JP2021151241A - Ｍｐｓ ｉ、ｉｉ、ｉｉｉａ、ｉｉｉｂ、ｉｖａ、ｖｉ、およびｖｉｉをスクリーニングするための試薬および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】リソソーム酵素活性の新生児スクリーニングのための方法および試薬を提供する。【解決手段】リソソーム蓄積症と関係している酵素についてアッセイする方法であって、（ａ）サンプルを第１の溶液と接触させて、１種以上のリソソーム酵素を含む溶液を生成することと、（ｂ）前記１種以上のリソソーム酵素を含む溶液を、前記リソソーム蓄積症と関係している酵素の酵素基質と接触させ、前記リソソーム蓄積症と関係している酵素の酵素生成物を含む溶液を生成するのに十分な時間をかけて前記１種以上のリソソーム酵素を含む溶液をインキュベートすることと、（ｃ）前記リソソーム蓄積症と関係している酵素の量を決定することとを含み、前記リソソーム蓄積症と関係している酵素が、ヘパランＮ−スルファターゼまたはＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼから選択される、方法である。【選択図】図１

Description

発明の分野

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれの全内容が参照によりここに明確に組み込まれている、２０１３年９月５日出願の米国仮特許出願第６１／８７４，２９３号、２０１３年９月５日出願の米国仮特許出願第６１／８７４，３３１号、２０１３年９月９日出願の米国仮特許出願第６１／９６０，１０２号、２０１３年９月９日出願の米国仮特許出願第６１／９６０，１１３号、２０１４年３月７日出願の米国仮特許出願第６１／９４９，９７０号、２０１４年３月２０日出願の米国仮特許出願第６１／９６８，０２１号、２０１４年６月１３日出願の米国仮特許出願第６２／０１２，０２０号の利益を主張する。
政府の許諾の権利の規定
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から授与された認可番号ＤＫ６７８５９の政府支援によって実施された。政府は、本発明に特定の権利を有する。

本発明は、ＭＰＳ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶＡ、ＶＩ、およびＶＩＩをスクリーニングするための試薬、方法、およびキットに関する。

発明の背景

一部のリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の治療が可能になり、多くの場合、療法の早期開始が臨床改善につながる。こうした励みになる結果は、ＬＳＤの新生児スクリーニングに対する関心の広がりを生んでいる。

新生児スクリーニングプログラムは、これらの治療可能な病気と関係している代謝産物のレベルを定量化するために設立された。現在、ニューヨーク州は、クラッベ病のスクリーニングを実現しており、別のいくつかの州では新生児スクリーニングを発展させたＬＳＤに対する現在の法律が認可され、台湾ではポンペ病およびファブリー病についての新生児スクリーニングが実施されている。

ＭＰＳ（ＭＰＳ Ｉ〜ＶＩＩ）は、リソソーム酵素のうちの１種が不足することによって生じる代謝病／症候群のグループであり、グリコサミノグリカン（ヘパラン、デルマタン、ケラタン、またはコンドロイチンサルフェートなど）を分解する。適当な酵素として、５種のスルファターゼ、４種のエキソグリコシダーゼ、および１種の非加水分解的なアセチル−Ｎ−トランスフェラーゼが挙げられる。これらの症候群は、分解されない、または部分的に分解されたグリコサミノグリカンをもたらし、リソソーム中に蓄積し、その結果、不可逆的な多系統臓器障害を招く。

現在、いくつかのＭＰＳ症候群に対して治療が可能になったが、これらの治療による最適な効果は、不可逆的症状の発現前に治療を開始することが必要と考えられている。ＭＰＳ症候群の早期発見が、治療の潜在的効果を最大化するため、早期診断に適した検査を開発する必要がある。同様に、サンプル源として乾燥血液スポット（ＤＢＳ）、たとえば新生児スクリーニング用実験室に提出されるものを使用する、迅速、安価かつ信頼性のある診断法を開発する必要がある。

したがって、リソソーム酵素活性の新生児スクリーニングのための方法および試薬、特にＭＰＳ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶＡ、ＶＩ、およびＶＩＩの改善されたスクリーニングを可能にする方法および試薬に対する必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、さらに関連の利点を提供する。

本発明は、ＭＰＳ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶＡ、ＶＩ、およびＶＩＩをスクリーニングするための試薬、ＭＰＳ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶＡ、ＶＩ、およびＶＩＩをスクリーニングするための方法、ならびに試薬を含むキットを提供する。

一側面において、本発明は、リソソーム蓄積症と関係している１種以上の酵素をアッセイする方法を提供する。

第１の態様において、方法は、
（ａ）サンプルを第１の溶液と接触させて、１種以上のリソソーム酵素を含む溶液を生成することと、
（ｂ）溶液中の１種以上のリソソーム酵素を、分析しようとする各リソソーム酵素の酵素基質と接触させ、サンプル中に存在する各リソソーム酵素の酵素生成物を含む溶液を生成するのに十分な時間をかけて基質を酵素と一緒にインキュベートすることと、
ここで各リソソーム酵素の酵素基質は、炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式：

を有する化合物であり、
［式中、Ｓは、アグリコン部分に共有結合するときに、
（ｉ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
（ｉｉ）イズロン酸２−スルファターゼ、
（ｉｉｉ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
（ｉｖ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
（ｖ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、
（ｖｉ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、および
（ｖｉｉ）β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
Ｌ_２は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｌ_３は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｌ_４は、任意であり、存在する場合、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｒ_１は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基またはＣ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基であり、
Ｒ_２は、それぞれの出現において、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、または−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（式中、ＲはＣ_１〜Ｃ_８アルキル基である）から独立に選択され、
Ｒ_３は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基または置換もしくは無置換のＣ_６〜Ｃ_１０アリール基であり、
ｎは、０、１、２、３または４である］
（ｃ）１種以上の酵素生成物の量を決定することと
を含む。

ある種の態様において、方法は、酵素生成物をグリコヒドロラーゼと接触させて第２の酵素生成物を生成することをさらに含む。ある種の態様において、方法は、阻害剤を添加して、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼまたはＮ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼの基質に対して作用する内因性グリコヒドロラーゼ酵素活性を遮断することをさらに含む。

第２の態様において、方法は、
（ａ）サンプルを第１の溶液と接触させて、１種以上のリソソーム酵素を含む溶液を生成することと、
（ｂ）溶液中の１種以上のリソソーム酵素を、分析しようとする各リソソーム酵素の酵素基質と接触させ、サンプル中に存在する各リソソーム酵素の第１の酵素生成物を含む溶液を生成するのに十分な時間をかけて基質を酵素と一緒にインキュベートすることと、
（ｃ）第１の酵素生成物をグリコヒドロラーゼに供して、グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けやすい各第１の酵素生成物の第２の酵素生成物を生成することと、
（ｄ）１種以上の第１の酵素生成物および／または１種以上の第２の酵素生成物の量を決定することと
を含む。

上記の方法において、ある種の第１の酵素生成物は、グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けにくい。グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けにくい、第１の酵素生成物は、以下から選択される酵素の作用によって生成される。

（ａ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
（ｂ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、および
（ｃ）β−グルクロニダーゼ。

グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けやすい第１の酵素生成物は、以下から選択される酵素の作用によって生成される。

（ａ）イズロン酸２−スルファターゼ、
（ｂ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
（ｃ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、および
（ｄ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ。

ある種の態様において、方法は、阻害剤を添加して、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼまたはＮ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼの基質に対して作用する内因性グリコヒドロラーゼ酵素活性を遮断することをさらに含み、ここで、阻害剤は、工程（ｃ）のグリコヒドロラーゼの活動を有意に阻害しない。

上記の方法において、１種以上のリソソーム酵素は、以下から選択される酵素を含む。

（ａ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
（ｂ）イズロン酸２−スルファターゼ、
（ｃ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
（ｄ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
（ｅ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、
（ｆ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、および
（ｇ）β−グルクロニダーゼ。

上記の方法のある種の態様において、分析しようとする各リソソーム酵素の内部標準は、リソソーム酵素を基質と接触させる前、後、または同時に添加する。

上記の方法のある種の態様において、酵素反応を失活した後で、１種以上の酵素生成物の量を決定する。

上記の方法の態様において、サンプルは、血液または組織サンプルである。ある種の態様において、サンプルは乾燥血液スポットである。

代表的なグリコヒドロラーゼは、ヒトヘキソサミニダーゼＡ、細菌性Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、細菌性β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ（アスペルギルス）、およびα−グルコシダーゼ（酵母）を含む。

代表的な阻害剤は、（Ｚ）−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）−アミノＮ−フェニルカルバメート、１−デオキシノジリマイシン、カスタノスペルミン、スウェインソニン、カリステギンＢ_２、イソファガミン（isofagamine）、タミフル、グルコノヒドロキシモラクトン、グルクロン酸ならびにそのラクトンおよびラクタム、リレンザ、ミグリトール、フェネチル置換グルコ−およびガラクト−イミダゾール、Ｎ−ヒドロキシエチルデヒドロノジリマイシン、ＧａｌＮＡｃチアゾリン、ならびにＧｌｃＮＡｃチアゾリンを含む。

上記の方法のある種の態様において、酵素生成物（たとえば、第１および／または第２の酵素生成物）の量を決定することは、質量分光分析を含む。ある種の態様において、酵素生成物の量を決定することは、質量分光分析によって各生成物とその内部標準との比を決定することを含む。ある種の態様において、酵素生成物の量を決定することは、生成物およびこれらの内部標準の親イオンを生成し、単離し、衝突誘起解離を受けて、生成物断片イオンおよび内部標準断片イオンを生成する、タンデム質量分光分析を含む。ある種の態様において、酵素生成物の量を決定することは、生成物断片イオンおよび内部標準断片イオンの各ピーク強度を比較して生成物の量を計算することを含む。ある種の態様において、酵素生成物の量を決定することは、液体クロマトグラフィーまたはフローインジェクションによって生成物を質量分析計に導くことを含む。

上記の方法のある種の態様において、酵素生成物の量を決定することは、蛍光分析を含む。

上記の方法のある種の態様において、方法は、酵素生成物の量を用いて、サンプルが、１種以上のリソソーム酵素欠損症と関係している病状を治療するための候補に由来しているかどうかを決定することをさらに含む。

上記の方法の第２の態様において、ある種の態様において、基質は、炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式：

を有する
［式中、
Ｓは、アグリコン部分に共有結合するときに、
（ａ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
（ｂ）イズロン酸２−スルファターゼ、
（ｃ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
（ｄ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
（ｅ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、
（ｆ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、および
（ｇ）β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
Ｌ_２は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｌ_３は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｌ_４は、任意であり、存在する場合、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｒ_１は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基またはＣ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基であり、
Ｒ_２は、それぞれの出現において、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、または−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（式中、ＲはＣ_１〜Ｃ_８アルキル基である）から独立に選択され、
Ｒ_３は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基または置換もしくは無置換のＣ_６〜Ｃ_１０アリール基であり、
ｎは、０、１、２、３または４である］。

本発明の方法において有用な代表的基質は、ここと以下に記載の本発明の基質を含む。

本発明の方法において有用な代表的内部標準は、ここに記載する本発明の内部標準を含む。

本発明の別の側面において、リソソーム蓄積症と関係している１種以上の酵素をアッセイするための試薬（基質および内部標準）を提供する。

代表的基質は、炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式：

を有する化合物を含む
［式中、Ｓは、アグリコン部分に共有結合するときに、
（ａ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
（ｂ）イズロン酸２−スルファターゼ、
（ｃ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
（ｄ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
（ｅ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、
（ｆ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、および
（ｇ）β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
Ｌ_２は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｌ_３は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｌ_４は、任意であり、存在する場合、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｒ_１は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基またはＣ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基であり、
Ｒ_２は、それぞれの出現において、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、または−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（式中、ＲはＣ_１〜Ｃ_８アルキル基である）から独立に選択され、
Ｒ_３は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基または置換もしくは無置換のＣ_６〜Ｃ_１０アリール基であり、
ｎは、０、１、２、３または４である］。

ある種の態様において、Ｌ_２は−（ＣＨ_２）_ｎ−であり、ここでｎは１〜６である。

ある種の態様において、Ｌ_３は、−（ＣＨ_２）_ｍ−（式中、ｍは１〜１２である）である。

ある種の態様において、Ｌ_４は、−（ＣＨ_２）_ｎ−（式中、ｎは１〜６である）である。

ある種の態様において、Ｌ_４は存在しない。

ある種の態様において、Ｒ_１は、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキルである。

ある種の態様において、Ｒ_２は、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキルである。

ある種の態様において、Ｒ_３は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルである。

ある種の態様において、Ｒ_３はフェニルである。

代表的基質を以下に示す。

ある種の態様において、基質は次式：

を有する。

一態様において、基質は次式：

を有する。

ある種の態様において、基質は次式：

を有する。

一態様において、基質は次式：

を有する。

ある種の態様において、基質は次式：

を有する。

一態様において、基質は次式：

を有する。

ある種の態様において、基質は次式：

を有する。

一態様において、基質は次式：

を有する。

ある種の態様において、基質は次式：

を有する。

一態様において、基質は次式：

を有する。

ある種の態様において、基質は次式：

を有する。

一態様において、基質は次式：

を有する。

ある種の態様において、基質は次式：

を有する。

一態様において、基質は次式：

を有する。

本発明のさらなる側面において、リソソーム蓄積症と関係している１種以上の酵素をアッセイするためのキットを提供する。一態様において、キットは、本発明の１種以上の試薬（たとえば、基質および内部標準）を含む。ある種の態様において、キットによってアッセイできる酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＭＰＳ−Ｉ）、イズロン酸２−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩ）、ヘパランＮ−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ）、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＢ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＶＡ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＶＩ）、およびβ−グルクロニダーゼ（ＭＰＳ−ＶＩＩ）のうちの１つ以上を含む。

図１は、本発明の代表的なＭＰＳ−ＶＩアッセイにおける、添加されたヘキソサミニダーゼＡの量の関数として放出されたアグリコンの量を例示したグラフである。アグリコンは、ＵＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出された。 図２は、本発明の代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ基質の調製の概略図である。 図３は、本発明の代表的なＭＰＳ−ＶＩ基質の調製の概略図である。 図４は、本発明の代表的なＭＰＳ−ＶＩ基質の調製の概略図である。 図５は、代表的なＭＰＳ−ＶＩ生成物の調製の概略図である。

発明の詳細な説明

本発明は、ムコ多糖症Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶＡ、ＶＩ、およびＶＩＩ（それぞれＭＰＳ−Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶＡ、ＶＩ、およびＶＩＩ）をスクリーニングするための試薬、ＭＰＳ−Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶＡ、ＶＩ、およびＶＩＩのスクリーニング方法、ならびに試薬を含むキットを提供する。

一側面において、本発明は、ＭＰＳ−Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶＡ、ＶＩ、およびＶＩＩをスクリーニングするための試薬を提供する。ある種の態様において、本発明の試薬は、ＭＰＳ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶＡ、ＶＩ、およびＶＩＩをスクリーニングするための基質（Ｓ）、生成物（Ｐ）、および内部標準（ＩＳ）を含む。

別の側面において、本発明は、ＭＰＳ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶＡ、ＶＩ、およびＶＩＩのスクリーニング方法を提供する。方法は、特定の酵素をアッセイし、この酵素の不足がリソソーム蓄積症の病状につながる。方法は、有利には、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＭＰＳ−Ｉ）、イズロン酸２−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩ）、ヘパランＮ−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ）、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＢ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＶＡ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＶＩ）、およびβ−グルクロニダーゼ（ＭＰＳ−ＶＩＩ）のうちの１つ以上をアッセイする。

試薬
一側面において、本発明は、酵素をアッセイするために有利に利用され得る試薬を提供する。試薬は、酵素基質（Ｓ）、酵素生成物（Ｐ）、およびアッセイ内部標準（ＩＳ）を含む。ある種の態様において、１種以上の基質（Ｓ）およびこれらの対応する内部標準（ＩＳ）を好適な緩衝液中で好適な酵素源、たとえば新生児検査カードまたは尿サンプル由来の乾燥血液スポットと一緒に十分な時間かけてインキュベートして１種以上の生成物（Ｐ）を形成し、続いてこれをタンデム質量分光分析によって検出する。ある種の態様において、内部標準（ＩＳ）は、標準が異なる質量（たとえば、置換されたホモログまたは重同位体、たとえば重水素および／または炭素−１３置換基）を有する以外は、酵素形成生成物と化学的に類似している、または同等である。他の態様において、１つ以上の基質（Ｓ）を好適な緩衝液中で好適な酵素源と一緒にインキュベートして、１種以上の生成物（Ｐ）を形成し、これを続いて蛍光分析によって検出する。

本発明の試薬で有利にアッセイされる酵素として、以下が挙げられる：
（ａ）基質ＭＰＳ−Ｉ−Ｓに作用して、生成物ＭＰＳ−Ｉ−Ｐを生成し、アッセイには内部標準ＭＰＳ−Ｉ−ＩＳを使用する、α−Ｌ−イズロニダーゼ、
（ｂ）基質ＭＰＳ−ＩＩ−Ｓに作用して、生成物ＭＰＳ−ＩＩ−Ｐを生成し、アッセイには内部標準ＭＰＳ−ＩＩ−ＩＳを使用する、イズロン酸−２−スルファターゼ、
（ｃ）基質ＭＰＳ−ＩＩＩＡ−Ｓに作用して、生成物ＭＰＳ−ＩＩＩＡ−Ｐを生成し、アッセイには内部標準ＭＰＳ−ＩＩＩＡ−ＩＳを使用する、ヘパランＮ−スルファターゼ、
（ｄ）基質ＭＰＳ−ＩＩＩＢ−Ｓに作用して、生成物ＭＰＳ−ＩＩＩＢ−Ｐを生成し、アッセイには内部標準ＭＰＳ−ＩＩＩＢ−ＩＳを使用する、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
（ｅ）基質ＭＰＳ−ＩＶＡ−Ｓに作用して、生成物ＭＰＳ−ＩＶＡ−Ｐを生成し、アッセイには内部標準ＭＰＳ−ＩＶＡ−ＩＳを使用する、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、
（ｆ）基質ＭＰＳ−ＶＩ−Ｓに作用して、生成物ＭＰＳ−ＶＩ−Ｐを生成し、アッセイには内部標準ＭＰＳ−ＶＩ−ＩＳを使用する、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸スルファターゼ、および
（ｇ）基質ＭＰＳ−ＶＩＩ−Ｓに作用して、生成物ＭＰＳ−ＶＩＩ−Ｐを生成し、アッセイには内部標準ＭＰＳ−ＶＩＩ−ＩＳを使用する、β−グルクロニダーゼ。

以下は、本発明の試薬、ＭＰＳ−Ｉ、ＭＰＳ−ＩＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ、ＭＰＳ ＩＶＡ、ＭＰＳ−ＶＩ、およびＭＰＳ−ＶＩＩの基質（Ｓ）、生成物（Ｐ）、ならびに内部標準（ＩＳ）の説明である。

糖−アグリコン

本発明の基質は、グリコシドである。用語「グリコシド」は、グリコシド結合によって糖基（グリコーン）がそのアノマー炭素を通して別の基（アグリコン）に結合している化合物を意味する。

本発明の基質は、糖−アグリコン構造を有することを特徴とする。基質の糖成分は、特定の酵素の基質である天然糖またはアッセイする特定の酵素の基質であるのに十分な機能を維持する改質糖のいずれかである。基質のアグリコン成分は、酵素活性の分析を可能にする。基質のアグリコン成分は、酵素生成物の成分でもあり、分析して酵素活性を決定する。アグリコン成分は、質量分析または蛍光の分析機能を含む。分析が質量分析によるものである場合、生成物とは異なる質量を有する内部標準を用いてもよい。内部標準は、生成物と構造的に同一で、１種以上の同位体（たとえば、重水素または^１３Ｃ）を含むか、または構造的に類似しており、機能的に同等の構造および構造変動（たとえば、ホモログ：−（ＣＨ_２）_５−ｖ．−（ＣＨ_２）_６−またはその逆も同様）を有するかのいずれかである。

アグリコン
本発明の試薬は、アグリコン成分を含む。アグリコンの性質は、対象の酵素をアッセイするために利用される分析技術の性質に応じて変わり得る。代表的アグリコンは、以下の式（Ｉ）〜（ＶＩ）によって表される。以下のアグリコン構造において、波線は、糖アノマー炭素に結合する箇所を示す。

ある種の態様において、アグリコンは、次式：

を有するタイプＡアグリコンである
［式中、Ｌ_１は、Ｇ_１とクマリン部分とを共有結合するリンカーであり、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、およびＸ_４は、それぞれの出現において独立に、水素またはハロゲン（たとえば、クロロ）である］。

ある種の態様において、Ｌ_１は、１〜２０個の炭素原子（分枝または直鎖状）を含み、１個以上の炭素原子は、エーテル酸素もしくは−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−基、チオエーテル硫黄もしくは−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−基、ＮＨ、ＮＲ、または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−もしくは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ−（式中、Ｒは、炭素１〜６個のアルキル基である）により置きかえられていてもよい。水素原子による１個以上の炭素原子の置換は任意である。ある種の態様において、Ｌ_１は、−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｇ_１である。

Ｇ_１は、正電荷を持つ基（たとえば、永久的に正電荷を持つ基、たとえば第四級アンモニウムイオン）、たとえば以下のうちの１つを含む：
（ａ）Ｎ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）（Ｒ_ｃ）^＋（式中、Ｒ_ａ、Ｒ_ｂおよびＲ_ｃは、それぞれ独立に、Ｈまたは炭素１〜６個のアルキル基である）、
（ｂ）Ｓ（Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）^＋（式中、Ｒ_ａおよびＲ_ｂは、上記の通りである）、
（ｃ）次のタイプのピリジニウム、

（ｄ）次のタイプのピリジニウム、

（ｅ）次のタイプのピリジニウム、

（ｆ）次のタイプのピリジニウム、

ある種の態様において、Ｌ_１は、−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_４−Ｎ^＋（Ｃ_５Ｈ_５）であり、ここで−Ｃ_６Ｈ_４−Ｎ^＋（Ｃ_５Ｈ_５）はｐ−ピリジニウムフェニルである。

上記のクマリン（ウンベリフェロン）アグリコン類に加えて、下記の他の蛍光アグリコン類（たとえば、フルオレセイン類、レゾルフィン類、ローダミン類、ニトロフェノール類、および７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン類）、ならびにこれらのハロゲン化誘導体）も利用できることを理解されたい。

ある種の態様において、タイプＡアグリコンは次式：

を有する［式中、Ｒ_ｄは、水素またはメチルであり、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、およびＸ_４は、それぞれの出現において独立に、水素またはハロゲン（たとえば、クロロ）である］。上記のクマリン（ウンベリフェロン）アグリコンに加えて、他の蛍光アグリコンも利用できることを理解されたい。好適な他のアグリコン類として、フルオレセイン類、レゾルフィン類、ローダミン類、ニトロフェノール類、および７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン類）、ならびにこれらのハロゲン化誘導体が挙げられる。フルオレセイン類、レゾルフィン類、ニトロフェノール類、および７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン類）の場合、上記のクマリンにおいてと同様に、アグリコンは糖に、そのヒドロキシ基を通して結合する。ローダミンの場合、アグリコンは糖にそのアミノ基を通して結合する。

タイプＡアグリコン成分は、本発明の試薬中に含まれ得、蛍光機能（すなわち、クマリン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、レゾルフィン、ニトロフェノール、ローダミン、７−ヒドロキシ−９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン）部分）を付与し、蛍光技術による分析が可能な試薬を生成する。

一態様において、アグリコンは、タイプＢアグリコンであり、次式：

を有する。

Ｌ_２は、１〜２０個の炭素原子（分枝または直鎖状）を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がヘテロ原子（たとえば、Ｎ、Ｏ、Ｓ）で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子が置換されていてもよい（たとえば、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、ハロゲン）。ある種の態様において、Ｌ_２は−（ＣＨ_２）_ｎ−であり、ここでｎは１〜６である。ある種の態様において、Ｌ_２は−（ＣＨ_２）_２−である。

Ｌ_３は、１〜２０個の炭素原子（分枝または直鎖状）を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がヘテロ原子（たとえば、Ｎ、Ｏ、Ｓ）で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子が置換されていてもよい（たとえば、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、ハロゲン）。ある種の態様において、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_ｍ−であり、ここでｍは１〜１２である。ある種の態様において、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_ｍ−であり、ここでｍは４、５または６である。

Ｒ_１は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基（たとえば、分枝または直鎖状）またはＣ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基（たとえば、ＯｔＢｕ）である。ある種の態様において、Ｒ_１は、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキル基（たとえば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル）である。

Ｒ_２は、それぞれの出現において、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基（たとえば、分枝または直鎖状）、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基（たとえば、分枝または直鎖状）、ハロゲン（たとえば、フルオロ、クロロ）、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、または−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ［式中、ＲはＣ_１〜Ｃ_８アルキル基（たとえば、メチル）であり、ｎは０、１、２、３または４である］から独立に選択される。Ｒ_２の（フェノール性酸素に対する）代表的な置換パターンは、２−、２，６−ジ、３−、３，５−ジ、および２，３−ジを含む（すなわち、２位および６位はオルトであり、３位および５位はメタである）。ある種の態様において、Ｒ_２は、フェノール性酸素に対してオルトまたはメタのいずれかに配置されるフルオロ、メチル、またはメトキシ基である（たとえば、２−フルオロ、２−メチル、２−メトキシ、３−フルオロ、３−メチル、３−メトキシ）。他の態様において、Ｒ_２は、フェノール性酸素に対してメタに配置されるフルオロ、メチル、またはメトキシ基である。ある種の態様において、ｎはゼロであり、フェニレン基は無置換である。

Ｒ_３は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基（たとえば、分枝または直鎖状）、または置換もしくは無置換のＣ_６〜Ｃ_１０アリール基（たとえば、フェニル）である。アリール基の置換基として、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基（たとえば、分枝または直鎖状）、およびハロゲン（たとえば、クロロ）が挙げられる。ある種の態様において、Ｒ_３はＣ_１〜Ｃ_６アルキル基（たとえば、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル）である。他の態様において、Ｒ_３はフェニル基である。

ある種の態様において、タイプＢアグリコンは、次式：

を有する
［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りであり、Ｒ_４は、それぞれの出現において、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル（たとえば、メチル）から独立に選択され、ｍは０、１、２、３、４または５である。ある種の態様において、ｍは０である。他の態様において、Ｒ_４はＣ_１〜Ｃ_５アルキル基（たとえば、メチル）であり、ｍは２である］。

別の態様において、タイプＢアグリコンは、次式：

を有する
［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りであり、Ｌ_４は、１〜２０個の炭素原子（分枝または直鎖状）を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がヘテロ原子（たとえば、Ｎ、Ｏ、Ｓ）で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子が置換されていてもよい（たとえば、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、ハロゲン）。ある種の態様において、Ｌ_４は−（ＣＨ_２）_ｎ−であり、ここでｎは１〜６である。ある種の態様において、Ｌ_４は−（ＣＨ_２）−である］。

ある種の態様において、タイプＢアグリコンは、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、ｎおよびｍは、式（Ｖ）について上で説明した通りである］。

重原子誘導体

ある種の態様において、本発明の試薬は、これらの重原子誘導体（すなわち、１つ以上の重原子同位体を含む誘導体）を含む。重原子誘導体は、質量分光分析を利用するアッセイ用の内部標準として有用である。ある種の態様において、タイプＡおよびタイプＢアグリコンは、アグリコンの質量が１ダルトン以上増加するように、重水素で置きかえられる１個以上（たとえば、３個以上）の水素原子または炭素−１３で置きかえられる１個以上（たとえば、３個以上）の炭素原子を有する。酵素生成物と内部標準のペア（たとえば、ＭＰＳ−ＩＩ−ＰおよびＭＰＳ−ＩＩ−ＩＳ）間の関係では、試薬は質量が異なり、質量の違いは、追加の（または減じた）原子（たとえば、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、またはＲ_４に対して、たとえば、１つ以上のメチレンによる化合物の一部の長さにおける変化）の使用によって、または重原子（たとえば、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、またはＲ_４中、たとえば、水素の場合は重水素、炭素の場合は^１３Ｃ、窒素の場合は^１５Ｎ）の取り込みによって実現し得る。

ＭＰＳ−Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶＡ、ＶＩ、およびＶＩＩ試薬の基質／内部標準ペア用の代表的アグリコンを以下に挙げる：
ＭＰＳ−Ｉ基質（式（ＩＶ）参照）の場合、Ｒ_１はメチルであり、Ｒ_２は水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_６−であり、Ｒ_４は水素であり、ｍは５であり、ＭＰＳ−Ｉ内部標準の場合、Ｒ_１はメチルであり、Ｒ_２は水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_６−であり、Ｒ_４は重水素であり、ｍは５である。

ＭＰＳ−ＩＩ基質（式（ＩＶ）参照）の場合、Ｒ_１はｎ−ブチルであり、Ｒ_２は水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_６−であり、Ｒ_４は水素であり、ｍは５であり、ＭＰＳ−ＩＩ内部標準の場合、Ｒ_１はｎ−ブチルであり、Ｒ_２は水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_６−であり、Ｒ_４は重水素であり、ｍは５である。

ＭＰＳ−ＩＩＩＡ基質（式（ＩＶ）参照）の場合、Ｒ_１はエチルであり、Ｒ_２は水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_６−であり、Ｒ_４は水素であり、ｍは５であり、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ内部標準の場合、Ｒ_１はエチルであり、Ｒ_２は水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_６−であり、Ｒ_４は重水素であり、ｍは５である。

ＭＰＳ−ＩＩＩＢ基質（式（ＩＩＩ）参照）の場合、Ｒ_１はｎ−ブチルであり、Ｒ_２は水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_６−であり、Ｒ_３はエチルであり、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ内部標準の場合、Ｒ_１はｎ−ブチルであり、Ｒ_２は重水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_６−であり、Ｒ_３はエチルである。

ＭＰＳ−ＩＶＡ基質（式（ＩＩＩ）参照）の場合、Ｒ_１はｎ−ブチルであり、Ｒ_２は水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_５−であり、Ｒ_３は３，５−ジメチルフェニルであり、ＭＰＳ−ＩＶＡ内部標準の場合、Ｒ_１はｎ−ブチルであり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_５−であり、Ｒ_３は３，５−ジメチルフェニルであり、Ｒ_２は重水素であり、ｎは４であり、代替の態様において、ＭＰＳ−ＩＶＡ基質の場合、Ｒ_１はｎ−ペンチルであり、Ｒ_２は水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_６−であり、Ｒ_３はフェニルであり、ＭＰＳ−ＩＶＡ内部標準の場合、Ｒ_１はｎ−ペンチルであり、Ｒ_２は水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_６−であり、Ｒ_３はｄ_５−フェニルである。

ＭＰＳ−ＶＩ基質（式（ＩＶ）参照）の場合、Ｒ_１はｎ−ブチルであり、Ｒ_２は水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_５−であり、Ｒ_４は水素であり、ｍは５であり、ＭＰＳ−ＶＩ内部標準の場合、Ｒ_１はｎ−ブチルであり、Ｒ_２は水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_５−であり、Ｒ_４は重水素であり、ｍは５である。

ＭＰＳ−ＶＩＩ基質（式（ＩＩＩ）参照）の場合、Ｒ_１はブチルであり、Ｒ_２は水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_６−であり、Ｒ_３はプロピルであり、ＭＰＳ−ＶＩＩ内部標準の場合、Ｒ_１はブチルであり、Ｒ_２は重水素であり、ｎは４であり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_６−であり、Ｒ_３はプロピルである。

塩
ある種の態様において、試薬は、ｐＨ環境に応じて荷電基（たとえば、−ＮＨ_３ ^＋、−ＣＯ_２ ⁻、−ＯＳＯ_３ ⁻、−ＮＨＳＯ_３ ⁻）になることができるアミノ基（たとえば、−ＮＨ_２）、カルボン酸基（−ＣＯ_２Ｈ）、スルホン酸基（たとえば、−ＯＳＯ_３Ｈ）、およびアミドスルホン酸基（たとえば、−ＮＨＳＯ_３Ｈ）を含む。本発明の試薬は、これらの塩（たとえば、金属塩）を含むことを理解されたい。

代表的なＭＰＳ−Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶＡ、およびＶＩ試薬の調製は、例１、４および５に記載されている。

以下は、本発明の代表的な試薬（すなわち、化合物）の説明である。

ＭＰＳ−Ｉ試薬
一態様において、本発明は、次式：

によって定義されるＭＰＳ−Ｉ試薬（Ｓ、Ｐ、およびＩＳ試薬）
［式中、
Ｒ_１＝アグリコン、Ｒ_２＝Ｈ
または
Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝アグリコン
Ｒ_３＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_４＝Ｈ
または
Ｒ_４＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_３＝Ｈ
Ｒ_５＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_６＝Ｈ
または
Ｒ_６＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_５＝Ｈ
Ｒ_７＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_８＝Ｈ
または
Ｒ_８＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_７＝Ｈ
Ｒ_９＝ＣＯＯＨ、およびＲ_１０＝Ｈ
または
Ｒ_１０＝ＣＯＯＨ、およびＲ_９＝Ｈ
ただし、Ｒ_３とＲ_４、Ｒ_５とＲ_６、およびＲ_７とＲ_８のペアのうちの１つのみが、両方のＲ基を水素として有していてもよい（すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基（−ＣＨ_２−）のみを含むことができる）］、
その塩およびこれらの重原子誘導体を提供する。

上記の化合物の場合、アグリコンは上記の通りである。

上記のＭＰＳ−Ｉ試薬のある種の態様において、炭水化物部分は、水素原子により置きかえられ、この場合、水素原子がアグリコンに添加される。これらの試薬は、ＭＰＳ−Ｉ酵素生成物および内部標準を代表するものである。

一態様において、糖は次式：

を有する。

ある種の態様において、化合物は、ｐＨ環境に応じて電荷基（たとえば、−ＮＨ_３ ^＋または−ＣＯ_２ ⁻）になることができるアミノ基（たとえば、−ＮＨ_２）およびカルボン酸基（−ＣＯ_２Ｈ）を含む。本発明の化合物は、これらの塩（たとえば、金属塩）を含むことを理解されたい。

上記の通り、本発明の化合物は、これらの重原子誘導体を含む。重原子誘導体は、内部標準として有用である。ある種の態様において、タイプＡおよびタイプＢアグリコンは、アグリコンの質量が１ダルトン以上増加するように、重水素で置きかえられる１個以上の（たとえば、３個以上の）水素原子、または炭素−１３で置きかえられる１個以上の（たとえば、３個以上の）炭素原子を有する。酵素生成物および内部標準は、質量が異なり、質量の違いは、追加原子（たとえば、１つ以上のメチレンによる化合物の一部の長さにおける変化）の使用によって、または重原子（たとえば、水素の場合は重水素、炭素の場合は^１３Ｃ、窒素の場合は^１５Ｎ）の取り込みによって実現し得る。

上に定義のＭＰＳ−Ｉ試薬のある種の態様において、炭水化物部分は水素原子により置きかえられ、この場合、水素原子がアグリコンに添加される。これらの試薬は、ＭＰＳ−Ｉ酵素生成物および内部標準を代表するものである。

代表的なＭＰＳ−Ｉ試薬は、以下の化合物を含む。

ある種の態様において、ＭＰＳ−Ｉ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

ある種の態様において、ＭＰＳ−Ｉ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、およびＲ_１は、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

代表的なＭＰＳ−Ｉ基質は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−Ｉ−Ｓ）から形成されたＭＰＳ−Ｉ生成物は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

代表的なＭＰＳ−Ｉ生成物は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−Ｉ−Ｓ）から形成された生成物をアッセイする上で有用なＭＰＳ−Ｉ内部標準は、次式：

を有し［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］、ＭＰＳ−Ｉ−ＩＳの質量は、ＭＰＳ−Ｉ−Ｐの質量と異なり、この２つは質量分析により識別できる。上記の通り、ＭＰＳ−Ｉ−ＩＳは、１個以上の重原子同位体（上記の構造中には図示せず）を含むことができ、または構造変動（たとえば、基質のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、およびＲ_２の１個以上は、内部標準のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、およびＲ_２と異なる）を有し得る。

代表的なＭＰＳ−Ｉ内部標準は、次式：

を有する。

代表的なＭＰＳ−Ｉ基質に由来する代表的なＭＰＳ−Ｉ生成物は、代表的なＭＰＳ−Ｉ内部標準を使用してアッセイすることができる。

ＭＰＳ−ＩＩ試薬
一態様において、本発明は、次式：

によって定義されるＭＰＳ−ＩＩ試薬（Ｓ、Ｐ、およびＩＳ試薬）
［式中、
Ｒ_１＝アグリコン、Ｒ_２＝Ｈ
または
Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝アグリコン
Ｒ_３＝ＯＳＯ_３Ｈ、ＮＨＳＯ_３Ｈであり、Ｒ_４＝Ｈ
または
Ｒ_４＝ＯＳＯ_３Ｈ、ＮＨＳＯ_３Ｈであり、Ｒ_３＝Ｈ
Ｒ_５＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２であり、Ｒ_６＝Ｈ
または
Ｒ_６＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２であり、Ｒ_５＝Ｈ
Ｒ_７＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２であり、Ｒ_８＝Ｈ
または
Ｒ_８＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２であり、Ｒ_７＝Ｈ
Ｒ_９＝ＣＯＯＨであり、Ｒ_１０＝Ｈ
または
Ｒ_１０＝ＣＯＯＨであり、Ｒ_９＝Ｈ
ただし、Ｒ_５とＲ_６、およびＲ_７とＲ_８のペアのうちの１つのみが、両方のＲ基を水素として有していてもよい（すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基（−ＣＨ_２−）のみを含むことができる）］、
その塩およびこれらの重原子誘導体を提供する。

上記の化合物の場合、アグリコンは上記の通りである。

一態様において、糖は次式：

を有する。

別の態様において、糖は次式：

を有する。

ある種の態様において、化合物は、ｐＨ環境に応じて電荷基（たとえば、−ＮＨ_３ ^＋、−ＣＯ_２ ⁻、−ＯＳＯ_３ ⁻）になることができるアミノ基（たとえば、−ＮＨ_２）、カルボン酸基（−ＣＯ_２Ｈ）、およびスルホン酸基（たとえば、−ＯＳＯ_３Ｈ）を含む。本発明の化合物は、これらの塩（たとえば、金属塩）を含むことを理解されたい。

上記の通り、本発明の化合物は、これらの重原子誘導体を含む。重原子誘導体は、内部標準として有用である。さらなる態様において、タイプＡおよびタイプＢアグリコンは、アグリコンの質量が１ダルトン以上増加するように、重水素で置きかえられる１個以上の（たとえば、３個以上の）水素原子、または炭素−１３で置きかえられる１個以上の（たとえば、３個以上の）炭素原子を有する。酵素生成物および内部標準は、質量が異なり、質量の違いは、追加原子（たとえば、１つ以上のメチレンによる化合物の一部の長さにおける変化）の使用によって、または重原子（たとえば、水素の場合は重水素、炭素の場合は^１３Ｃ、窒素の場合は^１５Ｎ）の取り込みによって実現し得る。

ＭＰＳ−ＩＩ酵素生成物および内部標準は、質量が異なり、質量の違いは、追加原子（たとえば、１つ以上のメチレンによる化合物の一部の長さにおける変化）の使用によって、または重原子（たとえば、水素の場合は重水素、炭素の場合は^１３Ｃ、窒素の場合は^１５Ｎ）の取り込みによって実現し得る。

代表的なＭＰＳ−ＩＩ試薬は、以下の化合物を含む。

ある種の態様において、ＭＰＳ−ＩＩ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

ある種の態様において、ＭＰＳ−ＩＩ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、およびＲ_１は、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

代表的なＭＰＳ−ＩＩ基質は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−ＩＩ−Ｓ）から形成されたＭＰＳ−ＩＩ生成物は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。
代表的なＭＰＳ−ＩＩ生成物は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−ＩＩ−Ｓ）から形成された生成物をアッセイする上で有用なＭＰＳ−ＩＩ内部標準は、次式：

を有し［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］、ＭＰＳ−ＩＩ−ＩＳの質量は、ＭＰＳ−ＩＩ−Ｐの質量と異なり、この２つは質量分析により識別できる。上記の通り、ＭＰＳ−ＩＩ−ＩＳは、１個以上の重原子同位体（上記の構造中には図示せず）を含むことができ、または構造変動（たとえば、基質のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、またはＲ_２の１個以上は、内部標準のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、またはＲ_２と異なる）を有し得る。

代表的なＭＰＳ−ＩＩ内部標準は、次式：

を有する。

代表的なＭＰＳ−ＩＩ基質に由来する代表的なＭＰＳ−ＩＩ生成物は、代表的なＭＰＳ−ＩＩ内部標準を使用してアッセイすることができる。

ＭＰＳ−ＩＩＩＡ試薬
別の態様において、本発明は、次式：

によって定義されるＭＰＳ−ＩＩＩＡ試薬（Ｓ、ＰおよびＩＳ試薬）
［Ｒ_１＝アグリコン、Ｒ_２＝Ｈ
または
Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝アグリコン
Ｒ_３＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＳＯ_３Ｈ、ＯＳＯ_３Ｈであり、Ｒ_４＝Ｈ
または
Ｒ_４＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＳＯ_３Ｈ、ＯＳＯ_３Ｈであり、Ｒ_３＝Ｈ
Ｒ_５＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２であり、Ｒ_６＝Ｈ
または
Ｒ_６＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２であり、Ｒ_５＝Ｈ
Ｒ_７＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２であり、Ｒ_８＝Ｈ
または
Ｒ_８＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２であり、Ｒ_７＝Ｈ
Ｒ_９＝ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＮＨ_２であり、Ｒ_１０＝Ｈ
または
Ｒ_１０＝ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＮＨ_２であり、Ｒ_９＝Ｈ］、
その塩およびこれらの重原子誘導体を提供し、
式中、アグリコンは、上記の通りであるが、
ただし、Ｒ_３とＲ_４、Ｒ_５とＲ_６、およびＲ_７とＲ_８のペアのうちの１つのみが、両方のＲ基を水素として有していてもよい（すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基（−ＣＨ_２−）のみを含むことができる）。

一態様において、糖は次式：

を有する。

別の態様において、糖は次式：

を有する。

ある種の態様において、化合物は、ｐＨ環境に応じて電荷基（たとえば、−ＮＨ_３ ^＋、−ＮＨＳＯ_３ ⁻）になることができる、アミノ基（たとえば、−ＮＨ_２）およびアミドスルホン酸基（たとえば、−ＮＨＳＯ_３Ｈ）を含む。本発明の化合物は、これらの塩（たとえば、金属塩）を含むことを理解されたい。

ＭＰＳ−ＩＩＩＡ酵素生成物および内部標準は、質量が異なり、質量の違いは、追加原子（たとえば、１つ以上のメチレンによる化合物の一部の長さにおける変化）の使用によって、または重原子（たとえば、水素の場合は重水素、炭素の場合は^１３Ｃ、窒素の場合は^１５Ｎ）の取り込みによって実現し得る。

代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＡ試薬は、以下の化合物を含む。

ある種の態様において、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

ある種の態様において、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、およびＲ_１は、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＡ基質は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ−Ｓ）から形成されたＭＰＳ−ＩＩＩＡ生成物は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。
代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＡ生成物は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ−Ｓ）から形成された生成物をアッセイする上で有用なＭＰＳ−ＩＩＩＡ内部標準は、次式：

を有し［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ−ＩＳの質量は、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ−Ｐの質量と異なり、この２つは質量分析により識別できる。上記の通り、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ−ＩＳは、１個以上の重原子同位体（上記の構造中には図示せず）を含むことができ、または構造変動（たとえば、基質のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２の１個以上は、内部標準のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２と異なる）を有し得る。

代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＡ内部標準は、次式：

を有する。

代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＡ基質に由来する代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＡ生成物は、代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＡ内部標準を使用してアッセイすることができる。

ＭＰＳ−ＩＩＩＢ試薬
さらなる態様において、本発明は、次式：

によって定義されるＭＰＳ−ＩＩＩＢ試薬（Ｓ、ＰおよびＩＳ試薬）
［Ｒ_１＝アグリコン、Ｒ_２＝Ｈ
または
Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝アグリコン
Ｒ_３＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＲ_１１［式中、Ｒ_１１＝ホルミル、アセチル、Ｃ＝Ｏ（（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）（式中、ｎ＝１〜６）］、およびＲ_４＝Ｈ
または
Ｒ_４＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＲ_１１［式中、Ｒ_１１＝ホルミル、アセチル、Ｃ＝Ｏ（（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）（式中、ｎ＝１〜６）］、およびＲ_３＝Ｈ
Ｒ_５＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_６＝Ｈ
または
Ｒ_６＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_５＝Ｈ
Ｒ_７＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_８＝Ｈ
または
Ｒ_８＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_７＝Ｈ
Ｒ_９＝ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＮＨ_２、およびＲ_１０＝Ｈ
または
Ｒ_１０＝ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＮＨ_２、およびＲ_１０＝Ｈ］、
その塩およびこれらの重原子誘導体を提供し、
式中、アグリコンは、上記の通りであるが、
ただし、Ｒ_３とＲ_４、Ｒ_５とＲ_６、およびＲ_７とＲ_８のペアのうちの１つのみが、両方のＲ基を水素として有していてもよい（すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基（−ＣＨ_２−）のみを含むことができる）。

上記のＭＰＳ−ＩＩＩＢ試薬のある種の態様において、炭水化物部分は水素原子により置きかえられ、この場合、水素原子がアグリコンに添加される。これらの試薬は、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ酵素生成物および内部標準を代表するものである。

一態様において、糖は、次式：

を有する。

上式において、「ＮＨＡｃ」は、「ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ_３」を意味する。

ある種の態様において、化合物は、ｐＨ環境に応じて電荷基（たとえば、−ＮＨ_３ ^＋）になることができる、アミノ基（たとえば、−ＮＨ_２）を含む。本発明の化合物は、これらの塩（たとえば、金属塩）を含むことを理解されたい。

ＭＰＳ−ＩＩＩＢ酵素生成物および内部標準は、質量が異なり、質量の違いは、追加原子（たとえば、１つ以上のメチレンによる化合物の一部の長さにおける変化）の使用によって、または重原子（たとえば、水素の場合は重水素、炭素の場合は^１３Ｃ、窒素の場合は^１５Ｎ）の取り込みによって実現し得る。

代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＢ試薬は、以下の化合物を含む。

ある種の態様において、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

ある種の態様において、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、およびＲ_３は、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＢ基質は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−ＩＩＩＢ−Ｓ）から形成されたＭＰＳ−ＩＩＩＢ生成物は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＢ生成物は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−ＩＩＩＢ−Ｓ）から形成された生成物をアッセイする上で有用なＭＰＳ−ＩＩＩＢ内部標準は、次式：

を有し［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ−ＩＳの質量は、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ−Ｐの質量とは異なり、これら２つは質量分析により識別できる。上記の通り、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ−ＩＳは、１個以上の重原子同位体（上記の構造中では図示せず）を含んでいてもよい、または構造変動（たとえば、基質のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、またはＲ_３は、内部標準のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、またはＲ_３と異なる）を有していてもよい。

代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＢ内部標準は、次式：

を有する。

代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＢ基質に由来する代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＢ生成物は、代表的なＭＰＳ−ＩＩＩＢ内部標準を使用してアッセイすることができる。

ＭＰＳ−ＩＶＡ試薬
別の態様において、本発明は、次式：

によって定義されるＭＰＳ−ＩＶＡ試薬（Ｓ、ＰおよびＩＳ試薬）
［Ｒ_１＝アグリコン、Ｒ_２＝Ｈ
または
Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝アグリコン
Ｒ_３＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＲ_１１［式中、Ｒ_１１＝ホルミル、アセチル、Ｃ＝Ｏ（（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）（式中、ｎ＝１〜６）］、およびＲ_４＝Ｈ
または
Ｒ_４＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＲ_１１［式中、Ｒ_１１＝ホルミル、アセチル、Ｃ＝Ｏ（（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）（式中、ｎ＝１〜６）］、およびＲ_３＝Ｈ
Ｒ_５＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_６＝Ｈ
または
Ｒ_６＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_５＝Ｈ
Ｒ_７＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_８＝Ｈ
または
Ｒ_８＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_７＝Ｈ
Ｒ_９＝ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＯＳＯ_３Ｈ、ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＨ_２ＮＨＳＯ_３Ｈ、およびＲ_１０＝Ｈまたは
Ｒ_１０＝ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＯＳＯ_３Ｈ、ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＨ_２ＮＨＳＯ_３Ｈ、およびＲ_９＝Ｈ］その塩およびこれらの重原子誘導体を提供し、
式中、アグリコンは、上記の通りであるが、
ただし、Ｒ_３とＲ_４、Ｒ_５とＲ_６、およびＲ_７とＲ_８のペアのうちの１つのみが、両方のＲ基を水素として有していてもよい（すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基（−ＣＨ_２−）のみを含むことができる）。

一態様において、糖は次式：

を有する。

ある種の態様において、化合物は、ｐＨ環境に応じて電荷基（たとえば、−ＮＨ_３ ^＋、−ＯＳＯ_３ ⁻）になることができる、アミノ基（たとえば、−ＮＨ_２）およびスルホン酸基（たとえば、−ＯＳＯ_３Ｈ）を含む。本発明の化合物は、これらの塩（たとえば、金属塩）を含むことを理解されたい。

ＭＰＳ−ＩＶＡ酵素生成物および内部標準は、質量が異なり、質量の違いは、追加原子（たとえば、１つ以上のメチレンによる化合物の一部の長さにおける変化）の使用によって、または重原子（たとえば、水素の場合は重水素、炭素の場合は^１３Ｃ、窒素の場合は^１５Ｎ）の取り込みによって実現し得る。

代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ試薬は、以下の化合物を含む。

ある種の態様において、ＭＰＳ−ＩＶＡ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。Ｒ_４は、それぞれの出現において、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル（たとえば、メチル）から独立に選択され、ｍは０、１、２、３、４または５である。

他の態様において、ＭＰＳ−ＩＶＡ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

ある種の態様において、ＭＰＳ−ＩＶＡ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_４、およびｍは、式（ＩＶ）について上で説明した通りである］。

他の態様において、ＭＰＳ−ＩＶＡ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、およびＲ_３は、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ基質は、次式：

を有する。

別の代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ基質は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−ＩＶＡ−Ｓ１）から形成されたＭＰＳ−ＩＶＡ生成物は、次式：

を有する
［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４、ｎ、およびｍは、式（ＩＶ）で上述した通りである］。

別の態様において、上記基質（ＭＰＳ−ＩＶＡ−Ｓ２）から形成されたＭＰＳ−ＩＶＡ生成物は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、およびＲ_３は、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ生成物は、次式：

を有する。

別の代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ生成物は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−ＩＶＡ−Ｓ１およびＭＰＳ−ＩＶＡ−Ｓ２）から形成された生成物をアッセイする上で有用なＭＰＳ−ＩＶＡ内部標準は、次式：

および

を有し［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、ｎ、およびｍは、上記の通りである］、ＭＰＳ−ＩＶＡ−ＩＳ１とＭＰＳ−ＩＶＡ−ＩＳ２の質量は、ＭＰＳ−ＩＶＡ−Ｐ１とＭＰＳ−ＩＶＡ−Ｐ２の質量とはそれぞれ異なり、これら２つは質量分析により識別できる。上記の通り、ＭＰＳ−ＩＶＡ−ＩＳ１およびＭＰＳ−ＩＶＡ−ＩＳ２は、１個以上の重原子同位体（上記の構造中では図示せず）を含んでいてもよい、または構造変動（たとえば、基質のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、またはＲ_４の１個以上は、内部標準のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、またはＲ_４と異なる）を有していてもよい。

代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ内部標準は、次式：

を有する。

別の代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ内部標準は、次式：

を有する。

代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ基質に由来する代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ生成物は、代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ内部標準を使用してアッセイすることができる。

さらなる代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ試薬セットを以下に記述する。

さらなる代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ基質は、次式：

を有する。

さらなる代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ生成物標準は、次式：

を有する。

さらなる代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ内部標準は、次式：

を有する。

上式において、Ｘは、フルオロ、メチル、およびメトキシから選択される。

ＭＰＳ−ＶＩ試薬
別の態様において、本発明は、次式：

によって定義されるＭＰＳ−ＶＩ試薬（Ｓ、ＰおよびＩＳ試薬）
［Ｒ_１＝アグリコン、Ｒ_２＝Ｈ
または
Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝アグリコン
Ｒ_３＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＲ_１１［式中、Ｒ_１１＝ホルミル、アセチル、Ｃ＝Ｏ（（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）（式中、ｎ＝１〜６）］、およびＲ_４＝Ｈ
または
Ｒ_４＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＮＨＲ_１１［式中、Ｒ_１１＝ホルミル、アセチル、Ｃ＝Ｏ（（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）（式中、ｎ＝１〜６）］、およびＲ_３＝Ｈ
Ｒ_５＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_６＝Ｈ
または
Ｒ_６＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_５＝Ｈ
Ｒ_７＝ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＯＳＯ_３Ｈ、ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＨ_２ＮＨＳＯ_３Ｈ、およびＲ_８＝Ｈ
または
Ｒ_８＝ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＯＳＯ_３Ｈ、ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＨ_２ＮＨＳＯ_３Ｈ、およびＲ_７＝Ｈ
Ｒ_９＝ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＮＨ_２、およびＲ_１０＝Ｈ
または
Ｒ_１０＝ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＮＨ_２、およびＲ_９＝Ｈ］、
その塩およびこれらの重原子誘導体を提供し、
式中、アグリコンは、上記の通りであるが、
ただし、Ｒ_３とＲ_４、Ｒ_５とＲ_６、およびＲ_７とＲ_８のペアのうちの１つのみが、両方のＲ基を水素として有していてもよい（すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基（−ＣＨ_２−）のみを含むことができる）。

一態様において、糖は次式：

を有する。

別の態様において、糖は次式：

を有する。

上式において、「ＡｃＮＨ」は、「ＣＨ_３Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ」を意味する。

ある種の態様において、化合物は、ｐＨ環境に応じて電荷基（たとえば、−ＮＨ_３ ^＋、−ＯＳＯ_３ ⁻）になることができる、アミノ基（たとえば、−ＮＨ_２）およびスルホン酸基（たとえば、−ＯＳＯ_３Ｈ）を含む。本発明の化合物は、これらの塩（たとえば、金属塩）を含むことを理解されたい。

ＭＰＳ−ＶＩ酵素生成物および内部標準は、質量が異なり、質量の違いは、追加原子（たとえば、１つ以上のメチレンによる化合物の一部の長さにおける変化）の使用によって、または重原子（たとえば、水素の場合は重水素、炭素の場合は^１３Ｃ、窒素の場合は^１５Ｎ）の取り込みによって実現し得る。

代表的なＭＰＳ−ＶＩ試薬は、以下の化合物を含む。

ある種の態様において、ＭＰＳ−ＶＩ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

ある種の態様において、ＭＰＳ−ＶＩ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、およびＲ_１は、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

代表的なＭＰＳ−ＶＩ基質は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−ＶＩ−Ｓ）から形成されたＭＰＳ−ＶＩ生成物は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

代表的なＭＰＳ−ＶＩ生成物は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−ＶＩ−Ｓ）から形成された生成物をアッセイする上で有用なＭＰＳ−ＶＩ内部標準は、次式：

を有し［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］、ＭＰＳ−ＶＩ−ＩＳの質量は、ＭＰＳ−ＶＩ−Ｐの質量と異なり、この２つは質量分析により識別できる。上記の通り、ＭＰＳ−ＶＩ−ＩＳは、１個以上の重原子同位体（上記の構造中では図示せず）を含んでいてもよい、または構造変動（たとえば、基質のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、またはＲ_２の１個以上は、内部標準のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、またはＲ_２と異なる）を有していてもよい。

代表的なＭＰＳ−ＶＩ内部標準は、次式：

を有する。

代表的なＭＰＳ−ＶＩ基質に由来する代表的なＭＰＳ−ＶＩ生成物は、代表的なＭＰＳ−ＶＩ内部標準を使用してアッセイすることができる。

ＭＰＳ−ＶＩＩ試薬
一態様において、本発明は、次式：

によって定義されるＭＰＳ−ＶＩＩ試薬（Ｓ、ＰおよびＩＳ試薬）
［式中、
Ｒ_１＝アグリコン、Ｒ_２＝Ｈ
または
Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝アグリコン
Ｒ_３＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_４＝Ｈ
または
Ｒ_４＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_３＝Ｈ
Ｒ_５＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_６＝Ｈ
または
Ｒ_６＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_５＝Ｈ
Ｒ_７＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_８＝Ｈ
または
Ｒ_８＝Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、およびＲ_７＝Ｈ
Ｒ_９＝ＣＯＯＨ、およびＲ_１０＝Ｈ
または
Ｒ_１０＝ＣＯＯＨ、およびＲ_９＝Ｈ
ただし、Ｒ_３とＲ_４、Ｒ_５とＲ_６、およびＲ_７とＲ_８のペアのうちの１つのみが、両方のＲ基を水素として有していてもよい（すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基（−ＣＨ_２−）のみを含むことができる）］、
その塩およびこれらの重原子誘導体を提供する。

上記の化合物の場合、アグリコンは上記の通りである。

上記のＭＰＳ−ＶＩＩ試薬のある種の態様において、炭水化物部分は、水素原子により置きかえられ、この場合、水素原子がアグリコンに添加される。これらの試薬は、ＭＰＳ−ＶＩＩ酵素生成物および内部標準を代表するものである。

一態様において、糖は次式：

を有する。

ある種の態様において、化合物は、ｐＨ環境に応じて電荷基（たとえば、−ＮＨ_３ ^＋または−ＣＯ_２ ⁻）になることができるアミノ基（たとえば、−ＮＨ_２）およびカルボン酸基（−ＣＯ_２Ｈ）を含む。本発明の化合物は、これらの塩（たとえば、金属塩）を含むことを理解されたい。

上記の通り、本発明の化合物は、これらの重原子誘導体を含む。重原子誘導体は、内部標準として有用である。ある種の態様において、タイプＡおよびタイプＢアグリコンは、アグリコンの質量が１ダルトン以上増加するように、重水素で置きかえられる１個以上の（たとえば、３個以上の）水素原子、または炭素−１３で置きかえられる１個以上の（たとえば、３個以上の）炭素原子を有する。酵素生成物および内部標準は、質量が異なり、質量の違いは、追加原子（たとえば、１つ以上のメチレンによる化合物の一部の長さにおける変化）の使用によって、または重原子（たとえば、水素の場合は重水素、炭素の場合は^１３Ｃ、窒素の場合は^１５Ｎ）の取り込みによって実現し得る。

上記のＭＰＳ−ＶＩＩ試薬のある種の態様において、炭水化物部分は水素原子により置きかえられ、この場合、水素原子がアグリコンに添加される。これらの試薬は、ＭＰＳ−ＶＩＩ酵素生成物および内部標準を代表するものである。

代表的なＭＰＳ−ＶＩＩ試薬は、以下の化合物を含む。

ある種の態様において、ＭＰＳ−ＶＩＩ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

ある種の態様において、ＭＰＳ−ＶＩＩ基質は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、およびＲ_３は、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

代表的なＭＰＳ−ＶＩＩ基質は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−ＶＩＩ−Ｓ）から形成されたＭＰＳ−ＶＩＩ生成物は、次式：

を有する［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］。

代表的なＭＰＳ−ＶＩＩ生成物は、次式：

を有する。

上記基質（ＭＰＳ−ＶＩＩ−Ｓ）から形成された生成物をアッセイする上で有用なＭＰＳ−ＶＩＩ内部標準は、次式：

を有し［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、およびｎは、式（ＩＩＩ）について上で説明した通りである］、ＭＰＳ−ＶＩＩ−ＩＳの質量は、ＭＰＳ−ＶＩＩ−Ｐの質量と異なり、この２つは質量分析により識別できる。上記の通り、ＭＰＳ−ＶＩＩ−ＩＳは、１個以上の重原子同位体（上記の構造中には図示せず）を含むことができ、または構造変動（たとえば、基質のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、またはＲ_３の１個以上は、内部標準のＬ_２、Ｌ_３、Ｒ_１、Ｒ_２、またはＲ_３と異なる）を有し得る。

代表的なＭＰＳ−ＶＩＩ内部標準は、次式：

を有する。

代表的なＭＰＳ−ＶＩＩ基質に由来する代表的なＭＰＳ−ＶＩＩ生成物は、代表的なＭＰＳ−ＶＩＩ内部標準を使用してアッセイすることができる。

試薬キット
本発明の試薬は、有利には、キット中に合わせて酵素的アッセイを実施することができる。特定のアッセイ用の試薬キットは、適当な酵素基質と内部標準のペア（たとえば、ＭＰＳ−ＩＩ−ＳおよびＭＰＳ−ＩＩ−ＩＳ）を含む。ある種の態様において、キットは、１つ超の基質／内部標準ペアを含み、１種超の酵素をアッセイするために使用され得る（すなわち２種、３種、４種、５種または６種の酵素を１つのスクリーンにおいてアッセイできる多重検定）。他の態様において、キットは、アッセイを実施するための緩衝液をさらに含む。他の態様において、キットは、質量分析計を調節するために使用できる酵素生成物をさらに含む。他の態様において、キットは、品質管理乾燥血液スポットをさらに含む。このアッセイを実施するための指示書もキットに含まれ得る。

酵素的アッセイ
本発明の試薬は、リソソーム蓄積症と関係している酵素をアッセイするために有利に利用することができる。アッセイにおいて、１種以上の基質（Ｓ）を好適な緩衝液中で好適な酵素源、たとえば新生児スクリーニングカードまたは尿サンプル由来の乾燥血液スポットと一緒に十分な時間かけてインキュベートして、１種以上の生成物（Ｐ）を形成し、これを続いてタンデム質量分析によって検出する。アッセイには、ある種の態様において、酵素形成生成物と化学的に同一であるが、質量が異なる（たとえば、置換されている重同位体、たとえば重水素および／または炭素−１３置換）、内部標準（ＩＳ）も使用される。インキュベーションは、好適な緩衝液中で行って、酵素反応を進行させる（たとえば、５ｍＭ酢酸バリウムおよび７．５ｍＭ酢酸セリウムを含有する１００ｍＭギ酸アンモニウムｐＨ４．５）。

本発明の試薬で有利にアッセイされる酵素として、以下が挙げられる：
（ａ）ＭＰＳ−Ｉの基質に作用して、ＭＰＳ−Ｉ生成物を生成し、アッセイにはＭＰＳ−Ｉ内部標準を使用する、α−Ｌ−イズロニダーゼ、
（ｂ）ＭＰＳ−ＩＩの基質に作用して、ＭＰＳ−ＩＩ生成物を生成し、アッセイにはＭＰＳ−ＩＩ内部標準を使用する、イズロン酸２−スルファターゼ、
（ｃ）ＭＰＳ−ＩＩＩＡの基質に作用して、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ生成物を生成し、アッセイにはＭＰＳ−ＩＩＩＡ内部標準を使用する、ヘパランＮ−スルファターゼ、
（ｄ）ＭＰＳ−ＩＩＩＢの基質に作用して、生成物ＭＰＳ−ＩＩＩＢ生成物を生成し、アッセイにはＭＰＳ−ＩＩＩＢ内部標準を使用する、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
（ｅ）ＭＰＳ−ＩＶＡの基質に作用して、ＭＰＳ−ＩＶＡ生成物を生成し、アッセイにはＭＰＳ−ＩＶＡ内部標準を使用する、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、
（ｆ）ＭＰＳ−ＶＩの基質に作用して、ＭＰＳ−ＶＩ生成物を生成し、アッセイにはＭＰＳ−ＶＩ内部標準を使用する、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸スルファターゼ、および
（ｇ）ＭＰＳ−ＶＩＩの基質に作用して、ＭＰＳ−ＶＩＩ生成物を生成し、アッセイにはＭＰＳ−ＶＩＩ内部標準を使用する、β−グルクロニダーゼ。

上記の酵素をアッセイするための代表的方法は、全内容が参照によりここに明確に組み込まれている、ＷＯ２００９／０２６２５２（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７３５１６）、ＷＯ２０１０／０８１１６３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２０８０１）、ＷＯ２０１２／０２７６１２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９２２４）、およびＷＯ２０１３／０７０９５３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６４２０５）に記載されている。本発明の試薬は、これらの方法において有利に利用され得る。

本発明のＭＰＳ−Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＶＡ、およびＶＩ試薬を使用する代表的アッセイを例１〜１１に記載する。

本発明のアッセイは、本発明から逸脱しない変更を含むことができる。いくつかの変更を以下に記述する。

第１の態様において、基質および内部標準をアッセイ用緩衝液中で酵素源と一緒にインキュベートした後、失活し（たとえば、アセトニトリルの添加）、次いで糖−アグリコン生成物および内部標準（ＭＰＳ−Ｉ、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ、ならびにＭＰＳ−ＶＩＩの場合、生成物はアグリコン（および添加した水素）であることに留意されたい）の質量分光分析（たとえば、ＬＣ／ＭＳＭＳ）および定量化を行う。

第２の態様において、アッセイは、第１の態様に記載した通りであるが、生成物および内部標準を抽出するのに好適な有機溶媒（たとえば、酢酸エチル）を用いて（任意で失活せずに）酵素反応混合物を抽出し、抽出した混合物を濃縮乾固し、次いでフローインジェクション質量分光分析（たとえば、ＦＩＡ／ＭＳＭＳ）に適した溶媒中に取り込む点を例外とする。

第３の態様において、アッセイは、第２の態様に記載した通りであるが、失活させる間、陰イオン交換樹脂の懸濁液を添加して基質を捕捉する点を例外とする。

第４の態様において、アッセイは、第１の態様に記載した通りであるが、基質を開裂せずに初期のスルファターゼ生成物（サルフェートが除去された糖−アグリコン）を開裂するのに適した第２の酵素（たとえば、グリコヒドロラーゼ、たとえば細菌β−Ｎ−アセチルガラクトアミニダーゼ）をアッセイ用カクテル（基質および内部標準）中に添加する点を例外とする。抽出、濃縮、および再可溶化の後、質量分光分析（たとえば、ＦＩＡ／ＭＳＭＳ）を実施し、アグリコン生成物および内部標準を定量化する。場合によっては、硫酸化糖−アグリコン基質に作用してグリコシド結合を切断し得る、乾燥血液スポットサンプル中の内因性である酵素が存在し得る（すなわち、ヒトヘキソサミニダーゼＡ）。この場合、この内因性酵素の阻害剤を添加して、添加基質に対する内因性酵素の作用を遮断することができる。この阻害剤は、アッセイに添加されたグリコヒドロラーゼの作用を遮断しないように選択される。

第５の態様において、アッセイは、第２の態様に記載した通りであるが、選択性スルファターゼ糖−アグリコン基質を開裂するのに適した第２の酵素（たとえば、グリコヒドロラーゼ）をアッセイ用カクテル（基質および内部標準）中に添加する点を例外とする。失活後、質量分光分析（たとえば、ＬＳ／ＭＳＭＳ）を用いてアグリコン生成物および内部標準を定量化する。この態様の改変形態では、内因性作用（たとえば、ヒトヘキソサミニダーゼＡ）の阻害剤もアッセイ用カクテルに添加する。

第６の態様において、基質および内部標準をアッセイ用緩衝液中で酵素源と一緒にインキュベートし、次いで緩衝液を添加してｐＨをシフトさせ（たとえば、ｐＨ６に）、第２の酵素（たとえば、グリコヒドロラーゼ）の作用を最適化した後、グリコヒドロラーゼ（たとえば、細菌β−Ｎ−アセチルガラクトアミニダーゼ）を添加し、インキュベート（たとえば、１〜２時間）する。次いで、サンプルを失活させ、質量分光分析（たとえば、ＬＳ／ＭＳＭＳ）を使用してアグリコン生成物および内部標準を定量化する。この態様の改変形態では、内因性酵素活性（たとえば、ヒトヘキソサミニダーゼＡ）の阻害剤もアッセイ用カクテルに添加する。

第７の態様において、アッセイは、第６の態様に記載した通りであるが、酵素反応混合物を（任意で失活せずに）、生成物および内部標準を抽出するのに適した有機溶媒（たとえば、酢酸エチル）を用いて抽出し、抽出した混合物を濃縮乾固し、次いでフローインジェクション分析（たとえば、ＦＩＡ／ＭＳＭＳ）に適した溶媒中に取り込む点を例外とする。この態様の改変形態では、内因性酵素活性（たとえば、ヒトヘキソサミニダーゼＡ）の阻害剤もアッセイ用カクテルに添加する。

第８の態様において、有機溶媒を用いて抽出し、生成物および内部標準を単離することを利用した上記の態様の場合、溶媒を除去した後、好適なアシル化剤（たとえば、無水酢酸）および好適な塩基（たとえば、トリエチルアミン）を好適な溶媒に溶かした溶液を添加し、その結果得られる組み合わせをインキュベート（１〜２時間）し、ＭＳ分析において感度が向上した、アシル化（たとえば、アセチル化）アグリコン生成物および内部標準を生成する。

第９の態様において、アッセイは、第８の態様に記載した通りであるが、アシル化剤および塩基を抽出（たとえば、酢酸エチル）溶媒中に含めて、抽出プロセス中にまたは抽出させてインキュベート（たとえば１〜２時間）した後で、アグリコンおよび内部標準をアシル化（たとえば、アセチル化）させる点を例外とする。

第１０の態様において、基質および第２の酵素（グリコヒドロラーゼ）をアッセイ用緩衝液中で酵素源と一緒にインキュベートした後、失活させ、次いで蛍光分析により蛍光生成物を定量化する。この態様の改変形態では、内因性酵素活性（たとえば、ヒトヘキソサミニダーゼＡ）の阻害剤もアッセイ用カクテルに添加する。この態様の場合、タイプＡアグリコンを有する基質を使用する。

第１１の態様において、基質をアッセイ用緩衝液中で酵素源と一緒にインキュベートし、次いで緩衝液を添加してｐＨをシフトし（たとえば、ｐＨ６に）、第２の酵素（たとえば、グリコヒドロラーゼ）の作用を最適化した後、グリコヒドロラーゼ（たとえば、細菌β−Ｎ−アセチルガラクトアミニダーゼ）を添加し、インキュベート（たとえば、１〜２時間）し、次いで失活して、蛍光分析で蛍光生成物を定量化する。この態様の改変形態では、内因性酵素活性（たとえば、ヒトヘキソサミニダーゼＡ）の阻害剤もアッセイ用カクテルに添加する。この態様の場合、タイプＡアグリコンを有する基質を使用する。

ある種の態様において、追加のアッセイオプションも本発明の方法の範囲内に含まれる。２つのオプションを以下に記述する。

アッセイオプション１
所望のセットの基質と酵素源を好適な緩衝液中でインキュベートした後、反応液を、好適な溶媒、たとえば酢酸エチルを用いた液液抽出にかける。第２の酵素（グリコヒドロラーゼ）を使用せずにＭＰＳ−ＩＩをアッセイしてアグリコンを生成する場合、混合物を、好適な酸、たとえばクエン酸で、ｐＨ約２〜３に酸性化する必要があり、これにより、ＭＰＳ−ＩＩ−Ｐのカルボキシレート基がプロトン化され、より良好に酢酸エチルに抽出される。このアッセイにおいて第２の酵素を使用して糖を除去する場合、カルボキシ基がないため、アグリコンは、酸性化しなくてもよく溶媒に抽出する。液液抽出工程の目的は、２つの部分からなり、すなわち（１）抽出が、質量分析計におけるイオン化プロセスを干渉すると考えられている緩衝塩をほとんど除去させることと、（２）抽出が、酵素基質の抽出を最小限に抑えながら、ほとんどの酵素生成物を抽出させることである。質量分析計のイオン化源中のサルフェートが損失することによって基質が部分的に分解して生成物が形成し、これが、定量化することが望ましい唯一の酵素的に生成される生成物なので、これは有用である。液液抽出の後、酢酸エチル層を新しい容器に移し、蒸発によって溶媒を除去する。残留物を、質量分析計に注入するのに適した溶媒に取り込む。例示的溶媒は、水性ギ酸アンモニウム／メタノール混合物である。生成物および内部標準を、前駆イオンが第１の四重極中で単離され、次いで衝突誘起解離を受けて１つ以上の生成イオンを形成する多重反応モニタリングモードにおいて検出する。このような１つの生成イオンが第３の四重極中で単離され、イオン検出器（タンデム質量分析）によって検出される。各フラグメント化反応は、各生成物および内部標準につき１反応とし、デューティーサイクルの様式で別々にモニタリングし、生成物および内部標準の全セットを定量化する。生成物のモル数を得るために、生成物の質量分析シグナル（イオン計数）を内部標準のそれで割り、この比に、アッセイに添加した内部標準のモル数を乗じる。

アッセイオプション２
上記アッセイの変更に、改変プレ質量分析サンプルワークアップを使用する。インキュベートして基質から生成物を酵素的に生成した後、小分割量の好適な陰イオン交換樹脂を混合物に添加する。例示的樹脂は、Whatmann製のＤＥ５２である。陰イオンが、陰イオン交換樹脂上で陽イオンと静電相互作用によって結合し、この場合、すべての陰イオン性検体が樹脂に結合することがよく知られている。基質ＭＰＳ−Ｉ−Ｓ、ＭＰＳ−ＩＩ−Ｓ、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ−Ｓ、ＭＰＳ−ＩＶＡ−Ｓ、ＭＰＳ−ＶＩ−Ｓ、およびＭＰＳ−ＶＩＩ−Ｓは、カルボキシレート（ＭＰＳ−Ｉ−ＳおよびＭＰＳ−ＶＩＩ−Ｓ）または硫酸エステルのいずれかを含有することで樹脂に結合する。ＭＰＳ−Ｉ−Ｐ、ＭＰＳ−Ｉ−ＩＳ、ＭＰＳ−ＩＶＡ−Ｐ、ＭＰＳ−ＩＶＡ−ＩＳ、ＭＰＳ−ＶＩ−Ｐ、ＭＰＳ−ＶＩ−ＩＳ、ＭＰＳ−ＶＩＩ−Ｐ、およびＭＰＳ−ＶＩＩ−ＩＳは、電荷が欠乏している、または正電荷を含有し（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ−ＰおよびＭＰＳ−ＩＩＩＡ−ＩＳ）、そのため樹脂には結合されない。ＭＰＳ−ＩＩＩＢ−Ｓ、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ−ＰおよびＭＰＳ−ＩＩＩＢ−ＩＳも、負電荷を欠き、樹脂に結合されない。ＭＰＳ−ＩＩ−Ｓ、ＭＰＳ−ＩＩ−ＰおよびＭＰＳ−ＩＩ−ＩＳは、すべて陰イオン性であり、そのためすべて樹脂に結合される。このアッセイオプションでは、アッセイ用緩衝液は、ＭＰＳ−ＩＩ−ＰおよびＭＰＳ−ＩＩ−ＩＳに作用し、ＭＰＳ−ＩＩ−Ｓに作用しない組み換え型α−Ｌ−イズロニダーゼを含有し、アグリコンからイズロン酸残基を除去することにより、電荷を欠いた遊離アグリコンを残留させる。したがって、ＭＰＳ−ＩＩ−ＰおよびＭＰＳ−ＩＩ−ＩＳから誘導された、結果として得られる検体は、陰イオン交換樹脂に結合しない。組み換え型α−Ｌ−イズロニダーゼが含まれる場合、酵素はＭＰＳ−Ｉ−Ｓに作用してＭＰＳ−Ｉ−Ｐを作製するため、アッセイにＭＰＳ−Ｉ−Ｓを含むことはできない。α−Ｌ−イズロニダーゼの使用は、陰イオン交換樹脂を添加する、こうしたＭＰＳ−ＩＩアッセイに限定されない。この酵素の添加は、陰イオン交換体を使用しない他のすべてのＭＰＳ−ＩＩアッセイに適用できる。

陰イオン交換樹脂を添加した後、アッセイオプション１と同様に、混合物を酢酸エチルで抽出し、樹脂に結合されていないすべての検体は酢酸エチルに抽出される。次いで、タンデム質量分析による分析のために、アッセイオプション１に記載の通りに、酢酸エチル層を処理する。

多重アッセイ
本発明の方法は、ＭＰＳ−Ｉ、ＭＰＳ−ＩＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ、ＭＰＳ−ＩＶＡ、ＭＰＳ−ＶＩ、およびＭＰＳ−ＶＩＩの１つ以上ならびにこれらの任意の組み合わせの分析を提供する。質量分析を利用してアッセイ用生成物を定量化する態様の場合、ある種の態様において、各アッセイ用の生成物は質量が異なる。１回のアッセイを利用してすべてのアッセイ用生成物を定量化できるように、各生成物の質量は異なっている。質量の弁別性は、基質の選択によって実現される。

上記のＭＰＳ−Ｉ、ＭＰＳ−ＩＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ、ＭＰＳ−ＩＶＡ、ＭＰＳ−ＶＩ、およびＭＰＳ−ＶＩＩの代表的な基質は、質量の異なる生成物を生成する（すなわち、質量が同一の生成物は２つとない）。対応する内部標準（上記のＭＰＳ−Ｉ、ＭＰＳ−ＩＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ、ＭＰＳ−ＩＶＡ、ＭＰＳ−ＶＩ、およびＭＰＳ−ＶＩＩの代表的な内部標準を参照）を一緒に用いて、一度に単回より多い検定を実行し、分析する能力が得られる結果となる。

他の態様において、１つ超の生成イオンは同一の質量を有し得る。これらの態様において、これらの等圧生成物から誘導される分裂片質量が異なる限り、定量が得られる（すなわち、親イオン質量／断片イオン質量の組み合わせは、各種を混合物中で定量化する上で独特である）。

一態様において、本発明は、ここで記載する試薬を使用して、ＭＰＳ−Ｉ、ＭＰＳ−ＩＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ、ＭＰＳ−ＩＩＩＢ、ＭＰＳ−ＩＶＡ、ＭＰＳ−ＶＩ、およびＭＰＳ−ＶＩＩ、またはこれらの任意のサブセットを同時にアッセイする方法を提供する。

スルファターゼアッセイ：ＭＰＳ ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＶＡ、およびＶＩスクリーニング
別の態様において、本発明は、新生児スクリーニングのための、リソソーム蓄積症と関係しているスルファターゼ（ＭＰＳ ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＶＡ、およびＶＩ）の検出用のアッセイ、試薬、およびキットを提供する。

タンデム質量分析を使用するリソソーム酵素のアッセイは、リソソーム蓄積症の新生児スクリーニングに有用である。アッセイには、一般的な構造：サルフェート−糖−アグリコンの基質が利用される。これらの基質は、リソソームスルファターゼによって作用し、サルフェートを欠いた生成物：糖−アグリコンを得る。ある種のアッセイにおいて、糖−アグリコン生成物を、タンデム質量分析を用いて検出した。

本発明は、こうしたスルファターゼアッセイの代替を提供する。本発明のアッセイのある種の側面において、第２の酵素をアッセイ用カクテルに添加し、糖の除去を行ってアグリコンを生成する。アグリコンのタンデム質量分析による検出は、糖−アグリコンの検出よりも高感度である。糖を除去する第２の酵素は、硫酸化糖に作用しない（すなわち、第２の酵素は、スルファターゼの基質に作用しない）。したがって、本発明は、好適なグリコヒドロラーゼまたは好適なリアーゼをアッセイ用カクテルに添加して、最終酵素生成物としてアグリコンを生成し、次いで、これをタンデム質量分析によって検出する追加工程を含む方法を提供する。

ここで使用する場合、用語「グリコヒドロラーゼ」は、グリコシドを加水分解する酵素を意味する。用語「リアーゼ」は、糖Ｃ２からプロトンを除去し、グリコシド酸素（たとえば、アグリコン脱離基）をなくし、不飽和糖誘導体を生成する酵素を意味する。

好適な第２の酵素（たとえば、グリコヒドロラーゼおよびリアーゼ）は、ここで記載する酵素生成物のアグリコンから糖を切断し（たとえば、サルフェートが除去された場合に糖を切断するのみ）、酵素基質自体には作用せず、硫酸化基質を切断してアグリコンを生成し得る、ヘキソサミニダーゼＡなどの乾燥血液スポット中に存在する内因性酵素の作用を遮断するために本発明のアッセイに添加される阻害剤によって阻害されないことを特徴とする。

好適な第２の酵素は、グリコヒドロラーゼおよびリアーゼを含む。

代表的なグリコヒドロラーゼは、ヒトヘキソサミニダーゼＡ、細菌性Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、細菌性β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（たとえば、パエニバチルス属ＴＳ１２）、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ（アスペルギルス）、およびα−グルコシダーゼ（酵母）を含む。

代表的なリアーゼは、ヘパリンリアーゼ（ヘパリナーゼ）およびヘパラナーゼを含む。

アッセイ法
一側面において、本発明は、ＭＰＳ ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＶＡ、およびＶＩのスクリーニング方法を提供する。この方法は、その欠陥がリソソーム蓄積症の状態を招く特異的酵素をアッセイする。この方法は、有利には、イズロン酸２−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩ）、ヘパランＮ−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＶＡ）、およびＮ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＶＩ）のうちの１つ以上をアッセイする。

上記の通り、本発明の方法において、第２の酵素は、質量分光分析の態様の感度を改善し、蛍光分析の態様におけるフルオロフォアを生成するために利用される。本方法によれば、好適なスルファターゼ基質（すなわち、サルフェート−糖−アグリコン）を、スルファターゼ活性について評価するサンプルと接触させる。サンプルがスルファターゼを含む場合、基質は、初期酵素生成物（すなわち、糖−アグリコン）に酵素的に変換される。本発明の方法において、第２の酵素（たとえば、グリコヒドロラーゼ）は、初期酵素生成物に作用して、二次酵素生成物（すなわち、アグリコン）を生成する。タンデム質量分析による二次酵素生成物（すなわち、アグリコン）の分析は、第２の酵素が存在せず、初期に形成された酵素生成物の糖−アグリコンの分析に依存する先行するアッセイと比べて高い感度を示す。タイプＡアグリコンを含有する基質の場合、サルフェートが除去された後のみ、第２の酵素が作用して蛍光アグリコンを放出する。これにより、蛍光分析によるスルファターゼのアッセイが可能になる。

蛍光分析の場合、失活には、ｐＨを約１０に上げた緩衝液が含まれ得、アグリコンのフェノール性ヒドロキシを脱プロトン化することによって、生成物（アグリコン）の蛍光性を強くする。

アッセイにおいて、１種以上の基質（Ｓ）を、好適な緩衝液中で好適な酵素源、たとえば新生児スクリーニングカードまたは尿サンプルに由来する乾燥血液スポットと一緒に十分な時間をかけてインキュベートして１種以上の生成物（Ｐ１）を形成し、これを続いて第２の酵素（すなわち、グリコヒドロラーゼ）に供して二次酵素生成物（Ｐ２）を生成し、これをタンデム質量分析によって検出する。アッセイには、ある種の態様において、酵素形成生成物と化学的に同一であるが、質量が異なる（たとえば、置換されている重同位体、たとえば重水素および／または炭素−１３置換）内部標準（ＩＳ）も使用する。ある種のアッセイにおいて、内部標準は、第２の酵素によっても作用し、最終内部標準を生成し、これをタンデム質量分析によって検出する。好適な緩衝液中でインキュベートを行い、酵素反応を進行させる。好適な緩衝液は、たとえば、７．５ｍＭ酢酸バリウムおよび５ｍＭ酢酸セリウムを含有する１００ｍＭギ酸アンモニウムｐＨ４．５である。

有利には、本発明の試薬と一緒にアッセイされる酵素として、以下が挙げられる：
（ａ）ＭＰＳ−ＩＩの基質に作用して、ＭＰＳ−ＩＩ生成物を生成し、アッセイにはＭＰＳ−ＩＩ内部標準を使用する、イズロン酸２−スルファターゼ、
（ｂ）ＭＰＳ−ＩＩＩＡの基質に作用して、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ生成物を生成し、アッセイにはＭＰＳ−ＩＩＩＡ内部標準を使用する、ヘパランＮ−スルファターゼ、
（ｃ）ＭＰＳ−ＩＶＡの基質に作用して、ＭＰＳ−ＩＶＡ生成物を生成し、アッセイにはＭＰＳ−ＩＶＡ内部標準を使用する、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ、
（ｄ）ＭＰＳ−ＶＩの基質に作用して、ＭＰＳ−ＶＩ生成物を生成し、アッセイにはＭＰＳ−ＶＩ内部標準を使用する、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸スルファターゼ。

ある種の態様において、追加のアッセイオプションも、本発明の方法の範囲内に含まれる。上記のアッセイオプション１および２は、これらのアッセイ法において利用され得る。

試薬
ＭＰＳ ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＶＡ、およびＶＩをスクリーニングするための試薬は、ＭＰＳ ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＶＡ、およびＶＩをスクリーニングするための基質（Ｓ）、生成物（Ｐ）、および内部標準（ＩＳ）を含む。

酵素をアッセイするために、試薬を有利に利用することができる。試薬は、酵素基質（Ｓ）、酵素生成物（Ｐ）、およびアッセイ内部標準（ＩＳ）を含む。ある種の態様において、１種以上の基質（Ｓ）およびこれらの対応する内部標準（ＩＳ）を好適な緩衝液中で、好適な酵素源、たとえば新生児スクリーニングカードまたは尿サンプル由来の乾燥血液スポットと一緒に十分な時間をかけてインキュベートし、１種以上の生成物（Ｐ）を形成し、これを続いて第２の酵素（たとえば、グリコヒドロラーゼ）に供して、第２の酵素生成物を生成し、これは、タンデム質量分析により検出される。ある種の態様において、内部標準（ＩＳ）は、酵素形成生成物と化学的に同一であるが、標準の質量が異なる点（たとえば、置換されている重同位体、たとえば重水素および／または炭素−１３置換）は例外である。

これらのスルファターゼのアッセイにおいて有用な試薬は、ここで記載されているものを含めたＭＰＳ−ＩＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＶＡ、およびＭＰＳ−ＶＩの基質（Ｓ）、生成物（Ｐ）、および内部標準（ＩＳ）を含む。

ＭＰＳ−ＩＩ、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ、ＭＰＳ ＩＶＡ、およびＭＰＳ−ＶＩの代表的なアッセイは、例７〜１１に記載されている。

ＭＰＳ ＩＶＡおよびＶＩスクリーニングの代表的アッセイおよび結果
上記の通り、グリコヒドロラーゼおよびリアーゼ酵素を使用して、質量分析を用いたスルファターゼのアッセイの感度を改善し、蛍光分析用の蛍光アグリコン生成物を生成する。関連側面において、阻害剤を添加して内因性グリコヒドロラーゼ活性を遮断する工程をさらに含む方法を提供する。

好適な阻害剤は、内因性グリコヒドロラーゼ活性を遮断するが、添加したグリコヒドロラーゼの作用を有意に阻害しない。乾燥血液スポットは、たとえば、一工程で硫酸化基質に作用してアグリコンを形成できるヘキソサミニダーゼＡを含有する。この場合、スルファターゼ酵素を定量化するために、タンデム質量分析法または蛍光測定法によってアグリコンを測定する際に、ヘキソサミニダーゼの阻害剤を添加することが最適である。添加した阻害剤は、初期スルファターゼ生成物をアグリコンに変換するためにアッセイに添加される第２の酵素を有意に阻害しないはずである。

好適な阻害剤は、生体サンプル中のヘキソサミニダーゼを遮断するが、第２の酵素を完全には遮断しない。阻害剤は、第２の酵素を部分的に遮断できるが、完全ではなく、第２の酵素は、初期のスルファターゼ生成物すべてがそのアグリコンにならない場合にほとんどを変換し得る。好適な阻害剤は、ヒトヘキソサミニダーゼＡ、ヒトヘキソサミニダーゼＢ、および／またはヒトヘキソサミニダーゼＸを阻害する。

代表的な阻害剤として、（Ｚ）−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）アミノ Ｎ−フェニルカーバメート（Ｚ−ＰＵＧ−ＮＡｃ）、１−デオキシノジリマイシン、カスタノスペルミン、スウェインソニン、カリステギンＢ_２、イソファガミン、タミフル、グルコノヒドロキシモラクトン、グルクロン酸ならびにそのラクトンおよびラクタム、リレンザ、ミグリトール、フェネチル置換グルコ−およびガラクト−イミダゾール、Ｎ−ヒドロキシエチルデヒドロノジリマイシン、ＧａｌＮＡｃチアゾリン、ならびにＧｌｃＮＡｃチアゾリンが挙げられる。

ＭＰＳ−ＩＶＡおよびＭＰＳ−ＶＩの代表的なアッセイを以下に記述する。

ムコ多糖症ＩＶＡの代表的アッセイ

一態様において、モルキオＡ症候群としても知られるＭＰＳ−ＩＶＡのアッセイを行い、ＭＰＳ−ＩＶＡにおいて欠乏している酵素であるＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳとしても知られ、ここでは、この用語と同義で使用される）を検出する。ＧＡＬＮＳ基質は、アグリコンに結合したＮ−アセチルガラクトース−６−サルフェートであり、ここでＲ_１はｎ−ブチルであり、Ｌ_２は−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｌ_３は−（ＣＨ_２）_５−であり、Ｒ_３はフェニルである（下記参照）。本アッセイは、６−サルフェートが除去された後にのみ、アグリコンからＮ−アセチルガラクトサミンを除去する酵素を添加することを含む。アグリコンからＮ−アセチルガラクトサミンを除去する酵素は、β−グリコシドをＮ−アセチルガラクトサミンとＮ−アセチルグルコサミン残基に開裂させるβ−ヘキソサミニダーゼ（たとえば、ヒトヘキソサミニダーゼＡ）である。生体サンプルは、ヒトヘキソサミニダーゼＡおよび他のヒトヘキソサミニダーゼを含有していてもよい。ヒトヘキソサミニダーゼＡは、ＭＰＳ−ＩＶＡ基質に作用して、アグリコンを生成することができる。表１に示す通り、ヒトヘキソサミニダーゼＡは、６位で糖が硫酸化される場合でもグリコシドを開裂することができる。Ｚ−ＰＵＧ−ＮＡｃが省かれている行を参照されたい。

表１は、乾燥血液スポット中の内因性ヘキソサミニダーゼＡの量が、モルキオＡ症候群の新生児スクリーニング用の乾燥血液スポットを使用するＧＡＬＮＳアッセイにおいて問題を生じることも示す。

ある種の態様において、細菌酵素である、パエニバチルス属ＴＳ１２由来のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（β−ＮＧＡ）（J. Biol. Chem. 2011, 286, 14065-14072）を、アッセイにおいて使用する。この酵素は、ヒトヘキソサミニダーゼに構造的に関連せず、表１に示すデータは、６位で硫酸化されないとき、細菌酵素が、βグリコシドをＮ−アセチル−ガラクトサミンに開裂させ、サルフェートを保有する場合に酵素が基質にそれほど作用しないことを示す。

ある種の態様において、ヒトヘキソサミニダーゼＡの阻害剤をアッセイにおいて使用して、ＧＡＬＮＳ基質に及ぼすヒトヘキソサミニダーゼＡの作用を遮断する。ある種の態様において、阻害剤は、β−ＮＧＡを有意に阻害しない。

上記のアッセイにおいて使用されるＧＡＬＮＳ基質は、次の構造を有する：

代表的なアッセイは、ＧＡＬＮＳ源として新生児スクリーニングカードの乾燥血液スポットを使用する。こうしたアッセイは、β−ＮＧＡおよびヒトヘキソサミニダーゼＡ：Ｚ−ＰＵＧ−ＮＡｃ（（Ｚ）−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）−アミノＮ−フェニルカルバメート）の阻害剤も使用する。

乾燥血液スポット中のＧＡＬＮＳ酵素は、上に示すＧＡＬＮＳ基質に作用し、生成物（すなわち、６−サルフェートを含まないＧＡＬＮＳ基質）を遊離する。アッセイカクテル中の細菌β−ＮＧＡは、６−サルフェートを含まないＧＡＬＮＳ基質に作用してアグリコンを遊離し、ＧＡＬＮＳ基質に作用しない。アッセイカクテルへのＺ−ＰＵＧ−ＮＡｃの添加は、内因性ヒトヘキソサミニダーゼＡのＧＡＬＮＳ基質に作用してアグリコンを発生させる能力を遮断する。次いで、タンデム質量分析によってアグリコンを検出する。したがって、アグリコンの形成は、ＧＡＬＮＳの作用に印をつけ、感度は、最初に形成された脱硫酸化生成物よりもアグリコンを検出することによって得られる。

ＭＰＳ−ＩＶＡの代表的なスルファターゼアッセイは、例１０に記載している。

ＭＰＳ−ＶＩの代表的アッセイ

別の態様において、本発明は、ＭＰＳ−ＶＩのために開発したアッセイを提供し、ＭＰＳ−ＶＩに不足している酵素であり、マロトー・ラミー症候群としても知られる、アリールスルファターゼＢ（ＡＳＢ）を検出した。

以下のＡＳＢ（ＭＰＳ−ＶＩ）基質を、アッセイにおいて使用した：

ＡＳＢは、ＡＳＢ基質のＮ−アセチルガラクトサミン−４−サルフェート基から４−サルフェートを除去する。本発明より以前は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−サルフェートに作用するヒトヘキソサミニダーゼＡの能力に関するデータは入手できなかった。組み換え型ヒトヘキソサミニダーゼＡは、ＡＳＢ基質に作用してアグリコンを遊離させる。アグリコンは、ＵＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって検出した（図１参照）。

図１は、混合物にヘキソサミニダーゼＡの量を添加するに従い、このアグリコンの量が増加することを示す。混合物は、指示量のヘキソサミニダーゼを含有するｐＨ５．６の１００ｍＭのギ酸アンモニウム緩衝液中の１ｍＭのＡＳＢ基質を含む。３７℃で５時間インキュベートした後、混合物をＵＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析する。ヘキソサミニダーゼＡが省かれる場合はアグリコンが存在しないので、アグリコンのシグナルは、基質がアグリコンによって汚染されたわけではない。アグリコンの量は、ヘキソサミニダーゼＡが増えると増加し（図１）、アグリコンのＵＨＰＬＣ保持期間は、認められたアグリコンのそれと一致し、ＡＳＢ基質の保持期間と異なるので、アグリコンは、質量分析計のエレクトロスプレーイオン化源におけるＡＳＢの切断によって産出されたものではない。したがって、ヘキソサミニダーゼＡは、ＡＳＢ基質に作用してアグリコンを生成する。ヘキソサミニダーゼＡは、ＡＳＢ基質に作用してアグリコンを生成するため、この酵素は、ＡＳＢの連成解析において使用できず、さらに、ＡＳＢ基質から直接アグリコンを生成しないようにヘキソサミニダーゼＡを阻害することが重要である。

ヒトヘキソサミニダーゼＡのＡＳＢ基質への作用を確立し、ＧＡＬＮＳ用に開発したものと同じ手法を使用する、すなわち、β−ＮＧＡおよびＺ−ＰＵＧ−ＮＡｃを添加するＡＳＢアッセイを開発した。結果を以下の表２に記載する。ＧＡＬＮＳアッセイのための実験（例１０を参照）を実施したが、ＧＡＬＮＳ基質は１ｍＭのＡＳＢ基質に置きかえられる。

実験１（血液を含む全アッセイ）と実験２（血液を含まない対照）の比較は、両方の実験で、β−ＮＧＡの存在がほとんどのＡＳＢ内部標準をそのアグリコンに変換することを示す。血液を有する場合のアグリコンの量1,570,000は、血液を含まない対照において形成された58,300を大きく上回る。実験３は、血液およびＺ−ＰＵＧ−ＮＡｃを有するが、β−ＮＧＡは有さず、ＡＳＢ生成物の量371,000を、β−ＮＧＡの存在下で、そのアグリコンのシグナル1,570,000と比較すると、ここでも生成物をアグリコンに変換する感度の利点を示す。最後に、実験４は、血液がなく、β−ＮＧＡまたはＺ−ＰＵＧ−ＮＡｃもなく、ＡＳＢ基質が、少量の生成物3,340およびそのアグリコン33,800によって汚染されていることを示す。

本発明は、ＧＡＬＮＳおよびＡＳＢ酵素活性のアッセイを実行するために、ここで以下に記述する特性を有する任意の酵素の使用を提供する：
（ａ）ここで記載するアッセイに使用する酵素は、糖が４位または６位にサルフェートを保有していない場合のみ、糖を切断してアグリコンを生成する必要がある、および
（ｂ）ここで記載するアッセイに使用する酵素は、アッセイ対象のリソソーム酵素源である生体サンプル（たとえば、乾燥血液スポット）中に存在するヒトヘキソサミニダーゼＡを顕著に阻害する、アッセイ混合物に添加される阻害剤によって有意に阻害されてはならない。

蛍光検出

いくつかの態様において、本発明のある種のアッセイは、蛍光法を用いる、ここで記載する酵素のアッセイにおいても有用である。一側面において、アグリコンは蛍光性であるが、糖とグリコシド結合を形成する場合は蛍光性が弱い。したがって、一側面において、アリールスルファターゼＢ（ＡＳＢ）と細菌Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼとを組み合わせた作用は、蛍光性の強いアグリコンを形成するため、蛍光シグナルを高くする。本発明のアッセイでの使用に適した蛍光性グリコシドを以下に示す。

上に示す蛍光性グリコシドは、追加の置換基（Ｒ基）を保有する７−ヒドロキシクマリンに結合したグリコシドを含有する蛍光性ＡＳＢ基質である。ＡＳＢに後続する細菌Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの連続作用は、置換された７−ヒドロキシクマリンをもたらし、これはグリコシドよりも蛍光性が強い。したがって、ＡＳＢは、蛍光シグナルの増加を観察してアッセイする。グリコシドがＡＳＢおよびＮ−アセチルガラクトサミニダーゼの基質であり、グリコシドを切断したときにフルオロフォアの蛍光強度が変化する限り、他のフルオロフォアも使用可能である。脱プロトン化の結果、フェノールがフェノキシドになる場合、高ｐＨで蛍光強度が大きく向上することを理解されたい。実験的には、ある種の態様において、ｐＨ１０．５の緩衝液でアッセイを失活して蛍光性を現す。

以前は、ＡＳＢをアッセイするこの方法も、グリコシドを選択的に切断するために酵素を使用することも、硫酸化されていなければ、役に立たなかった。この方法は、糖残基の６位にサルフェートを含有する好適な基質を用いてＧＡＬＮＳをアッセイするために使用することもできる。本発明は、グリコシドとしてガラクトース−６−サルフェートに結合される４−メチルウンベリフェロンなど、他の基質よりも迅速にＧＡＬＮＳによって作用する、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン−６−サルフェートベースの基質を使用するアッセイを提供する。

以下の例は、説明を目的とし、本発明を制限せずに提供されるものである。

［実施例］
例１
代表的なＭＰＳ−ＩおよびＭＰＳ−ＩＩ試薬の合成
この例において、代表的なＭＰＳ−Ｉ（ＭＰＳ−Ｉ−Ｓ−アセチル−Ｃ６およびＭＰＳ−Ｉ−ＩＳ−アセチル−Ｃ６）試薬およびＭＰＳ−ＩＩ（ＭＰＳ−ＩＩ−Ｓ−ペンタノイル−Ｃ６およびＭＰＳ−ＩＩ−ＩＳ−ペンタノイル−Ｃ６）試薬の合成を記述する。

１−Ｆ−２，３，４−トリアセトキシ−イズロン酸メチルエステルの合成
１−Ｆ−２，３，４−トリアセトキシ−イズロン酸メチルエステルの合成を以下に記述する。

工程１

１，２，３，４−テトラ−Ｏ−アセチル−α，β−グルコピラノシルウロン酸メチル（Carbosynth、UK）の５０．０５ｇ（１３３．０ｍｍｏｌ）分を０℃、窒素下で２９５ｍＬの３３％ＨＢｒ／酢酸（Acros カタログ番号123180010）中に懸濁させ、０℃で１５分間攪拌した。反応液を室温まで温め、攪拌を３時間続けた。反応液を２９５ｍＬのトルエンで希釈し、次いでロータリーエバポレーター（３０〜３５℃の水浴および水流式アスピレータによる吸引）上で濃縮した。残留物を８００ｍＬのＥｔＯＡｃに溶解し、５００ｍＬの氷冷した飽和水性ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、氷冷したブラインで洗浄し、次いで無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水した。溶液を濾過し、上記のように回転蒸発で溶媒を除去した。化合物を高真空下の室温に１時間置いた。プロトン−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）は、生成物と一致する。２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（５％Ｈ_２ＳＯ_４のＭｅＯＨ溶液によるチャーリング（charring））を用いてシリカ上で実施したＴＬＣは、Ｒｆが約０．５の出発材料でＲｆが約０．６の生成物を示す。起点のすぐ上に２つの小さなスポットが検出された。

上記からの未精製臭化物を６００ｍＬの無水アセトニトリルに溶解し、窒素下で約５分間攪拌して臭化物を溶解した。フラスコをアルミニウム箔で包んで光を遮蔽した。２０．２７ｇのＡｇＦ（Oakwood カタログ番号002862）を一部ずつ添加した。室温の暗所で、反応液を２４時間、窒素下で攪拌した。２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（５％Ｈ_２ＳＯ_４のＭｅＯＨ溶液によるチャーリング）を用いてシリカ上で実施したＴＬＣは、Ｒｆが約０．６の出発材料でＲｆが約０．５の生成物を示す。混合物を、吸引によってセライトパッドに通して濾過し、次いで濾液を回転蒸発で濃縮した（３０〜３５℃の水浴および吸引のための水流式アスピレータ）。１８０ｇシリカをガラスカラムにローディングし、ヘキサンをカラムに通した。化合物はＥｔＯＡｃに溶解し、必要最低限量の乾燥シリカを加えた。回転蒸発によってＥｔＯＡｃを除去し、得られた化合物／シリカの混合物をカラム上部にローディングした。カラムは、低気圧で操作した。最初に１Ｌの１００％ヘキサンをカラムに通し、生成物は溶出しなかった。次いで、カラムに２Ｌの２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを通したところ、生成物は溶出しなかった。１Ｌの２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンでも生成物を溶出しなかった。最後にカラムに３Ｌの３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを通すと、すべての生成物が溶出された。各画分を貯めて、回転蒸発によって溶媒を除去して、白色の結晶性固体を得た。生成物を高真空下の室温で１時間乾燥して、２７．０ｇの生成物（収率６０．４％）を得た。プロトン−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）は、生成物と一致した。

工程２

６．０ｇの上記のフッ化物および６．０ｇのＮＢＳ（Aldrich カタログ番号B81255-500G、熱湯から再結晶化し、高真空下で終夜乾燥した）を２４０ｍＬのＣＣｌ_４（JT Baker カタログ番号1512-3）に溶解し、ＵＶランプ（４５０Ｗ、Ace Glass7825-34ランプ、石英ジャケット、水の循環によりランプを冷却する）の横に置いた丸底フラスコ中、窒素下で攪拌した。同じ反応液を入れた別の丸底フラスコを同ＵＶランプの反対側に置いた。２つの反応液は、このやり方で同時に実施した。

フードの外側をアルミニウム箔で覆って化学者を保護した。ランプのスイッチを入れ、反応液を７８℃で２時間還流させた。ランプをオフにし、一回分約６ｇのＮＢＳをそれぞれの反応液に添加し、ＵＶランプをオンに戻し、反応液の還流を続行させた。さらに２時間後、追加の一回分約６ｇのＮＢＳを上記と同様に添加し、ＵＶランプの存在下でさらに３時間還流を続けた。合計７時間後、ランプをオフにし、反応液を室温まで放冷させた。各反応液をガラスウールに通して濾過し、ウールを５０ｍＬのＣＣｌ_４で洗浄した。回転蒸発（３５℃の水浴および吸引のための水流式アスピレータ）によって溶媒を除去した。３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いたＴＬＣは、出発材料のすぐ上に移動した生成物のスポットは約０．６のＲｆを示した（５％Ｈ_２ＳＯ_４のＭｅＯＨ溶液によるチャーリング）。４×６ｇ規模の反応液を、１８０ｇのシリカをローディングしたカラム上で同時に精製した。化合物をＥｔＯＡｃに溶解し、必要最低限量の乾燥シリカを加え、回転蒸発によってＥｔＯＡｃを除去し、次いでシリカ／化合物の混合物をカラム上部に導入した。カラムに１Ｌの１００％ヘキサンを流したところ、生成物は溶出されなかった。カラムに２Ｌの１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを流したところ、生成物は溶出されなかった。カラムに３Ｌの２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを流したところ、生成物は溶出され、ゆっくり溶出された２つのスポットがＴＬＣで可視化された。副生成物（速く溶出されたＴＬＣスポット）を含有していた画分（加えた３Ｌのうちの７００ｍＬ〜１３００ｍＬ）は廃棄した。全生成物を含有する画分（加えた３Ｌのうちの１４００ｍＬ〜２５００ｍＬ）を合わせ、回転蒸発によって溶媒を除去して粘性の黄色の液体を得て、これを終夜放置して結晶性固体にした。この固体を高真空下に１２時間置いた。合計生成物１８．９０ｇが４×６ｇの反応液から得られた（収率６３．３％）。

工程３

上記の臭化物９．９２ｇを１５４ｍＬのトルエン（非乾燥、Macron Chemicals カタログ番号4483-4L）に溶解し、窒素下で攪拌した。１０．０ｍＬのＢｕ_３ＳｎＨ（Aldrich 234188-10GまたはAcros 215730500のいずれか）を添加し、混合物を１１０℃で１時間還流した。ＴＬＣ（１０％ＥｔＯＡｃのトルエン溶液）が、出発材料がいくらか残留していたことを示したため、さらに１時間還流を続けた。ＴＬＣを繰り返し、反応が完了したことを示した。丸底フラスコを室温に放冷させ、回転蒸発によって溶媒を除去した（約４０℃の水浴および吸引のための水流式アスピレータ）。

１８０ｇのシリカをカラムに導入した。未精製残留物をシリカに吸収させ、先と同様にカラムに導入した。カラムに１Ｌの１００％トルエンを流したところ、生成物は溶出されなかった。カラムに１Ｌの１０％ＥｔＯＡｃ／トルエンを流したところ、生成物は溶出されなかった。カラムに２．５Ｌの２０％ＥｔＯＡｃ／トルエンを流したところ、生成物は溶出され、ゆっくり溶出された２つのスポットがＲｆ約０．６で確認された（１０％ＥｔＯＡｃ／トルエンにおけるＴＬＣ）。Ｒｆ約０．７の速く溶出されたスポットは、副生成物のグルクロン酸であった。速く溶出されたＴＬＣスポットを含有していた画分（２．５Ｌのうちの６００ｍＬ〜１０００ｍＬ）は廃棄した。生成物を含有する画分（２．５Ｌのうちの１１００ｍＬ〜２１００ｍＬ）を貯めて、回転蒸発によって濃縮して（約４０℃の水浴および吸引のための水流式アスピレータ）、高真空下で３時間置いて５．２ｇの生成物（収率６４．７％）を得た。生成物は、精製すると、透明な粘性の液体である。

アグリコンの調製
アグリコンは２つの方法によって作製できる。第１の方法は、市販のモノ−ＢＯＣ−１，６−ヘキサンジアミンの、ＨＰ−Ｐｈ−ＮＨＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ_２へのマイケル付加、続いて第２級アミンのアセチル化、ＢＯＣの除去、および第１級アミンのベンゾイル化を利用する。フェノール−ＯＨのベンゾイル化がいくらか生じるが、サンプルの処理前に、このエステルはけん化によって切断される。第２の方法は、モノ−ＢＯＣ−１，６−ヘキサンジアミンを塩化ベンゾイルで処理し、ＢＯＣを除去してモノベンゾイル−１，６−ヘキサンジアミンを得、これをマイケル付加に使用した後、第２級アミンをアセチル化することを含む。ベンゾイル化およびＢＯＣ除去は両方ともほぼ定量的であるため、各経路は本質的に同等である。

対称ジアミンのモノベンゾイル化（Tang,W.; Fang,S. Tetrahedron Lett. 2008, 49, 6003）

安息香酸メチル（１．０ｇ、７．３４ｍｍｏｌ）に、ペンタン−１，５−ジアミン（０．７５ｇ、７．３４ｍｍｏｌ）および水（０．３７ｍＬ）を添加し、混合物を常時攪拌しながら２４時間１００℃に加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、短いシリカカラムに直接導入した（シリカカラムは、予め、４％トリエチルアミンのクロロホルムを流し、続いて１００％クロロホルムを流した後で、反応混合物を導入した）。３０％メタノールのクロロホルムで溶出して、所望の淡黄色の油状物のモノベンゾイル化生成物（０．８０ｇ、５３％）を得た。¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.83 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.58 - 7.31 (m, 4H), 3.41 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.74 - 1.21 (m, 6H).
［Ｍ＋Ｈ］^＋に対するＭＳ（ＥＳＩ^＋）、計算値：２０７．１、観測値：２０７．２。

方法１
ＣＨ_２Ｃｌ_２（４００ｍＬ）中の４−アミノフェノール（５０ｇ、４５８ｍｍｏｌｅ）の溶液および飽和ＮａＨＣＯ_３の水（４００ｍＬ）溶液を室温で１０分間攪拌し、次いで塩化アクリロイル（４０．９ｍＬ、５０３．８ｍｍｏｌｅ）を滴下添加し、反応液を室温でさらに６時間攪拌した。生成した固体を濾過によって集め、水で洗浄し、真空下（油ポンプ）で乾燥して、７５ｇの４−アクリルアミドフェノールを得た。

４−アクリルアミドフェノール（１６３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）およびモノ−ＢＯＣ−１，６−ヘキサンジアミン（Ark Pharm Inc.）（２３７ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を、イソプロパノール（９ｍＬ）と水（１ｍＬ）の溶液に溶解し、６５℃の油浴中で４８時間加熱した。反応混合物を回転蒸発によって濃縮して、マイケル付加反応生成物を得、これはさらなる精製をせずに、次の工程で使用した。

上記工程で得た残留物に、ＣＨ_２Ｃｌ_２（４ｍＬ）および４ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム水溶液を添加した。塩化アセチル（０．２１ｍＬ、３ｍｍｏｌｅ）を室温で攪拌しながら滴下添加し、混合物をさらに３時間、室温で攪拌した。層を分離させ、回転蒸発によってＣＨ_２Ｃｌ_２層を濃縮した。

残留物を４ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、２ｍＬの４Ｍ ＨＣｌのジオキサンを攪拌しながら滴下添加した。室温で１時間、攪拌し続けた。生成固体を濾過によって集め、固体を真空（油ポンプ）下で乾燥した。

上記の固体に、１０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２および１０ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム水溶液を添加した。塩化ベンゾイル（０．２３ｍＬ、２ｍｍｏｌｅ）を攪拌しながら滴下添加し、混合物を室温でさらに３時間攪拌した。層を分離させ、ロータリーエバポレーターによってＣＨ_２Ｃｌ_２層を濃縮した。残留物を２ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、２ｍＬの５％ＮａＯＨ水溶液を添加した。混合物を室温で３０分間攪拌した（この工程はベンゾイル化フェノールを完全に除去するために必要である）。混合物を１Ｍ ＨＣｌで中性化し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過して、回転蒸発によって溶媒を除去した。残留物を、５％ＭｅＯＨのＣＨ_２Ｃｌ_２を用いたシリカゲルクロマトグラフィーにかけて、１７０ｍｇの純粋な生成物（全体収率４０％）を得た。

方法２

氷冷したジクロロメタン（３５０ｍＬ）中のモノ−ＢＯＣ−１，６−ヘキサンジアミン・ＨＣｌ（２０ｇ、７９．１２ｍｍｏｌ）の乾燥溶液に、無水トリエチルアミン（３３ｍＬ、２３７．４ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で攪拌しながら滴下添加した。１０分後、塩化ベンゾイル（９．６４ｍＬ、８３ｍｍｏｌ）を０℃にて滴下添加し、得られた混合物を室温で終夜攪拌した。水（２００ｍＬ）を加え、水性層を一回分２００ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２で２回抽出し、有機抽出液を合わせ、水、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過し、回転蒸発によって濃縮した。生成固体をヘキサンで洗浄して低極性不純物を除去し、固体は、精製せずに次の工程に使用した。

上記固体を１００ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、３００ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２中２０％のＴＦＡを０℃で攪拌しながら滴下添加し、生成混合物を室温で終夜攪拌した。反応混合物を回転蒸発によって濃縮した。得られた残留物を３００ｍＬの水に溶解し、一回分２００ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２で２回洗浄し、低極性の不純物を除去した。得られた水性層を５％ＮａＯＨ水溶液で中性化し、一回分２００ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２で４回抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過し、回転蒸発によって溶媒を除去した。得られた粗生成物（１４．６ｇ、６６．４ｍｍｏｌ、８４％）は、さらに精製せずに次の工程で使用した。このやり方で遊離アミンを得、これは次の工程（マイケル付加）に必要である。

４−アクリルアミドフェノール（８．４３ｇ、５１．６ｍｍｏｌ）およびモノ−ベンゾイル−１，６−ヘキサンジアミン（１２．５ｇ、５６．８ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（４５０ｍＬ）と水（５０ｍＬ）の溶液に溶解し、６５℃の油浴中で４８時間加熱した。反応混合物を回転蒸発によって濃縮して、マイケル付加生成物を得て、これを２部に分け、さらに精製せずに次の工程に使用した。

アセチル化

上記工程で得た残留物に、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）、ＤＭＦ（１０ｍＬ）および１００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム水溶液を添加した。塩化アセチル（３．７ｍＬ、５２ｍｍｏｌ）を室温で攪拌しながら滴下添加し、混合物を室温でさらに６時間攪拌した。有機層を分離し、水性層を一回分５０ｍＬの５％ＭｅＯＨのＣＨ_２Ｃｌ_２で２回抽出した。有機層を合わせ、回転蒸発によって濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１〜５％ＭｅＯＨのＣＨ_２Ｃｌ_２）によって精製し、ＭＰＳ−Ｉアグリコン（４．５ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）を収率４１％で得た。
ペンタノイル化

上記工程で得た残留物に、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）、ＤＭＦ（１０ｍＬ）および１００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム水溶液を添加した。塩化ペンタノイル（６．１７ｍＬ、５２ｍｍｏｌ）を室温で攪拌しながら滴下添加し、混合物を室温でさらに６時間攪拌した。有機層を分離し、水性層を一回分５０ｍＬの５％ＭｅＯＨのＣＨ_２Ｃｌ_２で２回抽出した。有機層を合わせ、回転蒸発によって濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１〜５％ＭｅＯＨのＣＨ_２Ｃｌ_２）によって精製し、ＭＰＳ−ＩＩアグリコン（３．５ｇ、７．５ｍｍｏｌ）を収率２９％で得た。

ＭＰＳ−Ｉ−ＩＳ−アセチル−Ｃ６
内部標準ＭＰＳ−Ｉ−Ｐ−アセチル−Ｃ６は、ｄ_５−塩化ベンゾイル（Aldrich）を使用する以外は、ＭＰＳ−Ｉアグリコンについて記載したものと同様に調製した。酵素生成物ＭＰＳ−Ｉ−Ｐ−アセチル−Ｃ６は、ＭＰＳ−Ｉアグリコンである（すなわち、ＩＳと同一であるが、ベンゾイルは重水素化されない）。

アグリコンとイズロニル−Ｆとの結合、脱アセチル化、およびメチルエステル加水分解 以下に、ＭＰＳ−ＩＩアグリコンと結合させるための手順を記述する。ＭＰＳ−Ｉアグリコンと結合するための手順も同様である。

ＭＰＳ−ＩＩアグリコン（１．９ｇ、４．０６ｍｍｏｌ、１当量）、２，３，４−トリヒドロキシ−イズロノシ（iduronosy）−１−Ｆメチル（１．２３ｇ、３．６６ｍｍｏｌ、０．９当量）および２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルピリジン（２．５ｇ、１２．２ｍｍｏｌ、３当量）を高真空（油ポンプ）下で１時間乾燥し、乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（８０ｍＬ、０．０５Ｍ）に溶解した。ＢＦ_３−エーテラートを添加する前にすべてのＭＰＳ−ＩＩアグリコンを溶解した。ＭＰＳ−Ｉアグリコンとの反応では、より多くのＣＨ_２Ｃｌ_２を使用して０．０２Ｍアグリコンを得た（ＢＦ_３−エーテラートを添加した後でもすべては溶解しなかった）。

ＢＦ_３・Ｅｔ_２Ｏ（５．１ｍＬ、４０．６ｍｍｏｌ、１０当量）を窒素雰囲気下の室温で攪拌しながら滴下添加した。反応混合物を室温で２．５時間攪拌した後、１５０ｍＬの飽和水性ＮａＨＣＯ_３を添加した。水性層をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出し、有機抽出物を合わせ、水、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水した。溶液を濾過し、回転蒸発によって濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２、次いで１〜４％ＭｅＯＨのＣＨ_２Ｃｌ_２）によって精製し、生成物（１．８７ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を収率６５％で得た。

脱アセチル化

結合生成物（２．７ｇ、３．４４ｍｍｏｌ、１当量）の７５ｍＬの乾燥メタノール溶液（Aldrich）に、０．５Ｍナトリウムメトキシドのメタノール（２．７５ｍＬ、１．３８ｍｍｏｌ、０．４当量）を０℃の窒素雰囲気下で攪拌しながら滴下添加した。反応混合物を０℃で３時間攪拌した。反応混合物をAG 50W-X8樹脂（Ｈ＋）で中性化し、濾過した。濾液を回転蒸発によって濃縮した。シリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（１〜６％ＭｅＯＨのＣｈ_２Ｃｌ_２溶液）によって、収率９２％で生成物（２．１ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）を得た。

メチルエステル加水分解

ＭＰＳ−Ｉ−Ｓ−アセチル−Ｃ６は、メチルエステルを脱メチルすることによって作製する。ＭＰＳ−ＩＩ−Ｓ−ペンタノイル−Ｃ６の場合、脱アセチル化合物を硫酸化し、次いでメチルエステルを加水分解する。ＭＰＳ−ＩＩ−Ｐ−ペンタノイル−Ｃ６は、メチルエステルのけん化によって作製し、ＭＰＳ−Ｉ−Ｓ−アセチル−Ｃ６の場合のような硫酸化は行わない。ＭＰＳ−ＩＩ−ＩＳ−ペンタノイル−Ｃ６は、ＭＰＳ−ＩＩ−Ｐ−ペンタノイル−Ｃ６の場合と同様に作製するが、ｄ_５−ベンゾイル基を含有するアグリコンによって作製する。

脱アセチル化合物（１．５ｇ、２．４４ｍｍｏｌ、１当量）を１５０ｍＬの水／メタノール（１：１）に室温で溶解した。０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を、溶液のｐＨが約８（ｐＨ紙）に達するまで、０．１当量のＮａＯＨの増加分で添加した。反応の進行に応じて０．１ＭのＮａＯＨ溶液を増加分添加することによって（約２当量のＮａＯＨを添加した）、ｐＨを維持した。反応混合物を終夜攪拌した。反応混合物を１ＭのＨＣｌで中性化し、回転蒸発によって濃縮した。残留物をシリカ上のカラムクロマトグラフィー（５％ＭｅＯＨおよび１％ＡｃＯＨのＣｈ_２Ｃｌ_２、次いで１０％ＭｅＯＨおよび２％ＡｃＯＨのＣｈ_２Ｃｌ_２）によって精製し、生成物ＭＰＳ−Ｉ−Ｓ−アセチル−Ｃ６（１．４５ｇ、２．４１ｍｍｏｌ）を収率９８％で得た。

ＭＰＳ−Ｉ酵素生成物を基質から可能な限り多く除去することが重要であり、そうしなければアッセイブランクはより高くなる。生成物は抽出しやすいので、基質をｐＨ７の水に溶解してＥｔＯＡｃで抽出してもよい。しかし、そのカルボキシレートに起因して陰性の基質は、水中に残留する。１．５ｇのＭＰＳ−Ｉ−Ｓ−アセチル−Ｃ６を２００ｍＬの蒸留水に溶解し、ｐＨメーターを使用して、ＫＯＨによってｐＨを７近くに調節する。一回分２００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出する。水性層を丸底フラスコに移し、水流式アスピレーションおよび３０℃の水浴を備えたロータリーエバポレーター上に配置し、約２０分間、回転蒸発して水中のＥｔＯＡｃをすべて除去する。次いで、水性層を凍結乾燥して最終生成物のＭＰＳ−Ｉ−Ｓ−アセチル−Ｃ６のナトリウム塩を得る。この手順により、ＭＰＳ−Ｉ生成物を含有する基質が生成された。代替の精製を調べた。

一代替において、５０ｍｇのＭＰＳ−Ｉ−Ｓ−Ａｃ−Ｃ６を５ｍＬの水に溶解し、希釈したＮａＯＨ水溶液でｐＨ７（ｐＨメーター）に調節し、ボルテックスすることによって８ｍＬの酢酸エチルを用いて抽出し、次いで遠心分離にかけて層を分離し、さらに４回繰り返した（すなわち、合計４０ｍＬの酢酸エチル）。水性層を凍結乾燥した。ＭＰＳ−Ｉ生成物の量は非常に少なく、この精製によって許容されるものだった。

別の代替において、１２０ｍｇのＭＰＳ−Ｉ−Ｓ−Ａｃ−Ｃ６を、１０分にわたって１〜１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２線形勾配を使用し、次いで２０％までのＭｅＯＨ／２％水／ＣＨ_２Ｃｌ_２を使用したフラッシュＳｉカラム（１０ｇシリカ）によって精製した。材料のピークを３つのバッチ：ピークの３分の１、３分の２および最後の３番目にプールした。３０℃の水浴および水吸引を備えた回転蒸発によって溶媒を除去した。３つの別々のバッチを用いて行ったアッセイは、中間および最後の３番目のピーク材料が、許容量のＭＰＳ−Ｉ−生成物を含有していたことを示した。

硫酸化およびメチルエステル加水分解

脱アセチル化合物（２ｇ、３．０４ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＭｅＯＨ（１２０ｍＬ）中に可溶化し、ジブチルスズ（ＩＶ）オキシド（１．１３ｇ、４．５６ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。反応混合物を窒素下で１時間、還流下で加熱し、その後、ジブチルスズオキシドを完全に溶解した。反応混合物を放冷させ、真空下で濃縮した。残留物を、無水トルエン（１００ｍＬ）を用いて一度に共蒸発し、微量の水を除去した。残留物を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１２０ｍＬ）中に可溶化した。三酸化硫黄−トリメチルアミン複合体（６３３．８ｍｇ、４．５６ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、反応混合物を室温、窒素雰囲気下で２４時間攪拌した。反応混合物をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で失活した。次いで混合物を真空下で濃縮した。残留物を、シリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨおよび１％Ｈ_２Ｏ／ＣＨ_２Ｃｌ_２、次いで２０％ＭｅＯＨおよび２％Ｈ_２Ｏ／ＣＨ_２Ｃｌ_２）によって精製して、サルフェート化合物（１．２ｇ、１．６３ｍｍｏｌ）を収率５３．６％で得た。

サルフェート化合物（１ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を室温で１：１のメタノール−水（１００ｍＬ）中に可溶化した。溶液のｐＨが約８（ｐＨ紙）に達するまで、０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を０．１当量のＮａＯＨの増加分で添加した。反応の進行に応じて（１５〜３０分ごと）０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液を量を増やしながら添加することによってｐＨを維持した。ｐＨを高くしないことは恐らく重要であり、その理由は、これが、硫酸エステルのいくつかの加水分解をもたらし得るからである。反応混合物を終夜攪拌した（約２当量のＮａＯＨ添加）後、真空下で濃縮し、メタノールおよび水を除去した。残留物を、シリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨおよび１％Ｈ_２Ｏ／ＣＨ_２Ｃｌ_２、次いで２０％ＭｅＯＨおよび２％Ｈ_２Ｏ／ＣＨ_２Ｃｌ_２）によって精製して、ＭＰＳ−ＩＩ−Ｓ（０．７７ｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を収率７９％で得た。

硫酸化材料からの非硫酸化材料の除去は、下記の抽出またはイオン交換クロマトグラフィーによって実施することができる。

抽出クリーンアップ

シリカゲルからの化合物（０．７７ｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を純水（２００ｍＬ）に溶解し、１Ｍ ＨＣｌを滴下添加し、ｐＨメーターによるｐＨを２．７に調節した。水性層をＥｔＯＡｃ（５×２００ｍＬ）で抽出した。残りの水性層を丸底フラスコに移し、これを３０℃の水浴および水流式アスピレーションを備えたロータリーエバポレーターに配置し、３０分間、微量のＥｔＯＡｃを水性層から除去した。水性層を凍結乾燥した。ＥｔＯＡｃで５回抽出したＬＣ−ＭＳＭＳは、初回のものと比較して３回目の抽出における非硫酸化材料で約１００倍の落下を示した。４回目および５回目の抽出の量は少なく、３回目の抽出における量と類似していた。

イオン交換による精製

ＡＫＴＡは、溶媒Ａ（ＭｅＯＨ）および溶媒Ｂ（ＭｅＯＨ＋１Ｍギ酸アンモニウム）を使用する。市販のPharmacia HiLoad26/10 Q-Sepharoseカラム（３ｍＬ／分）を使用する。約１０ｍｇのＭＰＳ−ＩＩ−ＩＳ−Ｐｅｎｔ−Ｃ６−ｄ５を約０．５ｍＬでカラム上に注入し、１００％のＡで２０分間維持し、次いで線形勾配を０〜１００％のＢで３０分にわたって流し、１００％のＢで維持した（５１分で溶出）。２２ｍｇのＭＰＳ−ＩＩ−Ｓ−Ｐｅｎｔ−Ｃ６の１．５ｍＬ ＭｅＯＨ溶液を上記のプログラム（２ｍＬループ）を使用して注入した。基質は１００分で溶出した。ＭｅＯＨを回転蒸発により除去した（水流式アスピレータ、２５〜３０℃水浴）。残留物を約１０ｍＬの水に溶解し、予め約１００ｍＬのＭｅＯＨ、次いで約１００ｍＬの水で洗浄しておいた、Waters C18 Sep-Pak（サイズ５０ｇ）に導入し、約２００ｍＬの水で洗浄した（ＯＤ２８０ｎｍは０に近い）。化合物を約２００ｍＬのＭｅＯＨで溶出し、追加のＭｅＯＨは０に近いＯＤ２８０を有しており、メタノールは回転蒸発（水流式アスピレータ、３０℃水浴）によって除去した。残留物を数ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、２×５ｍＬガラス瓶に移し（移すのを完了するためにより多くのＭｅＯＨを使用した）、加熱せずにＳｐｅｅｄ−Ｖａｃに終夜かけた。

例２
ＭＰＳ−Ｉ試薬を使用する代表的アッセイ
この例において、本発明のＭＰＳ−Ｉ試薬を使用する代表的なアッセイを記述する。これらの試薬の結果を、他のＭＰＳ−Ｉ試薬と比較する。

元のＭＰＳ−Ｉ反応を以下に示す（Blanchard, Sophie, Sadilek, Markin, Scott, C.Ronald, Turecek, Frantisek, and Gelb, Mechael H. (2008) "Tandem mass spectrometry for the direct assay of Lysosomal enzymes in dried blood spots: Application to screening newborns for Mucopolysaccharidosis I." Clin. Chem., 54: 2067-2070）。Ｓ、ＰおよびＩＳがＢＯＣ基を有し、ＰとＩＳが化学的に同一ではない（Ｐは４つのＣＨ２基を結合中に有し、一方、ＩＳは３つ有する）ことに留意されたい。

代替のＭＰＳ−Ｉ反応を以下に示す：

異なるアグリコンが、Ｎ−アセチル基を有し、ＢＯＣカルバメート基を有さないことに留意されたい。また、内部標準が、生成物と化学的に同一ではないが、ベンゾイル基中に５つの重水素を有することにも留意されたい。

ＭＰＳ−Ｉ原基質および代替基質を以下の酵素的アッセイで対照比較した：０．５ｍＭ基質、３０ｕＬの緩衝液中の３．５ｕＭ内部標準（１００ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ４．０）。パンチ３ｍｍの乾燥血液スポットを添加し、混合物を３７℃で１６時間、振盪させながらインキュベートした。１２０ｕＬのアセトニトリルを添加することによって反応を失活した。ウェルを遠心分離にかけ、１２０ｕＬの上澄みを新しいウェルに移した。１２０ｕＬの水を添加することによってサンプルを希釈し、１０ｕＬをＬＣ／ＭＳＭＳ系上に注入した。ＬＣおよびＭＳ／ＭＳ条件は、刊行されている通りである（Spacil,Z., Tatipaka,H., Barcenas,M., Scott,C.R., Turecek,F., Gelb,M.H. (2012) "High-Throughput Assay of 9 Lysosomal Enzymes for Newborn Screening." Clinical Chemistry., 59(3), 1530-8561）。ブランクアッセイも実施し、パンチ３ｍｍの血液非含有濾紙が乾燥血液スポットと置きかわる。上記のようにブランクをインキュベートし、処理する。

^１酵素活性は、血液１リットル当たり、１時間当たりに形成された生成物のｕｍｏｌｅとして表す。

^２変動係数（ＣＶ）は、同乾燥血液スポットから異なるパンチでそれぞれ実施した６回のアッセイに基づく。

^３ＭＳＭＳ応答は、検体のｐｍｏｌｅ当たりのタンデム質量分析チャンネルにおいて測定されたイオン計数の量である。

^４血液−無血液のアッセイ比は、乾燥血液スポットのパンチを用いるアッセイにおいて測定された酵素活性と、血液非含有パンチで測定された酵素活性との比である。

どちらのＭＰＳ−Ｉ基質もＭＰＳ−Ｉ酵素（血液１リットル当たり、１時間当たりに生成された生成物ｕｍｏｌｅ）に対し同様の作用を示すが、代替基質が、ＭＳＭＳ検出において約５倍高感度な生成物（検体１ｐｍｏｌｅ当たりに検出されたイオン計数）を誘発することが上記の表から分かる。同様の結果が、フローインジェクション−ＭＳＭＳによって得られた。代替ＭＰＳ−Ｉ生成物および内部標準に対するＭＳＭＳ応答は、本来のもの（図示せず）より約５倍高かった。

ＭＰＳ−Ｉ生成物のＭＳＭＳ応答を、ファブリーアッセイ生成物（以下に構造を示す）と比較した。

ＭＰＳ−Ｉ生成物は、アミン上にアセチルを有し、一方でファブリー生成物はＢＯＣカルバメートを有することに留意されたい。ＢＯＣカルバメートは、イソブチレンおよびＣＯ_２の損失に起因して、ＭＳＭＳ機器のエレクトロスプレーイオン化源において部分的に分解し、ＢＯＣがＨに置きかわった分解生成物を生成する。ファブリー生成物は、１ｐｍｏｌｅ当たり２１１のイオン計数を与え、一方でＭＰＳ−Ｉ生成物は、１ｐｍｏｌｅ当たり５００イオン計数を与える。

例３
ＭＰＳ−ＩＩ試薬を使用する代表的アッセイ
この例において、本発明のＭＰＳ−ＩＩ試薬を使用する代表的なアッセイを記述する。これらの試薬についての結果を他のＭＰＳ−ＩＩ試薬と比較する。

元のＭＳＰ−ＩＩ反応を以下に示す（Wolfe,B.J., Blanchard,S., Sadilek,M., Scott,C.R., Turecek,F., Gelb,M.H. (2011) "Tandem mass spectrometry for the direct assay of Lysosomal enzymes in dried blood spots: Application to screening newborns for Mucopolysaccharidosis II(Hunter Syndrome)" Anal. Chem., 83: 1152-1156）。Ｓ、ＰおよびＩＳは、ＢＯＣ基を有することに留意されたい。

代替のＭＰＳ−ＩＩ反応を以下に示す：

Ｎ−ペンタノイル基を有し、ＢＯＣカルバメート基がない、異なるアグリコンに留意されたい。また、内部標準が、生成物と化学的に同一であるが、ベンゾイル基中に５つの重水素を有することも留意されたい。

ＭＰＳ−ＩＩ原基質および代替基質を以下の酵素的アッセイで対照比較した：１ｍＭ基質、３０ｕＬの緩衝液中の５ｕＭ内部標準（１００ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ４．０、７．５ｍＭ酢酸バリウム（ＩＩ）、５．０ｍＭ酢酸セリウム（ＩＩＩ））。パンチ３ｍｍの乾燥血液スポットを添加し、混合物を３７℃で１６時間、振盪させながらインキュベートした。２００ｕＬの４４ｍＭクエン酸を添加した後、４００ｕＬの酢酸エチルおよび１００ｕＬの水を添加することによって、反応を失活した。ピペットで上下に数回混合した後、サンプルを遠心分離（３０００ｒｐｍで１０分）にかけ、液層を分離した。２００ｕＬの酢酸エチル上層を一度に新しいウェルに移し、油を含まない気流による蒸発で溶媒を除去した。残留物を１００ｕＬのメタノール／５ｍＭ 水性ギ酸アンモニウム（８０／２０、ｖ／ｖ）に取り込み、タンデム質量分析計に注入した。バリウム塩およびセリウム塩は、乾燥血液スポット中に存在する遊離サルフェートおよびホスフェートを沈降させるために存在するが、その理由は、これらの陰イオンがＭＰＳ−ＩＩ酵素の生成阻害を生じるためである。クエン酸を使用して混合物を酸性化するため、ＭＰＳ−ＩＩ生成物および内部標準のイズロン酸部分のカルボキシレートは、プロトン化され、酢酸エチルに抽出される。ブランクアッセイも実施し、パンチ３ｍｍの血液非含有濾紙が乾燥血液スポットと置きかわる。上記のようにブランクをインキュベートし、処理する。

^１酵素活性は、血液１リットル当たり、１時間当たりに形成された生成物のｕｍｏｌｅとして表す。

^２変動係数（ＣＶ）は、同乾燥血液スポットから異なるパンチでそれぞれ実施した６回のアッセイに基づく。

^３ＭＳＭＳ応答は、検体のｐｍｏｌｅ当たりのタンデム質量分析チャンネルにおいて測定されたイオン計数の量である。

^４血液−無血液のアッセイ比は、乾燥血液スポットのパンチを用いるアッセイにおいて測定された酵素活性と、血液非含有パンチで測定された酵素活性との比である。

どちらのＭＰＳ−ＩＩ基質もＭＰＳ−ＩＩ酵素（血液１リットル当たり、１時間当たりに生成された生成物ｕｍｏｌｅ）に対し同様の作用を示すが、代替基質が、ＭＳＭＳ検出において約１０倍高感度な生成物（検体１ｐｍｏｌｅ当たりに検出されたイオン計数）を誘発することが上記の表から分かる。

例４
代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ基質および酵素生成物の合成
この例において、代表的なＭＰＳ−ＩＶＡ基質試薬の合成を記述する。ＭＰＳ−ＩＶＡ基質の合成の一般的なスキームを図２に示す。

（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−（４−ニトロフェノキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイル二酢酸（１）

ピリジン（６０ｍＬ）を、Ｄ−ガラクトサミン塩酸塩（５ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）を含有する窒素逆流置換フラスコに添加し、得られたスラリーを氷浴上で冷却した。冷却した混合物に、無水酢酸（２５ｇ、２４５ｍｍｏｌ）を滴下添加し、室温に温めた後、この温度で１６時間攪拌した。メタノール（１５ｍＬ）を添加して反応混合物を失活させ、２０分間攪拌させておいた。得られた混合物を減圧下で濃縮し、混合物を温めて、残留物を２０％メタノールのクロロホルムに溶解した。この溶液を１Ｎ ＨＣｌ溶液、続いてブライン溶液で洗浄した。生成した有機層を、無水硫酸ナトリウムを使用して乾燥し、減圧下で濃縮した。残留物を、滴下漏斗を備えた窒素逆流置換フラスコに取った。無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）をこの残留物に添加し、得られたスラリーを氷浴上で冷却した。滴下漏斗において、塩化チタン（６．５ｇ、４２．１ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を、冷却した溶液に滴下添加した。反応混合物を油浴中で５０℃に温め、この温度で４８時間攪拌させておいた。反応混合物を氷浴上で再度冷却し、飽和重炭酸ナトリウム溶液を激しく振盪しながら滴下添加した。得られた混合物をジクロロメタンと飽和重炭酸ナトリウム溶液との間で抽出した。無水硫酸ナトリウムを使用して有機層を乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた残留物をアセトン（６０ｍＬ）に溶解し、４−ニトロフェノール（１６．１ｇ、１１６ｍｍｏｌ）のアセトン（１３０ｍＬ）溶液および４Ｎ ＫＯＨ水溶液（２３．２ｍＬ）にゆっくり添加した。反応液を室温で４８時間攪拌させておき、減圧下で２０ｍＬ未満に濃縮した。この溶液を、１Ｎ ＮａＯＨとクロロホルムとの間で抽出した。無水硫酸ナトリウムを使用して有機層を乾燥し、減圧下で濃縮した。こうして得られた粗生成物を、ジクロロメタン中３％メタノールを溶出混合物として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ＴＬＣで決定された所望の化合物を含む画分を合わせ、減圧下で濃縮して１（３．２９ｇ、３０％）を得た。¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.20 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 5.61 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.56 - 5.39 (m, 3H), 4.32 - 4.07 (m, 4H), 2.18 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.97 (s, 3H).
［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対するＭＳ（ＥＳＩ^＋）、計算値：４９１．１、観測値：４９１．２。

Ｎ−（５−（Ｎ−（３−（（４−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アミノ）−３−オキソプロピル）ペンタンアミド）ペンチル）ベンズアミド（２）

１（３．５ｇ、７．４７ｍｍｏｌ）の無水メタノール（９０ｍＬ）溶液に、氷浴上で冷却した、０．５Ｍナトリウムメトキシドのメタノール（３ｍＬ、１．５０ｍｍｏｌ）溶液を滴下添加し、室温に温めた。２時間後、ギ酸（０．１ｍＬ）を反応混合物に添加し、減圧下で濃縮して乾燥させた。得られた残留したメタノール（１３５ｍＬ）に、水（１５ｍＬ）および活性炭担持１０％パラジウム（１２５ｍｇ）を添加し、水素雰囲気下の室温で１６時間攪拌させておいた。すべての白色の残留物が完全に溶解するまで、水を反応混合物に滴下添加した。反応混合物を濾過し、濾液を氷浴上で冷却した。これに、ピリジン（２ｍＬ）および続いて塩化アクリロイル（２．１ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液を滴下添加した。反応液を氷浴上で３０分間攪拌させておき、次いで室温に温め、２時間続行した。炭酸ナトリウム粉末（３．０ｇ）を反応混合物に添加し、１５分間攪拌させておき、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、高真空下でさらに乾燥した。残留物を２−プロパノール（５０ｍＬ）と水（６．６ｍＬ）の混合物に溶解し、これに、Ｎ−（５−アミノペンチル）ベンズアミド（２．０ｇ、９．６９ｍｍｏｌ）を添加し、６５℃で４０時間攪拌させておいた。反応混合物を室温に冷却し、メタノール（２５ｍＬ）をこれに添加した。この混合物を氷浴上で冷却し、トリエチルアミン（２．５ｍＬ）を添加した後、塩化ペンタノイル（２．７ｇ、２２．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液を滴下添加した。反応液を氷浴上で３０分間攪拌させておき、次いで室温に温め、１６時間続行した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン中１５％メタノールを溶出混合物として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィーによる精製にかけて、２（２．９６ｇ、６０％）を得た。¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.84 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.59 - 7.35 (m, 5H), 7.09 - 6.91 (m, 2H), 5.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.28 - 4.09 (m, 1H), 3.97 - 3.55 (m, 7H), 3.46 - 3.24 (m, 4H), 2.72 - 2.51 (m, 2H), 2.49 - 2.28 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 2.02 (s, 3H), 1.78 - 1.49 (m, 6H), 1.49 -1.22 (m, 4H), 0.94 (t, J = 7.1 Hz, 3H).［Ｍ＋Ｈ］^＋に対するＭＳ（ＥＳＩ^＋）、計算値：６５７．３、観測値：６５７．５。

（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−５−アセトアミド−６−（４−（３−（Ｎ−（５−ベンズアミドペンチル）−ペンタンアミド）プロパンアミド）フェノキシ）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチル硫酸ナトリウム（３）

化合物２（３２ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）に、窒素下で、無水ピリジン（１ｍＬ）を添加した。この溶液に、三酸化硫黄ピリジン複合体（１８ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で５時間攪拌させておいた。メタノール（０．３ｍＬ）を添加することによって反応を失活し、３０分間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、水に再度溶解し、水−メタノール勾配系を使用した逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣ精製にかけて、３（２３ｍｇ、６３％）を得た。¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.81 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.57 - 7.39 (m, 5H), 7.00 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 2H), 4.93 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.38 - 4.12 (m, 3H), 3.95 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 3.83 - 3.61 (m, 3H), 3.49 - 3.34 (m, 4H), 2.72 - 2.54 (m, 2H), 2.50 - 2.30 (m, 2H), 1.98 (s, 3H), 1.78 - 1.49 (m, 6H), 1.49 - 1.24 (m, 4H), 1.02 - 0.84 (m, 3H).［Ｍ−Ｎａ^＋］⁻に対するＭＳ（ＥＳＩ⁻）、計算値：７３５．３、観測値：７３５．５。

Ｎ−（６−（Ｎ−（３−（（４−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アミノ）−３−オキソプロピル）ヘキサンアミド）へキシル）ベンズアミド（４）

１（０．２７ｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）の無水メタノール（９ｍＬ）溶液に、氷浴で冷却した、０．５Ｍナトリウムメトキシドのメタノール（０．３ｍＬ、０．１５ｍｍｏｌ）溶液を滴下添加し、室温に温めた。２時間後、ギ酸（１０μＬ）を反応混合物に添加し、減圧下で濃縮乾固した。得られた残留したメタノール（１３．５ｍＬ）に、水（１．５ｍＬ）および活性炭担持１０％パラジウム（１２．５ｍｇ）を添加し、水素雰囲気下の室温で１６時間攪拌させておいた。すべての白色の残留物が完全に溶解するまで、水を反応混合物に滴下添加した。反応混合物を濾過し、濾液を氷浴上で冷却した。これに、ピリジン（０．１６ｍＬ）および続いて塩化アクリロイル（０．１６ｇ、１．７６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（４ｍＬ）溶液を滴下添加した。反応液を氷浴上で３０分間攪拌させておき、次いで室温に温め、２時間続行した。炭酸ナトリウム粉末（０．３ｇ）を反応混合物に添加し、１５分間攪拌させておき、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、高真空下でさらに乾燥した。残留物を２−プロパノール（６．３ｍＬ）と水（０．７ｍＬ）の混合物に溶解し、これに、Ｎ−（６−アミノへキシル）ベンズアミド（０．１７ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を添加し、６５℃で４０時間攪拌させておいた。反応混合物を室温に冷却し、メタノール（８ｍＬ）をこれに添加した。この混合物を氷浴上で冷却し、トリエチルアミン（０．２５ｍＬ）を添加した後、塩化ヘキサノイル（０．２４ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（４ｍＬ）溶液を滴下添加した。反応液を氷浴上で３０分間攪拌させておき、次いで室温に温め、１６時間続行した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン中１５％メタノールを溶出混合物として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィーによる精製にかけて、４（０．２３ｇ、５８％）を得た。¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.80 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.56 - 7.39 (m, 5H), 6.99 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 4.96 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 10.7, 8.4 Hz, 1H), 3.96 - 3.51 (m, 7H), 3.44 - 3.33 (m, 4H), 2.69 - 2.50 (m, 2H), 2.48 - 2.28 (m, 2H), 1.98 (s, 3H), 1.72 - 1.49 (m, 6H), 1.49 - 1.21 (m, 9H), 0.89 (dt, J = 8.7, 4.8 Hz, 3H).［Ｍ＋Ｈ］^＋に対するＭＳ（ＥＳＩ^＋）、計算値：６８５．４、観測値：６８５．５。

（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−５−アセトアミド−６−（４−（３−（Ｎ−（６−ベンズアミドへキシル）−ヘキサンアミド）プロパンアミド）フェノキシ）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチル硫酸ナトリウム（５）

化合物４（９９ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ）に、窒素下で、無水ピリジン（５ｍＬ）を添加した。この溶液に、三酸化硫黄ピリジン複合体（３４ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で５時間攪拌させておいた。メタノール（０．５ｍＬ）を添加することによって反応を失活し、３０分間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、水に再度溶解し、水−メタノール勾配系を使用した逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣ精製にかけて、３（３６ｍｇ、３２％）を得た。¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.81 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.59 - 7.35 (m, 5H), 7.00 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 4.93 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.32 - 4.10 (m, 3H), 4.03 - 3.90 (m, 2H), 3.83 - 3.60 (m, 3H), 3.44 - 3.33 (m, 4H), 2.61 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.49 - 2.29 (m, 2H), 1.98 (s, 3H), 1.72 - 1.49 (m, 6H), 1.48 - 1.22 (m, 9H), 0.98 - 0.81 (m, 3H).［Ｍ−Ｎａ^＋］⁻に対するＭＳ（ＥＳＩ⁻）、計算値：７６３．３、観測値：７６３．７。

例５
代表的なＭＰＳ−ＶＩ基質および酵素生成物の合成
この例において、代表的なＭＰＳ−ＶＩ基質および酵素生成物試薬の合成を記述する。ＭＰＳ−ＶＩ基質の合成の一般的なスキームを図３に示す。

ＭＰＳ−ＶＩ基質（ヘキサンアミド）
代表的なＭＰＳ−ＶＩ基質（ヘキサンアミド）の調製を以下に記述し、図４に例示する。

Ｎ−（５−（Ｎ−（３−（（４−ヒドロキシフェニル）アミノ）−３−オキソプロピル）ヘキサンアミド）ペンチル）−ベンズアミド（３）

Ｎ−（５−アミノペンチル）ベンズアミド（１８０ｍｇ、０．８７２ｍｍｏｌ）およびＮ−（４−ヒドロキシフェニル）アクリルアミド（１７１ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）をｉ−プロピルアルコール（７．８ｍＬ）および水（０．８７ｍＬ）に溶かした溶液を常時攪拌しながら２４時間、６５℃に加熱した。反応混合物を室温に冷却し、減圧下およびさらには高真空下で濃縮した。この未精製濃縮物に、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３．０ｍＬ）およびトリエチルアミン（２２０ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を添加し、完全に溶解した。この溶液を０℃に冷却し、塩化ヘキサノイル（２３４ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）を滴下添加し、室温に温め、２時間攪拌した。飽和重炭酸ナトリウム溶液を添加して反応を失活し、反応混合物をＤＣＭ／メタノール（４：１）で抽出した。有機層を水でさらに洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を減圧下で濃縮乾固し、メタノール（３．０ｍＬ）を添加し、再度溶解した。この溶液に、５％水性水酸化ナトリウム（３．０ｍＬ）を滴下添加し、室温で２時間攪拌した。反応液を、ｐＨ紙で示されるように１Ｎ ＨＣｌ溶液で酸性化し、ＤＣＭ／メタノール（４：１）で抽出した。有機層を減圧下で濃縮し、残留物をシリカカラムクロマトグラフィーにかけて、ＤＣＭ中５％メタノールで溶出して、３（１５１ｍｇ、３７％）を得た。¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 8.47 (s, 1H), 7.81 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.57 - 7.40 (m, 3H), 7.36 - 7.27 (m, 2H), 6.78 - 6.67 (m, 2H), 3.69 (dt, J = 18.7, 6.9 Hz, 2H), 3.46 - 3.33 (m, 4H), 2.60 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 2.47 - 2.29 (m, 2H), 1.63 (ddd, J = 11.6, 10.6, 5.7 Hz, 6H), 1.48 - 1.22 (m, 6H), 0.89 (td, J = 6.6, 2.6 Hz, 3H).［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対するＭＳ（ＥＳＩ^＋）、計算値：４９０．３、観測値：４９０．６。

Ｎ−（５−（Ｎ−（３−（（４−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アミノ）−３−オキソプロピル）ヘキサンアミド）ペンチル）ベンズアミド（４）

３（７３ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）および（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−クロロテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート（１１４ｍｇ、０．３１２ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（０．７ｍＬ）溶液に、炭酸セシウム（１５２ｍｇ、０．４６６ｍｍｏｌ）を添加し、室温で６時間攪拌させておいた。次いで、反応混合物を水とＤＣＭとの間で抽出し、有機層を水でさらに洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物を、ＤＣＭ中４％メタノールを溶離液として使用したフラッシュシリカカラムクロマトグラフィーによって精製し、過アセチル化中間体を得た。ＮＭＲ分光法は、過アセチル化中間体が、出発材料３と共に溶出したことを示した。この混合物は、さらに精製せずに、次の脱アセチル化工程に使用した。上記混合物の無水メタノール（５．０ｍＬ）溶液に、０℃で、０．５Ｍナトリウムメトキシドのメタノール（２００μＬ）溶液を滴下添加し、室温で２時間攪拌させておいた。ギ酸（１００μＬ）を添加することによって反応を失活し、セミ分取逆相ＨＰＬＣ精製（勾配水／メタノール系）にかけて、４（２３ｍｇ、２２％）を得た。¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.85 - 7.77 (m, 2H), 7.58 - 7.38 (m, 5H), 6.99 (dd, J = 9.1, 2.6 Hz, 2H), 4.96 (dd, J = 8.4, 1.3 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 10.7, 8.4 Hz, 1H), 3.90 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 3.84 - 3.60 (m, 6H), 3.38 (dd, J = 11.1, 6.8 Hz, 4H), 2.61 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.47 - 2.29 (m, 2H), 1.98 (s, 3H), 1.74 - 1.50 (m, 6H), 1.47 - 1.21 (m, 6H), 0.89 (td, J = 6.6, 3.3 Hz, 3H).［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対するＭＳ（ＥＳＩ^＋）、計算値：６９３．３、観測値：６９３．４。

（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−５−アセトアミド−６−（４−（３−（Ｎ−（５−ベンズアミドペンチル）−ヘキサンアミド）プロパンアミド）フェノキシ）−４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル硫酸ナトリウム（５）

冷却した（０℃）４（２２ｍｇ、３２．８μｍｏｌ）の無水ピリジン（０．５ｍＬ）溶液に、塩化ベンゾイル（７．７μＬ、６５．６μｍｏｌ）を添加した。室温で１時間後、溶液を０℃に再度冷却し、別の部分の塩化ベンゾイル（７．７μＬ、６５．６μｍｏｌ）を添加し、室温で２時間攪拌させておいた。メタノール（２００μＬ）を添加することによって反応を失活し、さらに３０分間攪拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭ中４％メタノールを溶離液として使用したフラッシュシリカカラムクロマトグラフィーによって精製した。所望の画分を減圧下、さらに高真空下で濃縮した。得られた残留物を無水ピリジン（１．０ｍＬ）に溶解し、これに三酸化硫黄ピリジン複合体（１７ｍｇ、１０９μｍｏｌ）を室温で添加した。得られた混合物を３時間、４５℃に加熱した後、メタノール（０．５ｍＬ）を添加し、さらに１０分間攪拌した。反応混合物を減圧下で、さらに高真空下で濃縮した。得られた残留物を無水メタノール（６．０ｍＬ）に再度溶解し、０℃に冷却した。この冷却した溶液に、０．５Ｍナトリウムメトキシドのメタノール（０．８ｍＬ）溶液を滴下添加し、１６時間攪拌させておいた。塩基性リン酸ナトリウム（１．０ｍＬ）の１Ｍ水溶液を添加することによって反応を失活し、セミ分取逆相ＨＰＬＣ精製（勾配水／メタノール系）にかけて、５（１２ｍｇ、４７％）を得た。¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.85 - 7.76 (m, 2H), 7.58 - 7.38 (m, 5H), 7.05 - 6.92 (m, 2H), 5.00 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 10.9, 8.4 Hz, 1H), 3.95 - 3.60 (m, 6H), 3.38 (dt, J = 11.2, 5.6 Hz, 4H), 2.62 (dd, J = 15.9, 6.9 Hz, 2H), 2.47 - 2.29 (m, 2H), 1.97 (s, 3H), 1.76 - 1.51 (m, 6H), 1.47 - 1.21 (m, 6H), 0.89 (td, J = 6.6, 3.4 Hz, 3H).［Ｍ−Ｎａ^＋］⁻に対するＭＳ（ＥＳＩ⁻）、計算値：７４９．３、観測値：７４９．５。

ＭＰＳ−ＶＩ基質（ペンタンアミド）。

代表的なＭＰＳ−ＶＩ基質（ペンタンアミド）の調製を以下に記述し、図４に例示する。

Ｎ−（５−（Ｎ−（３−（（４−ヒドロキシフェニル）アミノ）−３−オキソプロピル）ペンタンアミド）ペンチル）−ベンズアミド。

Ｎ−（５−アミノペンチル）ベンズアミド（２０７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）およびＮ−（４−ヒドロキシヘニル）アクリルアミド（１９７ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）をｉ−プロピルアルコール（９．０ｍＬ）および水（１．０ｍＬ）に溶かした溶液を常時攪拌しながら２４時間、６５℃に加熱した。反応混合物を室温に冷却し、減圧下およびさらには高真空下で濃縮した。この未精製濃縮物に、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３．０ｍＬ）およびトリエチルアミン（２５３ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）を添加し、完全に溶解した。この溶液を０℃に冷却し、塩化バレリル（２４１ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）を滴下添加し、室温に温め、２時間攪拌した。飽和重炭酸ナトリウム溶液を添加して反応を失活し、反応混合物をＤＣＭ／メタノール（４：１）で抽出した。有機層を水でさらに洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を減圧下で濃縮乾固し、メタノール（３．０ｍＬ）を添加し、再度溶解した。この溶液に、５％水性水酸化ナトリウム（３．０ｍＬ）を滴下添加し、室温で２時間攪拌した。反応液を１Ｎ ＨＣｌ溶液で酸性化し（ｐＨ紙で示される）、ＤＣＭ／メタノール（４：１）で抽出した。有機層を減圧下で濃縮し、残留物をシリカカラムクロマトグラフィーにかけて、ＤＣＭ中５％メタノールで溶出して、標題化合物（２０３ｍｇ、４５％）を得た。¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 8.45 (s, 1H), 7.83 - 7.78 (m, 2H), 7.56 - 7.40 (m, 3H), 7.34 - 7.26 (m, 2H), 6.76 - 6.68 (m, 2H), 3.69 (dt, J = 19.4, 6.9 Hz, 2H), 3.44 - 3.37 (m, 4H), 2.60 (dd, J = 14.7, 7.4 Hz, 2H), 2.47 - 2.30 (m, 2H), 1.75 - 1.49 (m, 6H), 1.47 - 1.26 (m, 4H), 0.91 (t, J = 7.3 Hz, 3H).［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対するＭＳ（ＥＳＩ^＋）、計算値：４７６．３、観測値：４７６．５。

Ｎ−（５−（Ｎ−（３−（（４−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アミノ）−３−オキソプロピル）ペンタンアミド）ペンチル）ベンズアミド。

Ｎ−（５−（Ｎ−（３−（（４−ヒドロキシフェニル）アミノ）−３−オキソプロピル）ペンタンアミド）ペンチル）−ベンズアミド（１４８ｍｇ、０．３２６ｍｍｏｌ）および（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−クロロテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート（２３９ｍｇ、０．６５３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（０．４ｍＬ）溶液に、テトラブチルアンモニウムハイドロゲンサルフェート（１１０ｍｇ、０．３２４ｍｍｏｌ）および２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．４ｍＬ）を添加し、室温で３時間攪拌させておいた。反応混合物に、別の部のジアセテート（９０ｍｇ、０．２４６ｍｍｏｌ）を添加し、さらに１３時間攪拌した。次いで、反応混合物を水とＤＣＭとの間で抽出し、有機層を水でさらに洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物を、ＤＣＭ中４％メタノールを溶離液として使用したフラッシュシリカカラムクロマトグラフィーによって精製し、過アセチル化中間体を得た。ＮＭＲ分光法は、過アセチル化中間体が、出発材料３と共に溶出したことを示した。この混合物は、さらに精製せずに、次の脱アセチル化工程に使用した。上記混合物の無水メタノール（５．０ｍＬ）溶液に、０℃で、０．５Ｍナトリウムメトキシドのメタノール（２００μＬ）溶液を滴下添加し、室温で２時間攪拌させておいた。ギ酸（１００μＬ）を添加することによって反応を失活し、セミ分取逆相ＨＰＬＣ精製（勾配水／メタノール系）にかけて、標題化合物（２９ｍｇ、１４％）を得た。¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.83 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.59 - 7.35 (m, 5H), 7.06 - 6.90 (m, 2H), 4.99 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.27 - 4.11 (m, 1H), 3.96 - 3.55 (m, 7H), 3.46 - 3.35 (m, 4H), 2.71 - 2.51 (m, 2H), 2.49 - 2.27 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 1.76 - 1.49 (m, 6H), 1.37 (dd, J = 14.6, 7.2 Hz, 4H), 0.93 (t, J = 7.2 Hz, 3H).［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対するＭ
Ｓ（ＥＳＩ^＋）、計算値：６７９．３、観測値：６７９．７。

（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−５−アセトアミド−６−（４−（３−（Ｎ−（５−ベンズアミドペンチル）−ペンタンアミド）プロパンアミド）フェノキシ）−４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル硫酸ナトリウム。

冷却した（０℃）、Ｎ−（５−（Ｎ−（３−（（４−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アミノ）−３−オキソプロピル）ペンタンアミド）ペンチル）ベンズアミド（２５ｍｇ、３８．１μｍｏｌ）の無水ピリジン（０．５ｍＬ）溶液に、塩化ベンゾイル（４．９μＬ、４１．９μｍｏｌ）を添加した。室温で１時間後、溶液を再度０℃に冷却し、別の部の塩化ベンゾイル（９．４μＬ、８０．４μｍｏｌ）を添加し、室温で２時間攪拌させておいた。反応液を、１Ｍ ＨＣｌ溶液とクロロホルムとの間で抽出した。クロロホルム層を、水とブライン溶液（１：１）の混合物でさらに洗浄した。有機層を濃縮し、ＤＣＭ中５％メタノールを溶離液として使用したフラッシュシリカカラムクロマトグラフィーによって精製した。所望の画分を減圧下、さらに高真空下で濃縮した。得られた残留物を無水ピリジンに溶解し、これに三酸化硫黄ピリジン複合体（８．３ｍｇ、５２．１μｍｏｌ）を室温で添加した。得られた混合物を３時間、４５℃に加熱した後、メタノール（０．５ｍＬ）を添加し、さらに１０分間攪拌した。反応混合物を減圧下で、さらに高真空下で濃縮した。得られた残留物を無水メタノール（５．０ｍＬ）に再度溶解し、０℃に冷却した。この冷却した溶液に、０．５Ｍナトリウムメトキシドのメタノール（０．５ｍＬ）溶液を滴下添加し、１６時間攪拌させておいた。塩基性リン酸ナトリウム（１．０ｍＬ）の１Ｍ水溶液を添加することによって反応を失活し、セミ分取逆相ＨＰＬＣ精製（勾配水／メタノール系）にかけて、標題化合物（５．８ｍｇ、２０％）を得た。¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.80 (dd, J = 7.0, 1.2 Hz, 2H), 7.58 - 7.38 (m, 5H), 7.03 - 6.94 (m, 2H), 5.01 (dd, J = 8.4, 1.1 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 10.9, 8.4 Hz, 1H), 3.95 - 3.61 (m, 6H), 3.45 - 3.34 (m, 4H), 2.61 (dd, J = 16.1, 7.0 Hz, 2H), 2.47 - 2.31 (m, 2H), 1.97 (s, 3H), 1.73 - 1.49 (m, 6H), 1.43 - 1.23 (m, 5H), 0.91 (td, J = 7.3, 2.2 Hz, 3H).［Ｍ−Ｎａ^＋］⁻に対するＭＳ（ＥＳＩ⁻）、計算値：７３５．３、観測値：７３５．４。

ＭＰＳ−ＶＩ生成物

代表的なＭＰＳ−ＶＩ生成物の調製を以下に記述し、図５に例示する。

（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｓ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−（４−ニトロフェノキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイル二酢酸（１）

ピリジン（６０ｍＬ）を、Ｄ−ガラクトサミン塩酸塩（５ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）を含有する窒素逆流置換フラスコに添加し、得られたスラリーを氷浴上で冷却した。冷却した混合物に、無水酢酸（２５ｇ、２４５ｍｍｏｌ）を滴下添加し、室温に温めた後、この温度で１６時間攪拌した。メタノール（１５ｍＬ）を添加して反応混合物を失活させ、２０分間攪拌させておいた。得られた混合物を減圧下で濃縮し、混合物を温めて、残留物を２０％メタノールのクロロホルムに溶解した。この溶液を１Ｎ ＨＣｌ溶液、続いてブライン溶液で洗浄した。生成した有機層を、無水硫酸ナトリウムを使用して乾燥し、減圧下で濃縮した。残留物を、滴下漏斗を備えた窒素逆流置換フラスコに取った。無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）をこの残留物に添加し、得られたスラリーを氷浴上で冷却した。滴下漏斗において、塩化チタン（６．５ｇ、４２．１ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を、冷却した溶液に滴下添加した。反応混合物を油浴中で５０℃に温め、この温度で４８時間攪拌させておいた。反応混合物を氷浴上で再度冷却し、飽和重炭酸ナトリウム溶液を激しく振盪しながら滴下添加した。得られた混合物をジクロロメタンと飽和重炭酸ナトリウム溶液との間で抽出した。無水硫酸ナトリウムを使用して有機層を乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた残留物をアセトン（６０ｍＬ）に溶解し、４−ニトロフェノール（１６．１ｇ、１１６ｍｍｏｌ）のアセトン（１３０ｍＬ）溶液および４Ｎ ＫＯＨ水溶液（２３．２ｍＬ）にゆっくり添加した。反応液を室温で４８時間攪拌させておき、減圧下で２０ｍＬ未満に濃縮した。この溶液を、１Ｎ ＮａＯＨとクロロホルムとの間で抽出した。無水硫酸ナトリウムを使用して有機層を乾燥し、減圧下で濃縮した。こうして得られた粗生成物を、ジクロロメタン中３％メタノールを溶出混合物として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ＴＬＣで決定された所望の化合物を含む画分を合わせ、減圧下で濃縮して１（３．２９ｇ、３０％）を得た。¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.20 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 5.61 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.56 - 5.39 (m, 3H), 4.32 - 4.07 (m, 4H), 2.18 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.97 (s, 3H).［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対するＭＳ（ＥＳＩ^＋）、計算値：４９１．１、観測値：４９１．２。

Ｎ−（５−（Ｎ−（３−（（４−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アセトアミド−４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アミノ）−３−オキソプロピル）ペンタンアミド）ペンチル）ベンズアミド（２）

１（３．５ｇ、７．４７ｍｍｏｌ）の無水メタノール（９０ｍＬ）溶液に、氷浴上で冷却した、０．５Ｍナトリウムメトキシドのメタノール（３ｍＬ、１．５０ｍｍｏｌ）溶液を滴下添加し、室温に温めた。２時間後、ギ酸（０．１ｍＬ）を反応混合物に添加し、減圧下で濃縮乾固した。得られた残留したメタノール（１３５ｍＬ）に、水（１５ｍＬ）および活性炭担持１０％パラジウム（１２５ｍｇ）を添加し、水素雰囲気下の室温で１６時間攪拌させておいた。すべての白色の残留物が完全に溶解するまで、水を反応混合物に滴下添加した。反応混合物を濾過し、濾液を氷浴上で冷却した。これに、ピリジン（２ｍＬ）および続いて塩化アクリロイル（２．１ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液を滴下添加した。反応液を氷浴上で３０分間攪拌させておき、次いで室温に温め、２時間続行した。炭酸ナトリウム粉末（３．０ｇ）を反応混合物に添加し、１５分間攪拌させておき、濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、高真空下でさらに乾燥した。残留物を２−プロパノール（５０ｍＬ）と水（６．６ｍＬ）の混合物に溶解し、これに、Ｎ−（５−アミノペンチル）ベンズアミド（２．０ｇ、９．６９ｍｍｏｌ）を添加し、６５℃で４０時間攪拌させておいた。反応混合物を室温に冷却し、メタノール（２５ｍＬ）をこれに添加した。この混合物を氷浴上で冷却し、トリエチルアミン（２．５ｍＬ）を添加した後、塩化ペンタノイル（２．７ｇ、２２．４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液を滴下添加した。反応液を氷浴上で３０分間攪拌させておき、次いで室温に温め、１６時間続行した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン中１５％メタノールを溶出混合物として使用したシリカフラッシュクロマトグラフィーによる精製にかけて、２（２．９６ｇ、６０％）を得た。¹H NMR (300 MHz, MeOD) δ 7.84 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.59 - 7.35 (m, 5H), 7.09 - 6.91 (m, 2H), 5.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.28 - 4.09 (m, 1H), 3.97 - 3.55 (m, 7H), 3.46 - 3.24 (m, 4H), 2.72 - 2.51 (m, 2H), 2.49 - 2.28 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 2.02 (s, 3H), 1.78 - 1.49 (m, 6H), 1.49 -1.22 (m, 4H), 0.94 (t, J = 7.1 Hz, 3H).［Ｍ＋Ｈ］^＋に対するＭＳ（ＥＳＩ^＋）、計算値：６５７．３、観測値：６５７．５。

例６
ＭＰＳ−ＶＩ試薬を使用する代表的アッセイ
この例において、本発明のＭＰＳ−ＶＩ試薬を使用する代表的なアッセイを記述する。これらの試薬の結果を、他のＭＰＳ−ＶＩ試薬と比較する。

本来のＭＳＰ−ＶＩ反応を以下に示す（Duffey,T.A., Sadilek,M., Scott,C.R., Turecek,F., Gelb,M.H. (2010) "Tandem mass spectrometry for the direct assay of lysosomal enzymes in dried blood spots: Application to screening newborns for Mucopolysaccharidosis VI (Maroteaux-Lamy Syndrome)" Anal. Chem., 82: 9587-9591）。Ｓ、ＰおよびＩＳはＢＯＣ基を有し、ＰおよびＩＳが化学的に同一ではない（Ｐは結合中に６つのＣＨ２基を有し、一方でＩＳは５つ有する）ことに留意されたい。

代替のＭＰＳ−ＶＩ反応を以下に示す：

Ｎ−ペンタノイル基を有するが、ＢＯＣカルバメート基を有さない異なるアグリコンに留意されたい。また、内部標準は生成物と化学的に同一であるが、ベンゾイル基中に５つの重水素を有することも留意されたい。

ＭＰＳ−ＶＩ原基質および代替基質を以下の酵素的アッセイで対照比較した：１ｍＭ基質、３０ｕＬの緩衝液中の１０ｕＭ内部標準（１００ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ４．０、７．５ｍＭ酢酸バリウム（ＩＩ）、５．０ｍＭ酢酸セリウム（ＩＩＩ））。パンチ３ｍｍの乾燥血液スポットを添加し、混合物を３７℃で１６時間、振盪させながらインキュベートした。ＤＥＡＥセルロース（Whatmann DE52）（１００ｕＬ）の水性懸濁液（１：１）を添加し、続いて４００ｕＬの酢酸エチルを添加することによって、反応を失活した。混合物を上下に数回ピペット操作することによって混合し、次いで遠心分離（３０００ｒｐｍで１０分）にかけて液層を分離し、ＤＥ５２をペレット化した。３００ｕＬの部の酢酸エチル上層を新しいウェルに移し、油を含有しない気流による蒸発で溶媒を除去した。残留物を１００ｕＬのメタノール／５ｍＭ水性ギ酸アンモニウム（８０／２０、ｖ／ｖ）に取り込み、タンデム質量分析計に注入した。乾燥血液スポット中に存在する遊離サルフェートおよびホスフェートを析出するためにバリウム塩およびセリウム塩を提供するが、これは、これらの陰イオンが、ＭＰＳ−ＶＩ酵素の生成阻害を生じるからである。ＤＥ５２を添加して残留する基質を捕捉し、したがって生成物および内部標準（電荷中性）のみが酢酸エチルに抽出される。ブランクアッセイも実施し、パンチ３ｍｍの血液非含有濾紙が乾燥血液スポットと置きかわる。上記のようにブランクをインキュベートし、処理する。

^１酵素活性は、血液１リットル当たり、１時間当たりに形成された生成物のｕｍｏｌｅとして表す。

^２変動係数（ＣＶ）は、同乾燥血液スポットから異なるパンチでそれぞれ実施した６回のアッセイに基づく。

^３ＭＳＭＳ応答は、検体のｐｍｏｌｅ当たりのタンデム質量分析チャンネルにおいて測定されたイオン計数の量である。

^４血液−無血液のアッセイ比は、乾燥血液スポットのパンチを用いるアッセイにおいて測定された酵素活性と、血液非含有パンチで測定された酵素活性との比である。

どちらのＭＰＳ−ＶＩ基質もＭＰＳ−ＶＩ酵素（血液１リットル当たり、１時間当たりに生成された生成物ｕｍｏｌｅ）に対し同様の作用を示すが、代替基質が、ＭＳＭＳ検出において約１０倍高感度な生成物（検体１ｐｍｏｌｅ当たりに検出されたイオン計数）を誘発することが上記の表から分かる。血液−無血液検査の応答における改善は、恐らく、新規の基質が生成物非含有形態で生成されやすいため、ＭＰＳ−ＶＩ代替基質中の不純物であるより少量の生成物に起因するものである。

例７
ＭＰＳ−ＩＩについての代表的なスルファターゼアッセイ
この例において、本発明の代表的なアッセイ（ハンター症候群（ＭＰＳ−ＩＩ）に欠いた酵素である、イズロン酸２−スルファターゼについてのアッセイ）を記述する。

反応における第１の工程は上に記述の通りである（ＷＯ２００９／０２６２５２（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７３５１６）、ＷＯ２０１０／０８１１６３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２０８０１）、ＷＯ２０１２／０２７６１２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４９２２４）、およびＷＯ２０１３／０７０９５３（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６４２０５）も参照）。

アッセイにおいて、第２の酵素である、α−Ｌ−イズロニダーゼ（グリコヒドロラーゼ）をアッセイ用カクテルに添加し、これにより、イズロン酸残基が除去され、アグリコンを残すことによって、初期ＭＰＳ−ＩＩ生成物が最終ＭＰＳ−ＩＩ生成物に変換する。イズロニダーゼは、乾燥血液スポットを使ってインキュベートされるアッセイ用カクテル中に存在していてもよい、または乾燥血液スポットを使った第１のインキュベーションに後続する第２のインキュベーション期間の後に、これを加えてもよい。添加するイズロニダーゼの量は、すべての初期ＭＰＳ−ＩＩ生成物を最終ＭＰＳ−ＩＩ生成物に変換するために十分である。アッセイ用カクテルは、イズロニダーゼによって最終ＭＰＳ−ＩＩ内部標準に変換される、初期ＭＰＳ−ＩＩ内部標準（初期ＭＰＳ−ＩＩ生成物と同一であるが、たとえば、ベンゾイル基に５つの重水素を有する）も含有する。最終ＭＰＳ−ＩＩ生成物と最終ＭＰＳ−ＩＩ内部標準はどちらも、タンデム質量分析法によって検出され、最終ＭＰＳ−ＩＩ生成物の量を定量化することができる。典型的には、反応混合物を有機溶媒で抽出し、最終ＭＰＳ−ＩＩ内部標準と最終ＭＰＳ−ＩＩ生成物を、比較的塩を含まない形態の有機溶媒相に分割させる。有機溶媒は、蒸発によって除去し、残留物を溶媒に溶解し、溶媒をタンデム質量分析計に注入する。検体を、多重式反応モニタリングによって検出する。

第２の酵素（すなわち、グリコヒドロラーゼ）を含まないアッセイを用い、また新生児スクリーニングカードからのパンチ３ｍｍの乾燥血液スポットを使用して、１２〜１８時間のインキュベーション時間の後、典型的には10,000〜30,000のイオン計数が初期ＭＰＳ−ＩＩ生成物に観察される。イズロニダーゼを用いた本発明のアッセイを用いて、典型的には1,000,000〜5,000,000のイオン計数が最終ＭＰＳ−ＩＩ生成物に観察される。したがって、アッセイの感度は、約１００倍改善された。本発明の方法の第２の利点は、先行するアッセイにおいて、質量分析計エレクトロスプレーイオン化源に入る残留するＭＰＳ−ＩＩ基質は、源における加熱によって、ある程度の脱硫酸化を経る。これは、イズロン酸２−スルファターゼの作用と無関係である生成物シグナルを高めることによってアッセイバックグランドを高める。本発明のアッセイによって、検出された生成物がアグリコン（最終ＭＰＳ−ＩＩ生成物）であることから、この脱硫酸化は関係がない。

使用されるイズロニダーゼは、哺乳類の細胞において過剰発現することによって得られたヒト酵素である。ＭＰＳ−ＩＩ基質に作用しない限り、いずれのイズロニダーゼも使用できる（すなわち、イズロン酸からサルフェートが除去された後のみ、グリコシド結合を切断する）。

例８
ＭＰＳ−ＶＩについての代表的なスルファターゼアッセイ
ＭＰＳ−ＶＩについての代表的なアッセイにおいて使用する好適な第２の酵素は、細菌Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼであり、ＭＰＳ−ＶＩ酵素が糖の４位からサルフェートを除去した後、そのアグリコンからＮ−アセチルガラクトサミンを放出するために使用する。これによりアッセイ感度が約２０倍改善する。その他の好適な酵素として、細菌Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼが挙げられる。

例９
ＭＰＳ−ＩＶＡについての代表的なスルファターゼアッセイ
ＭＰＳ−ＩＶＡについての代表的なアッセイにおいて使用する好適な第２の酵素は、アスペルギルス種由来のβ−ガラクトシダーゼであり、ＭＰＳ−ＩＶＡ酵素が糖の６位からサルフェートを除去した後、そのアグリコンからガラクトースを放出するために使用する。これによりアッセイ感度が約２０倍改善する。アスペルギルス酵素は、ＭＰＳ−ＩＶＡアッセイのｐＨであるｐＨ４〜５で高活性を保持するため、たとえば、大腸菌（E.coli）酵素を好ましくは上回る。あるいは、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン−６−サルフェートを有するＭＰＳ−ＩＶＡ基質を使用してもよく、ＭＰＳ−ＶＩアッセイ（上記参照）において使用されるものと同じ酵素によって初期ＭＰＳ−ＩＶ生成物が作用されてアグリコンを生成する。

例１０
ＭＰＳ−ＩＩＩＡについての代表的なスルファターゼアッセイ
ＭＰＳ−ＩＩＩＡについての代表的なアッセイにおいて使用する好適な第２の酵素は、パン酵母由来の酵母α−グルコシダーゼであり、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ酵素が、グルコサミン−Ｎ−サルフェートのアミノ基からサルフェートを除去した後、そのアグリコンからグルコサミンを放出するために使用する。あるいは、ＭＰＳ−ＩＩＩＡ酵素がサルフェートを除去した後、アセチル−ＣｏＡ：グルコサミンＮ−アセチルトランスフェラーゼを使用して遊離アミノ基をアセチル化することができる。哺乳類と細菌両方のアセチルトランスフェラーゼを使用することができる。

例１１
ＭＰＳ−ＩＶＡについての代表的なアッセイ
この例において、ＭＰＳ−ＩＶＡについての代表的なアッセイを、６位で硫酸化されない場合にβグリコシドをＮ−アセチル−ガラクトサミンに開裂させる、細菌酵素のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（β−ＮＧＡ）と、ＧＡＬＮＳ基質に対するヒトヘキソサミニダーゼＡを遮断する、ヒトヘキソサミニダーゼＡの阻害剤である（Ｚ）−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）−アミノＮ−フェニルカルバメート（Ｚ−ＰＵＧ−ＮＡｃ）とを使用して記述する。

本アッセイにおいて使用するＧＡＬＮＳ基質は、次の構造を有する：

本アッセイにおいて使用するＧＡＬＮＳ内部標準は、次の構造を有する：

実験１

７．５ｍＭ酢酸バリウム、５．０ｍＭ酢酸セリウム、１ｍＭ Ｚ−ＰＵＧ−ＮＡｃ、および０．０１ｍｇの細菌β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを含有するｐＨ４．０の５０ｍＭギ酸アンモニウム中の１ｍＭ ＧＡＬＮＳ基質からなるアッセイ用カクテル０．０３ｍＬを使って、基質無作為の新生児に由来するパンチ３ｍｍの乾燥血液スポットをインキュベートする。混合物は、０．００５ｍＭ内部標準も含有する。３７℃で振盪しながら１６時間経った後、０．１２ｍＬのアセトニトリルで混合物を失活させ、サンプルプレートを遠心分離にかけて沈降物をペレット化する。上澄み（０．１２ｍＬ）を新しいプレートに移し、０．１２ｍＬの水を添加する。プレートを、ＵＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ機器（Waters Acquity UHPLC系を備えたWaters Xevo TQ MS/MS）のオートサンプラ上に置く。一部のサンプル（０．０１ｍＬ）を注入し、ＧＡＬＮＳ生成物（基質からサルフェートを引いたもの）、内部標準、およびＧＡＬＮＳ生成物および内部標準に由来するアグリコンを、多重式反応モニタリング（ＭＳ／ＭＳ）によって定量化する。添加した内部標準、たとえばＧＡＬＮＳ生成物は、細菌β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼの添加によって、そのアグリコンに変換されることに留意されたい。上記の表１は、各検体についてのＭＳ／ＭＳイオンピーク面積を示す。

実験１は、血液含有パンチ、ＧＡＬＮＳ基質、内部標準、１ｍＭ Ｚ−ＰＵＧ−ＮＡｃ、および０．０１ｍｇのβ−ＮＧＡをアッセイ緩衝液中で用いた完全アッセイの結果を示す。イオンピーク面積411,000のアグリコンシグナルは、初期に形成されたＧＡＬＮＳ生成物のシグナルよりもかなり高く、β−ＮＧＡがほとんどの生成物をアグリコンに変換することを示す。また、実験１は、ほとんどの内部標準がアグリコンに変換されることも示す。アグリコンおよび内部標準アグリコンの量を使用して、ＧＡＬＮＳ酵素活性の量を決定する。

実験２

実験２は、実験１と同じであるが、パンチした濾紙（血液なし）を使用する。ほとんどの内部標準はアグリコンに変換され、添加したβ−ＮＧＡが作用していることを示す。アグリコンの量は僅か42,000であり、血液の存在下でみられる場合よりも約１０倍少ない。この高い血液と無血液の比率は、ＧＡＬＮＳアッセイが作用していることを示す。さらに、確定されたモルキオＡ患者由来の乾燥血液スポットを使用する場合、アグリコンの量は、無血液でみられる量（45,000）と同様であり、アッセイ試料が作用して、非罹患個人の血液に存在するＧＡＬＮＳのみが検出されることを示す。

実験３

実験３は、完全アッセイであるが、β−ＮＧＡを含まないアッセイを示す。予想した通り、ほとんどの内部標準はそのアグリコンに変換されないが、それは、β−ＮＡＧがなく、血液由来のヘキソサミニダーゼＡがＺ−ＰＵＧ−ＮＡｃによってすべて遮断されるためである。ＧＡＬＮＳ生成物の量は121,000であり、アグリコンの量は42,900である。

実験４

実験４は、実験３と同じであるが、血液を用いない。実験４は、ＧＡＬＮＳ生成物に対し僅か753しか示さない。したがって、実験３における生成物の計数121,000のほとんどは、ＧＡＬＮＳによるものである。β−ＮＧＡのみがアグリコンを産生するので、実験３の生成物の計数がヘキソサミニダーゼＡに起因することはあり得ない。実験３および４におけるアグリコンの量は類似しており、これは、ＧＡＬＮＳ基質中に不純物として存在するアグリコンを表す。

実験１〜４は、ＧＡＬＮＳ生成物をそのアグリコンに変換する利点をも示し、血液およびβ−ＮＧＡの存在下でアグリコンシグナルは411,000であり、これを、β−ＮＧＡによってそのアグリコンに変換されなかった場合の僅か121,000のＧＡＬＮＳ生成物と比較する。したがって、ＧＡＬＮＳアッセイ感度に４倍の向上が得られる。

実験５

実験５は、完全アッセイであるが、ヘキソサミニダーゼＡ阻害剤のＺ−ＰＵＧ−ＮＡｃを欠くアッセイを示す。β−ＮＧＡが存在するため、ほとんどの内部標準は、予想通り、そのアグリコンに変換される。アグリコンのシグナルは1,350,000であり、実験１よりもかなり高い。これは、ヘキソサミニダーゼＡが、阻害されない場合、ＧＡＬＮＳ基質から実質的な量のアグリコンを産生することを示す。

実験６。

実験６は、血液を含有するが、β−ＮＧＡおよびＺ−ＰＵＧ−ＮＡｃは含まない。ＧＡＬＮＳ生成物の量は、実験５の25,100とは異なり、110,000であり、ＧＡＬＮＳのＧＡＬＮＳ基質に対する作用に起因する。β−ＮＧＡが不在なので、ごく少量のＧＡＬＮＳ生成物のみがアグリコンに変換されるが、アグリコンの量は1,110,000で高いままである。これは、Ｚ−ＰＵＧ−ＮＡｃの不在下で、血液中のヘキソサミニダーゼＡがＧＡＬＮＳ基質に作用するためである。

実験７および８

実験７および８は、濾紙（血液なし）を用いる。実験７はβ−ＮＧＡを含むが、実験８はβ−ＮＧＡを含まない。予想通り、実験７では、ほとんどの内部標準がアグリコンに変換されるが、実験８では変換されない。実験８は、ＧＡＬＮＳ基質が、不純物として少量の生成物（820）およびアグリコン（14,500）を含有することを示す。これらは、ＧＡＬＮＳ基質のさらなる一連の精製によって除去できる。

表１の結果は、乾燥血液スポット中に内生的に存在する非阻害ヒトヘキソサミニダーゼＡの作用が、ＧＡＬＮＳ基質から過剰のアグリコンを産生し、ヘキソサミニダーゼＡ阻害剤の不在下で有用なＧＡＬＮＳアッセイをもたらすことを明確に示す。このデータは、β−ＮＧＡが所望の特性、すなわち、これが、ヘキソサミニダーゼＡを完全に遮断するために十分なヘキソサミニダーゼＡ阻害剤Ｚ−ＰＵＧ−ＮＡｃの存在下であっても、ほとんどのＧＡＬＮＳ生成物および内部標準をこれらのアグリコンに変換する特性を有することをも明確に示す。

本発明の好ましい態様を例示し、記述してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更をここで施すことが可能であることを理解されたい。

独占的な所有権または実施権が主張される本発明の態様は、以下の通りに定義される。

独占的な所有権または実施権が主張される本発明の態様は、以下の通りに定義される。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］ リソソーム蓄積症と関係している酵素についてアッセイする方法であって、
（ａ）サンプルを第１の溶液と接触させて、１種以上のリソソーム酵素を含む溶液を生成することと、
（ｂ）溶液中の前記１種以上のリソソーム酵素を、分析しようとする各リソソーム酵素の酵素基質と接触させ、前記サンプル中に存在する各リソソーム酵素の酵素生成物を含む溶液を生成するのに十分な時間をかけて前記基質を前記酵素と一緒にインキュベートすることと、
ここで各リソソーム酵素の前記酵素基質が、炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式：

［式中、Ｓは、アグリコン部分に共有結合するときに、
（ｉ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
（ｉｉ）イズロン酸２−スルファターゼ、
（ｉｉｉ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
（ｉｖ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
（ｖ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、
（ｖｉ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、および
（ｖｉｉ）β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
Ｌ _２ は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ _１ 〜Ｃ _６ アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｌ _３ は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ _１ 〜Ｃ _６ アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｌ _４ は、任意であり、存在する場合、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ _１ 〜Ｃ _６ アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｒ _１ は、Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ アルキル基またはＣ _１ 〜Ｃ _１０ アルコキシ基であり、
Ｒ _２ は、それぞれの出現において、Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ アルキル基、Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、または−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（式中、ＲはＣ _１ 〜Ｃ _８ アルキル基である）から独立に選択され、
Ｒ _３ は、Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ アルキル基または置換もしくは無置換のＣ _６ 〜Ｃ _１０ アリール基であり、
ｎは、０、１、２、３または４である］
を有する化合物であり、
（ｃ）１種以上の前記酵素生成物の量を決定することと
を含む、方法。
［２］ 前記酵素生成物をグリコヒドロラーゼと接触させて、第２の酵素生成物を生成することをさらに含む、［１］に記載の方法。
［３］ （ａ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、および
（ｂ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ
からなる群から選択される１種以上の酵素の基質に作用する内因性グリコヒドロラーゼ酵素活性を遮断するために阻害剤を添加することをさらに含む、［１］に記載の方法。
［４］ １種以上のリソソーム酵素の酵素活性をアッセイする方法であって、
（ａ）サンプルを第１の溶液と接触させて、１種以上のリソソーム酵素を含む溶液を生成することと、
（ｂ）溶液中の前記１種以上のリソソーム酵素を、分析しようとする各リソソーム酵素の酵素基質と接触させ、前記サンプル中に存在する各リソソーム酵素の第１の酵素生成物を含む溶液を生成するのに十分な時間をかけて前記基質を前記酵素と一緒にインキュベートすることと、
（ｃ）前記第１の酵素生成物をグリコヒドロラーゼに供して、グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けやすい各第１の酵素生成物の第２の酵素生成物を生成することと、
（ｄ）１種以上の前記第１の酵素生成物および／または１種以上の前記第２の酵素生成物の量を決定することとを含む、方法。
［５］ 前記グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けやすい前記第１の酵素生成物が、
（ａ）イズロン酸２−スルファターゼ、
（ｂ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
（ｃ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、および
（ｄ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、
からなる群から選択される酵素の作用によって生成される、［４］に記載の方法。
［６］ 前記グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けにくい前記第１の酵素生成物が、
（ａ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
（ｂ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、および
（ｃ）β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の作用によって生成される、［４］に記載の方法。
［７］ （ａ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、および
（ｂ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ
からなる群から選択される１種以上の酵素の基質に作用する内因性グリコヒドロラーゼ酵素活性を遮断するために阻害剤を添加することをさらに含み、前記阻害剤が、工程（ｃ）の前記グリコヒドロラーゼの作用を有意に阻害しない、［４］に記載の方法。
［８］ 前記１種以上のリソソーム酵素が、
（ａ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
（ｂ）イズロン酸２−スルファターゼ、
（ｃ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
（ｄ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
（ｅ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、
（ｆ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、および
（ｇ）β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素を含む、［１］または［４］に記載の方法。
［９］ 前記リソソーム酵素を前記基質と接触させる前、後、または同時に、分析しようとする各リソソーム酵素の内部標準を添加することをさらに含む、［１］または［４］に記載の方法。
［１０］ １種以上の前記酵素生成物の量を決定する前に酵素反応を失活させることをさらに含む、［１］または［４］に記載の方法。
［１１］ 前記サンプルが、血液または組織サンプルである、［１］または［４］に記載の方法。
［１２］ 前記サンプルが、乾燥血液スポットである、［１］または［４］に記載の方法。
［１３］ 前記グリコヒドロラーゼが、ヒトヘキソサミニダーゼＡ、細菌性Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、細菌性β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ（アスペルギルス）、およびα−グルコシダーゼ（酵母）からなる群から選択される、［２］または［４］に記載の方法。
［１４］ 前記阻害剤が、（Ｚ）−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）−アミノＮ−フェニルカルバメート、１−デオキシノジリマイシン、カスタノスペルミン、スウェインソニン、カリステギンＢ _２ 、イソファガミン、タミフル、グルコノヒドロキシモラクトン、グルクロン酸ならびにそのラクトンおよびラクタム、リレンザ、ミグリトール、フェネチル置換グルコ−およびガラクト−イミダゾール、Ｎ−ヒドロキシエチルデヒドロノジリマイシン、ＧａｌＮＡｃチアゾリン、ならびにＧｌｃＮＡｃチアゾリンからなる群から選択される、［３］または［７］に記載の方法。
［１５］ 前記酵素生成物の量を決定することが、質量分光分析を含む、［１］または［４］に記載の方法。
［１６］ 前記酵素生成物の量を決定することが、質量分光分析によって各生成物とその内部標準との比を決定することを含む、［１］または［４］に記載の方法。
［１７］ 前記酵素生成物の量を決定することが、生成物の親イオンおよびこれらの内部標準を生成し、単離し、衝突誘起解離を受けて、生成物断片イオンおよび内部標準断片イオンを生成する、タンデム質量分光分析を含む、［１］または［４］に記載の方法。
［１８］ 前記酵素生成物の量を決定することが、生成物断片イオンおよび内部標準断片イオンのピーク強度を比較して生成物の量を計算することを含む、［１］または［４］に記載の方法。
［１９］ 前記酵素生成物の量を決定することが、液体クロマトグラフィーまたはフローインジェクションによって生成物を質量分析計に導くことを含む、［１］または［４］に記載の方法。
［２０］ 前記酵素生成物の量を決定することが、蛍光分析を含む、［１］または［４］に記載の方法。
［２１］ 前記酵素生成物の量を用いて、前記サンプルが、１種以上のリソソーム酵素欠損症と関係している病状を治療するための候補に由来しているかどうかを決定することをさらに含む、［１］または［４］に記載の方法。
［２２］ 前記基質が、炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式：

［式中、
Ｓは、アグリコン部分に共有結合するときに、
（ａ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
（ｂ）イズロン酸２−スルファターゼ、
（ｃ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
（ｄ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
（ｅ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、
（ｆ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、および
（ｇ）β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
Ｌ _２ は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ _１ 〜Ｃ _６ アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｌ _３ は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ _１ 〜Ｃ _６ アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｌ _４ は、任意であり、存在する場合、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ _１ 〜Ｃ _６ アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｒ _１ は、Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ アルキル基またはＣ _１ 〜Ｃ _１０ アルコキシ基であり、
Ｒ _２ は、それぞれの出現において、Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ アルキル基、Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、または−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（式中、ＲはＣ _１ 〜Ｃ _８ アルキル基である）から独立に選択され、
Ｒ _３ は、Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ アルキル基または置換もしくは無置換のＣ _６ 〜Ｃ _１０ アリール基であり、
ｎは、０、１、２、３または４である］
を有する、［４］に記載の方法。
［２３］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［２４］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［２５］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［２６］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［２７］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［２８］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［２９］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［３０］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［３１］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［３２］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［３３］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［３４］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［３５］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［３６］ 前記基質が、次式：

を有する、［１］または［２２］に記載の方法。
［３７］ 炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式：

［式中、Ｓは、アグリコン部分に共有結合するときに、
（ａ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
（ｂ）イズロン酸２−スルファターゼ、
（ｃ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
（ｄ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
（ｅ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、
（ｆ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、および
（ｇ）β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
Ｌ _２ は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ _１ 〜Ｃ _６ アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｌ _３ は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ _１ 〜Ｃ _６ アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｌ _４ は、任意であり、存在する場合、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ _１ 〜Ｃ _６ アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
Ｒ _１ は、Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ アルキル基またはＣ _１ 〜Ｃ _１０ アルコキシ基であり、
Ｒ _２ は、それぞれの出現において、Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ アルキル基、Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、または−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（式中、ＲはＣ _１ 〜Ｃ _８ アルキル基である）から独立に選択され、
Ｒ _３ は、Ｃ _１ 〜Ｃ _１０ アルキル基または置換もしくは無置換のＣ _６ 〜Ｃ _１０ アリール基であり、
ｎは、０、１、２、３または４である
を有する、化合物。
［３８］ Ｌ _２ が、−（ＣＨ _２ ） _ｎ −（式中、ｎは１〜６である）である、［３７］に記載の化合物。
［３９］ Ｌ _３ が、−（ＣＨ _２ ） _ｍ −（式中、ｍは１〜１２である）である、［３７］に記載の化合物。
［４０］ Ｌ _４ が、−（ＣＨ _２ ） _ｎ −（式中、ｎは１〜６である）である、［３７］に記載の化合物。
［４１］ Ｌ _４ が存在しない、［３７］に記載の化合物。
［４２］ Ｒ _１ が、Ｃ _１ 〜Ｃ _５ アルキルである、［３７］に記載の化合物。
［４３］ Ｒ _２ が、Ｃ _１ 〜Ｃ _８ アルキルである、［３７］に記載の化合物。
［４４］ Ｒ _３ が、Ｃ _１ 〜Ｃ _６ アルキルである、［３７］に記載の化合物。
［４５］ Ｒ _３ がフェニルである、［３７］に記載の化合物。
［４６］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［４７］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［４８］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［４９］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［５０］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［５１］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［５２］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［５３］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［５４］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［５５］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［５６］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［５７］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［５８］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［５９］ 次式：

を有する、［３７］に記載の化合物。
［６０］ ［３７］〜［５９］に記載の化合物の１種以上から選択される基質を含む、リソソーム蓄積症と関係している酵素をアッセイするためのキット。
［６１］ 前記酵素が、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＭＰＳ−Ｉ）、イズロン酸２−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩ）、ヘパランＮ−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ）、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＢ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＶＡ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＶＩ）、およびβ−グルクロニダーゼ（ＭＰＳ−ＶＩＩ）のうちの１つ以上から選択される、［６０］に記載のキット。
［６２］ アッセイしようとする前記酵素それぞれの内部標準をさらに含む、［６０］に記載のキット。
［６３］ サンプルを、［３７］〜［５９］に記載の化合物の１種以上から選択される基質と接触させることを含む、リソソーム蓄積症と関係している酵素についてアッセイする方法。
［６４］ 前記酵素が、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＭＰＳ−Ｉ）、イズロン酸２−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩ）、ヘパランＮ−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ）、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＢ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＶＡ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＶＩ）、およびβ−グルクロニダーゼ（ＭＰＳ−ＶＩＩ）のうちの１つ以上から選択される、［６３］に記載の方法。
［６５］ 前記サンプルを、アッセイしようとする前記酵素それぞれの内部標準と接触させることをさらに含む、［６３］に記載の方法。
［６６］ サンプルを、［４６］または［４７］に記載の化合物と接触させることを含む、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＭＰＳ−Ｉ）をアッセイする方法。
［６７］ サンプルを、［４８］または［４９］に記載の化合物と接触させることを含む、イズロン酸２−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩ）をアッセイする方法。
［６８］ サンプルを、［５０］または［５１］に記載の化合物と接触させることを含む、ヘパランＮ−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ）をアッセイする方法。
［６９］ サンプルを、［５２］または［５３］に記載の化合物と接触させることを含む、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＢ）をアッセイする方法。
［７０］ サンプルを、［５４］または［５５］に記載の化合物と接触させることを含む、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＶＡ）をアッセイする方法。
［７１］ サンプルを、［５６］または［５７］に記載の化合物と接触させることを含む、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＶＩ）をアッセイする方法。
［７２］ サンプルを、［５８］または［５９］に記載の化合物と接触させることを含む、β−グルクロニダーゼ（ＭＰＳ−ＶＩＩ）をアッセイする方法。

Claims (72)

1. リソソーム蓄積症と関係している酵素についてアッセイする方法であって、
   （ａ）サンプルを第１の溶液と接触させて、１種以上のリソソーム酵素を含む溶液を生成することと、
   （ｂ）溶液中の前記１種以上のリソソーム酵素を、分析しようとする各リソソーム酵素の酵素基質と接触させ、前記サンプル中に存在する各リソソーム酵素の酵素生成物を含む溶液を生成するのに十分な時間をかけて前記基質を前記酵素と一緒にインキュベートすることと、
   ここで各リソソーム酵素の前記酵素基質が、炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式：
   

   

   ［式中、Ｓは、アグリコン部分に共有結合するときに、
   （ｉ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
   （ｉｉ）イズロン酸２−スルファターゼ、
   （ｉｉｉ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
   （ｉｖ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
   （ｖ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、
   （ｖｉ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、および
   （ｖｉｉ）β−グルクロニダーゼ
   からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
   Ｌ_２は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
   Ｌ_３は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
   Ｌ_４は、任意であり、存在する場合、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
   Ｒ_１は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基またはＣ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基であり、
   Ｒ_２は、それぞれの出現において、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、または−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（式中、ＲはＣ_１〜Ｃ_８アルキル基である）から独立に選択され、
   Ｒ_３は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基または置換もしくは無置換のＣ_６〜Ｃ_１０アリール基であり、
   ｎは、０、１、２、３または４である］
   を有する化合物であり、
   （ｃ）１種以上の前記酵素生成物の量を決定することと
   を含む、方法。
2. 前記酵素生成物をグリコヒドロラーゼと接触させて、第２の酵素生成物を生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. （ａ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、および
   （ｂ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ
   からなる群から選択される１種以上の酵素の基質に作用する内因性グリコヒドロラーゼ酵素活性を遮断するために阻害剤を添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. １種以上のリソソーム酵素の酵素活性をアッセイする方法であって、
   （ａ）サンプルを第１の溶液と接触させて、１種以上のリソソーム酵素を含む溶液を生成することと、
   （ｂ）溶液中の前記１種以上のリソソーム酵素を、分析しようとする各リソソーム酵素の酵素基質と接触させ、前記サンプル中に存在する各リソソーム酵素の第１の酵素生成物を含む溶液を生成するのに十分な時間をかけて前記基質を前記酵素と一緒にインキュベートすることと、
   （ｃ）前記第１の酵素生成物をグリコヒドロラーゼに供して、グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けやすい各第１の酵素生成物の第２の酵素生成物を生成することと、
   （ｄ）１種以上の前記第１の酵素生成物および／または１種以上の前記第２の酵素生成物の量を決定することと
   を含む、方法。
5. 前記グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けやすい前記第１の酵素生成物が、
   （ａ）イズロン酸２−スルファターゼ、
   （ｂ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
   （ｃ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、および
   （ｄ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、
   からなる群から選択される酵素の作用によって生成される、請求項４に記載の方法。
6. 前記グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けにくい前記第１の酵素生成物が、
   （ａ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
   （ｂ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、および
   （ｃ）β−グルクロニダーゼ
   からなる群から選択される酵素の作用によって生成される、請求項４に記載の方法。
7. （ａ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、および
   （ｂ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ
   からなる群から選択される１種以上の酵素の基質に作用する内因性グリコヒドロラーゼ酵素活性を遮断するために阻害剤を添加することをさらに含み、
   前記阻害剤が、工程（ｃ）の前記グリコヒドロラーゼの作用を有意に阻害しない、請求項４に記載の方法。
8. 前記１種以上のリソソーム酵素が、
   （ａ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
   （ｂ）イズロン酸２−スルファターゼ、
   （ｃ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
   （ｄ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
   （ｅ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、
   （ｆ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、および
   （ｇ）β−グルクロニダーゼ
   からなる群から選択される酵素を含む、請求項１または４に記載の方法。
9. 前記リソソーム酵素を前記基質と接触させる前、後、または同時に、分析しようとする各リソソーム酵素の内部標準を添加することをさらに含む、請求項１または４に記載の方法。
10. １種以上の前記酵素生成物の量を決定する前に酵素反応を失活させることをさらに含む、請求項１または４に記載の方法。
11. 前記サンプルが、血液または組織サンプルである、請求項１または４に記載の方法。
12. 前記サンプルが、乾燥血液スポットである、請求項１または４に記載の方法。
13. 前記グリコヒドロラーゼが、ヒトヘキソサミニダーゼＡ、細菌性Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、細菌性β−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ（アスペルギルス）、およびα−グルコシダーゼ（酵母）からなる群から選択される、請求項２または４に記載の方法。
14. 前記阻害剤が、（Ｚ）−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシリデン）−アミノＮ−フェニルカルバメート、１−デオキシノジリマイシン、カスタノスペルミン、スウェインソニン、カリステギンＢ_２、イソファガミン、タミフル、グルコノヒドロキシモラクトン、グルクロン酸ならびにそのラクトンおよびラクタム、リレンザ、ミグリトール、フェネチル置換グルコ−およびガラクト−イミダゾール、Ｎ−ヒドロキシエチルデヒドロノジリマイシン、ＧａｌＮＡｃチアゾリン、ならびにＧｌｃＮＡｃチアゾリンからなる群から選択される、請求項３または７に記載の方法。
15. 前記酵素生成物の量を決定することが、質量分光分析を含む、請求項１または４に記載の方法。
16. 前記酵素生成物の量を決定することが、質量分光分析によって各生成物とその内部標準との比を決定することを含む、請求項１または４に記載の方法。
17. 前記酵素生成物の量を決定することが、生成物の親イオンおよびこれらの内部標準を生成し、単離し、衝突誘起解離を受けて、生成物断片イオンおよび内部標準断片イオンを生成する、タンデム質量分光分析を含む、請求項１または４に記載の方法。
18. 前記酵素生成物の量を決定することが、生成物断片イオンおよび内部標準断片イオンのピーク強度を比較して生成物の量を計算することを含む、請求項１または４に記載の方法。
19. 前記酵素生成物の量を決定することが、液体クロマトグラフィーまたはフローインジェクションによって生成物を質量分析計に導くことを含む、請求項１または４に記載の方法。
20. 前記酵素生成物の量を決定することが、蛍光分析を含む、請求項１または４に記載の方法。
21. 前記酵素生成物の量を用いて、前記サンプルが、１種以上のリソソーム酵素欠損症と関係している病状を治療するための候補に由来しているかどうかを決定することをさらに含む、請求項１または４に記載の方法。
22. 前記基質が、炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式：
    

    

    ［式中、
    Ｓは、アグリコン部分に共有結合するときに、
    （ａ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
    （ｂ）イズロン酸２−スルファターゼ、
    （ｃ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
    （ｄ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
    （ｅ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、
    （ｆ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、および
    （ｇ）β−グルクロニダーゼ
    からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
    Ｌ_２は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
    Ｌ_３は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
    Ｌ_４は、任意であり、存在する場合、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
    Ｒ_１は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基またはＣ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基であり、
    Ｒ_２は、それぞれの出現において、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、または−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（式中、ＲはＣ_１〜Ｃ_８アルキル基である）から独立に選択され、
    Ｒ_３は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基または置換もしくは無置換のＣ_６〜Ｃ_１０アリール基であり、
    ｎは、０、１、２、３または４である］
    を有する、請求項４に記載の方法。
23. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
24. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
25. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
26. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
27. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
28. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
29. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
30. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
31. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
32. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
33. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
34. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
35. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
36. 前記基質が、次式：
    

    

    を有する、請求項１または２２に記載の方法。
37. 炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式：
    

    

    ［式中、
    Ｓは、アグリコン部分に共有結合するときに、
    （ａ）α−Ｌ−イズロニダーゼ、
    （ｂ）イズロン酸２−スルファターゼ、
    （ｃ）ヘパランＮ−スルファターゼ、
    （ｄ）Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、
    （ｅ）Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ、
    （ｆ）Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ、および
    （ｇ）β−グルクロニダーゼ
    からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
    Ｌ_２は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
    Ｌ_３は、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
    Ｌ_４は、任意であり、存在する場合、１〜２０個の炭素原子を含み、そのうちの１個以上の炭素原子がＮ、ＯもしくはＳから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ／または１個以上の炭素原子がＣ_１〜Ｃ_６アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
    Ｒ_１は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基またはＣ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基であり、
    Ｒ_２は、それぞれの出現において、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、または−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（式中、ＲはＣ_１〜Ｃ_８アルキル基である）から独立に選択され、
    Ｒ_３は、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基または置換もしくは無置換のＣ_６〜Ｃ_１０アリール基であり、
    ｎは、０、１、２、３または４である
    を有する、化合物。
38. Ｌ_２が、−（ＣＨ_２）_ｎ−（式中、ｎは１〜６である）である、請求項３７に記載の化合物。
39. Ｌ_３が、−（ＣＨ_２）_ｍ−（式中、ｍは１〜１２である）である、請求項３７に記載の化合物。
40. Ｌ_４が、−（ＣＨ_２）_ｎ−（式中、ｎは１〜６である）である、請求項３７に記載の化合物。
41. Ｌ_４が存在しない、請求項３７に記載の化合物。
42. Ｒ_１が、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキルである、請求項３７に記載の化合物。
43. Ｒ_２が、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキルである、請求項３７に記載の化合物。
44. Ｒ_３が、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルである、請求項３７に記載の化合物。
45. Ｒ_３がフェニルである、請求項３７に記載の化合物。
46. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
47. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
48. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
49. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
50. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
51. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
52. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
53. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
54. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
55. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
56. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
57. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
58. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
59. 次式：
    

    

    を有する、請求項３７に記載の化合物。
60. 請求項３７〜５９に記載の化合物の１種以上から選択される基質を含む、リソソーム蓄積症と関係している酵素をアッセイするためのキット。
61. 前記酵素が、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＭＰＳ−Ｉ）、イズロン酸２−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩ）、ヘパランＮ−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ）、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＢ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＶＡ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＶＩ）、およびβ−グルクロニダーゼ（ＭＰＳ−ＶＩＩ）のうちの１つ以上から選択される、請求項６０に記載のキット。
62. アッセイしようとする前記酵素それぞれの内部標準をさらに含む、請求項６０に記載のキット。
63. サンプルを、請求項３７〜５９に記載の化合物の１種以上から選択される基質と接触させることを含む、リソソーム蓄積症と関係している酵素についてアッセイする方法。
64. 前記酵素が、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＭＰＳ−Ｉ）、イズロン酸２−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩ）、ヘパランＮ−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ）、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＢ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＶＡ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＶＩ）、およびβ−グルクロニダーゼ（ＭＰＳ−ＶＩＩ）のうちの１つ以上から選択される、請求項６３に記載の方法。
65. 前記サンプルを、アッセイしようとする前記酵素それぞれの内部標準と接触させることをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
66. サンプルを、請求項４６または４７に記載の化合物と接触させることを含む、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＭＰＳ−Ｉ）をアッセイする方法。
67. サンプルを、請求項４８または４９に記載の化合物と接触させることを含む、イズロン酸２−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩ）をアッセイする方法。
68. サンプルを、請求項５０または５１に記載の化合物と接触させることを含む、ヘパランＮ−スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＡ）をアッセイする方法。
69. サンプルを、請求項５２または５３に記載の化合物と接触させることを含む、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＭＰＳ−ＩＩＩＢ）をアッセイする方法。
70. サンプルを、請求項５４または５５に記載の化合物と接触させることを含む、Ｎ−アセチルガラクトサミン６−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＩＶＡ）をアッセイする方法。
71. サンプルを、請求項５６または５７に記載の化合物と接触させることを含む、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸スルファターゼ（ＭＰＳ−ＶＩ）をアッセイする方法。
72. サンプルを、請求項５８または５９に記載の化合物と接触させることを含む、β−グルクロニダーゼ（ＭＰＳ−ＶＩＩ）をアッセイする方法。

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