容易推论、验证和/或评估给定三部分的化合物以及本文所述单个部分的亲脂性。在实施例中，本文提供了确定内体GPCR靶向的相应测试方法。
本领域技术人员将理解，接头部分的目的是将脂质锚与内体PAR2信号传导的抑制剂连接，以允许内体PAR2信号传导的抑制剂在脂质锚锚定在内体膜中时与PAR2相互作用。脂质锚和接头将包含允许两个基团共价键合的官能团。脂质锚的官能团的性质没有任何限制，并且可以包括例如与接头形成酰胺键的胺基，或与接头形成醚或酯键的羟基或羧酸基团。
类似地，技术人员将理解，与内体PAR2信号传导的抑制剂连接的接头末端的官能团的选择将主要由所选择的内体PAR2信号传导的抑制剂上的任何可用官能团决定。例如，若内体PAR2信号传导的抑制剂包含游离的胺或羧酸基团，则设想接头的官能团将包含互补的羧酸或胺以形成酰胺键。
在需要提纯本发明化合物时，可以使用色谱技术，例如可以使用反相高效液相色谱(HPLC)。肽可通过质谱和/或其它适当的方法来表征。
现在将参考以下非限制性实施例描述本发明：
合成前体
实施例1:合成6-氯咪唑并[l,2-b]哒嗪-2-羧酸乙基酯(通用合成方案1的步骤(a))
Figure BDA0002625731940000381
在1L圆底烧瓶中添加6-氯哒嗪-3-胺(30g，0.2316mol)溶于DMF(300mL)。随后分批添加3-溴-2-氧代-丙酸乙基酯(38mL，0.3mol)。将混合物在50℃保持1.5小时。用水/冰浴将混合物冷却至室温，并在2小时内将水(600mL)滴加至反应混合物中。然后在室温搅拌过夜。通过在布氏漏斗上过滤(约30分钟)将形成的沉淀物滤出。将沉淀物用3x500mL的水洗涤，并在布氏漏斗上真空干燥2小时，然后在40℃的真空烘箱中干燥20小时，得到6-氯咪唑并[2,l-b]哒嗪-2-羧酸乙基酯(29.9g，57％)为黄色固体。1H NMR(401MHz，DMSO)δ8.85(s，2H)，8.27(d，J＝9.6Hz，3H)，7.47(d，J＝9.6Hz，3H)，4.33(q，J＝7.0Hz，6H)，1.32(t，J＝7.1Hz，9H)。
实施例2:合成8-叔丁基-6-氯咪唑并[l,2-b]哒嗪-2-羧酸乙基酯(通用合成方案1的步骤(b))
Figure BDA0002625731940000382
在装有滴液漏斗、N2入口和冷凝器的1L 3颈圆底烧瓶中装入水(98.10mL)和三氟乙酸(10.72mL，139.1mmol)。一旦放热结束，添加6-氯咪唑并[2,l-b]哒嗪-2-羧酸乙基酯(21g，92.72mmol)、2,2-二甲基丙酸(37.88g，21.30mL，370.9mmol)和乙腈(200mL)，然后添加AgNO3(7.88g，46.36mmol)。将反应混合物包裹在铝箔中并加热至80℃。在30分钟内经由滴液漏斗添加过硫酸铵(35.24g，166.9mmol)的水(98.10mL)溶液。添加完成后，移去加液漏斗，并给混合物配备冷凝器，并在80℃加热30分钟。
然后将反应冷却至室温并用200mL乙酸乙酯稀释。将滤液在冰/水浴中冷却至0℃，并添加NH4OH直至pH＝8。20分钟后，将混合物在硅藻土上过滤并用乙酸乙酯洗涤。分离各层，将水层用1x200mL乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物用2x200mL的1N NaOH/盐水1:1的溶液洗涤。再次在硅藻土上过滤有机相以除去Ag盐，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到35g深色泡沫状胶。
粗品经硅胶色谱提纯(二氯甲烷)，得到8-叔丁基-6-氯-咪唑并[2,1-b]哒嗪-2-羧酸乙基酯(7.28g，28％)为淡黄色固体。1H NMR(401MHz，DMSO)δ8.81(s，1H)，7.17(s，1H)，4.35(q，J＝7.1Hz，2H)，1.53(s，9H)，1.33(t，J＝7.1Hz，3H)。
实施例3:合成8-叔丁基-6-(4-氟苯基)咪唑并[l,2-b]哒嗪-2-羧酸乙基酯(通用合成方案1的步骤(c))
Figure BDA0002625731940000391
8-叔丁基-6-氯咪唑并[l,2-b]哒嗪-2-羧酸乙基酯(500mg，1.755mmol)的DMF(7mL)溶液中添加(4-氟苯基)硼酸(280mg，2.004mmol)、PdCl2(dppf)2-DCM(30mg，0.03644mmol)和Na2CO3(1.822mL，2M，3.644mmol)。用N2鼓泡5分钟使其脱气后，将其在80℃加热18小时。将水与乙酸乙酯一起添加，并分离各相。将有机相用水和盐水(1∶1混合物)洗涤2次，经MgSO4干燥，过滤并减压蒸发，得到8-叔丁基-6-(4-氟苯基)咪唑并[l,2-b]哒嗪-2-羧酸乙基酯(545mg，90％)为固体。1H NMR(401MHz，DMSO)δ8.79(s，1H)，8.20-8.11(m，2H)，7.51(s，1H)，7.46-7.38(m，2H)，4.36(q，J＝7.1Hz，2H)，1.60(s，9H)，1.34(t，J＝7.1Hz，3H)。
实施例4:合成8-叔丁基-6-(4-氟苯基)咪唑并[l,2-b]哒嗪-2-羧酸(通用合成方案1的步骤(d))
Figure BDA0002625731940000401
将8-叔丁基-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羧酸乙基酯(8.3g，24.31mmol)溶于甲醇(388mL)，并添加NaOH(49mL，2.5M)。将该溶液在室温搅拌2小时。添加HCl(6N)直至达到酸性pH。然后添加水，沉淀出固体。将固体用水彻底洗涤并干燥得到8-叔丁基-6-(4-氟苯基)咪唑并[l,2-b]哒嗪-2-羧酸(6.85g，90％)为米色固体。1H NMR(401MHz，DMSO)δ12.97(s，1H)，8.72(s，1H)，8.21-8.08(m，2H)，7.49(s，1H)，7.46-7.34(m，2H)，1.60(s，9H)。
LC-MS：313.97(M+H+)，保留时间：3.06
实施例5:合成4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-鎓氯化物(通用合成方案1的步骤(e)和(f))
Figure BDA0002625731940000403
8-叔丁基-6-(4-氟苯基)咪唑并[l,2-b]哒嗪-2-羧酸(5g，16mmol)、DMF(120mL)、HATU(7.3g，19.2mmol)、3,3-二甲基哌嗪-1-羧酸叔丁基酯(4.1g，1.92mmol)和DIPEA(10mL，57.4mmol)得到4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[l,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羧酸叔丁基酯，将其溶于4N HCl的1,4-二噁烷溶液(60mL)中，得到4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[l,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪盐酸盐(6.5g，97％)为固体。1HNMR(401MHz，DMSO)δ9.71(bs，2H)，8.57(s，1H)，8.17-8.10(m，2H)，7.50(s，1H)，7.44-7.36(m，2H)，4.16-4.08(m，2H)，3.35-3.27(m，2H)，3.23-3.14(m，2H)，1.61(s，6H)，1.59(s，9H)。
实施例6:合成1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-羧酸
Figure BDA0002625731940000405
将叠氮化钠(5mmol)和溴乙酸叔丁基酯(5mmol)在DMF(10mL)中、在室温搅拌72小时。添加丙酸(5mmol)和CuI(0.5mmol)，并继续搅拌另外48小时。通过添加1M HCl将反应溶液的pH调节至4，并将所得混合物倒入盐水中。用DCM萃取水相，经MgSO4干燥，并蒸发至干。将粗残余物在硅胶上提纯，得到标题产物。29.5％。1H NMR(401MHz，DMSO)δ8.76-7.63(m，2H)，5.42-5.19(m，2H)，1.43(s，9H).LCMS:Rf＝2.90，m/z＝225.9(M-H，C9H12N3O4 -)。
合成I-343、Cy5-胆甾烷醇和Cy5-乙基酯
实施例7：合成(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-基)(2,2-二甲基-4-(5-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-羰基)哌嗪-1-基)甲酮(I-343)
将5-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-羧酸(1.2当量)溶于DMSO，然后与HATU(1.2当量)、相应的胺(1.0当量)和DIPEA(2.5当量)混合(室温，过夜)。添加水并将固体过滤洗涤，得到标题产物(88％产率)。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.52(d，J＝7.2Hz，1H)，8.18-8.10(m，2H)，7.48(d，J＝8.8Hz，1H)，7.45-7.36(m，2H)，4.34-3.66(m，6H)，2.43-2.30(m，3H)，1.61(s，6H)，1.56(s，3H)，1.54(s，3H)，1.48(s，3H).LCMS:Rf＝3.37，m/z＝519.3(M+H，C27H31FN8O2 +)。
实施例8：合成Cy5-胆甾烷醇(Cy5-Chol)
通过在Fmoc-PAL-PEG-PS树脂(Life Technologies，0.17mmol/g树脂负载)上通过标准Fmoc固相肽合成(SPPS)、通过柔性PEG接头将花青5与胆甾烷醇偶联。使用在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的20％v/v哌啶进行Fmoc脱保护反应。使用Fmoc保护的氨基酸与O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HCTU)作为偶联剂，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)作为活化剂，进行偶联反应。使用Fmoc-Asp(OChol)-OH、Fmoc-PEG4-OH、Fmoc-PEG3-OH和Fmoc-PEG4-OH作为氨基酸，通过手动SPPS制备Cy5-Chol[Cy5-PEG4-PEG3-PEG4-Asp(OChol)-NH2]。在最后的脱保护步骤之后，使用Cy5酸、HCTU和DIPEA在DMF中的混合物将N端封端，然后使用95:2.5:2.5三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIPS)/水从树脂上裂解肽构建体(Jensen，D.D.等人，Sci Transl Med 2017，9(392):eaal3447)。
实施例9：合成Cy5-乙基酯
使用与实施例8相同的方法合成，除了在第一偶联步骤中用Fmoc-Asp(OEt)-OH替代Fmoc-Asp(OChol)-OH(Jensen，D.D.等人，Sci Transl Med 2017，9(392):eaal3447)。合 成本发明化合物
实施例10:合成3-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-基)-3-氧代丙烷-1-磺酸(1)
Figure BDA0002625731940000421
在干燥的THF中，在DIPEA(101mg，0.787mmol)的存在下，于30分钟内用氯甲酸异丁酯(54mg，0.29mmol)活化3-氯丙酸(51mg，0.472mmol)。添加4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-鎓氯化物(70mg，0.157mmol)，将所得的反应混合物再搅拌60分钟。通过LCMS认为反应完成，并通过添加饱和碳酸氢钠淬灭。用DCM(3x)萃取产物，经MgSO4干燥并蒸发至干。将该粗制混合物重新溶解于EtOH(5mL)和水(5mL)中，并添加Na2SO3(99mg，0.787mmol)；将将混合物在80℃加热过夜。通过LCMS认为反应完成，用TFA酸化并在制备HLPC上提纯，得到标题产物(1)。两个步骤33.7mg，39.3％。1H NMR(401MHz，DMSO)δ8.52(d，J＝4.2Hz，1H)，8.18-8.10(m，2H)，7.48(s，1H)，7.45-7.36(m，2H)，4.27-4.21(m，2H)，3.74-3.67(m，1H)，3.66-3.48(m，5H)，2.69-2.62(m，1H)，2.62-2.55(m，1H)，1.60-1.59(m，9H)，1.55(s，3H)，1.50(s，3H).LCMS(通用程序13)：Rf＝3.66，m/z＝546.2(M+H，C26H33FN5O5S+)。
实施例11:合成2-(4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙酸(2)
Figure BDA0002625731940000422
根据通用程序2，使用4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-鎓氯化物(实施例5)和1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-羧酸(实施例6)，得到酯中间体(91.8％)，将其用TFA和DCM脱保护，得到定量产率的标题化合物。LCMS(通用程序12)：Rf＝3.56，m/z＝562.9(M+H，C28H32FN8O4 +)。1H NMR(401MHz，CDCl3)δ8.37(s，1H)，8.27(d，J＝5.8Hz，1H)，7.93(dd，J＝8.8，5.3Hz，2H)，7.24(d，J＝4.1Hz，1H)，7.19(t，J＝8.6Hz，2H)，5.13-5.07(m，2H)，4.60-4.44(m，4H)，3.96-3.89(m，2H)，1.70(s，2H)，1.66(s，4H)，1.63-1.58(m，9H)，1.49-1.47(m，9H).LCMS:Rf＝3.71，m/z＝619.0(M+H，C32H40FN8O4 +)。
实施例12:合成(1S,4R)-4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)-N-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基)环己烷-1-甲酰胺(3)
Figure BDA0002625731940000431
根据通用程序1，将4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-鎓氯化物偶联至(1S,4S)-4-(甲氧基羰基)环己烷-1-羧酸。将酯溶解在甲醇中，然后添加2M NaOH(2当量)。在室温将其搅拌直至水解完成。减压除去甲醇，并通过添加1M HCl溶液将反应混合物中和。将固体过滤并洗涤以获得所需的酸中间体。34％。1HNMR(401MHz，DMSO)δ12.11(bs，1H)，8.51(d，J＝8.5Hz，1H)，8.20-8.08(m，2H)，7.48(d，J＝4.3Hz，1H)，7.46-7.35(m，2H)，4.21-4.11(m，2H)，3.84-3.45(m，4H)，2.61-2.52(m，2H)，2.08-1.99(m，2H)，1.69-1.42(m，21H)。LCMS(通用程序13)：Rf＝3.54，m/z＝562.0(M-H，C31H37FN5O4 -)。
根据通用程序1，将酸性中间体与D-葡萄糖胺偶联，得到标题产物。48％。1H NMR(401MHz，DMSO)δ8.51(d，J＝8.4Hz，1H)，8.20-8.08(m，2H)，7.62-7.45(m，2H)，7.45-7.31(m，2H)，4.79-4.70(m，1H)，4.51-4.20(m，4H)，4.22-4.06(m，2H)，3.86-3.72(m，1H)，3.71-3.52(m，5H)，3.52-3.34(m，4H)，3.29-3.18(m，1H)，3.12-2.97(m，1H)，2.77-2.57(m，1H)，2.40-2.28(m，1H)，2.04-1.84(m，2H)，1.81-1.65(m，2H)，1.65-1.38(m，19H).LCMS:Rf＝3.28，m/z＝727.0(M+H，C37H52FN6O8 +)。
实施例13:合成4-(4-(7-(叔丁基)-5-(4-氟苯基)苯并[d]噁唑-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-基)-4-氧代-N-((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基)丁酰胺(4)
Figure BDA0002625731940000441
将4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-鎓氯化物(120mg，0.27mmol)悬浮于DCM中，并添加琥珀酸酐(1.5当量)和DIPEA(2当量)。将反应混合物在室温搅拌30分钟，倒入1N HCl溶液中，并用DCM萃取。合并的有机相经MgSO4干燥，蒸发至干，，并在短硅胶垫上用DCM：MeOH提纯，得到112.2mg(81.7％)的4-(4-(7-(叔丁基)-5-(4-氟苯基)苯并[d]噁唑-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸。按照通用程序1，将酸性中间体与D-葡萄糖胺偶联，得到标题产物4。66％。1H NMR(401MHz，DMSO)δ8.52(d，J＝7.1Hz，1H)，8.19-8.08(m，2H)，7.77(q，J＝5.8Hz，1H)，7.48(d，J＝2.5Hz，1H)，7.45-7.36(m，2H)，4.31-4.10(m，2H)，3.72(t，J＝5.4Hz，1H)，3.68-3.54(m，5H)，3.54-3.43(m，2H)，3.43-3.33(m，2H)，3.26(dt，J＝10.6，5.7Hz，1H)，3.09-2.96(m，1H)，2.64-2.51(m，2H)，2.38(dd，J＝12.8，6.7Hz，2H)，1.59(d，J＝3.5Hz，9H)，1.55(s，3H)，1.49(s，3H).LCMS(通用程序13)：Rf＝3.27，m/z＝672.9(M+H，C27H33FN5O4 +)。
实施例14:合成2-(4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-N-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)乙酰胺(5)
Figure BDA0002625731940000444
通过通用程序2，用实施例11的产物和2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙-1-醇合成，得到标题化合物为粘稠油状物。LCMS:Rf＝3.31，m/z＝693.9(M+H，C34H45FN9O6 +)。
实施例15:合成2-(4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-N-(17-羟基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)乙酰胺(6)
Figure BDA0002625731940000451
通过通用程序2，用实施例11的产物和17-氨基-3,6,9,,12,15-五氧杂十七烷-1-醇合成，得到标题化合物为粘稠油状物。LCMS:Rf＝3.32，m/z＝825.8(M+H，C40H57FN9O9 +)。
实施例16:合成(2R,3S,4R,5S)-N1-((1s,4S)-4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)环己基)-2,3,4,5-四羟基己烷二酰胺(7)
Figure BDA0002625731940000452
通过通用程序2，用粘酸二丙酮化物-Rink AM树脂和(4-((1s,4s)-4-氨基环己烷-1-羰基)-2,2-二甲基哌嗪-1-基)(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-基)甲酮合成，得到标题化合物为无定形固体。LCMS:Rf＝3.36，m/z＝709.8(M+H-NH2，C36H46FN6O8 +)
实施例17:合成4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)双环[2.2.2]辛烷-1-羧酸甲基酯(8)
根据通用程序1，使用4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-鎓氯化物(实施例5)和4-(甲氧基羰基)双环[2.2.2]辛烷-1-羧酸，得到标题化合物，其产率为82％。1H NMR(401MHz，CDCl3)δ8.37(s，1H)，7.99-7.89(m，2H)，7.26(s，1H)，7.24-7..17(m，2H)，4.46-4.31(m，2H)，3.92-3.71(m，4H)，3.66(s，3H)，2.03-1.79(m，12H)，1.64(s，3H)，1.61(s，9H)，1.56(s，3H).LCMS:Rf＝3.83，m/z＝603.9(M+H，C34H43FN5O4 +)。
实施例18:合成(14S)-1-(4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-14-氨基甲酰基-2,12-二氧代-6,9-二氧杂-3,13-二氮杂十六烷-16-酸(3S,10S,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基酯(9)
Figure BDA0002625731940000461
经通用程序4合成，得到标题化合物为粘稠油状物。
LCMS(通用程序13)：Rf＝3.18，m/z＝1206.56(M+H，，C66H97FN11O9 +)
实施例19:合成(44S)-1-(4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-44-氨基甲酰基-2,42-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二氧杂-3,,43-二氮杂四十六-46-酸(3S,10S,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基酯(10)
Figure BDA0002625731940000462
步骤1：根据通用程序3合成树脂结合的NH2-PEG12-Asp(OChol)-树脂。使用95％三氟乙酸将胺从树脂上裂解，并蒸发至干，得到粗制的NH2-PEG12-Asp(OChol)。
步骤2：按照通用程序2，使用实施例11的酸产物和步骤1中的NH2-PEG12-Asp(OChol)生成标题产物(45％)。1H NMR(401MHz，CDCl3)δ8.43(d，J＝4.2Hz，2H)，7.99-7.90(m，2H)，7.74-7.50(m，3H)，7.34-7.26(m，2H)，7.19(dt，J＝19.6，7.5Hz，3H)，5.22(s，2H)，4.95-4.86(m，1H)，4.74-4.64(m，1H)，4.62-4.40(m，4H)，4.28-4.17(m，1H)，3.97-3.79(m，3H)，3.74-3.54(m，45H)，3.49(dd，J＝10.9，5.7Hz，2H)，3.03(dd，J＝17.2，5.1Hz，1H)，2.70(dd，J＝17.9，5.9Hz，1H)，2.57(t，J＝3.8Hz，2H)，1.96(dd，J＝9.3，3.1Hz，1H)，1.86-1.18(m，43H)，1.18-0.78(m，26H)，0.67-0.58(m，4H).LCMS(高分辨):m/z＝824.5132(M+2H，C86H138FN11O19 2+)。
实施例20:合成(20S)-1-(4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-20-氨基甲酰基-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷-22-酸(3S,10S,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基酯(11)
Figure BDA0002625731940000471
经通用程序4合成，得到标题化合物为粘稠油状物。
LCMS:Rf＝3.28，m/z＝1294.66(M+H，C70H105FN11O111 +)。
实施例21:合成(32S)-1-(4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-32-氨基甲酰基-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3,31-二氮杂三十四烷-34-酸(3S,10S,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基酯(12)
Figure BDA0002625731940000472
经通用程序4合成，得到标题化合物为粘稠油状物。
LCMS:Rf＝2.83，m/z＝1470.878(M+H，C78H121FN11O15 +)。
实施例22:合成(37S)-1-(4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-37-氨基甲酰基-2,7,35-三氧代-11,14,17,20,23,26,29,32-八氧杂-3,8,36-三氮杂三十九烷-39-酸(3S,10S,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基酯(13)
Figure BDA0002625731940000481
经通用程序4合成，得到标题化合物为粘稠油状物。
LCMS:Rf＝2.30，m/z＝1555.98(M+H，C82H128FN12O16 +)。
实施例23:合成(26S,51S)-1-(4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-51-氨基甲酰基-26-(3-胍基丙基)-2,24,27,49-四氧代-6,9,12,15,18,21,31,34,37,40,43,46-十二氧杂-3,25,28,50-四氮杂五十三烷-53-酸(8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基酯(14)
Figure BDA0002625731940000482
经通用程序4合成，得到标题化合物为粘稠油状物。
LCMS(通用程序13)：Rf＝3.44，m/z＝936.8(M+2H，C95H155FN16O21 2+)。
实施例24:合成(S)-3-(1-(4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二氧杂-3-氮杂四十二烷-42-酰氨基)-N1-十六烷基琥珀酰胺(15)
Figure BDA0002625731940000483
经通用程序4合成，其中Fmoc-L-Asp(OChol)-OH被Fmoc-L-Asp(NH(CH2)15CH3)-OH替代，得到标题化合物为粘稠油状物。
LCMS(高分辨):m/z＝750.4622(M+2H，C75H125FN12O18 2+)
实施例25:合成(3S,28S,29R,30S,31R)-32-((4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)环己基)氨基)-3-氨基甲酰基-28,29,30,31-四羟基-5,27,32-三氧代-8,11,14,17,20,23-六氧杂-4,26-二氮杂三十二烷酸(3S,5R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)十六氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基酯(16)
Figure BDA0002625731940000491
经通用程序4合成，其中在偶联至PAR2拮抗剂之前，，将粘酸二丙酮化物偶联至PEG间隔基。标题产物被分离为玻璃状物。
LCMS(高分辨):m/z＝1547.9463(M+H，C82H129FN9O18 2+)。
实施例26:合成((R)-1-(4-(4-(8-(叔丁基)-6-(4-氟苯基)咪唑并[1,2-b]哒嗪-2-羰基)-3,3-二甲基哌嗪-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-44-(肼羰基)-2,42-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二氧杂-3,43-二氮杂四十八烷-48-基)氨基甲酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基酯(17)
Figure BDA0002625731940000492
通过通用程序4合成，其中Fmoc-D-Lys(NCOChol)-NHNH2被Fmoc-L-Asp(NH(CH2)15CH3)-OH替代，得到标题化合物为粘稠油状物。
LCMS(高分辨):m/z＝859.5373(M+2H，C75H125FN12O18 2+)。
实施例27:在转染的KNRK或HT29细胞中PAR2的抑制
将KNRK-hPAR2、KNRK或HT-29细胞以50x103细胞/孔的密度接种在透明的聚-d-赖氨酸包被的96孔组织培养板中。在37℃和5％CO2温育24小时后，除去培养基，并用80μl IP1刺激缓冲液(10mM HEPES，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，4.2mM KCl，146mM NaCl，5.5mM葡萄糖，50mM LiCl)代替。添加刺激缓冲液后，孔中接受10μl10x拮抗剂或DMSO媒剂。将所有板在37℃、5％CO2进一步温育30分钟。将10μl 2F或ATP添加至板中，并进一步温育40分钟。温育后，通过抽吸快速去除刺激缓冲液，并用25μl裂解缓冲液(IP-One
Figure BDA0002625731940000493
检测试剂盒，Cisbio)代替。将裂解物在37℃、5％CO2温育10分钟后，将10μl裂解物转移至384孔OptiPlate(PerkinElmer)中，并使用IP-One
Figure BDA0002625731940000494
检测试剂盒(Cisbio)进行检测。
在添加10μM ATP或100nM或300nM PAR2激动剂(2F；EC80，以10μL体积添加10x浓度)之前，将本发明化合物(以10μL体积添加10x浓度)温育30分钟，然后进一步温育40分钟。裂解后，用IP-One
Figure BDA0002625731940000501
检测试剂盒，Cisbio对磷酸肌醇1进行定量。使用Prism，GraphPad分析数据以计算IC50值，如下表1所示。
表1：本发明化合物在IP1积累测定(a)或Ca2+FLIPRTETRA测定(b)中的抑制效力(pIC50)
Figure BDA0002625731940000502
c ND，当使用30μM拮抗剂时，观察到对2F的抑制作用低于50％
从以上结果可以明显看出，本发明化合物为有效的PAR2信号传导抑制剂。
实施例28:PAR2介导的伤害感受
蛋白酶可以通过激活伤害感受器或其它细胞类型的PAR2来诱导疼痛。为了确定PAR2对伤害感受器的贡献，使用NaV1.8启动子(Scn10a)将小鼠的LoxP位点侧边的PAR2(PAR2 lox/lox)与表达针对伤害感受器的小鼠的Cre重组酶进行育种(Stirling L.C.等人，Pain 2005，113(1-2):27-36)。在NaV1.8阳性伤害感受器(图1A)中，PAR2-NaV1.8小鼠缺乏免疫反应性PAR2。WT小鼠中的小直径(<25μm)DRG神经元中有31％(65个中的20个)对胰蛋白酶(100nM)的[Ca2+]i升高有响应，而来自PAR2-NaV1.8小鼠的神经元中只有6％(51个中的3个)有响应(图1B，11A和11B)。通过测量对von Frey微丝刺激后爪足底表面的退缩反应，对伤害感受进行评估。在WT小鼠中，胰蛋白酶(80nM)、NE(3.9μM)或CS(5μM)的足底注射(10μl)在30分钟内引起机械触诱发痛，保持180分钟(图1B-D)。在PAR2-NaV1.8小鼠中，初始响应得以维持，但120分钟后的响应减弱。在180分钟时，当在WT小鼠中完全维持机械触诱发痛时，PAR2-NaV1.8小鼠中的响应已恢复至基线(NE)或显著减弱(胰蛋白酶，CS)。在WT小鼠中，足底胰蛋白酶增加爪子厚度，其在1小时达到峰值，并维持4小时，并在4小时后刺激嗜中性粒细胞大量涌入，这与炎症一致(图11C和11D)。在PAR2-NaV1.8小鼠中显著减少了胰蛋白酶引起的炎症。
为了评估内吞作用对蛋白酶引起的伤害感受的贡献，将Dyngo4a(Dy4，发动蛋白抑制剂；Robertson M.J.等人，Nat.Protoc.2014，9(4):851-870)、PitStop2(PS2，网格蛋白抑制剂；Robertson，M.J.等人，Nat.Protoc.2014，9(7):1592-1606)、无活性(无效)类似物(50μM)或媒剂(0.2％DMSO，0.9％NaCl)(10μl)通过足底注射给予小鼠。30分钟后，将胰蛋白酶(10nM)、NE(1.2μM)或CS(2.5μM)(10μl)注入同一只爪中。在对照(媒剂或无效类似物)中，胰蛋白酶、NE和CS诱导机械触诱发痛4小时(图1E-J)。Dy4和PS2在1和2小时抑制了胰蛋白酶引起的触诱发痛(图1E，H)，而NE-(图1F，I)和CS-(图1G，J)诱导的触诱发痛未改变或受到最小的影响。内吞抑制剂或蛋白酶不影响未注射对侧爪的退缩反应(图12A，B)。胰蛋白酶、NE和CS会使爪子厚度增加，与水肿一致(图12C-H)。发动蛋白和网格蛋白抑制剂不影响水肿。
结果表明，蛋白酶通过激活NaV1.8伤害感受器上的PAR2来诱导持续的伤害感受，并且PAR2内吞作用对于胰蛋白酶(而不是NE或CS)的感受伤害作用是必需的。
实施例29:PAR2介导的伤害感受器的超兴奋性
为了评估内吞作用对蛋白酶引起的伤害感受器的超兴奋性的贡献，通过膜片钳记录测量了小鼠背根神经节(DRG)的小直径神经元的基强度(激发一个动作电位的最小电流)。神经元经胰蛋白酶(50nM，10min)、NE(390nM，30min)、CS(500nM，60min)(选择引起强烈超兴奋性的条件)或媒剂预培育并洗涤。洗涤后0或30分钟测量基强度。胰蛋白酶、NE和CS在0和30分钟时的基强度降低，表明初始的超兴奋性至少维持30分钟(图2)。Dy4(30μM)或PS2(15μM)不影响胰蛋白酶、NE或CS引起初始超兴奋性(0min)的能力。Dy4和PS2消除了胰蛋白酶(图2A-C)而非NE(图2D，E)或CS(图2F，G)(30min)的持续作用。Dy4、PS2或媒剂(0.3％DMSO)不影响DRG神经元的基础兴奋性(图13)。
在表达内源性PAR2的HT-29细胞和HEK293细胞以及表达人(h)PAR2的KNRK细胞中研究了用已知的PAR2抑制剂I-343(图14A)抑制PAR2信号传导。响应于PAR2选择性激动剂2-呋喃酰基-LIGRLO-NH2(2F)(胰蛋白酶暴露的束缚配体或胰蛋白酶的类似物)的响应，测量了肌醇磷酸酯-1(IP1)的积累。I-343抑制HT-29细胞中2F(300nM)引起的IP1(pIC50 8.93±0.11，IC50 1.1nM)和KNRK-hPAR2细胞中2F(100nM)引起的IP1(pIC50 6.18±0.11，IC50666nM；图14B-D)。I-343抑制HEK293细胞(pIC50 9.36±0.20，IC50 0.4nM)中和KNRK-hPAR2细胞(pIC50 5.13±0.14，IC50 7507nM)中胰蛋白酶(30nM)引起的IP1。I-343不影响KNRK细胞中ATP(10μM)刺激的IP1(图14E)。
I-343(10μM)防止了胰蛋白酶和CS(但不防止NE)施予后30分钟的基强度的降低(图3A-C)。但是，I-343防止了NE施予后0分钟基强度的降低(图3D)。I-343(100nM，300nM)也防止了胰蛋白酶施予后0分钟的基强度的降低(图15A)。将神经元与凝血酶(50nM，20min)温育并洗涤后，基强度立即降低，这是通过与PAR1拮抗剂SCH79797预温育阻止的(1μM，10min；Ahn，H.S.等人，Biochem.Pharmacol.2000，60(10):1425-1434)；单独的SCH79797没有作用(图15B)，SCH79797没有影响对胰蛋白酶的响应(图15C)。因此，PAR2介导胰蛋白酶和CS的持久作用以及NE的初始作用，但NE通过不同的机制引起持久的超兴奋性。另一个PAR2拮抗剂GB88也可阻止伤害感受器的胰蛋白酶、NE和CS激活(Lieu，T.et al.Br J Pharmacol 2016，173(18):2752-2765)。通过βARR-和Raf-1-依赖性的过程，胰蛋白酶激活的PAR2从核内体发出信号，从而激活ERK(DeFea，K.A.等人，J Cell Biol 2000，148(6):1267-1281)。抑制有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶1(MEK1)激活的PD98059(50μM)(Lieu，T.等人，Br J Pharmacol2016，173(18):2752—2765)不影响初始胰蛋白酶引起的超兴奋性，但阻止持续的胰蛋白酶引起的超兴奋性(图3E)。相反，GF109203X(Bis-1，10μM)抑制PKCα和其它激酶(Davies，S.P.等人，Biochem J 2000，351(Pt 1):95-105)，阻止了初始胰蛋白酶的作用，但并不持久(图3F)。
因此，胰蛋白酶通过来自质膜的PAR2/PKC信号传导引起最初的伤害感受器的超兴奋性，并通过来自核内体的PAR2/ERK信号传导引起持续的超兴奋性。腺苷酸环化酶和PKA介导NE-和CS引起的伤害感受器的超兴奋性(Zhao，P.等人，J.Biol.Chem.2014，289(39):27215-27234；Zhao，P.等人，J.Biol.Chem.2015，290(22):13875-13887)，其并未被进一步研究。
实施例30:伤害感受器中的PAR2内吞作用和划分的信号传导
为了评估PAR2在伤害感受器中的内吞作用，将小鼠(m)PAR2-GFP转染到小鼠DRG神经元中。在媒剂处理的神经元中，在质膜和细胞内隔室中检测到mPAR2-GFP，这可能对应于高尔基体中PAR2的存储(图4A)(Jensen D.D.，et al.J Biol Chem.2016，291(21):11285-11299)。胰蛋白酶而非NE或CS(100nM，30min)诱导mPAR2-GFP内吞作用(图4A，B)。Dy4(而非Dy4无效)抑制胰蛋白酶引起的mPAR2-GFP内吞作用(图4C)。为了确定PAR2是否募集介导内吞作用的βARR，在小鼠DRG神经元中表达了PAR2-RLuc8(供体)和βARR2-YFP(受体)的生物发光共振能量转移(BRET)传感器。胰蛋白酶(而非NE或CS)升高PAR2-RLuc8/βARR2-YFP BRET(图4D)。
为了确定胰蛋白酶是否引起PKC和ERK的PAR2-依赖性的激活(其分别介导初始的和持续的胰蛋白酶引起的伤害感受器的超兴奋性)，在神经元中表达基因编码的
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共振能量转移(FRET)生物传感器。质膜PKC(pmCKAR)、胞质溶胶的PKC(CytoCKAR)、胞质溶胶的ERK(CytoEKAR)和细胞核ERK(NucEKAR)的生物传感器(Halls M.L.等人，Methods MolBiol.2015，1335:131-161)在来自大鼠的DRG神经元中表达，因为初步研究显示，与中小鼠神经元中相比，PAR2响应更强更一致。胰蛋白酶(10或100nM)激活质膜处的PKC而非胞质溶胶中的PKC(图4E-G)，并激活胞质溶胶和细胞和中的ERK(图4H-J)。PAR2拮抗剂I-343(10μM)抑制胰蛋白酶引起的PKC和ERK的激活，而PAR1拮抗剂SCH530348(100nM)没有作用(图4F，I)。在实验的最后，神经元被关于EKAR生物传感器的阳性对照12,13-二丁酸佛波醇酯(PDBu)激发，或被关于CKAR生物传感器的PDBu加上磷酸酶抑制剂混合物-2激发，以确保生物传感器的响应为不饱和的。
结果显示，胰蛋白酶而非NE或CS刺激伤害感受器中PAR2的βARR2募集和发动蛋白-依赖性的内吞作用。胰蛋白酶引起质膜处的PKC和胞质溶胶和细胞核中的ERK的PAR2-依赖性的激活。
实施例31:PAR2内吞作用和内体信号传导的机制
在HEK293细胞中检查了PAR2内吞作用和内体信号传导的机制。为了定量从质膜中去除PAR2及其在早期核内体中的积累，使用BRET评估PAR2与驻留在质膜(RIT)和早期核内体(Rab5a)的蛋白质之间的接近性(Jensen，D.D.等人，Sci Transl.Med.2017，9(392):eaal3447；Yarwood，R.E.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2017，114(46):12309-12314)。BRET的这种应用利用了非特异性蛋白质-蛋白质相互作用的优势来跟踪膜蛋白质通过不同区室的运动(Lan，T.H.等人，Traffic 2012，13(11):1450-1456)。胰蛋白酶诱导PAR2-RLuc8/RIT-Venus BRET的降低(EC50 2.9nM)以及PAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRET的升高(EC50 2.7nM)(图5A，5B和16A-D)。NE和CS(100nM)均不影响PAR2-RLuc8/RIT-Venus或Rab5a-Venus BRET(图5A，B)。PS2(而非PS2无效)抑制胰蛋白酶引起的PAR2-RLuc8/RIT-VenusBRET的降低和PAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRET的升高(图5C，5D，16E和16F)。GTP结合不足的显性阴性发动蛋白K44E(DynK44E)(Herskovits，J.S.等人，J Cell Biol.1993，122(3):565-578)抑制PAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRET的升高，但不影响PAR2-RLuc8/RIT-VenusBRET(图5C，5D，16G和16H)。野生型发动蛋白(DynWT)影响最小。由于从质膜上切下萌芽的囊泡需要GTP结合，因此DynK44E可能将PAR2捕获在膜囊泡中，这将阻止与Rab5a而非RIT的相互作用。因此，胰蛋白酶(而不是CS或NE)诱导PAR2网格蛋白-和发动蛋白-依赖性的内吞作用。
内体PAR2信号传导介导的胰蛋白酶引起的ERK信号传导在表达Flag-PAR2-HA11的HEK293细胞中，以及胞质溶胶和细胞核ERK(CytoEKAR，NucEKAR)的FRET生物传感器、质膜和胞质溶胶PKC(pmCKAR，CytoCKAR)，以及质膜和胞质溶胶的cAMP(pmEpac，CytoEpac)中研究。胰蛋白酶(10nM)而不是NE或CS(100nM)刺激了胞质溶胶和细胞核中ERK的快速持续活化(EC50，5nM)(图5E，5F，17A-F)。I-343(10μM)而不是SCH530348(100nM)抑制胞质溶胶和细胞核的ERK的胰蛋白酶激活(图5G)。当与PS2无效和DynWT对照对比时，PS2和DynK44E抑制胞质溶胶和细胞核的ERK的胰蛋白酶刺激的激活(图5H，5I，17G-J)。EGF受体酪氨酸激酶抑制剂AG1478(1μM)(Levitzki，A.&Gazit，A.Science 1995，267(5205):1782-1788)，UBO-QIC(100nM)抑制Gαq和某些Gβγ信号(Levitzki，A.等人，Science 1995，267(5205):1782-1788)，且
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(1μM)抑制PKC的所有同工型(Gschwendt，M等人，FEBS Lett 1996，392(2):77-80)，所述AG1478和
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抑制胞质溶胶的ERK的胰蛋白酶刺激的激活(图5J和17K)。UBO-QIC和
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也抑制细胞核的ERK的激活(图5K和17L)。结果表明，Gαq-依赖性的机制从核内体发出的PAR2信号激活胞质溶胶和细胞核中的ERK。
为了确定胰蛋白酶是否诱导βARR和Gαq易位至核内体，我们在HEK293细胞中测量了βARR1-RLuc8或Gαq-RLuc8和Rab5a-Venus之间的BRET。胰蛋白酶(100nM)刺激βARR1-RLuc8/Rab5a-Venus BRET和Gαq-RLuc8/Rab5a-Venus BRET的升高(图18A，B)。使用免疫荧光和结构照明显微镜在HEK-293细胞中定位PAR2-HA、Gαq和早期内体抗原-1(EEA1)。在未刺激的细胞中，尽管在早期核内体中检测到Gαq，但PAR2局限于质膜(图18C)。胰蛋白酶(10nM，30min)诱导PAR2易位至含Gαq的早期核内体。该结果支持以下假设：胰蛋白酶引起早期核内体中PAR2/βARR/Gαq信号小体的组装。
胰蛋白酶(10nM)在HEK293细胞的质膜和胞质脂质中引起PKC的快速持续活化和cAMP的生成(图19A-H)。DynK44E强烈抑制了这些信号，但DynWT没有作用。I-343(而不是SCH530348)抑制PKC和cAMP的胰蛋白酶刺激，因此其依赖于PAR2(图19G和H)。这些结果表明，内吞作用对于PAR2信号传导的多个成分是必需的。质膜上的cAMP信号传导通常通过磷酸二酯酶的βARR递送而脱敏，该磷酸二酯酶降解cAMP(Perry，S.J.等人，Science 2002，298(5594):834-836)。质膜cAMP对胰蛋白酶的持续响应支持允许持久PAR2信号传导的机制的存在，这需要进一步研究。用阳性对照PDBu(EKAR)、PDBu+磷酸酶抑制剂混合物2(CKAR)或佛司可林(forskolin)+3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Epac)刺激细胞后发现，对蛋白酶的响应不会使FRET生物传感器饱和(图5E，5F和19A-D)。
实施例32:IBS引起的伤害感受器的超兴奋性
通过涉及PAR2内体信号传导的机制，对IBS患者粘膜活检组织中的蛋白酶是否引起持续的伤害感受器的超兴奋性进行了研究。将腹泻为主的IBS(IBS-D)患者或健康对照(HC)受试者的结肠粘膜活检组织置于培养基中(24小时，37℃)。然后将小鼠DRG神经元暴露于活检上清液(30分钟，37℃)并洗涤。洗涤后30分钟测量基强度，以评估持续的超兴奋性。与HC受试者的上清液相比，IBS-D患者活检组织上清液导致基强度持续降低，这与超兴奋性一致(基强度在30分钟时：HC，78.33±4.41pA，12神经元，来自4HC的上清液；IBS-D，54.55±4.74pA，11神经元，来自4IBS-D的上清液；P<0.05；ANOVA，Tukey多重比较检验)(图6A，B)。I-343(10μM)、Dy4(发动蛋白抑制剂，30μM)和PD98059(MEK1抑制剂，50μM)消除了IBS-D引起的伤害感受器的超兴奋性(图6A-D)。Dy4使暴露于HC上清液的神经元的基元强度不显著降低，但I-343和PD98059没有作用。
为了检查IBS-D上清液中的蛋白酶是否可以刺激PAR2的内吞作用，使用BRET评估了在HEK293细胞中表达的PAR2-RLuc8与Rab5a-Venus之间的接近性。与HC上清液相比，IBS-D上清液在60分钟后增加了PAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRET(图6E)。胰蛋白酶(10nM，阳性对照)也增加了PAR2-RLuc8/Rab5a-Venus BRET。
这些结果表明，从IBS-D患者的结肠粘膜活检组织中释放的蛋白酶通过需要从核内体中的PAR2和PAR2 ERK信号传导的发动蛋白依赖性的内吞作用的机制，引起伤害感受器的持续超兴奋性。
实施例33:向核内体的PAR2的拮抗剂递送
与跨膜脂质胆甾烷醇的缀合促进神经激肽1受体(NK1R)和降钙素受体样受体(CLR)的拮抗剂在体内的递送，从而提供更有效和持续的抗伤害感受(Jensen，D.D.等人，Sci Transl Med，2017，9(392):eaal3447；Yarwood R等人，Proc Natl Acad Sci USA2017，114(46):12309-12314)。为了评估核内体的PAR2是否为治疗靶标，合成了三部分的探针，其中包括：胆甾烷醇，其将探针锚定到膜上或不掺入膜中的乙基酯上；聚乙二醇(PEG)12接头，其促进在在水性环境中的呈递；以及用于定位的花青5(Cy5)负载(cargo)或PAR2拮抗剂I-343(图20A和B)。为了确定三部分探针是否在含有PAR2的核内体中积聚，将表达mPAR2-GFP的小鼠DRG神经元与Cy5-PEG-胆甾烷醇(Cy5-Chol)或Cy5-PEG-乙基酯(Cy5-乙基酯)一起温育(200nM，60min，37℃)。将神经元洗净并成像(37℃)。Cy5-乙基酯没有被神经元吸收，而Cy5-Chol插入质膜内，然后在3小时内积累在体细胞和神经突的核内体中。胰蛋白酶诱导PAR2-GFP的内吞作用进入含有Cy5-Chol的囊泡附近的核内体。视频成像揭示了含有PAR2-GFP和Cy5-Chol的核内体的频繁关联。I-343-PEG-胆甾烷醇(化合物10，图20A)拮抗2F刺激的HT-29细胞中的IP1积累(pIC506.18±0.07；IC50，670nM)，尽管与母体化合物I-343相比，其效力降低(pIC508.96±0.10；IC50 1.1nM)(图20C)。
实施例34:内体PAR2的拮抗作用和伤害感受器的超兴奋性
为评估本发明化合物抑制由内体PAR2引起的、蛋白酶引起的伤害感受器的超兴奋性的能力，小鼠DRG神经元经化合物10(30μM)或媒剂预培育(60min，37℃)，洗涤，并在无拮抗剂的培养基中恢复180分钟，以使拮抗剂在核内体中积聚(图8A)。在10和30分钟时，使用胰蛋白酶进行的短暂温育会降低媒剂处理的神经元的基强度(图8B)。化合物10不会影响0分钟时的初始兴奋性，但会阻止30分钟时的持续响应。化合物10对基线基强度没有影响。同样，与HC上清液相比，用IBS-D上清液进行短暂温育在30分钟时降低了基强度(图8C)。化合物10完全阻止了IBS-D上清液对伤害感受器兴奋性的持久作用(在30分钟时的基强度：媒剂IBS-D，40±3.89pA，12神经元，来自4位患者的上清液；化合物10IBS-D，64.7±3.84pA，17神经元，来自4位患者的上清液；P<0.05)(图7C)。化合物10不影响HC上清液处理的神经元的兴奋性。
实施例35:PAR2内体信号传导介导胰蛋白酶引起的结肠传入神经元的敏化作用
结肠传入神经元对机械刺激的敏化作用是IBS疼痛的主要假设(Azpiroz F.等人，Neurogastroenterol Motil.2007，19(1Suppl):62-88)。为了检查蛋白酶是否在结肠的伤害感受器的外周末端上裂解PAR2来诱导机械超敏反应，从小鼠结肠神经支配的传入神经元中制作了单一单位记录。通过用von Frey微丝对粘膜表面进行机械刺激来识别接受域，将蛋白酶应用于粘膜接受域，并重新评估机械响应以评估敏化作用。在基础条件下，重复的机械刺激(2g微丝)引起可再现的激发(firing)(图9A)。胰蛋白酶(10nM，10min)将激发机械刺激的频率提高了35.8±5.9％，NE(100nM，10min)将激发机械刺激的频率提高了41.0±11.8％，CS(100nM，10min)将激发机械刺激的频率提高了52.0±13.2％(图9B-E)。
小鼠中的短暂性结肠炎会诱发结肠传入神经元的超敏反应，其在炎症消除后持续存在(Azpiroz F.等人，Neurogastroenterol Motil.2007，19(1Suppl):62--88)。这种慢性内脏超敏反应(CVH)可以模拟感染后/炎性IBS。为了确定蛋白酶是否可以进一步扩增CVH，将小鼠用三硝基苯磺酸(TNBS，灌肠剂)处理以诱发结肠炎。在TNBS后28天，当无法检测到炎症时，结肠的机械刺激在CVH小鼠中引起的激发率比在HC小鼠中更高，这与慢性超兴奋性一致(图21A-D)。与基线响应相比，胰蛋白酶进一步将响应增强了16.4±7.9％，NE将响应增强了30.6±9.0％，CS将响应增强了29.6±9.2％。因此，即使由于先前的炎症已经使它们过敏，蛋白酶仍可以增强结肠的伤害感受器的兴奋性。
为了确定正常小鼠中内体PAR2信号传导介导结肠传入神经元的胰蛋白酶引起的敏化作用，将I-343(10μM)、PS2或PS2无效(50μM)应用于接受域。I-343和PS2不会影响基础机械敏感性，但消除了胰蛋白酶引起的机械响应的敏化作用(图9F，G)。PS2无效不会影响基础响应或胰蛋白酶引起的敏化作用(图9H)。该结果支持以下假设：结肠的传入神经元的胰蛋白酶引起的敏化作用需要PAR2内吞作用。
有害的结直肠扩张(CRD)触发内脏运动反应(VMR)，这是一种感受伤害性脑干反射，由腹部肌肉的收缩组成，可以通过肌电图监测。该方法允许评估清醒小鼠的内脏敏感性(Castro，J.等人，Br.J.Pharmacol.2017，175(12):2384-2398)。为了检查蛋白酶引起的超敏性，将(10nM胰蛋白酶+100nM NE+100nM CS)或媒剂(盐水)(100μL)注入健康小鼠的结肠内(灌肠)。15分钟后，用气压调节器气球测量VMR对分级CRD(20-80mm Hg)的响应。在经过媒剂处理的小鼠中，CRD诱发了分级的VMR(图9I)。蛋白酶混合物在40至80mm Hg的所有压力扩增VMR。在蛋白酶混合物前30分钟，将I-343(30mg/kg)注入结肠(100μL灌肠剂)，消除了这种响应(图9J)。由于结肠顺应性的改变会改变VMR对CRD的作用，因此在所有扩张压力均测量了压力/体积关系。结肠的顺应性不受蛋白酶混合物或I-343的影响(图21E和F)。
该结果支持以下假设：结肠的传入神经元和结肠的伤害感受的胰蛋白酶引起的敏化作用需要PAR2内吞作用。
材料及方法
人类受试者：皇后大学的人类伦理委员会批准了人类研究。所有受试者均给予知情同意。内窥镜活检组织是从13名成年IBS-D患者(12名女性)的下行结肠中获得的，对这些患者使用ROME III腹泻为主的IBS标准进行了诊断，并从12名健康对照中获得了诊断。所有IBS患者的症状均大于1年，大多数大于5年。血液检查排除了腹腔疾病，在结肠镜检查时对每天腹泻超过40年的患者进行活检，以排除微观结肠炎。没有患者有暗示感染后IBS的病史。对照活检组织取自接受结肠筛查的无胃肠道症状的患者。活检组织(每名患者8个样品)在含有10％胎牛血清、青霉素/链霉素和庆大霉素/两性霉素B的250μl RPMI培养基中温育(95％O2/5％CO2，24小时，37℃)。上清液在-80℃保存。汇集来自4-6名患者的上清液，并在单独的实验中进行研究。
动物受试者：女王大学、莫纳什(Monash)大学、弗林德斯(Flinders)大学和纽约大学的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committees)以及南澳大利亚卫生与医学研究院(South Australian Health and Medical ResearchInstitute)批准了小鼠和大鼠的研究。研究了小鼠(C57BL/6，雄性，6-15周)和大鼠(Sprague-Dawley，雄性，8-12周)。将动物饲养在温度控制的环境中，光照/黑暗周期为12小时，可自由获取食物和水。通过吸入CO2或过量麻醉和开胸手术处死动物。将动物随机分配治疗，并且没有动物被排除在研究之外。
Par2-NaV1.8小鼠：F2rl1条件敲除C57BL/6小鼠由genOway(法国里昂)生产。F2rl1的最后一个外显子，编码F2RL1的跨膜、胞外和细胞质结构域，位于内含子1中的loxP位点和新霉素盒(neomycin cassette)的侧面。通过用C57BL/6Flp表达的小鼠系繁殖这些小鼠，切除了新霉素盒。为了去除外周神经元中的Par2，在Scn10a基因启动子(B6.129-Scn10atm2(cre )Jnw/H)的控制下，用表达Cre重组酶的小鼠繁殖F2rl1条件敲除小鼠。通过免疫荧光评估了NaV1.8伤害感受器中PAR2的缺失。将野生型和Par2-NaV1.8小鼠的DRG在10％福尔马林中固定3小时，转移至70％酒精中，并包埋在石蜡中。在柠檬酸钠缓冲液中将切片(5μm)脱蜡、再水化、微波，然后在室温、在SuperBlockTM(ThermoFisher Scientific)中封闭一小时。将切片与针对偶联至Alexa-488的PAR2的小鼠抗体(Santa Cruz Biotechnology，SC-13504，1:200，4℃，过夜)温育，并与针对NaV1.8的豚鼠抗体(Alomone Labs，AGP-029，1:200，4℃，过夜)温育，然后与Alexa Fluor-594(Life Technologies，A11076，1:500，室温，1小时)偶联的山羊抗豚鼠二级抗体温育。切片用Nikon Eclipse Ti显微镜以10倍的放大倍率成像；图像用Photometrics CoolSNAP相机捕捉。
躯体伤害感受和炎症：在研究前连续2天，将小鼠适应实验设备、房间和研究人员1-2小时。研究人员对测试试剂不知情。小鼠被镇静(5％异氟烷)，用于足底注射。将Dy4a、Dy4无效、PS2、PS2无效(均为50μM)或媒剂(0.2％DMSO，于0.9％NaCl中)(10μl)注入左后爪。30分钟后，将胰蛋白酶(10或80nM)、CS(2.5或5μM)或NE(1.2或3.9μM)(全部10μl)注射至同一只后爪中。通过用校准的von Frey微丝检查爪子缩回对后爪爪底表面的刺激的响应来评估机械伤害感受性响应。在实验前一天，一式三份测量von Frey评分，以建立每只动物的基线，然后在给药蛋白酶后至多4小时进行测量。为了评估水肿，使用数码卡尺在爪底和爪背表面之间的注射部位测量爪的厚度。为了评估嗜中性粒细胞的浸润，足底注射胰蛋白酶(10μl，80nM)或媒剂后4小时，在10％中性福尔马林缓冲液中固定48-72小时，一分为二，并在福尔马林中固定额外的12小时。将组织在10％0.5M EDTA中脱钙6天，在水中洗涤，转移到70％乙醇中24小时，然后包埋在石蜡中。将切片(5μm)与嗜中性粒细胞抗体Ly6G/6C克隆NIMP-R14(Abcam#ab2557，Lot#GR135037-1，AB_303154，1:800，室温，12小时)一起温育。在Ventana Medical Systems Discovery XT平台上对切片进行显色免疫组织化学处理，并使用Ventana试剂在线进行脱蜡。用蛋白酶-3(Ventana Medical Systems)酶处理Ly6G/Ly6c8分钟。用温育16分钟的山羊抗大鼠辣根过氧化物酶缀合的多聚体检测到Ly6G/Ly6c。
用于电生理研究的DRG神经元的分离：从C57BL/6小鼠中收集支配结肠的DRG(T9-T13)。通过在胶原酶IV(1mg/ml，Worthington)和分散酶(4mg/ml，Roche)中温育(10分钟，37℃)来消化神经节。用火抛光的Pasteur移液器将DRG研磨，然后进一步消化(5分钟，37℃)。洗涤神经元，置于层粘连蛋白-(0.017mg/ml)和聚-D-赖氨酸-(2mg/ml)包被的玻璃盖玻片上，并保存在含有10％胎牛血清、青霉素和链霉素的F12培养基中(95％空气，5％CO2，16小时，37℃)，直到进行电生理研究为止。
膜片钳记录：由于小直径(<30pF电容)神经元具有伤害感知器的特性，因此对其进行了研究(Valdez-Morales E.E.等人，Am J Gastroenterol 2013，108(10):1634-1643)。通过测量基强度来量化兴奋性的变化。使用两性霉素B(240μg/ml，Sigma Aldrich)在室温、在当前钳制模式下进行全细胞穿孔膜片钳记录。用2ml/min的外部溶液灌注记录室。使用Multiclamp 700B或Axopatch 200B放大器进行记录，并通过Digidata 1440A或1322A将其数字化，并使用pClamp 10.1软件(Molecular Devices)进行处理。溶液的成分(mM)：移液器-K-葡糖酸盐110，KCl 30，HEPES 10，MgCl2 1，CaCl2 2；pH 7.25，用1M KOH调节；外部-NaCl 140，KCl 5HEPES 10，葡萄糖10，MgCl2 1，CaCl2 2；用3M NaOH调节pH至7.3-7.4。将神经元经HC或IBS-D受试者的结肠粘膜l活检组织的上清液(200μl上清液与500μl F12培养基混合，过滤)预培育30分钟。神经元还经胰蛋白酶(50nM，10min)，NE(390nM，30min)，CS(500nM，60min)，或媒剂(37℃)预培育，并洗涤。在洗涤后T0或T30分钟测量基强度。为研究蛋白酶诱发的作用机制，将神经元与I-343(100nM，300nM，10μM，30min预温育)，SCH79797(1μM，10min)，Dy4(30μM，30min)，PS2(15μM，30min)，PD98059(50μM，30min)，GF109203X(10μM，30min)或媒剂(预温育并完全包埋)温育。在使用三部分的拮抗剂的实验中，将神经元经化合物10(30μM，60min，37℃)或媒剂预培育并洗涤。将它们在37℃的F12培养基中可变时间地恢复，用HC或IBS-D上清液或胰蛋白酶(50nM，10min)激发，然后洗涤。洗涤后0或30分钟测量基强度。在所有实验中，均计算了暴露于上清液、蛋白酶或媒剂的神经元的平均基强度。
结肠的传入记录：从C57BL/6小鼠切除结肠和直肠(5-6厘米)。传入记录是由内脏神经进行的，如(Hughes，P.A.等人，Gut 2009，58(10):1333-134；Brierley，S.M.等人，Gastroenterology 2004，127(1):166-178)所述。简要地，打开肠并将其在器官浴中平坦地，粘膜面朝上固定。用改性的Krebs溶液(mM:117.9NaCl，4.7KCl，25NaHCO3，1.3NaH2PO4，1.2MgSO4(H2O)7，2.5CaCl2，11.1D-葡萄糖；95％O2，5％CO2，34℃)灌流，该溶液含L型钙通道拮抗剂硝苯地平(1μM)来抑制平滑肌活动，以及含环加氧酶抑制剂吲哚美辛(3μM)来抑制前列腺素的抑制作用。内脏神经延伸到充满石蜡的记录室中，在该记录室中，将细切的链条放置在铂电极上，以单一单位胞外记录通过机械刺激结肠中的接受域产生的动作电位。通过用足够刚度的刷子对粘膜表面进行机械刺激以激活所有类型的机械敏感传入，来识别接受域。一旦确定，用三种不同的机械刺激对接受域进行测试以进行分类：用校准的von Frey微丝(2g力；3次，持续3秒钟)进行静态探测；用von Frey微丝的粘膜抚摸(10mg力；10次)或循环拉伸(5g；1分钟)。结肠的伤害感受器显示出较高的机械激活阈值，并且对有害的扩张(40mmHg)、循环拉伸(≥7g)或2g细丝探测有反应，但对细微的粘膜抚摸(10mg微丝)没有反应。这些神经元表达与疼痛有关的一系列通道和受体，在慢性内脏疼痛模型中变得机械性过敏，并具有伤害感受器表型。因此，它们被称为“结肠的伤害感受器”。一旦建立了对机械刺激(2g微丝)的基线结肠伤害感受器响应，在应用胰蛋白酶(10nM)、NE(100nM)或CS(100nM)10分钟后，重新测试机械敏感性。将蛋白酶应用于放置在目标黏膜接受域上的金属圆柱体上。已经显示出该给药途径可激活结肠的传入(Hughes，P.A.等人，Gut 2009，58(10):1333-134)。使用Spike 2波形标记功能分析动作电位，并根据可区分的波形、幅度和持续时间将动作电位区分为单一单位。
结肠的内脏超敏反应(CVH)：如(Hughes，P.A.等人，Gut 2009，58(10):1333-134；Brierley，S.M.等人，Gastroenterology 2004，127(1):166-178)所述，通过结肠内给药三硝基苯磺酸(TNBS)诱导CVH。简而言之，对12周龄的小鼠禁食5％葡萄糖溶液过夜。将TNBS(100μl，在30％的EtOH中含有4mg TNBS)通过插入肛门3cm处的聚乙烯导管向镇静的小鼠(5％异氟烷)给药。然后允许小鼠恢复28天。此时，小鼠表现出结肠的机械超敏反应、触诱发痛和痛觉过敏。因此，它们被称为CVH小鼠。
对结直肠扩张(CRD)的内脏运动响应(VMR)：腹部肌肉的肌电图(EMG)用于监测VMR对CRD的响应(Eichel，K.等人，Nat.Cell Biol.2016，18(3):303-310)。在异氟烷麻醉下，将电极植入小鼠的右腹肌中。评估VMR之前，小鼠至少恢复了三天。在进行VMR评估的当天，用异氟烷对小鼠进行镇静，然后通过灌肠剂将媒剂(盐水)或蛋白酶鸡尾酒(10nM胰蛋白酶、100nM NE、100nM CS)(100μl)向结肠内给药。在一组小鼠中，在蛋白酶鸡尾酒前30分钟将I-343(30mg/kg，100μl)向结肠内给药。将一个润滑的气球(2.5厘米)引入结直肠直至越过肛门0.25厘米。球囊导管固定在尾巴的底部，并连接至恒压器(Isobar 3，G&J Electronics)，以进行分级和压力控制的球囊扩张。在CRD序列之前，允许小鼠从麻醉中恢复15分钟。在20、40、50、60、70和80mm Hg(持续20秒的时间)以4分钟的间隔进行扩张；最终的扩张是在给药蛋白酶或媒剂后30分钟。记录EMG信号(NL100AK前端)、放大(NL104)、过滤(NL125/126，Neurolog，Digitimer Ltd，带通50-5000Hz)，并数字化(CED 1401，Cambridge ElectronicDesign)以使用Spike2(Cambridge Electronic Design)进行离线分析。模拟的EMG信号经过整流和积分。为了量化每个扩张压力下VMR的大小，针对基线活性(AUC扩张前20秒)校正了扩张期间(20秒)的曲线下面积(AUC)。在清醒的小鼠中对气球施加分级体积(40-200μl，持续20秒)，同时记录相应的结直肠压力，来评估结肠的依从性，如(Eichel，K.等人，Nat.Cell Biol.2016，18(3):303-310；Irannejad，R.等人，Nature 2013，495(7442):534-538)所述。
关于信号传导和搬运研究的DRG神经元分离：从C57BL/6小鼠和Sprague-Dawley大鼠(所有水平)收集DRG。将DRG用胶原酶IV(2mg/ml)和分散酶II(1mg/ml)在37℃温育30分钟(小鼠)和45min(大鼠)。用火抛光的Pasteur移液器研磨将DRG分散。根据制造商的说明，使用Lonza4D-Nucleofector X装置，用mPAR2-GFP(1μg)、FRET生物传感器CytoEKAR、NucEKAR、pmCKAR或CytoCKAR(均为1μg)或BRET生物传感器PAR2-RLuc8(125ng)和βARR2-FYP(475ng)转染分离的神经元。将神经元置于层粘连蛋白-(0.004mg/ml)和聚-L-赖氨酸-(0.1mg/ml)涂覆的玻璃盖玻片上进行共聚焦显微镜检查，置于ViewPlate-96板(PerkinElmer)上进行FRET测定，或置于CulturPlates板(PerkinElmer)上用于BRET测定。在研究前，神经元在含有10％胎牛血清(FBS)、抗生素抗有丝分裂剂和N1补充剂的Dulbecco改性Eagle培养基(DMEM)中保持48小时。
DRG神经元中搬运的PAR2：将表达mPAR2-GFP的小鼠DRG神经元与胰蛋白酶(10nM)，CS(100nM)，NE(100nM)或媒剂温育(30min，37℃)，并固定(4％多聚甲醛，20min，4℃)。如(Jensen，D.D.等人，Sci Transl Med.2017，9(392)，eaal3447)所述，通过间接免疫荧光检测NeuN。使用带有HCX PL APO63x(NA 1.40)油物镜的Leica SP8共聚焦显微镜观察神经元。使用ImageJ软件量化NeuN-阳性神经元中的PAR2内化。神经元体细胞中细胞质的边界由NeuN荧光确定。将边界为0.5μm以内的mPAR2-GFP荧光定义为质膜相关受体。确定质膜与胞质脂质的mPAR2-GFP的比率。
DRG神经元中的FRET测定：表达FRET生物传感器的大鼠DRG神经元被血清-限制(0.5％FBS过夜)，并在HBSS-HEPES中平衡(10mM HEPES，pH 7.4，30min，37℃)。使用Operetta CLS高内涵成像系统(PerkinElmer)或INCell Analyzer 2000(GE HealthcareLife Sciences)分析FRET。对于CFP/YFP发射比率分析，依次使用CFP滤光片(410-430nm)激发细胞，并使用YFP(520-560nm)和CFP(460-500nm)滤光片测量发射。细胞以1或2分钟的间隔成像。测量基线，神经元被胰蛋白酶(10或100nM)或媒剂激发，并继续记录响应30分钟。然后，用关于EKAR生物传感器或PDBu(200nM)的12,13-二丁酸佛波醇酯(PDBu，200nM，10min)和关于CKAR生物传感器的磷酸酶抑制剂鸡尾酒-2(SigmaAldrich，10min)激发神经元。使用Harmony 4.1或Image J 1.51软件分析数据。对准拍摄的图像，根据直径选择细胞，并计算FRET和CFP通道的荧光强度。减去背景强度，并将FRET比率确定为相对于每个细胞的基线(F/F0)的FRET/供体(EKAR)或供体/FRET(CKAR)发射比率的变化。选择PDBu刺激后，对(F/F0)变化>5％的细胞进行分析。将神经元与I-343(10μM)、SCH530348(100nM)或媒剂温育(30分钟，37℃预温育，并完全包埋)。
DRG神经元中的BRET测定：将小鼠DRG神经元在HBSS-HEPES中平衡(30分钟，37℃)，并与海肾荧光素酶底物腔肠素h(Renilla luciferase substrate coelenterazine h)(NanoLight Technologies)一起温育(5μM，5min)。在使用胰蛋白酶(10nM)、NE(100nM)或CS(100nM)激发之前和之后，使用CLARIOstar单色微孔板读数器(BMG LabTech)在475±30nm和535±30nm处测量BRET比率。数据以BRET比率表示，其以YFP与RLuc8信号的比率计算，并归一化为基线平均值。将数据绘制为25分钟测定的曲线下面积。
DRG神经元中的Ca2+测定：如(Tsvetanova，N.G.等人，Nat.Chem.Biol.2014，10(12):1061-1065)所述，在WT和Par2-NaV1.8小鼠的DRG神经元中测量[Ca2+]i。含Ca2+和Mg2+的DMEM中，神经元用Fura-2AM(1μM)装载(45分钟，室温)。使用Nikon Eclipse Ti显微镜(放大20倍)和Photometrics CoolSNAP相机，在340nm、380nm激发和530nm处测量单个神经元的荧光。使用Nikon Ti Element软件分析数据。首先用KCl(65mM)激发培养物，以鉴定响应性神经元，然后将其暴露于胰蛋白酶(100nM)。选择直径≤25μm的细胞进行分析。为了确定激活阈值，将暴露于胰蛋白酶后的340/380比率的量值与基线比率进行比较。若相对于基线的340/380比率≥0.1，则认为神经元对胰蛋白酶有响应。
DRG神经元中的三部分的探针的吸收：将表达mPAR2-GFP的小鼠DRG神经元用Cy5-乙基酯(对照)或Cy5-Chol(200nM，60min，37℃)温育，然后在HBSS-HEPES中洗涤。将神经元转移到HBSS-HEPES的加热室(37℃)中，并在使用胰蛋白酶(100nM，15min)之前或之后通过共聚焦显微镜观察。使用带有HCX PL APO 63x(NA 1.40)油物镜的Leica TCS SP8激光扫描共聚焦显微镜获得图像。Cy5-Chol和Cy5-乙基酯荧光检测的图像采集设置一致。
细胞系，转染：HEK293细胞在补充有10％(v/v)FBS的DMEM中培养(5％CO2，37℃)。必要时可通过用含有0.5％FBS的DMEM替代培养基来实现过夜血清限制。使用聚乙烯亚胺(PEI)(1:6DNA:PEI)瞬时转染细胞。
HEK293细胞中的测定FRET：将HEK293细胞在含Flag-PAR2-HA(2.5μg)和FRET生物传感器CytoEKAR或NucEKAR(2.5μg)的10cm皿中(约50％汇合)瞬时转染(Jensen，D.D.等人，Sci Transl Med.2017，9(392)，eaal3447；Thomsen，A.R.B.等人，Cell 2016，166(4):907-919)。在检查发动蛋白的作用的实验中，将细胞分别用FLAG-PAR2-HA(1.25μg)、FRET生物传感器(1.25μg)，以及DynWT-HA、DynK44E-HA或pcDNA3.1之一(2.5μg)转染。转染后24小时，将细胞接种在ViewPlate-96孔板(PerkinElmer)上。转染后72小时评估FRET，随后过夜血清限制。细胞在HBSS-HEPES中平衡(30分钟，37℃)。使用PHERAstar FSX微孔板读数器(BMGLabTech)测量FRET。对于CFP/YFP发射比率分析，依次使用CFP滤光片(425/10nm)激发细胞，并使用YFP(550/50nm)和CFP(490/20nm)滤光片测量发射。在使用胰蛋白酶(10nM)、NE(100nM)、CS(100nM)、12,13-二丁酸佛波醇酯、PDBu(阳性对照，1μM)或媒剂激发之前和之后测量FRET。计算FRET比率(EKAR的供体/受体强度，或CKAR和Epac的供体/受体强度)并校正至基线和媒剂处理，以确定配体引起的FRET(ΔFRET)。通过比较曲线值下的面积确定治疗效果。信号传导抑制剂被溶解在HBSS-HEPES中。将PS2和PS2无效溶解在HBSS-HEPES+1％DMSO中。将细胞与UBO-QIC(100nM)、AG1478(1μM)、
Figure BDA0002625731940000651
(1μM)、PS2或PS2无效(30μM)或媒剂一起温育(预温育30分钟，并完全包埋)。
HEK293细胞中的BRET测定：将HEK293细胞在含PAR2-RLuc8(1μg)和RIT-Venus或Rab5a-Venus(均为4μg)；Flag-PAR2-HA(1μg)和βARR1-RLuc8(1μg)加上Rab5a-Venus(4μg)；或Flag-PAR2-HA(1μg)和Gαq-RLuc8(0.5μg)、Gb(1μg)、Gg(1μg)以及Rab5a-Venus(4μg)的10cm皿中(约50％汇合)瞬时转染。为了检查发动蛋白的作用，将细胞分别用PAR2-RLuc8(0.5μg)、RIT-Venus或Rab5a-Venus(2μg)，以及DynWT-HA、DynK44E-HA或pcDNA3.1之一(2.5μg)转染。转染后24小时，将细胞接种在CulturPlates(PerkinElmer)上。第二天，将细胞在HBSS-HEPES中平衡，并与腔肠素h(NanoLight Technologies)温育(5μM，5min)。在用蛋白酶、活检上清液或媒剂激发之前和之后，使用LUMIstar Omega微孔板读数器(BMG LabTech)分别在475±30nm和535±30nm测量RLuc8和YFP强度。数据以BRET比率表示，其以YFP与RLuc8信号的比率计算，并归一化为基线平均值，然后减去媒剂。通过比较曲线值下的面积确定治疗效果。
免疫荧光和结构照明显微镜：将瞬时表达Flag-PAR2-HA的HEK293细胞接种在涂有聚D-赖氨酸的高耐受性盖玻片上，并进行温育过夜。将细胞与胰蛋白酶(10nM)或媒剂在DMEM中于37℃温育30分钟。将细胞在冰上的4％多聚甲醛中固定20分钟，然后在PBS中洗涤。将细胞在PBS+0.3％皂苷+3％NHS中封闭1小时。将细胞与抗HA(大鼠抗-HA，1:1,000，Roche)、EEA-1(兔抗-EEA-1 1:100，Abcam)、Gαq(小鼠抗-GNAQ 1:100，Millipore)的一级抗体在4℃、于PBS+0.3％皂苷+1％NHS中一起温育过夜。在PBS中洗涤细胞，并与二级抗体(山羊抗-大鼠Alexa568、驴抗-兔Alexa488、山羊抗-小鼠Dylight405，1:1,000，Invitrogen)一起在室温温育1小时。用PBS洗涤细胞，并用延长的Diamond固定培养基(ThermoFisher)固定在载玻片上。使用具有SR Apo-TIRF100x/1.49物镜的Nikon N-SIM Eclipse TiE倒置显微镜，通过超高分辨率结构照明显微镜(SIM)观察细胞。使用405、488和561nm激光器和在Andor iXon 3EMCCD相机上获取用于标准蓝、绿和红光发射的滤光片组来在3D-SIM模式中获取图像。以125nm的z间隔收集Z堆叠。NIS-Elements AR软件用于重建SIM图像。
cDNA：已描述BRET传感器PAR2-RLuc8、KRas-Venus、Rab5a-Venus和βARR2-YFP(Jensen，D.D.等人，Sci Transl Med.2017，9(392):eaal3447；Yarwood，R.等人，Proc NatlAcad Sci USA 2017，114(46):12309-12314)。FRET传感器CytoEKAR、NucEKAR、CytoCKAR和pmCKAR来自Addgene(分别为质粒18680、18681、14870、14862)。
IP1积累测定：将KNRK-hPAR2、KNRK、HEK293或HT-29细胞以50x103细胞/孔的密度接种到透明的96孔板(PerkinElmer)上。培养24小时后，用IP1刺激缓冲液(10mM HEPES、1mMCaCl2、0.5mM MgCl2、4.2mM KCl、146mM NaCl、5.5mM葡萄糖、50mM LiCl；37℃、5％CO2)替换培养基。在添加激动剂之前，将细胞与拮抗剂或载体预温育30分钟。然后将细胞进一步温育40分钟。吸出刺激缓冲液，将细胞在裂解缓冲液中温育10分钟(
Figure BDA0002625731940000673
Figure BDA0002625731940000671
检测试剂盒，Cisbio)。将裂解液转移到384孔OptiPlate(PerkinElmer)中，并检测IP1(
Figure BDA0002625731940000672
检测试剂盒，Cisbio)。使用Envision读板仪(PerkinElmer LifeSciences)测量均相时间分辨的FRET。
统计：结果为平均值±SEM。差异的评估方法是使用学生t检验(两次比较)或单向或双向ANOVA(多次比较)，然后进行Tukey的多次比较检验(电生理测定)或Dunnett的多次比较检验(躯体伤害感受，单细胞FRET分析)。对于BRET分析和总体FRET分析，将曲线数据下的面积归一化以匹配单独的胰蛋白酶响应，并使用单一样本t检验与100％进行比较。对于结肠的伤害感受(VMR至CRD)的分析，数据通过广义估计方程进行统计学分析，然后在适当的情况下使用SPSS 23.0，进行Fisher最小显著差事后检验。使用GraphPad Prism 7软件(美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行统计分析和图形准备。

Claims (20)

1.式(I)的化合物：
Figure FDA0002625731930000011
或其药学上可接受的盐，其中：
R1为H、C1-C6烷基或卤素；
R2为C1-C6烷基、C3-C6环烷基或C1-C6芳基，其各自任选地被1至3个卤素取代；
R3为氧代或C1-C6烷基；
p为整数0至3；
R4为-C1-C6烷基S(O)2OH、-1,2,3-三唑-1-乙酸、-NHR7、-双环[2.2.2]辛烷C(O)OR6、-C4-C8环烷基-R5、4-6元杂环或杂芳基基团，其被-C1-C6烷基-R5或-(CH2)2C(O)NHC2-C10烷基取代，其中所述C2-C10烷基被2至10个-NH2或-OH取代；
R5为-C(O)NHR7或-NHC(O)R7；
R6为H或R7
R7为-R8、-C1-C20烷基、-C1-C20烷基C(O)NH2或-C1-C20烷基C(O)NR8，其中所述-C1-C20烷基、-C1-C20烷基C(O)NH2和-C1-C20烷基C(O)NR8任选地被2至10个-NH2或-OH取代，且其中所述烷基基团中的一个或多个碳原子任选地被氮或氧替代；
R8表示为下式：
Figure FDA0002625731930000012
其中
L为长度为1nm至50nm的接头部分；和
LA为促进所述化合物嵌入质膜的脂质锚。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为卤素且R2为C1-C6烷基。
3.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为氟且R2为叔丁基基团。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3为C1-C6烷基且p为2。
5.根据权利要求4所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3为甲基且p为2。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述脂质锚(LA)氛围分成脂质膜，所述脂质膜在4℃的非离子清洁剂中不溶。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中促进所述化合物嵌入质膜的所述脂质锚(LA)表示为式(IIa)、(IIIa)或(IVa)：
Figure FDA0002625731930000021
其中
R1a为任选取代的C1-12烷基、烯基、炔基或烷氧基基团；
R2a和R3a、R3b、R4b、R4c、R5a、R6a、R7a、R7b、R8a、R8b、R9a、R9b、R10a、R11a、R11b、R12a、R12b、R13a、R14a、R15a、R15b、R16a和R16b独立地为H、C1-3烷基、羟基、C1-3烷氧基或氨基；或
任选地，R3a、R3b和/或R4b、R4c和/或R7a、R7b和/或R8a、R8b和/或R11a、R11b和/或R12a、R12b和/或R15a、R15b和R16a、R16b一起得到＝O(通过双键与氧连接)；
R4a为C、O、NH或S；和
Figure FDA0002625731930000031
表示单键或双键。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L为长度为1nm至50nm的接头部分，其中L表示为式(XVa)：
Figure FDA0002625731930000032
其中
Z为所述接头和所述脂质锚之间的连接基团，且为-C1-C10烷基-、-C2-C10烯基-、-C2-C10炔基-、-C1-C10烷基C(O)-、-C2-C10烯基C(O)-或-C2-C10炔基C(O)-；或
Z与其相邻的胺一起为任选地C-末端酰胺化的氨基酸，所述氨基酸选自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸；其中所述氨基酸通过其侧链官能团连接至所述脂质锚；
m为1或2；
n为1至20；和
p为1至8。
9.化合物或其药学上可接受的盐，其选自：
Figure FDA0002625731930000033
Figure FDA0002625731930000041
Figure FDA0002625731930000051
Figure FDA0002625731930000061
10.药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
11.一种抑制PAR2信号传导的方法，其包括将所述受体与根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐接触。
12.一种在有此需要的受试者中抑制PAR2信号传导的方法，其包括向所述受试者给药有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
13.一种预防或治疗由PAR2信号传导介导的疾病或病症的方法，其包括向有此需要的受试者给药有效量的根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述疾病或病症由内体PAR2信号传导介导。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述由PAR2信号传导介导的疾病或病症选自急性和慢性炎性病症、肿瘤转移、胃肠动力、疼痛、痒、皮肤病症例如特应性皮炎、饮食引起的肥胖、哮喘、类风湿性关节炎、牙周炎、炎性肠疾病、肠道易激综合征、癌症、纤维化疾病、代谢功能紊乱和神经疾病。
16.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述由PAR2信号传导介导的疾病或病症为与肠道易激综合征相关的疼痛。
17.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其用于预防或治疗由PAR2信号传导介导的疾病或病症。
18.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗由PAR2信号传导介导的疾病或病症。
19.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或根据权利要求10所述的药物组合物，其用于预防或治疗由PAR2信号传导介导的疾病或病症。
20.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或根据权利要求10所述的药物组合物，其用于预防或治疗疾病或病症，所述疾病或病症选自急性和慢性炎性病症、肿瘤转移、胃肠动力、疼痛、痒、皮肤病症例如特应性皮炎、饮食引起的肥胖、哮喘、类风湿性关节炎、牙周炎、炎性肠疾病、肠道易激综合征、癌症、纤维化疾病、代谢功能紊乱和神经疾病。
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