JP2021158932A - 核酸増幅用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】ウイルスＲＮＡ遺伝子を標的とするリアルタイムＰＣＲにおける高速で感度の良いＰＣＲ方法の提供。【解決手段】以下の成分を含有する核酸増幅用組成物。（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂ）逆転写酵素 １．５〜４．５Ｕ／μＬ（Ｃ）フォワードプライマー １．２μＭ以上（Ｄ）リバースプライマー １．２μＭ以上【選択図】図２

Description

本発明は、核酸増幅用組成物に関する。

リアルタイムＰＣＲ法は、サーマルサイクルにより遺伝子を指数関数的に増幅する強力な手法であるが、リアルタイムＰＣＲに使用される汎用のサーマルサイクラー装置は、ヒーターであるアルミブロック部の巨大な熱容量のため温度制御が遅く、３０〜４０サイクルのＰＣＲ操作に従来１〜２時間、場合によってはそれ以上を要する。そのため、最新の遺伝子検査装置を用いても分析にはトータルで、通常１時間以上を要しており、ＰＣＲ操作の高速化は、技術登場以来の大きな課題であった。

かかる状況の下、本願発明者らは、ＰＣＲ操作の高速化を図る目的からマイクロブロア等を送液用機構として使用するレシプロカルフロー型の核酸増幅装置を開発した（特許文献１）。

ＷＯ２０１６／００６６１２

リアルタイムＰＣＲ法による標的ＤＮＡ量の定量は、臨床において有用であり、ウイルス感染の有無を確認すること等に利用される。
しかし、細菌感染の場合と異なり、ウイルス感染の場合は、精製したＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを作成する工程が必要なため、逆転写反応の分余計に時間を要する。また、ｃＤＮＡ合成に用いたＲＮＡが、ｃＤＮＡとプライマーとの結合を干渉する。
したがって、ウイルスＲＮＡ遺伝子を標的とするリアルタイムＰＣＲを行う場合は、より高速で感度の良いＰＣＲ方法が望まれる。

本発明者らは、プライマー及び逆転写酵素の添加量を特定範囲に調整することにより上記課題を解決できることを見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
項１、以下の成分を含有する核酸増幅用組成物。
（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）逆転写酵素 １．５〜４．５Ｕ／μＬ
（Ｃ）フォワードプライマー １．２μＭ以上
（Ｄ）リバースプライマー １．２μＭ以上
項２、（Ｂ）逆転写酵素が、１．８〜４．２Ｕ／μＬである、項１記載の核酸増幅用組成物。
項３、（Ｃ）フォワードプライマー及び（Ｄ）リバースプライマーが、各々１．５〜３．５ μＭである、項１又は２記載の核酸増幅用組成物。
項４、（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ １Ｕに対して、（Ｂ）逆転写酵素 ５〜１８Ｕ含有する、項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項５、（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ １Ｕに対して、（Ｂ）逆転写酵素 ７〜１６Ｕ含有する、項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅用組成物。
項６、さらに（Ｅ）蛍光プローブを含有する、項１〜５に記載の核酸増幅用組成物。

ＰＣＲチップの構成を示す図である。Ｐの点線で囲まれた領域は、ＰＣＲ反応が行われる領域を表し、Ｒの点線で囲まれた領域は、逆転写反応が行われる領域を表す。 異なる濃度の逆転写酵素を用いた高速なＯｎｅ−ｓｔｅｐ逆転写リアルタイムＰＣＲにおけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＥ遺伝子配列を有するＲＮＡに対する核酸の増幅を示す図である。

以下、本発明の核酸増幅用組成物について詳説する。

本発明の核酸増幅用組成物は、ＲＮＡを鋳型として逆転写酵素によりｃＤＮＡを生成後、ＰＣＲ反応を行うための核酸増幅用組成物である。特に、ＰＣＲ反応中の遺伝子増幅の状況をモニタリングすることができるリアルタイムＰＣＲ用の組成物である。

（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
本発明の核酸増幅用組成物は、ＤＮＡポリメラーゼを含む。本発明において、「ＤＮＡポリメラーゼ」とは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを意味する。試薬として、タカラバイオ社のＳｐｅｅｄＳＴＡＲ（登録商標） ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅやＥｘＴａｑ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを挙げることができる。
本発明の核酸増幅用組成物中に含まれるＤＮＡポリメラーゼは、０．１５Ｕ／μＬ以上であり、好ましくは０．１５〜１Ｕ／μＬ、さらに好ましくは０．１８〜０．７５Ｕ／μＬであり、特に好ましくは０．２〜０．５Ｕ／μＬである。
ここで、酵素活性の定義は、活性化サケ精子 ＤＮＡ を鋳型／プライマーとして用い、７４℃において、３０ 分間 に１０ｎｍｏＬ の全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を１Ｕとする。

（Ｂ）逆転写酵素
本発明の核酸増幅用組成物は、逆転写酵素を含む。本発明において、「逆転写酵素」とは、ＲＮＡに遺伝情報をＤＮＡに逆転写する酵素をいい、適当なオリゴマーをプライマーとして、ｍＲＮＡ分子よりｃＤＮＡを合成するために用いられる。試薬として、タカラバイオ社のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅやライフテクノロジーズ社のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを挙げることができる。
本発明の核酸増幅用組成物中に含まれる逆転写酵素は、１．５〜４．５Ｕ／μＬであり、好ましくは１．８〜４．０Ｕ／μＬ、さらに好ましくは１．８〜３．５Ｕ／μＬであり、特に好ましくは１．８〜３．５Ｕ／μＬである。
なお、Ｐｏｌｙ（ｒＡ）・ｏｌｉｇｏ （ｄＴ）_{１２−１８}を鋳型／プライマーとして、３７℃、１０ 分間に１ ｎｍｏｌの［^３Ｈ］ｄＴＴＰ を取り込む酵素活性を１Ｕとする。
ここで活性測定用反応液組成は、以下の通りである。
５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３
７５ ｍＭ ＫＣｌ
８ ｍＭ ＭｇＣｌ_２
１０ ｍＭ ＤＴＴ
２０ μｇ／ｍｌ （ｒＡ）ｎ・（ｄＴ）_{１２−１８}
０．５ ｍＭ ［^３Ｈ］ｄＴＴＰ
０．１％ ＮＰ−４０
また、逆転写酵素は、例えば、本発明の核酸増幅用組成物中にＤＮＡポリメラーゼ １Ｕに対して５〜１８Ｕ又は７〜１６Ｕ含有することができる。

（Ｃ）フォワードプライマー及び（Ｄ）リバースプライマー
本発明の核酸増幅用組成物は、プライマーセットを含む。「プライマーセット」とは、フォワードプライマー及びリバースプライマーを組み合わせたものをいい、通常は一つの標的遺伝子領域に対応して１種のフォワードプライマー及び１種のリバースプライマーを用いる。
本発明の核酸増幅用組成物中に含まれるフォワードプライマー及びリバースプライマーは、各々１．２μＭ以上であり、好ましくは１．５〜４．５μＭであり、さらに好ましくは１．５〜４．０μＭであり、特に好ましくは１．８〜３．５ μＭである。フォワードプライマー及びリバースプライマーの含有量は、同一であっても異なっていてもよい。

（Ｅ）蛍光プローブ
本発明の核酸増幅用組成物は、リアルタイムＰＣＲを行う場合は、ＴａｑＭａｎプローブ、Ｃｙｃｌｅａｖｅプローブ、Ｅプローブ（登録商標）などの蛍光プローブを配合することが好ましい。

蛍光検出に用いる色素（蛍光色素）の例としては、ＡＢＹ、アクリジン、アレクサフルーア４８８、アレクサフルーア５３２、アレクサフルーア５９４、アレクサフルーア６３３、アレクサフルーア６４７、ＡＴＴＯ（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ蛍光色素）、バイオサーチブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、クマリン、ＤＡＮＳＹＬ、ＦＡＭ（例えば、５−ＦＡＭ、６−ＦＡＭ）、ＦＩＴＣ、ＧＰＦ、５−ＨＥＸ、６−ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＪＵＮ、マリーナブルー、ＮＥＤ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＰＥＴ、パルサー、クエザー５７０、クエザー６７０、クエザー７０５、ローダミングリーン、ローダミンレッド、５−ＲＯＸ、６−ＲＯＸ、５−ＴＡＭＲＡ、６−ＴＡＭＲＡ、５−ＴＥＴ、６−ＴＥＴ、テキサスレッド、ＴＲＩＴＣ、ＶＩＣが挙げられる。

本発明の核酸増幅用組成物は、その他ＰＣＲの反応に必要な成分が含まれている。例えば、試料液は水を主体とした水性媒体に、標識されていてもよい各種デオキシリボヌクレオチド三リン酸、などのＰＣＲの反応に必要な成分などが含まれている。また、ｐＨ及び塩濃度を調整するための緩衝液成分が含まれていてもよい。

本発明の核酸増幅用組成物を用いたリアルタイムＰＣＲは、例えば、以下の核酸増幅装置と核酸増幅用チップの組み合わせを用いて実施することができる。

［核酸増幅装置］
変性温度帯と伸長・アニーリング温度帯を形成できるヒーター、
微小流路中に存在する試料液の蛍光強度を測定可能な蛍光検出器、
前記２つの温度帯間の試料液の移動を可能にし、かつ、送液停止時には大気圧開放される送液用機構、
核酸増幅用チップを載置可能な基板、
試料液の移動に関する蛍光検出器からの電気信号が送られて送液用機構の駆動を制御する制御機構を備え、
サーマルサイクル毎の蛍光強度の計測を行うことでリアルタイムＰＣＲを実施するレシプロカルフロー型の核酸増幅装置。

［核酸増幅用チップ］
前記変性温度帯と前記伸長・アニーリング温度帯に各々対応する曲線流路、前記曲線流路をつなぐ直線状又は曲線状の中間流路、流路の一方又は両端部に前記核酸増幅装置における送液用機構に接続可能な接続部を備えた微小流路を少なくとも１つ有する核酸増幅用チップ。

具体的には、以下の工程１〜４により行うことができる：
工程１：上記核酸増幅装置の基板に上記核酸増幅用チップを載置する工程、
工程２：微小流路の一方又は両端部の送液用機構接続部と送液用機構を接続する工程、
工程３：前記送液用機構により試料液を微小流路の２つの曲線流路間で往復させてサーマルサイクリングを行う工程
工程４：前記流路の所定の位置で前記蛍光検出器によりサーマルサイクル毎の試料液の蛍光強度の計測を行う工程。

微小流路は、（i）熱伝導性が比較的高い、（ii）ＰＣＲに必要な温度範囲において安定である、（iii）電解質溶液や有機溶媒に侵食されにくい、（iv）核酸やタンパク質の吸着性が低いなどの要件の一部又は全部を満たす材料から構成されることが好ましい。具体的には、ガラス、石英、シリコン、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などの熱硬化性や光硬化性の各種樹脂が例示される。また、蛍光検出を実施するとの観点から、光（特に、蛍光検出を行うための励起光及び放射光）の透過性が高い（すなわち、吸収、拡散、反射等が少ない）、透明な材料であることが好ましい。

微小流路は、例えば、ＮＣ加工による切削などの機械加工、射出成形、ナノインプリンティング、ソフトリソグラフィーなどの方法により溝が素材に形成され、シール（好ましくは、例えばポリオレフィン製などの透明シール）により密閉された構造とすることができる。あるいは、三次元プリンティングにより微小流路を形成することもできる。微小流路の断面の形状は、特に限定されず、半円形状、円形状、直方形状、くさび形、台形、多角形などとすることができる。また、微小流路の断面は、例えば、幅１０〜１０００μｍ程度、深さ１０〜１０００μｍ程度とすることができる。また、微小流路の幅及び深さのそれぞれは、一定、または又は、部分的に幅若しくは深さが変化するものとすることができる。

微小流路が備える変性温度帯に対応する曲線流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路の形状は、ループ形状を有する蛇行流路、渦巻き状などの曲線流路の形状とすることができる。変性温度帯に対応する曲線流路と伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路とをつなぐ中間流路は、直線状又は曲線状のいずれの形状とすることができる。

変性温度帯に対応する曲線流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路のそれぞれの長さは、２０ｍｍ以上であることが好ましい。

微小流路が備える変性温度帯に対応する曲線流路及び伸長・アニーリング温度帯に対応する曲線流路のそれぞれは、対応する温度に維持されており、当該温度帯に移動してきた試料液の温度を当該温度帯の温度に変化させる。

変性温度帯は、ＰＣＲにおけるＤＮＡ変性反応に必要な温度に維持されている。変性温度帯の温度は９０〜１００℃程度が好ましく、９５℃程度がより好ましい。伸長・アニーリング温度帯は、ＰＣＲにおけるＤＮＡのアニーリング反応及び伸長反応のために必要な温度に維持されている。伸長・アニーリング温度帯の温度は４０〜７５℃程度が好ましく、５５〜６５℃程度がより好ましい。

変性温度帯及び伸長・アニーリング温度帯のそれぞれは、一定の温度に維持されていることが好ましい。温度の維持は、熱源により実現することができる。熱源は、例えば、微小流路に内蔵されている又は微小流路が接触している。熱源の具体例としては、カートリッジヒーター、フィルムヒーター、ペルチェヒーター等が例示される。

本発明の核酸増幅方法において、試料液はプラグ状の形態で微小流路中を移動する。微小流路中を移動する試料液の容量は、特に限定されず、好ましくは５〜５０μＬ程度、より好ましくは１５〜２０μＬ程度とすることができる。

本発明の核酸増幅方法における試料液の移動は、送液停止時には大気圧開放される送液用機構により実現される。すなわち、シリンジポンプ等の圧力が逃げないように流路内部を閉鎖系とする必要がある機構を用いるのではなく、送液時であっても開放系を形成するように構成される送液用機構を使用する。このような送液用機構を採用することで、送風を停止させると、流路内部の圧力が瞬時に大気圧に開放され、プラグ状試料液へ作用する圧力が失われるため送液はすぐに停止する。そのため、試料液の位置制御を行うための圧力開放用の複数の弁がなくても、正確な位置制御が可能となる。

送液停止時には大気圧開放される送液用機構の例としては、マイクロブロア、ファンを挙げることができる。

マイクロブロア（圧電マイクロブロアともいう）とは、空気を吸引及び吐出する公知の装置であり、密閉構造でない（逆止弁を有しない）ことを特徴とする。代表的なマイクロブロアにおいて、圧電素子への電圧印加によりダイヤフラムを屈曲変形させることで、空気の吸引及び吐出を実現する。マイクロブロアとしては、例えば、株式会社村田製作所が製造したものを使用することができる（ＭＺＢ１００１Ｔ０２，ＭＺＢ３００４Ｔ０４)。

ファンとは、羽根車の回転運動によって送風を行う装置をいう。羽根車の構造上の特性上、流路を閉鎖系としない。

上記サイクルを少なくとも１回以上、好ましくは３０〜５０回程度、より好ましくは３５〜５０回程度繰り返して行い、サーマルサイクリングを行う。サイクル数は、鋳型核酸の濃度、標的遺伝子の種類などに応じて適宜設定することができる。

試料液を変性温度帯内に保持させる時間及び試料液を伸長・アニーリング温度帯内に保持させる時間のそれぞれは、標的遺伝子領域（遺伝子の種類、領域の長さ等）に応じて適宜設定することができる。例えば、試料液を変性温度帯内に保持させる時間としては、２〜１０秒程度、試料液を伸長・アニーリング温度帯内に保持させる時間としては、２〜６０秒程度とすることができる。

送液用機構は、例えば接続部を介して、微小流路と接続している。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

［実施例］ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の定量
高速リアルタイムＰＣＲ用のＰＣＲチップ（図１）及びＷＯ２０１６／００６６１２に記載されたマイクロブロアを送液用機構とするリアルタイムＰＣＲ装置を用いて、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２）の標的遺伝子の定量を行った。１０，０００コピー／μｌに調製したＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２のＥゲノムＲＮＡ遺伝子をテンプレートとし、ネガティブコントロール（ＮＴＣ）には滅菌水を代わりに混合して高速リアルタイムＰＣＲを実施した。

プライマー及びプローブの配列は、標的に対して以下の配列を使用した。Ｅ遺伝子に対するフォーワードプライマー配列は、５’− ＡＣＡＧＧＴＡＣＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴ−３’ （配列番号１）、リバースプライマー配列は、５’− ＡＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡ−−３’（配列番号２）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ配列は、５’− ＡＣＡＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧ−３’（配列番号３）とした。

ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２に対する蛍光プローブには、それぞれＣｙ５標識のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを利用し、ＰＣＲ溶液中の最終濃度は各２００ｎＭとした。

フォワードプライマー並びにリバースプライマーのＰＣＲ溶液中の最終濃度は各２μＭとした。
ＤＮＡポリメラーゼとしては、タカラバイオ社のＳｐｅｅｄＳＴＡＲ（登録商標） ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを最終濃度０．２５Ｕ／μＬにて使用した。
逆転写酵素としては、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ II を最終濃度２〜５Ｕ／μＬにて使用した。

サーマルサイクル条件は、逆転写反応は、４２℃で３０秒とした。逆転写反応終了後、引き続き、ホットスタートに９６℃で１０秒加熱後、さらに９６℃で５秒と５８℃で８秒を５０サイクル繰り返す設定とした。

高速リアルタイムＰＣＲを用いたＳＡＲＳ−ＣｏＶ−２の蛍光強度は、図２に示す通り、逆転写酵素の最終濃度を５Ｕ／μＬとすることにより阻害された。
一方、フォワードプライマー及びリバースプライマーが、各２μＭ含有するＰＣＲ反応液においては、逆転写酵素が２，３，４Ｕ／μＬでは高速で感度よいＰＣＲが実施できた。

Claims (3)

1. 以下の成分を含有する核酸増幅用組成物。
   （Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
   （Ｂ）逆転写酵素 １．５〜４．５Ｕ／μＬ
   （Ｃ）フォワードプライマー １．２μＭ以上
   （Ｄ）リバースプライマー １．２μＭ以上
2. （Ｂ）逆転写酵素が、１．８〜４．２Ｕ／μＬである、請求項１記載の核酸増幅用組成物。
3. （Ｃ）フォワードプライマー及び（Ｄ）リバースプライマーが、各々１．５〜３．５ μＭである、請求項１又は２記載の核酸増幅用組成物。

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