JP6898486B2 - Mps i、ii、iiia、iiib、iva、vi、およびviiをスクリーニングするための試薬および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、それぞれの全内容が参照によりここに明確に組み込まれている、2013年9月5日出願の米国仮特許出願第61/874,293号、2013年9月5日出願の米国仮特許出願第61/874,331号、2013年9月9日出願の米国仮特許出願第61/960,102号、2013年9月9日出願の米国仮特許出願第61/960,113号、2014年3月7日出願の米国仮特許出願第61/949,970号、2014年3月20日出願の米国仮特許出願第61/968,021号、2014年6月13日出願の米国仮特許出願第62/012,020号の利益を主張する。
政府の許諾の権利の規定
本発明は、米国国立衛生研究所(NIH)から授与された認可番号DK67859の政府支援によって実施された。政府は、本発明に特定の権利を有する。
(a)サンプルを第1の溶液と接触させて、1種以上のリソソーム酵素を含む溶液を生成することと、
(b)溶液中の1種以上のリソソーム酵素を、分析しようとする各リソソーム酵素の酵素基質と接触させ、サンプル中に存在する各リソソーム酵素の酵素生成物を含む溶液を生成するのに十分な時間をかけて基質を酵素と一緒にインキュベートすることと、
ここで各リソソーム酵素の酵素基質は、炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式:
[式中、Sは、アグリコン部分に共有結合するときに、
(i)α−L−イズロニダーゼ、
(ii)イズロン酸2−スルファターゼ、
(iii)ヘパランN−スルファターゼ、
(iv)N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ、
(v)N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ、
(vi)N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ、および
(vii)β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
L2は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OおよびSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
L3は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
L4は、任意であり、存在する場合、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
R1は、C1〜C10アルキル基またはC1〜C10アルコキシ基であり、
R2は、それぞれの出現において、C1〜C10アルキル基、C1〜C10アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−C(=O)NHR、または−C(=O)OR(式中、RはC1〜C8アルキル基である)から独立に選択され、
R3は、C1〜C10アルキル基または置換もしくは無置換のC6〜C10アリール基であり、
nは、0、1、2、3または4である]
(c)1種以上の酵素生成物の量を決定することと
を含む。
(a)サンプルを第1の溶液と接触させて、1種以上のリソソーム酵素を含む溶液を生成することと、
(b)溶液中の1種以上のリソソーム酵素を、分析しようとする各リソソーム酵素の酵素基質と接触させ、サンプル中に存在する各リソソーム酵素の第1の酵素生成物を含む溶液を生成するのに十分な時間をかけて基質を酵素と一緒にインキュベートすることと、
(c)第1の酵素生成物をグリコヒドロラーゼに供して、グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けやすい各第1の酵素生成物の第2の酵素生成物を生成することと、
(d)1種以上の第1の酵素生成物および/または1種以上の第2の酵素生成物の量を決定することと
を含む。
(b)N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ、および
(c)β−グルクロニダーゼ。
(b)ヘパランN−スルファターゼ、
(c)N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ、および
(d)N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ。
(b)イズロン酸2−スルファターゼ、
(c)ヘパランN−スルファターゼ、
(d)N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ、
(e)N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ、
(f)N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ、および
(g)β−グルクロニダーゼ。
[式中、
Sは、アグリコン部分に共有結合するときに、
(a)α−L−イズロニダーゼ、
(b)イズロン酸2−スルファターゼ、
(c)ヘパランN−スルファターゼ、
(d)N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ、
(e)N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ、
(f)N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ、および
(g)β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
L2は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OおよびSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
L3は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
L4は、任意であり、存在する場合、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
R1は、C1〜C10アルキル基またはC1〜C10アルコキシ基であり、
R2は、それぞれの出現において、C1〜C10アルキル基、C1〜C10アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−C(=O)NHR、または−C(=O)OR(式中、RはC1〜C8アルキル基である)から独立に選択され、
R3は、C1〜C10アルキル基または置換もしくは無置換のC6〜C10アリール基であり、
nは、0、1、2、3または4である]。
[式中、Sは、アグリコン部分に共有結合するときに、
(a)α−L−イズロニダーゼ、
(b)イズロン酸2−スルファターゼ、
(c)ヘパランN−スルファターゼ、
(d)N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ、
(e)N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ、
(f)N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ、および
(g)β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
L2は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OおよびSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
L3は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
L4は、任意であり、存在する場合、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
R1は、C1〜C10アルキル基またはC1〜C10アルコキシ基であり、
R2は、それぞれの出現において、C1〜C10アルキル基、C1〜C10アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−C(=O)NHR、または−C(=O)OR(式中、RはC1〜C8アルキル基である)から独立に選択され、
R3は、C1〜C10アルキル基または置換もしくは無置換のC6〜C10アリール基であり、
nは、0、1、2、3または4である]。
一側面において、本発明は、酵素をアッセイするために有利に利用され得る試薬を提供する。試薬は、酵素基質(S)、酵素生成物(P)、およびアッセイ内部標準(IS)を含む。ある種の態様において、1種以上の基質(S)およびこれらの対応する内部標準(IS)を好適な緩衝液中で好適な酵素源、たとえば新生児検査カードまたは尿サンプル由来の乾燥血液スポットと一緒に十分な時間かけてインキュベートして1種以上の生成物(P)を形成し、続いてこれをタンデム質量分光分析によって検出する。ある種の態様において、内部標準(IS)は、標準が異なる質量(たとえば、置換されたホモログまたは重同位体、たとえば重水素および/または炭素−13置換基)を有する以外は、酵素形成生成物と化学的に類似している、または同等である。他の態様において、1つ以上の基質(S)を好適な緩衝液中で好適な酵素源と一緒にインキュベートして、1種以上の生成物(P)を形成し、これを続いて蛍光分析によって検出する。
(a)基質MPS−I−Sに作用して、生成物MPS−I−Pを生成し、アッセイには内部標準MPS−I−ISを使用する、α−L−イズロニダーゼ、
(b)基質MPS−II−Sに作用して、生成物MPS−II−Pを生成し、アッセイには内部標準MPS−II−ISを使用する、イズロン酸−2−スルファターゼ、
(c)基質MPS−IIIA−Sに作用して、生成物MPS−IIIA−Pを生成し、アッセイには内部標準MPS−IIIA−ISを使用する、ヘパランN−スルファターゼ、
(d)基質MPS−IIIB−Sに作用して、生成物MPS−IIIB−Pを生成し、アッセイには内部標準MPS−IIIB−ISを使用する、N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ、
(e)基質MPS−IVA−Sに作用して、生成物MPS−IVA−Pを生成し、アッセイには内部標準MPS−IVA−ISを使用する、N−アセチルガラクトサミン−6−硫酸スルファターゼ、
(f)基質MPS−VI−Sに作用して、生成物MPS−VI−Pを生成し、アッセイには内部標準MPS−VI−ISを使用する、N−アセチルガラクトサミン−4−硫酸スルファターゼ、および
(g)基質MPS−VII−Sに作用して、生成物MPS−VII−Pを生成し、アッセイには内部標準MPS−VII−ISを使用する、β−グルクロニダーゼ。
本発明の試薬は、アグリコン成分を含む。アグリコンの性質は、対象の酵素をアッセイするために利用される分析技術の性質に応じて変わり得る。代表的アグリコンは、以下の式(I)〜(VI)によって表される。以下のアグリコン構造において、波線は、糖アノマー炭素に結合する箇所を示す。
[式中、L1は、G1とクマリン部分とを共有結合するリンカーであり、X1、X2、X3、およびX4は、それぞれの出現において独立に、水素またはハロゲン(たとえば、クロロ)である]。
(a)N(Ra)(Rb)(Rc)+(式中、Ra、RbおよびRcは、それぞれ独立に、Hまたは炭素1〜6個のアルキル基である)、
(b)S(Ra)(Rb)+(式中、RaおよびRbは、上記の通りである)、
(c)次のタイプのピリジニウム、
[式中、L2、L3、R1、R2、およびnは、式(III)について上で説明した通りであり、R4は、それぞれの出現において、C1〜C6アルキル(たとえば、メチル)から独立に選択され、mは0、1、2、3、4または5である。ある種の態様において、mは0である。他の態様において、R4はC1〜C5アルキル基(たとえば、メチル)であり、mは2である]。
[式中、L2、L3、R1、R2、R3、およびnは、式(III)について上で説明した通りであり、L4は、1〜20個の炭素原子(分枝または直鎖状)を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がヘテロ原子(たとえば、N、O、S)で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子が置換されていてもよい(たとえば、C1〜C6アルキル、ハロゲン)。ある種の態様において、L4は−(CH2)n−であり、ここでnは1〜6である。ある種の態様において、L4は−(CH2)−である]。
MPS−I基質(式(IV)参照)の場合、R1はメチルであり、R2は水素であり、nは4であり、L2は−CH2CH2−であり、L3は−(CH2)6−であり、R4は水素であり、mは5であり、MPS−I内部標準の場合、R1はメチルであり、R2は水素であり、nは4であり、L2は−CH2CH2−であり、L3は−(CH2)6−であり、R4は重水素であり、mは5である。
ある種の態様において、試薬は、pH環境に応じて荷電基(たとえば、−NH3 +、−CO2 −、−OSO3 −、−NHSO3 −)になることができるアミノ基(たとえば、−NH2)、カルボン酸基(−CO2H)、スルホン酸基(たとえば、−OSO3H)、およびアミドスルホン酸基(たとえば、−NHSO3H)を含む。本発明の試薬は、これらの塩(たとえば、金属塩)を含むことを理解されたい。
一態様において、本発明は、次式:
[式中、
R1=アグリコン、R2=H
または
R1=H、R2=アグリコン
R3=H、OH、NH2、およびR4=H
または
R4=H、OH、NH2、およびR3=H
R5=H、OH、NH2、およびR6=H
または
R6=H、OH、NH2、およびR5=H
R7=H、OH、NH2、およびR8=H
または
R8=H、OH、NH2、およびR7=H
R9=COOH、およびR10=H
または
R10=COOH、およびR9=H
ただし、R3とR4、R5とR6、およびR7とR8のペアのうちの1つのみが、両方のR基を水素として有していてもよい(すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基(−CH2−)のみを含むことができる)]、
その塩およびこれらの重原子誘導体を提供する。
一態様において、本発明は、次式:
[式中、
R1=アグリコン、R2=H
または
R1=H、R2=アグリコン
R3=OSO3H、NHSO3Hであり、R4=H
または
R4=OSO3H、NHSO3Hであり、R3=H
R5=H、OH、NH2であり、R6=H
または
R6=H、OH、NH2であり、R5=H
R7=H、OH、NH2であり、R8=H
または
R8=H、OH、NH2であり、R7=H
R9=COOHであり、R10=H
または
R10=COOHであり、R9=H
ただし、R5とR6、およびR7とR8のペアのうちの1つのみが、両方のR基を水素として有していてもよい(すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基(−CH2−)のみを含むことができる)]、
その塩およびこれらの重原子誘導体を提供する。
代表的なMPS−II生成物は、次式:
別の態様において、本発明は、次式:
[R1=アグリコン、R2=H
または
R1=H、R2=アグリコン
R3=H、OH、NH2、NHSO3H、OSO3Hであり、R4=H
または
R4=H、OH、NH2、NHSO3H、OSO3Hであり、R3=H
R5=H、OH、NH2であり、R6=H
または
R6=H、OH、NH2であり、R5=H
R7=H、OH、NH2であり、R8=H
または
R8=H、OH、NH2であり、R7=H
R9=CH2OH、CH2NH2であり、R10=H
または
R10=CH2OH、CH2NH2であり、R9=H]、
その塩およびこれらの重原子誘導体を提供し、
式中、アグリコンは、上記の通りであるが、
ただし、R3とR4、R5とR6、およびR7とR8のペアのうちの1つのみが、両方のR基を水素として有していてもよい(すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基(−CH2−)のみを含むことができる)。
代表的なMPS−IIIA生成物は、次式:
さらなる態様において、本発明は、次式:
[R1=アグリコン、R2=H
または
R1=H、R2=アグリコン
R3=H、OH、NH2、NHR11[式中、R11=ホルミル、アセチル、C=O((CH2)nCH3)(式中、n=1〜6)]、およびR4=H
または
R4=H、OH、NH2、NHR11[式中、R11=ホルミル、アセチル、C=O((CH2)nCH3)(式中、n=1〜6)]、およびR3=H
R5=H、OH、NH2、およびR6=H
または
R6=H、OH、NH2、およびR5=H
R7=H、OH、NH2、およびR8=H
または
R8=H、OH、NH2、およびR7=H
R9=CH2OH、CH2NH2、およびR10=H
または
R10=CH2OH、CH2NH2、およびR10=H]、
その塩およびこれらの重原子誘導体を提供し、
式中、アグリコンは、上記の通りであるが、
ただし、R3とR4、R5とR6、およびR7とR8のペアのうちの1つのみが、両方のR基を水素として有していてもよい(すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基(−CH2−)のみを含むことができる)。
別の態様において、本発明は、次式:
[R1=アグリコン、R2=H
または
R1=H、R2=アグリコン
R3=H、OH、NH2、NHR11[式中、R11=ホルミル、アセチル、C=O((CH2)nCH3)(式中、n=1〜6)]、およびR4=H
または
R4=H、OH、NH2、NHR11[式中、R11=ホルミル、アセチル、C=O((CH2)nCH3)(式中、n=1〜6)]、およびR3=H
R5=H、OH、NH2、およびR6=H
または
R6=H、OH、NH2、およびR5=H
R7=H、OH、NH2、およびR8=H
または
R8=H、OH、NH2、およびR7=H
R9=CH2OH、CH2OSO3H、CH2NH2、CH2NHSO3H、およびR10=Hまたは
R10=CH2OH、CH2OSO3H、CH2NH2、CH2NHSO3H、およびR9=H]その塩およびこれらの重原子誘導体を提供し、
式中、アグリコンは、上記の通りであるが、
ただし、R3とR4、R5とR6、およびR7とR8のペアのうちの1つのみが、両方のR基を水素として有していてもよい(すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基(−CH2−)のみを含むことができる)。
[式中、L2、L3、R1、R2、R4、n、およびmは、式(IV)で上述した通りである]。
別の態様において、本発明は、次式:
[R1=アグリコン、R2=H
または
R1=H、R2=アグリコン
R3=H、OH、NH2、NHR11[式中、R11=ホルミル、アセチル、C=O((CH2)nCH3)(式中、n=1〜6)]、およびR4=H
または
R4=H、OH、NH2、NHR11[式中、R11=ホルミル、アセチル、C=O((CH2)nCH3)(式中、n=1〜6)]、およびR3=H
R5=H、OH、NH2、およびR6=H
または
R6=H、OH、NH2、およびR5=H
R7=CH2OH、CH2OSO3H、CH2NH2、CH2NHSO3H、およびR8=H
または
R8=CH2OH、CH2OSO3H、CH2NH2、CH2NHSO3H、およびR7=H
R9=CH2OH、CH2NH2、およびR10=H
または
R10=CH2OH、CH2NH2、およびR9=H]、
その塩およびこれらの重原子誘導体を提供し、
式中、アグリコンは、上記の通りであるが、
ただし、R3とR4、R5とR6、およびR7とR8のペアのうちの1つのみが、両方のR基を水素として有していてもよい(すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基(−CH2−)のみを含むことができる)。
。
一態様において、本発明は、次式:
[式中、
R1=アグリコン、R2=H
または
R1=H、R2=アグリコン
R3=H、OH、NH2、およびR4=H
または
R4=H、OH、NH2、およびR3=H
R5=H、OH、NH2、およびR6=H
または
R6=H、OH、NH2、およびR5=H
R7=H、OH、NH2、およびR8=H
または
R8=H、OH、NH2、およびR7=H
R9=COOH、およびR10=H
または
R10=COOH、およびR9=H
ただし、R3とR4、R5とR6、およびR7とR8のペアのうちの1つのみが、両方のR基を水素として有していてもよい(すなわち、炭水化物環は、環内に単一のメチレン基(−CH2−)のみを含むことができる)]、
その塩およびこれらの重原子誘導体を提供する。
本発明の試薬は、有利には、キット中に合わせて酵素的アッセイを実施することができる。特定のアッセイ用の試薬キットは、適当な酵素基質と内部標準のペア(たとえば、MPS−II−SおよびMPS−II−IS)を含む。ある種の態様において、キットは、1つ超の基質/内部標準ペアを含み、1種超の酵素をアッセイするために使用され得る(すなわち2種、3種、4種、5種または6種の酵素を1つのスクリーンにおいてアッセイできる多重検定)。他の態様において、キットは、アッセイを実施するための緩衝液をさらに含む。他の態様において、キットは、質量分析計を調節するために使用できる酵素生成物をさらに含む。他の態様において、キットは、品質管理乾燥血液スポットをさらに含む。このアッセイを実施するための指示書もキットに含まれ得る。
本発明の試薬は、リソソーム蓄積症と関係している酵素をアッセイするために有利に利用することができる。アッセイにおいて、1種以上の基質(S)を好適な緩衝液中で好適な酵素源、たとえば新生児スクリーニングカードまたは尿サンプル由来の乾燥血液スポットと一緒に十分な時間かけてインキュベートして、1種以上の生成物(P)を形成し、これを続いてタンデム質量分析によって検出する。アッセイには、ある種の態様において、酵素形成生成物と化学的に同一であるが、質量が異なる(たとえば、置換されている重同位体、たとえば重水素および/または炭素−13置換)、内部標準(IS)も使用される。インキュベーションは、好適な緩衝液中で行って、酵素反応を進行させる(たとえば、5mM酢酸バリウムおよび7.5mM酢酸セリウムを含有する100mMギ酸アンモニウムpH4.5)。
(a)MPS−Iの基質に作用して、MPS−I生成物を生成し、アッセイにはMPS−I内部標準を使用する、α−L−イズロニダーゼ、
(b)MPS−IIの基質に作用して、MPS−II生成物を生成し、アッセイにはMPS−II内部標準を使用する、イズロン酸2−スルファターゼ、
(c)MPS−IIIAの基質に作用して、MPS−IIIA生成物を生成し、アッセイにはMPS−IIIA内部標準を使用する、ヘパランN−スルファターゼ、
(d)MPS−IIIBの基質に作用して、生成物MPS−IIIB生成物を生成し、アッセイにはMPS−IIIB内部標準を使用する、N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ、
(e)MPS−IVAの基質に作用して、MPS−IVA生成物を生成し、アッセイにはMPS−IVA内部標準を使用する、N−アセチルガラクトサミン−6−硫酸スルファターゼ、
(f)MPS−VIの基質に作用して、MPS−VI生成物を生成し、アッセイにはMPS−VI内部標準を使用する、N−アセチルガラクトサミン−4−硫酸スルファターゼ、および
(g)MPS−VIIの基質に作用して、MPS−VII生成物を生成し、アッセイにはMPS−VII内部標準を使用する、β−グルクロニダーゼ。
所望のセットの基質と酵素源を好適な緩衝液中でインキュベートした後、反応液を、好適な溶媒、たとえば酢酸エチルを用いた液液抽出にかける。第2の酵素(グリコヒドロラーゼ)を使用せずにMPS−IIをアッセイしてアグリコンを生成する場合、混合物を、好適な酸、たとえばクエン酸で、pH約2〜3に酸性化する必要があり、これにより、MPS−II−Pのカルボキシレート基がプロトン化され、より良好に酢酸エチルに抽出される。このアッセイにおいて第2の酵素を使用して糖を除去する場合、カルボキシ基がないため、アグリコンは、酸性化しなくてもよく溶媒に抽出する。液液抽出工程の目的は、2つの部分からなり、すなわち(1)抽出が、質量分析計におけるイオン化プロセスを干渉すると考えられている緩衝塩をほとんど除去させることと、(2)抽出が、酵素基質の抽出を最小限に抑えながら、ほとんどの酵素生成物を抽出させることである。質量分析計のイオン化源中のサルフェートが損失することによって基質が部分的に分解して生成物が形成し、これが、定量化することが望ましい唯一の酵素的に生成される生成物なので、これは有用である。液液抽出の後、酢酸エチル層を新しい容器に移し、蒸発によって溶媒を除去する。残留物を、質量分析計に注入するのに適した溶媒に取り込む。例示的溶媒は、水性ギ酸アンモニウム/メタノール混合物である。生成物および内部標準を、前駆イオンが第1の四重極中で単離され、次いで衝突誘起解離を受けて1つ以上の生成イオンを形成する多重反応モニタリングモードにおいて検出する。このような1つの生成イオンが第3の四重極中で単離され、イオン検出器(タンデム質量分析)によって検出される。各フラグメント化反応は、各生成物および内部標準につき1反応とし、デューティーサイクルの様式で別々にモニタリングし、生成物および内部標準の全セットを定量化する。生成物のモル数を得るために、生成物の質量分析シグナル(イオン計数)を内部標準のそれで割り、この比に、アッセイに添加した内部標準のモル数を乗じる。
上記アッセイの変更に、改変プレ質量分析サンプルワークアップを使用する。インキュベートして基質から生成物を酵素的に生成した後、小分割量の好適な陰イオン交換樹脂を混合物に添加する。例示的樹脂は、Whatmann製のDE52である。陰イオンが、陰イオン交換樹脂上で陽イオンと静電相互作用によって結合し、この場合、すべての陰イオン性検体が樹脂に結合することがよく知られている。基質MPS−I−S、MPS−II−S、MPS−IIIA−S、MPS−IVA−S、MPS−VI−S、およびMPS−VII−Sは、カルボキシレート(MPS−I−SおよびMPS−VII−S)または硫酸エステルのいずれかを含有することで樹脂に結合する。MPS−I−P、MPS−I−IS、MPS−IVA−P、MPS−IVA−IS、MPS−VI−P、MPS−VI−IS、MPS−VII−P、およびMPS−VII−ISは、電荷が欠乏している、または正電荷を含有し(MPS−IIIA−PおよびMPS−IIIA−IS)、そのため樹脂には結合されない。MPS−IIIB−S、MPS−IIIB−PおよびMPS−IIIB−ISも、負電荷を欠き、樹脂に結合されない。MPS−II−S、MPS−II−PおよびMPS−II−ISは、すべて陰イオン性であり、そのためすべて樹脂に結合される。このアッセイオプションでは、アッセイ用緩衝液は、MPS−II−PおよびMPS−II−ISに作用し、MPS−II−Sに作用しない組み換え型α−L−イズロニダーゼを含有し、アグリコンからイズロン酸残基を除去することにより、電荷を欠いた遊離アグリコンを残留させる。したがって、MPS−II−PおよびMPS−II−ISから誘導された、結果として得られる検体は、陰イオン交換樹脂に結合しない。組み換え型α−L−イズロニダーゼが含まれる場合、酵素はMPS−I−Sに作用してMPS−I−Pを作製するため、アッセイにMPS−I−Sを含むことはできない。α−L−イズロニダーゼの使用は、陰イオン交換樹脂を添加する、こうしたMPS−IIアッセイに限定されない。この酵素の添加は、陰イオン交換体を使用しない他のすべてのMPS−IIアッセイに適用できる。
本発明の方法は、MPS−I、MPS−II、MPS−IIIA、MPS−IIIB、MPS−IVA、MPS−VI、およびMPS−VIIの1つ以上ならびにこれらの任意の組み合わせの分析を提供する。質量分析を利用してアッセイ用生成物を定量化する態様の場合、ある種の態様において、各アッセイ用の生成物は質量が異なる。1回のアッセイを利用してすべてのアッセイ用生成物を定量化できるように、各生成物の質量は異なっている。質量の弁別性は、基質の選択によって実現される。
別の態様において、本発明は、新生児スクリーニングのための、リソソーム蓄積症と関係しているスルファターゼ(MPS II、IIIA、IVA、およびVI)の検出用のアッセイ、試薬、およびキットを提供する。
一側面において、本発明は、MPS II、IIIA、IVA、およびVIのスクリーニング方法を提供する。この方法は、その欠陥がリソソーム蓄積症の状態を招く特異的酵素をアッセイする。この方法は、有利には、イズロン酸2−スルファターゼ(MPS−II)、ヘパランN−スルファターゼ(MPS−IIIA)、N−アセチルガラクトサミン−6−硫酸スルファターゼ(MPS−IVA)、およびN−アセチルガラクトサミン−4−硫酸スルファターゼ(MPS−VI)のうちの1つ以上をアッセイする。
(a)MPS−IIの基質に作用して、MPS−II生成物を生成し、アッセイにはMPS−II内部標準を使用する、イズロン酸2−スルファターゼ、
(b)MPS−IIIAの基質に作用して、MPS−IIIA生成物を生成し、アッセイにはMPS−IIIA内部標準を使用する、ヘパランN−スルファターゼ、
(c)MPS−IVAの基質に作用して、MPS−IVA生成物を生成し、アッセイにはMPS−IVA内部標準を使用する、N−アセチルガラクトサミン−6−硫酸スルファターゼ、
(d)MPS−VIの基質に作用して、MPS−VI生成物を生成し、アッセイにはMPS−VI内部標準を使用する、N−アセチルガラクトサミン−4−硫酸スルファターゼ。
MPS II、IIIA、IVA、およびVIをスクリーニングするための試薬は、MPS II、IIIA、IVA、およびVIをスクリーニングするための基質(S)、生成物(P)、および内部標準(IS)を含む。
上記の通り、グリコヒドロラーゼおよびリアーゼ酵素を使用して、質量分析を用いたスルファターゼのアッセイの感度を改善し、蛍光分析用の蛍光アグリコン生成物を生成する。関連側面において、阻害剤を添加して内因性グリコヒドロラーゼ活性を遮断する工程をさらに含む方法を提供する。
(a)ここで記載するアッセイに使用する酵素は、糖が4位または6位にサルフェートを保有していない場合のみ、糖を切断してアグリコンを生成する必要がある、および
(b)ここで記載するアッセイに使用する酵素は、アッセイ対象のリソソーム酵素源である生体サンプル(たとえば、乾燥血液スポット)中に存在するヒトヘキソサミニダーゼAを顕著に阻害する、アッセイ混合物に添加される阻害剤によって有意に阻害されてはならない。
例1
代表的なMPS−IおよびMPS−II試薬の合成
この例において、代表的なMPS−I(MPS−I−S−アセチル−C6およびMPS−I−IS−アセチル−C6)試薬およびMPS−II(MPS−II−S−ペンタノイル−C6およびMPS−II−IS−ペンタノイル−C6)試薬の合成を記述する。
1−F−2,3,4−トリアセトキシ−イズロン酸メチルエステルの合成を以下に記述する。
アグリコンは2つの方法によって作製できる。第1の方法は、市販のモノ−BOC−1,6−ヘキサンジアミンの、HP−Ph−NHCO−CH=CH2へのマイケル付加、続いて第2級アミンのアセチル化、BOCの除去、および第1級アミンのベンゾイル化を利用する。フェノール−OHのベンゾイル化がいくらか生じるが、サンプルの処理前に、このエステルはけん化によって切断される。第2の方法は、モノ−BOC−1,6−ヘキサンジアミンを塩化ベンゾイルで処理し、BOCを除去してモノベンゾイル−1,6−ヘキサンジアミンを得、これをマイケル付加に使用した後、第2級アミンをアセチル化することを含む。ベンゾイル化およびBOC除去は両方ともほぼ定量的であるため、各経路は本質的に同等である。
[M+H]+に対するMS(ESI+)、計算値:207.1、観測値:207.2。
CH2Cl2(400mL)中の4−アミノフェノール(50g、458mmole)の溶液および飽和NaHCO3の水(400mL)溶液を室温で10分間攪拌し、次いで塩化アクリロイル(40.9mL、503.8mmole)を滴下添加し、反応液を室温でさらに6時間攪拌した。生成した固体を濾過によって集め、水で洗浄し、真空下(油ポンプ)で乾燥して、75gの4−アクリルアミドフェノールを得た。
ペンタノイル化
内部標準MPS−I−P−アセチル−C6は、d5−塩化ベンゾイル(Aldrich)を使用する以外は、MPS−Iアグリコンについて記載したものと同様に調製した。酵素生成物MPS−I−P−アセチル−C6は、MPS−Iアグリコンである(すなわち、ISと同一であるが、ベンゾイルは重水素化されない)。
MPS−I試薬を使用する代表的アッセイ
この例において、本発明のMPS−I試薬を使用する代表的なアッセイを記述する。これらの試薬の結果を、他のMPS−I試薬と比較する。
MPS−II試薬を使用する代表的アッセイ
この例において、本発明のMPS−II試薬を使用する代表的なアッセイを記述する。これらの試薬についての結果を他のMPS−II試薬と比較する。
代表的なMPS−IVA基質および酵素生成物の合成
この例において、代表的なMPS−IVA基質試薬の合成を記述する。MPS−IVA基質の合成の一般的なスキームを図2に示す。
[M+Na]+に対するMS(ESI+)、計算値:491.1、観測値:491.2。
代表的なMPS−VI基質および酵素生成物の合成
この例において、代表的なMPS−VI基質および酵素生成物試薬の合成を記述する。MPS−VI基質の合成の一般的なスキームを図3に示す。
代表的なMPS−VI基質(ヘキサンアミド)の調製を以下に記述し、図4に例示する。
S(ESI+)、計算値:679.3、観測値:679.7。
MPS−VI試薬を使用する代表的アッセイ
この例において、本発明のMPS−VI試薬を使用する代表的なアッセイを記述する。これらの試薬の結果を、他のMPS−VI試薬と比較する。
MPS−IIについての代表的なスルファターゼアッセイ
この例において、本発明の代表的なアッセイ(ハンター症候群(MPS−II)に欠いた酵素である、イズロン酸2−スルファターゼについてのアッセイ)を記述する。
MPS−VIについての代表的なスルファターゼアッセイ
MPS−VIについての代表的なアッセイにおいて使用する好適な第2の酵素は、細菌N−アセチルガラクトサミニダーゼであり、MPS−VI酵素が糖の4位からサルフェートを除去した後、そのアグリコンからN−アセチルガラクトサミンを放出するために使用する。これによりアッセイ感度が約20倍改善する。その他の好適な酵素として、細菌N−アセチルヘキソサミニダーゼが挙げられる。
MPS−IVAについての代表的なスルファターゼアッセイ
MPS−IVAについての代表的なアッセイにおいて使用する好適な第2の酵素は、アスペルギルス種由来のβ−ガラクトシダーゼであり、MPS−IVA酵素が糖の6位からサルフェートを除去した後、そのアグリコンからガラクトースを放出するために使用する。これによりアッセイ感度が約20倍改善する。アスペルギルス酵素は、MPS−IVAアッセイのpHであるpH4〜5で高活性を保持するため、たとえば、大腸菌(E.coli)酵素を好ましくは上回る。あるいは、N−アセチル−ガラクトサミン−6−サルフェートを有するMPS−IVA基質を使用してもよく、MPS−VIアッセイ(上記参照)において使用されるものと同じ酵素によって初期MPS−IV生成物が作用されてアグリコンを生成する。
MPS−IIIAについての代表的なスルファターゼアッセイ
MPS−IIIAについての代表的なアッセイにおいて使用する好適な第2の酵素は、パン酵母由来の酵母α−グルコシダーゼであり、MPS−IIIA酵素が、グルコサミン−N−サルフェートのアミノ基からサルフェートを除去した後、そのアグリコンからグルコサミンを放出するために使用する。あるいは、MPS−IIIA酵素がサルフェートを除去した後、アセチル−CoA:グルコサミンN−アセチルトランスフェラーゼを使用して遊離アミノ基をアセチル化することができる。哺乳類と細菌両方のアセチルトランスフェラーゼを使用することができる。
MPS−IVAについての代表的なアッセイ
この例において、MPS−IVAについての代表的なアッセイを、6位で硫酸化されない場合にβグリコシドをN−アセチル−ガラクトサミンに開裂させる、細菌酵素のβ−N−アセチルガラクトサミニダーゼ(β−NGA)と、GALNS基質に対するヒトヘキソサミニダーゼAを遮断する、ヒトヘキソサミニダーゼAの阻害剤である(Z)−O−(2−アセトアミド−2−デオキシ−D−グルコピラノシリデン)−アミノN−フェニルカルバメート(Z−PUG−NAc)とを使用して記述する。
[1]
リソソーム蓄積症と関係している酵素についてアッセイする方法であって、
(a)サンプルを第1の溶液と接触させて、1種以上のリソソーム酵素を含む溶液を生成することと、
(b)溶液中の前記1種以上のリソソーム酵素を、分析しようとする各リソソーム酵素の酵素基質と接触させ、前記サンプル中に存在する各リソソーム酵素の酵素生成物を含む溶液を生成するのに十分な時間をかけて前記基質を前記酵素と一緒にインキュベートすることと、
ここで各リソソーム酵素の前記酵素基質が、炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式:
(i)α−L−イズロニダーゼ、
(ii)イズロン酸2−スルファターゼ、
(iii)ヘパランN−スルファターゼ、
(iv)N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ、
(v)N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ、
(vi)N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ、および
(vii)β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
L 2 は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OおよびSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC 1 〜C 6 アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、 L 3 は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC 1 〜C 6 アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、 L 4 は、任意であり、存在する場合、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC 1 〜C 6 アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
R 1 は、C 1 〜C 10 アルキル基またはC 1 〜C 10 アルコキシ基であり、
R 2 は、それぞれの出現において、C 1 〜C 10 アルキル基、C 1 〜C 10 アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−C(=O)NHR、または−C(=O)OR(式中、RはC 1 〜C 8 アルキル基である)から独立に選択され、
R 3 は、C 1 〜C 10 アルキル基または置換もしくは無置換のC 6 〜C 10 アリール基であり、
nは、0、1、2、3または4である]
を有する化合物であり、
(c)1種以上の前記酵素生成物の量を決定することと
を含む、方法。
[2]
前記酵素生成物をグリコヒドロラーゼと接触させて、第2の酵素生成物を生成することをさらに含む、[1]に記載の方法。
[3]
(a)N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ、および
(b)N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ
からなる群から選択される1種以上の酵素の基質に作用する内因性グリコヒドロラーゼ酵素活性を遮断するために阻害剤を添加することをさらに含む、[1]に記載の方法。
[4]
1種以上のリソソーム酵素の酵素活性をアッセイする方法であって、
(a)サンプルを第1の溶液と接触させて、1種以上のリソソーム酵素を含む溶液を生成することと、
(b)溶液中の前記1種以上のリソソーム酵素を、分析しようとする各リソソーム酵素の酵素基質と接触させ、前記サンプル中に存在する各リソソーム酵素の第1の酵素生成物を含む溶液を生成するのに十分な時間をかけて前記基質を前記酵素と一緒にインキュベートすることと、
(c)前記第1の酵素生成物をグリコヒドロラーゼに供して、グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けやすい各第1の酵素生成物の第2の酵素生成物を生成することと、
(d)1種以上の前記第1の酵素生成物および/または1種以上の前記第2の酵素生成物の量を決定することとを含む、方法。
[5]
前記グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けやすい前記第1の酵素生成物が、
(a)イズロン酸2−スルファターゼ、
(b)ヘパランN−スルファターゼ、
(c)N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ、および
(d)N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ、
からなる群から選択される酵素の作用によって生成される、[4]に記載の方法。
[6]
前記グリコヒドロラーゼによるさらなる酵素作用を受けにくい前記第1の酵素生成物が、
(a)α−L−イズロニダーゼ、
(b)N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ、および
(c)β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の作用によって生成される、[4]に記載の方法。
[7]
(a)N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ、および
(b)N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ
からなる群から選択される1種以上の酵素の基質に作用する内因性グリコヒドロラーゼ酵素活性を遮断するために阻害剤を添加することをさらに含み、前記阻害剤が、工程(c)の前記グリコヒドロラーゼの作用を有意に阻害しない、[4]に記載の方法。
[8]
前記1種以上のリソソーム酵素が、
(a)α−L−イズロニダーゼ、
(b)イズロン酸2−スルファターゼ、
(c)ヘパランN−スルファターゼ、
(d)N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ、
(e)N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ、
(f)N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ、および
(g)β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素を含む、[1]または[4]に記載の方法。
[9]
前記リソソーム酵素を前記基質と接触させる前、後、または同時に、分析しようとする各リソソーム酵素の内部標準を添加することをさらに含む、[1]または[4]に記載の方法。
[10]
1種以上の前記酵素生成物の量を決定する前に酵素反応を失活させることをさらに含む、[1]または[4]に記載の方法。
[11]
前記サンプルが、血液または組織サンプルである、[1]または[4]に記載の方法。[12]
前記サンプルが、乾燥血液スポットである、[1]または[4]に記載の方法。
[13]
前記グリコヒドロラーゼが、ヒトヘキソサミニダーゼA、細菌性N−アセチルヘキソサミニダーゼ、細菌性β−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−L−イズロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ(アスペルギルス)、およびα−グルコシダーゼ(酵母)からなる群から選択される、[2]または[4]に記載の方法。
[14]
前記阻害剤が、(Z)−O−(2−アセトアミド−2−デオキシ−D−グルコピラノシリデン)−アミノN−フェニルカルバメート、1−デオキシノジリマイシン、カスタノスペルミン、スウェインソニン、カリステギンB 2 、イソファガミン、タミフル、グルコノヒドロキシモラクトン、グルクロン酸ならびにそのラクトンおよびラクタム、リレンザ、ミグリトール、フェネチル置換グルコ−およびガラクト−イミダゾール、N−ヒドロキシエチルデヒドロノジリマイシン、GalNAcチアゾリン、ならびにGlcNAcチアゾリンからなる群から選択される、[3]または[7]に記載の方法。
[15]
前記酵素生成物の量を決定することが、質量分光分析を含む、[1]または[4]に記載の方法。
[16]
前記酵素生成物の量を決定することが、質量分光分析によって各生成物とその内部標準との比を決定することを含む、[1]または[4]に記載の方法。
[17]
前記酵素生成物の量を決定することが、生成物の親イオンおよびこれらの内部標準を生成し、単離し、衝突誘起解離を受けて、生成物断片イオンおよび内部標準断片イオンを生成する、タンデム質量分光分析を含む、[1]または[4]に記載の方法。
[18]
前記酵素生成物の量を決定することが、生成物断片イオンおよび内部標準断片イオンのピーク強度を比較して生成物の量を計算することを含む、[1]または[4]に記載の方法。
[19]
前記酵素生成物の量を決定することが、液体クロマトグラフィーまたはフローインジェクションによって生成物を質量分析計に導くことを含む、[1]または[4]に記載の方法。
[20]
前記酵素生成物の量を決定することが、蛍光分析を含む、[1]または[4]に記載の方法。
[21]
前記酵素生成物の量を用いて、前記サンプルが、1種以上のリソソーム酵素欠損症と関係している病状を治療するための候補に由来しているかどうかを決定することをさらに含む、[1]または[4]に記載の方法。
[22]
前記基質が、炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式:
Sは、アグリコン部分に共有結合するときに、
(a)α−L−イズロニダーゼ、
(b)イズロン酸2−スルファターゼ、
(c)ヘパランN−スルファターゼ、
(d)N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ、
(e)N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ、
(f)N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ、および
(g)β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
L 2 は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OおよびSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC 1 〜C 6 アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、 L 3 は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC 1 〜C 6 アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、 L 4 は、任意であり、存在する場合、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC 1 〜C 6 アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
R 1 は、C 1 〜C 10 アルキル基またはC 1 〜C 10 アルコキシ基であり、
R 2 は、それぞれの出現において、C 1 〜C 10 アルキル基、C 1 〜C 10 アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−C(=O)NHR、または−C(=O)OR(式中、RはC 1 〜C 8 アルキル基である)から独立に選択され、
R 3 は、C 1 〜C 10 アルキル基または置換もしくは無置換のC 6 〜C 10 アリール基であり、
nは、0、1、2、3または4である]
を有する、[4]に記載の方法。
[23]
前記基質が、次式:
[24]
前記基質が、次式:
[25]
前記基質が、次式:
[26]
前記基質が、次式:
[27]
前記基質が、次式:
[28]
前記基質が、次式:
[29]
前記基質が、次式:
[30]
前記基質が、次式:
[31]
前記基質が、次式:
[32]
前記基質が、次式:
[33]
前記基質が、次式:
[34]
前記基質が、次式:
[35]
前記基質が、次式:
[36]
前記基質が、次式:
[37]
炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式:
(a)α−L−イズロニダーゼ、
(b)イズロン酸2−スルファターゼ、
(c)ヘパランN−スルファターゼ、
(d)N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ、
(e)N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ、
(f)N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ、および
(g)β−グルクロニダーゼ
からなる群から選択される酵素の基質を与える炭水化物部分であり、
L 2 は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OおよびSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC 1 〜C 6 アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、 L 3 は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC 1 〜C 6 アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、 L 4 は、任意であり、存在する場合、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC 1 〜C 6 アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
R 1 は、C 1 〜C 10 アルキル基またはC 1 〜C 10 アルコキシ基であり、
R 2 は、それぞれの出現において、C 1 〜C 10 アルキル基、C 1 〜C 10 アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−C(=O)NHR、または−C(=O)OR(式中、RはC 1 〜C 8 アルキル基である)から独立に選択され、
R 3 は、C 1 〜C 10 アルキル基または置換もしくは無置換のC 6 〜C 10 アリール基であり、
nは、0、1、2、3または4である
を有する、化合物。
[38]
L 2 が、−(CH 2 ) n −(式中、nは1〜6である)である、[37]に記載の化合物。
[39]
L 3 が、−(CH 2 ) m −(式中、mは1〜12である)である、[37]に記載の化合物。
[40]
L 4 が、−(CH 2 ) n −(式中、nは1〜6である)である、[37]に記載の化合物。
[41]
L 4 が存在しない、[37]に記載の化合物。
[42]
R 1 が、C 1 〜C 5 アルキルである、[37]に記載の化合物。
[43]
R 2 が、C 1 〜C 8 アルキルである、[37]に記載の化合物。
[44]
R 3 が、C 1 〜C 6 アルキルである、[37]に記載の化合物。
[45]
R 3 がフェニルである、[37]に記載の化合物。
[46]
次式:
[47]
次式:
[48]
次式:
[49]
次式:
[50]
次式:
[51]
次式:
[52]
次式:
[53]
次式:
[54]
次式:
[55]
次式:
[56]
次式:
[57]
次式:
[58]
次式:
[59]
次式:
[60]
[37]〜[59]に記載の化合物の1種以上から選択される基質を含む、リソソーム蓄積症と関係している酵素をアッセイするためのキット。
[61]
前記酵素が、α−L−イズロニダーゼ(MPS−I)、イズロン酸2−スルファターゼ(MPS−II)、ヘパランN−スルファターゼ(MPS−IIIA)、N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ(MPS−IIIB)、N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ(MPS−IVA)、N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ(MPS−VI)、およびβ−グルクロニダーゼ(MPS−VII)のうちの1つ以上から選択される、[60]に記載のキット。
[62]
アッセイしようとする前記酵素それぞれの内部標準をさらに含む、[60]に記載のキット。
[63]
サンプルを、[37]〜[59]に記載の化合物の1種以上から選択される基質と接触させることを含む、リソソーム蓄積症と関係している酵素についてアッセイする方法。[64]
前記酵素が、α−L−イズロニダーゼ(MPS−I)、イズロン酸2−スルファターゼ(MPS−II)、ヘパランN−スルファターゼ(MPS−IIIA)、N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ(MPS−IIIB)、N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ(MPS−IVA)、N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ(MPS−VI)、およびβ−グルクロニダーゼ(MPS−VII)のうちの1つ以上から選択される、[63]に記載の方法。
[65]
前記サンプルを、アッセイしようとする前記酵素それぞれの内部標準と接触させることをさらに含む、[63]に記載の方法。
[66]
サンプルを、[46]または[47]に記載の化合物と接触させることを含む、α−L−イズロニダーゼ(MPS−I)をアッセイする方法。
[67]
サンプルを、[48]または[49]に記載の化合物と接触させることを含む、イズロン酸2−スルファターゼ(MPS−II)をアッセイする方法。
[68]
サンプルを、[50]または[51]に記載の化合物と接触させることを含む、ヘパランN−スルファターゼ(MPS−IIIA)をアッセイする方法。
[69]
サンプルを、[52]または[53]に記載の化合物と接触させることを含む、N−アセチル−α−D−グルコサミニダーゼ(MPS−IIIB)をアッセイする方法。
[70]
サンプルを、[54]または[55]に記載の化合物と接触させることを含む、N−アセチルガラクトサミン6−硫酸スルファターゼ(MPS−IVA)をアッセイする方法。[71]
サンプルを、[56]または[57]に記載の化合物と接触させることを含む、N−アセチルガラクトサミン4−硫酸スルファターゼ(MPS−VI)をアッセイする方法。[72]
サンプルを、[58]または[59]に記載の化合物と接触させることを含む、β−グルクロニダーゼ(MPS−VII)をアッセイする方法。
Claims (15)
- N−アセチルガラクトサミン−6−硫酸 スルファターゼについてアッセイする方法であって、
(a)サンプルを第1の溶液と接触させて、1種以上のリソソーム酵素を含む溶液を生成することと、
(b)1種以上のリソソーム酵素を含む溶液を、N−アセチルガラクトサミン−6−硫酸 スルファターゼの酵素基質と接触させ、前記1種以上のリソソーム酵素を含む溶液を、N−アセチルガラクトサミン−6−硫酸 スルファターゼの酵素生成物を含む溶液を生成するのに十分な時間をかけてインキュベートすることと、
ここでN−アセチルガラクトサミン−6−硫酸 スルファターゼの前記酵素基質が、炭水化物部分およびアグリコン部分を有し、次式:
L 2 は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OおよびSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
L3は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
L4は、任意であり、存在する場合、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
R1は、C1〜C10アルキル基であり、
R2は、それぞれの出現において、C1〜C10アルキル基、C1〜C10アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−C(=O)NHR、または−C(=O)OR(式中、RはC1〜C8アルキル基である)から独立に選択され、
R3は、C1〜C10アルキル基または置換もしくは無置換のC6〜C10アリール基であり、
nは、0、1、2、3または4である]
を有する化合物であり、
(c)N−アセチルガラクトサミン−6−硫酸 スルファターゼの量を決定することと
を含む、方法。 - L 2 がCH 2 CH 2 である請求項1または2に記載の方法。
- L 3 がn−C 6 H 12 である、請求項1または2に記載の方法。
- R 1 がn−C 5 H 10 である、請求項1または2に記載の方法。
- 次式:
L 2 は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OおよびSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
L3は、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
L4は、任意であり、存在する場合、1〜20個の炭素原子を含み、そのうちの1個以上の炭素原子がN、OもしくはSから選択されるヘテロ原子で置きかえられていてもよく、かつ/または1個以上の炭素原子がC1〜C6アルキル基もしくはハロゲンで置換されていてもよいリンカーであり、
R1は、C1〜C10アルキル基であり、
R2は、それぞれの出現において、C1〜C10アルキル基、C1〜C10アルコキシ基、ハロゲン、ニトロ、−C(=O)NHR、または−C(=O)OR(式中、RはC1〜C8アルキル基である)から独立に選択され、
R3は、C1〜C10アルキル基または置換もしくは無置換のC6〜C10アリール基であり、
nは、0、1、2、3または4である]
を有する、化合物。 - L 2 がCH 2 CH 2 である請求項7または8に記載の化合物。
- L 3 がn−C 6 H 12 である、請求項7または8に記載の化合物。
- R 1 がn−C 5 H 10 である、請求項7または8に記載の化合物。
- 請求項7〜12のいずれか1項に記載の化合物の1種以上から選択される基質を含む、リソソーム蓄積症と関係している酵素をアッセイするためのキット。
- 前記酵素が、N−アセチルガラクトサミン−6−硫酸 スルファターゼ(MPS−IVA)である、請求項13に記載のキット。
- N−アセチルガラクトサミン−6−硫酸 スルファターゼ(MPS−IVA)の内部標準をさらに含む、請求項14に記載のキット。
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