JP2021099362A - マイクロアレイを用いた生体分子分析のための方法、ツール、およびツールアセンブリ - Google Patents

Abstract

【課題】気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイを用いた生体分子分析のための方法、ツール、ピラープレート、およびツールアセンブリ。【解決手段】ツールの態様は、ツールマウント部分と把持部分を有する2つのクランプを含む。ツールマウント部分は、マイクロアレイを備えるピラープレートを動かすために、プレートハンドリングロボットのリフト機構と係合するように構成されている。把持部分は、ツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角の傾きでピラープレートを自由につり下げるように構成されている。ピラープレートの態様は、ピラープレートの両側にある2つの突出端部と、1つまたは複数の付けられたマイクロアレイを有する複数のピラーを含む。ツールアセンブリの態様はツールとピラープレートを含み、突出端部は把持部分と係合するように構成されている。【選択図】図５

Description

背景
典型的なマイクロアレイシステムは、概して、ガラス、プラスチック、またはシリコンチップのような固体平面上にフォーマットされた生体分子プローブ、例えば、DNA、タンパク質、またはペプチドと、試料を扱うために必要とされる機器(自動ロボット工学)、レポーター分子を読み取るために必要とされる機器(スキャナ)、およびデータを解析するために必要とされる機器(生物情報学ツール)からなる。マイクロアレイ技術によって、1平方センチメートルあたり多くのプローブをモニタリングすることが容易になる。複数のプローブを使用する利点には、速度、順応性、包括性、および相対的に安い大量生産コストが含まれるが、これに限定されない。このようなマイクロアレイの用途には、病原体の検出および特定を含む診断微生物学、抗菌剤耐性の研究、疫学的菌株分類、癌遺伝子の研究、宿主ゲノム発現を用いた微生物感染の解析、および多型プロファイルが含まれるが、これに限定されない。

生体分子分析のためにマイクロアレイを用いるシステムでは、マイクロアレイは、当業者に周知の技法、例えば、化学選択的固定化または固相合成によってマイクロアレイの支持体上で合成された別個の分析物検出領域またはプローブを用いて官能化される。複数の官能化マイクロアレイは、典型的には、マイクロアレイをパラレルアッセイするためのプレートに配置される。場合によっては、生体分子プローブのあるマイクロアレイは、プローブをもっと効率的に取り扱い、かつアッセイするために逆ピラープレートに付けられる。ピラーまたはイマージョンプレートは、マイクロアレイ上にあるプローブをアッセイしているときに、マイクロアレイが付けられているピラー面が下に向いていれば「逆」だと言われる。

プローブをアッセイするには、典型的に、マイクロアレイは、ウェルプレート上のウェル内に含まれるアッセイ溶液の中に浸漬される。プレートハンドリングシステムは、マイクロアレイを有するプレートを、各ピラーについて対応するウェルを有するウェルプレートに垂直に近づける。ピラープレートとウェルプレートを十分に近づけると、平らなマイクロアレイはアッセイ溶液の表面と接触する。さらに、2つのプレートを一緒に動かすことによって、マイクロアレイはアッセイ溶液の中に沈む。多くの場合、マイクロアレイが溶液の中に浸漬されたときに、溶液中に気泡が生じ、マイクロアレイの近くに溜まる。これらの気泡はアッセイの分析結果に悪影響を及ぼす。なぜなら、泡があると、例えば、溶液はプローブの全てと十分に接触しなくなり、一部のプローブはアッセイ溶液ではなく空気に取り囲まれるようになるからである。従って、マイクロアレイシステムにおいて逆ピラープレートを用いると、速度、順応性、費用、および生体分子分析の包括性の点から見て多数のプローブを効率的に取り扱いかつアッセイすることが可能になるものの、これらのシステムの信頼性および精度の点から見ると、これらのシステムにおいて気泡が発生することはかなり大きな欠点である。

概要
本開示は、気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイをアッセイするための方法、ツール、ピラープレート、およびツールアセンブリを含む。

一部の態様において、前記ツールは2つのクランプを備え、各クランプは、(1)マイクロアレイを備えるピラープレートを動かすために、プレートハンドリングロボットのリフト機構と係合するように構成されているツールマウント部分と、(2)ツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角の傾きでピラープレートを自由につり下げるように構成されている把持部分とを備える。本開示は概してピラープレートについて言及するが、「ピラープレート」という用語は、ピラーが無いプレートも含む。一部の態様において、0でない傾斜角は、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°、または30°である。一部の態様において、0でない傾斜角は5°〜30°の範囲内であるか、30°より少ないかもしくはこれに等しいか、または45°より少ないかもしくはこれに等しい。

一部の態様において、ピラープレートのピラーが下に向き、1つまたは複数のマイクロアレイが少なくとも1つのピラーに付けられた状態で、ピラープレートは自由につり下げられる。一部の態様において、ピラープレートは逆ピラープレートを含む。これらの態様の一部において、1つまたは複数のマイクロアレイは直接プレートに付けられ、少なくとも1つのピラーに付けられない。一部の態様において、マイクロアレイは、周知の技法、例えば、下記でさらに詳細に説明される合成によって、マイクロアレイの支持体上で合成された別個の分析物検出領域または生体分子プローブを用いて官能化される。

ツールおよびツールアセンブリを用いて、アッセイ溶液を保持するように構成されているウェルを備えるウェルプレートにピラープレートを近づけることによって、1つまたは複数のマイクロアレイはアッセイ溶液の中に浸漬される。一部の態様において、各ピラーは、ウェルプレートの対応するウェルに収容された後に、ピラーはウェル内でアッセイ溶液と接触する。

一部の態様において、ツールの各クランプの把持部分は2対の収容バーを備える。第1の対の収容バーは第1の垂直方向の幅で隔てられ、第2の対の収容バーは第2の垂直方向の幅で隔てられている。一部の態様において、第1の垂直方向の幅は、予め規定された閾値距離の分だけ第2の垂直方向の幅より広く、ピラープレートは2つのクランプによって自由につり下げられている場合、0でない傾斜角をとる。

0でない傾斜角でピラープレートを有する利点は、マイクロアレイが溶液の中に浸漬されたときに、アッセイ溶液中に気泡が生じる可能性が小さくなることである。ピラーが溶液と接触し、溶液の中に沈むときに、最初に、アッセイ溶液の表面を突き抜けるのはピラーの平らな面ではなく端部なので、気泡はほとんど発生しないか、または発生しない。ピラーの平らな上面と比較してピラー端部の総面積は小さいので、アッセイ溶液の表面張力に打ち勝つエネルギーはかなり小さくなり、そのため、生じる泡の数が少なくなる。さらに、ピラーは傾斜角で沈むので、生じた泡は、ピラーの下に溜まることなく、傾斜のついたピラー表面に沿って、溶液の表面に向かって広がることができる。

一部の態様において、ピラープレートは、ピラープレートからほぼ垂直に伸びている複数のピラーを備え、ピラープレートが上下反転されたときに、各マイクロアレイが少なくとも1つのピラーから移動しないように、1つまたは複数のマイクロアレイは少なくとも1つのピラーに付けられている。ピラープレートはピラープレートの両側に2つの突出端部をさらに備え、突出端部は、ツールのクランプの把持部分と係合するように構成されている。

一部の態様において、ツールアセンブリはツールとピラープレートを備える。ピラープレートは、ピラープレートからほぼ垂直に伸びている複数のピラーを備える。ピラープレートが上下反転されたときに、各マイクロアレイが少なくとも1つのピラーから移動しないように、1つまたは複数のマイクロアレイは少なくとも1つのピラーに付けられている。ピラープレートはピラープレートの両側に2つの突出端部をさらに備え、突出端部は、ピラープレートをつり下げるためにクランプの把持部分と係合するように構成されている。一部の態様において、ピラープレートが2つのクランプによってつり下げられている場合、2つの突出端部はそれぞれ両方とも、2つのクランプのうちの1つの2対の収容バーと別々に噛み合わされている。

一部の態様において、前記方法は、気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリを使用する方法を含む。前記方法は、ツールアセンブリを準備する工程と、複数のウェルを備えるウェルプレートを準備する工程を含む。前記方法では、ピラープレートが、クランプのツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角で傾けられ、マイクロアレイが、ウェルプレートの1つまたは複数のウェル内でアッセイ溶液と接触しているときに、各ウェルはピラープレートの1つのピラーを収容することができる。前記方法は、クランプのツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角で傾けた状態で、ツールアセンブリのピラープレートを自由につり下げる工程をさらに含む。自由につり下げる工程は、ピラープレートが上下反転され、クランプのツールマウント部分がプレートハンドリングロボットのリフト機構と係合している間に、ピラープレートの突出端部とクランプの把持部分を噛み合わせることを含む。前記方法では、自由につり下げられたピラープレートをウェルプレートに近づけて、1つまたは複数のマイクロアレイをウェル内のアッセイ溶液と接触させることによって、ピラープレートの少なくとも1つのピラーに付けられた1つまたは複数のマイクロアレイはアッセイされる。

各図面の簡単な説明
本発明のこれらのおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明および添付の図面に関して、さらによく理解されるようになるだろう。

一部の態様に従う、ツールおよびツールアセンブリを用いたアッセイにおいて工程を行うためのワークベンチシステムを示す。 一部の態様に従う、マイクロアッセイをアッセイするための2つのクランプを備えるツールの側面図および上面図を示す。 一部の態様に従う、24ピラープレートおよび96ピラープレートの寸法を含む、マイクロアレイをアッセイするのに用いられるピラープレートを示す。 一部の態様に従う、24ピラープレートおよび96ピラープレートの寸法を含む、マイクロアレイをアッセイするのに用いられるピラープレートを示す。 一部の態様に従う、24ピラープレートおよび96ピラープレートの寸法を含む、マイクロアレイをアッセイするのに用いられるピラープレートを示す。 一部の態様に従う、24ピラープレートおよび96ピラープレートの寸法を含む、マイクロアレイをアッセイするのに用いられるピラープレートを示す。 一部の態様に従う、マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリの側面図および正面図を示す。 一部の態様に従う、マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリの側面図および正面図を示す。 一部の態様に従う、マイクロアレイをアッセイする際に工程を行う異なるステージでの、マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリを示す。

図面に示したピラープレートは、ピラープレート、例えば、ピラープレートのピラーの上面にマイクロアレイが付けられてもよいが、これらのマイクロアレイは図面に明示的に示されないことが本開示に基づいて理解すべきである。

詳細な説明
本開示は、気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイをアッセイするための方法、ツール、ピラープレート、およびツールアセンブリについて説明する。マイクロアレイをアッセイするためのツールおよびツールアセンブリは、クランプおよびピラープレートのいくつかの新規の配置を含み、プレートにはマイクロアレイが付けられている。前記のツールおよびツールアセンブリを用いると、ツールのマウント部分に対して0でない傾斜角でピラープレートを動かすことが可能になる。一部の態様は、複数のピラーを備え、ピラーの少なくとも1つに1つまたは複数のマイクロアレイが付けられ、ピラーが下に向いている逆ピラープレートに関する。一部の態様において、マイクロアレイは、周知の技法、例えば、下記でさらに詳細に説明される合成によって、マイクロアレイの支持体上で合成された別個の分析物検出領域または生体分子プローブを用いて官能化される。

マイクロアレイがアッセイ溶液の中に浸漬されたときに、傾斜角が0でなければ、気泡が生じてその後マイクロアレイ付近に溜まる可能性が小さくなる。本開示のツールおよびツールアセンブリは単回で用いられてもよく、何回も用いられてもよい。一部の態様において、ツールおよびツールアセンブリ(例えば、クランプおよびプレート)は使い捨てである。

定義
特許請求の範囲および明細書において用いられる用語は、他で特定しない限り、以下で示されるように定義される。

本明細書で使用する「ウェーハ」という用語は、集積回路製作において一般的に用いられる半導体材料、例えば、ケイ素またはゲルマニウム結晶の薄片を指す。ウェーハは、様々なサイズ、例えば、ある寸法に沿って25.4mm(1インチ)〜300mm(11.8インチ)をとってもよく、厚さは、例えば、275μm〜775μmである。

本明細書で使用する「フォトレジスト」または「レジスト」または「光活性材料」という用語は、紫外線または遠紫外線に露光されたときに溶液中での溶解度が変わる感光性材料を指す。フォトレジストは、典型的に、2つのタイプ:ポジティブレジストおよびネガティブレジストに分けられる、有機化合物または無機化合物である。ポジティブレジストは、露光されたフォトレジスト部分がフォトレジスト現像剤に溶けるようになるフォトレジストの一種である。露光されなかったフォトレジスト部分はフォトレジスト現像剤に溶けないままである。ネガティブレジストは、露光されたフォトレジスト部分がフォトレジスト現像剤に溶けなくなるフォトレジストの一種である。露光されなかったフォトレジスト部分はフォトレジスト現像剤によって溶解される。

本明細書で使用する「フォトマスク」または「レチクル」または「マスク」という用語は、光を通すことができる光透過性のパターンまたは穴を備えた光不透過性の板を指す。典型的な露光プロセスでは、フォトレジスト上にフォトマスクのパターンが移される。

本明細書で使用する「カップリング分子」という用語は、一つの態様では、アミノ基がフルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)またはtert-ブチルオキシカルボニル(boc)基で保護されている任意の天然アミノ酸または人工合成アミノ酸を含む。これらのアミノ酸は任意で側鎖が保護されていてもよい。カップリング分子の例にはboc-Gly-COOH、Fmoc-Trp-COOHが含まれるが、これに限定されない。カップリング分子の他の態様は、カップリングするとポリマーを形成することができる単量体分子およびその組み合わせ、例えば、ヌクレオチド、糖などを含み、以下で説明される。

本明細書で使用する「カップリング」または「カップリングプロセス」または「カップリング工程」という用語は、リンカー分子またはカップリング分子などの2つ以上の分子間で結合を形成するプロセスを指す。結合はペプチド結合などの共有結合でもよい。ペプチド結合は、一方のカップリング分子のカルボキシル基が他方のカップリング分子のアミノ基と反応して水分子(H₂O)を放出するときに2つの分子間で形成される化学結合でもよい。これは脱水合成反応(縮合反応とも知られる)であり、通常、アミノ酸間で発生する。結果として生じた-C(=O)NH-結合はペプチド結合と呼ばれ、結果として生じた分子はアミドである。

本明細書で使用する「ポリペプチド」、「ペプチド」、または「タンパク質」という用語は、結合によって連結されたアミノ酸の鎖またはポリマーについて述べるために同義に用いられる。従って、本明細書で使用する「ペプチド」という用語は、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、およびポリペプチドを含む。「ペプチド」という用語はアミノ酸の任意の特定の数に限定されない。一部の態様において、ペプチドは約2〜約50アミノ酸、約5〜約40アミノ酸、または約5〜約20アミノ酸を含有する。酵素を含むタンパク質またはポリペプチドなどの分子は、自然の中で天然に発生したことを意味する「天然」または「野生型」分子でもよく、天然分子または別の分子、例えば、変異体から作られている、変えられている、得られているか、何らかの点で異なるか、または変わっていることを意味する「変異体」、「変種」、「誘導体」、または「改変」でもよい。「点変異」は、ペプチド配列中のアミノ酸の中の1個のアミノ酸の変異を指す。

本明細書で使用する「バイオマーカー」という用語は、DNA、RNA、タンパク質(例えば、キナーゼなどの酵素)、ペプチド、糖、塩、脂肪、脂質、イオンなどを含むが、これに限定されない。

本明細書で使用する「リンカー分子」または「スペーサー分子」という用語は、結果として生じたペプチドにいかなる機能も付け加えないが、ペプチドの間隔をあけ、支持体からペプチドを伸ばし、従って、支持体表面と、成長しているペプチドとの間の距離を広げる任意の分子を含む。これにより、一般的に、ペプチドが関与する反応(単分子フォールディング反応および多分子結合反応を含む)の場合、支持体との立体障害が減り、そのため、ペプチド機能の1つまたは複数の態様を測定するアッセイの成績が改善される。

本明細書で使用する「現像剤」という用語は、露光された、または露光されなかった材料を選択的に溶解することができる溶液を指す。典型的には、現像剤は、微量の塩基が添加された水をベースとする溶液である。例には、水をベースとする現像剤に溶解したテトラメチルアンモニウムヒドロキシドが含まれる。現像剤は、市販のフォトレジストが用いられる初回パターンの画定に用いられる。

本明細書で使用する「保護基」という用語は、後の化学反応における化学選択性を得るために官能基の化学修飾によって分子に導入された基を含む。「化学選択性」とは、化学反応を望ましい経路に向けて、予め選択された産物を別の産物と比較して得ることを指す。例えば、保護基としてbocを使用すると、光マスクおよび光酸発生剤を用いたペプチド合成の化学選択性によって保護基は選択的に除去され、光マスクによって規定された場所における予め決められた直接的なペプチドカップリング反応の発生が可能になる。

本明細書で使用する「マイクロアレイ」、「アレイ」、または「チップ」という用語は、タンパク質または特異的DNA結合配列の複数のプローブ分子が別々の場所に、順序づけられたやり方で付けられており、従って、微小アレイを形成している支持体を指す。タンパク質または特異的DNA結合配列は1つまたは複数の異なるタイプのリンカー分子を介してチップの支持体に結合されてもよい。「チップアレイ」とは、複数のチップ、例えば、24個、96個、または384個のチップを有するプレートを指す。

本明細書で使用する「プローブ分子」という用語は、タンパク質、DNA結合配列、抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド核酸(「PNA」)、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ペプチド模倣体、ヌクレオチド模倣体、キレート剤、バイオマーカーなどを指すが、これに限定されない。本明細書で使用する「特徴」という用語は、マイクロアレイに取り付けられている特定のプローブ分子を指す。本明細書で使用する「リガンド」という用語は、1つまたは複数の特徴に結合することができる関心対象の分子、薬剤、分析物、または化合物を指す。

本明細書で使用する「マイクロアレイシステム」または「チップアレイシステム」という用語は、通常、ガラス、プラスチック、またはシリコンチップのような固体平面上にフォーマットされたプローブ分子と、試料を扱うために必要とされる機器(自動ロボット工学)、レポーター分子を読み取るために必要とされる機器(スキャナ)、およびデータを解析するために必要とされる機器(生物情報学ツール)からなるシステムを指す。

本明細書で使用する「パターン領域」または「パターン」または「場所」という用語は、様々な特徴が成長される支持体上の領域を指す。これらのパターンはフォトマスクを用いて定めることができる。

本明細書で使用する「誘導体化」という用語は、表面が生体分子合成に適するように表面を化学修飾するプロセスを指す。典型的には、誘導体化は、以下の工程:支持体を親水性にする工程、アミノシラン基を付加する工程、およびリンカー分子を取り付ける工程を含む。

本明細書で使用する「キャッピング」または「キャッピングプロセス」または「キャッピング工程」という用語は、取り付けられた分子のさらなる反応を阻止する分子の付加を指す。例えば、ペプチド結合のさらなる形成を阻止するために、典型的に、無水酢酸分子の存在下でアミノ基がアセチル化によってキャッピングされる。

本明細書で使用する「拡散」という用語は、高濃度の領域から低濃度の領域へのランダムな運動を介した、例えば、光酸の広がりを指す。

本明細書で使用する「色素分子」という用語は、典型的に、支持体に結合することができる有色物質である色素を指す。色素分子は、アレイ上にある特徴と、リガンド、例えば、関心対象の分子との間の結合の検出において有用であり得る。

本明細書で使用する「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と、その免疫グロブリンが特異性を示す抗原との間で発生するタイプの非共有結合相互作用を指す。

本明細書で使用する「生物学的試料」という用語は、関心対象の分析物または任意のリガンドについてアッセイすることができる生物学的な組織または液体に由来する試料を指す。このような試料には、痰、羊水、血液、血球(例えば、白血球)、組織もしくは細針生検試料、尿、腹水、および胸膜液、またはこれに由来する細胞が含まれるが、これに限定されない。生物学的試料はまた、組織切片、例えば、組織学的目的で採取された凍結切片を含んでもよい。試料は典型的にヒト患者から採取されるが、アッセイは、任意の生物(例えば、哺乳動物、細菌、ウイルス、藻類、もしくは酵母)または哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、およびブタに由来する試料中の関心対象の分析物を検出するのに使用することができる。試料は、必要に応じて、適切な緩衝溶液で希釈することによって調製されてもよく、所望であれば濃縮されてもよい。

本明細書で使用する「アッセイ」という用語は、物質の複合混合物を含有し得る溶液中にある関心対象の物質の存在または濃度を測定する生化学的試験の一種を指す。

本明細書で使用する「抗原」という用語は、対象の免疫系によって免疫応答、例えば、免疫系による抗体の産生を誘発する分子を指す。抗原は外因性でもよく、内因性でもよく、自己抗原でもよい。外因性抗原とは、吸入、摂取、または注射を介して外部から身体に入った抗原である。内因性抗原とは、正常細胞代謝の結果として、またはウイルス感染もしくは細胞内細菌感染の結果として、以前は正常であった細胞内に発生した抗原である。自己抗原は、宿主体内に存在する正常なタンパク質またはタンパク質複合体であるが、免疫応答を刺激することができる抗原である。

本明細書で使用する「エピトープ」または「免疫活性領域」という用語は、適応免疫系の成分、例えば、抗体またはT細胞受容体が結合することができる、抗原の別個の分子表面特徴を指す。抗原分子は、特異的な抗体の相互作用点として作用し得る、いくつかの表面特徴を提示し得る。このような別個の分子特徴は全てエピトープを構成し得る。従って、抗原には、いくつかの別個の抗体が結合する能力があり、これらの抗体はそれぞれ特定のエピトープに特異的である。

本明細書で使用する「抗体」または「免疫グロブリン分子」という用語は、特定のタイプの免疫系細胞:B細胞によって天然に分泌される分子を指す。抗体には5つの異なる天然アイソタイプ、すなわち、IgA、IgM、IgG、IgD、およびIgEがある。

2つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の状況でのパーセント「同一性」という用語は、下記の配列比較アルゴリズムの1つ(例えば、当業者が利用可能なBLASTPおよびBLASTNもしくは他のアルゴリズム)を用いて、または目視検査によって測定されたときに、最大限一致するように比較およびアラインメントされたときに同一である特定のパーセントのヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する2つ以上の配列または部分配列を指す。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較されている配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在してもよく、比較しようとする2つの配列の完全長にわたって存在してもよい。

配列比較の場合、典型的には、ある配列が参照配列として働き、参照配列と試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列はコンピュータに入力され、必要に応じて、部分配列の座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて参照配列と比較して試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Smith & Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性手法のための検索、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisの中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または目視検査によって行うことができる(概して、Ausubel et al., 下記を参照されたい)。

パーセント配列同一性および配列類似性を求めるのに適したアルゴリズムの一例は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載のBLASTアルゴリズムである。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、米国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトから公的に入手することができる。

明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、特に文脈によってはっきり規定されていない限り複数の指示物を含むことに留意しなければならない。

組成物
マイクロアレイをアッセイするためのツール
一部の態様において、マイクロアレイをアッセイするためのツールは2つのクランプを備え、各クランプは、(1)マイクロアレイを備えるピラープレートを動かすために、プレートハンドリングロボットのリフト機構と係合するように構成されているツールマウント部分と、(2)ツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角の傾きでピラープレートを自由につり下げるように構成されている把持部分とを備える。一部の態様において、0でない傾斜角は、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°、または30°である。一部の態様において、0でない傾斜角は5°〜30°の範囲内であるか、30°より少ないかもしくはこれに等しいか、または45°より少ないかもしくはこれに等しい。

一部の態様において、マイクロアレイは、周知の技法、例えば、下記でさらに詳細に説明される合成によって、マイクロアレイの支持体上で合成された別個の分析物検出領域または生体分子プローブを用いて官能化される。一部の態様において、マイクロアレイ上にある生体分子プローブをアッセイしている間に、ピラープレートが上下反転されたときに、マイクロアレイが少なくとも1つのピラーから移動しないように、1つまたは複数のマイクロアレイはピラープレートの少なくとも1つのピラーに付けられている。一部の態様において、マイクロアレイは接着剤でピラーの上面に付けられている。一部の態様において、接着剤は、エポキシ、可視光硬化性エポキシ、紫外線硬化性グルー、または熱硬化性グルーエポキシである。

前記ツールは、ピラープレートを扱い、マイクロアレイをアッセイする工程を行うロボットプレートシステムにおいて用いられてもよい。一部の態様において、前記ツールは、様々なアッセイモジュール(例えば、プレート、ディップスティック(dipstick)、測定セル、カセット、カートリッジ、要素、もしくは装置)、プレートまたはモジュール部品、およびルミネセンスに基づくアッセイを行うための器具と組み合わせて用いられる。

ロボットプレートシステム
図1は、一部の態様に従う、ロボットプレートシステムの一部としてのツールおよびツールアセンブリを図示する。ロボットプレートシステム100は、クランプ110と、リフト機構に連結しているクランプアーム120と、1つまたは複数のマイクロアレイが少なくとも1つのピラー140に取り付けられているピラープレート130と、ワークベンチ160上に配置され様々なアッセイ溶液を含むウェルプレート150を備える。ピラープレートの図示されたアッセイプロセスは、以下の6つの工程を含んだ:メタノールが充填された第1のウェルプレートの中にピラープレートを配置し、洗浄する工程；第1のウェルプレートからピラープレートを引き上げ、洗浄のためにTBSが充填された第2のウェルプレートに移す工程。第3の工程では、このプロセスによって、ピラープレートは、一次抗体とのインキュベーションのために第3のウェルプレートの中に配置される。それに続いて、ピラープレートは、PBSTを含む第4のウェルプレートの中で洗浄される。次の工程は、二次抗体とのインキュベーションのためにピラープレートを第5のウェルプレートの中に配置する工程を含む。それに続いて、ピラープレートは、PBSTを含む第6のウェルプレートの中で洗浄され、次いで、DI水を含む第7のウェルプレートの中で洗浄された後に、さらなる分析のために窒素内で乾燥される。

それぞれのアッセイ工程の間に、クランプ110と、リフト機構に連結しているクランプアーム120を用いて、システム100のプレートハンドリングロボットはピラープレート130を、ワークベンチ160上にある1つのウェルプレート150から、隣接するウェルプレート150に動かす。図1に示したように、ピラープレートをワークベンチ160に沿って動かしているときに、クランプ110の把持部分は、ピラープレートに対して、プレートの側面に沿った、中央からずれた位置170でピラープレート130と係合する。中央からずれた位置170で係合すると、ピラープレートの両端190を引っ張っている重力が釣り合わなくなるために、クランプ110のツールマウント部分180に対するピラープレート130の傾きは、0でない角度になる。一部の態様において、中央からずれた位置は、ロボットプレートシステムによってピラープレートが動かされる方向に向いているピラープレート末端の方に近い。一部の態様において、中央からずれた位置は、ロボットプレートシステムによってピラープレートが動かされる方向とは反対のピラープレート末端の方に近い。中央からずれた位置に基づいて、中央からずれた位置がピラープレートの中央から遠くなるにつれて、0でない傾斜角は大きくなり、中央からずれた位置がピラープレートの中央に近づくにつれて、0でない傾斜角は小さくなる。

図1に示したように、前記ツールは、マイクロアレイをアッセイしている間に、クランプ110のマウント部分170に対して0でない傾斜角でピラープレート130を持ち上げ、動かすのを可能にする。一部の態様において、ロボットプレートシステム100は、アッセイ溶液をウェルプレートに供給し、マイクロアレイをアッセイするためにリキッドハンドリングを行うように自動化されたリキッドハンドリングアッセイステーションを備える。一部の態様において、リキッドハンドリングアッセイステーションは、標準的な、またはオーダーメイドのウェルプレートを使用することができる任意の市販のリキッドハンドリングアッセイステーションである。

ロボットプレートシステム100を用いてアッセイが行われた後に、1つまたは複数のマイクロアレイは、任意の市販の共焦点スキャナ、CCDスキャナ、sCMOSスキャナ、またはCMOSスキャナを用いてスキャンされる。一部の態様において、スキャナは複数のマイクロアレイをスキャンする。一部の態様において、スキャナからのデータはVibrant Bio Analyzerによって解析される。

一部の態様において、1個またはいくつかのオートローダユニットが、ピラープレート130をロボットプレートシステム100に送り込む。一部の態様において、1個またはいくつかのオートローダユニットは、ウェルプレート150をワークベンチ160の上に配置する。一部の態様において、マイクロアレイは、オートローダを用いてスキャナによってスキャンされる。一部の態様において、アッセイされるマイクロアレイを備えるピラープレート130を、1つまたは複数のスキャナにオートローダが移すことができるようにするために、1個またはいくつかのスキャナはオートローダに接続される。

一部の態様において、前記ツールは、ピラープレートに付けられたマイクロアレイをスキャンするのに用いられる。一部の態様において、クランプ110の把持部分は、ピラープレートに対して、側面に沿って、中央195にある位置でピラープレート130と係合する。マイクロアレイをスキャンするためには、ピラープレートがスキャナの下で動かされているときには、プレートのピラーは上向きになっている。中央位置で係合すると、クランプ110のツールマウント部分180に対して、ピラープレートの傾きは0°になる。この場合、ピラープレートの両端190を引っ張っている重力は互いに釣り合っている。

クランプ
図2Aおよび図2Bは、それぞれ、一部の態様に従う、2つのクランプ110の側面図および上面図を図示する。各クランプ110はツールマウント部分210と把持部分220を備える。ツールマウント部分は、ピラープレートを動かすために、クランプアームを介してロボットプレートシステムのリフト機構と係合するように構成されている。把持部分220は、ツールマウント部分210に垂直な平面に対して0でない傾斜角の傾きでピラープレートを自由につり下げるように構成されている。

一部の態様において、0でない傾斜角は、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°、または30°である。一部の態様において、0でない傾斜角は、(図2Aに示したように)5°〜30°の範囲内であるか、30°より少ないかもしくはこれに等しいか、または45°より少ないかもしくはこれに等しい。

一部の態様において、把持部分220は内面230および外面240を備える。ツールのクランプがピラープレートと係合して、ピラープレートをつり下げ、動かしているときに、内面230はピラープレートに面しており、ピラープレートと接触している。一部の態様において、各クランプの把持部分は2対の収容バー245および250を備える。第1の対の収容バー245は第1の垂直方向の幅255で隔てられ、第2の対の収容バー250は第2の垂直方向の幅260で隔てられている。従って、それぞれの対の収容バーは、ピラープレートの突出端部を収容するための、幅が異なる別個のスロート(throat)を形成する。

一部の態様において、第1の垂直方向の幅は、予め規定された閾値距離の分だけ第2の垂直方向の幅より広く、ピラープレートはツールの2つのクランプによって自由につり下げられている場合、0でない傾斜角をとる。一部の態様において、予め規定された閾値距離は、ある係数を第1の垂直方向の幅で掛けたものに等しく、この係数は1〜2の範囲内である。一部の態様において、第1の垂直方向の幅は2.75mmである。一部の態様において、第1の垂直方向の幅は5.5mmより狭い。一部の態様において、第1の垂直方向の幅は1mm〜5mmの範囲内である。一部の態様において、第1の垂直方向の幅は、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、または5mmである。一部の態様において、第1の垂直方向の幅は5mmより広い。一部の態様において、第2の垂直方向の幅は5.5mmより狭い。一部の態様において、第2の垂直方向の幅は5.5mmより広い。

一部の態様において、図2Aに示したように、2対の収容バーの上部収容バー265a、265bは、0でない傾斜角で並べられ、下部収容バー270a、270bはツールマウント部分に垂直な平面に対して平行に並べられる。一部の態様において、クランプは、2対より多い収容バーを備える。一部の態様において、2対の収容バーは1対の収容バーを形成するように接続されている。

一部の態様において、収容バー245、250はクランプの内面230から垂直に伸びている。一部の態様において、収容バーは、把持部分の内面から0.5mm〜5mmの範囲内にある距離だけ張り出している。一部の態様において、収容バーは内面から1mm、張り出している。一部の態様において、収容バーは収容バーの端部の内面から5mm未満、張り出している。一部の態様において、収容バーは内面から0.5mm超、張り出している。一部の態様において、収容バーの端部は、ピラープレートの突出端部の収容を容易にするために傾斜が付けられているか、または丸みが付けられている。

一部の態様において、ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられておらず、その代わりに、ウェルプレートの1つまたは複数のウェル内でアッセイ溶液に浮いている場合、2つのクランプの把持部分は、ツールマウント部分に垂直な平面に対して、平行にピラープレートの平面が並ぶのを可能にするように構成されている。例えば、下部収容バー270a、270bは、ツールマウント部分210に垂直に一直線に並んで内面上に配置されている。

ピラープレート
図3A〜3Dは、一部の態様に従う、マイクロアレイをアッセイするためのピラープレートを図示する。図3Aは、mmの単位で示したプレートの寸法を含む、96ピラープレート130の一態様の上面図を示す。一部の態様において、ピラープレート130は、ピラープレート130の反対側315に2つの突出端部310を備える。突出端部は、ピラープレートをつり下げるためにクランプの把持部分と係合するように構成されている。

一部の態様において、ピラープレート130は、ピラー335を取り付ける際に、1つまたは複数のアライメントマーク320、プレート支持体325、およびベース領域330をさらに備える。一部の態様において、図3Aに示したように、アライメントマーク320はプレート支持体325の両側の中央にある。一部の態様において、図3Cおよび図3Dに示したように、アライメントマーク320はプレート支持体325の向い合わせの隅に配置される。一部の態様において、図3Cおよび図3Dに示したようにピラー140は円筒形である。図3Aに示した態様では、ピラーは、傾斜が付けられた端部のある長方形の形を有する。他の態様は、当業者に公知の様々な形状およびサイズのピラーを含む。一部の態様において、ピラープレートの面積は50平方センチメートルより大きい。

一部の態様において、図3Bに示したように、ピラープレートは、ピラープレートからほぼ垂直に伸びている複数のピラーを備える。一部の態様において、ピラープレートが上下反転されたときに、各マイクロアレイが少なくとも1つのピラーから移動しないように、1つまたは複数のマイクロアレイは少なくとも1つのピラーに付けられる。

一部の態様において、マイクロアレイは、周知の技法、例えば、下記でさらに詳細に説明される合成によって、マイクロアレイの支持体上で合成された別個の分析物検出領域または生体分子プローブを用いて官能化される。一部の態様において、マイクロアレイはウェーハを含む。一部の態様において、マイクロアレイは支持層を含む。一部の態様において、支持層は、さらなる特徴、例えば、マイクロピラーを含む。一部の態様において、マイクロアレイ上にある生体分子プローブをアッセイしている間に、ピラープレートが上下反転されたときに、マイクロアレイが少なくとも1つのピラーから移動しないように、1つまたは複数のマイクロアレイはピラープレートの少なくとも1つのピラーに付けられる。一部の態様において、マイクロアレイは接着剤でピラーの上面に付けられる。一部の態様において、接着剤は、エポキシ、可視光硬化性エポキシ、紫外線硬化性グルー、または熱硬化性グルーエポキシである。

一部の態様において、本明細書において開示されたマイクロアレイはチップアレイを備える。一部の態様において、チップアレイは、プレート上にあるマイクロアレイ(「チップ」)の二次元アレイである。一部の態様において、各マイクロアレイは1種類のタンパク質または抗体しか含まない。他の態様において、各マイクロアレイは、複数種のタンパク質、抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA、ペプチド核酸(「PNA」)、プローブ分子などを含む。一部の態様において、マイクロアレイは、ピラープレート上にあるピラーに付着するキャップに取り付けられる。

一つの態様において、マイクロアレイが、支持層であるシリコンウェーハ上に形成され、次いで、様々な寸法の複数のチップに分割される。一部の態様において、各マイクロアレイの寸法は1mmx1mmから2cm〜2cmまでである。一部の態様において、マイクロアレイはウェーハ上に形成され、24ピラープレート、96ピラープレート、192ピラープレート、もしくは384ピラープレート、または他の任意のオーダーメイドプレートとぴったり合う複数のマイクロアレイに分割される。一部の態様において、ピラープレートは、タンパク質間相互作用アッセイまたは他の酵素反応などのインビトロ診断に用いられる。

一部の態様において、ピラープレートは複数のピラーを備える。一部の態様において、ピラープレートのピラーの数は、24個、96個、384個、または1536個のピラーである。図3Bもまたピラープレートの両側に2つの突出端部を備えるピラープレートを図示する。一部の態様において、ピラーには上面340および底面345があり、底面はベース領域330に取り付けられている。一部の態様において、突出端部310はプレート支持体325から1mm、張り出している。一部の態様において、突出端部310はプレート支持体から1mm未満、張り出している。一部の態様において、突出端部310はプレート支持体から1mm超、張り出している。一部の態様において、突出端部310は、0.5mm〜5mmの範囲内にある距離だけプレート支持体から張り出している。一部の態様において、図3Bに示したように、突出端部はプレート支持体の側壁350の中央から張り出している。態様では、突出端部は、中央からずれた側壁340の領域、例えば、側壁350の下端部355または上端部360から張り出している。

図3Cおよび図3Dに示したように、一部の態様において、ピラープレートは外縁壁365を備える。一部の態様において、図3Dに示したように、突出端部310は、プレート支持体325ではなく外縁壁365から伸びている。一部の態様において、突出端部、アライメントマーク、プレート支持体、ベース領域、ピラー、外縁壁はプレートピラーの一体成形された特徴である。

マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリ
図4Aおよび図4Bは、一部の態様に従う、2つのクランプとピラープレートを備えるツールを備える、マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリの側面図および正面図を図示する。示した態様では、ピラープレートが2つのクランプによってつり下げられているときに、2つの突出端部はそれぞれ両方とも、2つのクランプのうちの1つの2対の収容バーと別々に噛み合わされている。さらに、一部の態様では、ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられていないときに、2つの突出端部はそれぞれ両方とも、2つのクランプのうちの1つの2対の収容バーと別々に噛み合わされている。図4Aおよび図4Bにおいて、つり下げられたピラープレートは、0でない傾斜角(5°〜30°)で示されている。図4Bは、ピラープレートの底面410(網掛けされている領域)を示したツールアセンブリの正面図を図示する。さらに、図4Aおよび図4Bは、中央からずれた位置170を図示する。中央からずれた位置170で、クランプの把持部分はピラープレートの突出端部310と噛み合っている。

一部の態様において、ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられている場合、2つのクランプそれぞれの2対の収容バーの上部収容バーは、個々に、または組み合わせて、ピラープレートの噛み合わせられた突出端部に下向きの力を加えるように構成されている。一部の態様において、ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられている場合、第2の対の収容バーの下部収容バーは、ピラープレートの噛み合わせられた突出端部に上向きの力を加えるように構成されている。

一部の態様において、ピラープレートの1つまたは複数のピラーが、ウェルプレートの1つまたは複数のウェル内にあるアッセイ溶液中で閾値深さ以上に浸漬されていれば、ツールアセンブリに含まれる2つのクランプは、ツールマウント部分に垂直な平面に対して、平行にピラープレートが並ぶのを可能にするように構成されている。

一部の態様において、ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられていない場合、2つのクランプの前記対の収容バーの下部収容バーは、個々に、または組み合わせて、ピラープレートの噛み合わせられた突出端部に上向きの力を加えるように構成されている。一部の態様において、ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられていなければ、2つのクランプの第2の対の収容バーの上部収容バーは、ピラープレートの噛み合わせられた突出端部に下向きの力を加えるように構成されている。

ツールアセンブリの一部の態様において、ピラープレートのピラーの数は24、96、384、および1536からなる群より選択される。ツールアセンブリの一部の態様において、ピラープレートの面積は50平方センチメートルより大きい。

ツールアセンブリの一部の態様において、2つのクランプはそれぞれ、(1)マイクロアレイを備えるピラープレートを動かすために、プレートハンドリングロボットのリフト機構と係合するように構成されているツールマウント部分と、(2)ツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角の傾きでピラープレートを自由につり下げるように構成されている把持部分とを備える。

一部の態様において、0でない傾斜角は、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°、または30°である。一部の態様において、0でない傾斜角は5°〜30°の範囲内であるか、30°より少ないかもしくはこれに等しいか、または45°より少ないかもしくはこれに等しい。

一部の態様において、マイクロアレイは、周知の技法、例えば、下記でさらに詳細に説明される合成によって、マイクロアレイの支持体上で合成された別個の分析物検出領域または生体分子プローブを用いて官能化される。一部の態様において、マイクロアレイ上にある生体分子プローブをアッセイしている間に、ピラープレートが上下反転されたときに、マイクロアレイが少なくとも1つのピラーから移動しないように、1つまたは複数のマイクロアレイはピラープレートの少なくとも1つのピラーに付けられる。一部の態様において、マイクロアレイは接着剤でピラーの上面に付けられる。一部の態様において、接着剤は、エポキシ、可視光硬化性エポキシ、紫外線硬化性グルー、または熱硬化性グルーエポキシである。

マイクロアレイ
マイクロアレイも本明細書において開示される。マイクロアレイ(「チップ」)の態様は、支持体表面の、位置が定められた場所に取り付けられた支持体および特徴を含む。

一部の態様において、マイクロアレイは、位置が定められた場所が2次元面を占める二次元アレイを含む。例えば、それぞれの特徴は、決定可能な配列および意図された長さのペプチド鎖のコレクションを含んでもよい。ここで、独特の特徴の中で、意図された長さを有する前記コレクションの中にあるペプチド鎖の一部分は、約98％のそれぞれのカップリング工程の平均カップリング効率を特徴とする。一部の態様において、それぞれのカップリング工程の平均カップリング効率は少なくとも98.5％である。一部の態様において、それぞれのカップリング工程の平均カップリング効率は少なくとも99％である。一部の態様において、それぞれのカップリング工程の平均カップリング効率は、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、または100％である。

一部の態様において、支持体表面に取り付けられる特徴は、タンパク質、DNA結合配列、抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド核酸、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ペプチド模倣体、ヌクレオチド模倣体、キレート剤、バイオマーカーなどからなる群より選択される。

一部の態様において、マイクロアレイの支持体表面は、ポリペプチド合成のために遊離アミンまたは遊離カルボン酸によって官能化される。一部の態様において、遊離カルボン酸は、例えば、マイクロアレイ表面上でのポリペプチド合成の間に、アミン基に結合するように活性化される。

一部の態様において、マイクロアレイ上の特徴の表面密度は、10/cm²、100/cm²、1,000/cm²、10,000/cm²、100,000/cm²、1,000,000/cm²、10,000,000/cm²または20,000,000/cm²より大きい。一部の態様において、マイクロアレイ上の特徴の総数は、少なくとも約100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、10,000,000、12,000,000、14,000,000、16,000,000、または18,000,000である。他の態様において、マイクロアレイのサイズは、0.1平方ミリメートル、0.2平方ミリメートル、0.3平方ミリメートル、0.4平方ミリメートル、0.5平方ミリメートル、0.6平方ミリメートル、0.7平方ミリメートル、0.8平方ミリメートル、0.9平方ミリメートル、1平方ミリメートル、2平方ミリメートル、3平方ミリメートル、4平方ミリメートル、5平方ミリメートル、6平方ミリメートル、7平方ミリメートル、8平方ミリメートル、9平方ミリメートル、10平方ミリメートル、15平方ミリメートル、20平方ミリメートル、25平方ミリメートル、30平方ミリメートル、35平方ミリメートル、40平方ミリメートル、45平方ミリメートル、50平方ミリメートル、55平方ミリメートル、60平方ミリメートル、65平方ミリメートル、70平方ミリメートル、75平方ミリメートル、80平方ミリメートル、85平方ミリメートル、90平方ミリメートル、95平方ミリメートル、100平方ミリメートル、110平方ミリメートル、120平方ミリメートル、130平方ミリメートル、140平方ミリメートル、150平方ミリメートル、160平方ミリメートル、170平方ミリメートル、180平方ミリメートル、190平方ミリメートル、200平方ミリメートル、250平方ミリメートル、300平方ミリメートル、400平方ミリメートル、500平方ミリメートル、600平方ミリメートル、700平方ミリメートル、800平方ミリメートル、900平方ミリメートル、もしくは1,000平方ミリメートルより少ないか、またはこれに等しい。

一部の態様において、マイクロアレイは、三次元アレイ、例えば、多孔層を備え、特徴が多孔層の表面に取り付けられている支持体でもよい。一部の態様において、多孔層の表面は、外面および多孔層内の孔容積を規定する表面を含む。一部の態様において、三次元マイクロアレイは、表面の、位置が定められた場所に取り付けられた特徴を含んでもよい。前記特徴はそれぞれ、決定可能な配列および意図された長さのペプチド鎖のコレクションを含む。一つの態様において、独特の特徴の中で、意図された長さを有する前記コレクションの中にあるペプチド鎖の一部分は、98％を超えるそれぞれのカップリング工程の平均カップリング効率を特徴とする。一部の態様において、それぞれのカップリング工程の平均カップリング効率は、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、または100％である。

一部の態様において、それぞれのペプチド鎖は長さが5〜60アミノ酸である。一部の態様において、それぞれのペプチド鎖は長さが少なくとも5アミノ酸である。一部の態様において、それぞれのペプチド鎖は長さが少なくとも5アミノ酸、10アミノ酸、15アミノ酸、20アミノ酸、25アミノ酸、30アミノ酸、35アミノ酸、40アミノ酸、45アミノ酸、50アミノ酸、55アミノ酸、または60アミノ酸である。一部の態様において、それぞれのペプチド鎖は長さが5アミノ酸より少ないか、少なくとも5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、12アミノ酸、13アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、16アミノ酸、17アミノ酸、18アミノ酸、19アミノ酸、20アミノ酸、21アミノ酸、22アミノ酸、23アミノ酸、24アミノ酸、25アミノ酸、26アミノ酸、27アミノ酸、28アミノ酸、29アミノ酸、30アミノ酸、31アミノ酸、32アミノ酸、33アミノ酸、34アミノ酸、35アミノ酸、36アミノ酸、37アミノ酸、38アミノ酸、39アミノ酸、40アミノ酸、41アミノ酸、42アミノ酸、43アミノ酸、44アミノ酸、45アミノ酸、46アミノ酸、47アミノ酸、48アミノ酸、49アミノ酸、50アミノ酸、51アミノ酸、52アミノ酸、53アミノ酸、54アミノ酸、55アミノ酸、56アミノ酸、57アミノ酸、58アミノ酸、59アミノ酸、60アミノ酸であるか、または60アミノ酸より多い。一部の態様において、それぞれのペプチド鎖は1つまたは複数のLアミノ酸を含む。一部の態様において、それぞれのペプチド鎖は1つまたは複数のDアミノ酸を含む。一部の態様において、それぞれのペプチド鎖は1つまたは複数の天然アミノ酸を含む。一部の態様において、それぞれのペプチド鎖は1つまたは複数の合成アミノ酸を含む。

一部の態様において、マイクロアレイは、表面に取り付けられた少なくとも1,000の異なるペプチド鎖を含んでもよい。一部の態様において、マイクロアレイは、表面に取り付けられた少なくとも10,000の異なるペプチド鎖を含んでもよい。一部の態様において、マイクロアレイは、表面に取り付けられた少なくとも100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000の、もしくは10,000(またはその間の任意の整数)より多い異なるペプチド鎖を含んでもよい。

一部の態様において、マイクロアレイは、複数の異なるタイプのリンカー分子に取り付けられた1種類のタンパク質、ペプチド鎖、または抗体を含んでもよい。一部の態様において、マイクロアレイは少なくとも2つの異なるタイプのリンカー分子を含んでもよい。一部の態様において、マイクロアレイは、支持体に取り付けられた少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75の、または100より多い異なるタイプのリンカー分子を含んでもよい。

一部の態様において、位置が定められた場所はそれぞれ、他の位置が定められた場所のそれぞれと物理的に分離された異なる既知の場所にある。一部の態様において、位置が定められた場所はそれぞれ、位置が区別できる場所である。一部の態様において、それぞれの決定可能な配列は既知配列である。一部の態様において、それぞれの決定可能な配列は別個の配列である。

一部の態様において、特徴は表面に共有結合的に取り付けられる。一部の態様において、前記ペプチド鎖はリンカー分子またはカップリング分子を介して表面に取り付けられる。

一部の態様において、前記特徴は、既知配列を有する供給源タンパク質に由来する部分配列を含む複数の別個の入れ子状の重複ペプチド鎖を含む。一部の態様において、複数の重複ペプチド鎖の中にある、それぞれのペプチド鎖は実質的に同じ長さである。複数の重複ペプチド鎖の中にある、それぞれのペプチド鎖は同じ長さである。一部の態様において、複数の重複ペプチド鎖の中にある、それぞれのペプチド鎖は長さが少なくとも5アミノ酸である。一部の態様において、複数の重複ペプチド鎖の中にある、それぞれのペプチド鎖は長さが少なくとも5アミノ酸、10アミノ酸、15アミノ酸、20アミノ酸、25アミノ酸、30アミノ酸、35アミノ酸、40アミノ酸、45アミノ酸、50アミノ酸、55アミノ酸、または60アミノ酸である。一部の態様において、複数の重複ペプチド鎖の中にある、それぞれのペプチド鎖は長さが5アミノ酸より短いか、少なくとも5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、12アミノ酸、13アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、16アミノ酸、17アミノ酸、18アミノ酸、19アミノ酸、20アミノ酸、21アミノ酸、22アミノ酸、23アミノ酸、24アミノ酸、25アミノ酸、26アミノ酸、27アミノ酸、28アミノ酸、29アミノ酸、30アミノ酸、31アミノ酸、32アミノ酸、33アミノ酸、34アミノ酸、35アミノ酸、36アミノ酸、37アミノ酸、38アミノ酸、39アミノ酸、40アミノ酸、41アミノ酸、42アミノ酸、43アミノ酸、44アミノ酸、45アミノ酸、46アミノ酸、47アミノ酸、48アミノ酸、49アミノ酸、50アミノ酸、51アミノ酸、52アミノ酸、53アミノ酸、54アミノ酸、55アミノ酸、56アミノ酸、57アミノ酸、58アミノ酸、59アミノ酸、60アミノ酸であるか、または60アミノ酸より長い。一部の態様において、複数の重複ペプチド鎖の中にある少なくとも1つのペプチド鎖は長さが少なくとも5アミノ酸である。一部の態様において、複数の重複ペプチド鎖の中にある少なくとも1つのペプチド鎖は長さが少なくとも5アミノ酸、10アミノ酸、15アミノ酸、20アミノ酸、25アミノ酸、30アミノ酸、35アミノ酸、40アミノ酸、45アミノ酸、50アミノ酸、55アミノ酸、または60アミノ酸である。一部の態様において、複数の重複ペプチド鎖の中にある少なくとも1つのペプチド鎖は長さが5アミノ酸より短いか、少なくとも5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、12アミノ酸、13アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、16アミノ酸、17アミノ酸、18アミノ酸、19アミノ酸、20アミノ酸、21アミノ酸、22アミノ酸、23アミノ酸、24アミノ酸、25アミノ酸、26アミノ酸、27アミノ酸、28アミノ酸、29アミノ酸、30アミノ酸、31アミノ酸、32アミノ酸、33アミノ酸、34アミノ酸、35アミノ酸、36アミノ酸、37アミノ酸、38アミノ酸、39アミノ酸、40アミノ酸、41アミノ酸、42アミノ酸、43アミノ酸、44アミノ酸、45アミノ酸、46アミノ酸、47アミノ酸、48アミノ酸、49アミノ酸、50アミノ酸、51アミノ酸、52アミノ酸、53アミノ酸、54アミノ酸、55アミノ酸、56アミノ酸、57アミノ酸、58アミノ酸、59アミノ酸、60アミノ酸であるか、または60アミノ酸より長い。一部の態様において、特徴の中にある、それぞれのポリペプチドは実質的に同じ長さである。一部の態様において、特徴の中にある、それぞれのポリペプチドは同じ長さである。一部の態様において、特徴は複数のペプチド鎖を含み、それぞれのペプチド鎖はアミノ酸のランダムな決定可能な配列を有する。

方法
マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリを使用する方法
支持体、製剤、および/またはマイクロアレイを使用する方法も本明細書において開示される。本明細書において開示されたマイクロアレイの用途は、研究用途、治療目的、医療診断、および/または1人もしくは複数人の患者の層別化を含んでもよい。

図5は、一部の態様に従う、マイクロアレイをアッセイする際に工程を行う異なるステージでの、マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリを図示する。気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリを使用する方法は以下の工程を含む。最初に、説明されたツールアセンブリが準備される。さらに、複数のウェルを備えるウェルプレートが準備される。ピラープレートが、クランプのツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角で傾けられ、マイクロアレイが、ウェルプレートの1つまたは複数のウェル内でアッセイ溶液と接触しているときに、各ウェルはピラープレートの1つのピラーを収容することができる。一部の態様において、ウェルは円筒形または長方形のウェルである。ウェルがピラーを収容できるようになるためには、ウェルの直径は、クランプのツールマウント部分に対して垂直に測定されたときにピラーの横断面の直径より大きい。

次に、ツールアセンブリのピラープレートは、クランプのツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角で傾けた状態で自由につり下げられる。この工程は、ピラープレートが上下反転され、クランプのツールマウント部分がプレートハンドリングロボットのリフト機構と係合している間に、ピラープレートの突出端部とクランプの把持部分を噛み合わせることを含む。自由につり下げられたピラープレートをウェルプレートに近づけて、1つまたは複数のマイクロアレイをウェル内のアッセイ溶液と接触させることによって、ピラープレートの少なくとも1つのピラーに付けられた1つまたは複数のマイクロアレイはアッセイされる。

図5に示したステージは、自由につり下げられた逆ピラープレートの第1のステージのツールアセンブリを含む。第2のステージは、ピラープレートのピラーの1つがウェルの1つの中でアッセイ溶液と接触しているツールアセンブリを示す。両ステージとも、ピラープレートは、0でない傾斜角でつり下げられている。第3のステージは、アッセイ溶液の中に浸漬されたピラープレートのピラーを示す。溶液はピラープレートを浮かせて、ピラープレートに働く重力を打ち消す。第3のステージでは、ピラープレートは、ツールマウント部分に垂直な平面に対して、平行に並べられている。このステージでは、2対の各クランプの下部収容バーは依然としてピラープレートを支えており、このため、ピラーがもっと下に落ちてウェルの中に入ることはない。

本明細書に記載のマイクロアレイはいずれも研究ツールとして、または研究用途において使用することができる。一つの態様において、マイクロアレイはハイスループットスクリーニングアッセイに使用することができる。例えば、酵素基質(すなわち、本明細書に記載のペプチドマイクロアレイ上にあるペプチド)は、マイクロアレイを酵素に供し、マイクロアレイ上での酵素基質の存在または非存在を特定することによって、例えば、マイクロアレイの特徴の中の少なくとも1つの変化を検出することによって試験することができる。

マイクロアレイはまた、基質特異性を確かめるためのリガンド結合のスクリーニングアッセイ、またはタンパク質を阻害もしくは活性化するペプチドを特定するためのスクリーニングアッセイにおいても使用することができる。これらの方法を行うのに有用な標識法、プロテアーゼアッセイ、ならびに結合アッセイは一般的に当業者に周知である。

一部の態様において、マイクロアレイは、既知のタンパク質配列を重複ペプチドの配列として提示するのに使用することができる。例えば、既知タンパク質のアミノ酸配列は任意の長さおよび任意の適切な重複フレームの重複配列セグメントに分けられ、それぞれの配列セグメントに対応するペプチドは、本明細書において開示されたようにインサイチューで合成される。このように合成された個々のペプチドセグメントは、既知タンパク質のアミノ末端から開始して並べることができる。

一部の態様において、既知タンパク質の抗原配列全体がエピトープスライディングによってカバーされている少なくとも1つの領域をマイクロアレイの抗原提示が含む方法において、マイクロアレイが用いられる。抗原の免疫活性領域は、アレイまたは複数の異なるマイクロアレイ上の1つまたは複数の臨床試料を接触させることによって確かめられ、既知のタンパク質抗原を提示するために必要とされるペプチド配列のセットは低減される。

一部の態様において、試料は、複数のランダムペプチドを有するマイクロアレイに適用される。所定の抗原配列と、例えば、90％以上の同一性を有する相同ドメインを確かめるためにランダムペプチドをスクリーニングおよびBLAST検索することができる。次いで、一部の態様では、抗原配列全体を合成および使用して、関心対象の疾患の潜在的なマーカーおよび/または原因を特定することができる。

一部の態様において、マイクロアレイは1種類または複数種の遺伝因子のハイスループットスクリーニングに用いられる。遺伝子に関連するタンパク質は潜在的な抗原となる可能性があり、これらのタンパク質に対する抗体を用いて、遺伝子と疾患との関係を評価することができる。

別の例において、マイクロアレイは1種類または複数種のバイオマーカーを特定するのに使用することができる。バイオマーカーは疾患の診断、予後、処置、および管理に使用することができる。バイオマーカーは、疾患状態、疾患の段階、および疾患処置に対する反応に応じて個体において発現されてもよく、存在しなくてもよく、異なるレベルでもよい。バイオマーカーは、例えば、DNA、RNA、タンパク質(例えば、キナーゼなどの酵素)、糖、塩、脂肪、脂質、またはイオンでもよい。

マイクロアレイはまた、治療目的、例えば、1種類または複数種の生理活性剤の特定にも使用することができる。生理活性剤を特定するための方法は、複数種の試験化合物をマイクロアレイに適用する工程、および生理活性剤として少なくとも1種類の試験化合物を特定する工程を含んでもよい。試験化合物は、低分子、アプタマー、オリゴヌクレオチド、化学物質、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、抗体断片、抗体様分子、または抗体でもよい。生理活性剤は治療剤または治療標的の修飾物質でもよい。治療標的は、ホスファターゼ、プロテアーゼ、リガーゼ、シグナル伝達分子、転写因子、タンパク質輸送体、タンパク質ソーター、細胞表面受容体、分泌因子、および細胞骨格タンパク質を含んでもよい。

別の態様において、マイクロアレイは、治療用の薬物候補を特定するのに使用することができる。例えば、特異的抗体に対する1つまたは複数のエピトープがアッセイ(例えば、ELISAなどの結合アッセイ)によって確かめられたとき、エピトープを用いて、疾患における標的抗体に対する薬物(例えば、モノクローナル中和抗体)を開発することができる。

一つの態様において、医療診断において使用するためのマイクロアレイも提供される。アレイは、薬物またはワクチンの投与に対する反応を確かめるために使用することができる。例えば、ワクチンに対する個体の反応は、誘導された免疫応答によって産生される抗体が認識するエピトープを提示するペプチドを有するマイクロアレイを用いて個体の抗体レベルを検出することによって確かめることができる。別の診断用途は、バイオマーカーの存在について個体を試験することである。ここで、試料は対象から採取され、1種類または複数種のバイオマーカーの存在について試験される。

マイクロアレイはまた、対象が治療的処置に反応する可能性を示すバイオマーカーの存在または非存在に基づいて患者集団を層別化するのに使用することもできる。マイクロアレイは、既知のバイオマーカーを特定して適切な治療群を確かめるのに使用することができる。例えば、ある状態を有する対象からの試料をマイクロアレイに適用することができる。マイクロアレイへの結合によって、状態のバイオマーカーの存在が分かる場合がある。以前の研究から、バイオマーカーは処置後の正のアウトカムと関連するのに対して、バイオマーカーの非存在は処置後の負または中立のアウトカムに関連することが分かる場合がある。患者にバイオマーカーがあるので、医療専門家によって、処置を受ける群に患者が層別化される場合がある。

一部の態様において、試料中の関心対象の分子(例えば、タンパク質、抗体、または他の任意のリガンド)の存在または非存在を検出する方法が、本明細書において開示され、関心対象の分子を含むと疑われる試料と接触させたマイクロアレイを得る工程;およびマイクロアレイの1つまたは複数の特徴との結合の存在または非存在を検出することによって関心対象の分子が試料中に存在するかどうかを確かめる工程を含んでもよい。

一部の態様において、関心対象の分子は、100μL、50μL、10μL、5μL、1.5μL、または1μLより少ないか、またはこれに等しい体積を有する試料内で検出することができる。一部の態様において、試料接触から関心対象の分子の検出までの経過時間は、40分未満、30分未満、20分未満、19分未満、18分未満、17分未満、16分未満、15分未満、14分未満、13分未満、12分未満、11分未満、10分未満、9分未満、8分未満、7分未満、6分未満、5分未満、4分未満、3分未満、2分未満、または1分未満である。一部の態様において、関心対象の分子は約1pg/ml〜1,000μg/mlの範囲内の接触試料中の濃度で検出することができる。

一部の態様において、関心対象のタンパク質は、体液、例えば、羊水、房水、硝子体液、胆汁、血清、母乳、脳脊髄液、耳垢、乳び、内リンパ、外リンパ、糞便、女性の膣液、胃酸、胃液、リンパ、粘液、腹水、胸膜液、膿、唾液、皮脂、精液、汗、滑液、涙、腟分泌物、嘔吐物、または尿から得られてもよい。

一部の態様において、ワクチン候補を特定する方法は、ワクチン候補が以前に投与された対象から得られた試料と接触させた、本明細書において開示されたマイクロアレイを得る工程であって、試料が複数の抗体を含む、工程;およびマイクロアレイの1つまたは複数の特徴に対する複数の抗体の結合特異性を確かめる工程を含んでもよい。一部の態様において、前記特徴は、既知配列を有する供給源タンパク質に由来する部分配列を含む複数の別個の入れ子状の重複ペプチド鎖を含む。

マイクロアレイを製造する方法
マイクロアレイを製造するための方法も本明細書において開示される。一部の態様において、本明細書において開示されたマイクロアレイは、表面、例えば、本明細書において開示された支持体上で、インサイチューで合成することができる。場合によっては、マイクロアレイは光リソグラフィを用いて作られる。例えば、支持体を光活性カップリング溶液と接触させる。マスクを用いて、保護基を有する遊離リンカー分子または遊離カップリング分子が設けられた表面上の特定の場所への放射線または光の曝露を制御することができる。曝露された場所では保護基は除去されて、カップリング分子上またはリンカー分子上に1つまたは複数の新たに露出した反応性部分が生じる。次いで、望ましいリンカーまたはカップリング分子が、保護されていない取り付けられた分子に、例えば、カルボン酸基に連結される。表面上の、特定の場所または位置が定められた場所において多数の特徴を合成するために、このプロセスが繰り返されてもよい(例えば、Pirrungらへの米国特許第5,143,854号、米国特許出願公開第2007/0154946号(2005年12月29日に出願された)、同第2007/0122841号(2005年11月30日に出願された)、同第2007/0122842号(2006年3月30日に出願された)、同第2008/0108149号(2006年10月23日に出願された)、および同第2010/0093554号(2008年6月2日に出願された)を参照されたい。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる)。

一部の態様において、特徴の三次元マイクロアレイを生成する方法は、表面に取り付けられた多孔層を得る工程;ならびに特徴を多孔層に取り付ける工程を含んでもよく、前記特徴はそれぞれ、決定可能な配列および意図された長さのペプチド鎖のコレクションを含み、独特の特徴の中で、意図された長さを有する前記コレクションの中にあるペプチド鎖の一部分は、少なくとも約98％のそれぞれのカップリング工程の平均カップリング効率を特徴とする。一部の態様において、前記特徴は、光活性化合物、カップリング分子、カップリング試薬、ポリマー、および溶媒を含む光活性カップリング製剤を用いて表面に取り付けられる。一部の態様において、前記特徴は、本明細書において開示された光活性カップリング製剤を用いて表面に取り付けられる。一部の態様において、光活性カップリング製剤は水を用いて取り除かれる。

一つの態様において、マイクロアレイを製造するプロセスが本明細書において説明される。取り付けられたカルボン酸基を含む表面が設けられる。表面を、光活性化合物、カップリング分子、カップリング試薬、ポリマー、および溶媒を含む光活性カップリング溶液と接触させる。表面は、フォトマスクによって規定されるパターンに従って遠紫外線スキャナツールにおいて紫外線に露光され、光活性カップリング溶液中に光塩基発生剤が存在するので、紫外線に露光された場所は光塩基が発生する。十分な光塩基を発生させるために、露光エネルギーは1mJ/cm²〜100mJ/cm²であってもよい。

表面は、ポスト露光ベークモジュールにおいて露光の際にポストベークされる。ポスト露光ベークは化学的増幅工程として働く。ベーク工程は、最初に発生した光塩基を増幅させ、支持体への拡散速度も速める。ポストベーク温度は、多孔性表面の厚さに応じて75℃〜115℃、少なくとも60秒間、まれに120秒超でもよい。遊離カルボン酸基は遊離ペプチドまたはポリペプチドの脱保護アミン基に連結されて、表面に取り付けられたカルボン酸基に遊離ペプチドまたはポリペプチドがカップリングされることになる。この表面は多孔性表面でもよい。表面に取り付けられたカルボン酸基にカップリングされたペプチドの合成はN→C合成方向で行われ、遊離ペプチドのアミン基は、支持体表面に結合しているカルボン酸基に付着する。または、合成をC→N方向に指向させるためにジアミンリンカーが遊離カルボン酸基に取り付けられてもよく、遊離ペプチドのカルボン酸基は、支持体表面に結合しているアミン基に付着する。

次に、光活性カップリング溶液を取り除くことができる。一部の態様において、脱イオン(DI)水を用いてフォトレジストを完全に取り除く方法が本明細書において提供される。このプロセスは現像モジュールにおいて達成される。ウェーハを真空チャックにおいて例えば60秒〜90秒間回転させ、ノズルを通して脱イオン水が約30秒間分注される。

光活性カップリング製剤はカップリングスピンモジュールにおいて表面に塗布されてもよい。カップリングスピンモジュールは、典型的には、光活性カップリング製剤を供給するために20個以上のノズルを有してもよい。これらのノズルは、これらの溶液を保持するシリンダを加圧することによって、または必要量を分注するポンプによって光活性カップリング製剤を分注するように作られてもよい。一部の態様において、ポンプは、支持体上に5〜8ccの光活性カップリング製剤を分注するように用いられる。支持体を真空チャックにおいて15〜30秒間回転させ、光活性カップリング製剤が分注される。回転速度は2000rpm〜2500rpmになるように設定することができる。

任意で、支持体上にある未反応アミノ基が次のカップリング分子と反応しないようにするためにキャップフィルム溶液コートが表面上に塗布される。キャップフィルムコート溶液は、以下:溶媒、ポリマー、およびカップリング分子、のように調製することができる。使用することができる溶媒は、N-メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、またはその組み合わせのような有機溶媒でもよい。キャッピング分子は典型的には無水酢酸であり、ポリマーはポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリ-(メチル-イソプロペニル)-ケトン、またはポリ-(2-メチル-ペンテン-1-スルホン)でもよい。一部の態様において、キャッピング分子はエタノールアミンである。

このプロセスはキャッピングスピンモジュールにおいて行われる。キャッピングスピンモジュールは、キャップフィルムコート溶液を支持体上に分注するように作ることができる1本のノズルを備えてもよい。この溶液は、キャップフィルムコート溶液を貯蔵するシリンダを加圧することによって、または必要量を正確に分注するポンプを通して分注されてもよい。一部の態様において、約5〜8ccのキャップコート溶液を支持体上に分注するためにポンプが用いられる。支持体を真空チャックにおいて15〜30秒間回転させ、カップリング製剤が分注される。回転速度は約20秒間に2000〜2500rpmになるように設定される。

キャッピング溶液を含む支持体はキャップベークモジュールにおいてベークされる。キャッピングベークモジュールは、キャッピングフィルムコートが適用された直後に、特にウェーハを受け取るように設けられたホットプレートである。一部の態様において、ホットプレートにおいて、スピンコーティングされたキャッピングコート溶液をベークしてキャッピング反応を著しく加速する方法が本明細書において提供される。一般的に、ホットプレートベークはアミノ酸のキャッピング時間を2分未満に短縮する。

キャッピング反応の副産物はストリッパモジュールにおいて取り除かれる。ストリッパモジュールは、有機溶媒、例えば、アセトン、イソプロピルアルコール、N-メチルピロリドン、ジメチルホルムアミド、DI水などを分注するために設けられた、いくつかのノズル、典型的には10個までのノズルを備えてもよい。一部の態様において、ノズルは、アセトンの後にイソプロピルアルコールが回転ウェーハ上に分注されるように指定されてもよい。回転速度は約20秒間に2000〜2500rpmになるように設定される。

この全サイクルは、所望に応じて、望ましい配列を得るために毎回、異なるカップリング分子を用いて繰り返すことができる。

一部の態様において、ポリペプチドをN→C方向に合成するために遊離カルボン酸表面を含むマイクロアレイが用いられる。一つの態様において、支持体表面上にあるカルボン酸は、アミノ酸にある遊離アミン基に結合できるようにするために活性化される(例えば、カルボニルに変換される)。一つの態様において、表面の基にあるカルボン酸の活性化は、マイクロアレイ表面にカルボジイミドまたはスクシンイミドを含む溶液を添加することによって行うことができる。一部の態様において、1-エチル-3-(3-ジメチル-アミノプロピル)-カルボジイミド(EDC)、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、1,3-ジイソプロピル-カルボジイミド(DIC)、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、0-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HATU)、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBOP)、またはN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)をマイクロアレイ表面に添加することによってカルボン酸は活性化されてもよい。活性化溶液は洗い流され、アミノ酸層(すなわち、それぞれの活性化カルボン酸基に1個のアミノ酸)を付加するためにマイクロアレイ表面は調製される。カルボン酸基は2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、または10時間まで活性化されたままである。

遊離アミン基を有するアミノ酸を含む溶液がマイクロアレイの活性化カルボン酸表面に添加されると、1個のアミノ酸がそれぞれのカルボン酸基に結合される。一部の態様において、アミノ酸は、保護アミン基を有するアミノ酸を含む。感光性化学反応を用いると、保護基は、レチクルを用いて、部位特異的な場所にある選択されたアミノ酸のアミン基から除去することができる。例えば、光塩基を含む溶液中でFmoc保護アミノ酸が混合される。マイクロアレイ上の溶液が部位特異的な場所で特定の周波数の光に曝露されると、光塩基は塩基を放出し、塩基はアミノ酸を脱保護して、マイクロアレイの表面上にある活性化カルボン酸基とアミノ酸がカップリングされる。塩基を発生させる別の方法は光酸発生剤の使用を介した方法である。一部の態様において、光酸発生剤はN-boc-ピペリジンまたは1-boc-4-ピペラジンである。

完成したアミノ酸層がカップリングされた後に、後の合成工程におけるアミノ酸の非特異的結合を阻止するために、残存しているカップリングされなかった活性化カルボン酸がキャッピングされる。マイクロアレイ上の特定の場所において望ましいポリペプチドを合成するために、活性化、アミノ酸層の付加、およびキャッピングの工程が必要に応じて繰り返される。

一つの態様において、N→C末端方向に合成されたペプチドは、生物学的分子、例えば、抗体に対する選択されたポリペプチド配列の結合特性を増強するためにジアミン分子でキャッピングされてもよい。他の態様において、C→N方向に合成されたペプチドは、生物学的分子に対する選択された配列の結合特性を増強するためにジカルボン酸分子でキャッピングされてもよい。

ポリペプチドをマイクロアレイ表面上で同時に合成している間、本明細書に記載の方法はマイクロアレイ表面上にあるカルボン酸の完全な活性化を確実にする。活性化エステルには長期間の安定性があるために、1回の活性化工程の後に、(例えば、マイクロアレイ上の異なる場所にある2〜25個またはそれより多い異なるアミノ酸からなる層を丸ごとカップリングするために)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25回、またはそれより多いカップリングサイクルが完了されてもよい。カップリングはハードベーク(コーティング直後に90秒間、85〜90℃のホットプレートにおける加熱)の間に行われ、かつ溶液中に過剰なアミノ酸が存在するので、極めて高いカップリング収率を得るために、Fmoc保護アミノ酸の完全な100％脱保護は必要とされない場合がある。全アミノ酸の添加およびキャッピングの後に、全ての遊離活性化カルボン酸はカップリングまたはキャッピングされ、従って、ポリペプチド合成の高い効率および精度が得られる。

一部の態様において、他の方法がマイクロアレイを官能化するために用いられ、国際特許出願番号PCT/US2013/025190、PCT/US2013/062773、PCT/US2013/070207、PCT/US2014/016737、PCT/US2015/017173、およびPCT/US2015/049528に記載されている。これらの内容は参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は、好ましい態様および様々な他の態様に関して詳細に示され、説明されたが、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、形状および細部において様々な変更を加えることができることが関連分野の当業者によって理解されるだろう。

本明細書の本文の中で引用された全ての参考文献、発行された特許、および特許出願はこれらの全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。

一部の態様において、前記方法は、気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリを使用する方法を含む。前記方法は、ツールアセンブリを準備する工程と、複数のウェルを備えるウェルプレートを準備する工程を含む。前記方法では、ピラープレートが、クランプのツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角で傾けられ、マイクロアレイが、ウェルプレートの1つまたは複数のウェル内でアッセイ溶液と接触しているときに、各ウェルはピラープレートの1つのピラーを収容することができる。前記方法は、クランプのツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角で傾けた状態で、ツールアセンブリのピラープレートを自由につり下げる工程をさらに含む。自由につり下げる工程は、ピラープレートが上下反転され、クランプのツールマウント部分がプレートハンドリングロボットのリフト機構と係合している間に、ピラープレートの突出端部とクランプの把持部分を噛み合わせることを含む。前記方法では、自由につり下げられたピラープレートをウェルプレートに近づけて、1つまたは複数のマイクロアレイをウェル内のアッセイ溶液と接触させることによって、ピラープレートの少なくとも1つのピラーに付けられた1つまたは複数のマイクロアレイはアッセイされる。
[本発明1001]
気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイをアッセイするためのツールであって、
2つのクランプ
を備え、2つのクランプがそれぞれ、
マイクロアレイを備えるピラープレートを動かすために、プレートハンドリングロボットのリフト機構と係合するように構成されているツールマウント部分と、
ツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角の傾きでピラープレートを自由につり下げるように構成されている把持部分
を備える、ツール。
[本発明1002]
各クランプの把持部分が2対の収容バーを備え、第1の対の収容バーが第1の垂直方向の幅で隔てられ、第2の対の収容バーが第2の垂直方向の幅で隔てられ、第1の垂直方向の幅が、予め規定された閾値距離の分だけ第2の垂直方向の幅より広く、ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられている場合に0でない傾斜角をとる、本発明1001のツール。
[本発明1003]
2対の収容バーの上部収容バーが0でない傾斜角で並べられ、下部収容バーが、ツールマウント部分に垂直な平面に対して平行に並べられる、本発明1002のツール。
[本発明1004]
ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられておらず、その代わりに、ウェルプレートの1つまたは複数のウェル内でアッセイ溶液に浮いている場合に、ピラープレートの平面がツールマウント部分に垂直な平面に対して平行に並ぶのを可能にするように2つのクランプの把持部分が構成されている、本発明1001のツール。
[本発明1005]
0でない傾斜角が、5°〜30°の範囲内である、本発明1001のツール。
[本発明1006]
0でない傾斜角が、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°、または30°である、本発明1001のツール。
[本発明1007]
0でない傾斜角が、30°より少ないかまたはこれに等しい、本発明1001のツール。
[本発明1008]
0でない傾斜角が、45°より少ないかまたはこれに等しい、本発明1001のツール。
[本発明1009]
本発明1001〜1004のいずれかのツールと、
ピラープレート
を備える、気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリであって、
ピラープレートが、ピラープレートからほぼ垂直に伸びている複数のピラーを備え、ピラープレートが上下反転されたときに、各マイクロアレイが少なくとも1つのピラーから移動しないように、1つまたは複数のマイクロアレイが少なくとも1つのピラーに付けられており、ピラープレートがピラープレートの両側に2つの突出端部をさらに備え、
突出端部が、ピラープレートをつり下げるためにクランプの把持部分と係合するように構成されている、ツールアセンブリ。
[本発明1010]
ピラープレートが2つのクランプによってつり下げられている場合に、2つの突出端部がそれぞれ両方とも、2つのクランプのうちの1つの2対の収容バーと別々に噛み合わされている、本発明1009のツールアセンブリ。
[本発明1011]
ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられている場合に、2つのクランプそれぞれの2対の収容バーの上部収容バーが、個々に、または組み合わせて、ピラープレートの噛み合わせられた突出端部に下向きの力を加えるように構成されている、本発明1010のツールアセンブリ。
[本発明1012]
ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられている場合に、第2の対の収容バーの下部収容バーが、ピラープレートの噛み合わせられた突出端部に上向きの力を加えるように構成されている、本発明1010のツールアセンブリ。
[本発明1013]
ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられていない場合に、2つの突出端部がそれぞれ両方とも、2つのクランプのうちの1つの2対の収容バーと別々に噛み合わされている、本発明1009のツールアセンブリ。
[本発明1014]
ピラープレートの1つまたは複数のピラーが、ウェルプレートの1つまたは複数のウェル内にあるアッセイ溶液中で閾値深さ以上に浸漬されている場合に、ピラープレートがツールマウント部分に垂直な平面に対して平行に並ぶのを可能にするように2つのクランプが構成されている、本発明1009のツールアセンブリ。
[本発明1015]
ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられていない場合に、2つのクランプの対の収容バーの下部収容バーが、個々に、または組み合わせて、ピラープレートの噛み合わせられた突出端部に上向きの力を加えるように構成されている、本発明1010のツールアセンブリ。
[本発明1016]
ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられていない場合に、2つのクランプの第2の対の収容バーの上部収容バーが、ピラープレートの噛み合わせられた突出端部に下向きの力を加えるように構成されている、本発明1010のツールアセンブリ。
[本発明1017]
ピラープレートのピラーの数が、24、96、384、および1536からなる群より選択される、本発明1009のツールアセンブリ。
[本発明1018]
0でない傾斜角が、5°〜30°の範囲内である、本発明1009のツールアセンブリ。
[本発明1019]
0でない傾斜角が、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°、または30°である、本発明1009のツールアセンブリ。
[本発明1020]
0でない傾斜角が、30°より少ないかまたはこれに等しい、本発明1009のツールアセンブリ。
[本発明1021]
0でない傾斜角が、45°より少ないかまたはこれに等しい、本発明1009のツールアセンブリ。
[本発明1022]
ピラープレートが、50平方センチメートルより大きい面積を有する、本発明1009のツールアセンブリ。
[本発明1023]
マイクロアレイが接着剤でピラーの上面に付けられている、本発明1009のツールアセンブリ。
[本発明1024]
接着剤が、エポキシ、可視光硬化性エポキシ、紫外線硬化性グルー、および熱硬化性グルーエポキシからなる群より選択される、本発明1023のツールアセンブリ。
[本発明1025]
気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイをアッセイするためのピラープレートであって、
ピラープレートからほぼ垂直に伸びている複数のピラー
を備え、ピラープレートが上下反転されたときに、各マイクロアレイが少なくとも1つのピラーから移動しないように、1つまたは複数のマイクロアレイが少なくとも1つのピラーに付けられており、
ピラープレートの両側に2つの突出端部をさらに備え、
突出端部が、クランプの把持部分と係合するように構成されている、ピラープレート。
[本発明1026]
ピラープレートのピラーの数が24、96、384、および1536からなる群より選択される、本発明1025のピラープレート。
[本発明1027]
ピラープレートが50平方センチメートルより大きい面積を有する、本発明1025のピラープレート。
[本発明1028]
マイクロアレイが接着剤でピラーの上面に付けられている、本発明1025のピラープレート。
[本発明1029]
接着剤が、エポキシ、可視光硬化性エポキシ、紫外線硬化性グルー、および熱硬化性グルーエポキシからなる群より選択される、本発明1028のピラープレート。
[本発明1030]
気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリを使用する方法であって、以下の工程を含む、方法:
本発明1009〜1024のいずれかのツールアセンブリを準備する工程、
複数のウェルを備えるウェルプレートを準備する工程であって、ピラープレートが、クランプのツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角で傾けられ、マイクロアレイが、ウェルプレートの1つまたは複数のウェル内でアッセイ溶液と接触しているときに、各ウェルがピラープレートの1つのピラーを収容することができる、工程、
クランプのツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角で傾いた状態で、ツールアセンブリのピラープレートを自由につり下げる工程であって、ピラープレートが上下反転され、クランプのツールマウント部分がプレートハンドリングロボットのリフト機構と係合している間に、ピラープレートの突出端部とクランプの把持部分を噛み合わせることを含む、工程、ならびに
自由につり下げられたピラープレートをウェルプレートに近づけて、1つまたは複数のマイクロアレイをウェル内のアッセイ溶液と接触させることによって、ピラープレートの少なくとも1つのピラーに付けられた1つまたは複数のマイクロアレイをアッセイする工程。

Claims (30)

1. 気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイをアッセイするためのツールであって、
   2つのクランプ
   を備え、2つのクランプがそれぞれ、
   マイクロアレイを備えるピラープレートを動かすために、プレートハンドリングロボットのリフト機構と係合するように構成されているツールマウント部分と、
   ツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角の傾きでピラープレートを自由につり下げるように構成されている把持部分
   を備える、ツール。
2. 各クランプの把持部分が2対の収容バーを備え、第1の対の収容バーが第1の垂直方向の幅で隔てられ、第2の対の収容バーが第2の垂直方向の幅で隔てられ、第1の垂直方向の幅が、予め規定された閾値距離の分だけ第2の垂直方向の幅より広く、ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられている場合に0でない傾斜角をとる、請求項1記載のツール。
3. 2対の収容バーの上部収容バーが0でない傾斜角で並べられ、下部収容バーが、ツールマウント部分に垂直な平面に対して平行に並べられる、請求項2記載のツール。
4. ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられておらず、その代わりに、ウェルプレートの1つまたは複数のウェル内でアッセイ溶液に浮いている場合に、ピラープレートの平面がツールマウント部分に垂直な平面に対して平行に並ぶのを可能にするように2つのクランプの把持部分が構成されている、請求項1記載のツール。
5. 0でない傾斜角が、5°〜30°の範囲内である、請求項1記載のツール。
6. 0でない傾斜角が、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°、または30°である、請求項1記載のツール。
7. 0でない傾斜角が、30°より少ないかまたはこれに等しい、請求項1記載のツール。
8. 0でない傾斜角が、45°より少ないかまたはこれに等しい、請求項1記載のツール。
9. 請求項1〜4のいずれか一項記載のツールと、
   ピラープレート
   を備える、気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリであって、
   ピラープレートが、ピラープレートからほぼ垂直に伸びている複数のピラーを備え、ピラープレートが上下反転されたときに、各マイクロアレイが少なくとも1つのピラーから移動しないように、1つまたは複数のマイクロアレイが少なくとも1つのピラーに付けられており、ピラープレートがピラープレートの両側に2つの突出端部をさらに備え、
   突出端部が、ピラープレートをつり下げるためにクランプの把持部分と係合するように構成されている、ツールアセンブリ。
10. ピラープレートが2つのクランプによってつり下げられている場合に、2つの突出端部がそれぞれ両方とも、2つのクランプのうちの1つの2対の収容バーと別々に噛み合わされている、請求項9記載のツールアセンブリ。
11. ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられている場合に、2つのクランプそれぞれの2対の収容バーの上部収容バーが、個々に、または組み合わせて、ピラープレートの噛み合わせられた突出端部に下向きの力を加えるように構成されている、請求項10記載のツールアセンブリ。
12. ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられている場合に、第2の対の収容バーの下部収容バーが、ピラープレートの噛み合わせられた突出端部に上向きの力を加えるように構成されている、請求項10記載のツールアセンブリ。
13. ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられていない場合に、2つの突出端部がそれぞれ両方とも、2つのクランプのうちの1つの2対の収容バーと別々に噛み合わされている、請求項9記載のツールアセンブリ。
14. ピラープレートの1つまたは複数のピラーが、ウェルプレートの1つまたは複数のウェル内にあるアッセイ溶液中で閾値深さ以上に浸漬されている場合に、ピラープレートがツールマウント部分に垂直な平面に対して平行に並ぶのを可能にするように2つのクランプが構成されている、請求項9記載のツールアセンブリ。
15. ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられていない場合に、2つのクランプの対の収容バーの下部収容バーが、個々に、または組み合わせて、ピラープレートの噛み合わせられた突出端部に上向きの力を加えるように構成されている、請求項10記載のツールアセンブリ。
16. ピラープレートが2つのクランプによって自由につり下げられていない場合に、2つのクランプの第2の対の収容バーの上部収容バーが、ピラープレートの噛み合わせられた突出端部に下向きの力を加えるように構成されている、請求項10記載のツールアセンブリ。
17. ピラープレートのピラーの数が、24、96、384、および1536からなる群より選択される、請求項9記載のツールアセンブリ。
18. 0でない傾斜角が、5°〜30°の範囲内である、請求項9記載のツールアセンブリ。
19. 0でない傾斜角が、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、11°、12°、13°、14°、15°、16°、17°、18°、19°、20°、21°、22°、23°、24°、25°、26°、27°、28°、29°、または30°である、請求項9記載のツールアセンブリ。
20. 0でない傾斜角が、30°より少ないかまたはこれに等しい、請求項9記載のツールアセンブリ。
21. 0でない傾斜角が、45°より少ないかまたはこれに等しい、請求項9記載のツールアセンブリ。
22. ピラープレートが、50平方センチメートルより大きい面積を有する、請求項9記載のツールアセンブリ。
23. マイクロアレイが接着剤でピラーの上面に付けられている、請求項9記載のツールアセンブリ。
24. 接着剤が、エポキシ、可視光硬化性エポキシ、紫外線硬化性グルー、および熱硬化性グルーエポキシからなる群より選択される、請求項23記載のツールアセンブリ。
25. 気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイをアッセイするためのピラープレートであって、
    ピラープレートからほぼ垂直に伸びている複数のピラー
    を備え、ピラープレートが上下反転されたときに、各マイクロアレイが少なくとも1つのピラーから移動しないように、1つまたは複数のマイクロアレイが少なくとも1つのピラーに付けられており、
    ピラープレートの両側に2つの突出端部をさらに備え、
    突出端部が、クランプの把持部分と係合するように構成されている、ピラープレート。
26. ピラープレートのピラーの数が24、96、384、および1536からなる群より選択される、請求項25記載のピラープレート。
27. ピラープレートが50平方センチメートルより大きい面積を有する、請求項25記載のピラープレート。
28. マイクロアレイが接着剤でピラーの上面に付けられている、請求項25記載のピラープレート。
29. 接着剤が、エポキシ、可視光硬化性エポキシ、紫外線硬化性グルー、および熱硬化性グルーエポキシからなる群より選択される、請求項28記載のピラープレート。
30. 気泡がマイクロアレイ付近に溜まる可能性を減らす、マイクロアレイをアッセイするためのツールアセンブリを使用する方法であって、以下の工程を含む、方法:
    請求項9〜24のいずれか一項記載のツールアセンブリを準備する工程、
    複数のウェルを備えるウェルプレートを準備する工程であって、ピラープレートが、クランプのツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角で傾けられ、マイクロアレイが、ウェルプレートの1つまたは複数のウェル内でアッセイ溶液と接触しているときに、各ウェルがピラープレートの1つのピラーを収容することができる、工程、
    クランプのツールマウント部分に垂直な平面に対して0でない傾斜角で傾いた状態で、ツールアセンブリのピラープレートを自由につり下げる工程であって、ピラープレートが上下反転され、クランプのツールマウント部分がプレートハンドリングロボットのリフト機構と係合している間に、ピラープレートの突出端部とクランプの把持部分を噛み合わせることを含む、工程、ならびに
    自由につり下げられたピラープレートをウェルプレートに近づけて、1つまたは複数のマイクロアレイをウェル内のアッセイ溶液と接触させることによって、ピラープレートの少なくとも1つのピラーに付けられた1つまたは複数のマイクロアレイをアッセイする工程。

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