BR112018012425B1 - Composto tripartido, e, composição farmacêutica - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a compostos tripartidos que compreendem uma fração moduladora para receptores acoplados à proteína G endossomal como receptor de neurocinina-1, um ligante e uma âncora lipídica adequada para ancorar o composto tripartido em uma membrana plasmática. A presente invenção também se refere a um pró-fármaco e a uma composição farmacêutica que compreende o composto tripartido e ao uso do composto tripartido para o tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por receptores acoplados à proteína G endossomal, como a sinalização NK1R.
Description
[001] A presente invenção refere-se a compostos tripartidos e seus usos e, em particular, a compostos tripartidos que atuam como moduladores para receptores acoplados à proteína G endocitados.
[002] Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são a maior família de receptores de superfície celular (~850 membros), participam da maioria dos processos fisiopatológicos e são o alvo de ~30% dos fármacos terapêuticos (Audet, M. & Bouvier, M. Nat Chem Biol 2008, 4, 397-403). GPCRs de superfície celular interagem com ligantes extracelulares e se acoplam a proteínas G heterotriméricas, que desencadeiam vias de sinalização que se originam da membrana plasmática, incluindo formação de segundos mensageiros, transativação dos receptores do fator de crescimento e regulação dos canais iônicos.
[003] Até recentemente, era amplamente presumido que a ativação de GPCRs, a subsequente sinalização a jusante e a terminação do sinal ocorriam exclusivamente na membrana plasmática. A sinalização na membrana plasmática é terminada dentro de minutos de ativação através da fosforilação do receptor por quinases de GPCR que são seletivas para a conformação do receptor ligado ao ligante ativo. Os receptores fosforilados se ligam então a β-arrestina (βarr), o que impede estericamente o acoplamento entre o receptor e a proteína G, terminando assim a ativação da proteína G mediada por agonista. As βarrs promovem ainda a transferência do receptor ligado ao ligante da superfície celular para endossomas precoces através de endocitose dependente de dinamina e clatrina. Uma vez endocitados, os grupos ligante e fosfato são removidos do GPCR e o receptor é rapidamente redistribuído para a membrana celular ou é transportado para um lisossoma para degradação.
[004] Recentemente, no entanto, descobriu-se que uma gama diversificada de GPCRs nem sempre segue o paradigma convencional. Estudos descobriram que após ligação do ligante e ativação do receptor, alguns GPCRs da superfície celular internalizam e redistribuem em endossomas precoces onde a sinalização por proteína G heterotrimérica é mantida durante um período de tempo prolongado. Assim, em vez de apenas agir como um conduto para o tráfego de GPCR para reciclagem ou vias degradatórias, os endossomas podem ser um sítio vital de transdução de sinal (Murphy, J. E. et al. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106, 17615-17622). Ao recrutar GPCRs e proteínas quinases ativadas por mitógenos para endossomas, as βarrs podem mediar a sinalização por GPCR endossomal (Murphy, J. E. et al. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106, 17615-17622; DeFea, K. A. et al. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97, 11086-11091; DeFea, K. A. et al. J Cell Biol 2000, 148, 1267-1281), embora alguns GPCRs induzam sinais dependentes de Gαs de endossomas (Calebiro, D. et al. PLoS Biol 2009, 7, e1000172; Irannejad, R. et al. Nature 2013, 495, 534-538).
[005] As βarrs recrutam diversas proteínas sinalizadoras para receptores ativados em membranas plasmáticas e endossomais e são mediadoras essenciais da sinalização. As cascatas de MAPK [ERK, c-Jun quinase aminoterminal (JNK), p38] são as vias de sinalização porpendentes de βarrs mais completamente caracterizadas. A primeira evidência de que as βarrs são participantes ativos na sinalização foi a observação de que mutantes dominantes negativos de βarr inibiram a ativação induzida por β2AR de ERK1/2 (Daaka Y, et al. J Biol Chem 1998, 273, 685-688). Subsequentemente, verificou-se que as βarrs acoplam β2AR a c-Src e medeiam a ativação de ERK1/2 (Lutterall L. M. et al. Science 1999, 283, 655661). βDe modo similar, as arrs participam na sinalização por ERK1/2 por outros GPCRs, incluindo o receptor de neurocinina-1 (NK1R), receptor ativado por protease 2 (PAR2), receptor tipo 1A de angiotensina II (AT1AR) e receptor de vasopressina V2 (V2R). Essas observações levaram à ideia de que as βarrs são arcabouços que acoplam GPCRs ativados com complexos de sinalização por MAPK. βAs arrs medeiam assim uma segunda onda de sinalização por GPCR que é distinta da sinalização por pendente de proteína G na membrana plasmática.
[006] Consequentemente, a modulação de GPCRs endocitados pode, vantajosamente, prover um novo método para tratar o vasto número de doenças e distúrbios ligados a essa grande família de receptores.
[007] São providos novos compostos tripartidos que são adequados para a modulação da sinalização por GPCR endossomal. Os compostos tripartidos da presente invenção podem prover um novo método para o tratamento e a prevenção de doenças e distúrbios mediados por esses receptores.
[008] Por conseguinte, em um aspecto, a presente invenção provê um composto tripartido para alvejar a sinalização por GPCR endossomal da fórmula (I): em que LA é uma âncora lipídica que promove inserção do composto em uma membrana plasmática; L é uma fração ligante de 1 nm a 50 nm de comprimento; e X é o modulador do GPCR endossomal; ou ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[009] Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê um composto tripartido para alvejar a sinalização por receptor de neurocinina-1 (NK1R) endossomal da fórmula (I): em que LA é uma âncora lipídica que promove inserção do composto em uma membrana plasmática; L é uma fração ligante de 1 nm a 5 nm de comprimento, em que L é representado pela fórmula (IVa): em que Z é o grupo de ligação do ligante à âncora lipídica LA; em que Z é definido por: ai) Ci-Cioalquila-, -C2-Cioalquenila-, -C2-Cioalquinila-, -Ci- CioalquilaC(O)-, -C2-CioalquenilaC(O)- ou -C2- Ci0alquinilaC(O)-; ou bi) junto com a amina adjacente, um aminoácido opcionalmente amidado no terminal C selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido é ligado à âncora lipídica através do seu grupo funcional de cadeia lateral; e Y é o grupo de ligação do ligante ao modulador X, que é um modulador do receptor de neurocinina-i (NKiR) endossomal, em que a2) Y é definido por uma ligação covalente, -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)O-, -O-C(O)-, -NH-C(O)-, ou -C(O)S-; ou b2) Y, quando tomado junto com o grupo amido adjacente, é definido por: a) um aminoácido alfa selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido alfa é opcionalmente ligado ao modulador do receptor NK1R endossomal através do grupo funcional de cadeia lateral de pelo menos um dos ditos aminoácidos alfa; ou b) um aminoácido beta, gama ou delta que compreende um grupo funcional de cadeia lateral que também é encontrado em ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido beta, gama ou delta é opcionalmente ligado ao modulador do receptor NK1R endossomal através de pelo menos um dos ditos grupos funcionais de cadeia lateral; ou c) um peptídeo formado a partir de aminoácidos alfa, beta, gama ou delta, em que o peptídeo compreende pelo menos um aminoácido alfa, beta, gama ou delta que tem um grupo funcional de cadeia lateral que também é encontrado em ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; ou combinações dos mesmos, em que o dito peptídeo é opcionalmente ligado ao modulador do receptor NK1R endossomal através de pelo menos um dos ditos grupos funcionais de cadeia lateral; m é 1 ou 2; n é de 1 a 20; p é de 1 a 8; e X é o modulador do receptor de neurocinina-1 (NK1R) endossomal definido pela estrutura X = M-R1- conforme definido pela fórmula (Va) ou pela fórmula (Vb), opcionalmente fórmula (V), em que M é ligado covalentemente através de R1 a Y do ligante L: Opcionalmente em que: R1 é definido por -F1-R2’-F2-, em que: M é ligado covalentemente a R2’ através de F1 (M-F1-R2’-), e R2’ é adicionalmente ligado covalentemente a Y do ligante L através de F2 (M-F1-R2’-F2-Y-), e F1 e F2 têm, independentemente um do outro, uma ligação covalente a R2’; R2’ é definido por: a3) ligação covalente, b3) grupo C1-4 alquila linear ou ramificado, tendo opcionalmente, como um substituinte, um grupo heterocíclico aromático ou não aromático de 5 a 7 membros, que opcionalmente adicionalmente contém, em adição aos átomos de carbono, 1 a 4 heteroátomos selecionados do grupo que consiste em átomo de oxigênio, átomo de enxofre e átomo de nitrogênio, e opcionalmente adicionalmente tendo um ou dois oxo como substituintes, c3) um grupo heterocíclico não aromático de 5 a 7 membros, opcionalmente adicionalmente contendo, além de átomos de carbono, 1 ou 2 átomos de nitrogênio, e tendo opcionalmente 1 a 3 substituintes selecionado de um grupo que consiste em oxo, C1-6 alquila linear ou ramificada, fenila, C1-6 alquil-carbonila linear ou ramificada e C1-6 alquil-carbonilamino, d3) grupo C1-6 alquila linear ou ramificado, tendo opcionalmente substituinte(s) selecionado(s) do grupo que consiste em: (i) um grupo heterocíclico aromático ou não aromático de 5 a 7 membros contendo, além de átomos de carbono, 1 a 4 átomos de nitrogênio, e tendo opcionalmente um ou dois oxo como substituintes, (ii) um grupo C1-6 alquil-carbonilamino, (iii) um grupo C1-6 mono- ou dialquilamino, e (iv) um grupo C1-6 alcóxi; e3) grupo C1-6 alcóxi linear ou ramificado, f3) grupo C3-8 cicloalquila tendo opcionalmente 1 ou 2 substituintes selecionados de um grupo que consiste em um grupo C1-6 alquil- carbonilamino, um grupo C1-6 alcóxi-carbonilamino e um grupo amino, g3) grupo carbamoíla, h3) grupo C1-6 alcoxi-carbonila linear ou ramificado, i3) grupo C1-6 alquil-carbamoíla; ou combinações dos mesmos; F1 é definido por uma ligação covalente ou por uma fração selecionada da lista de grupos funcionais que consiste em: -C(=O)-, -C(=O)-O-, -C(=O)-N(R4’) , e -S(=O)2-N(R4’)-; com R4’ sendo átomo de hidrogênio ou C1 a C12 alquila linear ou ramificada; F2 é definido por uma fração selecionada da lista de grupos funcionais que consiste em: -C(=O)-, -C(=O)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2)n-C(=O)- -C(=O)-(CH2)n- C(=O)-O-(CH2)n-C(=O)- -C(=O)-O-(CH2)n- M é definido pelos seguintes substituintes: R2 é um átomo de hidrogênio, ou grupo C1-6 alquila linear ou ramificado, que é opcionalmente halogenado; R3 e R3’ são, cada um, independentemente um átomo de carbono ou metila, ou R3 e R3’ são opcionalmente ligados um ao outro para formar um anel junto com um átomo de carbono ligado aos mesmos; R4 é um átomo de cloro, metila ou trifluorometila; R5 é um átomo de cloro, metila ou trifluorometila; e um grupo representadopela fórmula: é um grupo aromático tendo opcionalmente substituinte(s); p = 0, 1 ou 2; q = 1 ou 2; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0010] Em uma outra modalidade preferida do composto tripartido, a âncora lipídica se divide em membranas lipídicas que são insolúveis em detergente não iônico a 4°C; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0011] Em uma outra modalidade preferida do composto tripartido, LA é uma âncora lipídica, que opcionalmente promove inserção do composto em uma membrana plasmática, representada pela fórmula (IIaa), opcionalmente pela fórmula (IIa) ou fórmula (IIIa): em que R1a é um grupo C1-12 alquila, alquenila, alquinila, alcóxi opcionalmente substituído; 2a 3a 3b 4b 4c 5 6 7a 7b 8a 8b 9a 9b 10 R , R , R , R , R , R, R, R , R , R ; R , R , R , R , R 11a 11b 12a 12b 13 14 15a 15b 16a 16b , R , R , R , R , R , R , R , R , R são, independentemente, H ou C1-3alquila; hidroxila, alcóxi ou amino; ou, opcionalmente, R3a R3b e/ou R4b R4c, e/ou R7a R7b, e/ou R8a R8b, e/ou R9a R9b, e/ou R11a R11b, e/ou R12a R12b, e/ou R15a R15b, e/ou R16a R16b são tomados juntos para dar =O (ligação dupla a oxigênio); R4a é CH2, O, NH ou S; e representa uma ligação simples ou dupla; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0012] Em uma outra modalidade preferida do composto tripartido, o modulador do NK1R endossomal é selecionado de pelo menos um composto de acordo com a fórmula (VI) ou fórmula (Vb) em que R2 é metila ou ciclopropila; R3 é um átomo de hidrogênio ou CH3; R4 e R5 são trifluorometila; e um grupo representado por, que é um grupo representado pela fórmula: em que R6 é um átomo de hidrogênio, metila, etila ou isopropila; R7 é um átomo de hidrogênio, metila ou átomo de cloro; e R8 é um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor, um átomo de cloro ou metila; ou 3-metiltiofen-2-ila; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0013] Em uma outra modalidade preferida do composto tripartido, a estrutura parcial:ou R3 é átomo de hidrogênio, e R3’ é átomo de hidrogênio; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0014] Em uma outra modalidade preferida do composto tripartido, a fração -R2’-F1-M, que é ligada covalentemente ao ligante L por -F2- como mostrado na seguinte estrutura, é a seguinte: em que R3 é hidrogênio ou -CH3; R4 é hidrogênio ou flúor; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0015] Em uma outra modalidade preferida do composto tripartido, a fração -R2’-F1-M, que é ligada covalentemente ao ligante L por -F2- como mostrado na seguinte estrutura, é a seguinte: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0016] Em uma outra modalidade preferida do composto tripartido, a fração -F2-R2’-F1-M, que é ligada covalentemente por Y ao ligante L como mostrado nas seguintes estruturas, é selecionada da lista de compostos que consiste em:
e combinações dos mesmos, em que R3 é átomo de hidrogênio ou CH3; R4 é hidrogênio ou flúor ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[0017] Em uma outra modalidade preferida do composto tripartido, a fração -F2-R2’-F1-M, que é ligada covalentemente por Y ao ligante L como mostrado nas seguintes estruturas, é selecionada da lista de compostos que consiste em:
e combinações dos mesmos; ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[0018] Em uma outra modalidade preferida do composto tripartido, o composto é selecionado da lista de compostos que consiste nas seguintes estruturas:
em que R3 é átomo de hidrogênio ou -CH3; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0019] Em um outro aspecto da invenção, é provido um pró-fármaco do composto tripartido.
[0020] Em um outro aspecto da invenção, é provida uma composição farmacêutica que compreende o composto tripartido, ou um pró-fármaco do mesmo.
[0021] Em uma outra modalidade preferida, a composição farmacêutica é para uso como um antagonista do receptor de taquicinina.
[0022] Em uma outra modalidade preferida, a composição farmacêutica é provida para tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por NK1R endossomal.
[0023] Em uma outra modalidade preferida, a composição farmacêutica é provida para uso na profilaxia ou no tratamento de uma doença do trato urinário inferior, uma doença gastrointestinal ou uma doença do sistema nervoso central.
[0024] Em uma outra modalidade preferida, a composição farmacêutica é provida para profilaxia ou tratamento de bexiga hiperativa, síndrome do intestino irritável, doença inflamatória intestinal, vômitos, náuseas, depressão, neurose de ansiedade, ansiedade, transtorno de ansiedade generalizada (TAG), dor visceral pélvica ou cistite intersticial.
[0025] Em uma outra modalidade preferida, a composição farmacêutica é provida para tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por NK1R endossomal selecionado da lista de náusea e vômito induzidos por quimioterapia (CINV), síndrome de vômitos cíclicos, náuseas e vômitos no pós-operatório, distúrbios afetivos e aditivos, incluindo depressão e ansiedade, transtorno de ansiedade generalizada (TAG), distúrbios gastrointestinais incluindo doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, gastroparesia e dispepsia funcional, distúrbios inflamatórios crônicos incluindo artrite, doenças respiratórias incluindo DPOC e asma, distúrbios urogenitais, distúrbios sensoriais e dor incluindo dor somática e dor visceral, prurido, infecções virais e bacterianas e distúrbios proliferativos (câncer), e combinações dos mesmos.
[0026] Em uma outra modalidade preferida, a doença ou o distúrbio mediado por sinalização por NK1R endossomal é dor somática ou dor visceral.
[0027] Em uma outra modalidade preferida, a doença ou o distúrbio mediado por sinalização por NK1R endossomal é uma doença ou um distúrbio crônico.
[0028] Em um outro aspecto da invenção, o composto tripartido é usado no tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por NK1R endossomal.
[0029] Em um outro aspecto da invenção, é provida uma composição farmacêutica, em que a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto tripartido, ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, junto com pelo menos um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[0030] Em um outro aspecto da invenção, é provido um composto tripartido para alvejar a sinalização por GPCR endossomal da seguinte fórmula:
[0031] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um composto tripartido para alvejar a sinalização por GPCR endossomal da fórmula (Ie): em que LA é uma âncora lipídica que promove inserção do composto em uma membrana plasmática; L é uma fração ligante de 1 nm a 5 nm de comprimento; e X é um modulador de um GPCR endossomal; em que a âncora lipídica se divide em membranas lipídicas que são insolúveis em detergente não iônico a 4°C; ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[0032] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um composto tripartido para alvejar a sinalização por GPCR endossomal da fórmula (Ia): em que LA é uma âncora lipídica que promove inserção do composto em uma membrana plasmática representada pelas fórmulas (IIa) ou (IIIa): em que R1a é um grupo C1-12 alquila opcionalmente substituído; R2a e R3a são, independentemente, H ou C1-3alquila; R4a é C, O, NH ou S; representa uma ligação simples ou dupla; L é um grupo ligante de 1 nm a 5 nm de comprimento; e X é um modulador de um GPCR endossomal; ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[0033] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um composto tripartido para alvejar a sinalização por GPCR endossomal da fórmula (Ib): em que LA é uma âncora lipídica que promove inserção do composto em uma membrana plasmática representada pelas fórmulas (IIa) ou (IIIa):em que R1a é um grupo C1-12 alquila opcionalmente substituído; R2a e R3a são, independentemente, H ou C1-3alquila; R4a é C, O, NH ou S; representa uma ligação simples ou dupla; L é representado pela fórmula (IVa):em que Z é o grupo de ligação entre o ligante e a âncora lipídica e é - Ci-Cioalquila-, -C2-Cioalquenila- -C2-C10alquinila-, -Ci-CioalquilC(O)-, - C2-CioalquenilC(O)- ou -C2-CioalquinilC(O)-; ou Z, junto com a amina adjacente, é um aminoácido opcionalmente amidado no terminal C selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido é ligado à âncora lipídica através do seu grupo funcional de cadeia lateral; Y é o grupo de ligação entre o ligante e o modulador de um GPCR endossomal e é -O-, -NH-, -S- , -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)O- ou -C(O)S-; ou Y, junto com o grupo amido adjacente, é um aminoácido selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido é ligado ao modulador de um GPCR endossomal através do seu grupo funcional de cadeia lateral; m é 1 ou 2; n é de 1 a 20; p é de 1 a 8; e X é um modulador de um GPCR endossomal; ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[0034] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método para modular a sinalização por GPCR endossomal que compreende contactar um GPCR endossomal com um composto tripartido de fórmula (Ie) como definido aqui.
[0035] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método para modular a sinalização por GPCR endossomal em um indivíduo em necessidade da mesma que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um composto tripartido de fórmula (Ie) como definido aqui.
[0036] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por substância endossomal P (SP) ou do receptor da neurocinina 1 (NK1R) que compreende administrar uma quantidade eficaz de um composto tripartido de fórmula (Ie) como aqui definido a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0037] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por CGRP endossomal que compreende administrar uma quantidade eficaz de um composto de fórmula (Ie) como aqui definido a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0038] Esses e outros aspectos da presente invenção se tornarão mais evidentes para o destinatário versado após a leitura da seguinte descrição detalhada em conexão com os exemplos e reivindicações anexos.
[0039] Figura 1: Representação esquemática do composto tripartido da presente invenção ilustrando as suas diferentes frações e o padrão de ligação entre as frações.
[0040] Figura 2: Procedimento sintético para preparar o composto tripartido Composto A.
[0041] Figura 3: Procedimento sintético para preparar o composto tripartido Composto B.
[0042] Figura 4: Procedimento sintético para preparar as frações moduladoras de núcleo Composto C-1 e Composto C-2, antes de acoplar esses moduladores via -Y- ao ligante.
[0043] Figura 5: Representações gráficas do tráfego subcelular de NK1R. A. Análise BRET da proximidade entre NK1R-RLuc8, β-arr1/2-YFP, KRas-Venus ou Rab5a-Venus. B-C. BRET induzida por SP em células HEK293 entre NK1R-RLuc8 e β-arr1-YFP (B) ou β-arr2-YFP (C). D-F. BRET induzida por SP em células HEK293 entre NK1R-RLuc8 e KRas- Venus (D, E) ou Rab5a-Venus (D, F). E, F mostram efeitos de inibidores endocíticos. *P<0,05, ***P<0,001. Observações triplicadas, n > 3 experimentos.
[0044] Figura 6: Representações gráficas de sinalização subcelular de NK1R A, C, E. Biossensores FRET para detecção de ERK ativado no núcleo (NucEKAR), PKC ativado no citosol (CytoCKAR) e cAMP no citosol (CytoEpac2). FRET induzida por SP em células HEK293 que expressam NK1R usando biossensores para ERK nuclear (B, G, H), PKC citosólica (D) e cAMP citosólico (F). Os efeitos dos inibidores endocíticos são mostrados. B, D, E, G, H mostram a área sob a curva (AUC). **P<0,01, ***P<0,001 SP para veículo; AA P <0,01, AAA P <0,001 controle de SP para SP com Dy4, PS2, dinamina K44E, siRNA de dinamina ou siRNA de clatrina. n=30-170 células.
[0045] Figura 7: Representações gráficas da sinalização por NK1R dependente de proteína G. A-D. BRET induzida por SP em células HEK293 entre NK1R-RLuc8 e KRas-Venus (A), NK1R-RLuc8 e Rab5a-Venus (B), Gαq-RLuc8 e GY2-Venus (C), e Gαq-RLuc8 e Rab5a-Venus (D) após 15 min. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 para linha de base. Observações triplicadas, n > 3 experimentos. E-G. FRET induzida por SP em células HEK293 que expressam NK1R para ERK nuclear (E), PKC citosólica (F) e cAMP citosólico (G). *** P <0,001 SP para veículo; AAA P <0,001 controle de SP para SP com inibidor. n=35-67 células.
[0046] Figura 8: Representações gráficas de endocitose de NK1R evocada por SP e excitabilidade em neurônios espinhais. A. Efeitos dos inibidores endocíticos em endocitose de NK1R-IR estimulada por SP em neurônios do corno dorsal da lâmina I de fatias da medula espinhal de ratos. Os resultados mostram a razão entre o NK1R-IR citosólico e da membrana plasmática em neurônios espinhais de ratos. ****P<0,0001, n=6 neurônios por tratamento. Veh, veículo. B-D. Efeitos dos inibidores endocíticos no disparo evocado por SP de neurônios espinhais de ratos. B mostra traços representativos. C mostra taxa de disparo normalizada para resposta a 2 min (P>0,05). D mostra o tempo de disparo como duração da resposta ao último potencial de ação. n=7 células por tratamento, 17 ratos, *P<0,05, **P<0,01.
[0047] Figura 9: Representações gráficas de endocitose de NK1R e sinalização por ERK em neurônios espinhais. Veículo (Veh), Dy4, Dy4 inativa, PS2 ou PS2 inativa foi injetada por via intratecal (i.t.) em ratos 30 min antes da injeção intraplantar (i.pl.) de veículo ou capsaicina (Cap). A mostra a razão entre o NK1R-IR citosólico e da membrana plasmática, e B mostra a razão entre os neurônios de pERK-IR e de NeuN-IR. LI, LII, lâmina I, II. Escala A, 10 μm; C, 25 μm. **P<0,01, ***P<0,001. n=3 ratos; NKiR, análise de 6 células por condição, análise de p-ERK de 6 campos por condição.
[0048] Figura 10: Representações gráficas de hiperalgesia mecânica, edema inflamatório e coordenação motora em camundongos. A-D. Veículo (Veh) ou inibidor endocítico foi injetado por via intratecal 30 min antes da injeção intraplantar de capsaicina (Cap) ou veículo na pata esquerda. A, B mostram respostas de retirada de von Frey da pata esquerda injetada, C mostra respostas de edema da pata esquerda injetada. D. Veículo ou inibidor endocítico foi injetado por via intratecal 30 min antes da medição da latência do rotarod (barra rotatória). E-H. siRNA para dinamina-1 (E, F), βarr1+2 (G, H) ou siRNA de controle foi injetado por via intratecal 24-48 h antes da injeção intraplantar de capsaicina na pata esquerda. E, G mostram knockdown (redução da expressão) no corno dorsal da dinamina-1 determinado por Western blot (E), e βarr1+2 determinada por RT-PCR (G). F, H mostram respostas de retirada de von Frey da pata esquerda injetada. I. Veículo ou U0126 foi injetado por via intratecal 30 min antes da injeção intraplantar de capsaicina ou veículo na pata esquerda. Respostas de retirada de von Frey da pata esquerda injetada foram medidas. J, K. Veículo ou inibidor endocítico foi injetado por via intratecal 30 min antes da injeção intraplantar de formalina (Form). O comportamento nocifensivo foi medido por 60 min. J mostra cinética de resposta. K mostra respostas durante as primeira e segunda fases. L. CFA foi injetado na pata esquerda 36 h antes da injeção intratecal de veículo ou inibidor endocítico. Respostas de retirada de von Frey da pata esquerda injetada foram medidas. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001 comparado a Veh/Cap, siRNA de controle, Veh/Form ou CFA/Veh. (n), número de camundongos.
[0049] Figura 11: Representações gráficas do alvejamento de NK1R endossomal usando sondas tripartidas. A. Estrutura de sondas tripartidas com carga de Cy5, espantida ou L-733.060. B. Captação de Cy5-etil éster ou Cy5- colestanol (Cy5-Chol) (30 min, 37°C) em células HEK293. Asterisco, extracelular; pontas de seta, membrana plasmática; setas, endossomas. Escala, 10 μm. C. Ativação de SP de ERK nuclear em células HEK293. Pré- incubação: As células foram pré-incubadas com espantida (Span), Composto 1 ou SR140,333 (SR) durante 30 min, e em seguida, imediatamente estimuladas com SP (na presença de inibidores). Incubação por pulsos: As células foram incubadas por pulsos com espantida, Composto 1 ou SR140,333 durante 30 min, lavadas e estimuladas com SP 240 min após lavagem. Os resultados mostram área sob a curva (AUC) ao longo de 20 min. **P<0,01, *** P <0,001 SP para veículo (Veh); AAA P <0,001 SP com veículo para SP com espantida, espantida-colestanol, ou SR140,333. n=31-83 células.
[0050] Figura 12: Representações gráficas do alvejamento de NK1R endossomal em neurônios espinhais usando sondas tripartidas. A-C. Disparo evocado por SP de neurônios espinhais de ratos. A mostra traços representativos. B mostra taxa de disparo normalizada para resposta a 2 min (eventos.2 min-1: Composto 1, 196,6±81,6; espantida, 242,6±95,9; P>0,05). C mostra o tempo de disparo como duração da resposta ao último potencial de ação. n=7 células por tratamento, 18 ratos, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. D, E. Veículo (Veh), Cy5-colestanol (Cy5-Chol), espantida (Span) ou Composto 1 foi injetado por via intratecal em camundongos 3 h antes (D) ou 30 min depois (E) de injeção intraplantar de capsaicina (Cap) na pata esquerda. São mostradas respostas de retirada de von Frey da pata esquerda injetada. F, G. Veículo, SR140,333 (SR), espantida ou Composto 1 foi injetado por via intratecal em camundongos 30 min antes de injeção intraplantar de formalina (Form). Comportamento nocifensivo foi medido por 60 min. F mostra cinética de resposta, G mostra respostas durante as primeira e segunda fases. H, I. CFA foi injetado na pata esquerda de camundongos 36 h antes de injeção intratecal de veículo, SR140,333 (SR), espantida ou Composto 1. As respostas de retirada de von Frey da pata esquerda injetada foram medidas em diferentes grupos de camundongos 36-39 h (H) ou 39-42 h (I) após CFA. J. Veículo (Veh), L-733,060 (L733) ou Composto 4 foi injetado por via intratecal em camundongos 3 h antes de injeção intraplantar de capsaicina na pata esquerda. São mostradas respostas de retirada de von Frey da pata esquerda injetada. **P<0,01, ****P<0,0001 para Cy5-colestanol ou veículo. (n), número de camundongos.
[0051] Figura 13: Representações gráficas de hiperalgesia mecânica mediada por CGRP em camundongos. A, B. Veículo (Veh), Olcegepant (Olceg), Composto 4 ou CGRP8-37 livre foi injetado por via intratecal 3 h antes de injeção intraplantar de capsaicina (Cap) na pata esquerda. A mostra respostas de retirada de von Frey da pata esquerda injetada, e B mostra respostas de retirada de von Frey da pata direita não injetada. C, D. Veículo, Olcegepant, Composto 4 ou CGRP8-37 livre foi injetado por via intratecal 3 h antes de injeção intraplantar de formalina na pata esquerda. Comportamento nocifensivo foi medido por 60 min. C mostra cinética de resposta, D mostra respostas durante as primeira e segunda fases. E. O adjuvante completo de Freund (CFA) foi injetado na pata esquerda de camundongos 36 h antes de injeção intratecal de veículo, Composto 4 ou CGRP8-37 livre. As respostas de retirada de von Frey da pata esquerda injetada foram medidas 39-42 h após o adjuvante completo de Freund. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001 para veículo. (n), número de camundongos.
[0052] Ao estudar o receptor de neurocinina 1 (NK1R) da substância P (SP) como um GPCR prototípico que trafega de modo robusto para endossomas após ativação, foi agora demonstrado que os GPCRs endossomal transmitem sinais sustentados que são subjacentes a excitação e a transmissão nociceptiva em neurônios espinhais. Esses achados sugerem que o alvejamento de GPCRs em endossomas é necessário para uma intervenção farmacológica ideal. O conceito de que os endossomas são plataformas para sinalização compartimentada de GPCR que são subjacentes a processos fisiopatologicamente importantes tem implicações na especificidade do sinal do receptor e no alvejamento terapêutico. O tráfico endossomal permite que os GPCRs gerem sinais em compartimentos subcelulares que podem explicar como diferentes receptores que ativam as mesmas proteínas G e βarrs podem regular especificamente as respostas. A dispensação de moduladores de GPCR a endossomas pode permitir o alvejamento de sinais que são subjacentes a processos relevantes para doenças com eficácia e seletividade intensificadas.
[0053] Foi anteriormente sugerido que o alvejamento da endotelina tipo B (ETBR) de GPCR localizada em cavéolas pode prover uma terapia antitumoral eficaz (ver WO2005/097199). A ETBR demonstrou mediar diversos efeitos fisiológicos na vasoconstrição, desenvolvimento, diferenciação e mitogênese celular (Yamaguch, T. et al. Eur. J. Biochem 2003, 270, 1816-1827). Diferentes dos endossomas, as cavéolas são pequenas cavidades em formato de frasco ou em formato de copo formadas na membrana celular e, ao contrário dos endossomas, as cavéolas não são revestidas com clatrina.
[0054] Descobriu-se agora, pela primeira vez, que o alvejamento de GPCRs endossomais provê um novo método para tratamento e prevenção de doenças e distúrbios mediados pela sinalização por GPCR endossomal.
[0055] Em uma modalidade, é provido um composto tripartido de acordo com a fórmula (I) para modular a sinalização por GPCR endossomal.
[0056] Em uma outra modalidade, a presente invenção provê um método para modular a sinalização por GPCR endossomal que compreende administrar uma quantidade eficaz de um composto de fórmula (Ie) como aqui definido a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0057] O termo “composto tripartido” como aqui usado refere-se a compostos compreendendo um modulador de GPCR endossomal ligado covalentemente a um grupo ligante, o grupo ligante sendo ligado covalentemente a uma âncora lipídica capaz de ancorar o composto de fórmula (I) ou (Ie) à bicamada lipídica de uma membrana celular e, finalmente, à membrana de um endossoma inicial.
[0058] O termo “âncora lipídica” (LA) como aqui usado denota frações que são capazes de se dividir em membranas lipídicas e assim ancorar o composto de fórmula (I) na membrana lipídica. A divisão na membrana lipídica pode ocorrer diretamente do espaço luminal extracelular ou vesicular ou pode ocorrer lateralmente a partir da bicamada lipídica.
[0059] Em uma modalidade preferida, a âncora lipídica pode ser caracterizada pela sua capacidade de divisão em membranas lipídicas, pelo que as ditas membranas lipídicas são caracterizadas por insolubilidade em detergentes não iônicos a 4°C.
[0060] Exemplos de âncoras lipídicas adequadas incluem, mas não se limitam a colesterol, colestanol, esfingolipídio, âncora GPI ou derivados de ácidos graxos saturados. Muitas dessas âncoras lipídicas foram descritas na técnica, por exemplo, no documento WO2005/097199, cuja totalidade é aqui incorporada por referência.
[0061] Em uma modalidade, a âncora lipídica é uma fração selecionada das fórmulas (IIa) ou (IIIa): em que R1a é um grupo C1-12 alquila opcionalmente substituído; R2a e R3a são, independentemente, H ou C1-3alquila; R4a é -CH2-, -O-, -NH-, -S-, -NH(CH2)aOPO3--, -NH(CH2)aSO2CF2-, -NH(CH2)aSO2NH-, -NHCONH-, -NHC(O)O-, -NHCH(CONH2)(CH2)bC(O)O-, -NHCH(COOH)(CH2)bC(O)O-, -NHCH(CONH2)(CH2)bCONH-, -NHCH(COOH)(CH2)bCONH-, -NHCH(CONH)(CH2)4NH((CO)CH2O)e- ou -NHCH(COOH)(CH2)4NH((CO)CH2O)e-; a é um número inteiro de 2 a 3; b é um número inteiro de 1 a 2; e é um número inteiro de 0 a 1; e representa uma ligação simples ou dupla.
[0062] Em outras modalidades, a âncora lipídica é uma fração selecionada das fórmulas (VIa), (VIIa), (VIIIa) ou (IXa): em que R4a é como descrito acima; representa uma ligação simples ou dupla; representa uma ligação simples, dupla ou tripla; cada ocorrência de R5a é independentemente -NH-, -O-, -S-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -NHCONH-, -NHC(O)O- ou -NHS(O2)-; cada ocorrência de R6a é independentemente um grupo C14-30 alquila opcionalmente substituído com flúor, opcionalmente 1 a 4 átomos de flúor; cada ocorrência de R7a é independentemente NH2, NHCH3, OH, H, halogênio ou O, desde que quando R7a for NH2, NHCH3, OH, H ou halogênio, então é uma ligação simples e quando R7a for O então é uma ligação dupla; cada ocorrência de R8a é independentemente H, OH ou está ausente quando representa uma ligação tripla; R9a é um grupo C10-30 alquila opcionalmente substituído com flúor, opcionalmente 1 a 4 átomos de flúor; e cada ocorrência de R10a é independentemente um grupo C24-40 alquileno, um grupo C24-40 alquenileno ou um grupo C24-40 alquinileno opcionalmente substituído com flúor, opcionalmente 1 a 4 átomos de flúor.
[0063] Em modalidades adicionais, a âncora lipídica é uma fração selecionada das fórmulas (Xa) ou (XIa):
representa uma ligação simples ou dupla; representa uma ligação simples, dupla ou tripla; cada ocorrência de R13a é independentemente -O- ou -CO(CH2)a(CO)bO-, em que a é um número inteiro de 1 a 3 e b é um número inteiro de 0 a 1; R14a é -O- ou -OC(O) -; cada ocorrência de R15a é independentemente selecionada de um grupo C16-30 alquila opcionalmente substituído com flúor, opcionalmente 1 a 4 átomos de flúor; R16a é -PO3-CH2-, -SO3CH2-, -CH2-, -CO2CH2- ou uma ligação direta; R17a é -NH-, -O-, -S-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -NHCONH-, -NHC(O)O- ou -NHS(O2)-; R18a é NH2, NHCH3, OH, H, halogênio ou O; R19a é um grupo C16-30 alquila opcionalmente substituído com flúor, opcionalmente 1 a 4 átomos de flúor; e cada R20a é um grupo C(O)C13-25alquila opcionalmente substituído com um grupo das seguintes fórmulas: em que é uma ligação simples ou dupla; R21a é -PO3-CH2-, -SO3CH2-, -CH2-, -CO2CH2- ou uma ligação direta; R22a é -NH-, -O-, -S-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -NHCONH-, -NHC(O)O- ou -NHS(O2)-; R23a é -O- ou -OC(O) -; cada ocorrência de R24a é independentemente selecionada de um grupo C16-30 alquila opcionalmente substituído com flúor, opcionalmente 1 a 4 átomos de flúor; R25a é -CO(CH2)a(CO)bO- ou -CO(CH2)a(CO)bNH-, em que a é um número inteiro de 1 a 3 e b é um número inteiro de 0 a 1; e R26a é um grupo C4-20 alquila opcionalmente substituído com flúor, opcionalmente 1 a 4 átomos de flúor.
[0064] Em modalidades adicionais, a âncora lipídica é uma fração selecionada das fórmulas (XIIa), (XIIIa), (XIVa) ou (XVa): cada ocorrência de R27a é independentemente selecionada de -NH-, -O-, -NH(CH2)cOPO3--, -NH(CH2)cSO2NH-, -NHCONH-, -NHC(O)O-, -CO(CH2)b(CO)aNH-, -CO(CH2)b(CO)aO-, -CO(CH2)bS-, -CO(CH2)bOPO3--, -CO(CH2)bSO2NH-, -CO(CH2)bNHCONH-, -CO(CH2)bOCONH-, -CO(CH2)bOSO3-, ou -CO(CH2)bNHC(O)O-, em que a é um número inteiro de 0 a 1, b é um número inteiro de 1 a 3 e c é um número inteiro de 2 a 3; cada ocorrência de R28a é independentemente -CH2- ou -O-; cada ocorrência de R29a é independentemente selecionada de H ou um grupo C16-30 alquila opcionalmente substituído com flúor, opcionalmente 1 a 4 átomos de flúor; cada ocorrência de R31a é independentemente selecionada de H, ou um grupo C1-15 alquila, opcionalmente substituído com flúor, opcionalmente 1 a 4 átomos de flúor, ou um grupo C1-15 alcóxi opcionalmente substituído com flúor, opcionalmente 1 a 4 átomos de flúor; e n é um número inteiro de 1 a 2.
[0065] O termo “ligante” como aqui usado refere-se à parte do composto que liga o modulador de um GPCR endossomal à âncora lipídica. Será entendido que o ligante deve ser selecionado de tal modo que não haja competição com o modulador de um GPCR endossomal no sítio de ligação do ligante. Nem o ligante deve se dividir na membrana lipídica.
[0066] O grupo ligante deve ser opcionalmente de um comprimento entre 1 nm a 50 nm de modo a permitir que o modulador de um GPCR endossomal interaja com o receptor quando a âncora lipídica é ancorada na membrana endossomal.
[0067] Em uma modalidade, o grupo ligante compreenderá uma ou mais unidades de polietileno glicol. Em uma outra modalidade, é previsto que o ligante, ou subunidades do ligante, podem ser resíduos de aminoácidos, resíduos de aminoácidos derivatizados ou funcionalizados, poliéteres, ureias, carbamatos, sulfonamidas ou outras subunidades que proveem uma distância adequada entre o modulador de um GPCR endossomal e a âncora lipídica sem interferir na função de nenhum dos grupos.
[0068] Em uma modalidade, o ligante é representado por uma fração da fórmula (IVa): em que Z é o grupo de ligação do ligante à âncora lipídica e é -C1- C10alquila-, -C2-C10alquenila-, -C2-C1oalquinila-, -C1-C1oalquilC(O)-, - C2-CioalquenilC(O)- ou -C2-C1oalquinilC(O)-; ou Z, junto com a amina adjacente, é um aminoácido opcionalmente amidado no terminal C selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido é ligado à âncora lipídica através do seu grupo funcional de cadeia lateral; Y é o grupo de ligação entre o ligante e o modulador de um GPCR endossomal e é -O-, -NH-, -S- , -C(O)-, -C(O)NH- -C(O)O- ou -C(O)S-; ou Y, junto com o grupo amido adjacente, é um aminoácido selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido é ligado ao modulador de um GPCR endossomal através do seu grupo funcional de cadeia lateral; ou Y é o grupo de ligação do ligante ao modulador X, que é um modulador do receptor de neurocinina-1 (NK1R) endossomal, em que a2) Y é definido por -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)O-, - O-C(O)-, -NH-C(O)-, ou -C(O)S-; ou b2) Y, quando tomado junto com o grupo amido adjacente, é definido por: a) um aminoácido alfa selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido alfa é opcionalmente ligado ao modulador do receptor NK1R endossomal através do grupo funcional de cadeia lateral de pelo menos um dos ditos aminoácidos alfa; ou b) um aminoácido beta, gama ou delta que compreende um grupo funcional de cadeia lateral que também é encontrado em ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido beta, gama ou delta é opcionalmente ligado ao modulador do receptor NK1R endossomal através de pelo menos um dos ditos grupos funcionais de cadeia lateral; ou c) um peptídeo formado a partir de aminoácidos alfa, beta, gama ou delta, em que o peptídeo compreende pelo menos um aminoácido alfa, beta, gama ou delta que tem um grupo funcional de cadeia lateral que também é encontrado em ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; ou combinações dos mesmos, em que o dito peptídeo é opcionalmente ligado ao modulador do receptor NK1R endossomal através de pelo menos um dos ditos grupos funcionais de cadeia lateral; m é 1 ou 2; n é de 1 a 20; e p é de 1 a 8.
[0069] Em uma outra modalidade, o ligante é representado por uma fração da fórmula (XXa): em que cada ocorrência de R11a é independentemente qualquer cadeia lateral de um resíduo de aminoácido de ocorrência natural, derivatizado ou funcionalizado; m é um número inteiro de 3 a 80; e n é um número inteiro de 0 a 1.
[0070] Em outras modalidades, o ligante é representado por uma fração da fórmula (XXIa): em que m é um número inteiro de 0 a 40; n é um número inteiro de 0 a 1; cada ocorrência de o é independentemente um número inteiro de 1 a 5; cada ocorrência de R11a é independentemente qualquer cadeia lateral de um resíduo de aminoácido de ocorrência natural, derivatizado ou funcionalizado; e em que o terminal SO2 é ligado à âncora lipídica e o terminal N é ligado ao modulador de um GPCR endossomal.
[0071] Em uma outra modalidade, o ligante é representado por uma fração da fórmula (XXIIa): em que m é um número inteiro de 0 a 40; n é um número inteiro de 0 a 1; cada ocorrência de o é independentemente um número inteiro de 1 a 5; cada R12a é independentemente NH ou O; cada ocorrência de R11a é independentemente qualquer cadeia lateral de um resíduo de aminoácido de ocorrência natural, derivatizado ou funcionalizado; e em que o terminal C(O) é ligado à âncora lipídica e o terminal R12a é ligado ao modulador de um GPCR endossomal.
[0072] Várias porções ligantes adequadas foram descritas no documento WO2005/097199, cuja totalidade é aqui incorporada por referência.
[0073] O termo “modulador de um GPCR endossomal” como aqui usado refere-se a agonistas e antagonistas ou inibidores de receptores acoplados a proteína G que são endocitados em endossomas.
[0074] Em uma modalidade, o modulador de GPCR será um agonista do receptor. Em uma outra modalidade, o modulador de GPCR será um antagonista ou inibidor do receptor.
[0075] O modulador de GPCR pode estar em qualquer forma incluindo, mas não limitado a uma molécula orgânica, uma sequência de polipeptídeos, um hormônio, um fragmento de proteína ou um derivado de qualquer um destes.
[0076] Em particular, o modulador de GPCR é opcionalmente uma molécula orgânica, ou, alternativa ou adicionalmente, um hormônio, ou um derivado destes.
[0077] O termo “sinalização por GPCR endossomal” como aqui usado refere-se ao sinal transduzido por um receptor acoplado à proteína G ativado que foi endocitado em um endossoma, opcionalmente um endossoma inicial.
[0078] Em uma modalidade, a sinalização por GPCR endossomal será a sinalização que é primeiro transduzida na membrana plasmática e é mantida quando o receptor é endocitado em endossomas iniciais.
[0079] Em uma outra modalidade, a sinalização por GPCR endossomal será a sinalização que requer endocitose do receptor e/ou ocorre exclusivamente em membranas endossomais, por exemplo, sinalização mediada por β-arrestina. Acredita-se que βarrs interagem com os GPCRs fosforilados pela quinase de receptores acoplados à proteína G (GRK) ocupados por agonista na superfície celular e promovem a transferência do receptor ligado ao ligante da superfície celular para os endossomas iniciais via endocitose dependente de dinamina e clatrina. Foi recentemente verificado que esta via pode mediar uma segunda série de sinalização por GPCR endossomal que é distinta da sinalização porpendente de proteína G na membrana plasmática. Acredita-se que a importância desse mecanismo depende da afinidade com a qual os GPCRs interagem com as βarrs, que varia dependendo da extensão da fosforilação de GPCR por GRKs. GPCRs de “classe A” (por exemplo, β2AR, α1bAR) têm poucos sítios de fosforilação e interagem transitoriamente com βarr1 e βarr2, principalmente na membrana plasmática, com maior afinidade para βarr2. GPCRs de “classe B” (por exemplo, AT1AR, NK1R) são fosforilados em vários sítios e interagem tanto com βarr1 quanto com 2 com alta afinidade por períodos prolongados em membranas plasmáticas e endossomais. GPCRs de “classe C” (por exemplo, receptor de bradicinina B2) internalizam com βarrs em endossomas seguido de rápida dissociação de βarr mediante remoção do agonista.
[0080] Acredita-se que a sinalização por MAPK induzida por βarr depende da afinidade do receptor para βarrs, que depende da estrutura do receptor e de qual das sete GRKs de mamíferos fosforila o receptor. Dessa forma, a ativação de AT1AR e V2R causa maior fosforilação de ERK1/2 ligada a βarr do que a ativação de α1bAR e β2AR, sugerindo que os receptores de classe B sinalizam de forma mais robusta por essa via. Os GPCRs de classe B incluem o receptor de secretina, receptor de VPAC1, receptor de VPAC2, receptor de PAC1, receptor de glucagon, receptor do hormônio liberador do hormônio do crescimento (GHRH), receptor do peptídeo relacionado ao glucagon 1 (GLP-1), receptor do peptídeo relacionado ao glucagon 2 (GLP- 2), receptor do polipeptídeo inibidor gástrico (GIP), receptor do fator de liberação de corticotrofina 1 (CRF1), receptor do fator de liberação de corticotropina 2 (CRF2), receptor do paratormônio 1 (PTH1), receptor do paratormônio 2 (PTH2), receptor semelhante ao receptor de calcitonina, receptor de calcitonina, receptor de angiotensina II tipo 1, receptor de vasopressina 2, receptor do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), receptor de neurocinina 1 (NK1R), e receptor ativado por protease 2 (PAR2).
[0081] Em algumas modalidades preferidas da invenção, e com referência à fórmula geral (I) ou (Ie), uma ou mais das seguintes modalidades se aplicam: a) LA é uma âncora lipídica selecionada de colesterol, colestanol, esfingolipídio, uma âncora GPI ou um derivado de ácido graxo saturado.
[0082] b) LA é uma âncora lipídica selecionada de frações de fórmulas (IIa), (IIIa), (VIIa), (VIIIa), (IXa), (Xa), (XIa), (XIIa), (XIIIa) e (IXa).
[0083] c) LA é uma âncora lipídica selecionada de frações de fórmulas (IIa) ou (IIIa).
[0084] d) L é uma fração ligante que compreende uma ou mais subunidades, as subunidades compreendendo unidades de polietileno glicol, resíduos de aminoácidos, resíduos de aminoácidos derivatizados ou funcionalizados, poliéteres, ureias, carbamatos e/ou sulfonamidas.
[0085] e) L é uma fração ligante representada pelas fórmulas (IVa), (XXa), (XXIa) ou (XXIIa).
[0086] f) L é uma fração ligante representada pela fórmula (IVa).
[0087] g) X é um agonista de um GPCR endossomal, opcionalmente do receptor de neurocinina-1 endossomal.
[0088] h) X é um antagonista de um GPCR endossomal, opcionalmente do receptor de neurocinina-1 endossomal.
[0089] Em uma modalidade preferida, LA é uma âncora lipídica representada pelas fórmulas (IIa) ou (IIIa).
[0090] Por conseguinte, em uma modalidade, a presente invenção provê compostos tripartidos da fórmula (I) representados pela fórmula (Ia): em que LA é uma âncora lipídica que promove inserção do composto em uma membrana plasmática representada pelas fórmulas (IIa) ou (IIIa): em que R1a é um grupo C1-12 alquila opcionalmente substituído; R2a e R3a são, independentemente, H ou C1-3alquila; R4a é C, O, NH ou S; e representa uma ligação simples ou dupla; L é um grupo ligante de 1 nm a 5 nm de comprimento; e X é um modulador de um GPCR endossomal, opcionalmente receptor de neurocinina-1 endossomal; ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[0091] Em uma outra modalidade preferida, LA é uma âncora lipídica representada pelas fórmulas (IIa) ou (IIIa) e L é um ligante representado pela fórmula (IVa).
[0092] Por conseguinte, em uma outra modalidade, a presente invenção provê compostos tripartidos da fórmula (I) representados pela fórmula (Ib): em que LA é uma âncora lipídica que promove inserção do composto em uma membrana plasmática representada pelas fórmulas (IIa) ou (IIIa): em que R1a é um grupo C1-12 alquila opcionalmente substituído; R2a e R3a são, independentemente, H ou C1-3alquila; R4a é C, O, NH ou S; representa uma ligação simples ou dupla; L é um ligante representado pela fórmula (IVa): em que Z é o grupo de ligação entre o ligante e a âncora lipídica e é - Ci-Cioalquila-, -C2-Cioalquenila-, -C2-C10alquinila-, -Ci-CiθalquilC(O)-, - C2-CioalquenilC(O)- ou -C2-CioalquinilC(O)-; ou Z, junto com a amina adjacente, é um aminoácido opcionalmente amidado no terminal C selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido é ligado à âncora lipídica através do seu grupo funcional de cadeia lateral; Y é o grupo de ligação entre o ligante e o modulador de um GPCR endossomal e é -O-, -NH-, -S- , -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)O- ou -C(O)S-; ou Y, junto com o grupo amido adjacente, é um aminoácido selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido é ligado ao modulador de um GPCR endossomal através do seu grupo funcional de cadeia lateral; ou Z é o grupo de ligação do ligante à âncora lipídica LA; em que Z é definido por: al) C1-C10alquila- -C2-C10alquenila-, -C2-C10alquinila-, -C1- CioalquilaC(O)-, -C2—CioalquenilaC(O)- ou -C2- C10alquinilaC(O)-; ou b1) junto com a amina adjacente, um aminoácido opcionalmente amidado no terminal C selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido é ligado à âncora lipídica através do seu grupo funcional de cadeia lateral; e Y é o grupo de ligação do ligante ao modulador X, que é um modulador do receptor de neurocinina-1 (NK1R) endossomal, em que a2) Y é definido por -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)O-, - O-C(O)-, -NH-C(O)-, ou -C(O)S-; ou b2) Y, quando tomado junto com o grupo amido adjacente, é definido por: a. um aminoácido alfa selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido alfa é opcionalmente ligado ao modulador do receptor NK1R endossomal através do grupo funcional de cadeia lateral de pelo menos um dos ditos aminoácidos alfa; ou b. um aminoácido beta, gama ou delta que compreende um grupo funcional de cadeia lateral que também é encontrado em ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido beta, gama ou delta é opcionalmente ligado ao modulador do receptor NK1R endossomal através de pelo menos um dos ditos grupos funcionais de cadeia lateral; ou c. um peptídeo formado a partir de aminoácidos alfa, beta, gama ou delta, em que o peptídeo compreende pelo menos um aminoácido alfa, beta, gama ou delta que tem um grupo funcional de cadeia lateral que também é encontrado em ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; ou combinações dos mesmos, em que o dito peptídeo é opcionalmente ligado ao modulador do receptor NK1R endossomal através de pelo menos um dos ditos grupos funcionais de cadeia lateral; m é 1 ou 2; n é de 1 a 20; p é de 1 a 8; e X é um modulador de um GPCR endossomal; ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.
[0093] Em uma modalidade preferida, X é um modulador do receptor de NK1 endossomal.
[0094] O receptor de neurocinina 1 (NK1R) da substância P (SP) medeia dor e inflamação (Steinhoff, M. S. et al. Physiol Rev 2014, 94, 265301). Embora estudos pré-clínicos com antagonistas da sinalização por NK1R da membrana plasmática apoiem seu envolvimento em distúrbios neurológicos e inflamatórios, esses antagonistas são tratamentos ineficazes para doenças crônicas. O NK1R redistribui rápida e completamente os endossomas nos sítios de transmissão da dor na medula espinhal (Marvizon, J. C. et al. J Neurosci 1997, 17, 8129-8136) e inflamação na vasculatura (Bowden, J. J. et al. Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91, 8964-8968), e acredita-se que é internalizado em pacientes com dor crônica e inflamação (Jarcho, J. M. et al. Pain, 2013).
[0095] Verificou-se surpreendentemente que a sinalização por NK1R endossomal gera sinais subcelulares que são subjacentes à ativação neuronal e hiperalgesia. Estímulos dolorosos e pró-inflamatórios, incluindo o agonista do receptor de potencial transitório vaniloide 1, a capsaicina, estimulam a liberação de SP de nociceptores sensoriais primários nas lâminas I, II do corno dorsal, onde a SP estimula a endocitose de NK1R em neurônios espinhais. Verificou-se que a espantida antagonista de NK1R era incapaz de melhorar a hiperalgesia provocada pela capsaicina, provavelmente devido ao metabolismo e depuração do composto. No entanto, quando o mesmo antagonista do NK1R foi incorporado nos compostos tripartidos da presente invenção, a hiperalgesia foi inibida durante mais de 120 minutos, sugerindo que o antagonismo do NK1R nos endossomas é um tratamento eficaz contra a dor.
[0096] A modulação da ativação de NK1R mediada por SP tem sido associada ao tratamento e à prevenção de uma ampla variedade de distúrbios incluindo depressão e transtornos de humor, transtornos de ansiedade, distúrbios relacionados à dependência de drogas, distúrbios relacionados ao álcool, distúrbios do sono, transtornos alimentares, transtornos do espectro autista, transtorno de déficit de atenção/hiperatividade, transtornos de personalidade e câncer. Os moduladores de NK1R podem também ser úteis para o tratamento e a prevenção de inflamação, distúrbios alérgicos, distúrbios neurológicos, emese, dor e câncer.
[0097] Em uma modalidade, a presente invenção provê compostos tripartidos da fórmula (I) representados pela fórmula (Ic): em que LA é uma âncora lipídica que promove inserção do composto em uma membrana plasmática; L é uma fração ligante de 1 nm a 5 nm de comprimento; e X é um modulador do NK1R endossomal; em que, em uma modalidade preferida da presente invenção, a âncora lipídica se divide em membranas lipídicas que são insolúveis em detergente não iônico a 4°C; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0098] Em uma modalidade preferida, o composto de fórmula (Ic) é selecionado de:
ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[0099] As frações individuais do composto tripartido da presente invenção incluindo X, L, LA, Y, Z, o espaçador entre Y e Z, M, F1, F2, R1 e R2’ que estão ligados uns aos outros como esquematicamente descrito na Figura 1.
[00100] Por conseguinte, o modulador X é formado a partir das frações M, e R1, em que R1 inclui as frações F1, R2’ e F2. A parte F1 é usado para ligar covalentemente M com R2’, e F2 é usado para ligar covalentemente R2’ com Y, Y sendo uma parte do ligante L.
[00101] As frações F1 e F2 são ligadas covalentemente a R2’ sem serem limitadas a qualquer padrão de substituição específico. O padrão de ligação de F1 e F2 em R2’ é limitado apenas pela disponibilidade dos grupos funcionais presentes em F1, F2 e R2’.
[00102] As frações moduladoras preferidas são como indicadas nas seguintes estruturas: Fração -R2’-F1-M, que é covalentemente ligada ao ligante L por -F2- como mostrado na seguinte estrutura. A fração -R2’-F1-M sob essa definição não inclui F2 que só é indicado na estrutura para ilustração adicional:em que R3 é hidrogênio ou -CH3; R4 é hidrogênio ou flúor; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00103] Fração -R2’-F1-M, que é covalentemente ligada ao ligante L como mostrado na seguinte estrutura. A fração -R2’-F1-M sob essa não inclui F2 que só é indicado na estrutura para ilustração adicional:
[00104] As sete frações seguintes –F2-R2’-F1-M, que são ligadas covalentemente aY pelo ligante L como mostrado nas seguintes estruturas (Frações -F2-R2’-F1-M sob essa definição não incluem Y que só é indicado nas três estruturas para ilustração adicional:
e combinações dos mesmos, em que R3 é átomo de hidrogênio ou CH3; R4 é átomo de hidrogênio ou flúor; ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00105] As sete frações seguintes -F2-R2’-F1-M, que são ligadas covalentemente aY pelo ligante L como mostrado nas seguintes estruturas (Frações -F2-R2’-F1-M sob essa definição não incluem Y que só é indicado nas três estruturas para ilustração adicional:
e combinações dos mesmos; ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00106] Os compostos tripartidos X-L-LA com as seguintes estruturas:
em que R3 é átomo de hidrogênio ou -CH3; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00107] Em uma modalidade, a presente invenção provê um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por NK1R endossomal que compreende administrar uma quantidade eficaz de um composto de fórmula (Ic) como aqui definido a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[00108] Em uma outra modalidade, a presente invenção provê o uso de um composto de fórmula (Ic) como aqui definido na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por NK1R endossomal.
[00109] Em uma outra modalidade, a presente invenção provê o uso de compostos tripartidos para o tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por NK1R endossomal.
[00110] Em uma modalidade adicional, a presente invenção provê um composto de fórmula (Ic) como aqui definido para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por NK1R endossomal.
[00111] Em uma modalidade preferida, a doença ou o distúrbio mediado por sinalização por NK1R endossomal é selecionado de náusea e vômito induzidos por quimioterapia (CINV), síndrome de vômitos cíclicos, náuseas e vômitos no pós-operatório, distúrbios afetivos e aditivos, incluindo depressão e ansiedade, transtorno de ansiedade generalizada (TAG), distúrbios gastrointestinais incluindo doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, gastroparesia e dispepsia funcional, doenças respiratórias incluindo DPOC e asma, distúrbios urogenitais, distúrbios sensoriais e dor incluindo dor somática e dor visceral, prurido, infecções virais e bacterianas e distúrbios proliferativos (câncer).
[00112] No contexto da presente invenção, o termo “dor” inclui dor inflamatória crônica (por exemplo, dor associada a artrite reumatoide, osteoartrite, espondilite reumatoide, artrite gotosa e artrite juvenil); dor musculoesquelética, dor lombar e cervical, entorses e distensões, dor neuropática, dor simpateticamente mantida, miosite, dor associada a câncer e fibromialgia, dor associada à enxaqueca, dor associada à cefaleia em salvas e crônica diária, dor associada à gripe ou outras infecções como o resfriado comum, febre reumática, dor associada a distúrbios intestinais funcionais, como dispepsia não ulcerosa, dor torácica não cardíaca e síndrome do cólon irritável, dor associada à isquemia miocárdica, dor pós-operatória, cefaleia, dor de dente, dismenorreia, neuralgia, síndrome de fibromialgia, síndrome da dor regional complexa (SDRC tipos I e II), síndromes de dor neuropática (incluindo neuropatia diabética, dor neuropática induzida quimioterapeuticamente, ciática, dor lombar não específica, dor de esclerose múltipla, neuropatia relacionada ao HIV, neuralgia pós-herpética, neuralgia do trigêmeo) e dor resultante de trauma físico, amputação, câncer, toxinas ou condições inflamatórias crônicas. Em uma modalidade preferida, a dor é dor somática ou dor visceral.
[00113] Em uma outra modalidade preferida, o modulador de um GPCR endossomal é um inibidor do receptor CGRP endossomal.
[00114] O peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) do neuropeptídeo é amplamente expresso nos sistemas nervosos periférico e central por neurônios sensoriais primários polimodais do gânglio trigeminal. A liberação de CGRP na medula espinhal dorsal tem sido associada à transmissão nociceptiva e a liberação de CGRP a partir de terminações nervosas perivasculares causa vasodilatação neurogênica e liberação de mediadores inflamatórios de mastócitos (Benemei, S. et al., Curr. Opin. Pharmacol. 2009, 9(1), 9-14; Durham P. L. N. Engl, J. Med. 2004, 350, 10731074). O CGRP contribui para a transmissão da dor e inflamação e acredita-se que desempenha um papel integral na fisiopatologia da enxaqueca (Durham, P. L. Headache, 2006, 46, S3-S8). Acredita-se também que o CGRP contribui para a dor e inflamação associadas à artrite, incluindo osteoartrite e artrite reumatoide (Walsh, D. A. et al., Br. J. Clin. Pharmacol., 2015, 80(5), 965978).
[00115] O receptor de CGRP (CGRP-R) é composto por duas subunidades, o receptor semelhante ao receptor de calcitonina (CLR, um GPCR) e a proteína modificadora da atividade do receptor 1 (RAMP1). Coexpressão e dimerização de CLR e RAMP1 criam o CGRP-R, com alta afinidade por CGRP (Russell, F. A. et al., Physiological Reviews, 2014, 94, 1099-1142). Demonstrou-se que a ligação de CGRP e a ativação do receptor levam à fosforilação de CLR e à internalização do CGRP-R como um complexo estável (Hilairet, S. et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 42182-42190). Verificou-se que a internalização era dependente tanto de dinamina quanto β- arrestina, indicando que a formação de um complexo trinário entre CLR, RAMP1 e β-arrestina leva à endocitose mediada por fossos revestidos de clatrina.
[00116] Estudos iniciais com o antagonista seletivo de CGRP-R, Telcagepant, mostraram resultados promissores com a administração do composto, resultando no tratamento eficaz de ataques de enxaqueca moderados a graves, com um desfecho primário de alívio da dor em 2 horas (Ho, T. W. et al., Neurology, 2008, 70(16) 1304-1312). O Telcagepant também se mostrou promissor como um tratamento eficaz para alívio da dor prolongada ao longo de 24 horas e alívio de sintomas relacionados à enxaqueca, como fotofobia, fonofobia e náuseas. No entanto, foi cessado um ensaio clínico de Fase IIa do composto, pois verificou-se que o Telcagepant aumentava significativamente os níveis da enzima hepática alanina transaminase para um nível inaceitável para o paciente.
[00117] Outro antagonista identificado para o CGRP-R é CGRP8-37. O CGRP existe em duas formas em humanos, α-CGRP e β-CGRP. Essas formas são derivadas de genes separados e diferem em relação a três aminoácidos, mas apresentam funções biológicas semelhantes (Durham, P. L and Vause, C. V. CNS Drugs, 2010, 24(7), 539-548). Estudos de ligação do neuropeptídeo de 37 aminoácidos α-CGRP revelaram que os primeiros sete aminoácidos N- terminais são essenciais para a ativação do receptor. Estudos de SAR demonstraram que os 18 aminoácidos restantes (CGRP8-37) são importantes para reconhecimento e acoplamento de receptor. No entanto, verificou-se que essa sequência não se envolve na ativação do receptor. Esse achado levou ao uso de CGRP8-37 como um inibidor de CGRP-R.
[00118] Em uma modalidade, a presente invenção provê compostos da fórmula (I) representados pela fórmula (Id): em que A é uma âncora lipídica que promove inserção do composto em uma membrana plasmática; L é uma fração ligante de 1 nm a 5 nm de comprimento; e X é um modulador do CGRP-R endossomal; em que, em uma modalidade preferida da presente invenção, a âncora lipídica se divide em membranas lipídicas que são insolúveis em detergente não iônico a 4°C; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00119] Em uma modalidade, X é o antagonista de CGRP-R olcegepant.
[00120] Em uma outra modalidade, X é o antagonista de CGRP-R CGRP8-37 e o composto de fórmula (Id) é representado pelo Composto 4: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00121] Em uma modalidade, a presente invenção provê um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por receptor de CGRP endossomal que compreende administrar uma quantidade eficaz de um composto de fórmula (Id) como aqui definido a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[00122] Em uma outra modalidade, a presente invenção provê o uso de um composto de fórmula (Id) como aqui definido na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por receptor de CGRP endossomal.
[00123] Em uma modalidade adicional, a presente invenção provê um composto de fórmula (Id) como aqui definido para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por receptor de CGRP endossomal.
[00124] Em uma modalidade, a doença ou distúrbio mediado por sinalização por receptor de CGRP endossomal é enxaqueca e sintomas associados à enxaqueca incluindo dor, fotofobia, fonofobia, náusea e vômito, distúrbios sensoriais, dor incluindo dor somática e visceral, dor associada à cefaleia em salvas e crônica diária, distúrbios respiratórios incluindo DPOC e asma, distúrbios gastrointestinais incluindo doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, gastroparesia e dispepsia funcional, e distúrbios inflamatórios crônicos incluindo osteoartrite e artrite reumatoide.
[00125] Em uma modalidade preferida, a doença ou o distúrbio mediado por sinalização por receptor de CGRP endossomal é enxaqueca e seus sintomas associados.
[00126] As estratégias gerais para sintetizar os compostos da presente invenção baseiam-se em métodos estabelecidos de química orgânica sintética, assim como química de peptídeos em fase sólida com as operações usuais aplicadas quando se adicionam e removem grupos protetores durante a preparação. As etapas sintéticas chave são ilustradas nas Figuras 2 a 4, enquanto a Figura 1 ajuda a compreender melhor as várias frações e o seu padrão de ligação para formar o composto tripartido final.
[00127] A síntese do ácido colesteril glicólico, 3-colesterilamina e colesteril-glicina é descrita na literatura (Hussey, S. L. et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 12712-12713; Hussey, S. L. et al., Org. Lett. 2002, 4, 415418; Martin, S. E. et al., Bioconjugate Chem. 2003, 14, 67-74). Âncoras lipídicas de fórmula (IIIa) com um grupo funcional amida, sulfonamida, ureia ou carbamato na posição 3 da estrutura esteroide podem ser preparadas a partir de 3-colesterilamina, por exemplo, 3-colesterilamina pode reagir com anidrido succínico na presença de DMAP para proporcionar o composto substituído com succinila correspondente. A sulfonamida correspondente pode ser obtida por reação de 3-colesterilamina com ácido clorossulfonilacético, que pode ser preparado conforme descrito na literatura (Hinman, R. L. and Locatell, L. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 5655-5658). A ureia ou carbamato correspondente pode ser preparado de acordo com os procedimentos da literatura através do isocianato correspondente (Knolker, H.-J. T. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 2497; Knolker, H.-J. et al., Synlett 1996, 502;. Knolker, H.-J. and. Braxmeier, T. Tetrahedron Lett. 1996, 37, 5861). Os intermediários do composto (IIIa) com um fosfato ou fosfato carboximetilado na posição 3 da estrutura esteroide podem ser preparados conforme descrito na literatura (Golebriewski, Keyes, Cushman, Bioorg. Med. Chem. 1996, 4, 1637-1648; Cusinato, Habeler, et al., J. Lipid Res. 1998, 39, 1844-1851; Himber, Missano, et al., J. Lipid Res. 1995, 36, 1567- 1585). Âncoras lipídicas da fórmula (IIIa) com um tiol na posição 3 da estrutura esteroide podem ser preparadas conforme descrito na literatura (J. G. Parkes, J. G. et al., Biochim. Biophys. Acta 1982, 691, 24-29), os tióis carboximetilados correspondentes são obtidos por alquilação simples conforme descrito para as aminas e álcoois correspondentes. Âncoras lipídicas da fórmula (IIIa) com um derivado de difluorometilenossulfona na posição 3 da estrutura esteroide podem ser preparadas conforme descrito na literatura (Lapiene, J. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 151-155). A introdução de várias cadeias laterais na posição 17 das âncoras lipídicas da fórmula (IIIa) pode ser conseguida por meio de protocolos da literatura a partir de desidroisoandrosterona ou pregnenolona (Bergmann, E. D. et al., J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 1239-1243 e referências no mesmo). Âncoras lipídicas da fórmula (IIIa) que são derivadas de colestano podem ser obtidas a partir dos precursores correspondentes que são derivados de colesterol por redução da ligação dupla 5,6 usando protocolos da literatura, por exemplo, hidrogenação na presença de vários catalisadores de metais de transição.
[00128] Âncoras lipídicas da fórmula (IIa) com um substituinte derivado de oxigênio na posição 3 são preparadas de uma maneira similar à descrita para as âncoras lipídicas da fórmula (IIIa) a partir de estrona. Âncoras lipídicas da fórmula (IIa) com substituição derivada de nitrogênio na posição 3 podem ser preparadas de uma maneira similar à descrita para as âncoras lipídicas da fórmula (IIIa) a partir de 3-amino estrona, que pode ser preparada conforme descrito na literatura (Zhang, X. and Sui, Z. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 3071-3073; Woo, L. W. L. et al., Steroid Biochem. Molec. Biol. 1996, 57, 79-88). Âncoras lipídicas da fórmula (IIa) com um substituinte derivado de enxofre na posição 3 podem ser preparadas de uma maneira similar à descrita para as âncoras lipídicas da fórmula (IIIa) a partir de 3-tioestrona, que pode ser preparada conforme descrito na literatura (Woo, L. W. L. et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 1996, 57, 79-88). A introdução de várias cadeias laterais na posição 17 da estrutura estrona pode ser conseguida por uma abordagem de Wittig, seguida pela hidrogenação da dupla ligação resultante, conforme descrito na literatura (Peters, R. H. et al., J. Org. Chem. 1966, 31, 24-26). Manipulações adicionais dentro da cadeia lateral (por exemplo, construções de ligações duplas, decorações de cicloalquila) podem ser conseguidas por protocolos padrão (acoplamentos de Suzuki, etc.).
[00129] Âncoras lipídicas da fórmula (VIa) que pertencem à classe das ceramidas, desidroceramidas e di-hidroceramidas com diferentes grupos hidrocarbonetos podem ser obtidas conforme descrito na literatura (A. H. Merrill, Jr., Y. A. Hannun (Eds.), Methods in Enzymology, Vol. 311, Academic Press, 1999;. Koskinen, P. M and Koskinen, A. M. P. Synthesis 1998, 1075). Em particular, a base de esfingosina pode ser usado como intermediário chave para todas as âncoras lipídicas da fórmula (VIa) com substituição derivada de oxigênio na posição 1 da cadeia principal da esfingosina. Os derivados de amino correspondentes podem ser obtidos por substituição dos sulfonatos, que podem ser preparados a partir dos álcoois de acordo com protocolos conhecidos. A alquilação e acilação de derivados de 1- amino ou 1-hidróxi podem ser conseguidas por reação com ácido bromoacético e anidrido succínico, respectivamente. O derivado tioacetilado pode ser preparado por substituição de um sulfonato com ácido mercapto acético. Os derivados de fosfato e sulfato podem ser obtidos conforme descrito na literatura (A. H. Merrill, Jr., YA A. Hannun (Eds.), Methods in Enzymology, Vol. 311, Academic Press, 1999; Koskinen, P. M. and Koskinen, A. M. P. Synthesis 1998, 1075). Acilação, sulfonilação e formação de ureia e carbamato podem ser conseguidas por procedimentos padrão. Âncoras lipídicas da fórmula (VIa) em que R5a é uma função amino ou amino derivada podem ser preparadas a partir da base de esfingosina, que está disponível como publicado por Koskinen (Koskinen, P. M. and Koskinen, A. M. P. Synthesis 1998, 1075), usando protocolos padrão. Os correspondentes esfingolipídios substituídos com 2-oxigênio podem ser obtidos por uma estratégia publicada por Yamanoi (Yamanoi, T. et al., Chem. Lett. 1989, 335). Âncoras lipídicas da fórmula (VIa), em que ambos R8a representam um grupo hidróxi, podem ser obtidas por bishidroxilação do alqueno correspondente usando protocolos conhecidos. Os derivados de mono-hidróxi correspondentes podem ser preparados conforme descrito na literatura (Howell, A. R. and Ndakala, A. J. Curr. Org. Chem. 2002, 6, 365-391). A modificação dos substituintes R6a e R9a em âncoras lipídicas da fórmula (VIa) pode ser conseguida por protocolos e estratégias descritas em vários artigos de revisão (Harwood, H. J. Chem. Rev. 1962, 62, 99-154; Gensler, W. J. Chem. Rev. 1957, 57, 191-280).
[00130] Âncoras lipídicas da fórmula (VIIa) podem ser obtidas por protocolos descritos na literatura (Müller, S. et al., J. Prakt. Chem. 2000, 342, 779) e por combinações dos mesmos com protocolos descritos para a preparação de âncoras lipídicas da fórmula (VIIa).
[00131] Âncoras lipídicas da fórmula (VIIIa), em que R4a e R5a são substituintes derivados de oxigênio, podem ser preparadas a partir de (R)-(-)- 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol disponível para comercialização conforme descrito por Fraser-Reid (Schlueter, U. Lu, J. and Fraser-Reid, B. Org. Lett. 2003, 5, 255-257). A variação dos substituintes R6a em compostos de fórmula (VIIIa) pode ser conseguida por protocolos e estratégias descritas em vários artigos de revisão (Harwood, H. J. Chem. Rev. 1962, 62, 99-154; Gensler, W. J. Chem. Rev. 1957, 57, 191-280). Âncoras lipídicas da fórmula (VIIIa), em que R4a e R5a são substituintes derivados de nitrogênio, podem ser obtidas a partir dos sistemas correspondentes substituídos com oxigênio por substituição nucleofílica dos sulfonatos correspondentes e modificações adicionais como descrito acima, ou a partir de 1,2,3-triaminopropano que pode ser obtido como descrito na literatura (Henrick, K. et al., J Chem. Soc. Dalton Trans. 1982, 225-227).
[00132] Âncoras lipídicas da fórmula (IXa) podem ser obtidas de um modo similar ao das âncoras lipídicas da fórmula (VIIa) ou, alternativamente, por metátese de fechamento de anel dos intermediários o-etenilados das âncoras lipídicas da fórmula (VIIIa).
[00133] Âncoras lipídicas das fórmulas (Xa) e (XIa) podem ser obtidas por estratégias sintéticas descritas na literatura (Xue, J. and Guo, Z. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12, 2015-2018; Xue, J. and Guo, Z. J. Am. Chem. Soc. 2003, 16334-16339; Xue, J. et al., J. Org. Chem. 2003, 68, 4020-4029; Shao, N., Xue, J. and Guo, Z. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 1569-1573) e por combinações dos mesmos com métodos descritos acima para a preparação de âncoras lipídicas das fórmulas (VIa) e (VIIIa).
[00134] Âncoras lipídicas das fórmulas (XIIa), (XIIIa) e (XIVa) podem ser obtidas por síntese total seguindo estratégias sintéticas descritas na literatura (Knolker, H.-J. Chem. Soc. Rev. 1999, 28, 151-157; Knolker, H.-J. and Reddy, K. R. Chem. Rev. 2002, 102, 4303-4427; Knolker, H.-J. and Knoll, J. Chem. Commun. 2003, 1170-1171; Knolker, H.-J. Curr. Org. Synthesis 2004, 1).
[00135] Âncoras lipídicas da fórmula (XVa) podem ser preparadas por síntese de indol do tipo Nenitzescu a partir de 4-metoxi-3-metilbenzaldeído para proporcionar 6-metoxi-5-metilindol. A clivagem com éter, a formação de triflato e o acoplamento de Sonogashira levam ao correspondente 5-metilindol substituído com 6-alquinila. A formilação de Nilsmeier e subsequente adição de nitrometano rende o derivado de indol substituído com 3-nitro vinila que é submetido a uma hidrogenação global resultando na formação da 5- metiltriptamina substituída com 6-alquila. A acilação do grupo amino usando anidrido de succinila completa a preparação.
[00136] Podem ser usadas técnicas conhecidas de fase sólida ou em solução na síntese dos peptídeos da presente invenção, tal como acoplamento do terminal N ou C a um suporte sólido (tipicamente uma resina) seguido por síntese passo a passo do peptídeo linear. As químicas de grupos protetores para proteção de resíduos de aminoácidos, incluindo cadeias laterais, são bem conhecidas na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, em: Theodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis (Third Edition, John Wiley & Sons, Inc, 1999), cujos conteúdos são incorporados aqui por referência.
[00137] Os métodos para a preparação de compostos como aqui descritos serão evidentes para os versados na técnica e compreenderão as etapas de a) definir a distância entre (a) grupo(s) principal(is) fosforila ou um grupo principal equivalente da âncora lipídica e um sítio de ligação e/ou interação do modulador de um GPCR endossomal; b) selecionar um ligante que seja capaz de abranger a distância como definida em (a); e c) ligar a âncora lipídica e o modulador de um GPCR endossomal pelo ligante como selecionado em (b).
[00138] Exemplos de trabalho correspondentes para tal método são aqui apresentados e são ilustrados nos exemplos anexos. O versado na técnica está em posição de deduzir sítios de ligação ou sítios de interação relevantes de um dado ou potencial modulador de um GPCR endossomal e, consequentemente, determinar a distância entre (a) grupo(s) principal(is) fosforila ou um grupo principal equivalente da âncora lipídica e um sítio de ligação e/ou interação do modulador de um GPCR endossomal. Tais métodos compreendem, mas não estão limitados a modelagem molecular, interação in vitro e/ou molecular ou ensaios de ligação (por exemplo, dois ou três sistemas híbridos de levedura, detecção de peptídeos, ensaios de sobreposição, exibição de fagos, exibições bacterianas, exibições de ribossomos), microscopia de força atômica, bem como métodos espectroscópicos e cristalografia de raios-X. Além disso, métodos como a mutagênese sítio- dirigida podem ser utilizados para verificar sítios de interação deduzidos de um dado modulador de um GPCR endossomal ou de um modulador candidato de um GPCR endossomal e o seu alvo correspondente.
[00139] Como explicado acima, o modulador de um GPCR endossomal é uma molécula que está envolvida em processos biológicos que ocorrem nos endossomas e é mediada por um receptor acoplado à proteína G.
[00140] O destinatário versado compreenderá que a seleção de um ligante compreende a seleção de ligantes conhecidos na técnica, bem como a geração e o uso de novos ligantes, por exemplo, por modelagem molecular e síntese correspondente ou outros métodos conhecidos na técnica.
[00141] O termo “abranger” como aqui usado com referência à etapa b) refere-se ao comprimento do ligante selecionado para colocar o modulador de um GPCR endossomal no locus correto no receptor a quando a âncora lipídica faz parte da camada lipídica do endossoma.
[00142] O destinatário versado está prontamente na posição de deduzir, verificar e/ou avaliar a lipofilicidade de um determinado composto tripartido, assim como da fração individual como aqui descrito. Ensaios de teste correspondentes para determinar o alvejamento de GPCR endossomal são aqui providos nos exemplos.
[00143] O destinatário versado compreenderá que o propósito da fração ligante é conectar a âncora lipídica ao modulador de um GPCR endossomal para permitir que o modulador de um GPCR endossomal interaja com o receptor quando a âncora lipídica é ancorada na membrana do endossoma. A âncora lipídica e o ligante conterão grupos funcionais permitindo que os dois sejam ligados covalentemente. A natureza do grupo funcional da âncora lipídica não é de modo algum limitada e pode incluir, por exemplo, um grupo amina que forma uma ligação amida com o ligante, ou um grupo hidroxila ou ácido carboxílico que forma uma ligação éter ou éster com o ligante.
[00144] De modo similar, o destinatário versado compreenderá que a seleção do grupo funcional no final do ligante que se conecta com o GPCR endossomal será ditada principalmente por quaisquer grupos funcionais disponíveis no modulador para um GPCR endossomal de escolha. Por exemplo, se o GPCR endossomal compreender um grupo amina livre ou ácido carboxílico, é considerado que o grupo funcional do ligante compreenderá um ácido carboxílico complementar ou uma amina para formar uma ligação amida.
[00145] Será entendido que os compostos da presente invenção podem existir em uma ou mais formas estereoisoméricas (por exemplo, diastereômeros). A presente invenção inclui no seu escopo todas estas formas estereoisoméricas ou isoladas (em, por exemplo, isolamento enantiomérico), ou em combinação (incluindo misturas racêmicas e misturas diastereômicas).
[00146] A presente invenção contempla o uso de aminoácidos em ambas as formas L e D, incluindo o uso de aminoácidos independentemente selecionados das formas L e D, por exemplo, em que o peptídeo compreende dois resíduos de alanina, cada resíduo de alanina pode ter a mesma, ou oposta, estereoquímica absoluta. Salvo indicação em contrário, o aminoácido é considerado na configuração L.
[00147] A invenção refere-se também a compostos em forma estereoisomérica substancialmente pura em relação aos centros assimétricos dos resíduos de aminoácidos, por exemplo, maior que cerca de 90% de, tal como cerca de 95% a 97% de, ou maior que 99% de, bem como misturas, incluindo misturas racêmicas, dos mesmos. Tais diastereômeros podem ser preparados por síntese assimétrica, por exemplo, usando intermediários quirais, ou as misturas podem ser resolvidas por métodos convencionais, por exemplo, cromatografia ou uso de um agente de resolução.
[00148] Quando os compostos da presente invenção requerem purificação, podem ser usadas técnicas cromatográficas, tais como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e HPLC de fase reversa. Os compostos podem ser caracterizados por espectrometria de massa e/ou outros métodos apropriados.
[00149] Quando o composto compreende um ou mais grupos funcionais que podem ser protonados ou desprotonados (por exemplo, a pH fisiológico), o composto pode ser preparado e/ou isolado como um sal farmaceuticamente aceitável. Será reconhecido que o composto pode ser zwitteriônico a um dado pH. Como aqui usada, a expressão “sal farmaceuticamente aceitável” refere-se ao sal de um dado composto, em que o sal é adequado para administração como um fármaco. Tais sais podem ser formados, por exemplo, pela reação de um ácido ou de uma base com uma amina ou um grupo ácido carboxílico, respectivamente.
[00150] Os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados a partir de ácidos inorgânicos e orgânicos. Exemplos de ácidos inorgânicos incluem ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e semelhantes. Exemplos de ácidos orgânicos incluem ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico e semelhantes.
[00151] Os sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados a partir de bases inorgânicas e orgânicas. Os contra-íons correspondentes derivados de bases inorgânicas incluem os sais de sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio e magnésio. As bases orgânicas incluem aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas de ocorrência natural e aminas cíclicas, incluindo isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2- dimetilaminoetanol, trometamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilenodiamina, glicosamina, N- alquilglucaminas, teobromina, purinas, piperazina, piperidina e N- etilpiperidina.
[00152] Os sais de adição de ácido/base tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos do que as correspondentes formas ácido/base livres.
[00153] A presente invenção também provê uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto tripartido, como aqui definido anteriormente, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, juntamente com pelo menos um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[00154] O termo “composição” pretende incluir a formulação de um ingrediente ativo com material encapsulante como carreador, para dar uma cápsula na qual o ingrediente ativo (com ou sem outro carreador) está circundado por carreadores.
[00155] Embora os compostos como aqui descritos anteriormente, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, possam ser o único ingrediente ativo administrado ao indivíduo, a administração de outro(s) ingrediente(s) ativo(s) com o composto está dentro do escopo da invenção. Em uma ou mais modalidades, é considerado que uma combinação de dois ou mais dos compostos da invenção será administrada ao indivíduo. Está previsto que o(s) composto(s) também pode(m) ser administrado(s) com um ou mais agentes terapêuticos adicionais em combinação. A combinação pode permitir a administração separada, sequencial ou simultânea do(s) composto(s) como aqui descrito anteriormente com o(s) outro(s) ingrediente(s) ativo(s). A combinação pode ser provida na forma de uma composição farmacêutica.
[00156] O termo “combinação”, como aqui usado, refere-se a uma composição ou kit de partes onde os parceiros de combinação como definidos acima podem ser dosados de forma dependente ou independente ou pelo uso de diferentes combinações fixas com quantidades distintas dos parceiros de combinação, ou seja, simultaneamente ou em diferentes pontos no tempo. Os parceiros de combinação podem então, por exemplo, ser administrados simultaneamente ou cronologicamente escalonados, isto é, em diferentes momentos e com intervalos de tempo iguais ou diferentes para qualquer parte do kit de partes. A razão das quantidades totais dos parceiros de combinação a serem administrados na combinação pode ser variada, por exemplo, a fim de lidar com as necessidades de uma subpopulação de pacientes a ser tratada ou as necessidades do paciente único cujas diferentes necessidades podem ser devido à idade, sexo, peso corporal, etc. dos pacientes.
[00157] Como será prontamente reconhecido pelos versados na técnica, a via de administração e a natureza do carreador farmaceuticamente aceitável dependerão da natureza da condição e do mamífero a ser tratado. Acredita-se que a escolha de um carreador ou sistema de dispensação em particular e a via de administração possam ser prontamente determinadas por um versado na técnica. Na preparação de qualquer formulação contendo o composto ativo, deve ter-se o cuidado de assegurar que a atividade do composto não seja destruída no processo e que o composto seja capaz de atingir o seu sítio de ação sem ser destruído. Em algumas circunstâncias, pode ser necessário proteger o composto por meios conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, microencapsulação. De modo similar, a via de administração escolhida deve ser tal que o composto atinja seu sítio de ação.
[00158] Os versados na técnica podem determinar prontamente formulações apropriadas para os compostos da presente invenção usando abordagens convencionais. A identificação das faixas preferidas de pH e excipientes adequados, por exemplo antioxidantes, é rotina na técnica. Os sistemas tampão são usados rotineiramente para prover valores de pH de uma faixa desejada e incluem tampões de ácido carboxílico, por exemplo acetato, citrato, lactato e succinato. Uma variedade de antioxidantes está disponível para tais formulações, incluindo compostos fenólicos, como BHT ou vitamina E, agentes redutores, tais como metionina ou sulfito, e quelantes de metais, como EDTA.
[00159] Os compostos como aqui descritos anteriormente, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, podem ser preparados em formas de dosagem parenterais, incluindo as adequadas para administração intravenosa, intratecal e intracerebral ou epidural. As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões estéreis injetáveis, e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis. Elas devem ser estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento e podem ser preservadas contra redução ou oxidação e a ação contaminante de microrganismos como bactérias ou fungos.
[00160] O solvente ou meio de dispersão para a solução ou dispersão injetável pode conter qualquer um dos sistemas convencionais de solvente ou carreador para o composto ativo e pode conter, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes), misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser realizada onde necessário pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes para ajustar a osmolaridade, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Opcionalmente, a formulação para injeção será isotônica com sangue. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina. As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável podem ser dispensadas por qualquer via apropriada incluindo injeção intravenosa, intramuscular, intracerebral, intratecal, epidural ou infusão.
[00161] As soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação dos compostos da invenção na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes tais como os enumerados acima, como requerido, seguido por esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e liofilização de uma solução previamente filtrada estéril do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado.
[00162] Outras formas farmacêuticas incluem formulações orais e entéricas da presente invenção, nas quais o composto ativo pode ser formulado com um diluente inerte ou com um carreador comestível assimilável, ou pode ser encerrado em uma cápsula de gelatina dura ou mole, ou pode ser comprimido em comprimidos, ou pode ser incorporado diretamente com o alimento da dieta. Para administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais ou sublinguais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas e semelhantes. A quantidade de composto ativo em tais composições terapeuticamente úteis é tal que será obtida uma dosagem adequada.
[00163] Comprimidos, pastilhas, pílulas, cápsulas e semelhantes podem também conter os componentes listados a seguir: um aglutinante tal como goma, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes tais como fosfato dicálcico; um agente desintegrante, tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e semelhantes; um lubrificante tal como estearato de magnésio; e um agente edulcorante tal como sacarose, lactose ou sacarina pode ser adicionado ou um agente aromatizante tal como menta, óleo de gualtéria ou aromatizante de cereja. Quando a forma unitária de dosagem é uma cápsula, pode conter, além dos materiais do tipo acima, um carreador líquido. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou, de outro modo, para modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidos com goma- laca, açúcar ou ambos. Um xarope ou elixir pode conter o composto ativo, sacarose como agente edulcorante, metilparabeno e propilparabeno como conservantes, um corante e aromatizante tal como aroma de cereja ou laranja. Naturalmente, qualquer material usado na preparação de qualquer forma unitária de dosagem deve ser farmaceuticamente puro e substancialmente não tóxico nas quantidades utilizadas. Além disso, os compostos da invenção podem ser incorporados em preparações e formulações de liberação prolongada, incluindo aquelas que permitem a dispensação específica do peptídeo ativo a regiões específicas do intestino.
[00164] As formulações líquidas podem também ser administradas entericamente através de um tubo estomacal ou esofágico. As formulações entéricas podem ser preparadas na forma de supositórios por mistura com bases apropriadas, tais como bases emulsificantes ou bases solúveis em água. É também possível, mas não necessário, que os compostos da presente invenção sejam administrados por via tópica, intranasal, intravaginal, intraocular e semelhantes.
[00165] Veículos e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem todo e qualquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e semelhantes. O uso de tais meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o ingrediente ativo, é contemplado o uso do mesmo nas composições terapêuticas. Os ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[00166] É especialmente vantajoso formular as composições na forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma unitária de dosagem tal como aqui usada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmaceuticamente aceitável. A especificação para as novas formas unitárias de dosagem da invenção é ditada por e diretamente dependente das (a) características únicas do material ativo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) limitações inerentes na técnica de composição de materiais ativos para o tratamento de doença em indivíduos vivos com uma condição de doença em que a saúde do corpo é comprometida como aqui descrito em detalhe.
[00167] Como mencionado acima, o principal ingrediente ativo pode ser composto para administração conveniente e eficaz em quantidades terapeuticamente eficazes com um veículo farmaceuticamente aceitável adequado na forma de dosagem unitária. Uma forma de dosagem unitária pode, por exemplo, conter o composto ativo principal em quantidades que variam de 0,25 mg a cerca de 2000 mg. Expresso em proporções, o composto ativo pode estar presente em cerca de 0,25 μg a cerca de 2000 mg/ml de carreador. No caso de composições contendo ingredientes ativos suplementares, as dosagens são determinadas por referência à dose usual e modo de administração dos ditos ingredientes.
[00168] Como usado aqui, o termo “quantidade eficaz” refere-se a uma quantidade de composto que, quando administrado de acordo com um regime de dosagem desejado, provê a atividade terapêutica desejada. A dosagem pode ocorrer uma vez, ou em intervalos de minutos ou horas, ou continuamente durante qualquer um desses períodos. Dosagens adequadas podem ficar na faixa de cerca de 0,1 ng por kg de peso corporal a 1 g por kg de peso corporal por dosagem. Uma dosagem típica fica na faixa de 1 μg a 1 g por kg de peso corporal por dosagem, tal como na faixa de 1 mg a 1 g por kg de peso corporal por dosagem. Em uma modalidade, a dosagem pode estar na faixa de 1 mg a 500 mg por kg de peso corporal por dosagem. Em uma outra modalidade, a dosagem pode estar na faixa de 1 mg a 250 mg por kg de peso corporal por dosagem. Em ainda uma outra modalidade, a dosagem pode estar na faixa de 1 mg a 100 mg por kg de peso corporal por dosagem, tal como até 50 mg por peso corporal por dosagem.
[00169] Os termos “tratamento” e “tratar” como usados aqui cobrem qualquer tratamento de uma condição ou doença em um animal, opcionalmente um mamífero, tal como um humano, e inclui o tratamento de qualquer doença ou distúrbio que é mediado por sinalização por GPCR endossomal. Os termos “prevenção” e “prevenir” como usados aqui cobrem a prevenção ou profilaxia de uma condição ou doença em um animal, opcionalmente um mamífero, tal como um humano e inclui a prevenção de uma doença ou distúrbio que é mediado pela sinalização por GPCR endossomal.
[00170] Ao longo deste relatório descritivo e reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija o contrário, a palavra “compreender”, e variações como “compreende” ou “compreendendo”, serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.
[00171] A referência neste relatório descritivo a qualquer publicação prévia (ou informação derivada dela), ou a qualquer matéria que seja conhecida, não é, e não deve ser tomada como um reconhecimento ou admissão ou qualquer forma de sugestão que aquela publicação prévia (ou informação derivada dela) ou matéria conhecida faz parte do conhecimento geral comum no campo de atuação ao qual este relatório descritivo se refere.
[00172] A invenção será agora descrita com referência aos seguintes exemplos não limitativos:
[00173] Os exemplos seguintes são representativos da presente invenção e proveem métodos detalhados para preparar compostos exemplificativos da presente invenção.
[00174] Os compostos tripartidos de acordo com a presente invenção foram preparados pelos seguintes procedimentos experimentais: NH2-PEG12-Asp(OChol)-resina. A síntese do conjugado espaçador-lipídio foi preparada por síntese peptídica manual com química Fmoc padrão na resina NovaSyn®TGR R (carga 0,18 mmol/g da NovaBiochem). O acoplamento de Fmoc-Asp(OChol)-OH (1,5 eq) com hexafluorofosfato de (1H-Benzotriazol-1-iloxi)(tri-1-pirrolidinil)fosfônio (PyBOP, 2 eq) em diclorometano (DCM) com ativação in situ usando di- isopropiletilamina (DIPEA, 3 eq) durante 3h. A desproteção de Fmoc foi conseguida usando 20% de piperidina em N,N-dimetilformamida (DMF). Fmoc-PEG12-OH (2 eq) foi acoplado a NH2-Asp(OChol) ligado a resina com PyBOP (2 eq) e DIPEA (3 eq) em DCM. A desproteção de Fmoc foi conseguida usando 20% de piperidina em N,N-dimetilformamida (DMF). Após a desproteção final, os antagonistas de NK1R foram acoplados ao conjugado espaçador-lipídio em resina.
[00175] Composto B. (3S,4S)-N-(3,5-bis(trifluorometil)benzil)-3-(4- fluoro-2-metilfenil)-N-metilpiperidina-4-carboxamida (500 mg, 1,0 mmol) em DCM (15 mL) foi adicionada DIPEA (3,47 mL, 2,0 mmol) seguido de cloroxoacetato de etila (1,67 mL, 1,5 mmol) e agitada à TA durante 1 h. A mistura foi diluída com DCM e lavada com bicarbonato saturado e depois HCl 1N. A camada orgânica foi seca (MgSO4), filtrada e concentrada até um resíduo e usada diretamente na etapa seguinte.
[00176] O resíduo foi dissolvido em MeOH (5 mL) e foi adicionado LiOH 0,5 M (4 mL, 2 mmol) e deixado em agitação à TA durante 2 h. A mistura foi particionada entre HCl 1N e DCM. A camada orgânica foi seca (MgSO4), filtrada e concentrada até um resíduo que foi purificado por cromatografia em gel de sílica (DCM:MeOH, 95:5 a 80:20), provendo ácido 2-((3S,4S)-4-((3,5-bis(trifluorometil)benzil)(metil)carbamoil)-3-(4-fluoro-2- metilfenil)piperidin-1-il)-2-oxoacético como uma espuma amorfa (432 mg,79%).
[00177] Ácido bis(trifluorometil)benzil)(metil)carbamoil)-3-(4-fluoro-2-metilfenil)piperidin- 1-il)-2-oxoacético (10 eq em comparação com a carga de resina) foi acoplado a NH2-PEG12-Asp(OChol)-resina ligada a resina (250 mg) com PyBOP (10 eq) e DIPEA (10 eq), HOBt (10 eq) em DMF durante a noite. A construção foi então clivada da resina usando 95% de ácido trifluoroacético e purificada por cromatografia em gel de sílica (DCM:MeOH, 98:2 a 80:20), provendo o composto de sonda tripartida B como um óleo viscoso (34,8 mg).
[00178] Composto C-1. (3S,4S)-N-(3,5-bis(trifluorometil)benzil)-3-(4- fluoro-2-metilfenil)-N-metilpiperidina-4-carboxamida (50 mg, 0,1 mmol) em DMF (1,5 mL) foi adicionado ácido oxâmico (17 mg, 0,2 mmol) seguido de PyBOP (104 mg, 0,2 mmol) e, por fim, DIPEA (34 μL, 0,2 mmol) e agitada à TA durante a noite. A mistura foi diluída com EtOAc e lavada com bicarbonato saturado e depois HCl 1N. A camada orgânica foi seca (MgSO4), filtrada e concentrada até um resíduo que foi purificado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa (coluna Phenomenex Luna C8, Lane Cove, Austrália) com 0,1% de TFA/H2O e 0,1% de TFA/ACN como solventes, provendo ácido 2-((3S,4S)-4-((3,5- bis(trifluorometil)benzil)(metil)carbamoil)-3-(4-fluoro-2-metilfenil)piperidin- 1-il)-2-oxoacético como um sólido amorfo (47 mg, 88%).
[00179] Composto C-3. (3S,4S)-4-((3,5-bis(trifluorometil)benzil)(metil)carbamoil)-3-(o-tolil)piperidina-1-carboxilato de terc-butila (200 mg, 0,36 mmol) foi desprotegido de Boc com HCl 4M em dioxano (6 mL) à TA durante 4 h. A mistura foi concentrada e triturada com EtOAc para prover um sólido (170 mg, 96%). O material de-Boc (150 mg, 0,303 mmol) foi acoplado a ácido N-Boc isonipecótico (76 mg, 0,334 mmol) com hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H- 1,2,3-triazol[4,5-b]-piridínio (HATU) H(127 mg, 0,334 mmol), em DMF (3 mL) com ativação in situ usando DIPEA (158 μL, 0,909 mmol) durante 3 h. A mistura foi diluída com EtOAc e lavada com água, bicarbonato saturado e, por fim, salmoura. A camada orgânica foi seca (MgSO4), filtrada e concentrada até um resíduo que foi purificado por cromatografia em gel de sílica (EtOAc:éter de pet, 50:50 a 100:0) provendo uma resina incolor clara (205 mg) que foi imediatamente desprotegida de Boc com HCl 4M em dioxano (6 mL). A concentração após 3 h provê o intermediário desprotegido 4 para um resíduo (180 mg, 98%). A (3S,4S)-N-(3,5-bis(trifluorometil)benzi)- N-metil-1-(piperidina-4-carbonil)-3-(o-tolil)piperidina-4-carboxamida (130 mg, 0,215 mmol) foi acoplada a anidrido succínico (24 mg, 0,236 mmol)) em DCM (3 mL) com ativação in situ usando DIPEA (112 μL, 0,644 mmol) durante 3 h. A mistura foi diluída com DCM e lavada com HCl 1N, depois salmoura. A camada orgânica foi seca (MgSO4), filtrada e concentrada até prover o Composto C - ácido 3, 4-(4-((3S,4S)-4-((3,5-bis(trifluorometil)benzil)(metil)carbamoil)-3-(o-tolil)piperidina-1-carbonil)piperidin-1-il)-4-oxobutanoico como uma espuma amorfa (157 mg).
[00180] Composto C-2. (3S,4S)-N-(3,5-bis(trifluorometil)benzil)-N- metil-1-(piperidina-4-carbonil)-3-(o-tolil)piperidina-4-carboxamida (50 mg, 0,083 mmol) foi dissolvida em DMF (2 mL) e a essa mistura foi adicionado ácido glicólico (7 mg, 0,091 mmol), HATU (35 mg, 0,091 mmol), seguido de DIPEA (43 μL, 0,248 mmol) e agitada à TA durante 2 h. A mistura foi diluída com éter e lavada com água, depois HCl 1N. A camada orgânica foi seca (MgSO4), filtrada e concentrada até um resíduo que foi purificado por cromatografia em gel de sílica (MeOH:EtOAc, 10:90) provendo uma resina opaca clara (36 mg). A resina foi triturada com éter de petróleo para prover o Composto C-2 (3S,4S)-N-(3,5-bis(trifluorometil)benzil)-1-(1-(2- hidroxiacetil)piperidina-4-carbonil)-N-metil-3-(o-tolil)piperidina-4- carboxamida como um sólido amorfo (26 mg, 50%).
[00181] A. O ácido Composto C-ácido 3 4-(4-((3S,4S)-4-((3,5- bis(trifluorometil)benzil)(metil)carbamoil)-3-(o-tolil)piperidina-1- carbonil)piperidin-1-il)-4-oxobutanoico (130 mg) foi acoplado a NH2-PEG12- Asp(OChol)-resina ligada a resina (250 mg) com PyBOP (2 eq) e DIPEA (3 eq) em DCM durante a noite. A construção foi então clivada da resina usando 95% de ácido trifluoroacético e purificada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa (coluna Phenomenex Luna C8, Lane Cove,Austrália) com 0,1% de TFA/H2O e 0,1% de TFA/ACN como solventes, provendo o Composto de sonda tripartida A como um óleo viscoso (30,2 mg).
[00182] Os seguintes compostos podem ser preparados usando a mesma química e partindo do antagonista de NK1 indicado.
[00183] O intermediário D-1 (1,0 g, 1,94 mmol) foi acoplado a ácido N-Boc isonipecótico (459 mg, 2,0 mmol) com hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazol[4,5-b]-piridínio (779 mg, 2,05 mmol), em DMF (10 mL) com ativação in situ usando Et3N (554 μL, 4,0 mmol) à TA durante a noite. A mistura foi lentamente diluída com água provendo um precipitado que foi agitado durante 2 h e depois filtrado. A torta de filtro foi lavada com grandes quantidades de água e seco para prover um sólido esbranquiçado (1,43 g) que foi imediatamente desprotegido de Boc com HCl 4M em dioxano (10 mL). A concentração após 3 horas provê o intermediário desprotegido D-2 como um sólido amorfo (1,28 g, 99%).A concentração após 3 h provê o intermediário desprotegido 4 para um resíduo (1,28 g, 99%).
[00184] O intermediário D-2 (100 mg, 0,151 mmol) foi acoplado a anidrido succínico (15 mg, 0,151 mmol)) em DCM (5 mL) com ativação in situ usando Et3N (63 μL, 0,453 mmol) à TA durante a noite. A mistura foi diluída com DCM e lavada com HCl 1N, depois salmoura. A camada orgânica foi seca (MgSO4), filtrada e concentrada para prover o intermediário D-3 como uma resina incolor clara (119 mg).
[00185] O ácido D-3 (119 mg) foi acoplado a NH2-PEG12- Asp(OChol)-resina ligada a resina (300 mg) com PyBOP (2 eq) e DIPEA (6 eq) em DCM:DMF (1:1) durante 2 h. A construção foi então clivada de resina usando 95:5 TFA:TIPS, concentrada até um resíduo que foi tomado em DCM e lavado com bicarbonato, seco (MgSO4), filtrado e concentrado até um resíduo (118 mg) e purificado por cromatografia em gel de sílica (MeOH:EtOAc:Et2NH 10:90:1) provendo o Composto D como um óleo viscoso incolor claro (68 mg, 69%).
[00186] HRMS: m/z calculado; C89H137Cl2F6N7O20 [M + H]+ 1809,9306, [M+ 2 H]2+ 905,4689; observado: [M + H]+ 1809,9361, [M+ 2 H]2+ 905,4735.
[00187] A sinalização por NK1R endossomal gera sinais subcelulares que são subjacentes à ativação neuronal e hiperalgesia. Estímulos dolorosos e pró-inflamatórios, incluindo o agonista do receptor de potencial transitório vaniloide 1, a capsaicina, estimulam a liberação de substância P (SP) de nociceptores sensoriais primários nas lâminas I, II do corno dorsal, onde a SP estimula a endocitose de NK1R em neurônios espinhais.
[00188] Uma sonda tripartida com base na presente invenção pode ser sintetizada compreendendo o colestanol lipídico ou etil éster (controle negativo, sem ancoragem à membrana), um ligante polietileno glicol e o corante fluorescente Cianina 5 (Cy5), além dos compostos tripartidos da presente invenção.
[00189] Em uma primeira abordagem experimental, o alvejamento do composto tripartido para o NK1R endossomal pode ser estudado da seguinte forma: Após a incubação com células HEK293, Cy5-colestanol irá inserir na membrana plasmática por 5 min e pode ser detectado em endossomas por 30 a 60 min, momento em que > 50% da sonda será internalizada, enquanto o Cy5-etil éster permanecerá no fluido extracelular. Após 4 h, o Cy5-colestanol irá redistribuir a partir da membrana plasmática para endossomas iniciais positivos para Rab5a contendo NK1R-GFP.
[00190] Um ensaio FRET pode ser usado para avaliar quantitativamente a capacidade de uma sonda tripartida para atingir o NK1R em endossomas da seguinte forma: As células HEK293 são transfectadas com 50 ng/poço de NK1R com Snap-Tag® N-terminal extracelular. Após 48 h, o NK1R de superfície celular é marcado com substrato fluorescente fotoestável SNAP-Surface™ 549 (New England Biolabs) (1 μM, 30 min, 37°C em DMEM, 0,5% de BSA). As células foram lavadas, recuperadas em DMEM por 30 min e estimuladas com substância P (SP) (10 nM, 30 min, 37°C) para induzir a endocitose de NK1R. As células são incubadas com Cy5-colestanol (200 nM, 37 °C). A FRET de emissão sensibilizada por SNAP-549/Cy5 é analisada por microscopia confocal usando excitação sequencial com lasers de argônio (514 nm)/HeNe (633 nm) e emissão a 570-620 nm (doador SNAP-549) e 670-750 nm (aceptor Cy5 FRET e Cy5) antes e depois da adição de Cy5-colestanol. Os controles incluem células HEK293 não transfectadas (apenas aceptor) e células HEK293 não tratadas com Cy5-colestanol (apenas doador). FRET é analisada conforme descrito e expressa como razões de emissão relativas aos controles (F/F0).
[00191] NK1R com Snap-Tag N-terminal extracelular pode ser expresso em células HEK293 e NK1R de superfície celular é marcado com substrato fluorescente fotoestável SNAP-Surface™ 549 não permeante à membrana. SP (10 nM, 30 min) evoca a translocação de todos os SNAP-549 detectáveis para endossomas. FRET de SNAP-549-NK1R e Cy5-colestanol pode ser detectada após a adição de Cy5-colestanol, e aumentada por >75 min. A análise da origem subcelular da FRET pode então confirmar que a maior parte do sinal será intracelular, comprovando a associação da sonda a NK1R endossomal.
[00192] Quando as células são pré-incubadas com um composto tripartido da presente invenção, por exemplo, por 30 min, e então imediatamente desafiadas com SP, antagonistas adequados serão mostrados para bloquear a ativação de ERK nuclear e citosólica indicando antagonismo efetivo do NK1R de superfície celular. Em contraste, quando as células são incubadas por pulsos com antagonistas por 30 min, lavadas e depois estimuladas com SP 4 h mais tarde, o composto tripartido sozinho inibirá a ERK nuclear e nenhum dos antagonistas inibirá a ERK citosólica. O composto tripartido da presente invenção não afeta a ativação induzida por isoprenalina da ERK nuclear, que é mediada pelo receptor adrenérgico β2 endógeno.
[00193] Assim, pode ser mostrado por tal abordagem que a conjugação ao colestanol dispensa sondas a endossomas precoces positivos para NK1R, e após incubação por pulsos os compostos tripartidos da presente invenção são capazes de causar antagonismo prolongado e seletivo de NK1R endossomal de superfície não celular.
[00194] Em uma segunda abordagem experimental, fatias de medula espinhal de rato podem ser incubadas com o composto tripartido da presente invenção para avaliar se o antagonismo do NK1R endossomal bloqueia a excitação induzida por SP prolongada de neurônios espinhais.
[00195] Após a incubação por 60 min, as fatias da medula espinhal são lavadas, incubadas em meio livre de antagonistas por 60 min e, em seguida, desafiadas com SP. Em fatias pré-tratadas com veículo ou com espantida, a SP causará alta descarga de potencial de ação que é prolongada após a remoção da SP. O composto tripartido não suprime a excitação inicial, mas impede a descarga do potencial de ação que é prolongada após a remoção do SP. Assim, um antagonista de NK1R alvejado por endossomas e ancorado à membrana efetivamente bloqueia a ativação de neurônios espinhais induzida por SP e provoca analgesia de longa duração.
[00196] Para avaliar adicionalmente se o antagonismo de NK1R endossomal também bloqueia a nocicepção, podem ser feitas injeções intratecais de Cy5-colestanol, espantida ou do composto tripartido da presente invenção a camundongos. Após 3 horas, a capsaicina é injetada na pata. O composto tripartido da presente invenção, mas não espantida ou Cy5- colestanol inibirá marcadamente a hiperalgesia evocada pela capsaicina.
[00197] Quando administrada 30 minutos após a capsaicina, a espantida intratecal terá um efeito analgésico pequeno e transitório, enquanto que o composto tripartido causará uma analgesia de inibição retardada, persistente e substancial. O Cy5-colestanol será detectado nos neurônios das lâminas I-III após 6 h, sugerindo uma dispensação efetiva da sonda. Quando injetado por via intratecal 3 h antes da formalina intraplantar, o composto tripartido inibirá marcadamente ambas as fases do comportamento nocifensivo com maior eficácia do que a espantida. Quando injetado por via intratecal 36 h após CFA intraplantar, o composto tripartido é analgésico após 4 h, e a analgesia é prolongada por > 6 h, enquanto as ações analgésicas da espantida serão menores e transitórias.
[00198] Para avaliar a utilidade geral do alvejamento endossomal, o antagonista de NK1R de molécula pequena L733-0660 pode também ser testado por conjugação com o colestanol através de um ligante de polietilenoglicol. Quando injetado por via intratecal 3 h antes da capsaicina intraplantar, esse conjugado mostrará analgesia prolongada por > 4h, enquanto o efeito de L-733.060 é apenas pequeno e transitório.
[00199] Assim, um antagonista de NK1R alvejado por endossomas e ancorado à membrana efetivamente bloqueia a ativação de neurônios espinhais induzida por SP e provoca analgesia de longa duração. Apesar de a espantida e o composto tripartido serem similarmente estáveis no CSF humano por > 4h, após a injeção intratecal no camundongo, a espantida será extensivamente metabolizada enquanto o composto tripartido é estável. Alvejamento e retenção endossomal podem contribuir para a estabilidade in vivo.
[00200] Os estudos acima podem ser feitos usando as seguintes técnicas: fatias parassagitais (340 a 400 μm) são preparadas usando um vibratomo da região lombar da medula espinhal de rato em líquido cefalorraquidiano artificial à base de sacarose gelado (sACSF) (mM: 100 sacarose, 63 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH2PO4, 1,2 MgCl2, 25 glicose, 25 NaHCO3; 95% O2/5% CO2). As fatias são transferidas para ACSF de recuperação à base de N-Metil-D-Glucamina (NMDG) (rACSF) (mM: 93 NMDG, 93 HCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glicose, 5 ascorbato de Na, 2 tioureia, 3 piruvato de Na, 10 MgSO4, 0,5 CaCl2; 95% O2/5% CO2, 15 min, 34 °C). As fatias são transferidas para ACSF normal (mM: 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,2 MgCl2, 2,5 CaCl2, 25 glicose, 11 NaHCO3; 95% O2/5% CO2) contendo 10 μM MK-801 (45 min, 34 °C), depois mantidas à TA.
[00201] Fatias de medula espinhal de rato são transferidas para uma câmara de registro e superfundidas com ACSF normal (2 ml.min-1, 36°C). Óptica de contraste Dodt é usada para identificar neurônios positivos para NK1R putativos (capacitância < 20 pF) na lâmina I com base em sua posição, tamanho e formato fusiforme com dendritos restritos à lâmina I. As fatias são pré-incubadas com Dy4 ou Dy4 inativa (ambas 30 μM, DMSO a 0,03%) durante 10 min antes de registrar, ou são pré-incubadas com o composto tripartido da presente invenção e espantida (ambos 1 μM em DMSO a 0,01%) durante 60 min, lavados e incubados em ACSF sem antagonista por mais 60 minutos antes de registrar. PS2 não será solúvel nas baixas concentrações de DMSO requeridas para eletrofisiologia. Os neurônios da lâmina I nociceptivos presumidos positivos para NK1R grandes são visualmente identificados conforme descrito (Imlach, W. L., et al., Molecular Pharmacology, 2015, 88, 460-428). Correntes espontâneas são registradas na configuração anexada à célula (Multiclamp 700B, Molecular Devices, Sunnyvale, CA), amostradas a 10 kHz, filtradas em alta passagem a 1 Hz, e eventos potenciais de ação capacitivamente acoplados são analisados usando Axograph X, V 1.4.4 (Axograph). Eletrodos adesivos (resistência 2,5-3,5 MQ) devem conter solução interna à base de KMES (mM: 105 KMES, 20 NaCl, 5 HEPES, 10 BAPTA, 1,5 MgCl2, 4 MgATP, 0,4 NaGTP, 0,1% biocitina; 285-295 mosmol.l-1) para facilitar registros subsequentes de propriedades de potencial de ação na configuração de célula inteira. Os registros são feitos na presença de CNQX (6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3- diona) (10 μM; antagonista do receptor de AMPA/cainato), picrotoxina (100 μM; antagonista do receptor GABAA), estricnina (0,5 μM; glicina e antagonista do receptor de acetilcolina), e AP5 (ácido (2R)-amino-5- fosfonovalérico; (2R)-amino-5- fosfonopentanoato) (100 mM; antagonista do receptor de NMDA) para minimizar as influências pré-sinápticas nas propriedades do potencial de ação. As fatias são então desafiadas por superfusão com SP (1 μM) por 2 min. Os registros são amostrados a 10 kHz e filtrados com um filtro passa-alta a 1 Hz e a taxa de disparo é medida em intervalos de dois minutos. No final de cada registro anexado à célula, os registros de célula inteira são feitos no modo de clampeamento de corrente para confirmar a retenção do disparo do potencial de ação normal. Os dados só são incluídos na análise se as células tiverem amplitudes de potencial de ação que estejam <50 mV acima do limite para garantir a inclusão de neurônios viáveis. As células são preenchidas com biocitina e as seções são processadas para confirmar a expressão de NK1R por imunofluorescência. A taxa de disparo para cada célula é normalizada para a resposta no ponto de tempo de 2 min, que não será significativamente diferente entre os grupos. O tempo de disparo é determinado como a duração da resposta ao último potencial de ação. Para avaliar a transmissão sináptica, os registros de configuração de células inteiras são feitos sob condições de controle ou após a exposição a Dy4 ou Dy4 inativa; um eletrodo estimulador bipolar é colocado na zona de entrada da raiz dorsal, e as correntes pós-sinápticas excitatórias eletricamente evocadas são registradas como descrito (Imlach, W. L., et al., Molecular Pharmacology, 2015, 88, 460-428). Para avaliar adicionalmente a endocitose de NK1R, fatias da medula espinhal (400 μm) são incubadas com SP (1 μM, 5 min), fixadas em PFA (4h, RT), crioprotegidas e processadas para localizar o NK1R.
[00202] Os camundongos são aclimatados ao aparelho experimental e ao ambiente durante 1 a 2 horas em 2 dias sucessivos antes dos experimentos. A hiperalgesia mecânica é avaliada por retirada da pata para estimulação da superfície plantar da pata traseira com filamentos graduados de von Frey. No dia anterior ao estudo, os escores de von Frey são medidos em triplicata para estabelecer uma linha de base para cada animal. Para avaliar o edema da pata, a espessura da pata traseira é medida usando paquímetros digitais antes e depois dos tratamentos. Para injeções intraplantares, os camundongos são sedados (5% de isoflurano). A capsaicina (5 μg), adjuvante completo de Freund (CFA, 2 mg/ml) ou veículo (capsaicina, 20% de etanol, 10% de Tween 80, 70% de solução salina; CFA, solução salina) é injetada subcutaneamente na superfície plantar da pata traseira esquerda (10 μl). Os escores de von Frey (patas esquerda e direita) e a espessura da pata (pata esquerda) são medidos por 30 a 240 min após a capsaicina e 36 a 40 h após a injeção de CFA. Os resultados são expressos como valores percentuais pré- injetados. Para avaliação do comportamento nocifensivo, os camundongos são sedados e formalina (4%, 10 μl) é injetada subcutaneamente na superfície plantar da pata traseira esquerda. Os camundongos são colocados em um recipiente de Perspex e o comportamento nocifensivo (vacilar, lamber, morder a pata injetada) é registrado por 60 min. O número total de eventos nocifensivos é subdividido em fases aguda (I, 0-10 min) e tônica (II, 10-60 min). No final dos experimentos, os camundongos são submetidos a perfusão transcardíaca com PBS e PFA, e a medula espinhal é removida e processada para localizar o NK1R por imunofluorescência, como descrito para ratos. Os investigadores não estão cientes dos agentes de teste.
[00203] Injeções intratecais (5 μl, L3/L4) são feitas em camundongos conscientes. Dy4, Dy4 inativa, PS2, PS2 inativa (todos 50 μM), SR-140333 (15 μM), SM-19712 (8 mM), U0126 (100 μM) ou veículo (1% de DMSO/solução salina) são injetados por via intratecal 30 min antes da injeção intraplantar de capsaicina ou formalina, ou 36 h após CFA. Espantida (50 μM), o composto tripartido (50 μM), L-733,060 (100 nM) ou Cy5-colestanol (10 μM) são injetados por via intratecal 3 h antes ou 30 min após injeção intraplantar de capsaicina, 3 h antes da formalina, ou 36 h após CFA.
[00204] Os exemplos seguintes são representativos da presente invenção e proveem métodos detalhados para preparar compostos exemplificativos da presente invenção. Detalhes experimentais gerais: A resina Fmoc-PAL-PEG-PS para SPPS foi obtida junto à Applied Biosciences. Aminoácidos de PEG (Fmoc-PEG3-OH e Fmoc-PEG4- OH) foram obtidos junto ao Polypeptide Group (França). Fmoc-Asp(OChol)- OH e Fmoc-Asp(OEt)-OH foram sintetizadas a partir de Fmoc-Asp-Ot-Bu comercialmente disponível usando química padrão (esterificação de cadeia lateral, seguida de desproteção ácida do C-terminal). Todos os outros aminoácidos Fmoc (com grupos protetores adequados) foram obtidos junto à Chem-Impex ou Auspep. Agentes de acoplamento (HBTU, HCTU) e solventes foram usados como recebidos.
[00205] Os dados de cromatografia líquida com espectrometria de massa (LC-MS) foram obtidos usando um espectrômetro Shimadzu LCMS- 2020 equipado com uma Phenomenex Luna C8 (2) 3 μm analítica (100 Â, 100 x 2 mm) eluída com misturas de tampões A e B consistindo em 0,05% de TFA/H2O e 0,05% de TFA/ACN, respectivamente. Cromatografia líquida de alta pressão preparativa (HPLC) foi realizada usando um sistema Waters Prep LC constituído por uma bomba de solvente, controlador de sistema e detector de absorbância de UV, usando uma coluna Phenomenex Luna C8 (2) 10 μm (10 Â, 50 x 21,2 mm) para purificações preparativas de maior escala e uma coluna Phenomenex Luna C8 (2) de 5 μm (100 Â, 250 x 10 mm) para purificações semipreparativas de menor escala. Todas as separações usaram os tampões A e B consistindo em 0,1% de TFA/H2O e 0,1% de TFA/ACN, respectivamente como solvente. Métodos gerais de SPPS: A SPPS automatizada foi realizada usando um instrumento Rainin PS3 por métodos padrão, usando 20% v/v de piperidina em DMF como mistura de desproteção e 7% v/v de DIPEA em DMF como mistura de ativação. Aminoácidos protegidos com Fmoc (3 equivalentes em relação à carga de resina) foram pré-misturados em frascos com HCTU (3 eq) como um agente de acoplamento e tempos de acoplamento padrão de 50 minutos foram usados.
[00206] A SPPS manual foi realizada em uma coluna de filtração de 5 mL que pode ser encerrada dentro de um balão de fundo redondo de 250 mL e agitada em um evaporador rotativo padrão. Para a desproteção de N-Fmoc, 20% v/v de piperidina em DMF (2 mL) foi adicionada à resina e a mistura foi agitada durante 15 minutos. A mistura de desproteção foi então removida por filtração e a resina foi lavada com DMF (5 x 2 mL). Esse processo foi repetido um total de três vezes para assegurar uma desproteção completa, com a resina lavada com DMF (5 x 2 mL), MeOH (5 x 2 mL) e CH2Cl2 (5 x 2 mL) na ocasião final. Para o acoplamento de aminoácidos, uma solução do aminoácido apropriado (3 equivalentes), HBTU ou HCTU (3 eq) e DIPEA (3,5 eq) em DMF (2 mL) foi adicionada à resina desprotegida e a mistura agitada durante 15 a 20 horas para garantir a desproteção completa. A mistura de acoplamento foi então removida por filtração e a resina foi lavada com DMF (5 x 2 mL), MeOH (5 x 2 mL) e CH2Cl2 (5 x 2 mL) e seca sob pressão reduzida.
[00207] Após a montagem do peptídeo na resina estar completa, a clivagem do suporte sólido foi conseguida por exposição da resina a uma mistura de TFA/TIPS/H2O a 95:2,5:2,5 v/v (3 mL) durante 2 a 3 horas com ocasional agitação. Para sínteses envolvendo aminoácidos com grupos protetores de cadeia lateral, foi usada uma mistura de TFA/TIPS/H2O/EDT a 92,5:2,5:2,5:2,5 v/v para evitar as reações secundárias indesejadas. A resina foi então removida por filtração e a solução de TFA foi concentrada sob uma corrente de N2 para dar o peptídeo bruto.
[00208] O peptídeo linear protegido DArg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-DTrp- Phe-DTrp-Leu-Leu-NH2 (Espantida I) foi sintetizado por SPPS automatizada como descrito acima, começando com N-desproteção de resina Fmoc-PAL- PEG-PS (278 mg, 0,18 mmol/g, 50,0 μmol). Após a etapa final de desproteção de N, uma porção do material foi clivada da resina para dar um resíduo bruto que foi suspenso em uma mistura 1:1 de ACN/H2O contendo 0,1% TFA para garantir a desproteção completa da cadeia lateral. A purificação desse produto bruto por HPLC semipreparativa (20 a 90% de tampão B durante 35 minutos) deu Espantida I, o que foi confirmado por espectrometria de massa, m/z calculada: 749,5 para C75H110N20O13 [M + 2H+]; observada: m/z 749,4.
[00209] Em seguida, uma porção do composto ligado a resina desprotegido de N (375 mg, 50,0 μmol) foi transferida a uma coluna de filtração de 5 mL e submetida a SPPS manual com Fmoc-PEG4-OH, Fmoc- PEG3-OH, Fmoc-PEG4-OH e Fmoc-Asp(OChol)-OH, respectivamente. Após a etapa final de desproteção de N, o N-terminal do peptídeo foi capeado por exposição da resina a uma solução de DIPEA (100 μL) e anidrido acético (1,5 mL) em DMF (1,5 mL) com agitação contínua durante duas horas. A resina foi então lavada da maneira usual e o peptídeo foi clivado da resina para dar o produto bruto. A purificação por HPLC preparativa (50 a100% de tampão B durante 35 minutos) deu o Composto 1 (5,5 mg).
[00210] O Composto 1 foi confirmado por espectrometria de massa, m/z calculada: 908,9 para C139H223N24O31 [M + 3H+]; observada: m/z 908,2; m/z calculada: 1362,7 para C139H223N24O31 [M + 2H+]; observada: m/z 1361,8.
[00211] A síntese foi realizada por SPPS manual conforme descrito acima, começando com resina Fmoc-PAL-PEG-PS (carga 0,17 mmol/g da Life Technologies) em uma escala de 0,025 mmol (147 mg de resina). O ciclo de acoplamento/desproteção foi repetido um total de 4 vezes, usando Fmoc- Asp(OChol)-OH, Fmoc-PEG4-OH, Fmoc-PEG3-OH e Fmoc-PEG4-OH, respectivamente.
[00212] Após a etapa final de desproteção de N, metade do peptídeo ligado a resina (85,7 mg, 12,5 μmol presumindo conversão completa) foi acoplado a 3 mol eq. de ácido 8-bromo-octanoico, 3 mol eq. de HCTU e 5 mol eq. de DIPEA em DMF (3 mL) com agitação constante durante 45 minutos, altura em que o teste TNBS apresentou um resultado positivo. A solução de acoplamento foi então filtrada e a resina foi lavada com DMF, MeOH e DCM (5 x 5 mL cada) e seca sob vácuo. Finalmente, o composto ligado a resina terminado em bromo foi reagido com o antagonista de NK1R L-733,060^HCl (0,8 mol eq.) em uma solução de iodeto de tetra-n- butilamônio (TBAI, 0,5 mol eq.) e DIPEA (5 mol eq.) ao longo de 3 dias. A solução de acoplamento foi então filtrada e a resina foi lavada com DMF, MeOH e DCM (5 x 5 mL cada) e seca sob vácuo. O produto foi clivado da resina usando 2 mL de uma mistura de TFA/TIPS/H2O (95:2,5:2,5) durante 1,5 h, após o que a resina foi filtrada, lavada com 2 mL de TFA, e o solvente foi removido sob uma corrente de nitrogênio. O resíduo bruto foi então tomado em uma mistura de água Milli-Q (1 mL) e acetonitrila (0,5 mL) e submetido a purificação por RP-HPLC. O Composto 2 foi confirmado como tendo o peso molecular correto por análise de ESI-MS: m/z calculada: 864,53 para C90H144F6N6O19 [M + 2H]2+; observada: m/z 864,70.
[00213] O agonista de NK1R GR73632 [Ava-Phe-Phe-Pro-N-MeLeu- Met-NH2] foi preparado por SPPS automatizada a partir de desproteção de N de resina Fmoc-PAL-PEG-PS como descrito acima. Após a desproteção de N final, uma porção do material foi clivada da resina usando solução de TFA (95:2,5:2,5 TFA:TIPS:H2O) para dar o peptídeo agonista desejado. O produto foi confirmado por espectrometria de massa: m/z 766,4, calc para C40H59N7O6S [M + H+] m/z 766,4.
[00214] O Composto 3 foi derivado de uma porção de GR73632 ligada a resina. A resina GR73632 desprotegida de N foi submetida a SPPS manual usando Fmoc-PEG4-OH, Fmoc-PEG3-OH, Fmoc-PEG4-OH e Fmoc- Asp(OChol)-OH como aminoácidos. Após a desproteção final, o N-terminal do peptídeo foi capeado por exposição a DIPEA e Ac2O em DMF durante 2 h. A construção foi clivada da resina como acima e purificada por HPLC repetida. Composto 3: m/z 996,6, calc para C104H173N11O24S [M + 2H+] m/z 996,1.
[00215] A síntese do peptídeo linear protegido VTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF-NH2 (CGRP8-37) foi realizada por SPPS manual como explicado acima. A síntese começou com resina NovaSyn®TGR R (carga 0,18 mmol/g) em uma escala de 0,18 mmol (1 g de resina). Uma pequena porção do peptídeo CGRP8-37 completo em resina (100 mg) foi clivada, filtrada e lavada com 2 mL da solução de clivagem e o solvente foi removido sob uma corrente de nitrogênio. O peptídeo bruto foi submetido a purificação por RP-HPLC provendo CGRP8-37 como um sólido branco amorfo em um rendimento de 7 mg. O composto foi confirmado como tendo o peso molecular correto por análise de ESI-MS. m/z (monoisotópica) calculada; C139H230N44O38 [M + 2H]2+ 1563,83, [M+ 3H]3+ 1042,89, [M + 4H]4+ 782,42, [M + 5H]5+ 626,14; observada: [M + 2H]2+ 1563,85, [M+ 3H]3+ 1043,00, [M + 4H]4+ 782,55, [M + 5H]5+ 626,30.
[00216] Uma porção do peptídeo CGRP8-37 completo em resina (100 mg; 0,018 mmol presumido para 100 mg de resina ligada a peptídeo) foi sequencialmente desprotegida e acoplada com N-Fmoc-Peg12-ácido, e Fmoc- Asp(OColestanol)-OH, respectivamente. O composto ligado a resina foi então tratado com anidrido acético (3 mol eq.) em DMF ativada com DIPEA (6 mol eq.) durante 20 min. O composto foi então clivado usando 2 mL de uma mistura de TFA/TES/H2O (95:2,5:2,5) durante 3 h em que os grupos protetores foram removidos simultaneamente. O composto bruto foi tomado em água milli-Q e submetido a purificação por RP-HPLC provendo o Composto 4 como um pó amorfo branco em um rendimento de 1,3 mg. O composto foi confirmado como tendo o peso molecular correto por análise de ESI-MS.
[00217] Composto 4, m/z (monoisotópica) calculada: C199H336N46O55 [M+ 3H]3+ 1418,84, [M + 4H]4+ 1064,38, [M + 5H]5+ 851,71, [M+ 6H]6+ 709,92; observada: [M+ 3H]3+ 1418,85, [M + 4H]4+ 1064,45, [M + 5H]5+851,80, [M+ 6H]6+ 710,05.
[00218] A Transferência de Energia por Ressonância de Bioluminescência (BRET) foi utilizada para avaliar quantitativamente a proximidade do NK1R aos principais reguladores do tráfego de GPCR (βarrs) e proteínas residentes de plasma (KRas) e membranas endossomais precoces (Rab5a) em células HEK293 (Fig. 1A). A substância P (SP, 1, 10 nM) estimulou BRET entre NK1R-RLuc8 e βarr1-YFP e βarr2-YFP (Fig. 1B, C). A SP diminuiu a BRET de NK1R-RLuc8/KRas-Venus e ao mesmo tempo aumentou a BRET de NK1R-RLuc8/Rab5a-Venus (Fig. 1D), consistente com endocitose de NK1R. A endocitose foi dependente de dinamina e clatrina, porque o inibidor de dinamina Dyngo 4a (Dy4), o inibidor de clatrina PitStop 2 (PS2) e a expressão de dinamina K44E dominante negativa bloquearam a diminuição de BRET de NK1R-RLuc8/KRas-Venus e o aumento de BRET de NK1R-RLuc8/Rab5a-Venus (Fig. 1E, F). Dy4 inativa (Dy4 inat), PS2 inativo (PS2 inat) e dinamina de tipo selvagem (WT) não tiveram efeito. A dinamina K44E aumentou a BRET de NK1R-RLuc8/βarr1-YFP e βarr2-YFP, sugerindo que a endocitose inicia a dissociação de NK1R/βarr.
[00219] O NK1R foi localizado pelo estudo do tráfego de Alexa568-SP em células HEK-NK1R. Nas células tratadas com veículo (Veh), Alexa568-SP ligou-se ao receptor da membrana plasmática a 4°C e foi completamente redistribuída aos endossomas após 30 min a 37°C. Dy4 e PS2, mas não controles inativos, causaram retenção de Alexa568-SP em vesículas próximas à membrana plasmática (dados não mostrados). Dessa forma, a SP promove associação de NK1R a βarrs, e induz endocitose dependente de clatrina e dinamina do NK1R.
[00220] Para estudar a ligação entre tráfego e sinalização por NK1R, os biossensores de NK1R e Transferência de Energia por Ressonância de Forster (FRET) alvejados para detectar ERK ativada no citosol (CytoEKAR) ou núcleo (NucEKAR, Fig. 2A), PKC ativada na membrana plasmática (pmCKAR) ou no citosol (CytoCKAR, Fig. 2C) e cAMP na membrana plasmática (pmEpac2) ou no citosol (CytoEpac2, Fig. 2E) foram expressos em células HEK293. A SP (1 nM) ativou a ERK citosólica de modo rápido e transitório (não mostrado) e causou uma ativação retardada e prolongada de ERK nuclear (Fig. 2B). A SP não afetou a atividade da PKC na membrana plasmática (não mostrada), mas causou um aumento rápido e prolongado na atividade da PKC citosólica (Fig. 2D). A SP aumentou de modo transitório o cAMP da membrana plasmática (não mostrado) e causou um aumento prolongado no cAMP citosólico (Fig. 2F). PS2 e Dy4, mas não controles inativos, aboliram a estimulação SP de ERK nuclear (Fig. 2B), PKC citosólica (Fig. 2D) e cAMP citosólico (Fig. 2F). PS2 e o Dy4 não suprimiram a ativação da SP da ERC citosólica ou do cAMP da membrana plasmática, mas fizeram com que ambas as respostas se tornassem prolongadas. PS2 e Dy4 amplificaram a atividade da PKC na membrana plasmática. A dinamina WT amplificou a ativação de SP da ERK nuclear, enquanto a dinamina K44E aboliu a ativação da ERK nuclear (Fig. 2G). A dinamina K44E não bloqueou a ativação da ERK citosólica, mas fez com que a resposta se tornasse prolongada. O siRNA da dinamina e da clatrina inibiu a expressão e evitou a ativação da SP da ERK nuclear (Fig. 2H). Assim, a endocitose de NK1R dependente de clatrina e dinamina é necessária para a ativação de ERK nuclear, que também depende de βarrs e da ativação de PKC e cAMP citosólicos.
[00221] Uma vez que a sinalização por PKC e cAMP através de GPCRs depende de proteínas G heterotriméricas, foi examinada a capacidade da SP de ativar proteínas G em endossomas de células HEK293. A BRET foi usada para determinar a proximidade do NK1R e Gαq a Rab5a e GY2. A SP (0,1-10 nM) diminuiu a BRET de NK1R-RLuc8/KRas-Venus, que espelhou o aumento na BRET de NK1R-RLuc8/Rab5a-Venus (Fig. 3A, B). A SP diminuiu a BRET de Gαq-RLuc8/GY2-Venus, que foi mantida durante 15 min (Fig. 3C), e aumentou a BRET de Gαq-RLuc8/Rab5a-Venus aos 15 min (Fig. 3D). Microscopia de imunofluorescência e de super-resolução foram usadas para determinar se Gαq colocalizava com o NK1R na membrana plasmática ou em endossomas de células HEK-NK1R. Após incubação com SP (10 nM) a 4°C, a imunorreatividade de NK1R (NK1R-IR) e Gαq-IR foram colocalizados na membrana plasmática. Após lavagem e aquecimento a 37°C durante 15 min, NK1R-IR e Gαq-IR foram colocalizados com antígeno endossomal precoce 1 (EEA1) (dados não mostrados). Dessa forma, a SP ativa esse complexo de proteína G por sua dissociação e recruta Gαq para endossomas.
[00222] O inibidor de Gαq UBO-QIC evitou a ativação de SP de ERK nuclear (Fig. 3E), que também depende de βarrs e PKC e é independente de transativação do receptor do fator de crescimento epidérmico. UBO-QIC, o inibidor de PLC U73122 e o quelante de Ca2+ EGTA evitou a ativação da PKC citosólica (Fig. 3F), consistente com a ativação da via de Gαq, PLC e PKC dependente de Ca2+. UBO-QIC, o inibidor de PKC GF109203X e EGTA, mas não o inibidor de Gαs NF449, evitou a geração de SP de cAMP citosólico (Fig. 3G), que implica a ativação mediada por Gαq de PKC dependente de Ca2+ na geração de cAMP. UBO-QIC não afetam a endocitose de NK1R. Esses resultados sugerem que NK1R ativado e Gαq translocam para endossomas, onde Gαq gera ERK nuclear e PKC citosólica e cAMP.
[00223] Estímulos dolorosos e pró-inflamatórios, incluindo a capsaicina (agonista do receptor de potencial transitório vaniloide 1), desencadeiam a liberação de SP de nociceptores sensoriais primários nas lâminas I, II do corno dorsal, onde a SP estimula a endocitose de NK1R em neurônios espinhais10,11. A SP causa excitação dependente de NK1R de neurônios espinhais20. Para avaliar se a sinalização endossomal de NK1R medeia essa ativação prolongada, os registros de clampeamento de voltagem ligados a células foram produzidos a partir de neurônios positivos para NK1R na lâmina I do corno dorsal em fatias de medula espinhal de rato. A SP (1 μM, 5 min) estimulou a endocitose de NK1R, que foi impedida por Dy4 (Fig. 4A). A SP (1 μM, 2 min) desencadeou um disparo rápido de potenciais de ação que foi mantido após a lavagem (Fig. 4B, C, D). Dy4, mas não Dy4 inativa, não afetou a excitação inicial, mas evitou a descarga do potencial de ação prolongada que persistiu após a remoção da SP (Fig. 6B, C, D) e inibiu a endocitose de NK1R. Esses achados apoiam um papel para a endocitose de NK1R na excitação neuronal persistente.
[00224] A Dy4 não afetou a transmissão sináptica aferente glutaminérgica primária ou a redução sináptica em fatias de medula espinhal de rato (não mostrada). PS2 e Dy4 não afetaram a liberação de SP-IR e CGRP-IR basal ou estimulada pela capsaicina de segmentos da medula espinhal dorsal do camundongo.
[00225] Para determinar o envolvimento de dinamina e clatrina na endocitose de NK1R in vivo, ratos Sprague-Dawley (machos, 3 a 8 semanas) foram injetados por via intratecal (L3/L4) com veículo (Veh), Dy4, Dy4 inativa, PS2 ou PS2 inativa. Injeções intraplantares de veículo ou capsaicina foram feitas após 30 min na pata traseira esquerda. A medula espinhal foi coletada 10 minutos depois para localização do NK1R. Nos controles (veículo intratecal, intraplantar), NK1R-IR estava principalmente na membrana plasmática do soma e neuritos de neurônios da lâmina I (80,7±1,6% de NK1R- IR total dentro de 0,5 μm da membrana plasmática do soma). A capsaicina estimulou a endocitose de NK1R (42,1±5,6% NK1R-IR na membrana plasmática, P<0,001 para controle; Fig. 4A). Dy4 ou PS2, mas não Dy4 inativa ou PS2 inativa, inibiu a endocitose de NK1R estimulada por capsaicina (% na membrana: Dy4 59,6±0,2, Dy4 inativa 49,9±0,8, P<0,001; PS269,0±1,1, PS2 inativa 51,9±1,3, P<0,05; Fig. 4A).
[00226] Estímulos periféricos dolorosos ativam a ERK em neurônios espinhais que expressam NK1R, o que coincide com a endocitose do receptor e contribui para a hiperalgesia. Capsaicina intraplantar estimulou a fosforilação de ERK em neurônios do corno dorsal da lâmina I (Fig. 5B). Dy4 ou PS2, mas não os análogos inativos, impediu a ativação evocada por capsaicina de ERK espinhal. Assim, a capsaicina estimula a endocitose de NK1R dependente de clatrina e dinamina e a ativação de ERK em neurônios espinhais in vivo.
[00227] Para avaliar a importância de NK1R, clatrina e dinamina, camundongos (C57BL/6, machos, 6 a 10 semanas) foram injetados por via intratecal (L3/L4) com veículo, antagonista de NK1R SR140,333, Dy4, Dy4 inativa, PS2 ou PS2 inativa. Após 30 min, injeções intraplantares de veículo ou capsaicina foram feitas na pata traseira esquerda. A hiperalgesia mecânica foi medida por estimulação da superfície plantar das patas esquerda e direita com filamentos de von Frey, e o edema inflamatório foi avaliado pela medição da espessura da pata esquerda com paquímetro. Em camundongos tratados com veículo (intratecal), a capsaicina causou hiperalgesia mecânica e edema da pata esquerda. SR140,333, Dy4 e PS2, mas não Dy4 inativa e PS2 inativa, inibiram a hiperalgesia (Fig. 6A, B). O edema não foi afetado, confirmando sua ação local na medula espinhal (Fig. 6C). Dy4 e PS2 não afetaram as respostas de retirada da pata da pata traseira direita não injetada ou latência do rotarod, sugerindo comportamento motor normal (Fig. 5D) Injeção intratecal de siRNA de dinamina-1 reduziu os níveis de dinamina-1 espinhal e inibiu a hiperalgesia evocada pela capsaicina em 24 h e 48 h (Fig. 6E, F). O siRNA de βarr1+2 intratecal reduziu os níveis espinhais de βarr1 e 2 e também inibiu a hiperalgesia evocada pela capsaicina às 36 h (Fig. 5G-H). Os siRNAs não afetaram as respostas de retirada da pata da pata traseira direita não injetada (não mostrada). O inibidor da MEK intratecal U0126 inibiu a hiperalgesia evocada pela capsaicina (Fig. 6I). SM-19712 intratecal, um inibidor da enzima conversora de endotelina-1 que previne a reciclagem e a ressensibilização de NK1R, não teve efeito na hiperalgesia, sugerindo que a ação analgésica dos inibidores endocíticos não se deve à ressensibilização inibida. Dy4 intratecal e PS2 inibiram ambas as fases do comportamento nocifensivo em camundongos evocado por injeção intraplantar de formalina (Fig. 6J, K). Injeção intraplantar de adjuvante completo de Freund (CFA) causou hiperalgesia mecânica prolongada em camundongos, que foi parcialmente revertida por Dy4 intratecal e PS2 em 1 a 5 h (Fig. 6L). A capsaicina intraplantar, a formalina e o CFA provocaram a endocitose de NK1R em neurônios do corno dorsal do camundongo, que foi inibido por Dy4 intratecal (dados não mostrados).
[00228] Esses resultados são consistentes com a hipótese de que a endocitose de NK1R e a ativação de ERK resultante contribuem para a hiperalgesia, uma vez que os inibidores de dinamina, clatrina, βarr e MEK eram analgésicos. As ações analgésicas dos inibidores endocíticos são improváveis devido à liberação do neuropeptídeo interrompida, transmissão sináptica ou coordenação motora, que não foram afetadas.
[00229] O achado de que o NK1R endossomal gera sinais compartimentalizados subjacentes à ativação neuronal e hiperalgesia prolongada sugeriu que o antagonismo do NK1R nos endossomas pode prover um tratamento eficaz para a dor. Para explorar a utilidade dessa abordagem, foi sintetizada uma sonda tripartida compreendendo o colestanol lipídico ou etil éster (controle, sem ancoragem à membrana), um ligante polietileno glicol e o corante fluorescente Cianina 5 (Cy5), além dos compostos da invenção. Após a incubação com células HEK293, Cy5-colestanol foi inserido na membrana plasmática por 5 min e detectado em endossomas por 30 a 60 min, momento em que > 50% da sonda foi internalizada, enquanto o Cy5-etil éster permaneceu no fluido extracelular (Fig. 7B). Após 4 h, o Cy5-colestanol redistribuiu a partir da membrana plasmática para endossomas iniciais positivos para Rab5a contendo NK1R-GFP.
[00230] FRET foi usada para avaliar quantitativamente a capacidade de uma sonda tripartida para atingir o NK1R em endossomas. NK1R com SnapTag N-terminal extracelular foi expresso em células HEK293 e NK1R de superfície celular foi marcado com substrato fluorescente fotoestável SNAP-Surface™ 549 não permeante à membrana. SP (10 nM, 30 min) evocou a translocação de todos os SNAP-549 detectáveis para endossomas. FRET de SNAP-549-NK1R e Cy5-colestanol foi detectada dentro de 5 min após a adição de Cy5-colestanol, e aumentada durante >75 min (dados não mostrados). A análise da origem subcelular da FRET confirmou que > 75% do sinal era intracelular, consistente com a associação da sonda ao NK1R endossomal.
[00231] O Composto 1 antagonizou a sinalização por Ca2+ estimulada por SP (3 nM, EC80) em células HEK-NK1R (pIC50 espantida I: 8,23±0,21; Composto 1: 8,44±0,29) e assim retém atividade antagonista. Uma vez que a sonda tripartida foi esgotada da membrana plasmática e redistribuída para endossomas após 4 h, a capacidade do Composto 1 e da espantida de influenciar a sinalização endossomal de NK1R foi comparada 4 h após pré- incubação com HEK293.
[00232] Quando as células foram pré-incubadas com o Composto 1, espantida ou SR140333 durante 30 min e depois imediatamente desafiadas com SP, todos os antagonistas bloquearam a ativação da ERK nuclear e citosólica (Fig. 7C), indicando antagonismo eficaz do NK1R de superfície celular. Em contraste, quando as células foram incubadas por pulsos com antagonistas por 30 min, lavadas e depois estimuladas com SP 4 h mais tarde, o Composto 1 sozinho inibiu a ERK nuclear e nenhum dos antagonistas inibiu a ERK citosólica. O Composto 1 não afetou a ativação induzida por isoprenalina da ERK nuclear, que é mediada pelo receptor adrenérgico β2 endógeno (não mostrado). Assim, a conjugação ao colestanol dispensa sondas a endossomas precoces positivos para NK1R e após incubação por pulsos o Composto 1 causa antagonismo prolongado e seletivo do NK1R endossomal de superfície não celular.
[00233] Em seguida, fatias de medula espinhal de rato foram incubadas com o Composto 1 ou espantida para avaliar se o antagonismo do NK1R endossomal bloqueia a excitação induzida por SP prolongada de neurônios espinhais. Após a incubação por 60 min, as fatias da medula espinhal foram lavadas, incubadas em meio livre de antagonistas por 60 min e, em seguida, desafiadas com SP. Em fatias pré-tratadas com veículo ou com espantida, a SP causou alta descarga de potencial de ação que foi prolongada após a remoção da SP (Fig. 8A-C). O Composto 1 não suprimiu a excitação inicial, mas impediu a descarga do potencial de ação que foi prolongada após a remoção do SP. Assim, um antagonista de NK1R alvejado por endossomas e ancorado à membrana efetivamente bloqueia a ativação de neurônios espinhais induzida por SP e provoca analgesia de longa duração.
[00234] Para avaliar se o antagonismo do NK1R endossomal bloqueia a nocicepção, foram feitas injeções intratecais de Cy5-colestanol, espantida ou Composto 1 a camundongos. Após 3 horas, a capsaicina foi injetada na pata. O Composto 1, mas não espantida ou Cy5-colestanol, inibiu marcadamente a hiperalgesia evocada por capsaicina durante > 120 min (Fig. 8D). Quando administrada 30 min após a capsaicina, a espantida intratecal teve um efeito analgésico pequeno e transitório (1 h), enquanto o Composto 1 causou uma analgesia retardada (3 h), persistente (> 6 h) e substancial (> 50% de inibição) (Fig. 8E). O Cy5-colestanol foi detectado nos neurônios das lâminas I-III após 6 h, sugerindo uma dispensação efetiva da sonda (não mostrado). Quando injetado por via intratecal 3 h antes da formalina intraplantar, o Composto 1 inibiu marcadamente ambas as fases do comportamento nocifensivo com maior eficácia do que a espantida ou SR140333 (Fig. 8F, G). Quando injetado por via intratecal 36 h após CFA intraplantar, o Composto 1 foi analgésico após 4 h, e a analgesia foi prolongada por > 6 h, enquanto as ações analgésicas de SR140333 e espantida foram menores e transitórias (Fig. 8H, I).
[00235] Para avaliar a utilidade geral do alvejamento endossomal, o antagonista de NK1R de molécula pequena L733-0660 foi conjugado a colestanol através de um ligante de polietilenoglicol (Composto 2). Quando injetado por via intratecal 3 h antes da capsaicina intraplantar, o Composto 2 mostrou analgesia prolongada por > 4h, enquanto o efeito de L-733.060 foi pequeno e transitório (Fig. 8J).
[00236] Assim, um antagonista de NK1R alvejado por endossomas e ancorado à membrana efetivamente bloqueia a ativação de neurônios espinhais induzida por SP e provoca analgesia de longa duração. Embora a espantida e o Composto 1 fossem similarmente estáveis no CSF humano por > 4h, após a injeção intratecal ao camundongo, a espantida foi extensivamente metabolizada, enquanto o Composto 1 foi estável (não mostrado). Alvejamento e retenção endossomal podem contribuir para a estabilidade in vivo de espantida-colestanol.
[00237] O CGRP e a SP podem ser coliberados a partir dos neurônios sensoriais primários para evocar a dor e a inflamação neurogênica. Em vista do fato de que o CGRP demonstrou estimular a endocitose dependente de βarr do CLR, foi conduzida uma investigação sobre se o CLR sinaliza a partir dos endossomas. Verificou-se que o CGRP (1 nM) diminui a BRET de CLR- RLuc8/KRas-Venus e aumenta a BRET de CLR-RLuc8/Rab5a-Venus (não mostrado), consistente com a endocitose de CLR. PS2 e dinaminK44E inibiram esses efeitos. O CGRP estimulou a ERK nuclear e citosólica. Dy4 e dinaminK44E impediram a ativação da ERK nuclear, mas não da citosólica.Verificou-se que o Composto 4, compreendendo o antagonista de CLR CGRP8-37, antagonizava eficazmente a sinalização por Ca2+ estimulada por CGRP em células HEK-CLR/RAMP1. Após pré-incubação com células HEK293 durante 30 min, tanto CGRP8-37 quanto Composto 4 inibiram a ativação estimulada por CGRP de ERK nuclear e citosólica (dados não mostrados). Quando as células foram incubadas por pulsos com antagonistas por 30 min, lavadas e depois estimuladas com CGRP 4 h mais tarde, o Composto 4 sozinho inibiu fortemente a ERK nuclear e nenhum antagonista inibiu fortemente a ERK citosólica.
[00238] Quando injetado por via intratecal a camundongos, o Composto 4 e o antagonista de CLR de molécula pequena olcegepant inibiram de modo semelhante a hiperalgesia mecânica evocada por capsaicina e ambas as fases de comportamento nocifensivo evocado por formalina mais completamente do que CGRP8-37 (Figura 9). Os tratamentos não afetaram a retirada da pata da pata não injetada (Fig. 9B). O Composto 4, mas não CGRP8-37, reverteu a hiperalgesia induzida por CFA (Fig. 9E). O Composto 4 também inibiu o comportamento nocifensivo evocado por formalina (Fig. 9C, D).
[00239] Esses resultados sugerem que a sinalização por CLR endossomal controla a excitabilidade dos neurônios espinhais e a transmissão da dor.
[00240] GR73632 [Ava-Phe-Phe-Pro-N-MeLeu-Met-NH2] é um agonista do receptor da neurocinina 1 que não é suscetível à clivagem pela enzima conversora da endotelina 1 (Hagan R.M. et al., Neuropeptides 1991, 19, 127-35). O GR73632 foi conjugado a colestanol (Composto 3) ou etil éster (GR73632-etil éster) por meio de um ligante de PEG flexível. O efeito desses compostos em células HEK293 que expressam NK1R foi então estudado.
[00241] Os ensaios de mobilização de cálcio revelaram uma diminuição aproximada de 100 vezes na potência do GR73632-etil éster (logEC50 = -7,28) e do Composto 3 (logEC50 = -6,80) em comparação ao agonista livre (logEC50 = -9,03). Os ensaios de transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET) mostram que o Composto 3, em comparação com GR73632, não induz o recrutamento de βarrs. Esses dados sugerem que o Composto 3 desvia o receptor de neurocinina 1 da membrana plasmática.
[00242] Os ensaios de transferência de energia por ressonância de Forster (FRET) foram realizados usando biossensores do repórter da atividade de quinase regulada extracelularmente (EKAR) direcionados para o citosol e o núcleo para a delineação espaço-temporal da ativação da quinase relacionada ao sinal extracelular (ERK) (Harvey C.D. et al, PNAS 2008, 105, 19264-9). Dados preliminares em ensaios FRET com imagens durante 20 minutos mostraram que o agonista livre de GR73632 estimulou a fosforilação de ERK citosólica e nuclear prolongada enquanto nenhuma fosforilação de ERK foi observada em resposta ao GR73632-etil éster. O Composto 3 estimula a fosforilação de ERK nuclear prolongada, mas não de ERK citosólica.
[00243] Esses resultados indicam que o Composto 3 é um agonista seletivo do NK1R endossomal.
[00244] O éster AlexaFluor568 NHS (Invitrogen, Carlsbad, CA; 6,3 μmol) foi incubado com SP (1,48 μmol) e trietilamina (2,9 μmol) em DMF (500 μl) (15 h, temperatura ambiente, TA). Alexa568-SP foi purificado por HPLC de fase reversa. O produto foi confirmado por espectrometria de massa: m/z 1012,8, calc para C96H127N19O24S3[M + 2H+] m/z 1012,9.
[00245] Sondas BRET NK1R-RLuc8, KRas-Venus, Rab5a-Venus, βarrl-YFP, βarr2-YFP, Gαq-RLuc8 e GY2-Venus foram descritas (Kocan, M., et al., Frontiers in Endocrinology, 2010, 1, 12; Lan, T. H., et al., Traffic, 2012, 13, 1450-1456). CytoEKAR e NucEKAR e CytoCKAR e pmCKAR eram da Addgene (plasmídeos 18680, 18681, 14870, 14862, respectivamente). CytoEpac2-camps era de M Lohse (Universidade de Wurzburg) e pmEpac2-camps era de D Cooper (Universidade de Cambridge). GFP-dinamina e GFP-dinamina K44E foram descritas (Schmidlin, F. et al., J. Biol Chem, 2001, 276, 25427-25437). NK1R humano com Snap-Tag® N- terminal extracelular era da Cisbio. HA-NK1R de ratos de comprimento total e truncado δ312 foram descritos (Dery, O., Defea, K. A. & Bunnett, N. W., American Journal of Physiology, 2001, 280, C1097-1106). Fusões RLuc8 dessas construções foram geradas por remoção do códon de parada por PCR e subclonagem em um vetor pcDNA3.1-RLuc8. HA-CLR e Myc-RAMP1 foram descritos (Cottrell, G. S. et al., J Biol. Chem., 2007, 282, 12260-12271). CLR-RLuc era de M. Bouvier (Université de Montreal).
[00246] As células HEK293 que expressam estavelmente NK1R de rato com epítopo HA11 N-terminal foram descritas (Roosterman, D. et al. P.N.A.S., 2007, 104, 11838-11843). As células HEK293 foram transfectadas transitoriamente usando polietilenimina (Polysciences) ou FuGene (Promega). As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 5% de FBS (37°C, 5% de CO2).
[00247] As células HEK293 foram transfectadas com os cDNAs seguintes: 1 μg de NK1R-RLuc8 ou 1 μg de CLR-RLuc8 + 1 μg de Myc- RAMP1 + 4 μg de KRas-Venus, 4 μg de Rab5a-Venus, 4 μg de βarrl-YFP, ou 4 μg de βarr2-YFP; ou 1 μg de NK1R + 0,5 μg de Gαq-RLuc8 + 1 μg de Gβi + 4 μg de GY2-Venus; ou 1 μg de NKiR + 0,5 μg de Gαq-RLuc8 + 1 μg de Gβ1 + 1 μg de GY2 + 4 μg de Rab5a-Venus. Após 48 h, as células foram equilibradas em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) a 37°C e incubadas com o substrato RLuc coelenterazina h (5, 15 min). As razões de BRET foram determinadas usando um leitor de microplacas LUMIstar Omega (BMG LabTech) antes e depois do desafio com SP (0,1-10 nM) ou veículo (dH2O).
[00248] As células HEK293 foram transfectadas com 55 ng/poço de NK1R de rato com marcador de epítopo HA.11 N-terminal (HA-NK1R) ou CLR mais RAMP1 e 40 ng/poço de biossensores FRET. A FRET foi avaliada 48 h após a transfecção, após restrição do soro (0,5% de FBS durante a noite). Para experimentos que usam clatrina ou siRNA de dinamina, as células foram transfectadas com 55 ng/poço de HA-NK1R de rato, 40 ng/poço de biossensor FRET e 25 nM/poço de siRNA de clatrina ou dinamina ON-TARGETplus SMARTpool bem misturado (GE Dharmacon). A FRET foi avaliada 72 h após a transfecção, após restrição do soro (0,5% de FBS durante a noite). As células foram equilibradas em HBSS a 37°C e a FRET foi analisada usando um analisador GE Healthcare INCell 2000. Para análise da razão de emissão de GFP/RFP, as células foram excitadas sequencialmente usando um filtro FITC (490/20) com emissão medida usando filtros dsRed (605/52) e FITC (525/36), e um filtro policroico otimizado para o par de filtros FITC/dsRed (Quad4). Para análise da razão de emissão de CFP/YFP, as células foram excitadas sequencialmente usando um filtro CFP (430/24) com emissão medida usando filtros YFP (535/30) e CFP (470/24), e um filtro policroico otimizado para o par de filtros CFP/YFP (Quad3). Foram formadas imagens das células a cada 1 min, permitindo a captura de imagens de 14 poços por minuto. Imagens de razão de emissão de linha de base foram capturadas por 4 min. As células foram desafiadas com uma concentração EC50 de SP (1 nM), GGRP (1 nM) ou veículo, e as imagens foram capturadas por 20 min. As células foram então estimuladas com o controle positivo (200 nM de forbol 12,13-dibutirato para ERK; 200 nM de forbol 12,13-dibutirato com coquetel inibidor de fosfatase para PKC; 10 μM de forscolina, 100 μM de 3-isobutil-1- metilxantina, 100 nM de PGE1 para cAMP) por 10 min para gerar um aumento máximo, e as imagens de razão de emissão positiva foram capturadas por 4 min. Os dados foram analisados conforme descrito e expressos como razões de emissão relativos à linha de base para cada célula (F/F0). Células com > 10% de mudança em F/F0 após estimulação com controles positivos foram selecionadas para análise.
[00249] As células HEK293 foram transfectadas com 50 ng/poço de NK1R com Snap-Tag® N-terminal extracelular. Após 48 h, o NK1R de superfície celular foi marcado com substrato fluorescente fotoestável SNAPSurface™ 549 (New England Biolabs) (1 μM, 30 min, 37°C em DMEM, 0,5% de BSA). As células foram lavadas, recuperadas em DMEM por 30 min e estimuladas com SP (10 nM, 30 min, 37°C) para induzir a endocitose de NK1R. As células foram incubadas com Cy5-colestanol (200 nM, 37°C). A FRET de emissão sensibilizada por SNAP-549/Cy5 foi analisada por microscopia confocal usando excitação sequencial com lasers de argônio (514 nm)/HeNe (633 nm) e emissão a 570-620 nm (doador SNAP-549) e 670-750 nm (aceptor Cy5 FRET e Cy5) antes e depois da adição de Cy5-colestanol. Os controles incluíam células HEK293 não transfectadas (apenas aceptor) e células HEK293 não tratadas com Cy5-colestanol (apenas doador). FRET foi analisada conforme descrito e expressa como razões de emissão relativas aos controles (F/F0).
[00250] [Ca2+]i foi medido conforme descrito (Jensen, D. D. et al., J Biol Chem, 2014, 289, 20283-20294). As células HEK293 que expressam transitoriamente HA-NK1R ou HA-CLR/Myc-RAMP1 foram carregadas com Fura2-AM (2 μM). Para comparar a capacidade antagonística de espantida, Composto 1, L-733,060, Composto 2, CGRP8-37 , ou Composto 4, as células foram pré-incubadas por 30 min com antagonistas, e foram então desafiadas com SP (3 nM, EC80) ou CGRP (10 nM, EC80).
[00251] As células HEK293 transfectadas transitoriamente com HA- NK1R ou HA-NK1Rδ312 foram fixadas em PFA (30 min). Para análise da expressão total, as células foram permeabilizadas usando 0,5% de NP-40 em TBS (30 min) após fixação. As células foram incubadas em tampão de bloqueio (1% de leite em pó desnatado, NaHCO3 0,1 M, 4 h, TA) e depois anti-HA (1: 5.000, Sigma. Durante a noite, 4°C). As células foram lavadas e incubadas com anticorpo anti-camundongo conjugado com peroxidase de rábano (1:2.000, 2 h, TA). As células foram lavadas e coradas usando o substrato SIGMAFAST OPD (SigmaAldrich). A absorbância a 490 nm foi medida usando um leitor de placas EnVision (PerkinElmer Life Sciences). Os valores foram normalizados para células HEK293 transfectadas com pcDNA3 ou para células não tratadas.
[00252] As células HEK-NK1R foram plaqueadas em lâminas ou lamelas de vidro revestidas com poli-D-lisina e cultivadas durante 48 h. Para examinar a captação de SP fluorescente, as células foram incubadas em HBSS com Alexa568-SP (100 nM, 20 min, 4°C), lavadas, incubadas durante 30 min a 37°C e fixadas em 4% de paraformaldeído, 100 mM de PBS pH. 7,4 (PFA, 20 min, 4°C). As células foram examinadas por microscopia confocal. Para examinar o tráfego de NK1R e Gαq, as células foram incubadas em HBSS com SP (100 nM, 15 min) ou veículo e fixadas. As células foram bloqueadas em PBS, 0,2% de saponina, 3% de soro de cabra normal (1 h, TA). As células foram incubadas em anticorpos primários: anti-HA de rato (1:1.000; Roche), anti-Gαq de coelho (1:2.000, C-19; Santa Cruz Biotechnology), anti-EEA1 de camundongo (1:100, 610457; BD Biosciences) (durante a noite, 4°C). As células foram lavadas e incubadas com Alexa488 anti-rato de burro (1:500), Alexa568 anti-coelho de burro (1:1000) e Alexa647 anti-rato de burro (1:1000) (Life Technologies ou Jackson ImmunoResearch) (1 h, TA). As células foram examinadas por microscopia de super-resolução.
[00253] As células HEK293 foram plaqueadas em lamelas de vidro revestidas com poli-D-lisina. As células foram infectadas com CellLight® Rab5a-RFP (Life Technologies) ou foram transfectadas com NK1R-GFP de rato. Após 24 h, as células foram equilibradas em HBSS, visualizadas a 37°C por microscopia confocal, e incubadas com Cy5-colestanol ou Cy5-etil éster (1,5 μM). As células que expressam NK1R-GFP foram incubadas com SP (10 nM).
[00254] Os Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais aprovaram todos os estudos. Os ratos (Sprague-Dawley, machos, 3 a 8 semanas) e camundongos (C57BL/6, machos, 6 a 10 semanas) eram da Plataforma de Pesquisa Animal Monash, do Centro de Recursos Animais, da Austrália Ocidental e dos Laboratórios Harlan. Os animais foram mantidos em um ambiente de temperatura controlada com um ciclo claro/escuro de 12 horas e livre acesso a comida e água. Os animais foram mortos por overdose anestésica e toracotomia.
[00255] Fatias parassagitais (340 a 400 μm) foram preparadas usando um vibratomo da região lombar da medula espinhal de rato em líquido cefalorraquidiano artificial à base de sacarose gelado (sACSF) (mM: 100 sacarose, 63 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH2PO4, 1,2 MgCl2, 25 glicose, 25 NaHCO3; 95% O2/5% CO2). As fatias foram transferidas para ACSF de recuperação à base de N-Metil-D-Glucamina (NMDG) (rACSF) (mM: 93 NMDG, 93 HCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glicose, 5 ascorbato de Na, 2 tioureia, 3 piruvato de Na, 10 MgSO4, 0,5 CaCl2; 95% O2/5% CO2, 15 min, 34°C). As fatias foram transferidas para ACSF normal (mM: 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,2 MgCl2, 2,5 CaCl2, 25 glicose, 11 NaHCO3; 95% O2/5% CO2) contendo 10 μM MK-801 (45 min, 34°C), depois mantidas à TA.
[00256] Fatias de medula espinhal de rato foram transferidas para uma câmara de registro e superfundidas com ACSF normal (2 ml.min-1, 36°C). Óptica de contraste Dodt foi usada para identificar neurônios positivos para NK1R putativos (capacitância < 20 pF) na lâmina I com base em sua posição, tamanho e formato fusiforme com dendritos restritos à lâmina I. As fatias foram pré-incubadas com Dy4 ou Dy4 inativa (ambas 30 μM, DMSO a 0,03%) durante 10 min antes de registrar, ou foram pré-incubadas com Composto 1, espantida, Composto 4 ou CGRP8-37 (todos 1 μM em DMSO a 0,01%) durante 60 min, lavados e incubados em ACSF sem antagonista por mais 60 minutos antes de registrar. PS2 não era solúvel nas baixas concentrações de DMSO requeridas para eletrofisiologia. Os neurônios da lâmina I nociceptivos presumidos positivos para NK1R grandes foram visualmente identificados conforme descrito (Imlach, W. L., et al., Molecular Pharmacology, 2015, 88, 460-428). Correntes espontâneas foram registradas na configuração anexada à célula (Multiclamp 700B, Molecular Devices, Sunnyvale, CA), amostradas a 10 kHz, filtradas em alta passagem a 1 Hz, e eventos potenciais de ação capacitivamente acoplados foram analisados usando Axograph X, V 1.4.4 (Axograph). Eletrodos adesivos (resistência 2,53,5 MQ) continham solução interna à base de KMES (mM: 105 KMES, 20 NaCl, 5 HEPES, 10 BAPTA, 1,5 MgCl2, 4 MgATP, 0,4 NaGTP, 0,1% biocitina; 285-295 mosmol.l-1) para facilitar registros subsequentes de propriedades de potencial de ação na configuração de célula inteira. Os registros foram feitos na presença de CNQX (6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3- diona)(10 μM; antagonista do receptor de AMPA/cainato), picrotoxina (100 μM; antagonista do receptor GABAA), estricnina (0,5 μM; glicina e antagonista do receptor de acetilcolina), e AP5 (ácido ((2R)-amino-5- fosfonovalérico; (2R)-amino-5- fosfonopentanoato) (100 mM; antagonista do receptor de NMDA) para minimizar as influências pré-sinápticas nas propriedades do potencial de ação. As fatias foram desafiadas por superfusão com SP ou CGRP (1 μM) por 2 min. As fatias estimuladas com CGRP foram desafiadas com SP no final do experimento para confirmar a coexpressão de receptores de CGRP e SP. Os registros foram amostrados a 10 kHz e filtrados com um filtro passa-alta a 1 Hz e a taxa de disparo foi medida em intervalos de dois minutos. No final de cada registro anexado à célula, os registros de célula inteira foram feitos no modo de clampeamento de corrente para confirmar a retenção do disparo do potencial de ação normal. Os dados só eram incluídos na análise se as células tivessem amplitudes de potencial de ação que estivessem <50 mV acima do limite para garantir a inclusão de neurônios viáveis. As células foram preenchidas com biocitina e as seções foram processadas para confirmar a expressão de NK1R por imunofluorescência. A taxa de disparo para cada célula foi normalizada para a resposta no ponto de tempo de 2 min, que não foi significativamente diferente entre os grupos. O tempo de disparo foi determinado como a duração da resposta ao último potencial de ação. Para avaliar a transmissão sináptica, os registros de configuração de células inteiras foram feitos sob condições de controle ou após a exposição a Dy4 ou Dy4 inativa; um eletrodo estimulador bipolar foi colocado na zona de entrada da raiz dorsal, e as correntes pós- sinápticas excitatórias eletricamente evocadas registradas como descrito (Imlach, W. L., et al., Molecular Pharmacology, 2015, 88, 460-428). Para avaliar a endocitose de NK1R, fatias da medula espinhal (400 μm) foram incubadas com SP (1 μM, 5 min), fixadas em PFA (4 h, RT), crioprotegidas e processadas para localizar o NK1R.
[00257] Fatias (0,4 mm) da medula espinhal dorsal do camundongo (segmentos cervical, torácico, lombossacral combinados) foram superfundidas (0,4 ml.min-1) com solução de Krebs (mM: NaCl 119, NaHCO3 25, KH2PO4 1,2, MgSO4 1,5, CaCl2 2,5, KCl 4,7, D-glicose 11 mM; 95% CO2/5% O2, 37°C) contendo 0,1% BSA, 1 μM fosforamidona e 1 μM captopril. Os tecidos foram superfundidos com Dy4, PS2, análogos inativos (30 μM) ou veículo (0,3% de DMSO/solução salina) durante 30 min. Os tecidos foram então superfundidos com capsaicina (0,3 μM, 10 min) na presença de inibidores ou controles. Superfusado (10 min de coletas, 4 ml) foi coletado antes, durante e após a estimulação com capsaicina, e analisado para SP-IR e CGRP-IR (Bertin Pharma). Os inibidores endocíticos não interferiram nos imunoensaios. Os limites de detecção dos ensaios foram 2 pg.ml-1 para SP-IR e 5 pg.ml-1 para CGRP-IR. Os resultados são expressos como fmol.g-1.20 min- 1 .
[00258] Dy4, Dy4 inativa, PS2, PS2 inativa (todos 50 μM) ou veículo (1% de DMSO/solução salina) foram injetados por via intratecal (10 μl, L3/L4) em ratos conscientes. Após 30 min, os ratos foram sedados (5% de isoflurano) e capsaicina (12,5 μg) ou veículo (20% de etanol, 10% de Tween 80, 70% de solução salina) foram injetados por via subcutâneamente na superfície plantar de uma pata traseira (25 μl). Após 10 min, os ratos foram submetidos a perfusão transcardíaca com PBS e, em seguida, 4% de PFA. A medula espinhal foi removida, a imersão fixada em PFA (2 h, 4°C) e crioprotegida (30% de sacarose, PBS, 24 h, 4°C). A medula espinhal (T12 a L4) foi embutida em OCT e seções coronais em série de 30 μm foram cortadas em placas de 48 poços contendo PBS. Seções de flutuação livre foram bloqueadas em PBS contendo 10% de soro de cavalo normal (1 h, TA).As seções foram incubadas com anti-NeuN de camundongo (1:20.000; AbCam) e anti-NK1R de coelho (1:5.000, #94168) ou anti-pERK de coelho (1:200; Cell Signaling Technology) em PBS contendo 3% de soro de cavalo normal (48 h, 4°C). As seções foram lavadas (4 x 20 min em PBS) e incubadas com Alexa488 anti-coelho de burro (1:8.000) e Alexa568 anti- camundongo de burro (1:2000 (Life Technologies) (1 h, TA). As seções foram lavadas, incubadas com DAPI (10 μg/ml, 5 min) e montadas em Vectashield (Vector Laboratories).
[00259] Os camundongos foram aclimatados ao aparelho experimental e ao ambiente durante 1 a 2 horas em 2 dias sucessivos antes dos experimentos. A hiperalgesia mecânica foi avaliada por retirada da pata para estimulação da superfície plantar da pata traseira com filamentos graduados de von Frey. No dia anterior ao estudo, os escores de von Frey foram medidos em triplicata para estabelecer uma linha de base para cada animal. Para avaliar o edema da pata, a espessura da pata traseira foi medida usando paquímetros digitais antes e depois dos tratamentos. Para injeções intraplantares, os camundongos foram sedados (5% de isoflurano). A capsaicina (5 μg), adjuvante completo de Freund (CFA, 2 mg/ml) ou veículo (capsaicina, 20% de etanol, 10% de Tween 80, 70% de solução salina; CFA, solução salina) foi injetada subcutaneamente na superfície plantar da pata traseira esquerda (10 μl). Os escores de von Frey (patas esquerda e direita) e a espessura da pata (pata esquerda) foram medidos por 30 a 240 min após a capsaicina e 36 a 40 h após a injeção de CFA. Os resultados são expressos como valores percentuais pré-injetados. Para avaliação do comportamento nocifensivo, os camundongos foram sedados e formalina (4%, 10 μl) foi injetada subcutaneamente na superfície plantar da pata traseira esquerda. Os camundongos foram colocados em um recipiente de Perspex e o comportamento nocifensivo (vacilar, lamber, morder a pata injetada) foi registrado por 60 min. O número total de eventos nocifensivos foi subdividido em fases aguda (I, 0-10 min) e tônica (II, 10-60 min). No final dos experimentos, os camundongos foram submetidos a perfusão transcardíaca com PBS e PFA, e a medula espinhal foi removida e processada para localizar o NK1R por imunofluorescência, como descrito para ratos. Os investigadores não estavam cientes dos agentes de teste.
[00260] Injeções intratecais (5 μl, L3/L4) foram feitas em camundongos conscientes. Dy4, Dy4 inativa, PS2, PS2 inativa (todos 50 μM), SR-140333 (15 μM), SM-19712 (8 mM), U0126 (100 μM) ou veículo (1% de DMSO/solução salina) foram injetados por via intratecal 30 min antes da injeção intraplantar de capsaicina ou formalina, ou 36 h após CFA. Espantida (50 μM), Composto 1 (50 μM), L-733,060 (100 nM), Composto 2 (100 nM), CGRP8-37 (10 μM), Composto 4 (10 μM), olcegepant (10 μM), ou Cy5- colestanol (10 μM) foi injetado por via intratecal 3 h antes ou 30 min após injeção intraplantar de capsaicina, 3 h antes da formalina, ou 36 h após CFA.
[00261] Foram usados lipossomas catiônicos e polímero aniônico adjuvante (poliglutamato) para distribuir o siRNA. siRNA que alveja dinamina-1 de camundongo (5’ (S-S) UAA GUG UCA AUC UGG UCU C dTdT 3’) ou siRNA de controle (5’ (S-S) CGU ACG CGG AAU ACU UCG AUU dTdT), ou siRNA que alveja β-arr1 de camundongo (sentido 5’ AGC CUU CUG CGC GGA GAA U dTdT 3’, antissentido 5’ dTdT U CGG AAG ACG CGC CUC UUA 5’) mais β-arr2 de camundongo (sentido: 5’ CCU ACA GGG UCA AGG UGA A dT dT 3’, antissentido: 5’ UUC ACC UUG ACC CUG UAG G dT dT 3’) ou siRNA de controle (sentido: 5’ AAG GCC AGA CGC GAA UUA U dT dT, 3’ antissentido: 5’ AUA AUU CGC GUC UGG CCU U dT dT 3’) (Dharmacon) (50 ng, 0,5 μl de 100 ng/μl estoque) foi misturado com 0,5 μl de poliglutamato adjuvante (0,1 μg/μl estoque) e 1,5 μl de NaCl 0,15 M estéril. Solução de lipossoma, lipídio catiônico 2-{3-[bis-(3- amino-propil)-amino] -propilamino} -N-ditetradecilcarbamoilmetil-acetamida (DMAPAP) e L-α-dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) (DMAPAP/DOPE, 1/1 M:M) (2,5 μl de 200 μM) foi adicionada a siRNA/adjuvante, submetida à vórticce durante 1 min, e incubada (30 min, TA). Os lipoplexos de siRNA foram administrados a camundongos por injeção intratecal (L1-L4, 5 μl). Após o teste comportamental (24-48 h), a medula espinhal (L1-L4) foi coletada para análise da expressão da dinamina-1 por Western blotting e expressão de β-arrestina-1 e β-arrestina-2 por q-PCR.
[00262] Linhagens celulares. Células HEK293 foram lisadas em 150 μl de tampão RIPA contendo protease HALT e inibidores da fosfatase (Thermo Scientific). As amostras foram sonicadas em gelo, centrifugadas e o sobrenadante (20 μg de proteína) foi fracionado por SDS-PAGE a 10% e transferido para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas (1 h, TA) em tampão de bloqueio Odyssey (LI-COR Biosciences) e incubadas com anticorpos anti-dinamina-1 de ovelhas54 (1:1.000) ou anti-clatrina de coelho (1 μg/ml, Abcam) em PBS, 0,2% de Tween-20, 50% de tampão de bloqueio Odyssey (16 h, 4°C). As membranas foram lavadas e incubadas com anti- cabra de burro 680 ou anti-coelho de cabra 680 (1:10000; LI-COR Biosciences) (1 h, TA). As membranas foram lavadas e retratadas com o scanner infravermelho LI-COR Odyssey. As membranas foram extraídas e ressondadas com anti-β-actina de coelho (1:1.000; Cell Signaling Technology, 16 h, 4°C), lavadas, incubadas com anti-coelho de cabra 800 (1:10.000, 1 h à TA, LI-COR), e retratadas novamente. Os sinais foram quantificados usando ImageJ (NIH). Medula espinhal. A metade dorsal da medula espinhal foi colocada em 100 μl de tampão RIPA gelado contendo inibidores de protease HALT e fosfatase (Thermo Scientific). Os tecidos foram homogeneizados, centrifugados e o sobrenadante (20 μg de proteína) foi separado por SDS-PAGE a 10% e transferido para membranas de PVDF. As membranas foram processadas para detectar dinamina-1 e β-actina como descrito.
[00263] A medula espinhal lombar do camundongo (L1-L4) foi colocada em RNAlater (Qiagen) e RNA total foi isolado usando o kit de isolamento de RNA RNeasy (Qiagen). O RNA total (500 ng) foi submetido a transcrição reversa usando o Kit de Sintese de cDNA Superscript?™ III (Invitrogen). Água foi adicionada a 1/3 da amostra para o controle negativo da transcriptase reversa (RT). Os 2/3 restantes da amostra foram submetidos a transcrição reversa usando Transcriptase Reversa Superscript III. O cDNA foi amplificado usando o sistema de PCR em tempo real Eppendorf RealPlex. Vinte microlitros de reação de amplificação incluíram modelo de cDNA, TaqMan Universal Master Mix e ensaios de expressão gênica TaqMan para um dos seguintes genes (n° de catálogo): ARRB2 (Mm00520666_g1), ARRB1 (Mm00617540_m1), ACTB (Mm02619580_g1), Gapdh (hs00363153_m1). Todas as amostras foram amplificadas em triplicatas. A abundância relativa (R) de cada transcrito foi estimada de acordo com o método ΔCt usando a seguinte fórmula: 2ΔCT . Ct é o limite crítico médio em que o aumento da fluorescência é o exponencial. Presumindo que a eficiência da reação de PCR foi de 100%, corresponde a um aumento de 2 vezes na quantidade de amplicon com cada ciclo de PCR. Com essa suposição, a 2ΔCT foi usada para calcular a abundância relativa de transcritos. Esses valores foram normalizados para uma média de genes de manutenção (β-actina e GAPHD).
[00264] Os camundongos foram aclimatados por 3 ensaios em 2 dias sucessivos antes dos experimentos. Os camundongos foram treinados para permanecer no rotarod por três períodos consecutivos. No dia do experimento, três testes de tempo de linha de base (corte de 120 s) foram registrados. Dy4, PS2, análogos inativos (50) ou veículo foi injetado por via intratecal (5 μl, L3/L4). Após 30 min, os ratos foram colocados no rotarod com velocidade de aceleração de até 120 s. Os tempos foram registrados em três tentativas sucessivas e o tempo de latência para queda foi determinado em 30, 90 e 120 min.
[00265] Os tecidos e as células foram observados usando um microscópio confocal Leica SP8 usando objetivas de óleo HCX PL APO 40x (NA 1.30) e HCX PL APO 63x (NA 1.40). Pilhas Z foram coletadas de neurônios positivos para NK1R na lâmina I do corno dorsal. Projeções de vídeo de pilhas Z foram feitas usando o software Imaris (Bitplane). A endocitose de NK1R e a expressão de pERK foram quantificadas usando ImageJ. Para quantificar a internalização de NK1R em neurônios da lâmina I, a borda do citoplasma da soma neuronal foi definida pela fluorescência de NeuN, e a fluorescência de NK1R em 5 pixels (0,5 μm) da borda foi definida como receptor associado à membrana plasmática. A razão entre a membrana plasmática e a fluorescência citosólica de NK1R-IR foi determinada em > 6 neurônios de lâmina I por condição. Para quantificar a ativação de ERK, a razão entre o número de neurônios pERK-IR e os neurônios Neu-N-positivos totais na lâmina I foi determinada em > 6 campos (objetiva x40) por condição.
[00266] Para avaliar a estabilidade no líquido cefalorraquidiano, a espantida ou o Composto 1 (10 μg/mL) foi incubado em líquido cefalorraquidiano humano (0 a 4 h, 37°C) e depois congelado. As proteínas foram precipitadas usando o ACN. Para avaliar a estabilidade na medula espinhal, a espantida ou o Composto 1 foi injetado por via intratecal em camundongos (10 μM, 5 μl, L3/L4). Após 3 horas, um segmento de medula espinhal de 5 mm de cada lado do sítio de injeção foi removido e congelado. Os tecidos foram esmagados com uma vareta de vidro em uma mistura de metanol (30 μl) e EDTA/KF (60 μl, EDTA 0,1 M, 4 g/l KF), submetidos a vórtice e centrifugados para remover os lipídios. Os peptídeos foram extraídos do glóbulo com 0,5% de ácido fórmico em 75% de ACN/H2O (100). As amostras foram analisadas por LC/MS usando um espectrômetro de massa triplo quadrupolo Waters Xevo TQ ou TQD acoplado a um Waters UPLC. Os peptídeos foram separados por HPLC (coluna Supelco Ascentis Express Peptide ES C18, 50 x 2,1 mm, 2,7 μm) com 0,05% de ácido fórmico em H2O e ACN como solventes. Os peptídeos foram quantificados por comparação com os padrões de calibração (50 a 50.000 ng/ml).
[00267] Os dados são apresentados como média ± SEM. As diferenças foram avaliadas usando o teste t de Student para duas comparações. Para comparações múltiplas, as diferenças foram avaliadas usando ANOVA de fator único ou duplo seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett (BRET, dor, rotarod, Western blot), teste de comparação múltipla de Tukey (FRET, internalização de NK1R, ativação ERK em neurônios espinhais, transmissão sináptica), teste de comparação múltipla de Sidak (taxa média de disparo de neurônios espinhais) ou teste de comparação múltipla de Dunn (duração da resposta de disparo de neurônios espinhais).
Claims (15)
1. Composto tripartido para alvejar sinalização por receptor de neurocinina-1 (NK1R) endossomal, caracterizado pelo fato de ser da fórmula (I): em que LA é uma âncora lipídica representada pelas fórmulas (IIaa), ou opcionalmente pela fórmula (IIa) ou pela fórmula (IIIa): em que R1a é um grupo C1-12 alquila, C2-10 alquenila, C2-10 alquinila, ou C1-6 alcóxi; 2a 3a 3b 4b 4c 5 6 7a 7b 8a 8b 9a 9b 10 R , R , R , R , R , R, R, R , R , R ; R , R , R , R , R 11a 11b 12a 12b 13 14 15a 15b 16a 16b , R , R , R , R , R , R , R , R , R são independentemente H ou C1-3 alquila; hidroxila, C1-6 alcóxi ou amino; ou opcionalmente, R3a R3b e/ou R4b R4c, e/ou R7a R7b, e/ou R8a R8b, e/ou R9a R9b, e/ou R11a R11b, e/ou R12a R12b, e/ou R15a R15b, e/ou R16a R16b são tomados em conjunto para dar =O (ligação dupla ao oxigênio); R4a é CH2, O, NH ou S; e representa uma ligação simples ou dupla; L é uma fração ligante de 1 nm a 50 nm de comprimento, em que L é representado pela fórmula (IVa):em que Z é o grupo de ligação do ligante à âncora lipídica LA; em que Z é definido por: al) Ci-Cioalquila-, -C2-Cioalquenila-, -C2-Cioalquinila-, - C1-C10alquilaC(O)-, -C2-C10alquenilaC(O)- ou -C2-C10alquinilaC(O)-; ou bi) junto com a amida NH adjacente, é um aminoácido ou um aminoácido amidado no terminal C, em que o aminoácido é selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido é ligado à âncora lipídica através do seu grupo funcional de cadeia lateral; e Y é o grupo de ligação do ligante L ao modulador X, que é um modulador do receptor de neurocinina-1 (NK1R) endossomal, em que a2) Y é definido por uma ligação covalente, -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)O-, -O-C(O)-, -NH-C(O)-, ou -C(O)S-; ou b2) Y, quando tomado junto com o grupo amido adjacente, é definido por: a. um aminoácido alfa selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; ou b. um aminoácido beta, gama ou delta que compreende um grupo funcional de cadeia lateral, em que o grupo funcional de cadeia lateral é o grupo funcional, que é presente na cadeia lateral de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; e em que o dito aminoácido beta, gama ou delta é opcionalmente ligado ao modulador do receptor NK1R endossomal através de um dos ditos grupos funcionais de cadeia lateral; ou c. um peptídeo formado a partir de aminoácidos alfa, beta, gama ou delta, em que o peptídeo compreende um aminoácido alfa, beta, gama ou delta que tem um grupo funcional de cadeia lateral, em que o grupo funcional de cadeia lateral é o grupo funcional, que é presente na cadeia lateral de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina, em que o dito peptídeo é opcionalmente ligado ao modulador do receptor NK1R endossomal através de um dos ditos grupos funcionais de cadeia lateral; m é 1 ou 2; n é de 1 a 20; p é de 1 a 8; e X é o modulador do receptor de neurocinina-1 (NK1R) endossomal definido pela estrutura X = M-R1- conforme definido pela fórmula (Va) ou pela fórmula (Vb), em que M é ligado covalentemente através de R1 a Y do ligante L: em que R1 é definido por -F1-R2’-F2-, em que: - M é ligado covalentemente a R2’ através de F1 (M-F1-R2’- ), e - R2’ é adicionalmente ligado covalentemente a Y do ligante L através de F2 (M-F1-R2’-F2-Y-), e - F1 e F2 têm, independentemente um do outro, uma ligação covalente a R2’; R2’ é definido por: a3) ligação covalente, b3) grupo C1-4 alquila linear ou ramificado, tendo opcionalmente, como um substituinte, um grupo heterocíclico aromático ou não aromático de 5 a 7 membros, que opcionalmente adicionalmente contém, em adição aos átomos de carbono, 1 a 4 heteroátomos selecionados do grupo que consiste em átomo de oxigênio, átomo de enxofre e átomo de nitrogênio, e opcionalmente adicionalmente tendo um ou dois oxo como substituintes, c3) um grupo heterocíclico não aromático de 5 a 7 membros, opcionalmente adicionalmente contendo, além de átomos de carbono, 1 ou 2 átomos de nitrogênio, e tendo opcionalmente 1 a 3 substituintes selecionados de um grupo que consiste em oxo, C1-6 alquila linear ou ramificada, fenila, C16 alquil-carbonila linear ou ramificada e C1-6 alquil-carbonilamino, d3) grupo C1-6 alquila linear ou ramificado, tendo opcionalmente substituinte(s) selecionado(s) do grupo que consiste em: (i) um grupo heterocíclico aromático ou não aromático de 5 a 7 membros contendo, além de átomos de carbono, 1 a 4 átomos de nitrogênio, e tendo opcionalmente um ou dois oxo como substituintes, (ii) um grupo C1-6 alquil-carbonilamino, (iii) um grupo C1-6 mono- ou dialquilamino, e (iv) um grupo C1-6 alcóxi; e3) grupo C1-6 alcóxi linear ou ramificado, f3) grupo C3-8 cicloalquila tendo opcionalmente 1 ou 2 substituintes selecionados de um grupo que consiste em um grupo C1-6 alquil- carbonilamino, um grupo C1-6 alcóxi-carbonilamino e um grupo amino, g3) grupo carbamoíla, h3) grupo C1-6 alcoxi-carbonila linear ou ramificado, ou i3) grupo C1-6 alquil-carbamoíla; F1 é definido por uma ligação covalente ou por uma fração selecionada da lista de grupos funcionais que consiste em: - C(=O)-, -C(=O)-O-, - C(=O)-N(R4’) , e - S(=O)2-N(R4’)-; com R4’ sendo átomo de hidrogênio ou C1 a C12 alquila linear ou ramificada; - 2 é definido por uma fração selecionada da lista de grupos funcionais que consiste em: -C(=O)-, -C(=O)-C(=O)-, - C(=O)-(CH2)n-C(=O)- com n = 1 a 12, - C(=O)-(CH2)n- com n = 1 a 12, - C(=O)-O-(CH2)n-C(=O)- com n = 1 a 12, e -C(=O)-O-(CH2)n- com n = 1 a 12; M é definido pelos seguintes substituintes: R2 é um átomo de hidrogênio, ou grupo C1-6 alquila linear ou ramificado, que é opcionalmente halogenado; R3 e R3’ são, cada um, independentemente um átomo de carbono ou metila, ou R3 e R3’ são opcionalmente ligados um ao outro para formar um anel junto com um átomo de carbono ligado aos mesmos; R4 é um átomo de cloro, metila ou trifluorometila; R5 é um átomo de cloro, metila ou trifluorometila; e um grupo representado pela fórmula: é um grupo aromático tendo opcionalmente substituinte(s); p = 0, 1 ou 2; q = 1 ou 2; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Composto tripartido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o modulador do NK1R endossomal é selecionado de um composto de acordo com a fórmula (VI) ou fórmula (Vb) em que R2 é um átomo de hidrogênio, metila ou ciclopropila; R3 é um átomo de hidrogênio ou CH3; R4 e R5 são trifluorometila; e um grupo representado por que é um grupo representado pela fórmula: em que R6 é um átomo de hidrogênio, metila, etila ou isopropila; R7 é um átomo de hidrogênio, metila ou átomo de cloro; e R8 é um átomo de hidrogênio, um átomo de flúor, um átomo de cloro ou metila; ou 3-metiltiofen-2-ila; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
3. Composto tripartido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a estrutura parcial: ou R3 é átomo de hidrogênio, e R3’ é átomo de hidrogênio; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
4. Composto tripartido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a fração -R2’-F1-M, que é ligada covalentemente ao ligante L por -F2- como mostrado na seguinte estrutura, é a seguinte: em que R3 é hidrogênio ou -CH3; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ou em que a fração -R2’-F1-M, que é ligada covalentemente ao ligante L por -F2- como mostrado na seguinte estrutura, é definida pela seguinte estrutura: em que R3 é hidrogênio ou -CH3; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
5. Composto tripartido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a fração -R2’-F1-M, que é ligada covalentemente ao ligante L por -F2- como mostrado na seguinte estrutura, é definida pela seguinte estrutura: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
6. Composto tripartido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a fração -F2-R2’-F1-M, que é ligada covalentemente por Y ao ligante L como mostrado nas seguintes estruturas, é selecionada da lista de compostos que consiste em:
em que R3 é átomo de hidrogênio ou CH3; ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
7. Composto tripartido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a fração -F2-R2’-F1-M, que é ligada covalentemente por Y ao ligante L como mostrado nas seguintes estruturas, é selecionada da lista de compostos que consiste em:
ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
8. Composto tripartido X-L-LA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser selecionado da lista de compostos que consiste nas seguintes estruturas:
em que R3 é átomo de hidrogênio ou -CH3; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto tripartido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para uso como um antagonista do receptor de taquicinina; ou para uso na profilaxia ou no tratamento de uma doença do trato urinário inferior, uma doença gastrointestinal ou uma doença do sistema nervoso central.
10. Composto tripartido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por sinalização por NK1R endossomal.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto tripartido como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, junto com um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
12. Composto tripartido para alvejar sinalização por GPCR endossomal, caracterizado pelo fato de ser da seguinte fórmula: em que R3 é um átomo de hidrogênio ou -CH3; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
13. Composto tripartido para alvejar sinalização por GPCR endossomal, caracterizado pelo fato de ser da fórmula (Ia): em que LA é uma âncora lipídica representada pelas fórmulas (IIa) ou (IIIa): em que R1a é um grupo C1-12 alquila; R2a e R3a são, independentemente, H ou C1-3alquila; R4a é C, O, NH ou S; representa uma ligação simples ou dupla; L é um grupo ligante de 1 nm a 5 nm de comprimento; e X é um modulador de um GPCR endossomal; ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
14. Composto tripartido para alvejar sinalização por GPCR endossomal, caracterizado pelo fato de ser da fórmula (Ib): em que LA é uma âncora lipídica representada pelas fórmulas (IIa) ou (IIIa): em que R1a é um grupo C1-12 alquila; R2a e R3a são, independentemente, H ou C1-3alquila; R4a é C, O, NH ou S; representa uma ligação simples ou dupla; L é representado pela fórmula (IVa):em que Z é o grupo de ligação entre o ligante e a âncora lipídica e é - Ci-Cioalquila-, -C2-Cioalquenila-, -C2-Cioalquinila-, -Ci-CioalquilC(O)-, - C2-CioalquenilC(O)- ou -C2-CwalqumilC(O)-; ou Z, junto com a amida NH adjacente, é um aminoácido ou um aminoácido amidado no terminal C, em que o aminoácido é selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido é ligado à âncora lipídica através do seu grupo funcional de cadeia lateral; Y é o grupo de ligação entre o ligante e o modulador de um GPCR endossomal e é -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)O- ou -C(O)S-; ou Y, junto com o grupo amido adjacente, é um aminoácido selecionado de ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina, histidina, cisteína, lisina, arginina, serina ou treonina; em que o aminoácido é ligado ao modulador de um GPCR endossomal através do seu grupo funcional de cadeia lateral; m é i ou 2; n é de i a 20; p é de i a 8; e X é um modulador de um GPCR endossomal; ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
15. Composto tripartido de acordo com a reivindicação i3 ou 14, caracterizado pelo fato de que o modulador de um GPCR endossomal é um modulador do NKiR endossomal; ou em que o modulador de um GPCR endossomal é um modulador do receptor de CGRP.
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