JP2021153602A - 迅速pcrのためのデバイスおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[0001]本発明は、米国国防省の助成を受けたW911QY−13−D−0080の下、政府支援により行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
[0002]本発明は、2016年2月22日出願の米国仮出願第62/298,311号、2016年5月2日出願の米国仮出願第62/330,701号、および2016年10月18日出願の米国仮出願第62/409,829号の利益および優先権を主張するものであり、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ゾーンを含み、かつ、ステップ(d)の前に、本方法は、試料を試料調製ゾーン内に導入するステップと、試料調製ゾーンを溶解装置と接触させて溶解物を生成するステップと、溶解物から核酸を回収するステップと、および回収された核酸を第1段階チャンバ内へ移動させるステップとをさらに含む。別の態様において、試料から核酸を回収するステップは、溶解物を複数の磁気ビーズと接触させることと、磁気ビーズを溶解物から分離するために磁石を配置することと、磁気ビーズを洗浄することと、磁気ビーズを磁石で再捕捉することと、磁気ビーズを溶出緩衝液と接触させて核酸を磁気ビーズから解放することと、磁気ビーズを磁石で再捕捉し、溶出した核酸を磁気ビーズから分離することとを含む。
が説明される。核酸は、試料容器内に提供され、核酸はアレイ内で構成される。本計器は、試料容器を受容するための開口部と、複数の加熱器であって、各加熱器が異なる温度で提供される、複数の加熱器と、加熱器を開口部に隣接する位置に順次移動させ、それにより上記位置にある加熱器のみが試料容器内の核酸の温度を制御するようにする移動部とを含む。1つの態様において、試料容器は、核酸を増幅するための構成要素をさらに含み、複数の加熱器は、アニーリング温度にある第1の加熱器および変性温度にある第2の加熱器を少なくとも含む。別の態様において、複数の加熱器は、延伸温度にある第3の加熱器をさらに含む。
よび科学用語を含む)は、本開示に関係する当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。共通して使用される辞書などにおいて定義されるような用語は、本出願および関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、理想化されたまたは過度に形式にとらわれた意味で解釈することは、本明細書において明白にそのように定義されない限りは、なされるべきではないことをさらに理解されたい。本明細書において本発明の説明に使用される言葉は、特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであり、本発明を限定することは意図されない。本明細書において説明されるものと同様または同等のいくつかの方法および材料を本開示の実践において使用することができるが、本明細書では例示的な材料および方法のみが説明される。
5号の図15に類似しており、同様のアイテムには同じ番号が付けられている。金具590は、試薬貯蔵所または廃物貯蔵所としての役割も果たす入口チャネル515a〜515lを備える。例示的に、試薬は、金具590内で凍結乾燥されて、使用前に再水和され得る。それぞれのチャネル514、538、543、552、553、562、および565を有するブリスタ522、544、546、548、564、および566は、米国特許第8,895,295号の図15の同じ数字のブリスタに類似している。図1の第2段階反応ゾーン580は、米国特許出願第8,895,295号のものに類似しているが、高密度アレイ581の第2段階ウェル582は、いくらか異なるパターンで配置される。図1の高密度アレイ581のより円形のパターンは、角のウェルを削除し、第2段階ウェル582のより均一な充填を結果としてもたらし得る。示されるように、高密度アレイ581は、102個の第2段階ウェル582を備える。ポーチ510は、FilmArray(登録商標)計器(BioFire Diagnostics、LLC、Salt Lake City、UT)での使用に好適である。しかしながら、ポーチ実施形態は例示にすぎないということが理解される。
クフィルム、またはポリエステル、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレートなどの他の可撓性材料、押し出し加工、プラズマ蒸着、ならびにラミネーションを含む当該技術分野において知られている任意のプロセスによって作製され得るそれらの混合物、組み合わせ、および層の2つの層で形成され得る。例えば、各層は、一緒にラミネートされる単一の種類または2つ以上の種類の材料の1つまたは複数の層からなり得る。アルミニウムラミネーションを有する金属箔またはプラスチックも使用され得る。ブリスタおよびチャネルを形成するために一緒に密閉され得る他のバリヤ材料が、当該技術分野において知られている。プラスチックフィルムが使用される場合、層は、例示的にはヒートシールによって、一緒に結合され得る。例示的には、この材料は、核酸結合力が弱い。
蛍光が十分に低いプラスチックフィルムが好ましい。そのような材料は、異なるプラスチック、異なる可塑剤、および混合比、ならびにフィルムの異なる厚さを試験することによって特定され得る。アルミニウムまたは他の箔ラミネーションを有するプラスチックでは、蛍光検出デバイスによって読み取られることになるポーチの一部分には箔がないことがある。例えば、ポーチ510の第2段階反応ゾーン580の第2段階ウェル582内で蛍光がモニタされる場合、ウェル582における1つまたは両方の層には箔がないことがある。PCRの例においては、約0.1219mm(0.0048インチ)厚のポリエステル(Mylar、DuPont、Wilmington DE)および0.025〜0.076mm(0.001〜0.003インチ)厚のポリプロピレンフィルムからなるフィルムラミネートが良い効果を発揮する。例示的には、ポーチ510は、入射光のおよそ80%〜90%を透過することができる透明材料製であり得る。
示的には空気圧の印加によって、ブリスタ間で移動される。したがって、圧力を用いる実施形態において、ポーチ材料は、例示的には、圧力により所望の効果を有するのに十分に可撓性である。本明細書では、「可撓性」という用語は、ポーチの材料の物理的特性を説明するために使用される。本明細書では、「可撓性」という用語は、本明細書で使用される圧力のレベルによって、亀裂、破砕、ひび、または同様のものなしに容易に変形可能であると定義される。例えば、Saran(商標)ラップおよびZiploc(登録商標)バッグなどの薄プラスチックシート、ならびにアルミニウム箔などの薄金属箔は可撓性である。しかしながら、空気圧を用いる実施形態においてさえ、可撓性である必要があるのは、ブリスタおよびチャネルの特定の領域だけである。さらに、ブリスタおよびチャネル
が容易に変形可能である限りは、可撓性である必要があるのは、ブリスタおよびチャネルの1つの側面だけである。ポーチ510の他の領域は、剛性材料製であり得るか、または剛性材料で補強され得る。したがって、「可撓性ポーチ」または「可撓性試料容器」などの用語が使用されるとき、ポーチまたは試料容器の部分のみが可撓性である必要があるということが理解される。
隆起した表面のパターンを有するダイを作成するために、金属、例示的にはアルミニウムのシート、または他の好適な材料が、粉砕され得るか、または別のやり方で切断され得る。例示的には195℃の動作温度に調整される空気プレス(例示的には、A−5302−PDS、Janesville Tool Inc.、Milton WI)に差し込まれると、空気プレスが印刷機のように機能して、ダイがフィルムに接触する唯一の場所であるプラスチックフィルムの密封表面を融解する。同様に、ポーチ510のために使用されるプラスチックフィルムは、レーザ切断および溶接デバイスを使用してまとめて切断および溶接され得る。PCRプライマー(例示的には、フィルム上にスポッティングされて乾燥される)、抗原結合基板、磁気ビーズ、およびケイ酸ジルコニウムビーズなどの様々な構成要素は、ポーチ510が形成される際に様々なブリスタの内側に密封され得る。試料処理のための試薬は、密封の前に、まとめて、または別々のいずれかで、フィルム上にスポッティングされ得る。1つの実施形態において、ヌクレオチド三リン酸(NTP)が、ポリメラーゼおよびプライマーとは別にフィルム上にスポッティングされ、反応が水性試料によって水和され得るまでポリメラーゼの活性を本質的に除去する。水性試料が水和の前に加熱されている場合、これが、真のホットスタートPCRのための条件を作成し、高価な化学的ホットスタート成分の必要性を低減または除去する。別の実施形態において、構成要素は、粉末または丸薬の形態で提供され得、最終密封の前にブリスタ内に置かれる。
様式で使用され得る。1つの例示的な実施形態において、試験されるべき試料(100μl)および溶解緩衝液(200μl)を含む300μl混合物が、入口チャネル515a近くの金具590内の注入口(図示されず)に注入され得、この試料混合物は、入口チャネル515aへ引き入れられ得る。水も入口チャネル5151に隣接する金具590の第2の注入口(図示されず)に注入され得、金具590内に提供されるチャネル(図示されず)を介して分配され、それにより、各々が事前に入口チャネル515bから5151において乾燥形態で提供されている最大11の異なる試薬を水和する。試料および水和流体(例えば、水または緩衝液)を注入するための例示的な方法およびデバイスは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第2014−0283945号に開示されているが、これらの方法およびデバイスは例示にすぎず、試料および水和流体をポーチ510内へ導入する他のやり方は、本開示の範囲内であるということが理解される。これらの試薬は、例示的には、乾燥凍結PCR試薬、DNA抽出試薬、洗浄液、免疫アッセイ試薬、または他の化学物質を含み得る。例示的には、試薬は、核酸抽出、第1段階多重PCR、多重反応の希釈、および第2段階PCR試薬の調製、ならびに制御反応のためのものである。図1に示される実施形態において、注入される必要があるのは、一方の注入口内に試料溶液および他方の注入口内に水がすべてである。注入後、2つの注入口は密封され得る。ポーチ510および金具590の様々な構成に関するさらなる情報については、すでに参照により組み込まれている米国特許第8,895,295号を参照されたい。
スタ522へと移動され得る。溶解ブリスタ522は、セラミックビーズまたは他の研磨要素などのビーズまたは粒子534を備え、FilmArray(登録商標)計器内に提供される回転刃またはパドルを使用した衝突により旋回流形成するように構成される。ケ
イ酸ジルコニウム(ZS)ビーズ534などの溶解する粒子の存在下での試料の揺動、旋回流形成、超音波処理、および同様の処理によるビーズ粉砕は、溶解物を形成する効果的な方法である。本明細書において使用される場合、「溶解する」、「溶解」、および「溶解物」などの用語は、細胞を破壊することに限定されず、そのような用語は、ウイルスなどの非細胞粒子の崩壊を含むことが理解される。
える、図2に示される計器800のビードたたきモータ819を示す。刃は、スロット804を通って延在してポーチ510に接触し得る。しかしながら、モータ819は、計器800の他の構造体に取り付けられ得ることが理解される。1つの例示的な実施形態において、モータ819は、支持部材802に取り付けられるMabuchi RC−280SA−2865 DCモータ(千葉、日本)である。1つの例示的な実施形態において、モータは、5,000〜25,000rpm、より例示的には10,000〜20,000rpm、およびさらにより例示的にはおよそ15,000〜18,000rpmで回転される。Mabuchiモータの場合、7.2Vが溶解に十分なrpmを提供することが分かっている。しかしながら、刃821がポーチ510に衝突するときには実際の速度はいくらか遅くなり得ることが理解される。使用されるモータおよびパドルによっては、他の電圧および速度が溶解のために使用され得る。任意選択的に、制御された少量の空気が、溶解ブリスタ522に隣接する内袋822内へ提供され得る。いくつかの実施形態においては、隣接する内袋に1回または複数回少量の空気を部分的に充填することが、溶解プロセス中に溶解ブリスタを位置付けることおよび支持することを手助けすることが分かっている。代替的に、他の構造体、例示的には剛性もしくは弾性ガスケットまたは溶解ブリスタ522の周りの他の保持構造体が、溶解中にポーチ510を保持するために使用され得る。また、モータ819は例示にすぎず、他のデバイスが試料を粉砕、揺動、旋回流形成するために使用され得ることが理解される。いくつかの実施形態において、機械的な溶解に加えて、またはその代わりに、化学作用または熱が使用され得る。
ネル538を通ってブリスタ544へ、およびチャネル543を通ってブリスタ546へと移動され、ここで試料は、シリカ被覆磁気ビーズ533などの核酸結合物質と混合される。代替的に、磁気ビーズ533は、例示的には入口チャネル515c〜515eのうちの1つから提供される流体を使用して、再水和され得、次いでチャネル543を通ってブリスタ544へ、次にチャネル538を通ってブリスタ522へと移動され得る。混合物は、適切な長さの時間、例示的にはおよそ10秒〜10分間、培養される。ブリスタ546に隣接して計器内に位置する引き込み式磁石が、溶液から磁気ビーズ533を捕捉し、ブリスタ546の内表面に対してペレットを形成する。培養がブリスタ522内で起こる場合、複数回分の溶液が、捕捉のためにブリスタ546へ移動される必要があり得る。次いでこの液体は、ブリスタ546から外へ移動され、ブリスタ544を通って、今度は廃物受け口として使用されるブリスタ522へと戻される。注入チャネル515c〜515eのうちの1つまたは複数からの1つまたは複数の洗浄緩衝液は、ブリスタ544およびチャネル543を介してブリスタ546へ提供される。任意選択的に、磁石は引き込まれ、磁気ビーズ533は、チャネル543を介してビーズをブリスタ544および546から行ったり来たり移動させることによって洗浄される。磁気ビーズ533が洗浄されると、磁気ビーズ533は、磁石の活性化によりブリスタ546内で再捕捉され、次いで洗浄液がブリスタ522へ移動される。このプロセスは、溶解緩衝液および核酸結合磁気ビーズ533からの試料デブリを洗浄するのに必要なだけ繰り返され得る。
と移動され、磁石が引き込まれる。溶液は、チャネル552を介してブリスタ546と548との間で循環され、ブリスタ546内の磁気ビーズ533のペレットを破壊し、捕捉された核酸がビーズから解離して溶液になることを可能にする。磁石がもう一度活性化されて、ブリスタ546内の磁気ビーズ533を捕捉し、溶出した核酸溶液がブリスタ548内へ移動される。
48内の核酸試料と混合される。任意選択的に、この混合物は、チャネル553を介して混合物を548と564との間に強制的に押し込むことによって混合される。いくつかの混合サイクル後、溶液はブリスタ564内に含有され、ここで第1段階PCRプライマーのペレット、各標的に対してプライマーの少なくとも1つのセットが提供され、第1段階多重PCRが実施される。RNA標的が存在する場合、RTステップは、第1段階多重PCRの前に、またはそれと同時に実施され得る。FilmArray(登録商標)計器内の第1段階多重PCR温度サイクルは、例示的には、15〜20サイクルにわたって実施されるが、特定の用途の要件によっては他のレベルの増幅が望ましい場合がある。第1段階PCRマスターミックスは、当該技術分野において知られているような様々なマスターミックスのうちのいずれかであり得る。1つの例示的な例において、第1段階PCRマスターミックスは、サイクル当たり20秒以下を要するPCRプロトコルと共に使用するための、参照により本明細書に組み込まれるUS2015/0118715に開示される化学作用のいずれかであり得る。
は試料の大部分をブリスタ548内へと強制的に押し込んで、ブリスタ564内には少量のみを残し、注入チャネル515iから第2段階PCRマスターミックスを添加することによって、希釈され得る。代替的に、515iからの希釈緩衝液が、ブリスタ566へと移動され得、次いで流体をブリスタ564と566との間で行ったり来たり移動させることによって、ブリスタ564内の増幅された試料と混合される。所望の場合、希釈は、注入チャネル515jおよび515kからの希釈緩衝液を使用して数回繰り返され得るか、または注入チャネル515kは、例示的には、シークエンシングまたは他のPCR後分析のために確保され得、次いで第2段階PCRマスターミックスを注入チャネル515hから希釈済みの増幅された試料の一部またはすべてに添加する。希釈のレベルは、希釈ステップの数を変更することによって、または、希釈緩衝液、もしくは増幅のための成分、例示的にはポリメラーゼ、dNTPs、および好適な緩衝液を含むが、特に非PCR増幅方法の場合は他の成分が好適であり得る第2段階PCRマスターミックスと混合する前に廃棄される試料の割合を変更することによって調節され得ることが理解される。所望の場合、試料および第2段階PCRマスターミックスのこの混合物は、第2段階増幅のために第2段階ウェル582への移動の前にブリスタ564内で事前加熱され得る。そのような事前加熱は、第2段階PCR混合物内のホットスタート成分(抗体、化学的、または別のやり方)の必要性を無くし得る。
欠けており、102個の第2段階ウェル582の各々は、特定のPCRプライマー対で前処置される。所望の場合、第2段階PCRマスターミックスは、他の反応成分に欠けていてもよく、これらの成分は、同様に第2段階ウェル582内で前処置され得る。各プライマー対は、第1段階PCRプライマー対に類似しているか、もしくはそれと同一であり得るか、または第1段階プライマー対内でネスト化され得る。ブリスタ564から第2段階ウェル582への試料の移動により、PCR反応混合物が完成する。高密度アレイ581が充填されると、個別の第2段階反応は、当該技術分野において知られているような任意の数の手段によって、それらのそれぞれの第2段階ブリスタ内に密封される。相互汚染なしに高密度アレイ581を充填および密封する例示的な方法は、すでに参照により組み込まれている米国特許第8,895,295号において論じられている。例示的に、高密度アレイ581のウェル582内の様々な反応は、例示的には1つまたは複数のペルチェ素
子を用いて、同時にまたは個別に熱サイクルされるが、熱サイクルのための他の手段が当該技術分野において知られている。
グナルを生成するために、dsDNA結合色素LCGreen(登録商標)Plus(BioFire Diagnostics、LLC)を含有する。しかしながら、この色素は例示にすぎず、当該技術分野において知られているような、例えば蛍光的、放射活性的、化学発光的、酵素的にラベル付けされる他のdsDNA結合色素およびプローブなど、他のシグナルが使用され得ることが理解される。代替的に、アレイ581のウェル582は、シグナルなしで提供され得、結果は後続の処理により報告される。
施形態において、「内袋」が用いられ得る。その一部分が図2〜図3に示される内袋組立体810は、複数の膨張可能な内袋822、844、846、848、864、および866を収容する内袋プレート824を含み、これらの内袋の各々は、例示的には圧縮ガス源により個別に膨張可能であり得る。内袋組立体810は、圧縮ガスに供され、複数回使用され得るため、内袋組立体810は、ポーチよりも丈夫なまたは厚い材料製であり得る。代替的に、内袋822、844、846、848、864、および866は、ガスケット、シール、バルブ、およびピストンと一緒に留められる一連のプレートから形成され得る。他の配置は本発明の範囲内である。代替的に、アレイまたは機械的アクチュエータおよびシールが、チャネルを密封し、ブリスタ間の流体の移動を管理するために使用され得る。本明細書に説明される計器のために適合され得る機械的シールおよびアクチュエータのシステムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮出願第62/368,095号に詳細に説明される。
に依存する。典型的には、PCRは、高純度のDNAを使用して実施される。フェノール抽出または市販のDNA抽出キットなどの方法は、高純度のDNAを提供する。ポーチ510を通って処理される試料は、低純度の調製を補うために対処がなされることが必要とされ得る。PCRは、生体試料の成分によって抑制され得、それは潜在的な障害である。例示的には、ホットスタートPCR、Taqポリメラーゼ酵素のより高い濃度、MgCl2濃度の調節、プライマー濃度の調節、およびアジュバント(DMSO、TMSO、またはグリセロール)の添加が、任意選択的に、より低い核酸純度を補うために使用され得る。純度の問題はどちらかというと第1段階増幅での懸念である可能性が高いが、同様の調節が第2段階増幅においても同様に提供され得ることが理解される。
10の1つの面に対して押圧されるため、特定の内袋が膨張される場合、その圧力が、液体をポーチ510内の対応するブリスタから外に押し出すことになる。ポーチ510のブリスタの多くに対応する内袋に加えて、内袋組立体810は、ポーチ510の様々なチャネルに対応する、内袋または空気駆動式ピストンなどのさらなる空気式アクチュエータを有し得る。図2〜図3は、ポーチ510のチャネル538、543、553、および565に対応する例示的な複数のピストンまたはハードシール838、843、852、853、および865、ならびに金具590内への逆流を最小限にするシール871、872、873、874を示す。作動されるとき、ハードシール838、843、852、853、および865は、対応するチャネルをピンチオフして閉めるためにピンチバルブを形成する。液体をポーチ510の特定のブリスタ内に閉じ込めるために、ハードシールがブリスタに出入りするチャネルに対して作動され、それによりアクチュエータがピンチバルブとして機能してチャネルをピンチして閉鎖する。例示的に、異なるブリスタ内の2つの容積の液体を混合するために、接続チャネルを密封するピンチバルブアクチュエータが作動され、ブリスタの上の空気式内袋が交互に加圧され、液体を、ブリスタを接続するチャネルを通して行ったり来たりさせて、その中の液体を混合する。ピンチバルブアクチュエータは、様々な形状およびサイズのものであり得、2つ以上のチャネルを同時にピンチオフするように構成され得る。空気式アクチュエータが本明細書では論じられるが、リニアステッパモータなどの様々な電気機械式アクチュエータ、モータ駆動カム、空気によって駆動される剛性パドル、水力もしくは電磁石力、ローラ、ロッカアーム、およびいくつかの場合においてはコックばねを含む、ポーチに圧力を提供する他の方法が企図されることが理解される。加えて、チャネルの軸に垂直に圧力を印加することに加えて、可逆的または不可逆的にチャネルを閉じる様々な方法が存在する。これらは、チャネルにわたってバッグをねじれさせること、ヒートシール、アクチュエータを回転させること、およびバタフライバルブおよびボールバルブなどのチャネル内に密封される様々な物理的バルブを含む。加えて、小型のペルチェ素子または他の温度調節器がチャネルに隣接して置かれ、流体を凍結させてシールを効果的に形成するのに十分な温度に設定され得る。また、図1の設計は、ブリスタおよびチャネルの各々の上に位置付けられたアクチュエータ要素を特徴とする自動化計器のために適合されるが、アクチュエータが静止したままである場合、さらには少ない数のアクチュエータが試料崩壊、核酸捕捉、第1および第2段階PCRを含む処理ステーション、ならびに免疫アッセイおよび免疫PCRなどのポーチ510の他の用途のための処理ステーションのいくつかのために使用され得るように、ポーチ510が遷移される場合も企図される。チャネルおよびブリスタに対して作用するローラは、ポーチ510がステーション間を移動される構成において特に有用であることが判明し得る。したがって、空気式アクチュエータが本開示の実施形態においては使用されるが、「空気式アクチュエータ」という用語が本明細書で使用されるとき、ポーチおよび計器の構成によっては、他のアクチュエータおよび圧力を提供する他の方法が使用され得ることが理解される。
895に接続される。図2にはいくつかのホース878のみが示されているが、各空気式部品は、ホース878を介して圧縮ガス源895に接続されることが理解される。圧縮ガス源895は、圧縮器であり得るか、または代替的に、圧縮ガス源895は、炭酸ガスシリンダなどの圧縮ガスシリンダであり得る。圧縮ガスシリンダは、携帯性が所望される場合は特に有用である。他の圧縮ガス源は本発明の範囲内である。同様の空気制御が、図12〜図16の実施形態においては、ポーチ1400内の流体の制御のために提供され得るか、または他のアクチュエータ、サーボなどが提供され得る。
。支持部材802の第2の側面814に装着される磁石850は、例示的には、ホース878を介して圧縮ガス源895からのガスを使用して配備され引き込まれるが、磁石850を移動させる他の方法が当該技術分野において知られている。磁石850は、支持部材802内の凹所851にある。凹所851は、支持部材802を通る通路であり得るため、磁石850は、ポーチ510のブリスタ546に接触することができるということが理解される。しかしながら、支持部材802の材料によっては、凹所851は、磁石850が配備されるときに磁石850がブリスタ546において十分な磁界を提供するのに十分に近く、かつ磁石850が完全に引き込まれるときに磁石850がブリスタ546内に存在するいかなる磁気ビーズ533にも実質的に影響を与えない限りは、支持部材802の初めから終わりまで延在する必要はないということが理解される。磁石850を引き込むことについての言及がなされるが、電磁石が使用され得、電磁石は、電磁石を通る電気の流れを制御することによって作動および無効化され得るということが理解される。したがって、本明細書は、磁石を撤退させるまたは引き込むことを論じているが、これらの用語は十分に幅広いため、磁界を撤退させる他のやり方を組み込むことができることが理解される。空気式接続は、空気式ホースまたは空気式エアマニホールドであり、したがって必要なホースまたはバルブの数を減少させ得ることが理解される。同様の磁石および磁石を作動させるための方法が、図12〜図16の実施形態において使用され得ることが理解される。
を介して圧縮ガス源895に接続される。空気式ピストン868を圧縮ガス源895に接続する2つのみのホース878が示されるが、空気式ピストン868の各々が圧縮ガス源895に接続されることが理解される。12個の空気式ピストン868が示される。
書において使用される場合、「温度制御要素」という用語は、試料に熱を追加するか、試料から熱を取り除くデバイスを指す。温度制御要素の例示的な例としては、限定されるものではないが、加熱器、冷却器、ペルチェ素子、抵抗加熱器、誘導加熱器、電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、およびそれらの組み合わせが挙げられる。温度制御要素は、複数の加熱器、冷却器、ペルチェなどを含み得る。1つの態様において、所与の温度制御要素は、2種類上の加熱器または冷却器を含み得る。例えば、温度制御要素の例示的な例は、ペルチェの上面および/または底面に適用される別個の抵抗性加熱器を有するペルチェ素子を含み得る。本明細書全体を通して「加熱器」という用語が使用されるが、他の温度制御要素が試料の温度を調節するために使用され得ることが理解される。
リスタ564の内容物を加熱および冷却するように位置付けられ得る。図2に見られるように、第2段階加熱器888は、第2段階PCRのために、ポーチ510のアレイ581の第2段階ブリスタ582の内容物を加熱および冷却するように位置付けられ得る。しかしながら、これらの加熱器はまた、他の加熱目的のために使用され得、また特定の用途に適切な場合には他の加熱器が含まれ得ることが理解され得る。
PCRには効果的であるが、いくつかの実施形態においては加熱器を一定の温度に維持することが望ましい場合がある。例示的には、これは、試料温度を遷移させるために必要とされる時間を超えて加熱器温度を遷移させるために必要とされる時間を除去することによって、ランタイムを減少させるために使用され得る。また、そのような配置は、はるかに大きな(より熱質量の多い)ペルチェ素子ではなく、より小さい試料および試料器を熱的にサイクルさせることが必要なだけであるため、システムの電気効率を改善することができる。図18は、加熱器組立体988によって置き換えられる第2段階加熱器888の代替的な実施形態を示す。例示的には、加熱器組立体988は、各加熱器がアレイ581に隣接する位置に順次移動される際に一度に1つの加熱器がアレイ581に接触するように、例示的には円形取付部934にはめ込まれ、モータ933によって輪状に駆動される3つの加熱器930、931、および932を含む。第1段階PCRを参照して、好適な加熱器のタイプが上に論じられる。例示的には、加熱器930は、アニーリング温度、例示的には60℃に設定され得、加熱器931は、延伸温度、例示的には72℃に設定され得、加熱器932は、変性温度、例示的には94℃に設定され得る。しかしながら、これらの温度は例示にすぎず、他の温度および他の数の加熱器が使用され得ることが理解される。多くの用途では、2つの加熱器が十分であり得る。この実施形態では、加熱器930、931、932は、アレイ581に接触するように移動する。取付部934は、一方向にのみ移動して、加熱器930、931、932の各々が順にアレイ581に接触し得るか、または取付部は時計回りおよび反時計回り両方の方向に移動して、例示的には各PCRサイクル後に方向を変え得る。
に対して移動されるが、これは例にすぎず、第1段階PCRのための図6〜図8に示される実施形態にあるように、2つ以上の静止した加熱器が提供され得、アレイ581が加熱器に対して回転され得ることが理解される。同様に、加熱器は、例えば、図12A〜図13Bおよび図17に例証される実施形態にあるように直線的に配置され得る。そのような例において、熱サイクルは、加熱器をアレイに対して移動させることによって、またはアレイを加熱器に対して移動させることによって達成され得る。
るように、光学アレイ890は、例示的にはフィルタ処理したLED光源、フィルタ処理した白色光、またはレーザ照射である光源898と、カメラ896とを含む。カメラ896は、例示的には複数の光検出器を有し、その各々がポーチ510内の第2段階ウェル582に対応する。代替的に、カメラ896は、第2段階ウェル582のすべてを含む画像を撮影し得、この画像は、第2段階ウェル582の各々に対応する別個の区域に分割され得る。構成によっては、光学アレイ890は静止状態にあり得るか、または光学アレイ890は、1つまたは複数のモータに取り付けられた移動部上に置かれ、各個別の第2段階ウェル582からシグナルを獲得するために移動され得る。他の配置が可能であることが理解される。図18に示される第2段階加熱器の実施形態は、ポーチ510の図2に示されるものとは反対側に加熱器を提供する。そのような配向は例示にすぎず、計器内の空間的制約によって決定され得る。第2段階反応ゾーン580が光学的に透明の材料で提供される限り、光検出器および加熱器は、アレイ581の左右に存在し得る。
制御し、したがって計器800の空気のすべてを制御する。加えて、計器内の空気式システムの多くは、他の実施形態においては、機械式アクチュエータ、圧力印加手段などと置き換えられ得る。コンピュータ894はまた、加熱器886および888、ならびに光学アレイ890を制御する。これらの構成要素の各々は、例示的にはケーブル891を介して電気的に接続されるが、他の物理的またはワイヤレス接続は本発明の範囲内である。コンピュータ894は、計器800内に収容され得るか、または計器800の外部にあり得ることが理解される。さらに、コンピュータ894は、構成要素の一部またはすべてを制御するビルトイン回路基板を含み得、光学アレイからデータを受信して表示するためにデスクトップまたはラップトップPCなどの外部コンピュータも含み得る。温度、サイクル時間などの情報および変数を入力するためのキーを含む、インターフェース、例示的にはキーボードインターフェースが提供され得る。例示的には、ディスプレイ892も提供される。ディスプレイ892は、例えば、LED、LCD、または他のそのようなディスプレイであり得る。
えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,645,758号および同第6,780,617号、ならびに米国特許出願第2014/0038272号を参照されたい。しかしながら、密封されたPCR器内での細胞溶解を含むことは、試験されるべき試料がバイオハザードを含有し得る場合には特に、使い易さおよび安全性を改善することができる。本明細書に例証される実施形態において、細胞溶解からの廃物、ならびにすべての他のステップからの廃物は、密封されたポーチ内に留まる。それでも、ポーチ内容物がさらなる試験のために取り出され得ることが理解される。
800は、ケーシングの壁を形成し得るか、ケーシング内に装着され得る支持部材802を含む。計器800はまた、ポーチ510の挿入および撤退を可能にするために、任意選択的に支持部材802に対して移動可能である第2の支持部材(図示されず)を含み得る
。例示的には、ポーチ510が計器800内へ挿入されると、蓋がポーチ510を覆い得る。別の実施形態において、両方の支持部材は、ポーチ510が他の機械的手段または空気圧によって適所に保持された状態で固定され得る。
れる。しかしながら、この配置は例示にすぎず、他の配置が可能であることが理解される。例示的な加熱器は、ブリスタ864の内容物および第2段階反応ゾーン580を熱サイクルさせるために、ペルチェ、ならびに当該技術分野において知られているような他のブロック加熱器、抵抗加熱器、電磁加熱器、および薄膜加熱器を含む。内袋822、844、846、848、864、866を有する内袋プレート810と、ハードシール838、843、852、853と、シール871、872、873、874とが、内袋組立体808を形成し、この内袋組立体808は例示的には、空気式アクチュエータがポーチ510と接触した状態で置かれるように、ポーチ510に向かって移動され得る移動可能な支持構造体に装着され得る。ポーチ510が計器800内へ挿入され、移動可能な支持部材が支持部材802に向かって移動されるとき、ポーチ510の様々なブリスタは、空気式アクチュエータの作動が、ポーチ510のブリスタのうちの1つまたは複数から液体を押し出し得るか、またはポーチ510の1つまたは複数のチャネルと共にピンチバルブを形成し得るように、内袋組立体810の様々な内袋および組立体808の様々なシールに隣接する位置にある。ポーチ510のブリスタおよびチャネルと組立体808の内袋およびシールとの関係は、図3により詳細に例証される。
イムは必ず、加熱器が各遷移において好適な温度に達するのにかかるのと少なくとも同じ長さである必要がある。加熱器の温度を変える必要がない場合にはランタイムは減少され得ることが理解される。図6〜図8は、第1段階PCR増幅の別の実施形態を示す。この例示的な実施形態において、ブリスタ548および564は、単一のブリスタ549と置き換えられ得、この例示的な計器は、加熱器986および987を含む温度制御要素を備え得る。しかしながら、ブリスタ548もしくは564のうちの一方が使用され得、より小さい加熱器986、987が使用され得ること、または、ブリスタ549が、細胞溶解および/もしくはさらなる増幅のための構成要素を含む場合と含まない場合があり得る他の実施形態と組み合わせて、単独で使用され得ることが理解される。加熱器986、987は、ペルチェ素子、抵抗加熱器、誘導加熱器、電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、当該技術分野において知られているような他の加熱器、または加熱器タイプの組み合わせ(例えば、ペルチェ熱電加熱器/冷却器デバイスおよび抵抗性加熱器を含む加熱器要素)であり得る。しかしながら、アニーリングと変性温度との間で熱サイクルするために提供される加熱器886とは異なり、1つの例では、加熱器986は、好適な変性温度、例示的には94℃で提供され得、加熱器987は、好適なアニーリング温度、例示的には60℃で提供され得るが、他の例示的な変性およびアニーリング温度が、当該技術分野において知られているように使用され得る。いくつかの実施形態において、加熱器986を94℃より高く設定し、加熱器987を60℃より低い温度に設定することは、流体が温度に達すると流体はこれらの加熱器の各々の制御によって循環され得、それによりランプ速度を増大させることから、望ましい場合がある。そのような実施形態は、高められたプライマーおよびポリメラーゼ濃度と共に使用するのに好適であり得る。例示的には、絶縁スペーサ983が、加熱器986と加熱器987との間に提供され得る。泡沫、プラスチック、ゴム、空気、真空、ガラス、または例示的には低伝導の任意の他の好適な材料を含む、任意の好適な絶縁材料が使用され得る。加熱器986および987が全体的に一定の温度に保持される実施形態において、ランタイムおよびエネルギー使用は、実質的に減少され得る。
549の上表面549bに係合する。流体がブリスタ549内へ移動されるとき、ワイパ989は、ワイパ989の本体913がブリスタ549を加熱器986、987と接触状態にさせ、それによりブリスタ549の一部分が加熱器の各々と接触状態にあるように移動されて、加熱器の各々からブリスタ549の一部分への熱伝達を可能にする。次いで、試料572をブリスタ549の1つのエリアからブリスタ549の別のエリアへと移動させるために、1つまたは複数のブレード949が使用され得る。
ントへの入口近くに留まり得るか、またはコンパートメントの内容物は完全には混合されないことがある。これは図8Aに概略的に例証されており、ここでは例証されたブリスタ549は、不規則な形状を取っており、加熱器986および987と十分な接触状態にない可能性がある。ブリスタ549の容積、追加される試料572の容積、試料の内容物などに応じて、流体572は不規則な形状をとり得、この流体の大部分は試料がブリスタ内に注入される場所の近くで集められている。これは、コンパートメントが拡張可能であり、かつ流体の添加の前は部分的もしくは完全に潰れている場合、または流体が、コンパートメントを完全に充填するのに十分な量よりも少ない場合がある他の状況において、特に当てはまり得る。試料572がチャネル552aを通ってブリスタ549に入り、チャネル552a近くに留まり、その結果、ブレード949の係合が試料572の大部分またはすべてをセクション549c内に閉じ込めるという実施形態を想像することが可能である。したがって、ブレードの係合の前に流体をコンパートメント全体に拡散させることが望ましい場合がある。したがって、図8Bに例証されるように、ワイパヘッド910は、それがブリスタ549に接触して試料572をブリスタ549全体に拡散させるまで下げられて、流体572をブリスタ549内に均一に分散させ、ブリスタ549に規則的な形状を取らせ、またブリスタ549を加熱器986および987と十分な一貫した接触状態になるように押圧し得る。
け、試料572をブリスタ549全体に拡散させる圧力部材981を備え得る。例示的には、部材981の使用には、いくつかのメリットがある。1つは、試料572のより多くが薄層内の加熱器986、987全体にわたって拡散され得ることにより、表面積対容積比を増大させ、それが試料572へのおよび試料572からの熱伝達を改善することになるということである。同様に、流体は迅速に熱サイクルされているため、すなわち、試料572の液体は加熱器986および987によって迅速に温度を上下されているため、液体をブリスタ549内の薄層内へ拡散させることが、任意の所与の温度における滞留時間を減少させ、試料のより多くがより素早く標的温度に達することを可能にし得る。また、ワイパ989の形状によっては、以下に論じられるように、部材981からブリスタ549への圧力が、試料572を拡散させ、その結果、ワイパ989のブレード949の係合がブリスタ549内の試料572を比較的均一または均整の取れた容積に分割する。ブレード949の係合前の部材981からの圧力は、試料572の一部をブリスタ549のセクションの各々の中へ押し込む。
例えば、圧縮可能または半圧縮可能材料で形成されるか、それを含む)。そのような材料は、圧縮可能または半圧縮可能な泡沫、プラスチック、もしくはゴムを含むか、またはより硬い材料であるが、部材981とワイパ本体913との間にばね荷重、エラストマー、もしくは他の付勢部材あるいは力を有し、それにより、試料572がブリスタ549内へ移動されるとき、試料572は、ブリスタ549全体に拡散されるが、部材981は、試料572に十分な空間を許すように適切に圧縮する。他の圧縮可能または半圧縮可能材料が、当該技術分野において知られているように使用され得る。代替的に、部材981は、実質的に剛性であり、試料572を押し込んでブリスタ549全体に拡散させるために部
材981と加熱器986、987との間に十分な空間のみを提供するような位置に設定され得る。
981を通って延在し、ワイパ989を4つのセクション945、946、947、948に分割するx形状のブレード949を有する。図8Cおよび図8Dに例証されるように、ワイパ989およびブレード949は、少なくとも2つのモードでブリスタに接触し得る。図8Cに例証されるように、ワイパ989は、部材981が部分的に圧縮され、かつブレード949がブリスタ549に部分的に衝突するまで下げられ得る。ワイパヘッド910が図8Cのモードで回転される場合、ブリスタ549の内容物572を完全に混合するための撹拌作用を提供するために、ブレード949の作用が使用され得る。
ブリスタ549に完全に衝突するように、ワイパヘッドがさらに下げられる場合、ブレードはブリスタを別々のセクションへと分割し得る。例えば、図7に例証されるように、x形状のブレード949では、ブレード949は、ブレード949がブリスタ549を対応する4つのセクション549a、549b、549c、549dに分割するように十分な圧力でブリスタ549に接触し得る。軸993の周りのワイパ989の回転は、ブリスタ549内の流体にブリスタ549の周りの円運動を強いる。1つの実施形態において、ブレード949は、加熱器986および987の各々によって同時に流体の部分が加熱されることを可能にし、流体の部分を一方の加熱器の温度制御から移動させながら、流体の他の部分が他方の加熱器の制御下にあるようにする。部材981は、ブリスタ549の内容物を圧縮する。したがって、ブリスタ549内に流体572を拡散させることおよびブリスタ549と加熱器986および987との接触を改善することに加えて、部材981はまた、ブリスタ549の内容物を別のブリスタへ投入し得る。例えば、第1段階熱サイクルが完了した後、出口チャネルが開放され得、それにより、部材981がその元の形状に戻る際に流体がブリスタから外へ流れるための通路を開放する。1つの実施形態において、流体は、チャネルと流体接続されているブリスタの象限からのみ外へ流れ得る。ワイパ989は、各象限が順に出口チャネルと接続されるように回転され得る。
スタ549をセクションに分割してブリスタ549内の流体を移動させるのには十分であるが、ブリスタ549を破裂または分裂させない硬さを有するTeflonもしくはDelrinなどの非粘着材料であり得るが、そのような材料は例示にすぎず、当該技術分野において知られているように他の材料が使用され得ることが理解される。ブレード949は、代替的に、ローラまたはブリスタ549内の流体の移動を可能にするための他の構成によって置き換えられ得る。ワイパ989およびブレード949を含むワイパヘッド910は、所定位置に移動され、当該技術分野において知られているように、任意のモータ、カム、クランク、ギア機序、油圧、空気、または他の手段によって回転され得る。そのような移動は、連続的であり得るか、またはワイパ989およびブレード949は、例示的には0.1秒から1分以上の間を置いて段階的に移動され得、これにより、次の位置に移動される前に試料の部分を加熱器986、987の各々の制御内に保持し、試料の異なる部分を加熱器986、987の各々の制御内に保持する。ワイパ989の運動は、時計回りもしくは反時計周りの円状運動であり得るか、または時計回りと反時計回りとを交互に方向を逆転し得る。ワイパ本体913およびブレード949は、単一の固定ユニットであり、単一の固体ユニットとして移動し得るか、または本体913は、ブレード949の移動とは独立してブリスタ549と接触状態および非接触状態になるように移動され得ることが理解される。ブリスタ549の円形形状および回転運動は例示にすぎず、他の試料器形状が可能であり、線運動、曲線運動、および半円運動などのブレードまたはローラの非回転運動も可能であることも理解される。ワイパの特定の実施形態の追加の特徴は、図11A〜Bを参照して説明される。
れにより、図6において最もよく見られるように、ワイパを4つのセグメント945、946、947、948に区分けし、また同様に、図7において最もよく見られるように、ブリスタ549を4つのセグメント549a、549b、549c、および549dに分割する。しかしながら、これは例示にすぎず、例示的にはブリスタ549の直径に実質的に対応する単一の線形ブレード、s形状のブレードもしくはらせん状のブレードを含む単一または複数の非線形ブレード、ブリスタ549の半径に対応する単一のブレード(時計の針に類似している)、およびブリスタ549を複数のセグメントに分割する複数のブレードなど、いかなる形状のブレード949も使用され得ることが理解される。ブリスタ549を複数の同様のセグメントに分割するブレードは、全セグメントが同時にアニーリングおよび変性温度にあるという異なるセグメント間のより制御された加熱を提供する傾向がある一方で、s形状、らせん状、および放射状のブレードは、複数の旋回流(vortex)、渦(eddy)、および様々な混合パターンを生成して、加熱器986、987によって作成される熱表面にわたって試料を移動させることが理解される。より少ないブレード材料は、試料のより多くが加熱器と緊密な接触状態にあることを可能にするが、より多くのブレード材料は、流体移動をよりうまく制御することが理解される。ブレードパターンが何であるにしろ、ブリスタ549内の流体の部分がアニーリング温度にある一方で、他の部分は変性温度にあるということ、またさらに他の部分は温度間の遷移にあり得、すべてが単一の試料容器内にあることが理解される。ブレード949の形状の選択は、ブリスタのサイズおよび厚さならびに加熱器のサイズと、第1段階熱サイクルが完了した後にブリスタ549から材料を排出するためにワイパ989を使用することの望ましさとに依存し得る。
の平坦表面に対してブリスタ549が押圧され得る。しかしながら、これは例示にすぎず、加熱器986、987は、試料均質性のために混合することを助けるためにテクスチャ表面を提供し得ることが理解される。
例示的にはそれぞれ94℃および60℃で提供され得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、加熱器986および987の温度を使用中に調節することが望ましい場合がある。例えば、試料が最初にブリスタ549に導入されるときに一方または両方の加熱器の温度を上昇させて、流体がブリスタ549に入る際に流体の冷却器温度を補うことが望ましい場合がある。以下の説明に適用可能な別の例において、加熱器がブリスタ内の流体の標的温度をより迅速に達成することを可能にするために加熱器を「過熱状態にする」ことが望ましい場合がある。例えば、熱サイクルの標的温度が94℃および60℃である場合、加熱器は、試料内の流体をより迅速に加熱および冷却するために、高い方の温度より上(例えば95〜110℃の範囲内)および低い方の温度より下(例えば59〜50℃の範囲内)に設定され得る。加えて、2つの加熱器が示されるが、任意の数の加熱器が使用され得る。1つの例示的な例は、3つの加熱器を使用し、1つは変性温度に設定され、1つはアニーリング温度に設定され、3つ目は延伸温度に設定されている。別の例示的な例においては、第1の加熱器は、第2の加熱器よりも大きい場合があり、その結果、試料はサイクルのより長い部分にわたって第1の温度のままである。さらには、ブリスタ549およびその内容物は、静止したままであり得、加熱器986、987が、回転されるかまたは横方向に移動され得ることが理解される。
酸抽出ゾーンからチャネル552aを通ってブリスタ549に入り得、次いでチャネル552aが閉じられ得る。次いで部材981がブリスタ549を押圧して、ブリスタ549の加熱器986および987との接触を促進し、次いでブレード949が、加熱器986、987に向かって移動され、ブリスタ549をセグメント549a、549b、549c、および549dに分割する。ワイパ989が回転されると、4つのセグメント549a、549b、549c、および549dの各々の中の試料は、加熱器986との接触から移動されて、加熱器987と接触し、再び元に戻る。セグメントの各々の中の試料を加熱および冷却するために必要とされる時間量は、ブリスタ549上のフィルムの厚さ、ブリスタ549内の流体層の厚さ、ブリスタ549内の試料の混合、および加熱器との接触量などのいくつかの因子に依存する。しかしながら、この例示的な実施形態においては、ワイパ989の1回の完全な回転は、概して、PCRの1つのサイクルに対応することが理解される。
的核酸の十分な複製が存在するようにさせるためには、ブリスタ549における十分な容積の試料で開始する必要があり得る。例示的には、ブリスタ549は10μL〜1mL、例示的には25μL〜200μLの流体を含有するが、システムの構成に応じて他の容積が適切であり得る。任意選択的に、数サイクル後、例示的には2〜10サイクル後、標的核酸の量がいくらか増幅されたとき、チャネル552a(または別のチャネル)が開放され得、本体913が、加熱器986、987のより近くに移動されてブリスタ549を絞り、それにより流体の一部分を、チャネル552aを通じてブリスタ549から排出し得る。次いでチャネル552aは閉じられ得る。試料の少なくとも一部分はまた、s形状のブレードのようにブレード949が試料の少なくとも一部分を外向きに押し込むように形作られる場合には特に、ブレード949の運動によって排出され得る。例示的には、試料容積の5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、もしくは50%以上、またはこれらの間の任意の量が取り除かれ得る。圧縮可能または半圧縮可能部材981が使用される場合、加熱器986、987に向かう本体913の運動は、試料容積の適切な低減を達成するためにこの圧縮を補うように調節される必要があり得ることが理解される。ブリスタ549内の流体の容積がここで低減されるため、流体を適切な温度にするために加熱器986、987の各々との接触に必要とされる時間は少なくなり得、またワイパ989回転の速度が増大され、それによりサイクル時間を減少させ得る。例示的には、試料容積が50%低減されるとき、サイクル時間は25〜50%減少され得る。1つの例では、試料容積が50%低減されると、サイクル時間は約35%減少された。さらに数サイクル後には、容積のさらなる低減が、それに対応するサイクル時間の減少を伴って、発生し得る。複数回の低減、例示的には1〜5回の低減が発生し得る。効率的な反応が各サイクルで標的配列を本質的に倍増させることが理解される。したがって、いくつかの実施形態において、より高速のランタイムを得るために早いサイクルにおいて一部の試料容積を失うことは、優れたトレードオフであり得る。
をブリスタ549から排出するため)用いられ得る別の実施形態を示す。この実施形態において、ワイパ1089は、2つのアーム1049aおよび1049bを有するブレード1049を備える。図9aに示されるように、2つのアーム1049aおよび1049bは、直線的配置で提供され、したがってブリスタ549を2つの実質的に均等な半体に分割する。矢印によって示されるように、ブレード1049は、時計回り方向に移動され得るが、上に論じられるように、他の運動が可能である。しかしながら、この実施形態において、アーム1049aおよび1049bは、独立して移動され得る。容積を低減するために、アーム1049bは、アーム1049aに向けて回転されて所望の場所に達し得る。この移動は、本体913を加熱器986、987から離れる方へ移動させることを伴って、または伴わずに行われ得る。ワイパ1089がこの移動の間に加熱器986、987から引き込まれる場合、本体913は、この移動が完了した後に加熱器986、987の方へ戻るように移動され得る。図9bに最もよく見られるように、アーム1049aおよび1049bが所望の位置にある状態になると、チャネル552aが開放され得、またブレード1049aおよび1049bが、例示的には図9bの矢印に示される方向にあるブレード1049bを図9cの位置に達するように移動させることによって、互いから離れる方へ移動され得る。約100度の回転が図9cに示されるが、これは例示にすぎず、容積の適切な低減を達成するため、またはブリスタを空にするために、回転の量は調節され得る。アーム1049aおよび1049bの一方または両方は、この容積低減を達成するために移動され得ることが理解される。次いで、チャネル552aは密封され得、アーム1049aおよび1049bは、それらの直線的配置に戻るように移動され得、熱サイクルは継続し得る。
ずれかと共に、または多種多様な試料器および加熱構成を使用する他の実施形態と共に使用され得ることが理解される。容積を低減しサイクル時間を減少させるこの方法は、生のPCR成分の導入と組み合わせて使用され得ることも理解される。そのようなことは、組み合わせたRT−PCR反応が所望されるとき、またはそのような追加がネステッド増幅のためもしくはユニバーサルプライマーとの使用のためのプライマーを含み得る場合に有用であり得る。
にブレード949が湾曲しているときは、ワイパ989の方向は、流体をブリスタ549からチャネル562a内へポンピングするように使用され得る。代替的に、ブリスタ549は、ブリスタ549がPCR反応物を受容した後に密封されるように、試料を熱サイクルさせるためのスタンドアローン容器であり得る。ブリスタ549は、熱サイクルを必要とする様々な試料タイプのいずれかのために使用され得る。
間で移動させるために、図6〜図9Cに例証される加熱器デバイスと一緒に使用され得るワイパシステム1000の実施形態を例証する。ワイパシステム1000は、シャフト1070およびコネクタ1060によって回転モータ1030に取り付けられ得るワイパヘッド1010を含む。回転モータ1030は、支持体1040に結合され得、モータ1030およびワイパヘッド1010は、支持体1040上、例えば、レール1050上を矢印1020によって示されるように上げ下げされ得る。ワイパシステム1000は、加熱器986、987(図6〜図7に示される)の上に装着され得、それらの間には試料ブリスタが挿入される空間がある。
基部1080の下に置かれ得るように計器に装着され得る。1つの例では、ヘッド1010およびモータ1030組立体は、流体充填されたブリスタに接触するために基部1080を過ぎて下げられ得る。モータ1030は、ワイパヘッド1010が流体充填されたブリスタの内容物を移動させることができるように回転され得る。流体充填されたブリスタが別個の加熱ゾーン(例えば94℃のゾーンおよび60℃の別個のゾーン)を有する加熱器デバイス(例えば加熱器986および987)と接触状態にある場合、モータ1030およびワイパヘッド1010は、ワイパヘッド1010のブレードがブリスタを別個の分離した容積に分割するように下げられ得、また図6〜図9Cを参照して上に説明されるように、PCRのための熱サイクルために、流体充填されたブリスタの内容物を移動させるために使用され得る。
よび混合器システムはまた、封入されたポーチ内での自動化された試料調製のために使用され得る。例えば、以下にさらに詳細に説明されるように、549のようなブリスタを加
熱器986および987のうちの一方または両方を用いて加熱しながら、混合器システム1000を用いて試料調製ブリスタの内容物を混合することは、細胞(例えばバクテリア細胞および哺乳動物細胞)を溶解し、その中の核酸を解放するために使用され得る。代替的に、または加えて、ブリスタは、カオトロピック試薬、洗剤、および/または溶解ビーズを含み得る(例えば、図1のポーチ510の溶解ブリスタ522を参照されたい)。同様に、熱電冷却デバイス(すなわち、ペルチェ素子)を用いて加熱および冷却して、混合することが、他の試料調製プロセスの効率を増大させるために使用され得る。例えば、核酸は、より低い温度(例えば約0〜10℃)でより効率的に磁気ビーズ(例えば図1の磁気ビーズ533)に結合し、より高い温度(例えば約60〜90℃)でより効率的に磁気ビーズから溶出される。したがって、溶解は、例示的には、ブリスタ549が加熱器/冷却器986と接触状態にあるときに発生し得るが、磁石ビーズ結合は、例示的には、ブリスタ549が加熱器/冷却器987と接触状態にあるときに発生し得、これらの加熱器は、図12〜図13を参照して以下に論じられるように、横方向に移動し得る。
いて含まれ得るワイパヘッド1100の実施形態が例証される。ワイパヘッド1100は、例えば、ワイパヘッドの遠位端であるチャック1170を介して図10のワイパシステム1000のシャフト1070に取り付けられ得る。ワイパヘッド1100の近位端は、ワイパブレード1149を有するワイパ本体1110を含む。ワイパヘッド1100はまた、ばね部材1140と、上体1160の上方部分をワイパ本体1110に結合するピン、ねじ、または同様のものなど1150とを含む。1つの実施形態において、ワイパヘッドは、ワイパヘッド1110およびワイパブレード1149が流体充填されたブリスタに対して加えることができる圧力量をばね部材1140が調整することができるように構成され得る。
間の象限内に設置される圧力部材1181a〜1181dを含み得る。1つの実施形態において、圧力部材1181a〜1181dは、図8A〜図8Dに関連して説明される圧力部材981のように機能するように一緒に働き得る。すなわち、圧力部材1181a〜1181dは、ワイパブレード1149が流体充填されたブリスタと接触状態にされるときに圧力部材1181a〜1181dが一貫した予測可能な圧力を印加することができるように、ワイパブレード1149に対して位置付けられ得る。しかしながら、図11Bを参照すると、流体充填されたブリスタに圧力を印加するために圧力部材1181a〜1181dがワイパブレード1149に対して配備されるか、移動されるか、または下げられ得る別の実施形態が例証される。例証された例において、圧力部材1181a〜1181dは、ブレード1149および圧力部材1181a〜1181dが流体充填されたブリスタに対して実質的に平坦の表面を提示するまでワイパヘッド1100を下げることによって配備され得る。1つの実施形態において、圧力部材1181a〜1181dは、ワイパヘッド1100を、ワイパブレード1149がブリスタに接触する地点を過ぎて下げることによって配備され得、ワイパヘッド1100を下げ続けることにより、ワイパブレード1149を上に圧迫すること、および/または圧力部材1181a〜1181dを下に押圧することができる。ばね部材1140は、ブレード1149に対する圧力の量を調整するように構成され得、圧力部材を配備するためにプランジャヘッド1110が必要とされる。ワイパブレードおよび圧力部材が実質的に平面の表面を形成するまでワイパヘッド1100を下へと下げることは、例えば、液体をブリスタ内に均質に拡散させるため、または液体を1つのブリスタから別のブリスタへと投入するために使用され得る。別の実施形態(図示されず)において、圧力部材は、例えば、流体充填されたブリスタに圧力を加えてブリスタとその下の加熱器との間の接触を改善するために、同様の機序によって中間位置に配備され得る。1つまたは複数の実施形態において、ワイパヘッド1100は、ブレード1149および圧力部材1181a〜1181dが流体充填されたブリスタに印加できる圧力の量を調節または調整するために、ワイパブレード1149および/または圧力部材1181a〜1181dに関連付けられる複数のばね部材タイプを含み得る。
ワイパシステム1000の特徴、図11Aおよび11Bを参照して論じられるワイパヘッド1100、ならびに図6の加熱器986および987の特徴の多くを含む、計器1200が例証される。例示的な例において、計器1200は、ヒンジ付きカバー1210およびシャーシカバー1220を含む。ヒンジ付きカバー1210は、ヒンジ付きカバー1210とシャーシカバー1220との間の計器内への自己完結型PCRのための可撓性ポーチの挿入のために開放され得る。シャーシカバー1220は、計器1200の内部構成要素の上に横たわり、計器内に図14Aに例証されるもののような可撓性ポーチを位置付けるための受け口を画定し得、ここでは受け口は、ポーチの一部分と同一の広がりをもつ。以下にさらに詳細に説明されるように、受け口は、計器内に可撓性ポーチを受容し、計器の様々な構成要素が可撓性ポーチと相互作用できるように可撓性ポーチを整列させるように構成され得る。同様に、受け口は、計器の内部構成要素が可撓性容器に接触できるように開口部および同様のものを含み得る。同様に、ヒンジ付きカバー1210は、計器の外部構成要素が可撓性容器と相互作用できるように開口部および同様のものを含み得る。カバー1210および1220の上に、計器1200は、駆動モータ1030および先に説明したワイパヘッドを含むワイパシステム1000と、蛍光データの収集のためのカメラ/蛍光光度計1250および取付部1260とを含む。先の例において、ワイパシステムは、ポーチに接触するために、基部1080内の孔1240を通り、かつヒンジ付きカバー1210内の1つまたは複数の孔を通って、矢印1020によって示されるように上下に移動され得る。
1230上を左右に移動され得、それによりワイパシステム1000は、計器1200内に挿入されるポーチの異なる領域に接触することができる。1つの実施形態において、ワイパシステム1000は、ワイパ1100がポーチの異なる部分と相互作用することができるように移動され得る。例えば、以下にさらに詳細に説明されるように、ワイパシステム1000は、ポーチ内試料調製および第1段階PCRステップのために使用され得る。代替的な実施形態において、ワイパシステム1000は、静止状態に保持され得、ポーチは、ワイパがポーチの異なる部分に接触することができるように移動され得る。しかしながら、この配置は例示にすぎず、ワイパ、加熱器、および試料容器を移動および整列させる他の配置が企図されることが理解される。ワイパ、加熱器、およびポーチの任意の組み合わせが、移動可能な要素の上に置かれ得ること、ならびにワイパ、加熱器、ポーチ、および同様のものの移動が論じられるとき、そのような移動は、任意の実施形態においては、移動可能な要素と協働するワイパ、加熱器、またはポーチの反対の移動と置き換えられ得、この任意の実施形態では、そのような反対の移動が他の要素の配置と一致することが理解される。いくつかの実施形態において、ポーチおよび他の計器要素の回転運動も企図される。
とができるようにカバー1210および1220が取り除かれている。計器1200の内部は、例示的には、例えばレール1292上を、矢印1294によって示されるように移動装置によって前後に移動され得る加熱器組立体1270を含む。加熱器組立体1270は、第1の加熱器要素1286および第2の加熱器要素1287を含む。例証された実施形態において、加熱器組立体は、例示的には駆動モータ1296および駆動部材(例えば、ねじ付き釘)1298を含む移動装置に機械的に結合され得る。加熱器組立体1270は、加熱器1286および1287が計器内に据え付けられたポーチの異なる領域と相互作用することができるように、例えばレール1292上を前後に移動され得る。しかしながら、モータおよびレールは例示にすぎず、他の線形および非線形移動装置が使用され得ることが理解される。図6〜図9Cを参照して上に詳細に論じられたように、加熱器組立体は、ブリスタの部分(例えば、第1段階PCRブリスタ)が、図6〜図8に示されるものに類似して、同時に第1の加熱器要素1286および第2の加熱器要素1287の温度制御下にあることができるように位置付けられ得る。同様に、全ブリスタが、1つの加熱器によって一度に制御され得、ブリスタ(例えば、第1段階PCRブリスタまたは第2段階PCRブリスタ)は、選択されたブリスタが第1の加熱器1286および次いで第2の加熱器1287などの温度制御下に繰り返してあるように移動装置を用いて加熱器組立体1270を前後に移動させることによって熱サイクルされ得る。例証された実施形態は移動することができる加熱器を含むが、加熱器組立体を移動させる代わりに加熱器に対してポーチを移動させることによって同じ効果が達成され得ること、およびこの運動が、例えば、線状経路、弓線状経路、または回転経路に沿っていてもよいことを理解するものとする。
電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、または当該技術分野において知られているような任意の他の加熱器であり得る。加熱器タイプはまた、単一のユニット内で組み合わされ得る(例えば、加熱器ユニットは、一定温度を維持するのを助けるためならびに/または加熱および冷却の効率および速度を増大させるために、ペルチェの前および/または裏側に抵抗性加熱器を有するペルチェ素子を含み得る)ことを理解するものとする。「加熱器」という用語は、要素1286および1287を指すために使用されるが、試料の温度を調節するために他の温度制御要素または要素の組み合わせが使用され得ることが理解される。アニーリングと変性温度との間を熱サイクルさせるために提供されるPCRデバイス内に典型的に含まれる加熱器とは異なり、加熱器1287および1286は、一定温度に保持され得るか、または限られた温度範囲内(例えばアニーリング温度と延伸温度との間)で熱サイクルされ得る。例えば、図6〜図9Cを参照して上に詳細に説明されるように、試料は、液体充填されたブリスタの内容物を2つの静温度ゾーン間で移動させることによって熱サイクルされ得る。1つの例では、加熱器1287は、好適な変性温度、例示的には94℃で提供され得、加熱器1286は、好適なアニーリング温度、例示的には60℃で提供され得るが、当該技術分野において知られているように、他の例示的な変性およびアニーリング温度が使用され得る。また、特定のプロトコルには3つ以上の加熱器が望ましい場合がある。
、ペルチェ素子を含み得る。加熱器1286および1287は熱サイクルされない場合があるが、例えば、加熱器1286および1287の一方または両方にペルチェ素子を含むことが望ましい場合がある。典型的な抵抗加熱器とは異なり、ペルチェ素子は、試料をアクティブに冷却ならびに加熱することができる。例えば、試料を変性温度(例えば94℃)からアニーリング温度(例えば60℃)へ移す際、試料は、アニーリング温度まで冷まされなければならない。これは、放熱/伝導によって起こるが、これらのプロセスは比較的緩徐である。迅速な熱サイクルのため、例えば、60℃に設定されたペルチェの「冷たい」側面と、より高い温度に設定され得る「熱い」側面とを有するペルチェ素子を用いて試料をアクティブに冷却することが好ましい場合があり、この「熱い」側面において、余熱は、例示的にはヒートシンクによりポンピングされ処理され得る。
イクルパラメータ(例えば、ワイパの移動、加熱器の温度、試料容器とワイパおよび加熱器との整列など)、試料容器内の流体移動などのうちの1つまたは複数を制御するように構成され得るコンピュータ1299を含む。同様に、コンピュータ1299は、光学システム1250からなど計器1200からのデータ取得および分析のために構成され得る。
これらの構成要素の各々は、例示的にはケーブル1291を介して電気的に接続されるが、他の物理的またはワイヤレス接続は本発明の範囲内である。コンピュータ1299は、計器1200内に収容され得るか、または計器1200の外部にあり得ることが理解される。さらに、コンピュータ1299は、構成要素の一部またはすべてを制御するビルトイン回路基板を含み得、計器1200からデータを受信して表示するためにデスクトップまたはラップトップPCなどの外部コンピュータも含み得る。温度、サイクル時間などの情報および変数を入力するためのキーを含む、インターフェース、例示的にはキーボードインターフェースが提供され得る。例示的には、ディスプレイも提供され得る。ディスプレイは、例えば、LED、LCD、または他のそのようなディスプレイであり得る。
る。計器1300は、多くの点において計器1200に類似しているが、但し計器1300は2つの混合器/ワイパを有するワイパシステム1305を含む。したがって、1つの実施形態において、ワイパ/混合器が計器1300内に据え付けられたポーチの異なる部分と相互作用することができるようにワイパを水平に移動させる必要がない場合がある。
と第1および第2のワイパヘッド1100aおよび1100bとを含むワイパシステム1305を含む。この計器はまた、第1および第2のカバー1315および1320と、カメラ1325と、カメラ支持体1330とを含む。これより図13Bを参照すると、計器1300は、レール1350上を水平に移動され得る加熱器システム1335と、第1および第2の加熱器要素1386および1387とをさらに含む。「加熱器」という用語は、要素1386および1387を指すために使用されるが、試料の温度を調節するために他の温度制御要素または要素の組み合わせが使用され得ることが理解される。加熱器システム1335は、加熱器システムの移動のために駆動モータ1360および駆動部材1365に機械的に結合される。例示的には、加熱器1386は、約90〜95℃の範囲内の温度で提供され得、加熱器1387は、約55〜65℃の範囲内の温度で提供され得るが、他の温度および配置が可能である。
よび1387、熱サイクルパラメータ(例えば、ワイパの移動、加熱器の温度、試料容器とワイパおよび加熱器との整列など)、試料容器内の流体移動などのうちの1つまたは複数を制御するように構成され得るコンピュータ1399を含む。同様に、コンピュータ1399は、光学システム1325からなど計器1300からのデータ取得および分析のために構成され得る。これらの構成要素の各々は、例示的にはケーブル1399を介して電気的に接続されるが、他の物理的またはワイヤレス接続は本発明の範囲内である。コンピュータ1399は、計器1300内に収容され得るか、または計器1300の外部にあり得ることが理解される。さらに、コンピュータ1399は、構成要素の一部またはすべてを制御するビルトイン回路基板を含み得、計器1300からデータを受信して表示するためにデスクトップまたはラップトップPCなどの外部コンピュータも含み得る。温度、サイクル時間などの情報および変数を入力するためのキーを含む、インターフェース、例示的にはキーボードインターフェースが提供され得る。例示的には、ディスプレイも提供され得る。ディスプレイは、例えば、LED、LCD、または他のそのようなディスプレイであり得る。
計器1200および1300において使用され得る可撓性ポーチまたは化学作用カードの実施形態が説明され(図14A)、試料調製、第1段階PCR、および第2段階PCRのために計器1200および1300によって実施され得る動作の手順が図15A〜図15Fに説明される。
出が発生し得るいくつかのゾーンまたはブリスタを含む実質的に平面の領域1402を含む。1つの実施形態において、ポーチ1400は、ポーチ1400を形成するために一緒に密封されるいくつかの材料層(同じ材料の層または異なる種類の材料の層)から製作され得る。図14Bでは、線B−Bに沿った層を例証する切断が示される。例示的なポーチは、第1のフィルム層1490、感圧性接着剤層1492、カード層1494、第2の感圧性接着剤層1496、および第2のフィルム層1498を含む。1つの例示的な例において、ポーチ1400内のブリスタエリアは、カード層1494内に適切な切欠きを作製することによって形成され得る。代替的に、ポーチのブリスタエリアは、フィルム層(例えばフィルム層1490および1498)を、カード層ありまたはなしの液体ブリスタとしての役割を果たす層間に開放空間を残して一緒にラミネートまたは溶接することによって形成され得る。他の構成が可能であることを理解するものとする。例示的なブリスタエリアは可撓性であるが、カード層1494は任意選択的に、より可撓性が低い場合があり得、また剛性であり得、さらには可撓性試料容器の部分であり得ることが理解される。したがって、「可撓性ポーチ」は特定のゾーンにおいてのみ可撓性である必要があることが理解される。充填チャネル1440〜1460、およびブリスタエリア1465〜1485を接続するチャネルは、第1の感圧性接着剤層1492もしくは第2の感圧性接着剤層1496のいずれかにおいて適切な切欠きを作製することによって、またはカード層1494内にチャネルを提供することによって形成され得る。代替的に、または加えて、ブリスタエリア間のフローチャネルは、フィルム層1490の上またはフィルム層1498の下に別のフィルム層を追加して、層間に開放したブリスタエリアおよびチャネルを残してそれらの層を一緒に溶接することによって形成され得る。
1に説明されるポーチ510に類似した可撓性プラスチックフィルムまたは他の可撓性材料から形成され得る。例えば、ポーチ1400は、限定されるものではないが、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレートなどの材料、押し出し加工、プラズマ蒸着、およびラミネーションを含む当該技術分野において知られている任意のプロセスによって作製され得るそれらの組み合わせ、混合物、およびラミネートされる層から製作され得る。同様の材料(例えばポリカーボネート)がカード層1494のために使用され得る。アルミニウムラミネーションを有する金属箔またはプラスチックなどの他の材料も使用され得る。ブリスタおよびチャネルを形成するために一緒に密封され得る他のバリヤ材料が、当該技術分野において知られている。プラスチックフィルムが使用され得る場合、層は、例示的にはヒートシールによって、一緒に結合され得る。例示的には、この材料は、核酸結合力が弱い。蛍光検出が使用される場合、光学的に透明の材料がポーチの適切なエリア(例えば第2段階アレイの付近)において使用され得る。
る核酸を含有する試料がポーチ1400内へと導入される場所である試料調製ブリスタ1405を含む。ポーチは、第1段階PCRブリスタ1410、第2段階PCRの前に第1段階PCRからの生成物の一部分を測定するための容積測定ウェル1415、および第2段階PCRのための反応ウェル1430のアレイをさらに含む。容積測定ウェル1415はまた、第2段階PCRのための試薬が導入される場所である試薬ブリスタ1425と、混合ブリスタ1420とに流体結合され得る。第2段階PCRのための試料は、ブリスタ1420とブリスタ1425との間の容積測定ウェル1415の内容物を繰り返し混合することによって調製され得る。第2段階アレイ1430はまた、廃物受け口1435に流体接続され得る。代替的に、ブリスタ1410は、試料調製および第1段階PCRの両方に使用され得、ブリスタ1405は、例えば試料調製廃物のための廃物受け口として使用
され得る。試料および試薬をポーチ1400内に導入するための手段は、図14Aには例証されないが、図1の金具590に形態が類似したデバイスが、ポーチ1400内への試料および試薬の導入のためにポーチ1400に差し込まれて使用され得ることを理解するものとする。同様に、密封可能ポート(図示されず)が、ポーチ1400内への試料の導入のために提供され得、1つまたは複数の密封可能ポートは、液体試薬または水和緩衝液の導入のために提供され得る。加えて、ポーチ1400は、金具内の脱水された(例えば凍結乾燥された)試薬、またはポーチの使用前に好適な水和緩衝液により脱水され得る同様の構造体を含み得る。
イ1500がより詳細に例証される。アレイ1500は、スタンドアローンアレイであり得るか、またはアレイ1430の一部などより幅広のアレイの一部として含まれ得る。アレイ1500は、個別のウェル1510a〜1510eを含む。ウェル1510a〜1510eの各々は、第2段階PCR反応に使用され得る。例証される実施形態において、ウェル1510a〜1510eは、充填チャネル1520に流体接続され、孔1530a〜1530eは、ウェルの各々を充填するために充填チャネル内に形成される。1つの実施形態において、ウェル1510a〜1510eは、1565に例証される領域内または領域周辺にシール(例えばヒートシール)を適用するかまたは圧力を印加することによって、充填チャネル1520から、および互いから封止され得る(すなわち、ウェル間のクロストークを防ぐことができる)。したがって、単一のシール1565が、ウェル1510a〜1510eを充填チャネル1520からおよび互いから閉鎖し得る。アレイ1500の横断面構造およびウェルを充填するためのフローパスは、以下に図15Bおよび図15B’に例証される。アレイ1500は充填チャネル1520と関連付けられた5つのウェル1510a〜1510eを有して例証されるが、より多くのまたはより少ない反応ウェルが充填チャネルと関連付けられ得ること、および複数の充填チャネルがウェルの複数のクラスタに流体接続され得ることを理解するものとする。複数のアレイ1500は、より大きなアレイを作成するために組み合わせて使用され得る。
に沿って例証される。ウェル充填システムの2つの異なる実施形態の断面図が示される。図15Bおよび図15Cに断面で例証されるアレイ1500の部分は、図14Bに示されるものに類似した層でできているが、アレイ1500は、図14Aに示されるポーチ1400の一部として含まれ得ることに留意されたい。アレイ1500は、第1のフィルム層1535、第2のフィルム層1540、接着剤層1545、アレイのウェル1510が中に形成され得るカード層1550、第2の接着剤層1555、および第3の(外側の)フィルム層1560から製作される。
フィルム層1540との間に液体が流れることができる空隙を残すことによって形成され得る。図15Cは、第1のフィルム層1535cと第2のフィルム層1540cとの間に空隙を残すことによって形成される類似した充填チャネル1520cを示す。充填チャネルは、第1および第2のフィルム層をアレイの周りで一緒に密封する溶接線1570または1570cによって画定され得る。これらの溶接1570がどのように適用されるかの例は図15Aに示される。図15Bでは、充填孔1530は、第2のフィルム層1540および第1の接着剤層内に選択的な切欠きを作製することによって形成され得る。図15Cでは、充填孔1530cは、第2のフィルム層1540c内に選択的な切欠きを作製することによって形成され得る。
上を流れるウェル充填チャネルは、カード層内に切欠き1575、および接着剤層155
5内に切欠き1580を作製することによって形成され得るが、これらのチャネル形成する他の方法が可能である。図15Bのウェル充填チャネルの設計は、例えば、フローパスが入り組んでいることが理由でウェル間のクロストークを抑制するのを助け得る。同様に、充填チャネル1520および充填孔1530が2つのフィルム層1535および1540間に形成されるため、充填孔1530およびアレイ1500は、例示的にはヒートシールデバイスを用いて、または圧力によって、例示的にはアレイ1500に対して膨張する内袋によって、密封され得る。図15Cでは、ウェル充填チャネルは、ウェル1510c内へ直接流れ、充填孔1530cをウェル1510cに流体接続する第1の接着剤層1545c内の切欠き1585cを作製することによって形成され得る。図15Cの充填設計はまた、ウェル間のクロストークを全体的に抑制することが期待される。しかしながら、図15Cの設計は、例示的には、圧力のみよりもより良好な密封を提供し得るヒートシールデバイスを用いて密封され得る。1つの実施形態において、第2段階アレイのウェル(例えばウェル1510)は、流体を充填チャネル1520からウェル1510内へと引き入れることを促進するために部分真空下にあり得る。別の実施形態(図示されず)において、第2段階アレイのウェルは、ポーチおよびアレイを真空下に維持する必要なく流体が充填チャネル1520からウェル1510内へと流れることができるように、空気および過剰流体を逃がすための出口孔および下流廃物受け口を含み得る。
び第2段階PCRのためにポーチ1400を使用して計器1300によって実施され得る例示的な動作の手順が説明される。図13Aに描写されるカバー1315および1320は明確性のために取り除かれているが、それらは通常、計器が動作中の間は適所にあり、ポーチ1400は、例示的には、ポーチをワイパ、加熱器、および同様のものに対して位置付けるために外側カバーと内側カバーとの間に挿入されることに留意されたい。図16Aでは、試料はすでにポーチ1400に添加されており、ポーチが計器1300内に位置付けられていることが理解される。しかしながら、いくつかの実施形態において、本計器は、ポーチが計器内にあるときに試料をポーチ内へ注入するように構成され得る。以下にさらに詳細に説明されるように、試料は、充填チャネル1440を介してブリスタ1405内に導入され得、それは図14Aに例証される。第1のステップにおいて、加熱器組立体1335は、加熱器要素が加熱および冷却された試料調製のためのブリスタ1405と接触状態にあるように移動され得る。この図では、加熱器要素1386および1387は見えないが、例えば、加熱器要素1386は、加熱器組立体1335がレール1392に沿って移動され、それより試料が細胞溶解のために加熱され、磁気ビーズでの核酸回収のために加熱器1387によって冷却され(例えば約5〜10℃)、磁石ビーズ洗浄ステップのために加熱器1387によって冷却され(例えば約5〜10℃)、磁気ビーズからの溶出のために加熱器要素1386によって加熱される(例えば約50〜60℃)ように位置付けられ得る。図16Bでは、ワイパヘッド1100aは、ワイパブレード(図示されず)がブリスタ1405に接触するまで下げられ得る。次いで、ワイパヘッド1100aは、モータ1310aと一緒に回転され得、加熱およびかくはんの組み合わせは、大部分の細胞およびウイルスタイプを効果的に溶解するのに十分であり得る。しかしながら、混合装置は溶解のために描写されるが、この混合装置は、限定されるものではないが、超音波処理デバイス、ビードビーターモータ、凍結/解凍機序、パドルビーター、レーザ溶解、スリッププレートハンマー機序、ハンマードリルビーター機序、ホモジナイザ、それらの組み合わせ、または当該技術分野において知られている別の細胞溶解装置などの溶解のための他の手段と置き換えられ得ることが理解される。試料調製は、省かれるか、または前もって実施され得、このステップが省かれ得ることも理解される。
ワイパヘッド1800の実施形態が例証される。ワイパヘッド1800は、ワイパヘッド1100に類似しているが、但しワイパヘッド1800は、細胞溶解物から核酸を回収す
るための本明細書に説明されるいくつかの実施形態に使用され得る磁気ビーズを選択的に隔離するために使用され得る磁石システムを含む。ワイパヘッド1800の近位端は、ワイパブレード1849を有するワイパ本体1810を含む。ワイパヘッド1800はまた、外側ばね部材1850、上体1860、およびワイパヘッドの上方部分を下方部分に結合するピン1865a〜1865d(ピン1865cは図示されず)を含む。1つの実施形態において、ワイパヘッドは、ワイパヘッド1810およびワイパブレード1849が流体充填されたブリスタに対して加えることができる圧力量をばね部材1850およびピン1865a〜1865dが調整することができるように構成され得る。
ブリスタに圧力をかけるために下向きに配備され得(例えば図32Bを参照されたい)、別の態様においてはブリスタの流体内容物を別のブリスタへと絞り出すためにさらに下向きに配備され得る(例えば図33Cのブリスタ2020を参照されたい)、ワイパブレード1849間の象限内に設置された圧力部材1881a〜1881d(圧力部材1881cは図示されず)を含む。例証された例において、圧力部材1881a〜1881dは、ワイパヘッド1800を、ワイパブレード1849がブリスタに接触する地点を過ぎて下げることによって配備され得、ワイパヘッド1800を下げ続けることにより、磁石1882a〜1882dが磁石ビーズを集めることができるまで、または圧力部材1881a〜1881dがブリスタに対して平坦に押圧されて流体を圧縮してブリスタの外へ出すまでさらに遠くへ、ワイパブレード1849を上に圧迫すること、および/または圧力部材1881a〜1881dを下に押圧することができる。
ると、ワイパヘッド1800の一連の図、磁石1882a〜1882dの磁石システム、およびそれらが流体充填されたブリスタに対してどのように作用するかが例証される。図33は、ポーチ1400に類似した試料カード内に含まれ得る、相互接続流体チャネル2030を有する一対のブリスタ2010および2020を例証する。1つの実施形態において、ブリスタ2010および2020は、図14Aのポーチ1400に含まれる試料調製ブリスタ1405および第1段階ブリスタ1410に類似し得る。別の実施形態において、ブリスタ2010は、試料調製ブリスタであり得、ブリスタ2020は、廃物受け口であり得、カードは、第1段階PCRのための別のブリスタ(図示されず)を含み得る。図33では、ブリスタ2010は、2015に概略的に例証される細胞溶解物のスラリーおよび磁気ビーズを含有するように示される。磁気ビーズは、細胞溶解物から核酸を結合することおよび単離することができるシリカ被覆磁石材料または同様のものを含み得る。溶解物からの核酸の磁石ビーズ回収のための例示的なプロセスは、本明細書内の他の場所において、例えば図1を参照して、詳細に論じられ、そのようなプロセスは、この実施形態および本明細書内の他の実施形態において使用され得る。
の状態およびワイパブレード1849がどのようにブリスタ2010と相互作用し得るかが例証される。第1の状態では、ワイパブレード1849は、例えば溶解物への磁気ビーズの曝露のために、ワイパヘッド1800の回転がスラリー2015を混合し得るように、ブリスタ2010内へ押圧され得る。図32Bおよび図33Bは、例えば、圧力部材1881a〜1881dがブリスタ2010により近づき、それにより磁石1882a〜1882dが磁気ビーズを集め始めることができるようにヘッド1800がさらに下げられている第2の状態を例証する。部分的に集められた磁気ビーズが2016に示され、部分的に除去されたスラリーが2017に概略的に示される。圧力部材および磁石がブリスタのより近くに移動されると、磁気ビーズは、例えば、ワイパヘッドを小さい弧状(例えば約+/−5〜20°の範囲内)で前後に回転させることによって、統合され得る。磁気ビーズが磁石によって完全に捕捉され完全に統合されると、ワイパヘッド1800は完全に下げられ得、その結果、圧力部材1881a〜1881dがブリスタ2010を平坦に押圧してチャネル2030を通じて溶解物をブリスタ2020内へと絞る。これは、図32Cおよび図33Cに例証される。補足された磁気ビーズは2018に示され、廃物溶解物は2019に示される。図32A〜図32Cおよび図33〜図33Cに例証されるステップは、ビーズ2018を洗浄し、それに続いてそこから捕捉された核を溶出するために繰り返され得る。
れた核酸は、第1段階PCRのためにブリスタ1410に移動され得る。これは図16Cに例証され、ここではワイパヘッドの圧力部材がブリスタに押し付けられ(例えば、図11Bに示されるように)、それによりワイパヘッドがブリスタ1405の内容物の少なくとも一部分をブリスタ1410に投入することができるように、ワイパヘッド1100aが下げられている。ほぼ同じ時に(すなわち、それより前に、同時に、または後に)、加熱器組立体1335は、ブリスタ1410が図6に関連して説明されるように加熱器1386および1387の両方の温度制御下にあるように再位置付けされ得る。これは図16Dに描写される。さらに図16Dでは、ワイパヘッド1100bは、ワイパブレード(図示されず)がブリスタ1410に接触するまで下げられる。1つの混合器を用いる代替的な実施形態においては、ポーチが移動され得るか、または混合ヘッド1100がポーチの様々なブリスタに接触し得るように混合器が移動され得る。加熱器1386および1387ならびにワイパヘッド1100bが適所にある状態で、第1段階PCRは、ワイパブレードが第1段階PCRを別個の離散した容積に分割するように混合ヘッド1100を下げ、図6〜図9Cを参照して先に説明されるように、ブリスタ1410の内容物を2つの加熱器1386および1387の間で移動させるためにワイパヘッドを回転させることによって達成され得る。代替的な実施形態において、第1段階PCR熱サイクルは、ブリスタ1410の内容物が、加熱器1386(例えば変性)、次いで加熱器1387(例えばアニーリング)、次いで加熱器1386(例えば延伸および変性)などの温度制御下に繰り返しあるように、加熱器組立体1335またはポーチ1400をレール1392に沿って前後に移動させることによって達成され得る。
による熱サイクルは、例えば図8Cに例証される、ワイパヘッド1100の混合作用と組み合わされ得る。例えば、ワイパヘッド1100を使用した混合は、ブリスタ1410の内容物を混合してブリスタ内の流体の温度均一性を増大させるために、加熱器組立体1335の移動による熱サイクルと組み合わされ得る。同様に、ブリスタ内の流体を混合することは、効果的な拡散速度を増大させてPCRの化学作用を改善するために、加熱器組立体1335の移動による熱サイクルと組み合わされ得る。1つの態様において、例えば加熱器組立体が前後に移動されている間に、ワイパヘッドが一定の速度で回転され得るか、またはワイパヘッドは、例えば、加熱器1387および次いで加熱器1386の制御下にあるブリスタの遷移に対応してタイミングが計られた間隔で回転され得る。
、容積測定ウェル1415へ移動され、ブリスタ1420と1425との間で混合することによって第2段階PCR試薬(ポリメラーゼ、dNTPsなど)と混合され得る。混合は、図2の内袋システム808に類似した内袋システムまたは別の圧力印加システムを用いて達成され得る。いくつかの実施形態において、第2段階PCRのための試料を、熱を用いて調製することが望ましい場合がある。これは、図16A〜図16Fには描写されないが、加熱器組立体1335は、真のホットスタートが所望される場合には加熱器1386をブリスタ1415、1420、および1425に隣接して移動させることによって、そのようなステップのために位置付けられ得る。第2段階PCR試薬が各第2段階ウェル内に提供され得ることも理解される。
試料の調製に続いて、試料は、第2段階PCRのためにアレイ1430に移動され得る。図16Eおよび図16Fに描写されるように、第2段階PCRのための熱サイクルは、アレイおよび個別のウェルの内容物が加熱器1386(例えば変性)、次いで加熱器1387(例えばアニーリング)、次いで加熱器1386(例えば延伸および変性)などの温度制御下にあるように、加熱器組立体1335をアレイ1430に対して移動させることによって達成され得る。これらの図では描写されないが、圧力印加手段(例えば、ブリスタに圧力を印加しながら同時にまたは実質的に同時に蛍光測定を可能にするように構成された透明の可撓性内袋など、膨張可能な内袋)が、アレイの上に位置付けられて、ウェル内の個別のウェルの内容物を密封し、ウェル間のクロストークを防止し得る。同様に、そのような圧力印加手段はまた、アレイと加熱器との間の接触を改善し、したがって熱伝達の効率を増大させ得る。ウェルは、ヒートシールなどの他の手段によって密封され得ることが理解される。これらの図には描写されないが、アレイ1430内の核酸増幅は、図13Aおよび図13Bに描写されるカメラ1325などの光学アレイを用いてモニタされ得る。
れる動作は、計器1200または同様の計器においても実施され得ることを理解するものとする。同様に、これらの図に描写される動作は、ポーチ1400を用いて実施されるが、これらの図に描写される動作が他のポーチタイプおよび構成を用いて実施され得る限りにおいてこれは単に例にすぎない。
証される。図12Bおよび図13Bの計器1200および1300は、2つの加熱器要素を有する加熱器組立体1270および1335を描写するが、加熱器組立体1700は、ハウジング1735内に収容される3つの加熱器要素1710、1720、および1730を含む。1つの実施形態において、加熱器1710および1730は、同じ温度(例えば、約90℃〜110℃の範囲内の変性温度)に設定され、加熱器1720は、例示的にはアニーリングのために中間の温度(例えば約55℃〜約65℃)に設定され得る。1つの実施形態において、ブリスタ(例えば図14のブリスタ1410またはアレイ1430)の流体内容物の熱サイクルは、3つすべての加熱器を使用し得る。例えば、熱サイクルされることになるブリスタは、変性のために加熱器1710で開始され得、次いで加熱器組立体1700が、ブリスタがアニーリングのために加熱器1720の温度制御下にあり得るように移動され得、次いで加熱器組立体1700は、ブリスタが延伸/変性のために加熱器1730の温度制御下にあるように移動され得、次いでこのプロセスは、反対方向に移動する加熱器組立体により繰り返され得る。2つではなく3つの加熱器を用いた熱サイクルは、例えば、より良好な温度均一性を提供し、先端におけるブリスタの部分が所与の温度にある時間が少ないいわゆる「エッジ効果」を低減させる。加熱器組立体1700が変性からアニーリングへ、また変性への遷移を各方向において可能にするため、ブリスタのすべての部分が所与の温度へのより均等な曝露を受けると考えられる。別の実施形態において、3つの加熱器は、3つの異なる温度、例示的には、アニーリング温度、延伸温度、および変性温度に設定され得る。
誘導加熱器、電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、または当該技術分野において知られているような任意の他の加熱器であり得る。1つの実施形態において、加熱器1720は、ペルチェ素子を含み得る。加熱器1286および1287を参照して上に論じられるように、加熱器1720は熱サイクルされない場合があるが、例えば、ペルチェ素子を含むことが望ましい場合がある。典型的な抵抗加熱器とは異なり、ペ
ルチェ素子は、試料をアクティブに冷却ならびに加熱することができる。別の実施形態において、加熱器1710または1730のうちのいずれか一方または両方がまた、ペルチェ素子を含み得る。例えば、加熱器1710または1730のうちの一方または両方は、限定されるものではないが、ペルチェ素子によって提供される細かい温度制御およびアクティブな冷却から恩恵を受け得る、加熱された/冷却された試料調製、ホットスタート、および同様のものなどのステップに参加するために位置付けられ得る。例示的には、絶縁スペーサ1715および1725が、加熱器1710と1720との間および1720と1730との間にそれぞれ提供され得る。泡沫、プラスチック、ゴム、空気、真空、ガラス、または例示的には低伝導の任意の他の好適な材料を含む、任意の好適な絶縁材料が使用され得る。加熱器1710、1720、および1730が全体的に一定温度に保持される実施形態において、ランタイムおよびエネルギー使用は、実質的に減少され得る。
を実施し、第2段階PCRを実施するための2つの代替的な手順が説明される。第1の方法において、試料調製および第1段階PCRは、別個のブリスタ内で実施される。これは、本明細書では「3ゾーン法」と称される。第1のステップでは、試料は、充填チャネル1440を介してブリスタ1405内へ注入される。1つの実施形態において、細胞、ウイルス、および同様のものは、本明細書内の他の場所に詳細に説明されるワイピングシステムを使用してブリスタ1405内で溶解される。代替的に、細胞溶解は、限定されるものではないが、超音波処理デバイスもしくはビードビーターなどの代替的な溶解デバイスを用いて、または化学的溶解によって達成され得る。溶解は、本明細書内の他の場所に詳細に説明される加熱器組立体の1つまたは複数の加熱器要素を用いて試料を加熱すること(例えば約70〜90℃)によって助けられ得る。溶解に続いて、試料は、磁気ビーズに結合することを助けるために熱電冷却器要素(すなわち、ペルチェ素子)を用いて約0℃〜約20℃(例えば約10〜15℃)の範囲内の温度まで冷却され得る。他の冷却器要素は、限定されるものではないが、流体またはガス加熱交換要素、ファン冷却ヒートシンク、ヒートパイプ、凝縮ユニット、および同様のものを含む。
てブリスタ1405内に注入され得、それは、溶解の前または溶解の後であり得る。例示的には、磁気ビーズおよび溶解物は、冷やして混合され得る(例えば約0〜10℃の範囲内、例示的には加熱器のうちの1つの温度を調節することによって)。磁気ビーズおよび溶解物が、十分な時間にわたって完全に混合されると、磁気ビーズは、例示的には計器内に提供される磁石を用いてブリスタ1405内に集められ得、廃溶解物が、チャネル1445を介して廃液へと送られ得る。次いで、洗浄緩衝液が充填チャネル1440を介して注入され得る。洗浄緩衝液および磁気ビーズは、冷やして混合され得る(例えば約0〜10℃の範囲内)。磁気ビーズは再び集められ得、廃洗浄緩衝液は、チャネル1445を介して廃液へと洗い流され得る。洗浄サイクルは、少なくともさらに1回繰り返され得る。洗浄に続いて、溶出緩衝液(+第1段階PCRプライマー)が、充填チャネル1440を介してブリスタ1405内へ注入され得る。溶出緩衝液(+第1段階PCRプライマー)および磁気ビーズは、例示的には1つまたは複数の加熱器の制御下で、温めて混合され得る(例えば約70〜90℃で)。
TPs、および当該技術分野において知られている他の増幅成分)が、充填チャネル1450を介してブリスタ1410内へ注入され得る。PCRマスターミックスは、磁気ビーズからの溶出物の導入の前に、(例えば約57℃まで)加熱され得る。ブリスタ1405内では、磁気ビーズが再び集められ得、溶出物は、チャネル1465を介してブリスタ1410に送られ得る。
1410が2つの加熱器の温度制御下にある状態での回転移動によりブリスタ1410内で実施され得る。代替的に、第1段階PCR熱サイクルは、ブリスタ1410が1つの加熱器および次いで別の加熱器の制御下にあり得るように加熱器組立体またはポーチ1400を移動させることによって実施され得る。ブリスタ1410を出入りするチャネルは、第1段階PCRの間、例示的にはハードシールにより閉じられる。いくつかの実施形態において、容積低減プロトコルを用いることによって、ポーチ内の第1段階PCRを速めることが可能な場合がある。例えば、容積低減プロトコルは、ブリスタ1410内の初期の容積(例えば約100μL)を用いていくつかのPCRサイクル(例えば5〜10回)を実施し、ブリスタ1410の容積のおよそ半分をパージし、さらにいくつかのPCRサイクル(例えば5〜10回)を実施し、ブリスタ1410の容積のおよそ半分を再度パージすることを含み得る。液体の容積が小さいほど、熱質量は少なくなり、より大きい容積よりも素早く熱サイクルされ得るため、容積低減によりPCR反応のサイクル時間を減少させることができる。
、第1段階PCRの少量の試料(例えば約1〜5μl)が希釈ウェル1415に送られ得る。チャネル1470は開放され得、チャネル1475〜1485は閉じられる。第2段階PCRのための試料は、チャネル1460を介して第2段階PCRマスターミックスをブリスタ1425内へ注入することによって調製され得る。シールは、チャネル1470および1485において閉じられ、シールは、チャネル1475および1480において開放される。ブリスタ1420および1425ならびにウェル1415は、加熱され得る。ウェル1415内の試料は、第2段階PCRのために第1段階PCR生成物を希釈するために、ブリスタ1425および1420とウェル1415との間で混合することによってマスターミックスと混合され得る。次いで、第2段階PCRミックスが第2段階PCRアレイ1430内へ移送され得るように、チャネル1485が開放される。別の実施形態において、ポーチ1400は、ウェル1415ならびにブリスタ1425および1420から下流かつアレイ1430から上流に1つまたは複数の追加の希釈ウェルと、混合ブリスタのセットとを含み得る。例えば、濃縮された第1段階PCRプライマーまたは高濃縮生成物を用いるいくつかの実施形態においては、1つの希釈ウェルを用いて達成できるものよりも高い度合いまで第1段階プライマーおよび生成物を希釈することが望ましい場合がある。第2段階PCRのための混合物は、第2段階PCRアレイ1430内への注入の前に、物理的な「ホットスタート」のために加熱され得る。アレイ1430内での第2段階PCRのための熱サイクルは、例示的には、先に説明されるように加熱器組立体を前後に移動させることによって達成され得る。
施される。これは、本明細書では「2ゾーン法」と称される。第1のステップでは、試料は、充填チャネル1450を介してブリスタ1410内へ注入され得る。1つの実施形態において、細胞、ウイルス、および同様のものは、本明細書内の他の場所に詳細に説明されるワイピングシステムを使用してブリスタ1410内で溶解される。代替的に、細胞溶解は、限定されるものではないが、超音波処理デバイスもしくはビードビーターなどの代替的な溶解デバイス、または化学的溶解によって達成され得る。溶解は、本明細書内の他の場所に詳細に説明される加熱器組立体の1つまたは複数の加熱器要素を用いて試料を昇温度に加熱すること(例えば約70〜90℃)によって助けられ得る。溶解に続いて、試料は、任意選択的に、熱電冷却器要素(すなわち、ペルチェ素子)を用いて、下降温度(例えば、制限されるものではないが約0〜10℃などの周囲温度未満の温度)まで冷却され得る。
てブリスタ1410内へ注入され得る。磁気ビーズは、充填チャネル1450を介してブリスタ1410内へ注入される。磁気ビーズおよび溶解物は、冷やして混合され得る(例えば約0〜10℃の範囲内の温度)。磁気ビーズおよび溶解物が、十分な時間にわたって完全に混合されると、磁気ビーズは、磁石を用いてブリスタ1410内に集められ得、廃溶解物が、チャネル1465を介してブリスタ1405(すなわち、この例では、廃液ブリスタ)廃液へと送られ得る。次いで、洗浄緩衝液が充填チャネル1450を介してブリスタ1410内に注入され得る。洗浄緩衝液および磁気ビーズは、冷やして混合され得る(例えば約0〜10℃の範囲内の温度)。磁気ビーズは再び集められ得、廃洗浄緩衝液は、ブリスタ1405へと洗い流され得る。洗浄サイクルは、所望の場合、1回または複数回繰り返され得る。磁気ビーズは、ブリスタ1410の上流半体内へと収集され、チャネル1465を介して廃物ブリスタ1405へと送られ得る。
ー)は、チャネル1450内へ注入され得、昇温度(例えば約57℃)に保持され得る。同時に、第1段階PCRマスターミックスが、チャネル1455内へ注入され、真のホットスタートが所望され得る場合には、任意選択的に、昇温度(例えば約57℃)に保持され得る。第1段階PCRマスターミックスは、ブリスタ1410内でプライマーおよびテンプレートと混合され得、第1段階PCRが上に説明されるように実施され得る。
においては、第1段階PCR生成物の少量の試料(例えば1〜5μl)が、希釈ウェル1415内へ移送され得る。チャネル1470は開放され、チャネル1475〜1485は閉じられる。第2段階PCRのための試料は、チャネル1460を介して第2段階PCRマスターミックスをブリスタ1425内へ注入することによって調製され得る。シールは、チャネル1470および1485において閉じられ、シールは、チャネル1475および1480において開放される。ブリスタ1420および1425ならびにウェル1415は加熱される。ウェル1415内の試料は、第2段階PCRのために第1段階PCR生成物を希釈するために、ブリスタ1425および1420とウェル1415との間で混合することによってマスターミックスと混合され得る。次いで、第2段階PCRミックスが第2段階PCRアレイ1430内へ移送され得るように、チャネル1485が開放される。アレイ1430内での第2段階PCRのための熱サイクルは、ペルチェの使用により、または先に説明されるような他の手段により、加熱器組立体を移動させることによって達成され得る。
メラシステム1250および1325を参照されたい)が提供され得る。光学アレイは、光源、例示的にはフィルタ処理したLED光源、フィルタ処理した白色光、または照射と、カメラとを含み得る。カメラは、例示的には複数の光検出器を有し、その各々がポーチ1400のアレイ1430内の第2段階ウェルに対応する。代替的に、カメラは、第2段階ウェルのすべてを含む画像を撮影し得、画像は、第2段階ウェルの各々に対応する別個の区域に分割され得る。構成によっては、光学アレイは、静止状態にあり得るか、または光学アレイは、1つまたは複数のモータに取り付けられた移動部上に置かれ、各個別の第2段階ウェルからシグナルを獲得するために移動され得る。他の配置が可能であることが理解される。
[00189]1つの例では、一般的な呼吸器ウイルスのための標準的な市販の免疫蛍光アッ
セイは、アデノウイルス、PIV1、PIV2、PIV3、RSV、インフルエンザA、およびインフルエンザBの7つのウイルスを検出できることが知られている。より完全な
パネルは、例示的には、コロナウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ライノウイルス、および非HRVエンテロウイルスなどの他のウイルスのためのアッセイを含む。アデノウイルスまたはHRVなどの多様性の高いウイルスについては、ウイルスの種族の枝のすべてを標的にするために複数のプライマーを使用することが望ましい(例示的には、それぞれ4つのアウタープライマーおよび4つのインナープライマーのセット)。コロナウイルスなどの他のウイルスについては、季節によって異なることのない4つの明白な種族(229E、NL63、OC43、HKU1)が存在するが、それらは、別個のプライマーセットが必要とされるほどに十分に分岐している。FilmArray(登録商標)Respiratory Panel(BioFire Diagnostics、LLC of Salt Lake City、UT)は、アデノウイルス、コロナウイルスHKU1、コロナウイルスNL63、コロナウイルス229E、コロナウイルスOC43、ヒトメタニューモウイルス、ヒトライノウイルス/エンテロウイルス、インフルエンザA、インフルエンザA/H1、インフルエンザA/H3、インフルエンザA/H1−2009、インフルエンザB、パラインフルエンザウイルス1、パラインフルエンザウイルス2、パラインフルエンザウイルス3、パラインフルエンザウイルス4、および呼吸器合胞体ウイルスを含む。これらのウイルスに加えて、FilmArray(登録商標)Respiratory Panelは、百日咳菌、クラミドフィラニューモニエ、およびマイコプラズマニューモニエの3つの細菌を含む。高密度アレイ581は、単一のポーチ510内にそのようなパネルを収納することを可能にする。他のパネルが、FilmArray(登録商標)に利用可能であり、各々が少なくとも20の病原体をアッセイする。
[00191]DNAを増幅するために、図6〜図8のポーチおよび加熱器構成を使用したプ
ロトタイプ計器を使用した。110bp合成DNA分子の10,000個の複製、ならびに10倍高いプライマー(各プライマー5μΜ)およびDNAポリメラーゼ(2U/μL)濃度(すでに参照により組み込まれているUS2015−0118715において教示されるような標準PCR濃度と比較して)を、0.45mMのdNTPs、および5mM Mg++と共に含む75μl試料。検出のためにIX LCGreenを使用した。反応混合物は例示にすぎないことが理解される。サイクル時間によっては、高められたプライマーおよびポリメラーゼ濃度が有益であり得る。高められたプライマーおよびポリメラーゼ濃度に関するさらなる情報については、すでに参照により組み込まれている米国特許出願第2015−0118715号を参照されたい。例えば、20秒未満のサイクル時間の場合、少なくとも0.5μΜポリメラーゼと、多重反応においては各プライマー少なくとも1μΜまたはシングルプレックス反応においては各プライマー2μΜとを有することが望ましい。加熱器986は90℃に設定し、加熱器987は57℃に設定した。この混合物を、ブリスタ549内へ密封し、10秒につき1回のフル回転の速度で回転するワイパ989を用いて実行した。回転速度はサイクル時間に対応することが理解される。
を伴う)を、ハードウェアが許す限り速く(サイクル当たり48秒、1秒保持)、96℃〜60℃の間で標準的なブロック熱サイクラ内でサイクルした。2つのシステムについて増幅の効率を比較するために、同一のPCR反応物を、5、10、15、および20サイクルの「サイクルコース」にわたって各計器内で増幅した。第1段階PCRの後、これらの反応物を100倍希釈してネステッド第2段階PCR反応物にし、Roche LC480リアルタイムPCR計器内で増幅した。
す。図19において、異なる速度でのワイパシステムにおける第1段階反応物の融解曲線が、LC480内での増幅の融解曲線と比較される。図20は、サイクルコースの結果を
示す。図6〜図8のプロトタイプにおける増幅およびLC480ブロック熱サイクラにおける増幅は重複し、R2値>0.99を有する線によりフィッティングされる。図20では、これらの線の傾斜は、プロトタイプにおける1つのサイクルと比較してLC480における1つのサイクルの相対的な効率を示す。ブロックサイクラの効率(1.08の傾斜)は、およそ3分20秒では、ブロック熱サイクラの完全効率よりわずかに低いことを示すワイパブレードシステムの効率(0.93)よりもわずかに高い。
[00195]上に論じられるように、いくつかのPCRプロトコルは、アニーリングのため
の第1の温度、例示的には酵素活性に基づいて選択される伸長のためのいくらかより高い温度、および変性のための第3の最も高い温度という3つの温度を使用する。図18は、3つの加熱器930、931、932を使用する実施形態を示すが、いくつかの実施形態においては、より大きな容積を素早く熱サイクルさせることが望ましい場合がある。例示的には、3つの温度によって第1段階PCRを熱サイクルさせることが望ましい場合があり、ここでは加熱器組立体988などの加熱器は、所望するほど迅速にはブリスタ564の内容物を加熱および冷却することができない場合がある。
Rにおいて3ステップPCRプロトコルを使用することが望ましい場合がある。上に論じられるように、図2の第1段階加熱器886は、第1段階PCRのためにブリスタ564の内容物を加熱および冷却するように位置付けられる。1つの実施形態において、加熱器887は、ブリスタ548の内容物の温度を制御するために提供され得、ここで加熱器886および887は、一緒に制御されかつ一緒にサイクルする。別の実施形態において、加熱器886および887は、別個の制御下にあり得、例示的には、加熱器887は好適なアニーリング温度を維持するために提供され得る一方、ブリスタ886は、好適な変性温度を維持するために提供され得るが、これは例示にすぎず、これらの加熱器は逆転され得ることが理解される。他の構成が可能である。2つの加熱ゾーンを使用した2温度PCRは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第2014−0038272号により詳細に論じられる。
まれる米国特許出願第15/099,721号に開示されるものなどの加熱器が、加熱器887、888および本明細書に論じられる他の加熱器に使用され得るが、当該技術分野において知られているような他の加熱器または加熱器組立体が、これらの加熱器の温度が調節可能であることを条件として、2つの温度ゾーン内での3温度サイクルを獲得するために使用され得る。1つの実施形態において、これらの加熱器のアクティブな制御が望ましい。
においては、加熱器887がアニーリング温度のために使用され得る場合、加熱器887の温度は、所望のアニーリング温度、例示的には60℃に設定され得るが、この温度は例示にすぎず、プライマーの長さおよびGC内容物に応じて他のアニーリング温度が使用され得ることが理解される。試料がブリスタ548内へ移動されると、試料全体がアニーリング温度に達するまで、試料はブリスタ548内に保持され得る。いくつかの例示的なプロトコルにおいては、試料がアニーリング温度に達した後ある時間期間にわたって試料をブリスタ548内に保持することが望ましい場合がある。別の例示的な実施形態において、破線により図21に例証されるように、加熱器887は、アニーリング温度より数度低い温度、例示的にはアニーリング温度より2〜20度低い温度(「低アニーリング温度」)、例示的には55℃に保持され得るが、他の温度が好適であり得る。試料が、加熱器886の制御下にありかつアニーリング温度より実質的に熱いブリスタ564から移動されると、加熱器887はアニーリング温度未満であるため、試料は、より素早くアニーリング温度まで冷却され得る。任意選択的に、内袋848の移動が、ブリスタ548内の流体試料を混合して、ブリスタ548内のより均一な温度を獲得し得る。試料流体が、流体の実質的にすべてがアニーリング温度にあるか、またはアニーリング温度近くにある時間の長さにわたってブリスタ548内に存在した後、加熱器887は、図21内の破線(−−−)によって示されるように、アニーリング温度に調節され得る。例示的には2秒〜5秒間の保持が、適切なアニーリングを可能にし得るが、使用される化学作用によっては、保持は不必要な場合がある。次いで、試料はブリスタ564に移動され得る。試料がブリスタ548を出ると、図21に示されるように、次いで加熱器887の温度は、次のサイクルの準備のために低アニーリング温度に調節して戻され得る。多くの加熱器は加熱よりも冷却により多くの時間を要し、またブリスタ546が空でありかつ加熱器887に対する熱負荷が最小限であるときには、加熱器887を冷却する方が速い場合があることが理解される。
物長、GC内容物、およびポリメラーゼの選択によっては他の伸長温度が好適であり得る。図21内の実線(―)によって示されるように、試料が依然としてブリスタ548内にある間に、加熱器886は、伸長温度より数度高い温度、例示的には伸長温度より2〜10度高い温度(「高伸長温度」)に調節され得る。試料流体が、流体の実質的にすべてが伸長温度にあるか、または伸長温度近くにある時間の長さにわたってブリスタ564内に存在した後、加熱器887は、図21内の実線によって示されるように、高伸長温度から伸長温度に調節され得る。ブリスタ548に関して上に論じられるように、内袋864の任意選択的な移動が、ブリスタ564内の流体試料を混合して、ブリスタ564内のより均一な温度を獲得し得る。例示的には0秒〜5秒の保持が、プロトコルに応じて適切な伸長を可能にし得る。この保持の後、次いで加熱器886は、核酸を変性させるために、変性温度に、または変性温度より数度高く調節され得る。加熱器886が変性温度より高い温度に調節される場合、流体試料はより素早く変性に達し得ることが理解される。ここでも、内袋864の任意選択的な移動が、ブリスタ564内の流体試料を混合して、ブリスタ564内のより均一な温度を獲得し得る。任意選択的に変性温度での保持ありまたはなしで試料が変性された後、試料は、ブリスタ548へと戻るように移動され得、加熱器886の温度は、ブリスタ564内に試料がないと獲得するのがより効率的であり得る高伸長温度に調節され得、このサイクルは、増幅のために十分な回数繰り返される。これが第1段階PCRである場合、減少された回数のサイクル、つまり標的の富化には十分なサイクル数が望ましい場合がある一方、これが第2段階または単一段階である場合、プラトー相に至るまで熱サイクルするか、プラトー相を過ぎることを望む場合があるということが理解される。
サイクル当たり20秒以上の長さで、標準的なPCR化学作用を使用して実施され得る。所望の場合、ポリメラーゼまたはプライマーの高められた濃度を使用したエクストリームPCR化学作用が追加され得、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第2015−0118715号に開示されるように、より高速な熱サイクルプロトコルが使用され得る。ポリメラーゼまたはプライマーの高められた濃度は、サイクル時間が減少されない限り、増大されたプライマーダイマーおよび他の非特異性の増幅生成物の形成を結果としてもたらし得ること、また、使用されるポリメラーゼまたはプライマーの濃度が高いほど、サイクル時間はより速くなり、ここではポリメラーゼおよびプライマーはサイクル時間のおよそ比例した減少に伴って増大され得ることが理解される。10秒以下のサイクル時間が可能なはずである。
[00202]図6〜図8のものと類似したポーチおよび加熱器構成を使用したプロトタイプ
計器を、試料内のDNAの多重増幅のために使用した。テンプレートは、天然および合成テンプレートの混合であった。このテンプレートは、105bpの長さを有する合成増幅産物(内部的に「メフィスト」と称される)、164bpの長さを有する合成増幅産物(内部的に「Baal3」と称される)、S.cerevisiae配列(天然、増幅産物長364bp、内部的には「ビール」と称される)、M13(天然、増幅産物長264bp)、およびMS2(天然、増幅産物長309bp)であった。各テンプレートの1000個の複製、各テンプレートに固有の順方向および逆方向プライマー(各プライマー5μΜ)、DNAポリメラーゼ(2U/μL)、0.45mMのdNTPs、および5mM Mg++を含む150μlおよび75μl試料を調製した。検出のためにIX LCGreenを使用した。反応混合物は例示にすぎず、他の混合が使用され得ることが理解される。これらの混合物を150μlおよび75μlアリコート内でブリスタ(例えばブリスタ549)内に密封した。150μl反応物については、第1の加熱器(例えば加熱器986)を103℃に設定し、第2の加熱器(例えば加熱器987)を55℃に設定した。75μl反応物については、第1の加熱器(例えば加熱器986)を102℃に設定し、第2の加熱器(例えば加熱器987)を55℃に設定した。これらの反応物を、例えば、ブリスタと接触状態にあるワイパブレード949と、8秒ごとに1回のフル回転の速度(例えば、180°の回転、4秒間保持、180°回転、4秒間保持など、または90°回転、2秒間保持、90°回転、2秒間保持などのサイクルであり、回転時間はごくわずかであった)で回転するワイパヘッド989とを用いた図6〜図8に説明される手順に従って熱サイクルさせた。回転速度はサイクル時間に対応し、各フル回転が1つのサイクルを表していることが理解される。また、各4分の1回転後の保持がこの例では使用されるが、そのようなものは例示にすぎず、連続回転が企図される。第1段階PCRの後、これらの反応物を100倍希釈してネステッド第2段階PCR反応物にし、Roche LC480リアルタイムPCR計器内で増幅した。
応のすべてが成功であったことを示している。テンプレートのすべてを、第1段階PCRおよび第2段階PCRにおいて増幅し、生成物のすべてがそれらの予期される温度で融解した。これは、プロトタイプシステムを多重第1段階PCRに使用できることを実証する。
[00205]この実施例では、標準的なPCRプロトコルに従って、合成DNAテンプレー
ト(メフィスト)を、第1段階PCRのためにLC480計器内で増幅した。第1段階反応からの増幅生成物を、第2段階増幅混合物(例えば、固有の順方向および逆方向プライマー(各プライマー5μΜ)、DNAポリメラーゼ(2U/μL)、0.45mMのdNTPs、5mM Mg++、および検出のためのIX LCGreen色素)と1:100で希釈し、図14Aのアレイ1430または図15Aのアレイ1500に類似した5ウェルアレイ内へ注入した。アレイの各ウェルの容積はおよそ0.5μLである。この試料を、第2段階PCRのために、図12A〜図13Bに示される計器に類似したプロトタイプ計器内で熱サイクルさせた。96℃に設定した第1の加熱器および60℃に設定した第2の加熱器を有する加熱器組立体1270および1335に類似した2つの要素加熱器を用いてアレイを熱サイクルさせた。図16A〜図16Fを参照して、具体的には図16Eおよび図16Fを参照して論じられる手順に従って、このアレイ上で第2段階PCRを実行した。第2段階PCR試料を有するアレイを、8秒/サイクル(96℃で4秒、60℃で4秒など)で40サイクルにわたり熱サイクルさせた。
イクル数の関数としての、アレイのウェルの各々における蛍光の変化を示し、図24は、アレイのウェルの各々におけるDNA生成物(存在する場合)の融解曲線を示す。図23および図24は、反応がアレイのウェル1で最も成功したこと(図23)、および生成物がメフィスト生成物の予期される温度で融解転移を有したこと(図24)を示す。この実施例は、加熱器組立体をアレイに対して移動させることによってアレイを温度から温度へ遷移させる加熱器を有する2つの温度加熱器ユニットによって、第2段階PCRを満足に実行することができることを例証する。熱サイクルはまた、アレイを加熱器要素に対して移動させることによって、例えば、試料容器または試料容器を計器内に位置付ける受け口を横方向に移動させることによって達成され得ることが理解されるものとする。
[00208]この実施例では、合成DNAテンプレート(メフィスト)を、第1段階PCR
および第2段階PCRのために、図14Aに例証されるポーチ1400に類似した反応容器内で増幅した。第1段階PCRについては、テンプレートDNAの約75,000個の複製、各テンプレートに固有の順方向および逆方向プライマー(各プライマー5μΜ)、DNAポリメラーゼ(2U/μL)、0.45mMのdNTPs、および5mM Mg++を混ぜ合わせて、第1段階PCR反応のために75μLをブリスタ(例えばブリスタ1410)内へ注入して密封した。PCR増幅のために反応容器を計器1300に類似した計器内に置いた。
に設定し、第2の加熱器(例えば加熱器1386)を106℃に設定した。加熱器組立体(例えば加熱器組立体1335)を、反応ブリスタのおよそ半分の温度が第1の加熱器によって制御され得、残部の温度が第2の加熱器によって制御され得るように位置付けた。反応ブリスタの内容物を、例えば、ブリスタと接触状態にあるワイパブレード(例えばワイパブレード1149)と、8秒のサイクル時間(例えば90°の回転、2秒間保持、90°回転、2秒間保持などのサイクル)で回転するワイパヘッド(例えばワイパヘッド1100)とを用いた図6〜図8に説明される手順に従って、計器内で熱サイクルさせた。回転速度はサイクル時間に対応し、1つのフル回転が1つのサイクルに匹敵することが理解される。
の第1段階PCRに続いて、第1段階PCR反応物の一部分(例えば約1μL)を容積測定ウェル(例えば容積測定ウェル1415)へ移動させ、第2段階PCR試薬(DNAポリメラーゼ(2U/μL)、0.45mMのdNTPs、2mM Mg++、および検出のためのIX LC Green)と、ポーチの2つのより大きい容積ブリスタ(例えばブリスタ1420および1425)間で混合することによって、混合した。希釈のレベルは、容積測定ウェルの容積を変更することによって、または第1段階PCRから試料に添加される希釈試薬(例示的には、ポリメラーゼ、dNTPs、および好適な緩衝液であるが、特に非PCR増幅方法の場合には他の成分が好適であり得る)の容積を変更することによって、調節され得ることが理解される。所望の場合、試料および第2段階PCRマスターミックスのこの混合物は、第2段階増幅のために第2段階アレイへの移動の前に容積測定ウェル1415ならびにブリスタ1420および1425内で事前に加熱され得る。そのような事前加熱およびマスターミックスからのプライマーの分離は、第2段階PCR混合物内のホットスタート成分(抗体、化学的、または別のやり方)の必要性を無くし得る。
での第2段階PCRのための試料の調製に続いて、試料は、第2段階PCRのためにアレイ1430に類似したアレイに移動され得る。アレイのウェルの各々は、特有の順方向および逆方向PCRプライマーで前処理される。プライマーは、2.5μΜまたは5μΜのいずれかでアレイのウェル内にスポッティングした。アレイのウェルは、アレイを第2段階PCRマスターミックスで充満させることによって充填される。アレイのウェルは、充填チャネルへのアクセスを封鎖するために、ヒートシールされ得、および/または透明の可撓性内袋をアレイに対して膨張させることによって密封され得る。過剰の第2段階PCRマスターミックスもまた、透明の可撓性内袋をアレイに対して膨張させることによってアレイからパージされ得る。この場合、透明の可撓性内袋を、およそ20psiの圧力で膨張させた。図16Eおよび図16Fに描写されるように、第2段階PCRのための熱サイクルは、アレイおよび個別のウェルの内容物が第2の加熱器(例えば変性のための加熱器1386)、次いで第1の加熱器(例えばアニーリングおよび延伸のための加熱器1387)、次いで第2の加熱器(再び変性のため)などの温度制御下にあるように、加熱器組立体1335をアレイ下で前後に移動させることによって達成され得る。この実施例では、第2の加熱器を102℃に設定して第2の加熱器において2秒間保持し、第1の加熱器を65℃に設定して6秒間保持した。第2段階反応を、合計30サイクルにわたり熱サイクルさせた。アレイ内での核酸増幅およびDNA融解を、図13Aおよび図13Bに描写されるカメラ1325に類似したカメラを用いてモニタした。
ル数の関数としての、アレイのウェルにおける蛍光の増加を描写する。見て分かるように、DNA増幅は、アレイのすべてのウェル内で発生した。同様に、増幅のための同様の時間コース(例えば交差点)が、ウェルの各々において観察された。図26および図27は、増幅されている生成物が正しい生成物であることを確実にするための融解実験の結果を描写する。図26は、生の融解曲線であり、図27は、融解曲線の負の一次導関数(dF/dt)を描写する。図26および図27に見られるように、ウェルのすべてにおける生成物は、本質的に同じ温度での融解転移を有する。ウェルのすべてについて融解転移はおよそ84℃で発生するが、それはこの特定の合成増幅産物について予測される融解温度である。
[00214]これより図28〜図31を参照すると、結果は、アレイ1430またはアレイ
1500に類似したアレイのウェル内の流体の温度応答を試験するために設計された一連の実験を例証するものである。実験において、小型熱電対をアレイの1つまたは複数のウェル内に挿入し、フィルム層間で密封した。熱サイクルのため、アレイに水性PCR緩衝液を充填し、このアレイを計器1200または1300に類似した計器内へ挿入し、図16Eおよび図16Fを参照して説明されるプロトコルに従って熱サイクルに供した。これらの実験では、計器内の透明の可撓性内袋をおよそ20PSIまでアレイに対して膨張させた。これらの実験は、高温度および低温度加熱器における異なる滞留時間でのアレイ内の流体の温度応答を示し、例証された例における滞留時間にかかわらず、加熱器の遷移時間(例えば、高温度から低温度へ、または低温度から高温度へ)は、滞留時間と比べて迅速である。これらのデータおよび図示されない他のデータは、使用者が熱サイクル、および様々なプライマーセットを有する様々なテンプレートの増幅のためにアレイ内の流体について高い標的温度および低い標的温度を容易に設定することができるように、加熱器の設定点、各温度での滞留時間、ならびにアレイおよびその中の流体の熱応答を含む温度モデルを開発するために使用されている。
た。加熱器は、98℃および62℃に設定され、各温度ゾーンにおいて4秒の保持時間(すなわち、滞留時間)を伴った。標的終点温度は、95℃および62℃であった。この実験は、比較的長い保持時間を含むため、加熱器に対する設定点および標的温度は比較的互いに近い。図28に見られるように、ウェル内の流体(約0.5μL)を、これらの加熱器設定点、保持時間、および本明細書の他の場所に説明される移動加熱器プロトコルを用いて、約95℃〜約62℃で熱サイクルさせることができた。
、各温度ゾーンで4秒の保持時間を伴った。この実験において目指している標的終点温度は、94℃および62℃であった。図29に見られるように、ウェル内の流体(約0.5μL)を、これらの加熱器設定点、保持時間、および移動加熱器プロトコルを用いて、約94℃〜約63℃で熱サイクルさせることができた。
、各温度ゾーンで2秒の保持時間を伴った。標的終点温度は、96℃および61℃であった。図30に見られるように、ウェル内の流体(約0.5μL)を、これらの加熱器設定点、保持時間、および移動加熱器プロトコルを用いて、約96℃〜約61℃で熱サイクルさせることができた。
れ、各温度ゾーンで1秒の保持時間を伴った。標的終点温度は、95℃および63℃であった。図31に見られるように、ウェル内の流体(約0.5μL)を、1秒という短い保持期間でさえも、これらの加熱器設定点および移動加熱器プロトコルを用いて約95℃〜約63℃で熱サイクルさせることができた。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第2015/0118715号および米国特許公開第2016/0289736号に説明されるように、ポリメラーゼおよびプライマー濃度が増大されるという化学作用の調節により、8秒、4秒、2秒、またはより短いサイクル時間に対応する速度でポリメラーゼ連鎖反応を進ませることができる。
で具現化されてもよい。説明された実施形態は、あらゆる点において例示にすぎず、限定的ではないと見なされるものとする。したがって、本発明の範囲は、先述の説明によってではなく添付の特許請求の範囲により示される。特定の実施形態および詳細事項は、本発明を例証する目的のために本明細書および添付の発明開示に含まれているが、当業者にとっては、本明細書に開示される方法および装置において様々な変更が添付の特許請求の範囲において規定される本発明の範囲から逸脱することなく行われ得ることは明白であるものとする。特許請求の範囲の同等性の意味および範囲内に入るすべての変更は、それらの範囲内に包含されるものとする。
以上説明したように、本発明は以下の形態を有する。
形態1
(a)第2段階反応ゾーンに流体接続された第1段階チャンバを備える試料容器を提供するステップであって、前記第2段階反応ゾーンが、複数の第2段階反応ウェルを備える、ステップと、
(b)試料を前記試料容器内に導入するステップと、
(c)前記試料容器を計器内に挿入するステップであって、前記計器が温度制御要素を備える、ステップと、
(d)前記温度制御要素と前記第1段階チャンバとを整列させて、前記第1段階チャンバ内で前記試料の熱サイクルを行うステップと、
(e)前記第1段階チャンバ内の前記試料の熱サイクルを行った後に、前記第1段階チャンバからの前記試料由来の生成物の少なくとも一部分を前記第2段階反応ゾーン内の前記複数の第2段階反応ウェル内へ移動させるステップと、
(f)前記温度制御要素と前記第2段階反応ゾーンとを整列させて、前記第2段階反応ゾーン内で前記試料の前記一部分の熱サイクルを行うステップとを含む、熱サイクルの方法。
形態2
前記温度制御要素は、ペルチェ素子、抵抗加熱器、誘導加熱器、電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数の加熱器または冷却器デバイスを備える、形態1に記載の方法。
形態3
前記温度制御要素は、第1の温度ゾーンおよび第2の温度ゾーンを含み、前記第1の温度ゾーンは、前記第2の温度ゾーンよりも熱い、形態1に記載の方法。
形態4
ステップ(f)は、前記温度制御要素を前記第2段階反応ゾーンに対して繰り返し移動させることを含む、形態3に記載の方法。
形態5
ステップ(f)は、前記第2段階反応ゾーンを前記温度制御要素に対して繰り返し移動させることを含む、形態3に記載の方法。
形態6
前記計器は、ワイパ要素をさらに備え、ステップ(d)は、前記ワイパ要素の回転運動が前記試料の第1の部分を前記第1の温度ゾーンの熱制御から前記第2の温度ゾーンの熱制御へ移動させながら、同時に前記試料の第2の部分を前記第2の温度ゾーンの熱制御から前記第1の温度ゾーンの熱制御へ移動させるように、前記ワイパ要素を前記温度制御要素および前記第1段階チャンバと整列させることをさらに含む、形態3に記載の方法。
形態7
前記試料容器は、前記第1段階チャンバに流体接続された試料調製ゾーンをさらに備え、ステップ(d)の前に、前記方法は、
前記試料を前記試料調製ゾーン内に導入するステップと、
前記試料調製ゾーンを溶解装置と接触させて溶解物を生成するステップと、
前記溶解物から核酸を回収するステップと、
前記回収した核酸を前記第1段階チャンバ内へ移動させるステップとをさらに含む、形態1に記載の方法。
形態8
前記試料から核酸を回収するステップは、
前記溶解物を複数の磁気ビーズと接触させることと、
前記磁気ビーズを前記溶解物から分離するために磁石を配置することと、
前記磁気ビーズを洗浄することと、
前記磁気ビーズを前記磁石で再捕捉することと、
前記磁気ビーズを溶出緩衝液と接触させて前記核酸を前記磁気ビーズから解放することと、
前記磁気ビーズを前記磁石で再捕捉し、溶出した前記核酸を前記磁気ビーズから分離することとをさらに含む、形態7に記載の方法。
形態9
前記試料調製ゾーンおよび前記第1段階チャンバは、前記試料容器内の別々のチャンバである、形態7に記載の方法。
形態10
前記方法のステップ(f)は、第2の核酸増幅ゾーンを、前記温度制御要素の前記第1の温度ゾーンおよび次いで前記第2の温度ゾーンと整列させて、前記第2の核酸増幅ゾーン内の前記試料を熱サイクルさせることをさらに含む、形態1に記載の方法。
形態11
前記方法の前記ステップは、20分以下、15分以下、または好ましくは、10分以下で完了される、形態10に記載の方法。
形態12
第1の核酸増幅ゾーンおよび前記第2の核酸増幅ゾーンの各熱サイクルは、8秒以下、6秒以下、または好ましくは、4秒以下で完了される、形態1に記載の方法。
形態13
前記整列させるステップを制御するように、および前記温度制御要素の温度を制御するように構成されたコンピューティングデバイスを提供するステップをさらに含む、形態1に記載の方法。
形態14
試料を熱サイクルさせるための計器であって、前記試料は、可撓性試料容器内に提供され、前記計器は、
前記試料の第1の部分を第1の温度へと調節するための前記可撓性試料容器の第1の部分に隣接する第1の加熱器と、
前記試料の第2の部分を前記第1の温度とは異なる第2の温度へと調節するための前記可撓性試料容器の第2の部分に隣接する第2の加熱器と、
前記試料のこれらの部分が同時に前記加熱器の各々の制御下にあるように、前記試料の前記第1の部分を前記可撓性試料容器の前記第2の部分へと移動させながら前記試料の前記第2の部分を前記可撓性試料容器の前記第1の部分へと移動させるワイパ要素とを備える、計器。
形態15
前記ワイパ要素は、前記試料を、少なくとも第1のセクションおよび第2のセクションを含む少なくとも2つの別々のセクションへと分割し、それにより、前記第1の部分が前記第1のセクションに含まれ、前記第2の部分が前記第2のセクションに含まれるようにする刃をさらに備える、形態14に記載の計器。
形態16
前記ワイパ要素は、前記試料の前記第1の部分が前記第1の加熱器の制御下にあり、前記試料の前記第2の部分が前記第2の加熱器の制御下にあり、前記試料の第3の部分が、前記第1の加熱器および前記第2の加熱器の制御の間の遷移にあるように、前記試料内に旋回流および渦を作る、形態14に記載の計器。
形態17
前記ワイパ要素は、前記試料の部分を前記試料容器の反対の部分へと繰り返し移動させて前記試料を熱サイクルさせる、形態14〜16のいずれかに記載の計器。
形態18
前記試料器は、PCRのための核酸および構成要素を含む、形態14に記載の計器。
形態19
前記ワイパ要素は、前記可撓性試料容器を圧縮して前記試料の一部分を排出するように移動可能であり、前記ワイパ要素は、前記試料の前記一部分を排出する前には第1の速度、および前記試料の前記一部分を排出した後にはより速い第2の速度を有する、形態1
4に記載の計器。
形態20
前記ワイパ要素と前記可撓性試料容器との間に設置された圧縮可能部材をさらに備え、前記圧縮可能部材は、前記試料容器に向かって付勢される、形態14に記載の計器。
形態21
前記試料容器に流体接続されたアレイをさらに備え、前記アレイは、前記試料の少なくとも一部分を受容するように構成され、前記計器は、前記アレイ内の前記試料の前記一部分の温度に順次影響を与えるように移動可能である複数の加熱器をさらに備える、形態14に記載の計器。
形態22
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に少なくとも第1の反応チャンバを有する可撓性試料容器を位置付けるための受け口と、
第1の加熱器要素および第2の加熱器要素を備える加熱器組立体と、
前記第1の反応チャンバが前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素のうちの少なくとも一方の温度制御下にあるように前記第1の反応チャンバを前記加熱器組立体の第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素に対して横方向に整列させるために、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器組立体のうちの少なくとも1つに機械的に結合された移動装置とを備え、
前記計器は、前記少なくとも1つの反応チャンバ内の流体試料を熱サイクルさせるために、前記第1の反応チャンバを前記第1の加熱器要素と、次いで第2の加熱器要素と、繰り返し整列させるように構成される、計器。
形態23
前記第1の加熱器要素は、約90℃〜110℃の範囲の温度に設定され、前記第2の加熱器要素は、約55℃〜約65℃の範囲の温度に設定される、形態22に記載の計器。
形態24
前記加熱器組立体は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素が前記第1の反応チャンバにおける制御された温度ゾーンを画定することができるように、前記加熱器組立体を前記第1の反応チャンバに対して横方向に移動させるように構成される、形態22に記載の計器。
形態25
前記受け口は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素が前記第1の反応チャンバにおける制御された温度ゾーンを画定することができるように、前記受け口およびその中に位置付けられた前記可撓性試料容器を前記加熱器組立体に対して横方向に移動させるように構成される、形態22に記載の計器。
形態26
前記可撓性試料容器は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第1の反応チャンバが前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素の温度制御下にあるように、前記可撓性試料容器を前記加熱器組立体に対して移動させるように構成される、形態22に記載の計器。
形態27
前記可撓性試料容器は、前記第1の反応チャンバから下流に第2の反応チャンバをさらに備え、前記移動装置は、前記第2の反応チャンバが前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素の温度制御下にあるように、前記第2の反応チャンバを前記加熱器組立体の前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素に対して横方向に整列させるように構成される、形態22に記載の計器。
形態28
前記第2の反応チャンバは、前記第1の反応チャンバに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記第1の反応チャンバから増幅生成物の少なくとも一部分を受容するように構成される、形態27に記載の計器。
形態29
前記受け口は、前記加熱器組立体の前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素が、前記受け口内に位置付けられたときに前記可撓性試料容器の1つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた1つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、形態22に記載の計器。
形態30
前記加熱器組立体は、第1の加熱器要素、第2の加熱器要素、および第3の加熱器要素を含む、形態22に記載の計器。
形態31
前記第1の加熱器要素、前記第2の加熱器要素、および前記第3の加熱器要素は、直線的に設置される、形態30に記載の計器。
形態32
前記第1の加熱器要素および前記第3の加熱器要素は、約90℃〜110℃の範囲の温度に設定され、前記第2の加熱器要素は、約55℃〜約65℃の温度に設定される、形態31に記載の計器。
形態33
可撓性試料容器を中に受容するための受け口であって、前記可撓性試料容器が、熱サイクルされることになる試料を中に含む第1段階チャンバを有する、受け口と、
前記可撓性試料容器の第1の側面に位置付けられた、少なくとも第1の温度ゾーンおよび第2の温度ゾーンを含む加熱器要素と、
前記試料容器の第2の側面に位置付けられたワイパ要素であって、前記試料を少なくとも第1の部分および第2の部分に分割するために前記第1段階チャンバに接触するように構成される、ワイパ要素とを備え、
前記受け口、前記加熱器要素、前記ワイパ要素、または前記可撓性試料容器のうちの1つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第1段階チャンバを前記ワイパ要素ならびに前記加熱器要素の前記第1の温度ゾーンおよび前記第2の温度ゾーンに対して整列させ、
前記ワイパ要素は、前記試料の前記第1の部分を前記第2の部分へ移動させながら前記試料の前記第2の部分を前記第1の部分へ移動させて、それにより前記第1の部分および前記第2の部分が前記加熱器要素の前記第1の温度ゾーンおよび前記第2の温度ゾーンの温度制御下にあるようにするために前記第1段階チャンバに隣接して回転するように構成される、熱サイクルシステム。
形態34
前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含み、前記試料調製ゾーンは、前記第1段階チャンバからの上流のうちの1つであるか、または前記試料調製ゾーンおよび前記第1段階チャンバは、単一のゾーンを含む、形態33に記載の熱サイクルシステム。
形態35
前記ワイパ要素は、前記試料を前記試料調製ゾーン内で混合するために前記試料容器に接触するように構成される、形態34に記載の熱サイクルシステム。
形態36
前記ワイパ要素および前記加熱器要素は、試料調製を行うように共同して働き、また核酸増幅を行うように共同して働く、形態35に記載の熱サイクルシステム。
形態37
前記ワイパ要素は、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料内に旋回流、渦、およびキャビテーション気泡のうちの1つまたは複数を作る、形態33〜36のいずれか一項に記載の熱サイクルシステム。
形態38
前記第1段階チャンバは、細胞溶解を高めるために研磨要素を含む、形態33に記載の熱サイクルシステム。
形態39
前記計器は、前記試料調製ゾーンに接触するように構成された溶解構成要素をさらに備え、前記溶解構成要素は、任意選択的に前記ワイパ要素の構成要素である、形態33に記載の熱サイクルシステム。
形態40
前記ワイパ要素は、前記試料を熱サイクルさせるために、前記試料の前記第1の部分を第2の部分へ繰り返し移動させながら前記試料の前記第2の部分を移動させる、形態33に記載の熱サイクルシステム。
形態41
前記可撓性試料容器は、前記第1段階チャンバから下流に第2段階チャンバをさらに備え、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器要素のうちの1つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第2段階チャンバが前記第1の温度ゾーンおよび前記第2の温度ゾーンの温度制御下にあるように前記第2段階チャンバを前記加熱器要素に対して整列させる、形態33に記載の熱サイクルシステム。
形態42
前記第2段階チャンバは、前記第1段階チャンバに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記第1段階チャンバから生成物の少なくとも一部分を受容するように構成される、形態41に記載の熱サイクルシステム。
形態43
前記加熱器要素は、少なくとも第1の温度ゾーン、第2の温度ゾーン、および第3の温度ゾーンをさらに含み、2つの温度ゾーンは、前記第1段階チャンバを熱サイクルさせるために整列され、3つの温度ゾーンは、前記第2段階チャンバを熱サイクルさせるために、一度に1つずつ整列される、形態41に記載の熱サイクルシステム。
形態44
前記受け口は、前記加熱器要素が可撓性試料容器の1つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた1つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、形態33〜43のいずれかに記載の熱サイクルシステム。
形態45
前記可撓性試料容器の少なくとも1つの部分から光学データを集めるように構成された、光源およびカメラ要素を含む光学アレイをさらに備える、形態33〜44のいずれかに記載の熱サイクルシステム。
形態46
前記可撓性試料容器は、核酸および核酸増幅用の試薬を含有する試料を含む、形態33〜45のいずれかに記載の熱サイクルシステム。
形態47
前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンおよび/または前記可撓性試料容器の前記第1段階チャンバに圧力を印加するように構成された1つまたは複数の圧力部材をさらに備える、形態33〜35のいずれか一項に記載の熱サイクルシステム。
形態48
前記1つまたは複数の圧力部材は、前記可撓性試料容器に隣接して配置可能な少なくとも1つの磁石をさらに備える、形態47に記載の熱サイクルシステム。
形態49
前記ワイパ要素は、前記可撓性試料容器に隣接して配置可能な少なくとも1つの磁石をさらに備える、形態33に記載の熱サイクルシステム。
形態50
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に可撓性試料容器を位置付けるための受け口であって、前記可撓性試料容器が、第1段階チャンバ、および第2段階反応ウェルのアレイを有する第2段階反応チャンバを含む、受け口と、
第1の温度ゾーンおよび第2の温度ゾーンを含む加熱器要素と備え、
前記受け口、前記試料容器、または前記加熱器要素のうちの1つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第1段階チャンバおよび前記第2段階反応チャンバを前記加熱器要素に対して整列させ、
前記受け口および前記加熱器要素は、前記第1段階チャンバ内で、次いで前記第2段階反応チャンバ内で熱サイクルおよび核酸増幅を行うために、前記加熱器要素が、まず前記第1段階チャンバを、次に前記第2段階反応チャンバを加熱することを可能にするように構成される、計器。
形態51
前記第1段階チャンバに接触し、前記第1段階チャンバを少なくとも第1の容積および第2の容積へと分割するように構成された少なくとも1つの刃を有するワイパ要素をさらに備え、
前記加熱器要素は、前記第1の容積が前記第1の温度ゾーンの上に位置付けられ、かつ前記第2の容積が前記第2の温度ゾーンの上に位置付けられるように、前記第1段階チャンバの真下に整列され、
前記ワイパ要素は、前記第1の容積および前記第2の容積が前記温度ゾーンの各々の制御下にあるように、前記第1の容積を前記第2の温度ゾーンへ移動させながら前記第2の容積を前記第1の温度ゾーンへ移動させるために回転するように構成される、形態50に記載の計器。
形態52
前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含む、形態51に記載の計器。
形態53
前記試料調製ゾーンは、前記第1段階チャンバから上流にある、形態52に記載の計器。
形態54
前記試料調製ゾーンおよび前記第1段階チャンバは、単一のチャンバを備える、形態52に記載の計器。
形態55
前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンに接触するように構成される、形態52に記載の計器。
形態56
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に可撓性試料容器を位置付けるための受け口であって、前記可撓性試料容器が少なくとも1つの反応チャンバを含む、受け口と、
第1の加熱器要素、第2の加熱器要素、および第3の加熱器要素を備える加熱器組立体であって、前記第1の加熱器要素および前記第3の加熱器要素が前記第2の加熱器要素よりも高い温度に保持される、加熱器組立体とを備え、
前記計器は、少なくとも1つの反応チャンバ内の流体試料を熱サイクルさせるために、前記少なくとも1つの反応チャンバを前記第1の加熱器要素、前記第2の加熱器要素、および前記第3の加熱器要素と整列させるように構成される、計器。
形態57
前記第1の加熱器要素および前記第3の加熱器要素は、約90℃〜110℃の範囲の温度に設定され、前記第2の加熱器要素は、約55℃〜65℃の温度に設定される、形態56に記載の計器。
形態58
前記第1の加熱器要素および前記第3の加熱器要素は、抵抗性加熱器要素を備え、前記第2の加熱器要素は、ペルチェ素子を備える、形態56に記載の計器。
形態59
前記第1の加熱器要素または前記第3の加熱器要素のうちの一方は、ペルチェ素子の上に敷設された抵抗性加熱器要素を備える、形態58に記載の計器。
形態60
前記加熱器組立体は、前記可撓性試料容器に隣接して回転されるように構成される円形取付部を備える、形態56に記載の計器。
形態61
前記加熱器組立体は、前記可撓性試料容器に隣接して移動されるように構成される線形取付部を備える、形態56に記載の計器。
形態62
形態56〜61のいずれか一項に記載の計器を使用したポリメラーゼ連鎖反応方法であって、
(a)少なくとも1つの反応チャンバを備える試料容器を提供するステップと、
(b)試料を前記反応チャンバ内に導入するステップであって、前記試料が、標的核酸、前記標的核酸を増幅するための少なくとも1つのプライマー、および耐熱性DNAポリメラーゼを含む、ステップと、
(c)前記試料容器を前記計器内へ挿入するステップと、
(d)前記第1の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させ、次いで前記第2の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させ、次いで前記第3の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させるステップであって、
前記第1の加熱器要素および前記第3の加熱器要素は、変性温度に設定され、前記第2の加熱器要素は、アニーリング温度に設定され、
ステップ(d)は、変性、アニーリング、および延伸/変性の1つのサイクルを含む、ステップと、
(f)ステップ(d)を繰り返すステップとを含む、方法。
形態63
試料容器内に提供される核酸を増幅するための計器であって、前記核酸はアレイ内で構成され、
前記試料容器を受容するための開口部と、
複数の加熱器であって、各々の加熱器が異なる温度で提供される、複数の加熱器と、
前記加熱器を前記開口部に隣接する位置に順次移動させ、それにより前記位置にある前記加熱器のみが前記試料容器内の前記核酸の温度を制御するようにする移動部とを備える、計器。
形態64
前記試料容器は、核酸を増幅するための構成要素をさらに備え、
前記複数の加熱器は、アニーリング温度にある第1の加熱器および変性温度にある第2の加熱器を少なくとも備える、形態63に記載の計器。
形態65
前記複数の加熱器は、延伸温度にある第3の加熱器をさらに備える、形態64に記載の計器。
形態66
前記試料は、増幅された核酸の検出のために構成された蛍光体をさらに含み、前記計器は、前記アレイからの蛍光を検出するように位置付けられた光検出器をさらに備える、形態64に記載の計器。
形態67
(a)ある容積を有するPCR混合物を試料器内に提供するステップと、
(b)第1の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第1の回数のサイクルの各々が第1のサイクル時間を有する、ステップと、
(c)前記試料容器内の前記PCR混合物の前記容積を第2の容積まで減らすステップであって、前記第2の容積が前記第1の容積よりも小さい、ステップと、
(d)第2の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第2の回数のサイクルの各々が第2のサイクル時間を有し、前記第2のサイクル時間が前記第1のサイクル時間より短い、ステップとを含む、PCRを実施するための方法。
形態68
(e)前記試料容器内の前記PCR混合物の前記容積を第3の容積まで減らすステップであって、前記第3の容積が前記第2の容積よりも小さい、ステップと、
(f)第3の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第2の回数のサイクルの各々が第3のサイクル時間を有し、前記第3のサイクル時間が前記第2のサイクル時間より短い、ステップとをさらに含む、形態67に記載の方法。
形態69
前記試料器は、圧縮可能であり、前記減らすステップは、前記試料の一部分を前記試料器から排出することによって実施される、形態67に記載の方法。
形態70
前記試料器は、少なくとも2つの温度ゾーンと接触状態にあり、前記熱サイクルさせるステップは、前記試料を前記温度ゾーン間で移動させることを含む、形態67に記載の方法。
形態71
前記試料器は、いくつかの温度間で熱サイクルさせる加熱器によって加熱される、形態67に記載の方法。
形態72
流体試料を容器の試料区画内へ導入するステップであって、前記流体試料が標的核酸および前記標的核酸を増幅するための試薬を含む、ステップと、
前記容器を加熱装置内へ導入するステップであって、前記加熱装置が、第1の加熱器、第2の加熱器、および前記試料区画内の前記流体試料を移動させるための移動部を備え、前記第1の加熱器が第1の温度に設定され、前記第2の加熱器が第2の温度に設定され、前記第1の温度が前記第2の温度よりも高く、前記試料区画の第1の部分が前記第1の加熱器に近接して設置されているため、前記第1の加熱器が前記試料区画の前記第1の部分に対して熱制御を呈し、前記試料区画の第2の部分が前記第2の加熱器に近接して設置されているため、前記第2の加熱器が前記試料区画の前記第2の部分に対して熱制御を呈する、ステップと、
前記流体試料の少なくとも一部分を前記試料区画の前記第1の部分と前記試料区画の前記第2の部分との間で選択的に移動させ、それにより前記試料のこれらの部分が同時に前記加熱器の各々の制御下にあるようにするステップとを含む、試料内の核酸を増幅する方法。
形態73
(a)流体試料を容器の第1の区画内へ導入するステップであって、前記流体試料が標的核酸および前記標的核酸を増幅するための試薬を含み、前記第1の区画が、アニーリング温度未満である温度(低アニーリング温度)に設定される第1の加熱器の制御下にある、ステップと、
(b)前記第1の加熱器の温度を前記アニーリング温度まで上げるステップと、
(c)前記流体試料を容器の第2の区画へ移動させるステップであって、前記第2の区画が、延伸温度を上回る温度(高延伸温度)に設定される第2の加熱器の制御下にある、移動させるステップと、および、前記流体試料を前記第2の区画へ移動させた後に、前記第1の加熱器の温度を低アニーリング温度まで下げるステップと、を行うステップと、
(d)前記第2の加熱器の温度を前記延伸温度まで下げるステップと、
(e)前記第2の加熱器の温度を少なくとも変性温度まで上げるステップと、
(f)ステップ(a)から(e)を繰り返すステップとを含む、試料内の核酸を増幅する方法。
形態74
ステップ(a)が繰り返されるとき、前記第2の加熱器の温度が前記高延伸温度へ移される、形態73に記載の方法。
形態75
前記低アニーリング温度は、前記アニーリング温度より2度から20度低い、形態73に記載の方法。
形態76
前記高延伸温度は、前記延伸温度より2度から10度高い、形態73に記載の方法。
形態77
ステップ(e)は、前記第2の加熱器の温度を、前記変性温度を上回る温度まで上げることを含み、ステップ(a)は、前記流体試料が前記変性温度に達するとすぐに繰り返される、形態73に記載の方法。
形態78
試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に第1段階チャンバを有する可撓性試料容器を位置付けるための受け口と、
少なくとも第1の温度ゾーンおよび第2の温度ゾーンを含む加熱器要素とを備え、
前記受け口または前記加熱器要素のうちの1つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第1段階チャンバを前記加熱器要素の前記第1の温度ゾーンおよび前記第2の温度ゾーンに対して位置付け、
前記受け口および前記加熱器要素は、前記第1の温度ゾーンおよび前記第2の温度ゾーンが前記第1段階チャンバの温度を制御してその中で熱サイクルおよび核酸増幅を行うことを可能にするように構成される、計器。
形態79
前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含む、形態78に記載の計器。
形態80
前記試料調製ゾーンは、前記第1段階チャンバから上流にある、形態79に記載の計器。
形態81
前記計器は、前記試料容器の第1の側面に位置付けられたワイパ要素をさらに備え、前記ワイパ要素は、前記試料を前記試料調製ゾーン内および前記第1段階チャンバ内で混合するために前記試料容器に接触するように構成され、
前記受け口、前記ワイパ要素、または前記加熱器要素のうちの1つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記可撓性試料容器を前記ワイパ要素および前記加熱器要素に対して位置付け、
前記ワイパ要素および前記加熱器要素は、試料調製を行うように共同して働き、また核酸増幅を行うように共同して働く、形態79に記載の計器。
形態82
前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンと前記第1段階チャンバとの間で移動可能であり、前記加熱器要素は、前記試料調製ゾーンおよび前記第1段階チャンバにおいて制御された温度ゾーンを画定するために移動可能である、形態81に記載の計器。
形態83
前記受け口は、前記試料調製ゾーンおよび前記第1段階チャンバにおいて混合温度および画定された温度ゾーンを提供するために、前記ワイパ要素および前記加熱器に対して移動可能である、形態81に記載の計器。
形態84
前記受け口、前記ワイパ要素、前記加熱器要素のうちの少なくとも2つは、前記試料調製ゾーンおよび前記第1段階チャンバにおいて混合温度および画定された温度ゾーンを提供するために移動可能である、形態81に記載の計器。
形態85
前記加熱器要素は、前記試料調製ゾーン内に存在する試料を加熱するために、前記試料調製ゾーンへ移動可能であり、前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンに接触して、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料をブレンドするように構成される少なくとも1つの刃を有する、形態81に記載の計器。
形態86
前記ワイパ要素は、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料内に旋回流、渦、およびキャビテーション気泡のうちの1つまたは複数を作る、形態85に記載の計器。
形態87
前記試料調製ゾーンは、細胞溶解を高めるために研磨要素を含む、形態86に記載の計器。
形態88
前記ワイパ要素は溶解構成要素を含む、形態81に記載の計器。
形態89
前記加熱器要素は、前記試料の第1の部分が前記第1の温度ゾーンに隣接して位置付けられ、かつ前記試料の第2の部分が前記第2の温度ゾーンに隣接して位置付けられるように、前記第1段階チャンバに隣接して位置付け可能であり、前記計器は、前記第1段階チャンバを少なくとも第1の部分および第2の部分を含む少なくとも2つの別々のセクションに分割するように、および、前記試料の前記第1の部分および前記第2の部分が前記温度ゾーンの各々の制御下にあるように、前記試料の前記第1の部分を前記第2の温度ゾーンへ移動させながら前記試料の前記第2の部分を前記第1の温度ゾーンに移動させるために回転するように構成される少なくとも1つの刃を有するワイパ要素をさらに含む、形態78に記載の計器。
形態90
前記刃は、前記試料を、少なくとも第1のセクションおよび第2のセクションを含む少なくとも2つの別々のセクションへと分割し、それにより、前記第1の部分が前記第1のセクションに含まれ、前記第2の部分が前記第2のセクションに含まれるようにする、形態89に記載の計器。
形態91
前記ワイパ要素は、前記試料の前記第1の部分が前記第1の温度ゾーンの制御下にあり、前記試料の前記第2の部分が前記第2の温度ゾーンの制御下にあり、前記試料の第3の部分が、前記第1の温度ゾーンおよび前記第2の温度ゾーンの制御の間の遷移にあるように、前記試料を移動させる、形態89に記載の計器。
形態92
前記ワイパ要素は、前記試料の部分を前記試料容器の反対の部分へと繰り返し移動させて前記試料を熱サイクルさせる、形態89〜91のいずれかに記載の計器。
形態93
前記容器は、前記第1段階チャンバから下流に第2の核酸増幅ゾーンをさらに含み、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器要素のうちの1つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第2の核酸増幅ゾーンにおいて、制御された温度ゾーンを画定するために前記第2の核酸増幅ゾーンを前記加熱器要素に対して位置付ける、形態78に記載の計器。
形態94
前記第2の核酸増幅ゾーンは、前記第1の核酸増幅ゾーンに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記試料の少なくとも一部分を受容するように構成される、形態93に記載の計器。
形態95
前記容器は、前記第1段階チャンバと前記アレイとの間にウェルを含み、前記ウェルは、前記試料の既知の容積を前記第1段階チャンバから受容し、前記既知の容積を前記アレイに送達するように構成される、形態94に記載の計器。
形態96
前記容器は、前記ウェルと前記アレイとの間に希釈ゾーンを含み、前記希釈ゾーンは、前記既知の容積を前記ウェルから受容し、前記既知の容積をある容積の流体で希釈して、希釈された試料を得て、前記希釈された試料を前記アレイに送達するように構成される、形態95に記載の計器。
形態97
前記受け口は、前記加熱器要素が前記受け口に挿入された可撓性試料容器の1つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた1つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、形態78に記載の計器。
形態98
前記容器の少なくとも1つの部分から光学データを集めるように構成された、光源およびカメラ要素を含む光学アレイをさらに備える、形態78に記載の計器。
形態99
前記加熱器要素は、第1の加熱器部分、第2の加熱器部分、および第3の加熱器部分を含む、形態78に記載の計器。
形態100
前記第1の加熱器部分は、抵抗性加熱器であり、前記第2の加熱器部分は、ペルチェ素子であり、前記第3の加熱器部分は、抵抗性加熱器である、形態99に記載の計器。
形態101
前記第3の加熱器部分は、ペルチェ素子の上に抵抗性加熱器を備え、前記抵抗性加熱器は、前記第3の加熱器部分を加熱するために使用され、前記ペルチェ素子は、前記第3の加熱器部分を冷却するために実質的に同時に使用される、形態100に記載の計器。
形態102
前記第1の加熱器部分、前記第2の加熱器部分、および前記第3の加熱器部分は、直線的に設置される、形態101に記載の計器。
形態103
前記計器の1つまたは複数の構成要素を制御するように、および/またはそこからデータを集めるように構成されたコンピューティングデバイスをさらに備える、形態78〜102のいずれか一項に記載の計器。
形態104
可撓性試料容器を受容するための開口部であって、前記可撓性試料容器が少なくとも1つの反応ゾーンを含む、開口部と、
複数の加熱器であって、前記加熱器の各々が異なる温度に設定されるように構成され、各加熱器を前記少なくとも1つの反応ゾーンと順次整列させて、その中の試料を加熱または冷却することができるように、前記加熱器が実質的に平面の取付部に位置付けられる、複数の加熱器とを備える、試料内の核酸を増幅するための計器。
形態105
前記実質的に平面の取付部は、前記可撓性試料容器に隣接して回転されるように構成される円形取付部を備える、形態104に記載の計器。
形態106
前記円形取付部は、時計回り方向および反時計回り方向の両方に回転するように構成される、形態105に記載の計器。
形態107
反応ウェルのアレイを有する反応チャンバであって、前記アレイの前記ウェルの各々が、選択的に開放可能および選択的に密封可能な充填チャネルに流体接続される、反応チャンバを備える、可撓性試料容器。
形態108
前記可撓性試料容器は、第1のフィルム層、前記第1のフィルム層に少なくとも部分的に付着された第2のフィルム層、前記第2のフィルム層および前記アレイの前記反応ウェルが形成されるカード層の1つの表面に付着された接着剤層、ならびに第3の外側フィルム層および前記カード層の反対表面に付着された第2の接着剤層から製作され、
前記充填チャネルは、前記第1のフィルム層と前記第2のフィルム層との間に開放空間を残すことによって形成される、形態107に記載の可撓性試料容器。
形態109
前記充填チャネルは、前記第1のフィルム層および前記第2のフィルム層を前記反応ウェルの前記アレイの周りで一緒に密封するシール線によって画定される、形態108に記載の可撓性試料容器。
形態110
前記充填チャネルは、前記第2のフィルム層および前記第1の接着剤層内の選択的な切欠きによって形成された充填孔によって前記アレイの前記ウェルの各々に流体接続される、形態108に記載の可撓性試料容器。
形態111
前記充填孔は、前記アレイのウェルに隣接して、かつその上を流れるウェル充填チャネルに流体接続され、前記ウェル充填チャネルは、前記アレイの前記ウェルに隣接する前記カード層内に切欠きを、および前記第2の接着剤層内に別の切欠きを作製することによって形成される、形態110に記載の可撓性試料容器。
形態112
前記充填孔は、前記アレイのウェル内へ流れるウェル充填チャネルに流体接続され、前記ウェル充填チャネルは、前記充填孔を前記アレイの前記ウェルに流体接続する前記第1の接着剤層内の切欠きを作製することによって形成される、形態110に記載の可撓性試料容器。
形態113
前記充填チャネルはヒートシール可能である、形態107に記載の可撓性試料容器。
形態114
単一のヒートシールが、充填チャネルから複数の充填チャネルへの流れを密封し、前記ウェルを互いから密封する、形態113に記載の可撓性試料容器。
形態115
前記充填チャネルは、前記アレイに対して圧力を印加することによって密封可能である、形態107に記載の可撓性試料容器。
Claims (115)
- (a)第2段階反応ゾーンに流体接続された第1段階チャンバを備える試料容器を提供するステップであって、前記第2段階反応ゾーンが、複数の第2段階反応ウェルを備える、ステップと、
(b)試料を前記試料容器内に導入するステップと、
(c)前記試料容器を計器内に挿入するステップであって、前記計器が温度制御要素を備える、ステップと、
(d)前記温度制御要素と前記第1段階チャンバとを整列させて、前記第1段階チャンバ内で前記試料の熱サイクルを行うステップと、
(e)前記第1段階チャンバ内の前記試料の熱サイクルを行った後に、前記第1段階チャンバからの前記試料由来の生成物の少なくとも一部分を前記第2段階反応ゾーン内の前記複数の第2段階反応ウェル内へ移動させるステップと、
(f)前記温度制御要素と前記第2段階反応ゾーンとを整列させて、前記第2段階反応ゾーン内で前記試料の前記一部分の熱サイクルを行うステップとを含む、熱サイクルの方法。 - 前記温度制御要素は、ペルチェ素子、抵抗加熱器、誘導加熱器、電磁加熱器、薄膜加熱器、印刷素子加熱器、正温度係数加熱器、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数の加熱器または冷却器デバイスを備える、請求項1に記載の方法。
- 前記温度制御要素は、第1の温度ゾーンおよび第2の温度ゾーンを含み、前記第1の温度ゾーンは、前記第2の温度ゾーンよりも熱い、請求項1に記載の方法。
- ステップ(f)は、前記温度制御要素を前記第2段階反応ゾーンに対して繰り返し移動させることを含む、請求項3に記載の方法。
- ステップ(f)は、前記第2段階反応ゾーンを前記温度制御要素に対して繰り返し移動させることを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記計器は、ワイパ要素をさらに備え、ステップ(d)は、前記ワイパ要素の回転運動が前記試料の第1の部分を前記第1の温度ゾーンの熱制御から前記第2の温度ゾーンの熱制御へ移動させながら、同時に前記試料の第2の部分を前記第2の温度ゾーンの熱制御から前記第1の温度ゾーンの熱制御へ移動させるように、前記ワイパ要素を前記温度制御要素および前記第1段階チャンバと整列させることをさらに含む、請求項3に記載の方法。
- 前記試料容器は、前記第1段階チャンバに流体接続された試料調製ゾーンをさらに備え、ステップ(d)の前に、前記方法は、
前記試料を前記試料調製ゾーン内に導入するステップと、
前記試料調製ゾーンを溶解装置と接触させて溶解物を生成するステップと、
前記溶解物から核酸を回収するステップと、
前記回収した核酸を前記第1段階チャンバ内へ移動させるステップとをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記試料から核酸を回収するステップは、
前記溶解物を複数の磁気ビーズと接触させることと、
前記磁気ビーズを前記溶解物から分離するために磁石を配置することと、
前記磁気ビーズを洗浄することと、
前記磁気ビーズを前記磁石で再捕捉することと、
前記磁気ビーズを溶出緩衝液と接触させて前記核酸を前記磁気ビーズから解放すること
と、
前記磁気ビーズを前記磁石で再捕捉し、溶出した前記核酸を前記磁気ビーズから分離することとをさらに含む、請求項7に記載の方法。 - 前記試料調製ゾーンおよび前記第1段階チャンバは、前記試料容器内の別々のチャンバである、請求項7に記載の方法。
- 前記方法のステップ(f)は、第2の核酸増幅ゾーンを、前記温度制御要素の前記第1の温度ゾーンおよび次いで前記第2の温度ゾーンと整列させて、前記第2の核酸増幅ゾーン内の前記試料を熱サイクルさせることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記方法の前記ステップは、20分以下、15分以下、または好ましくは、10分以下で完了される、請求項10に記載の方法。
- 第1の核酸増幅ゾーンおよび前記第2の核酸増幅ゾーンの各熱サイクルは、8秒以下、6秒以下、または好ましくは、4秒以下で完了される、請求項1に記載の方法。
- 前記整列させるステップを制御するように、および前記温度制御要素の温度を制御するように構成されたコンピューティングデバイスを提供するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 試料を熱サイクルさせるための計器であって、前記試料は、可撓性試料容器内に提供され、前記計器は、
前記試料の第1の部分を第1の温度へと調節するための前記可撓性試料容器の第1の部分に隣接する第1の加熱器と、
前記試料の第2の部分を前記第1の温度とは異なる第2の温度へと調節するための前記可撓性試料容器の第2の部分に隣接する第2の加熱器と、
前記試料のこれらの部分が同時に前記加熱器の各々の制御下にあるように、前記試料の前記第1の部分を前記可撓性試料容器の前記第2の部分へと移動させながら前記試料の前記第2の部分を前記可撓性試料容器の前記第1の部分へと移動させるワイパ要素とを備える、計器。 - 前記ワイパ要素は、前記試料を、少なくとも第1のセクションおよび第2のセクションを含む少なくとも2つの別々のセクションへと分割し、それにより、前記第1の部分が前記第1のセクションに含まれ、前記第2の部分が前記第2のセクションに含まれるようにする刃をさらに備える、請求項14に記載の計器。
- 前記ワイパ要素は、前記試料の前記第1の部分が前記第1の加熱器の制御下にあり、前記試料の前記第2の部分が前記第2の加熱器の制御下にあり、前記試料の第3の部分が、前記第1の加熱器および前記第2の加熱器の制御の間の遷移にあるように、前記試料内に旋回流および渦を作る、請求項14に記載の計器。
- 前記ワイパ要素は、前記試料の部分を前記試料容器の反対の部分へと繰り返し移動させて前記試料を熱サイクルさせる、請求項14〜16のいずれかに記載の計器。
- 前記試料器は、PCRのための核酸および構成要素を含む、請求項14に記載の計器。
- 前記ワイパ要素は、前記可撓性試料容器を圧縮して前記試料の一部分を排出するように移動可能であり、前記ワイパ要素は、前記試料の前記一部分を排出する前には第1の速度、および前記試料の前記一部分を排出した後にはより速い第2の速度を有する、請求項1
4に記載の計器。 - 前記ワイパ要素と前記可撓性試料容器との間に設置された圧縮可能部材をさらに備え、前記圧縮可能部材は、前記試料容器に向かって付勢される、請求項14に記載の計器。
- 前記試料容器に流体接続されたアレイをさらに備え、前記アレイは、前記試料の少なくとも一部分を受容するように構成され、前記計器は、前記アレイ内の前記試料の前記一部分の温度に順次影響を与えるように移動可能である複数の加熱器をさらに備える、請求項14に記載の計器。
- 試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に少なくとも第1の反応チャンバを有する可撓性試料容器を位置付けるための受け口と、
第1の加熱器要素および第2の加熱器要素を備える加熱器組立体と、
前記第1の反応チャンバが前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素のうちの少なくとも一方の温度制御下にあるように前記第1の反応チャンバを前記加熱器組立体の第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素に対して横方向に整列させるために、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器組立体のうちの少なくとも1つに機械的に結合された移動装置とを備え、
前記計器は、前記少なくとも1つの反応チャンバ内の流体試料を熱サイクルさせるために、前記第1の反応チャンバを前記第1の加熱器要素と、次いで第2の加熱器要素と、繰り返し整列させるように構成される、計器。 - 前記第1の加熱器要素は、約90℃〜110℃の範囲の温度に設定され、前記第2の加熱器要素は、約55℃〜約65℃の範囲の温度に設定される、請求項22に記載の計器。
- 前記加熱器組立体は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素が前記第1の反応チャンバにおける制御された温度ゾーンを画定することができるように、前記加熱器組立体を前記第1の反応チャンバに対して横方向に移動させるように構成される、請求項22に記載の計器。
- 前記受け口は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素が前記第1の反応チャンバにおける制御された温度ゾーンを画定することができるように、前記受け口およびその中に位置付けられた前記可撓性試料容器を前記加熱器組立体に対して横方向に移動させるように構成される、請求項22に記載の計器。
- 前記可撓性試料容器は、前記移動装置に結合され、前記移動装置は、前記第1の反応チャンバが前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素の温度制御下にあるように、前記可撓性試料容器を前記加熱器組立体に対して移動させるように構成される、請求項22に記載の計器。
- 前記可撓性試料容器は、前記第1の反応チャンバから下流に第2の反応チャンバをさらに備え、前記移動装置は、前記第2の反応チャンバが前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素の温度制御下にあるように、前記第2の反応チャンバを前記加熱器組立体の前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素に対して横方向に整列させるように構成される、請求項22に記載の計器。
- 前記第2の反応チャンバは、前記第1の反応チャンバに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記第1の反応チャンバから増幅生成物の少なくとも
一部分を受容するように構成される、請求項27に記載の計器。 - 前記受け口は、前記加熱器組立体の前記第1の加熱器要素および前記第2の加熱器要素が、前記受け口内に位置付けられたときに前記可撓性試料容器の1つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた1つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、請求項22に記載の計器。
- 前記加熱器組立体は、第1の加熱器要素、第2の加熱器要素、および第3の加熱器要素を含む、請求項22に記載の計器。
- 前記第1の加熱器要素、前記第2の加熱器要素、および前記第3の加熱器要素は、直線的に設置される、請求項30に記載の計器。
- 前記第1の加熱器要素および前記第3の加熱器要素は、約90℃〜110℃の範囲の温度に設定され、前記第2の加熱器要素は、約55℃〜約65℃の温度に設定される、請求項31に記載の計器。
- 可撓性試料容器を中に受容するための受け口であって、前記可撓性試料容器が、熱サイクルされることになる試料を中に含む第1段階チャンバを有する、受け口と、
前記可撓性試料容器の第1の側面に位置付けられた、少なくとも第1の温度ゾーンおよび第2の温度ゾーンを含む加熱器要素と、
前記試料容器の第2の側面に位置付けられたワイパ要素であって、前記試料を少なくとも第1の部分および第2の部分に分割するために前記第1段階チャンバに接触するように構成される、ワイパ要素とを備え、
前記受け口、前記加熱器要素、前記ワイパ要素、または前記可撓性試料容器のうちの1つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第1段階チャンバを前記ワイパ要素ならびに前記加熱器要素の前記第1の温度ゾーンおよび前記第2の温度ゾーンに対して整列させ、
前記ワイパ要素は、前記試料の前記第1の部分を前記第2の部分へ移動させながら前記試料の前記第2の部分を前記第1の部分へ移動させて、それにより前記第1の部分および前記第2の部分が前記加熱器要素の前記第1の温度ゾーンおよび前記第2の温度ゾーンの温度制御下にあるようにするために前記第1段階チャンバに隣接して回転するように構成される、熱サイクルシステム。 - 前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含み、前記試料調製ゾーンは、前記第1段階チャンバからの上流のうちの1つであるか、または前記試料調製ゾーンおよび前記第1段階チャンバは、単一のゾーンを含む、請求項33に記載の熱サイクルシステム。
- 前記ワイパ要素は、前記試料を前記試料調製ゾーン内で混合するために前記試料容器に接触するように構成される、請求項34に記載の熱サイクルシステム。
- 前記ワイパ要素および前記加熱器要素は、試料調製を行うように共同して働き、また核酸増幅を行うように共同して働く、請求項35に記載の熱サイクルシステム。
- 前記ワイパ要素は、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料内に旋回流、渦、およびキャビテーション気泡のうちの1つまたは複数を作る、請求項33〜36のいずれか一項に記載の熱サイクルシステム。
- 前記第1段階チャンバは、細胞溶解を高めるために研磨要素を含む、請求項33に記載の熱サイクルシステム。
- 前記計器は、前記試料調製ゾーンに接触するように構成された溶解構成要素をさらに備え、前記溶解構成要素は、任意選択的に前記ワイパ要素の構成要素である、請求項33に記載の熱サイクルシステム。
- 前記ワイパ要素は、前記試料を熱サイクルさせるために、前記試料の前記第1の部分を第2の部分へ繰り返し移動させながら前記試料の前記第2の部分を移動させる、請求項33に記載の熱サイクルシステム。
- 前記可撓性試料容器は、前記第1段階チャンバから下流に第2段階チャンバをさらに備え、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器要素のうちの1つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第2段階チャンバが前記第1の温度ゾーンおよび前記第2の温度ゾーンの温度制御下にあるように前記第2段階チャンバを前記加熱器要素に対して整列させる、請求項33に記載の熱サイクルシステム。
- 前記第2段階チャンバは、前記第1段階チャンバに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記第1段階チャンバから生成物の少なくとも一部分を受容するように構成される、請求項41に記載の熱サイクルシステム。
- 前記加熱器要素は、少なくとも第1の温度ゾーン、第2の温度ゾーン、および第3の温度ゾーンをさらに含み、2つの温度ゾーンは、前記第1段階チャンバを熱サイクルさせるために整列され、3つの温度ゾーンは、前記第2段階チャンバを熱サイクルさせるために、一度に1つずつ整列される、請求項41に記載の熱サイクルシステム。
- 前記受け口は、前記加熱器要素が可撓性試料容器の1つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた1つまたは複数の開口部を有する実質的に平面の表面を含む、請求項33〜43のいずれかに記載の熱サイクルシステム。
- 前記可撓性試料容器の少なくとも1つの部分から光学データを集めるように構成された、光源およびカメラ要素を含む光学アレイをさらに備える、請求項33〜44のいずれかに記載の熱サイクルシステム。
- 前記可撓性試料容器は、核酸および核酸増幅用の試薬を含有する試料を含む、請求項33〜45のいずれかに記載の熱サイクルシステム。
- 前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンおよび/または前記可撓性試料容器の前記第1段階チャンバに圧力を印加するように構成された1つまたは複数の圧力部材をさらに備える、請求項33〜35のいずれか一項に記載の熱サイクルシステム。
- 前記1つまたは複数の圧力部材は、前記可撓性試料容器に隣接して配置可能な少なくとも1つの磁石をさらに備える、請求項47に記載の熱サイクルシステム。
- 前記ワイパ要素は、前記可撓性試料容器に隣接して配置可能な少なくとも1つの磁石をさらに備える、請求項33に記載の熱サイクルシステム。
- 試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に可撓性試料容器を位置付けるための受け口であって、前記可撓性試料容器が、第1段階チャンバ、および第2段階反応ウェルのアレイを有する第2段階反応チャンバを含む、受け口と、
第1の温度ゾーンおよび第2の温度ゾーンを含む加熱器要素と備え、
前記受け口、前記試料容器、または前記加熱器要素のうちの1つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第1段階チャンバおよび前記第2段階反応チャンバを前記加熱器要素に対して整列させ、
前記受け口および前記加熱器要素は、前記第1段階チャンバ内で、次いで前記第2段階反応チャンバ内で熱サイクルおよび核酸増幅を行うために、前記加熱器要素が、まず前記第1段階チャンバを、次に前記第2段階反応チャンバを加熱することを可能にするように構成される、計器。 - 前記第1段階チャンバに接触し、前記第1段階チャンバを少なくとも第1の容積および第2の容積へと分割するように構成された少なくとも1つの刃を有するワイパ要素をさらに備え、
前記加熱器要素は、前記第1の容積が前記第1の温度ゾーンの上に位置付けられ、かつ前記第2の容積が前記第2の温度ゾーンの上に位置付けられるように、前記第1段階チャンバの真下に整列され、
前記ワイパ要素は、前記第1の容積および前記第2の容積が前記温度ゾーンの各々の制御下にあるように、前記第1の容積を前記第2の温度ゾーンへ移動させながら前記第2の容積を前記第1の温度ゾーンへ移動させるために回転するように構成される、請求項50に記載の計器。 - 前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含む、請求項51に記載の計器。
- 前記試料調製ゾーンは、前記第1段階チャンバから上流にある、請求項52に記載の計器。
- 前記試料調製ゾーンおよび前記第1段階チャンバは、単一のチャンバを備える、請求項52に記載の計器。
- 前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンに接触するように構成される、請求項52に記載の計器。
- 試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に可撓性試料容器を位置付けるための受け口であって、前記可撓性試料容器が少なくとも1つの反応チャンバを含む、受け口と、
第1の加熱器要素、第2の加熱器要素、および第3の加熱器要素を備える加熱器組立体であって、前記第1の加熱器要素および前記第3の加熱器要素が前記第2の加熱器要素よりも高い温度に保持される、加熱器組立体とを備え、
前記計器は、少なくとも1つの反応チャンバ内の流体試料を熱サイクルさせるために、前記少なくとも1つの反応チャンバを前記第1の加熱器要素、前記第2の加熱器要素、および前記第3の加熱器要素と整列させるように構成される、計器。 - 前記第1の加熱器要素および前記第3の加熱器要素は、約90℃〜110℃の範囲の温度に設定され、前記第2の加熱器要素は、約55℃〜65℃の温度に設定される、請求項56に記載の計器。
- 前記第1の加熱器要素および前記第3の加熱器要素は、抵抗性加熱器要素を備え、前記第2の加熱器要素は、ペルチェ素子を備える、請求項56に記載の計器。
- 前記第1の加熱器要素または前記第3の加熱器要素のうちの一方は、ペルチェ素子の上に敷設された抵抗性加熱器要素を備える、請求項58に記載の計器。
- 前記加熱器組立体は、前記可撓性試料容器に隣接して回転されるように構成される円形取付部を備える、請求項56に記載の計器。
- 前記加熱器組立体は、前記可撓性試料容器に隣接して移動されるように構成される線形取付部を備える、請求項56に記載の計器。
- 請求項56〜61のいずれか一項に記載の計器を使用したポリメラーゼ連鎖反応方法であって、
(a)少なくとも1つの反応チャンバを備える試料容器を提供するステップと、
(b)試料を前記反応チャンバ内に導入するステップであって、前記試料が、標的核酸、前記標的核酸を増幅するための少なくとも1つのプライマー、および耐熱性DNAポリメラーゼを含む、ステップと、
(c)前記試料容器を前記計器内へ挿入するステップと、
(d)前記第1の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させ、次いで前記第2の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させ、次いで前記第3の加熱器要素を前記反応チャンバと整列させるステップであって、
前記第1の加熱器要素および前記第3の加熱器要素は、変性温度に設定され、前記第2の加熱器要素は、アニーリング温度に設定され、
ステップ(d)は、変性、アニーリング、および延伸/変性の1つのサイクルを含む、ステップと、
(f)ステップ(d)を繰り返すステップとを含む、方法。 - 試料容器内に提供される核酸を増幅するための計器であって、前記核酸はアレイ内で構成され、
前記試料容器を受容するための開口部と、
複数の加熱器であって、各々の加熱器が異なる温度で提供される、複数の加熱器と、
前記加熱器を前記開口部に隣接する位置に順次移動させ、それにより前記位置にある前記加熱器のみが前記試料容器内の前記核酸の温度を制御するようにする移動部とを備える、計器。 - 前記試料容器は、核酸を増幅するための構成要素をさらに備え、
前記複数の加熱器は、アニーリング温度にある第1の加熱器および変性温度にある第2の加熱器を少なくとも備える、請求項63に記載の計器。 - 前記複数の加熱器は、延伸温度にある第3の加熱器をさらに備える、請求項64に記載の計器。
- 前記試料は、増幅された核酸の検出のために構成された蛍光体をさらに含み、前記計器は、前記アレイからの蛍光を検出するように位置付けられた光検出器をさらに備える、請求項64に記載の計器。
- (a)ある容積を有するPCR混合物を試料器内に提供するステップと、
(b)第1の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第1の回数のサイクルの各々が第1のサイクル時間を有する、ステップと、
(c)前記試料容器内の前記PCR混合物の前記容積を第2の容積まで減らすステップであって、前記第2の容積が前記第1の容積よりも小さい、ステップと、
(d)第2の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第2の回数のサイクルの各々が第2のサイクル時間を有し、前記第2のサイクル時間が前記第1のサイクル時間より短い、ステップとを含む、PCRを実施するための方法。 - (e)前記試料容器内の前記PCR混合物の前記容積を第3の容積まで減らすステップであって、前記第3の容積が前記第2の容積よりも小さい、ステップと、
(f)第3の回数のサイクルだけ熱サイクルさせるステップであって、前記第2の回数のサイクルの各々が第3のサイクル時間を有し、前記第3のサイクル時間が前記第2のサイクル時間より短い、ステップとをさらに含む、請求項67に記載の方法。 - 前記試料器は、圧縮可能であり、前記減らすステップは、前記試料の一部分を前記試料器から排出することによって実施される、請求項67に記載の方法。
- 前記試料器は、少なくとも2つの温度ゾーンと接触状態にあり、前記熱サイクルさせるステップは、前記試料を前記温度ゾーン間で移動させることを含む、請求項67に記載の方法。
- 前記試料器は、いくつかの温度間で熱サイクルさせる加熱器によって加熱される、請求項67に記載の方法。
- 流体試料を容器の試料区画内へ導入するステップであって、前記流体試料が標的核酸および前記標的核酸を増幅するための試薬を含む、ステップと、
前記容器を加熱装置内へ導入するステップであって、前記加熱装置が、第1の加熱器、第2の加熱器、および前記試料区画内の前記流体試料を移動させるための移動部を備え、前記第1の加熱器が第1の温度に設定され、前記第2の加熱器が第2の温度に設定され、前記第1の温度が前記第2の温度よりも高く、前記試料区画の第1の部分が前記第1の加熱器に近接して設置されているため、前記第1の加熱器が前記試料区画の前記第1の部分に対して熱制御を呈し、前記試料区画の第2の部分が前記第2の加熱器に近接して設置されているため、前記第2の加熱器が前記試料区画の前記第2の部分に対して熱制御を呈する、ステップと、
前記流体試料の少なくとも一部分を前記試料区画の前記第1の部分と前記試料区画の前記第2の部分との間で選択的に移動させ、それにより前記試料のこれらの部分が同時に前記加熱器の各々の制御下にあるようにするステップとを含む、試料内の核酸を増幅する方法。 - (a)流体試料を容器の第1の区画内へ導入するステップであって、前記流体試料が標的核酸および前記標的核酸を増幅するための試薬を含み、前記第1の区画が、アニーリング温度未満である温度(低アニーリング温度)に設定される第1の加熱器の制御下にある、ステップと、
(b)前記第1の加熱器の温度を前記アニーリング温度まで上げるステップと、
(c)前記流体試料を容器の第2の区画へ移動させるステップであって、前記第2の区画が、延伸温度を上回る温度(高延伸温度)に設定される第2の加熱器の制御下にある、移動させるステップと、および、前記流体試料を前記第2の区画へ移動させた後に、前記第1の加熱器の温度を低アニーリング温度まで下げるステップと、を行うステップと、
(d)前記第2の加熱器の温度を前記延伸温度まで下げるステップと、
(e)前記第2の加熱器の温度を少なくとも変性温度まで上げるステップと、
(f)ステップ(a)から(e)を繰り返すステップとを含む、試料内の核酸を増幅する方法。 - ステップ(a)が繰り返されるとき、前記第2の加熱器の温度が前記高延伸温度へ移される、請求項73に記載の方法。
- 前記低アニーリング温度は、前記アニーリング温度より2度から20度低い、請求項73に記載の方法。
- 前記高延伸温度は、前記延伸温度より2度から10度高い、請求項73に記載の方法。
- ステップ(e)は、前記第2の加熱器の温度を、前記変性温度を上回る温度まで上げることを含み、ステップ(a)は、前記流体試料が前記変性温度に達するとすぐに繰り返される、請求項73に記載の方法。
- 試料を熱サイクルさせるための計器であって、
前記計器内に第1段階チャンバを有する可撓性試料容器を位置付けるための受け口と、
少なくとも第1の温度ゾーンおよび第2の温度ゾーンを含む加熱器要素とを備え、
前記受け口または前記加熱器要素のうちの1つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第1段階チャンバを前記加熱器要素の前記第1の温度ゾーンおよび前記第2の温度ゾーンに対して位置付け、
前記受け口および前記加熱器要素は、前記第1の温度ゾーンおよび前記第2の温度ゾーンが前記第1段階チャンバの温度を制御してその中で熱サイクルおよび核酸増幅を行うことを可能にするように構成される、計器。 - 前記可撓性試料容器は、試料調製ゾーンを含む、請求項78に記載の計器。
- 前記試料調製ゾーンは、前記第1段階チャンバから上流にある、請求項79に記載の計器。
- 前記計器は、前記試料容器の第1の側面に位置付けられたワイパ要素をさらに備え、前記ワイパ要素は、前記試料を前記試料調製ゾーン内および前記第1段階チャンバ内で混合するために前記試料容器に接触するように構成され、
前記受け口、前記ワイパ要素、または前記加熱器要素のうちの1つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記可撓性試料容器を前記ワイパ要素および前記加熱器要素に対して位置付け、
前記ワイパ要素および前記加熱器要素は、試料調製を行うように共同して働き、また核酸増幅を行うように共同して働く、請求項79に記載の計器。 - 前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンと前記第1段階チャンバとの間で移動可能であり、前記加熱器要素は、前記試料調製ゾーンおよび前記第1段階チャンバにおいて制御された温度ゾーンを画定するために移動可能である、請求項81に記載の計器。
- 前記受け口は、前記試料調製ゾーンおよび前記第1段階チャンバにおいて混合温度および画定された温度ゾーンを提供するために、前記ワイパ要素および前記加熱器に対して移動可能である、請求項81に記載の計器。
- 前記受け口、前記ワイパ要素、前記加熱器要素のうちの少なくとも2つは、前記試料調製ゾーンおよび前記第1段階チャンバにおいて混合温度および画定された温度ゾーンを提供するために移動可能である、請求項81に記載の計器。
- 前記加熱器要素は、前記試料調製ゾーン内に存在する試料を加熱するために、前記試料調製ゾーンへ移動可能であり、前記ワイパ要素は、前記試料調製ゾーンに接触して、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料をブレンドするように構成される少なくとも1つの刃を有する、請求項81に記載の計器。
- 前記ワイパ要素は、前記試料内の細胞を溶解するために前記試料内に旋回流、渦、およびキャビテーション気泡のうちの1つまたは複数を作る、請求項85に記載の計器。
- 前記試料調製ゾーンは、細胞溶解を高めるために研磨要素を含む、請求項86に記載の計器。
- 前記ワイパ要素は溶解構成要素を含む、請求項81に記載の計器。
- 前記加熱器要素は、前記試料の第1の部分が前記第1の温度ゾーンに隣接して位置付けられ、かつ前記試料の第2の部分が前記第2の温度ゾーンに隣接して位置付けられるように、前記第1段階チャンバに隣接して位置付け可能であり、前記計器は、前記第1段階チャンバを少なくとも第1の部分および第2の部分を含む少なくとも2つの別々のセクションに分割するように、および、前記試料の前記第1の部分および前記第2の部分が前記温度ゾーンの各々の制御下にあるように、前記試料の前記第1の部分を前記第2の温度ゾーンへ移動させながら前記試料の前記第2の部分を前記第1の温度ゾーンに移動させるために回転するように構成される少なくとも1つの刃を有するワイパ要素をさらに含む、請求項78に記載の計器。
- 前記刃は、前記試料を、少なくとも第1のセクションおよび第2のセクションを含む少なくとも2つの別々のセクションへと分割し、それにより、前記第1の部分が前記第1のセクションに含まれ、前記第2の部分が前記第2のセクションに含まれるようにする、請求項89に記載の計器。
- 前記ワイパ要素は、前記試料の前記第1の部分が前記第1の温度ゾーンの制御下にあり、前記試料の前記第2の部分が前記第2の温度ゾーンの制御下にあり、前記試料の第3の部分が、前記第1の温度ゾーンおよび前記第2の温度ゾーンの制御の間の遷移にあるように、前記試料を移動させる、請求項89に記載の計器。
- 前記ワイパ要素は、前記試料の部分を前記試料容器の反対の部分へと繰り返し移動させて前記試料を熱サイクルさせる、請求項89〜91のいずれかに記載の計器。
- 前記容器は、前記第1段階チャンバから下流に第2の核酸増幅ゾーンをさらに含み、前記受け口、前記可撓性試料容器、または前記加熱器要素のうちの1つまたは複数は移動可能であり、その移動により、前記第2の核酸増幅ゾーンにおいて、制御された温度ゾーンを画定するために前記第2の核酸増幅ゾーンを前記加熱器要素に対して位置付ける、請求項78に記載の計器。
- 前記第2の核酸増幅ゾーンは、前記第1の核酸増幅ゾーンに流体接続された個別の増幅ウェルのアレイを含み、前記アレイは、前記試料の少なくとも一部分を受容するように構成される、請求項93に記載の計器。
- 前記容器は、前記第1段階チャンバと前記アレイとの間にウェルを含み、前記ウェルは、前記試料の既知の容積を前記第1段階チャンバから受容し、前記既知の容積を前記アレイに送達するように構成される、請求項94に記載の計器。
- 前記容器は、前記ウェルと前記アレイとの間に希釈ゾーンを含み、前記希釈ゾーンは、前記既知の容積を前記ウェルから受容し、前記既知の容積をある容積の流体で希釈して、希釈された試料を得て、前記希釈された試料を前記アレイに送達するように構成される、請求項95に記載の計器。
- 前記受け口は、前記加熱器要素が前記受け口に挿入された可撓性試料容器の1つまたは複数の部分に接触することを可能にするように位置付けられた1つまたは複数の開口部を
有する実質的に平面の表面を含む、請求項78に記載の計器。 - 前記容器の少なくとも1つの部分から光学データを集めるように構成された、光源およびカメラ要素を含む光学アレイをさらに備える、請求項78に記載の計器。
- 前記加熱器要素は、第1の加熱器部分、第2の加熱器部分、および第3の加熱器部分を含む、請求項78に記載の計器。
- 前記第1の加熱器部分は、抵抗性加熱器であり、前記第2の加熱器部分は、ペルチェ素子であり、前記第3の加熱器部分は、抵抗性加熱器である、請求項99に記載の計器。
- 前記第3の加熱器部分は、ペルチェ素子の上に抵抗性加熱器を備え、前記抵抗性加熱器は、前記第3の加熱器部分を加熱するために使用され、前記ペルチェ素子は、前記第3の加熱器部分を冷却するために実質的に同時に使用される、請求項100に記載の計器。
- 前記第1の加熱器部分、前記第2の加熱器部分、および前記第3の加熱器部分は、直線的に設置される、請求項101に記載の計器。
- 前記計器の1つまたは複数の構成要素を制御するように、および/またはそこからデータを集めるように構成されたコンピューティングデバイスをさらに備える、請求項78〜102のいずれか一項に記載の計器。
- 可撓性試料容器を受容するための開口部であって、前記可撓性試料容器が少なくとも1つの反応ゾーンを含む、開口部と、
複数の加熱器であって、前記加熱器の各々が異なる温度に設定されるように構成され、各加熱器を前記少なくとも1つの反応ゾーンと順次整列させて、その中の試料を加熱または冷却することができるように、前記加熱器が実質的に平面の取付部に位置付けられる、複数の加熱器とを備える、試料内の核酸を増幅するための計器。 - 前記実質的に平面の取付部は、前記可撓性試料容器に隣接して回転されるように構成される円形取付部を備える、請求項104に記載の計器。
- 前記円形取付部は、時計回り方向および反時計回り方向の両方に回転するように構成される、請求項105に記載の計器。
- 反応ウェルのアレイを有する反応チャンバであって、前記アレイの前記ウェルの各々が、選択的に開放可能および選択的に密封可能な充填チャネルに流体接続される、反応チャンバを備える、可撓性試料容器。
- 前記可撓性試料容器は、第1のフィルム層、前記第1のフィルム層に少なくとも部分的に付着された第2のフィルム層、前記第2のフィルム層および前記アレイの前記反応ウェルが形成されるカード層の1つの表面に付着された接着剤層、ならびに第3の外側フィルム層および前記カード層の反対表面に付着された第2の接着剤層から製作され、
前記充填チャネルは、前記第1のフィルム層と前記第2のフィルム層との間に開放空間を残すことによって形成される、請求項107に記載の可撓性試料容器。 - 前記充填チャネルは、前記第1のフィルム層および前記第2のフィルム層を前記反応ウェルの前記アレイの周りで一緒に密封するシール線によって画定される、請求項108に記載の可撓性試料容器。
- 前記充填チャネルは、前記第2のフィルム層および前記第1の接着剤層内の選択的な切欠きによって形成された充填孔によって前記アレイの前記ウェルの各々に流体接続される、請求項108に記載の可撓性試料容器。
- 前記充填孔は、前記アレイのウェルに隣接して、かつその上を流れるウェル充填チャネルに流体接続され、前記ウェル充填チャネルは、前記アレイの前記ウェルに隣接する前記カード層内に切欠きを、および前記第2の接着剤層内に別の切欠きを作製することによって形成される、請求項110に記載の可撓性試料容器。
- 前記充填孔は、前記アレイのウェル内へ流れるウェル充填チャネルに流体接続され、前記ウェル充填チャネルは、前記充填孔を前記アレイの前記ウェルに流体接続する前記第1の接着剤層内の切欠きを作製することによって形成される、請求項110に記載の可撓性試料容器。
- 前記充填チャネルはヒートシール可能である、請求項107に記載の可撓性試料容器。
- 単一のヒートシールが、充填チャネルから複数の充填チャネルへの流れを密封し、前記ウェルを互いから密封する、請求項113に記載の可撓性試料容器。
- 前記充填チャネルは、前記アレイに対して圧力を印加することによって密封可能である、請求項107に記載の可撓性試料容器。
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