JP2021073278A - 抗生物質として有用なコロルマイシン誘導体 - Google Patents

Abstract

【課題】ユビキノン酸化還元酵素（Ｎａ＋−ＮＱＲ）を調節する、細菌性疾患の処置のための医薬組成物を提供する。【解決手段】式（Ｉ）で表される抗生物質化合物もしくはその塩、または立体異性体：式中、Ｒ１〜Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、Ｈ、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ２、またはＳＨから独立に選択され、Ｒ４は、Ｈ、アルキル基または置換アルキル基であり、Ｘ１〜Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｈ、アルキル、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ２から独立に選択され、Ｙは、４〜２０個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または４〜２０個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり、但し、Ｙは酸素原子を含まず、Ｚは、ＣＨ３または任意の中性もしくは正電荷基である。【選択図】なし

Description

本発明は、抗生物質化合物およびその治療的使用に関する。

関連技術の説明
細菌感染症の処置および制圧に関する世界的危機についてはよく認識されている。医学上の懸念には、世界中で新しく出現する感染症に対処する十分な種類の抗生物質の不足および適応細菌で観察されている従来の抗生物質処置に対する耐性が含まれる。この状況に対処する新しい抗生物質は作り出されていない。１９８０年代の半ばに、１６種の新しい抗生物質がＦＤＡにより承認された。２００８／２００９年には、この数がただの１種に減少した（米国感染症学会）。ほぼ同じ期間中に、抗生物質に対する耐性の発生率は約５％から３０〜６０％に上昇した。これに突き動かされて世界保健機関は、「抗菌剤耐性の急速な発生は、ヒトの健康に対する３大脅威の１つである」という２００９年の声明に至った。

この危機に対処するための新規薬剤の特定における問題の一部は、産業界が細菌を制圧する標的を自ら使い尽くしてしまった点にある。過去において慣習的に使用されてきており、また、今日では全ての細菌に共通となっている標的には、原核生物リボソーム、ＤＮＡおよびＲＮＡに作用する酵素、ならびに細胞壁の合成、などが含まれる。事実上、新規の機構的標的は特定されていない。

細菌中のＮａ^＋−輸送ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素（Ｎａ^＋−ＮＱＲ）は、細菌複製および生存能を制御するための機構として示唆されてきた。これまで、次の３種のＮａ^＋−ＮＱＲの阻害剤が報告されている：変性させるＡｇ^＋イオン、（３Ｒ，４Ｚ，６Ｅ）−Ｎ−［（５Ｓ）−５−エチル−５−メチル−２−オキソ−２，５−ジヒドロ−３−フラニル］−３−ヒドロキシ−８−［（２Ｓ，３Ｒ）−３−オクチル−２−オキシラニル］−４，６−オクタジエンアミド（コロルマイシン）、および２−ｎ−ヘプチル−４−ヒドロキシキノリンＮ−オキシド（ＨＱＮＯ）。Ａｇ^＋イオンは、明らかに送達上の問題を有し、非特異的でもある。コロルマイシンおよびＨＱＮＯの両方は、Ｎａ^＋−ＮＱＲにより、ナトリウム依存性ユビキノン還元を相互排他的に抑制することが示され、また、両方は、抗菌活性を有することが示唆されてきた（例えば、日本特許第３９０５６０号（２００７年４月１８日公告）、日本特許出願公開第２０００−３３６０８８号（２０００年１２月５日公開）、および日本特許出願公開第２００１−１０９０８号（２００１年１月１６日公開）で考察されているように）。しかし、これら化合物のいずれも、動物、例えば、哺乳動物、またはより具体的にはヒトに対する効果的抗生物質治療薬としては開発されてこなかった。
したがって、代替抗生物質化合物に対する必要性が引き続き存在する。

一態様では、式（ＩＩＩ）：

の抗生物質化合物もしくはその塩、または立体異性体が提供され、
式中、
Ｒ^１〜Ｒ^３およびＲ^５〜Ｒ^１０は、Ｈ、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ_２、またはＳＨから独立に選択され、
Ｒ^４は、アルキル基または置換アルキル基であり、
Ｘ^１〜Ｘ^２は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｈ、アルキル、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ_２から独立に選択され、
Ｗは、１〜１５個の炭素原子を有し、水素および炭素原子から本質的になる飽和非環式炭化水素鎖であり、
Ｚは、ＣＨ_３または任意の中性もしくは正電荷基である。

一態様では、式（Ｉ）：

の抗生物質化合物もしくはその塩、または立体異性体が提供され、
式中、
Ｒ^１〜Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^６は、Ｈ、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ_２、またはＳＨから独立に選択され、
Ｒ^４は、Ｈ、アルキル基または置換アルキル基であり、
Ｘ^１〜Ｘ^２は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｈ、アルキル、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ_２から独立に選択され、
Ｙは、２〜２０個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜２０個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり、但し、Ｙは酸素原子を含まず、
Ｚは、ＣＨ_３または任意の中性もしくは正電荷基である。

ヒト細胞のトラコーマ病原体感染に対するコロルマイシンの効果を評価するための実験計画を示す図である。 ヒト細胞のトラコーマ病原体感染に対するＰＥＧ−２の効果を評価するための実験計画を示す図である。 ヒト細胞のトラコーマ病原体感染に対するＰＥＧ−２の効果を評価するための実験計画を示す図である。 図２に示すＰ５ ＰＥＧ−２処置の力価測定のための実験計画を示す図である。 コロルマイシンおよびＰＥＧ−２の構造アライメント比較を示す図である。 ヒーラ細胞のトラコーマ病原体感染に対するコロルマイシンの効果を示す画像である。 コロルマイシンを使った５回の連続処置後の侵入トラコーマ病原体の減少を示すグラフである。 初代血管平滑筋細胞に対するコロルマイシンの毒作用を示すグラフである。 初代血管平滑筋細胞に対しＰＥＧ−２の毒作用が存在しないことを示すグラフである。 ヒーラ細胞のトラコーマ病原体感染に対するＰＥＧ−２の効果を示す画像である。 図９に示す効果の定量化を示すグラフである。 ＰＥＧ−２を使った５回の連続処置後の侵入トラコーマ病原体の減少を示すグラフである。 トラコーマ病原体感染ヒーラ細胞のＰＥＧ−２処置（１０μＭ）を継代数に応じて示すグラフである。 トラコーマ病原体感染ヒーラ細胞のＰＥＧ−２処置（１５μＭ）を継代数に応じて示すグラフである。 トラコーマ病原体感染ヒーラ細胞におけるＰＥＧ−２とコロルマイシンの効力の比較を示すグラフである。 ヒーラ細胞毒性および抗クラミジア効力に関し試験したホモセリンラクトンの化学構造を示す図である。 細胞質の初期トラコーマ病原体誘発酸性化に対するＰＥＧ−２の効果を示すグラフである。 感染後の種々の時点（０、２時間、および２４時間）での細胞質のトラコーマ病原体誘発酸性化に対するＰＥＧ−２の効果を示すグラフである。 高ブドウ糖培地中でのトラコーマ病原体感染ＨＥＫ２９３細胞培養に起因する細胞質ｐＨ（Ａ）およびＮａ^＋含量（Ｂ）の変化を示すグラフである。 ＰＥＧ−２が用量依存的に作用して、クラミジア感染中の封入体数が低減することを示すグラフである。封入体数は、２回目、３回目、４回目、およびお５回目の連続処置後に計数した。 ＰＥＧ−２Ｓは、無害腸内細菌叢に属する３種のＮａ^＋−ＮＱＲ陰性種の液体培地中の増殖収率が、添加したＰＥＧ−２Ｓのいずれの試験濃度でも影響を受けなかったという点において高度に選択的な抗Ｎａ^＋−ＮＱＲ剤であることを示すグラフである。 細菌より小さいコレラ菌小胞中で直接測定した、ＰＥＧ−２ＳによるＮａ^＋−ＮＱＲの阻害を示す図である。（Ａ）Ｎａ^＋−ＮＱＲ欠損膜ではｄＮＡＤＨのＰＥＧ−２Ｓ感受性酸化が存在しない（記録（ａ））が、一方、Ｎａ^＋−ＮＱＲ含有膜はＰＥＧ−２Ｓに感受性でｄＮＡＤＨを酸化する（記録（ｂ））。（Ｂ）ＰＥＧ−２Ｓ阻害のＩＣ_５０の計算のために、［ＰＥＧ−２Ｓ］に応じてプロットした正規化Ｎａ^＋−ＮＱＲ活性（１００％は、阻害剤なしの場合の活性に対応する）。 ＰＥＧ−２ＳがＨＥＫ２９３細胞培養においてクラミジア感染を妨害することを示すグラフである。１および２．５μＭのＰＥＧ−２Ｓによる治療は、トラコーマ病原体に感染したＨＥＫ２９３細胞における細胞質のｐＨ（Ａ）および［Ｎａ^＋］（Ｂ）の変化を阻止する（プロットは８回の独立した実験の平均で、示した標準偏差を有する。Ｐ＜０．００３）。 ＰＥＧ−２誘導体の化学構造の例を示す図である。 ＰＥＧ−２の誘導体が、トラコーマ病原体感染ヒーラ細胞に対する効果的な処置を提供することを示す画像である。

本明細書で記載の化合物、配合物、組成物、処置方法、および薬物発見方法およびシステムは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶに関し、式Ｉは、式ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶを包含し、また、式ＩＩＩは式ＩＶを包含する。

式中、
Ｒ^１〜Ｒ^３およびＲ^５〜Ｒ^１０は、Ｈ、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨ_２、またはＳＨから独立に選択され、
Ｒ^４は、Ｈ、アルキル基または置換アルキル基であり、
Ｘ^１〜Ｘ^２は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、Ｈ、アルキル、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ_２から独立に選択され、
Ｙは、２〜２０個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜２０個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり、
Ｗは、１〜１５個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜１５個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり、
Ｚは、ＣＨ_３または任意の中性もしくは正電荷基である。

式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶは、非環式側鎖にＮ結合した共通のフラノン環を有する。式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶから明らかなように、フラノン環とＮ結合型側鎖の両方は種々の置換基を収容できる。

特定の実施形態では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの成分をさらに定義し得る。一例では、Ｒ^１〜Ｒ^１０は、ＨまたはＣ１−Ｃ５アルキル基またはＣ１−Ｃ５置換アルキル基から独立に選択される。別の例では、Ｒ^１〜Ｒ^１０は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキル基またはＣ１−Ｃ４置換アルキル基から独立に選択される。別の例では、Ｒ^１〜Ｒ^１０は、ＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル基またはＣ１−Ｃ３置換アルキル基から独立に選択される。別の例では、Ｒ^１〜Ｒ^１０は、ＨまたはＣ１−Ｃ２アルキル基またはＣ１−Ｃ２置換アルキル基から独立に選択される。別の例では、Ｒ^４はＨである。別の例では、Ｒ^１〜Ｒ^３はＨまたはＣ１−Ｃ２アルキルから独立に選択され、Ｒ^５〜Ｒ^１０はＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル基から独立に選択され、Ｒ^４はＨである。

別の例では、Ｘ^１〜Ｘ^２は、Ｏ、Ｓ、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨから独立に選択される。別の例では、Ｘ^１〜Ｘ^２は、Ｏ、Ｓ、Ｈ、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨから独立に選択される。別の例では、Ｘ^１〜Ｘ^２は、Ｈ、Ｏ、Ｓ、ＯＨ、またはＳＨから独立に選択される。別の例では、Ｘ^１〜Ｘ^２は、Ｈ、ＯまたはＯＨから独立に選択される。別の例では、Ｘ^１はＯであり、Ｘ^２はＯＨである。別の例では、Ｘ^１はＯであり、Ｘ^２はＨである。

別の例では、Ｙは、４〜２０個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または４〜２０個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖である。別の例では、Ｙは、２〜１４個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜１４個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖である。別の例では、Ｙは、２〜１２個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜１２個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖である。別の例では、Ｙは、２〜１０個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜１０個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖である。別の例では、Ｙは、２〜８個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜８個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖である。別の例では、Ｙはエポキシド基を含まない。別の例では、Ｙは臭素基を含まない。別の例では、Ｙは酸素原子を含まない。別の例では、Ｙは少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む。別の例では、Ｙは、水素および炭素原子から本質的になり、毒性を実質的に変えず、また、いかなるエポキシド基をも明示的に含まない変種を含む。別の例では、Ｙは、水素および炭素原子のみからなる。

別の例では、Ｗは、１〜１２個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜１２個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖である。別の例では、Ｗは、１〜１０個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜１０個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖である。別の例では、Ｗは、１〜８個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜８個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖である。別の例では、Ｗは、１〜６個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜６個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖である。別の例では、Ｗは、１〜４個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜４個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖である。別の例では、Ｗはエポキシド基を含まない。別の例では、Ｗは臭素基を含まない。別の例では、Ｗは酸素原子を含まない。別の例では、Ｗは、水素および炭素原子から本質的に構成され、飽和されており、毒性を実質的に変えず、また、いかなるエポキシド基をも明示的に含まない変種を含む。別の例では、Ｗは、水素および炭素原子のみからなる。

別の例では、Ｚはエポキシド基を含まない。別の例では、Ｚは臭素基を含まない。別の例では、Ｚは酸素原子を含まない。別の例では、ＺはＣＨ_３または有機基である。別の例では、Ｚは窒素原子を含む有機基である。別の例では、Ｚはリン原子を含む有機基である。別の例では、ＺはＣＨ_３または正電荷有機基である。別の例では、Ｚはハロゲンである。別の例では、ＺはＣＨ_３、トリフェニルホスフィン（３ＰｈＰ）基、グアニジン基、アミノペリミジン基、アミロライド基またはハロゲンである。別の例では、化合物の分子量は２０００ダルトン未満である。別の例では、化合物の分子量は１０００ダルトン未満である。

別の例では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物は、少なくとも２つのキラル中心、例えば、図４に示す５Ｓおよび３’Ｒキラル中心を有するであろう。別の例では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物は、２つのみのキラル中心、例えば、図４に示す５Ｓおよび３’Ｒキラル中心を有するであろう。

別の例では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物が提供され、式中、Ｒ^１〜Ｒ^３はＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル基から独立に選択され、Ｒ^５〜Ｒ^１０はＨまたはＣ１−Ｃ５アルキル基から独立に選択され；Ｒ^４はＨであり；Ｘ^１〜Ｘ^２はＯ、Ｓ、Ｈ、アルキル、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨから独立に選択され；Ｙは２〜２０個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜２０個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｗは１〜１５個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜１５個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｚは窒素原子を含む中性もしくは正電荷基であり、場合により該窒素原子はＹまたはＷの炭素原子と共有結合を形成する。

別の例では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物が提供され、式中、Ｒ^１〜Ｒ^３はＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル基から独立に選択され、Ｒ^５〜Ｒ^１０はＨまたはＣＨ_３基から独立に選択され；Ｒ^４はＨであり；Ｘ^１〜Ｘ^２はＯ、Ｓ、Ｈ、ＯＨ、またはＳＨから独立に選択され；Ｙは２〜１２個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜１２個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｗは１〜８個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜８個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｚは窒素原子を含む中性もしくは正電荷基であり、場合により該窒素原子はＹまたはＷの炭素原子と共有結合を形成する。

別の例では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物が提供され、式中、Ｒ^１〜Ｒ^３はＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル基から独立に選択され、Ｒ^５〜Ｒ^１０はＨまたはＣ１−Ｃ５アルキル基から独立に選択され；Ｒ^４はＨであり；Ｘ^１〜Ｘ^２はＯ、Ｓ、Ｈ、アルキル、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨから独立に選択され；Ｙは２〜２０個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜２０個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｗは１〜１５個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜１５個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｚはリン原子を含む中性もしくは正電荷基であり、場合により該リン原子はＹまたはＷの炭素原子と共有結合を形成する。

別の例では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物が提供され、式中、Ｒ^１〜Ｒ^３はＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル基から独立に選択され、Ｒ^５〜Ｒ^１０はＨまたはＣＨ_３基から独立に選択され；Ｒ^４はＨであり；Ｘ^１〜Ｘ^２はＯ、Ｓ、Ｈ、ＯＨ、またはＳＨから独立に選択され；Ｙは２〜１２個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜１２個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｗは１〜８個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜８個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｚはリン原子を含む中性もしくは正電荷基であり、場合により該リン原子はＹまたはＷの炭素原子と共有結合を形成する。

別の例では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物が提供され、式中、Ｒ^１〜Ｒ^３はＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル基から独立に選択され、Ｒ^５〜Ｒ^１０はＨまたはＣ１−Ｃ５アルキル基から独立に選択され；Ｒ^４はＨであり；Ｘ^１〜Ｘ^２はＯ、Ｓ、Ｈ、アルキル、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨから独立に選択され；Ｙは２〜２０個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜２０個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｗは１〜１５個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜１５個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｚはハロゲンである。

別の例では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物が提供され、式中、Ｒ^１〜Ｒ^３はＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル基から独立に選択され、Ｒ^５〜Ｒ^１０はＨまたはＣＨ_３から独立に選択され；Ｒ^４はＨであり；Ｘ^１〜Ｘ^２はＯ、Ｓ、Ｈ、ＯＨ、またはＳＨから独立に選択され；Ｙは２〜１２個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜１２個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｗは１〜８個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜８個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｚはハロゲンである。

別の例では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物が提供され、式中、Ｒ^１〜Ｒ^３はＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル基から独立に選択され、Ｒ^５〜Ｒ^１０はＨまたはＣ１−Ｃ５アルキル基から独立に選択され；Ｒ^４はＨであり；Ｘ^１〜Ｘ^２はＯ、Ｓ、Ｈ、アルキル、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨから独立に選択され；Ｙは２〜２０個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜２０個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｗは１〜１５個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜１５個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；ＺはＣＨ_３である。

別の例では、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物が提供され、式中、Ｒ^１〜Ｒ^３はＨまたはＣ１−Ｃ３アルキル基から独立に選択され、Ｒ^５〜Ｒ^１０はＨまたはＣＨ_３から独立に選択され；Ｒ^４はＨであり；Ｘ^１〜Ｘ^２はＯ、Ｓ、Ｈ、ＯＨ、またはＳＨから独立に選択され；Ｙは２〜１２個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または２〜１２個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；Ｗは１〜８個の炭素原子を有する非環式炭化水素鎖または１〜８個の炭素原子を有する置換非環式炭化水素鎖であり；ＺはＣＨ_３である。

本明細書で記載の化合物を使って、ヒトまたは非ヒト動物である対象または患者を処置し得る。例えば、ヒト、霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、雌ウシ、ブタ、ウマ、またはヒツジを含む、哺乳動物の処置が意図されている。ニワトリまたは七面鳥を含むトリの処置が意図されている。

「処置」または「処置すること」は、治療、防止、および予防、特に患者に対する予防（防止）のための、または患者が罹患している場合には衰弱または疾患を治癒するための薬物の投与または医療手技の実施を意味する。

「治療薬」は、宿主に対し所望の生物学的効果をもたらすことができる薬剤を意味する。抗生物質は、生物学的な起源とは対照的に、化学的な起源であることが一般的に知られている、典型的には、２０００ダルトン未満の分子量の小分子構造を有する治療薬の一例である。

用語の「治療有効量」は、このような処置を必要とする対象に投与した場合、処置を達成するのに十分な作用物質、モジュレーター、薬物またはその他の分子の量を意味する。治療有効量は、処置される対象および病状、対象の体重および年齢、病状の重症度、投与方法、などに応じて変化するであろう。これらの因子は当業者により容易に判断できる。

機能特性または生物活性またはプロセス（例えば、酵素活性または受容体結合）に関連して使用される場合、用語の「調節」は、上方制御する（例えば、活性化するまたは刺激する）、下方制御する（例えば、阻害するまたは抑制する）あるいはこのような特性、作用またはプロセスの質を変える能力を意味する。

モジュレーターとしては、例えば、調節を引き起こし得る、ポリペプチド、核酸、高分子、複合体分子、小分子、化合物、化学種、など（天然起源または非天然起源の）、または細菌、植物、真菌、または動物細胞または組織などの生体物質から作製された抽出物が挙げられる。

モジュレーターは、アッセイに組み込むことにより、機能特性、生物活性またはプロセス、またはこれらの組み合わせの（直接的または間接的）阻害剤または活性化剤（例えば、アゴニスト、部分アンタゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、抗菌剤、微生物感染または増殖の阻害剤）としての潜在活性で評価し得る。このようなアッセイでは、多くのモジュレーターを一度に評価し得る。モジュレーターの活性は、既知でも、未知でもまたは部分的に既知であってもよい。

抗生物質化合物の投与量の範囲は、日常試験を通して当業者により容易に決定される。投与量は、望ましくない交叉反応、アナフィラキシー反応、などの有害な副作用を引き起こすほど多量であってはならない。一般に、投与量は、患者の年齢、病状、性別、および疾患の程度で変わり、当業者によって決定可能である。万一何らかの禁忌の場合には、投与量は個々の医師によって調節可能である。

口腔、鼻腔内、腟、直腸、眼球外、筋肉内、皮内、皮下、または静脈内などに応じて、投与量、投与量の計画および投与経路は変わってもよい。

本明細書で記載の抗生物質化合物は、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて治療用として使用可能である。薬学的に許容可能は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題や合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して用いるのに適しており、妥当なベネフィットリスク比に見合っている構成成分、組成物およびこれらの投与量を意味する。薬学的に許容可能なキャリアは、当業者にとって既知である。最も典型的なものは、滅菌水、生理食塩水、および生理学的なｐＨを有する緩衝液などの溶液を含む、ヒトに対して組成物を投与するための標準的なキャリアであろう。

薬学的に許容可能なキャリアには、液体キャリア、固体キャリア、またはその両方が含まれる。液体キャリアとしては、水、生理食塩水、生理学的に許容可能な緩衝液、水性懸濁液、油乳剤、油中水乳剤、水中油型乳剤、部位特異的エマルジョン、長期滞留エマルジョン、粘着性エマルジョン、マイクロエマルジョンおよびナノエマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。水性キャリアの例には、水、生理食塩水および生理学的に許容可能な緩衝液が挙げられる。非水性キャリアの例には、限定されないが、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、脂質、油およびこれらの混合物を含む鉱物油または中性油が挙げられる。固体キャリアは、生物学的キャリア、化学的キャリア、またはその両方であり、これらには、例えば、粒子、微小粒子、ナノ粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、ミニポンプ、細菌細胞壁抽出物、および組成物の持続放出を可能とする生分解性または非生分解性の天然または合成ポリマーが挙げられる。

医薬品送達を目的とする分子は、医薬組成物中に配合してもよい。医薬組成物には、選択分子に加えて、許容可能なキャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、界面活性剤、などを含めてもよい。医薬組成物には、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤、アレルギー緩和剤、疼痛緩和剤などの生物活性を有する１種または複数の有効成分を含めてもよい。

組成物は、局所的あるいは全身的な処置が望ましいか否かに応じて、および処置されるべき領域に応じて、多くの方法で投与し得る。投与は、局所的（眼、膣、直腸、鼻腔内を含む）、経口的、吸入によって、または非経口的に、例えば静脈内点滴、皮下注射、腹腔内注射、または筋肉内注射によって行い得る。組成物は、当業者によって使用された標準的な手順に従って投与され得る。

本明細書で記載のいずれかの特定の化合物に対し、有効投与量または有効量、および配合物の投与のタイミングに与える任意の可能な効果を特定することが必要となる場合がある。これは、１種または複数の動物群を使って（例えば、少なくとも各群５個体を使って）日常的実験によりに行ってもよく、または適切な場合には、ヒトの試験で行ってもよい。任意の化合物の有効性および処置または予防方法は、その化合物を投与して、目的の疾患または状態と関連した１種または複数の指数を測定し、これらの指数の投与後値を処置前の同じ指数値と比較することにより、投与の効果を評価することにより評価し得る。

所与の患者において最も効果的な処置が得られると思われる任意の特定の化合物の正確な投与時間および投与量は、特定の化合物の活性、薬物動態学、および生物学的利用能、患者の生理的条件（年齢、性別、疾患の種類および段階、全身健康状態、薬物の与えられた投与量および種類に対する応答性を含む）、投与経路などに依存し得る。

対象が処置されている間に、対象の健康を１種または複数の関連指数の測定により２４時間の期間中の所定の時間にモニターしてよい。補充剤を含む処置、投与量、投与時間および配合は、このようなモニターの結果にしたがって最適化し得る。同じパラメータを測定することにより、対象を定期的に再評価して、改善の程度を判定し得る。最初は、このような再評価は通常、治療の開始から４週間の終わりに行い、それに続く再評価は治療中の４〜８週毎に、その後、３ヶ月毎に行う。治療は、数ヶ月あるいは数年にわたり継続してよく、最短で２週間が典型的なヒトの治療の長さである。これらの再評価に基づいて、薬剤投与の量（単一または複数）および場合によっては投与時期に対する調節を行ってよい。

処置は化合物の最適用量未満のより少ない投与量から開始してよい。その後、最適治療効果が得られるまで、投与量を小さい増分で増やしてよい。

本明細書で記載のいくつかの化合物、あるいは他の抗生物質を組み合わせた使用により、異なる成分の作用の開始および持続期間が相補的であり得るという理由で、いずれかの個々の成分に対する必要な投与量を減らし得る。このような併用療法では、異なる活性薬剤が一緒にまたは別々に送達してよく、同時にまたはその日の内の異なる時間に送達してよい。

対象化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０およびＥＤ５０を測定するための細胞培養または実験動物における標準的医薬手順により決定し得る。大きな治療指数を示す組成物が有利である。毒性副作用を示す化合物を使ってもよいが、副作用を減らすために所望の箇所へ化合物のターゲットを絞った投与量範囲、配合、または送達システムを設計するように配慮する必要がある。

細胞培養アッセイおよび非ヒト動物試験から得られたデータを使って、ヒトへの使用に対し一定の範囲の投与量を処方し得る。任意の補充剤、あるいはその中の任意の成分の投与量は、毒性がほとんどないまたは非毒性で、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあり得る。投与量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わってもよい。本明細書で記載の薬剤に対しては、治療有効量は、最初は細胞培養アッセイから推定してよい。用量は、動物モデルの細胞培養で測定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量抑制を達成する試験化合物の濃度）を包含する循環血漿中濃度範囲になるように処方し得る。このような情報を使って、ヒトに対する有用な用量をより正確に決定し得る。血漿中の量は、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定し得る。

本明細書で記載の化合物を、ヒトまたは非ヒト動物である対象または患者の抗生物質処置のために使用し得る。抗生物質処置は、種々の細菌の増殖の抑制および細菌感染症調節に有用であり得る。理論に束縛されることを意図するものではないが、抗生物質処置は、Ｎａ^＋−輸送ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素（Ｎａ^＋−ＮＱＲ）タンパク質またはペプチドとの相互作用を含み得、かつ／またはＮａ^＋−ＮＱＲ活性の調節を含み得る。

理論に束縛されることを意図するものではないが、本発明者らは、どのようにして、Ｎａ^＋サイクルおよびナトリウム輸送ポンプが細菌感染の過程で一定の役割を果たし得るかを説明するためのモデルを開発した。特に、このモデルは、細菌複製および生存能力を制御する機構としての細菌中のＮａ^＋−輸送ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素（Ｎａ^＋−ＮＱＲ）を標的にすることを提案している。Ｎａ^＋−ＮＱＲは、Ｎａ^＋イオンを細胞質から排出するためにキノンによるＮＡＤＨの酸化のエネルギーを利用する一次ナトリウムポンプとして機能する通常とは異なる呼吸酵素である。したがって、それは、アミノ酸の移入および多剤耐性ポンプの操作を含む、代謝作業に直接に使用できるナトリウム輸送力を作り出す。重要なのは、Ｎａ^＋−ＮＱＲは多くの病原菌中に存在するが、それはヒト細胞のミトコンドリア中ならびに正常な胃腸細菌叢に属する菌種中には存在しないことである。したがって、この酵素の特異的標的化は、ヒト細胞および正常な胃腸細菌叢中で生じる非特異的副作用が、従来から処方されている抗生物質より少ない可能性がある。

細菌代謝におけるＮａ^＋−ＮＱＲの機構的経路および関与はいくつかのステップで発生する可能性がある。侵入細菌による全ての利用可能な細胞内ＡＴＰの消費が、Ｎａ^＋ポンプの緩徐化をもたらし、これが感染細胞からのＮａ^＋の取り出しを減速させ得る。侵入細菌による解糖の刺激は、細胞質の酸性化を生ずることによりＮａ^＋過負荷を強め、これが最終的にＮａ^＋／Ｈ^＋交換輸送体（ＨＮＥ１）を活性化し、細胞内のＨ^＋の取り出しと引換により多くのＮａ^＋を細胞中に移入させ得る。細胞内のＡＴＰおよびブドウ糖プールが 枯渇すると、病原菌はアミノ酸異化作用に切り替えることができ、これは、細胞質のｐＨを効率的に上昇させる。Ｎａ^＋イオンの細胞内の濃度は、Ｎａ^＋ポンプの活性が低下しているために、上昇したままである。Ｎａ^＋−ＮＱＲは、Ｎａ^＋イオンを細胞質から排出ためにキノンによるＮＡＤＨの酸化のエネルギーを利用する一次ナトリウムポンプとして機能する通常とは異なる呼吸酵素である。したがって、それは、アミノ酸の移入および多剤耐性ポンプの操作を含む、代謝作業に直接に使用できるナトリウム輸送力を作り出す。これらの条件下で、病原菌はＮａ^＋−ＮＱＲに依存して、アミノ酸の取り込みを作動させ、これは、Ｎａ^＋−アミノ酸共輸送を含むいくつかの経路を介して起こり得る。したがって、これらの条件下でのＮａ^＋−ＮＱＲの阻害は、アミノ酸を取り込み、正常なイオン恒常性を回復するのを促進するためのエネルギーを供給する能力をもたらさないはずである。

Ｎａ^＋−ＮＱＲは、好気性病原体における主要な呼吸Ｎａ^＋ポンプである。系統発生解析は、病原性菌種において、完全Ｎａ^＋サイクルならびに一次Ｎａ^＋ポンプのみのバリアントの割合が不釣り合いに多いことを示し、これは、おそらく、侵入病原体が、コロニー形成したマクロ生物の厳しい微小環境下で充分に高いプロトン輸送力（ＰＭＦ）を維持するのが困難であることに起因すると思われる。Ｎａ^＋−ＮＱＲの広範囲にわたる分布および病原性形質の調節におけるその潜在的重要性は、この酵素を新規抗生物質の開発のための魅力的な候補にしており、Ｎａ^＋−ＮＱＲ構造の最近の研究における待望のブレークスルー（Ｓｔｅｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ Ｎａ^＋−ｐｕｍｐｉｎｇ ＮＡＤＨ：ｑｕｉｎｏｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１４；５１６：６２−６７）の後では、特にそうである。

Ｎａ^＋−ＮＱＲは、多くの病原菌で見出されている。したがって、それが広範囲の病原菌の過程に影響を与える可能性は高い。全てのＮａ^＋−ＮＱＲ含有病原性細菌がＮａ^＋−ＮＱＲを標的とする薬剤に感受性を有する可能性があると思われる。Ｎａ^＋−ＮＱＲを含有する多くの菌種およびこれらの細菌が関連する疾患の不完全で例示的なリストを表１に示す。

Ｎａ^＋−ＮＱＲ含有病原体の実例は、β−およびγ−プロテオバクテリア門（エンテロバクター目、ビブリオ目、パスツレラ目、エアロモナス目、シュードモナス目、ナイセリア目）、バクテロイデス門およびクラミジア門（クラミジアは遺伝子水平伝播によりＮａ^＋−ＮＱＲを受け入れ得る）中で見出される。

グラム陽性クロストリジウム科（クロストリジウム・ディフィシレおよびその他の病原性クロストリジウム科、例えば、ウェルシュ菌（壊疽、食中毒）、クロストリジウム・テタニ（破傷風）、ボツリヌス菌）は祖先型のＲＦＮと呼ばれるＮａ^＋−ＮＱＲ酵素を有する。ＲＦＮはサブユニットＲｆｎＤを含み、これは、ＮｑｒＢ（コロルマイシンにより標的にされる）に相同であるが、ＮｑｒＢ由来のＧｌｙ１４０−Ｇｌｙ１４１対はＲｆｎＤで保存されていない。

例証の目的のために、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物によって特徴付けられるフラノン環およびＮ結合型置換炭化水素鎖を有する化合物を化学合成し、第１セットの実験例において抗生物質活性を試験した。この化合物はＰＥＧ−２と呼ばれ、その化学構造は下記の通りである。

ＰＥＧ−２の抗生物質活性の実証をヒーラ細胞のトラコーマ病原体感染モデルアッセイで実施した。ＰＥＧ−２活性はまた、コロルマイシンおよび種々のホモセリンラクトンと比較した。この第１セットの実験例は、例示のみの目的のためであり、説明を限定することを意図していない。

トラコーマ病原体（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）増殖および処置は以下の通り実施した。トラコーマ病原体をヒーラ細胞で増殖させた。シクロヘキサミド処置ヒーラ細胞中でトラコーマ病原体の力価を測定し、使用した濃度を単位ｍＬ当たりの封入体形成単位（ＩＦＵ）として表した。

ＰＥＧ−２を（ストック濃度５０ｍＭ）でＤＭＳＯ中に可溶化した。ＰＥＧ−２での処置中に、引き続き希釈を行って、対応する量のＤＭＳＯを常に対照に加えた。

細胞毒性アッセイを次のように実施した。ヒーラ、ＨＥＫ２９３および初代ＶＳＭ細胞を５ｘ１０^３細胞／ウエルで９６ウエルプレートに播種し、コロルマイシン、ＰＥＧ−２またはホモセリンラクトンと共に、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を含むＤＭＥＭ中でインキュベートした。４８時間後、生存細胞中の細胞質酵素活性に基づいて、生細胞の数を比色分析酵素アッセイにより測定した。

感染のレベルの評価を以下のように実施した。ヒーラ細胞を３ｘ１０^４細胞／ウエルで２４ウエルプレートのカバーガラス上に播種し、トラコーマ病原体を接種した後、抗生物質（またはその他の着目化合物）で処置した。４８時間後、感染細胞を１００％メタノールで固定後、抗クラミジアモノクローナル抗体と共にインキュベートした。ＦＩＴＣ標識二次抗体および対比染色としてのＤＡＰＩで染色することにより封入体を可視化した。試料を蛍光顕微鏡で検査した。１００細胞当たりの封入体の数を計算した。

コロルマイシン（スキームを図１に示す）およびＰＥＧ−２（スキームを図２に示す）の抗クラミジア活性の評価を次のように実施した。細胞をトラコーマ病原体に感染させ、種々の濃度の選択抗生物質で処置した。４８時間後、トラコーマ病原体を集め（Ｐ１）、新しい細胞に感染させるのに使用した。引き続いてトラコーマ病原体の収集を行って、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４およびＰ５トラコーマ病原体ストックを得た。ＰＥＧ−２で処置後に細胞に感染させるために使用するトラコーマ病原体の希釈は、封入体を可視化するために最小限にする必要があった。（図２のスキームを参照されたい）。コロルマイシン処置の最後の継代のトラコーマ病原体（Ｐ５）の収集物およびＰＥＧ−２処置のトラコーマ病原体の全ての継代の収集物を、処置クラミジアの感染力を確定するために使用した（図３にスキームを示す）。

コロルマイシンおよびＰＥＧ−２構造の比較を図４に示す。ＰＥＧ−２は、エポキシ基を取り除いたコロルマイシンの誘導体分子である。

１９９７年に、吉川ら（日本特許第３９０５６０号（２００７年４月１８日公告））は、海洋細菌シュードアルテロモナス属菌種Ｆ−４２０からコロルマイシンを単離し、グラム陰性マリンビブリオの増殖に対するコロルマイシンの阻害活性を実証した。コロルマイシンは、Ｎａ^＋−ＮＱＲを阻害するために現時点で入手可能な最良の最も特異的な阻害剤である。コロルマイシンは、特異的で、極めて強力なＮａ^＋−ＮＱＲによるキノン還元の阻害剤で、８２ｐＭの阻害剤定数を有する（一方、ＨＱＮＯは３００ｎＭのＫｉである）。ＨＱＮＯおよびコロルマイシンは両方ともＮａ^＋−ＮＱＲ複合体中に共通の結合部位を有する（相互排他的阻害剤）。これは、微量の添加抗生物質のみがその標的（Ｎａ^＋−ＮＱＲ）に到達するという点で、アクセスのしやすさの問題が起こり得ることを示す。さらに、コロルマイシンは、動物、より具体的には哺乳動物、さらにより具体的にはヒトでの使用のために開発されてこなかった。したがって、第１の実験目標は、動物細胞、例えば、ヒト細胞の細胞内感染に対するコロルマイシンの効力を測定することであった。第２の実験目標は、コロルマイシンに対する代替物を設計し、動物細胞、例えば、ヒト細胞の細胞内感染における毒性および／または効力の結果を比較することであった。

図５および６は、コロルマイシンが真核細胞、より具体的にはヒト細胞のトラコーマ病原体感染に対し効果的であることを示す。しかし、細胞培養モデルでのこれらのコロルマイシンの濃度は、単離Ｎａ^＋−ＮＱＲの調製物（約８０ｐＭのＫｉ）の場合より、約１０，０００倍高い（マイクロモル範囲）。したがって、これらの結果は、想定したアクセスのしやすさの問題を裏付けているように見える。さらに、図７は、コロルマイシンが、抗菌作用を示すのと同じ濃度で、初代細胞に対し毒性があることを示す。コロルマイシンの動物細胞、より具体的にはヒト細胞に対する毒性の問題は、これまで認識されず、以前に発表された文献で立証されてこなかった新規な知見である。これらのデータは、天然のコロルマイシンがヒトの処置に抗生物質として有用ではないことを明確に示している。

図８は、ＰＥＧ−２が真核細胞、より具体的にはヒト細胞に対し非毒性であることを示す。さらに、ヒーラおよびＨＥＫ２９３細胞株ならびに初代血管平滑筋細胞の試験により、５０μＭ（図示せず）までのＰＥＧ−２濃度で毒作用がないことが認められた。

図９〜１３は、ＰＥＧ−２が、真核細胞、より具体的にはヒト細胞のトラコーマ病原体感染に対し抗生物質として効果的であることを示す。さらに、図１４は、ＰＥＧ−２が、抗クラミジア剤として天然のコロルマイシンよりほぼ１，０００倍効果的であることを示す。したがって、ＰＥＧ−２は、ヒト細胞の微生物感染の抗生物質処置における毒性および効力の両方に関して、コロルマイシンを改良する。さらに、ＰＥＧ−２はさらなる薬物設計のための優れたプラットフォームともいえるものである。

ホモセリンラクトンが真核生物における抗生物質として機能する可能性も調査した。代表的ホモセリンラクトンを図１５に示す。表２の結果は、試験したホモセリンラクトンはヒト細胞に対し極めて毒性である（Ｎ−３−オキソ−ドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン）か、または抗クラミジア剤として効果的ではない（その他の３種のホモセリンラクトン）ことを示す。これらの結果は、ＰＥＧ−２のフラノン環がＰＥＧ−２抗生物質活性の効力に対し、重要な寄与因子であり得ることを示唆している。

ＰＥＧ−２で処置した感染細胞の細胞内の酸性化をモニターすることにより、ＰＥＧ−２の作用機序も調査した。ＰＥＧ−２がＮａ^＋−ＮＱＲおよびナトリウム輸送力の阻害により作用している場合には、感染細胞内のＮａ^＋およびＨ^＋濃度に対し影響を与えることが予測されるであろう。ヒーラ細胞をトラコーマ病原体に感染させ、蛍光指示染料で細胞内酸性化をモニターした。

培養液中の真核細胞のトラコーマ病原体感染は、感染の発生時に宿主細胞の細胞質を酸性化する。図１６および１７に示すように、ＰＥＧ−２は初期トラコーマ病原体誘発酸性化を少なくとも２時間遅らせることができ、その後の酸性化を減少させる。

細胞内Ｈ^＋に対するこれら両方の効果は、病原菌感染に対し特定されたエネルギー代謝の提案された作用およびＮａ^＋−ＮＱＲ活性の阻害によるＰＥＧ−２の分子作用機序と一致する。

ＰＥＧ−２の立体異性体を含むさらなるＰＥＧ分子の合成を行い、抗生物質活性を示すために、第２セットの実験例で実験的に試験した。この第２セットの実験例では、ＰＥＧ−２は、第１セットの実験例における上記の非立体特異的フラノン抗生物質であるが、ＰＥＧ−２Ｓは、対応する立体特異的フラノン抗生物質である。次の第２セットの実験例は、例示のみの目的のためであり、説明を限定することを意図していない。

自由生活性バクテリアの増殖アッセイ。大腸菌、ラクチス乳酸菌および大腸レンサ球菌の増殖に対する合成Ｎａ^＋−ＮＱＲ阻害剤ＰＥＧ−２の効果を以下のようにアッセイした。オーバーナイトスターター培養液を標準的トリプチックソイブロス（ＴＳＢ、Ｄｉｆｃｏ）中で好気的に増殖させ、これを使って、９６ディープウエルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ）の２００μｌのＴＳＢ培地に０．０５の初期ＯＤ６００で接種した。得られた培養液に、０．５、１．０、２．０、５．０、１０．０、２０．０、および５０．０μＭのＰＥＧ−２（または「ゼロ」対照として純ＤＭＳＯ）を追加し、活発に通気を行いながら３７℃で２４時間増殖させた。６、１８、および２４時間で、Ｂｉｏ−ＲａｄのｉＭａｒｋマイクロプレートリーダーでプレートを走査することによりＯＤ６００として増殖を測定した。１８および２４時間に採取した試料に対し、細菌培養の一定分量を使って予め暖めた増殖培地で系列希釈を調製した。この実験を少なくとも３回繰り返した。

抗菌薬感受性試験の実施基準（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ；Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ―Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｖｏｌｕｍｅ ３２ Ｎｕｍｂｅｒ ５，２０１２）にしたがって、予め還元したＢＡＫプレートへの液滴法により、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＡＴＣＣ７０００５７）に対するＰＥＧ−２Ｓの評価を実施した。

抗生物質の抗クラミジア特性の評価。ＭＩＣ５０（クラミジア封入体の形成を５０％抑制する抗生物質最小濃度）測定のために、クラミジア播種の前に、ヒーラ細胞を２４ウエルまたは９６ウエルプレートで一晩増殖させた。少量のＳＰＧ（０．２２Ｍのスクロース、８．６ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、３．８ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭのグルタミン酸、０．２μｍ濾過、ｐＨ７．４）中の細胞に基本小体を適用し、インキュベーションの２時間後、非付着性基本小体を取り出し、感染細胞を、シクロヘキシミド（１．０μｇ／ｍｌ）の存在下、５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の異なる濃度の抗生物質で処置した。４２時間後、封入体を免疫細胞反応により可視化した。

コロルマイシン（スキーム１）およびＰＥＧ−２（スキーム２）のクラミジア殺菌効果を抑止するために、ヒーラ細胞をトラコーマ病原体に感染させ、種々の濃度の抗生物質で処置した。４８時間後、トラコーマ病原体を集め（Ｐ１）、新しい細胞に感染させるのに使用した。引き続いてトラコーマ病原体の収集を行って、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４およびＰ５トラコーマ病原体ストックを得た。ＰＥＧ−２で処置後に細胞に感染させるために使用するトラコーマ病原体の希釈は、封入体を可視化するために最小限にする必要があった。（下記スキーム２を参照）。コロルマイシン処置の最後の継代のトラコーマ病原体（Ｐ５）の収集物およびＰＥＧ−２処置のトラコーマ病原体の全ての継代の収集物を、処置トラコーマ病原体の感染力を確定するために使用した。コロルマイシン、ＰＥＧ−２およびＰＥＧ−２Ｓの最小クラミジア殺菌濃度（ＭＣＣ２）を、処置による感染の２回の継代後に計算し、９０％を超える感染の抑止を反映した。全ての実験で、封入体を免疫細胞化学により可視化した。

免疫細胞反応。細胞を２４ウエルプレートのカバーガラス上に（２〜４ｘ１０^４細胞／ウエル）またはガラスボトム９６ウエルプレート上に（１０^４細胞／ウエル）播種し、一晩後にトラコーマ病原体を接種した。４２時間後、感染細胞を９０％アセトン（または９６ウエルプレートの場合は１００％メタノール）で固定後、抗クラミジア抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にインキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を二次抗体として使用した。ＤＡＰＩ染色溶液（３００ｎＭ）をカバーガラスに加え、細胞核を特定した。蛍光倒立顕微鏡（ＴＥ−２０００ｓ；Ｎｉｋｏｎ）を使って封入体を可視化し、Ａｄｏｂｅ Ｓｔｏｃｋ Ｐｈｏｔｏｓ ＣＳ３．Ｉｎｋソフトウェアを使って細胞および封入体を計数した。

細胞増殖アッセイ。細胞を５ｘ１０^３細胞／ウエルで９６ウエルプレートに播種し、トラコーマ病原体と共に、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ.）を含むＤＭＥＭ中でインキュベートした。４８時間後、生存細胞中の細胞質酵素活性に基づいて、生細胞の数を比色分析酵素アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により測定した（Ｃｏｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｕｓｅ ｏｆ ａｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ／ｆｏｒｍａｚａｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｓｓａｙｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９１；３：２０７−２１２）。組織培地中のホルマザン生成物の吸光度をマイクロプレートリーダーを使って５００ｎｍで測定した。

コレラ菌細胞由来の細菌より小さい膜小胞の調製。コレラ菌株由来膜小胞を以前の記載（Ｄｉｂｒｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｏｓｍｏｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａｇ^＋ ｉｎ Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．２００２；４６：２６６８−２６７０）にいくつかの修正を加えて調製した。対数増殖中期の細胞を遠心分離により採取し、１回洗浄し、１００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＳＯ_４、２０ｍＭのヘペストリスを含む、ｐＨ８．０の緩衝液Ａ中に再懸濁した。１６，０００ｐｓｉのフレンチプレス（Ａｍｉｎｃｏ）を通すことにより細胞を破壊した。壊れていない細胞および壊死組織片を低速遠心分離により取り除き、１８０，０００ｇで９０分間遠心分離後に小胞を収集した。膜ペレットを２０〜３０ｍｇタンパク質／ｍＬで緩衝液Ａ中に懸濁し、液体窒素中で急速凍結して、−８０℃で使用するまで保存した。細菌より小さい小胞中のタンパク質含量をＢｉｏ−Ｒａｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにより測定した。

細菌より小さい小胞中のＮａ^＋−ＮＱＲ活性アッセイ。コレラ菌の膜は、ＮＡＤＨの酸化が可能な２種の酵素：Ｎａ^＋−ＮＱＲおよびＨＤＨ−２（非結合ＮＡＤＨ：２型ユビキノン酸化還元酵素）を含むが、Ｎａ^＋−ＮＱＲのみがｄＮＡＤＨ（デアミノ−ＮＡＤＨ、すなわちニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド）を酸化することができる。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＲＦ−１５０１分光蛍光光度計を使って、４４０ｎｍ（励起光λ＝３４０ｎｍ）の蛍光の変化を追跡することにより、細菌より小さいコレラ菌小胞中のＮａ^＋−ＮＱＲ活性をｄＮＡＤＨ（ε_３４０＝６．２２ｍＭ^−１ｃｍ^−１）の酸化として、２５℃で測定した。このアッセイは、１５μＭのＮａ^＋−ｄＮａＤＨを補充した緩衝液Ａ中、一定の撹拌下で実施した。反応を小胞（５０μｇの分割量のタンパク質）の添加により開始した。較正アッセイにより、４４０ｎｍでの蛍光は、実験緩衝液中の［ｄＮＡＤＨ］に対して、添加ｄＮＡＤＨの２０μＭまで直線であった（図示せず）。

細胞培養液中の細胞内のｐＨおよびナトリウムの測定。ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＡＭおよびＣｏｒｏＮａ Ｇｒｅｅｎ Ｓｏｄｉｕｍ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ（両方ともＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って、細胞内のｐＨ（ｐＨ_ｉ）および細胞内のナトリウム（Ｎａ^＋ _ｉ）濃度を測定した。ＨＥＫ２９３細胞を２４ウエルプレートに播種し、５％のＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で一晩のインキュベーション後に、トラコーマ病原体を感染させた。トラコーマ病原体と共に２時間のインキュベーション後、細胞を異なる濃度のＰＥＧ−２Ｓで処置し、製造業者のプロトコルにしたがって、異なる時点でのｐＨ_ｉおよびＮａ^＋ _ｉ測定に供した。全ての評価で、実験前に較正曲線を取得した。蛍光倒立顕微鏡（ＴＥ−２０００ｓ Ｎｉｋｏｎ）を使って画像を取得し、ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓイメージングソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使って、平均強度を定量化した。

統計分析 別に定める場合を除き、統計分析データは平均±ＳＥＭとして表される。処理群間の差異は、総一対多重比較法（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ Ｍｅｔｈｏｄ）を使って一元配置分散分析により評価した。Ｐ≦０．０５の確率を、統計的に有意であると見なした。

クラミジア侵入は、感染細胞のイオン恒常性を混乱させる。ＨＥＫ２９３細胞培養物に感染したトラコーマ病原体に起因する細胞質ｐＨおよびＮａ^＋含量の変化を図１８に示す。非感染対照中の内部ｐＨは、観察の過程で変化しなかったが（２時間および６時間での約７．７５の値はこの系統のゼロ時間での非感染細胞中のｐＨ（図示せず）と同じであった）、２時間の感染による感染細胞では、細胞質ｐＨは約６．６に低下し、６時間までに約６．４に達した（図１８Ａ）。クラミジアにより感染された細胞の細胞質の大きな酸性化が想定された。理由は、感染の開始時に、この寄生生物は２種の好ましいエネルギー基質であるＡＴＰおよびブドウ糖を急速に消費するためである。

さらに、クラミジア網様体（ＲＢ）の代謝作用により生ずる宿主ＡＴＰプールの枯渇に加えて、細胞質の相対的酸性化は、（ｉ）Ｎａ^＋／Ｋ^＋ＡＴＰアーゼによるＮａ^＋搬出を遅くし、（ｉｉ）細胞膜に存在するＮａ^＋／Ｈ^＋交換輸送体（単一または複数）を介したＮａ^＋取り込みを刺激し、したがって、細胞内ナトリウムの上昇がもたらされるであろうということが想定された。図１８Ｂで示された非感染および感染ＨＥＫ２９３細胞中の内部Ｎａ^＋の平行測定は、クラミジア感染細胞（黒色バー）ではＮａ^＋が徐々に増加するが、対照非感染細胞（白抜きバー）では観察された酸性化に比べて遅れたことを実際に示す。

クラミジアＮａ^＋−ＮＱＲの阻害剤であるコロルマイシンは、ＲＢの増殖を抑制するが、コロルマイシンは哺乳動物細胞には有毒性である。クラミジア属のその他のメンバーと同様に、トラコーマ病原体は、アミノ酸およびジカルボキシレートを含む多くの重要な基質の蓄積のためのＮａ^＋依存性共輸送体をコードする。したがって、膜貫通ナトリウム勾配の維持は、トラコーマ病原体の増殖のための必要条件になる。この細菌では、Ｎａ^＋−ＮＱＲは主要な一次Ｎａ^＋ポンプであるので、その阻害は強力な抗クラミジア効果を有する可能性がある。海洋細菌であるシュードアルテロモナス属菌種から最初に単離された抗生物質のコロルマイシンは、Ｎａ^＋−ＮＱＲ阻害剤であり、海洋細菌に対しては効果的であるが地上の微生物に対しては効果的ではない殺菌剤であることが知られている（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｋｏｒｏｒｍｉｃｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｒｉｎｅ ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ，ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９９７；５０：９４９−９５３）。コロルマイシンの魅力的な特徴は、（ｉ）その高効率（単離された酵素の調製物で、Ｋ_ｉ≒８ｘ１０^−１１Ｍ）および（ｉｉ）コロルマイシンは明らかにＮａ^＋非依存性ＮＡＤＨ酸化還元酵素に対しては効果がないというような、特異性である。

コロルマイシンは、潜在的クラミジアＮａ^＋−ＮＱＲ標的化抗生物質に対し、細胞培養モデルでトラコーマ病原体の増殖に対するその効果を試験することにより、上記第１セットの実験例で評価された。コロルマイシンは、１０〜２０μＭの濃度で添加された場合、トラコーマ病原体に対し効果的であることが見出された（図５および６）。蛍光顕微鏡画像は、コロルマイシンで処置した細胞培養液中の有効なトラコーマ病原体細胞の数の減少を明確に示した（図５）。コロルマイシンによる５回の連続処置後の感染力の急速な減少は、１０μＭの添加抗生物質で既に明らかであり、２０μＭでは、クラミジア封入体の数は、対照の２０％未満であった（図６）。コロルマイシン（１回目の処置後）に対する計算ＭＩＣ_５０は、ほぼ３．００ｍＭであった。この濃度は、単離したＮａ^＋−ＮＱＲに対し測定された有効阻害濃度を約６桁超えている。このような大きな差異は、コロルマイシン分子（図４）の本質的な疎水性および多くの膜障壁があり、これらによりコロルマイシンが標的に達する前にインサイツで除去される可能性があることを考慮すれば全く驚くべきことではない。また、この抗生物質は哺乳動物および／またはクラミジア細胞により、或る程度まで代謝され得ると主張することもできるであろう。

都合の悪いことに、コロルマイシンはまた、哺乳動物細胞に対し明白な細胞毒性作用を有した（図７）。血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の初代培養液の増殖を、潜在的に有毒性の傷害に対する細胞応答の感受性実験モデルとして使用した。図７に示すように、細胞はナノモル濃度の添加抗生物質に対しても感受性であった。５〜１５μＭの濃度のコロルマイシンは細胞力価を約１０％低下させた。したがって、コロルマイシンを使った実験によって、代謝におけるＮａ^＋−ＮＱＲの重要な役割、したがって、トラコーマ病原体の増殖および感染力を確証したが、この阻害剤は、その毒作用および感染の細胞培養モデル（これは感染組織の合理的な１次近似と見なすことが可能であろう）における低効率のために、抗クラミジア治療薬としては使用することができない。

合成Ｎａ^＋−ＮＱＲ阻害剤ＰＥＧ−２の設計。コロルマイシンおよび別のＮａ^＋−ＮＱＲ阻害剤のＨＱＮＯは、膜貫通型Ｎａ^＋輸送経路を収容するＮａ^＋−ＮＱＲ複合体の内在性膜サブユニットＮｑｒＢに結合する。ＨＱＮＯおよびコロルマイシンは、相互に排他的阻害剤であり、ＮｑｒＢ上のそれらの結合部位は同一ではないが重なり合うと想定される。コロルマイシンの化学構造を図４に示す。コロルマイシン分子の４つの離れたキラル中心は、８種の可能な立体異性体を可能とするが、それらの１種の（５Ｓ、３’Ｒ、９’Ｓ、１０’Ｒ）異性体のみ（図４に示す）が天然の抗生物質である。

ＨＱＮＯおよびコロルマイシン両方の作用モードは、キノン様「ヘッド」がＮｑｒＢの結合を担う活性構造モジュールであり得ること、および極性基の形状が特定の阻害剤の効力を決定し得ることを示している。両方の構造はまた、長い脂肪族「テール」を有し、これは膜障壁の横断および標的への阻害剤のドッキング（それらは脂質二重層内からＮｑｒＢに結合し得る）の両方に重要であり得る。コロルマイシンでは、共役ジエン（４’−７’Ｃ）、続けて、９’Ｃ−１０’Ｃのエポキシ基が、生物学的に活性なコロルマイシンの「ヘッド」を無秩序な「テール」から分離する堅い「スペーサー」の役割を果たし得る。９’Ｃ−１０’Ｃのエポキシ基は、コロルマイシンの毒性源である可能性があるとして特定された。該エポキシ基はアミノ、ヒドロキシルおよびカルボキシル基ならびに無機酸と反応することが知られている。遅延および即時エポキシ皮膚炎が報告されている。特定のエポキシ化合物は変異誘発の潜在能力を有する（すなわち、それらは潜在的に発がん性である）。

これら全ての構造的考察を考慮して、非毒性Ｎａ^＋−ＮＱＲ阻害剤の設計に次のアプローチを採用した：（ｉ）天然のコロルマイシンの細胞毒性作用を除くために、可能な毒性源としてのエポキシ基を構造から除いた。（ｉｉ）さらに、コロルマイシンの脂肪族「テール」を７炭素原子に短縮して、分子の全体的疎水性を減らし、それにより、効果の生じる抗クラミジア濃度を低下させることを可能とした。このアプローチにより、化合物ＰＥＧ−２（図４）が得られ、これは強力なＮａ^＋−ＮＱＲ阻害剤であることを示した。また、これはさらなるＮａ^＋−ＮＱＲ阻害剤の開発のための構造的プラットフォームとして使用できる。

ＰＥＧ−２の薬理学的特性。２つのキラル中心の存在に起因して、ＰＥＧ−２の４種の立体異性体が可能である（図４参照）。Ｅｎａｍｉｎｅ Ｌｔｄ（Ｋｉｅｖ，Ｕｋｒａｉｎｅ）での非立体特異的合成の過程で得られたＰＥＧ−２の調製物を、上記の第１セットの実験例に使用した。製造業者の報告により、この鏡像異性体混合物は、１０％以下の図４の活性な異性体を含むと推定した。

蛍光顕微鏡により、ＰＥＧ−２による１回のみの処置で既にヒーラ細胞へのトラコーマ病原体の感染に対する大きな効果があった（図９）。ＰＥＧ−２の存在下で形成されたクラミジア封入体は、対照非処理細胞培養物（図９、左の像）に比べて、中空（図９．右の像）であった。また、それらは著しく小さかった（図１０）。したがって、ＰＥＧ−２は抗クラミジア活性を保持していた。コロルマイシンとの直接比較により、ＰＥＧ−２の鏡像異性体混合物は大幅に効果的であり（図１４）、５回の１５μＭのＰＥＧ−２での連続処置後、封入体の数は対照の０．０１％で、一方、同じ濃度の天然コロルマイシンでは封入体の数は４．８％であることが示された。したがって、この感染モデルでは、所与のＰＥＧ−２バッチの抗クラミジア作用は、コロルマイシンの作用を少なくとも２桁上回っていた。ＰＥＧ−２は投与量依存的に作用する。図１９に示すように、１５μＭのＰＥＧ−２鏡像異性体混合物による１回目の処置では、約５倍の感染力の低下が得られた（次の継代中のクラミジア封入体の数として測定して）が、５回の連続処置後では、検出可能な封入体の数は、１０，０００倍少なかった。ＰＥＧ−２Ｓは抗クラミジア剤としてＰＥＧ−２よりさらに効果的であった（表３）：ＰＥＧ−２ＳのＭＩＣ５０は０．７μＭで、ＰＥＧ−２のＭＩＣ５０は１０μＭであった。この傾向は、２回の連続処置後も持続した。ＰＥＧ−２ＳのＭＩＣ５０_２は０．２５μＭであるのに対して、ＰＥＧ−２のＭＩＣ５０_２は４μＭであった（表３）。

ＰＥＧ−２は非毒性で高度に選択的な抗菌薬である。ＰＥＧ−２ならびにＰＥＧ−２Ｓは、哺乳動物細胞に低細胞毒性の利益を与える：天然のコロルマイシンとは対照的に、２０μＭの添加ＰＥＧ−２まで初代細胞培養液（ＶＳＭＣ）に対するＰＥＧ−２の毒作用がないことが検出された（図８；図７と比較されたい）。したがって、９’Ｃ−１０’Ｃのコロルマイシンエポキシド（図４参照）がコロルマイシンの細胞毒性の主要な理由であるように思われる。

天然のコロルマイシンの最も魅力ある特徴の１つは、阻害剤としての高い選択性である。コロルマイシンはＮａ^＋−ＮＱＲのみを阻害し、また、この酵素は哺乳動物細胞、ならびに大部分の無害細菌性細菌叢および自由生活性菌種中に同族体を有さない。この観点では、狭い範囲で標的とするまたは選択的Ｎａ^＋−ＮＱＲ阻害剤は、従来の抗生物質で現在発生しているような、望ましくない副作用がなく、複数の環境種中の変異体選択およびその後の水平遺伝子伝達を介した薬剤耐性の無制御伝播を誘発する可能性を最小化する「クリーンな抗生物質（ｃｌｅａｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」であろう。

図２０に示すように、１．０〜５０μＭで添加されたＰＥＧ−２Ｓは、無害消化管細菌叢の代表的なＮａ^＋−ＮＱＲ陰性細菌の、大腸菌（上段パネル）、エンテロコッカス・フィカリス（中断パネル）、およびラクチス乳酸菌（下段パネル）の増殖に影響を与えなかった。コロルマイシンの抗菌作用を試験するために定常的に使用されている標準的ろ紙ディスク法による病原性クロストリジウム・ディフィシレの増殖のＰＥＧ−２Ｓに対する感受性試験では同じ結果を得た：ＰＥＧ−２Ｓは、試験した濃度で（０．５μＭ〜５０μＭ）、クロストリジウム・ディフィシレ、ＡＴＣＣ７０００５７の増殖に影響を与えない（データは示さず）。注目すべきことに、グラム陽性クロストリジウム・ディフィシレは祖先型のＮａ^＋−ＮＱＲ、ＲＮＦを有する。すべての既知のＮａ^＋−ＮＱＲ酵素のＮｑｒＢサブユニット中で保存され、コロルマイシンの結合に結びつけられているＧｌｙ１４０残基は、ＲＮＦの相同サブユニット中では存在しない。したがって、ＰＥＧ−２およびＰＥＧ−２Ｓは、コロルマイシンに特徴的な阻害作用の高い選択性を維持したと結論付けることができる。

ＰＥＧ−２ＳによるＮａ^＋−ＮＱＲの阻害の直接測定。Ｎａ^＋−ＮＱＲの活性は、多くの実験構成で測定されるであろう。この研究では、特に魅力的なモデルは、細菌より小さい膜小胞中のＮＡＤＨのＮａ^＋−ＮＱＲ媒介酸化の記録である。このアプローチは、Ｎａ^＋−ＮＱＲ活性を直接リアルタイムでモニターでき、生理学的に適切な（天然の膜中に配置され、ＮＡＤＨから呼吸鎖に電子を供給している）バックグラウンド中で機能しているが、追加の透過障壁および細胞質代謝からの影響のない酵素を用いてＮａ^＋−ＮＱＲ阻害剤を試験できる。

危険なヒト病原体コレラ菌由来のＮａ^＋−ＮＱＲは、最も広範に調査された代表的種類である。したがって、この酵素を選択してＰＥＧ−２の阻害特性を試験した。細菌より小さい小胞中でのこれらの実験のために、Ｃａｎａｍ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ（Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｃａｎａｄａ）で立体特異的合成により製造された、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−２Ｓの精製活性立体異性体（構造は図４に示す）を使用した。

Ｎａ^＋−ＮＱＲに加えて、コレラ菌の膜は、別のＮＡＤＨ酸化酵素、非結合ＮＤＨ−２（非結合ＮＡＤＨ：２型ユビキノン酸化還元酵素）を含む。Ｎａ^＋−ＮＱＲはＮＡＤＨおよびその類似体ｄＮＡＤＨを類似の速度で酸化するが、ＮＤＨ−２はｄＮＡＤＨを基質として使用できない。したがって、ｄＮＡＤＨオキシダーゼ活性の膜小胞を使って、Ｎａ^＋−ＮＱＲを選択的にモニターし得るであろう。実際に、染色体のｎｑｒＡ−Ｆ欠失により機能性Ｎａ^＋−ＮＱＲを除去すると、変異体コレラ菌株から単離した膜小胞はｄＮＡＤＨを酸化することができない（図２１Ａ、記録（ａ））。対照的に、同系のＮａ^＋−ＮＱＲ陽性株から単離した小胞は、ＰＥＧ−２Ｓ感受性でｄＮＡＤＨを酸化した（図２１Ａ、記録（ｂ））。この実験モデルでのＮａ^＋−ＮＱＲ活性のＰＥＧ−２Ｓによる力価測定により、１．７６ｎＭのＭＩＣ_５０を得た（図２１Ｂ）。比較すると、同じ実験モデルで測定したＨＱＮＯのＩＣ_５０は１３０ｎＭであった。

ＰＥＧ−２Ｓは、細胞培養モデルでのクラミジア感染を妨害する。トラコーマ病原体に感染したＨＥＫ２９３細胞中の細胞質ｐＨの直接モニターにより、クラミジア感染の初期段階中の急速で強力な酸性化の（図１８Ａに示す結果に基づいた）予測を確認した（図２２Ａ、黒色三角形）。非感染細胞（中空三角形）における感染の最初の約５時間中のｐＨのわずかな一時的な変化は、統計的に有意ではなかったが、１．０μＭでのＰＥＧ−２Ｓの添加（中空正方形）は、感染の最初の５時間以内でのクラミジアによる酸性化を遮断し、内部ｐＨ約７．６の、ほぼ完全な緩和をもたらした。２．５μＭでは、ＰＥＧ−２Ｓは、クラミジア誘発酸性化を完全に防止した（図２２Ａ、黒色円）。注目すべきことは、観察された感染ＨＥＫ２９３細胞中の細胞質の酸性化は、長時間持続したことである。これは、使用した実験培地中の高ブドウ糖含量に起因すると思われる。

宿主細胞質の初期の酸性化は、存在するＮａ^＋／Ｈ^＋交換機構を活性化し、細胞内［Ｎａ^＋］の上昇をもたらすはずである。図２２Ａに示すように、感染細胞の内部ｐＨは、恒常的レベルの７．７５から感染の約５時間後の６．５に実際に低下する（図２２Ａ、黒色三角形）。細胞質［Ｎａ^＋］の大きな上昇（図２２Ｂ、黒色三角形）からわかるように、この驚くべき酸性化は、ＨＥＫ２９３細胞の原形質膜中で機能しているＮＨＥ型Ｎａ^＋／Ｈ^＋交換輸送体（単一または複数）を活性化したようである。図１８に示す結果に基づいて予測されるように、酸性化に比べて、ナトリウム蓄積は遅延性であった（図１８ＡおよびＢ；図２２ＡおよびＢの黒色三角形を比較されたい）。この場合も、細胞内のナトリウム蓄積は、低μＭのＰＥＧ−２Ｓに感受性であった（図２２Ｂ、中空正方形および黒色円）。

まとめると、図１８Ａ、Ｂおよび図２２Ａ、Ｂに要約されたデータは、侵入クラミジアによる感染細胞のイオン恒常性の操作についての考え方を支持し、感染過程に対するクラミジアＮａ^＋−ＮＱＲの重要性を実証している。

これらのデータは、ＰＥＧ−２およびＰＥＧ−２Ｓの抗生物質としてのおよび代替抗生物質のための薬物誘導体のさらなる設計のためのプラットフォームとしての使用を支持する。ＰＥＧ−３およびＰＥＧ−４を含むいくつかの期待が持てる例示的設計薬物が、ＰＥＧ−２と並べて図２３に提供されている。

図２３から明らかなように、ＰＥＧ−３およびＰＥＧ−４は、分子の脂肪族モジュールの遠位端に「遮蔽された」正電荷を有する。ＰＥＧ−２に比べて、ＰＥＧ−３は、（ａ）より可溶性で、（ｂ）クラミジア細胞質中でその濃度勾配に抗してより多く蓄積できることが予測される。グアニジニウム誘導体のＰＥＧ−４は、これらの有利な特徴をＰＥＧ−３と共有するであろう。さらに、ＰＥＧ−４は、感染細胞中のＮＨＥ−１交換輸送体を潜在的に抑制し（極めて徐々に）、したがって、細胞内［Ｎａ^＋］を低下させ、また、クラミジア感染の発生をさらに妨害するように潜在的に機能するであろう。

さらなる薬物誘導体が、ＰＥＧ−２プラットフォームから設計および合成され、溶解度および抗生物質活性が試験された。抗生物質活性は、第１と第２セット両方の実験例で、上記の細胞培養実験モデルのクラミジア感染を使って評価される。図２４に示す蛍光顕微鏡結果は、それぞれの誘導体での処置によりクラミジア感染細胞中の封入体サイズが小さくなることを示す。

表４は、参照値を得るために含めたＰＥＧ−２Ｓを加えた試験をまとめた結果を示す。誘導体ＰＥＧ−６（Ｂｏｃ）、ＰＥＧ−１０、ＰＥＧ−１１、ＰＥＧ−１４はすべて、ＰＥＧ−２Ｓに比べて向上した溶解度を示し、ＰＥＧ−６（Ｂｏｃ）およびＰＥＧ−１０では特に高いＤＭＳＯ中溶解度が得られた。抗クラミジア効力に対する同等のＩＣ５０値を有する表４に示す全ての誘導体の抗生物質活性も示した。

本明細書で提供された結果はいくつかの新規知見を裏付ける。例えば、結果は、Ｎａ^＋−ＮＱＲ阻害を介した抗菌剤攻撃の新規方法を支持し、Ｎａ^＋−ＮＱＲ阻害による動物細胞の細菌感染症の抗生物質処置の新しい実証を与える。式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶにより包含されるＰＥＧ−２および関連化合物の有用性は、Ｎａ^＋−ＮＱＲ阻害に関する理論または機構により制限されないことは認識されるべきである。

新規知見の別の例は、以前に発見された天然の抗生物質コロルマイシンは、その化学構造からエポキシ基を除去してＰＥＧ−２を生成し、真核生物毒性を減らすことにより大きく改善できることである。エポキシ基の除去による薬物毒性のこの顕著な低減は新規であり、以前の文献によって認識されていない。新規知見の別の例は、ＰＥＧ−２が抗クラミジア剤として、コロルマイシンより向上した効力を与えることである。この増加した効力は新規であり、以前の文献によって認識されていない。新規知見の別の例は、裏付けとなるデータが、ＰＥＧ−２のさらなる薬物設計の修正のための、可能性のある、合理的な予測を示し、結果として、多種多様の病原菌中のＮａ^＋−ＮＱＲを阻害する効果的分子に導くことである。

本明細書で記載の実施形態は、何ら意図された普遍性の喪失なしに、例証する目的を意図するものである。またさらなる変形例、修正例およびこれらの組み合わせが意図されており、これらは、当業者なら気付くであろう。したがって、前述の詳細説明は、請求された主題の範囲、適用性、または構成を制限する意図はない。

Claims (19)

1. 式（ＩＩＩ）：
   

   

   の抗生物質化合物またはその塩もしくは立体異性体であって、式中、
   Ｒ^１〜Ｒ^３は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキル基から独立に選択され、Ｒ^５〜Ｒ^１０は、ＨまたはＣ１〜Ｃ５アルキル基から独立に選択され、
   Ｒ^４は、Ｈであり、
   Ｘ^１〜Ｘ^２は、＝Ｏ、ＨおよびＯＨからなる群より独立に選択され、
   Ｗは、水素および炭素原子のみからなる、１〜１５個の炭素原子の飽和非環式炭化水素鎖であり、
   Ｚは、ＣＨ_３である、
   抗生物質化合物またはその塩もしくは立体異性体。
2. ２個のみのキラル中心５Ｓおよび３’Ｒを有する、請求項１に記載の化合物。
3. Ｒ^４がＨであり、Ｘ^１が＝Ｏであり、Ｘ^２がＯＨである、請求項１または２に記載の化合物。
4. Ｒ^１〜Ｒ^３は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキル基から独立に選択され、
   Ｒ^５〜Ｒ^１０は、ＨまたはＣＨ_３から独立に選択され、
   Ｒ^４は、Ｈであり、
   Ｗは、水素および炭素原子のみからなる、１〜８個の炭素原子の飽和非環式炭化水素鎖である、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
5. Ｒ^１〜Ｒ^３は、ＨまたはＣ１〜Ｃ２アルキル基から独立に選択され、
   Ｒ^５〜Ｒ^１０は、ＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキル基から独立に選択され、
   Ｒ^４は、Ｈである、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
6. Ｒ^１〜Ｒ^２は、Ｃ１〜Ｃ２アルキル基から独立に選択され、
   Ｒ^３〜Ｒ^１０は、それぞれ独立にＨである、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
7. 

   からなる群より選択される、請求項１または２に記載の化合物。
8. グラム陰性細菌のＮａ^＋−ＮＱＲ活性を調節する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
9. 抗菌有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物と薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
10. グラム陰性細菌によって引き起こされる細菌性疾患の処置のための請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬組成物。
11. 前記細菌性疾患が、コレラ、急性胃腸炎、潰瘍、胃腸感染症、創傷感染、敗血症、食物媒介性下痢、下痢、胃腸炎、在郷軍人病、壊死性歯肉炎、成人性歯周炎、歯周炎、若年性歯周炎、髄膜炎、淋病、肺炎、心内膜炎、耳炎、軟性下疳、肺感染症、皮膜感染症、腹膜炎、外傷、パラチフス熱、腸チフス熱、ペスト、極東猩紅様熱、気管支炎、トラコーマ、腟炎、若年性肺炎、急性細気管支炎、ヒト胎児死亡、腹膜感染症、呼吸器感染症、中耳炎、眼感染症および中枢神経系感染症からなる群より選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記細菌性疾患は、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、ビブリオ・ガストロエンテリティス（Ｖｉｂｒｉｏ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、ビブリオ・ダムセラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｄａｍｓｅｌａ）、ビブリオ・フラビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、ビブリオ・ファーニッシイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｕｒｎｉｓｓｉｉ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）、ビブリオ・ホリセ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈｏｌｌｉｓａｅ）、ビブリオ・コスティコラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｏｓｔｉｃｏｌａ）、ビブリオ・ミミカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｉｍｉｃｕｓ）、ビブリオ・シンシンナティエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉｅｎｓｉｓ）、アエロモナス・ベロニイ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ）、アエロモナス・カビアエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）、在郷軍人病菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ジンジバリス菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、タネレラ・フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）、ヘモフィラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・シッカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｉｃｃａ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、フォトラブダス・アシンビオティカ（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ａｓｙｍｂｉｏｔｉｃａ）、サルモネラ菌（パラチフス菌）（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（ｓ．Ｐａｒａｔｙｐｈｉ））、サルモネラ菌（チフス菌）（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（ｓ．Ｔｙｐｈｉ））、クレブシェラ肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、仮性結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、トラコーマ病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、シムカニア・ネゲベンシスＺ（Ｓｉｍｋａｎｉａ ｎｅｇｅｖｅｎｓｉｓ Ｚ）、ワドリア・コンドロフィラ（Ｗａｄｄｌｉａ ｃｈｏｎｄｒｏｐｈｉｌａ）、動物パスツレラ症病原（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）およびカタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）からなる群より選択される細菌の感染により引き起こされる、請求項１０に記載の医薬組成物。
13. 前記グラム陰性細菌が、エンテロバクター目、ビブリオ目、パスツレラ目、エアロモナス目、シュードモナス目、およびナイセリア目からなる群より選択されるプロテオバクテリア門の菌種である、請求項１０に記載の医薬組成物。
14. 前記化合物は、哺乳動物細胞に対して非毒性の量で治療効果のある抗生物質である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. グラム陰性細菌によって引き起こされる細菌性疾患の処置のための医薬の製造のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物の使用。
16. 前記細菌性疾患が、コレラ、急性胃腸炎、潰瘍、胃腸感染症、創傷感染、敗血症、食物媒介性下痢、下痢、胃腸炎、在郷軍人病、壊死性歯肉炎、成人性歯周炎、歯周炎、若年性歯周炎、髄膜炎、淋病、肺炎、心内膜炎、耳炎、軟性下疳、肺感染症、皮膜感染症、腹膜炎、外傷、パラチフス熱、腸チフス熱、ペスト、極東猩紅様熱、気管支炎、トラコーマ、腟炎、若年性肺炎、急性細気管支炎、ヒト胎児死亡、腹膜感染症、呼吸器感染症、中耳炎、眼感染症および中枢神経系感染症からなる群より選択される、請求項１５に記載の使用。
17. 前記細菌性疾患が、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、ビブリオ・ガストロエンテリティス（Ｖｉｂｒｉｏ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、ビブリオ・ダムセラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｄａｍｓｅｌａ）、ビブリオ・フラビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、ビブリオ・ファーニッシイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｕｒｎｉｓｓｉｉ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）、ビブリオ・ホリセ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈｏｌｌｉｓａｅ）、ビブリオ・コスティコラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｏｓｔｉｃｏｌａ）、ビブリオ・ミミカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｉｍｉｃｕｓ）、ビブリオ・シンシンナティエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉｅｎｓｉｓ）、アエロモナス・ベロニイ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ）、アエロモナス・カビアエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）、在郷軍人病菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ジンジバリス菌（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、タネレラ・フォーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）、ヘモフィラス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・シッカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｉｃｃａ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、フォトラブダス・アシンビオティカ（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ａｓｙｍｂｉｏｔｉｃａ）、サルモネラ菌（パラチフス菌）（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（ｓ．Ｐａｒａｔｙｐｈｉ））、サルモネラ菌（チフス菌）（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（ｓ．Ｔｙｐｈｉ））、クレブシェラ肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、仮性結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、トラコーマ病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、シムカニア・ネゲベンシスＺ（Ｓｉｍｋａｎｉａ ｎｅｇｅｖｅｎｓｉｓ Ｚ）、ワドリア・コンドロフィラ（Ｗａｄｄｌｉａ ｃｈｏｎｄｒｏｐｈｉｌａ）、動物パスツレラ症病原（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）およびカタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）からなる群より選択される細菌の感染により引き起こされる、請求項１５に記載の使用。
18. 前記グラム陰性細菌が、エンテロバクター目、ビブリオ目、パスツレラ目、エアロモナス目、シュードモナス目、およびナイセリア目からなる群より選択されるプロテオバクテリア門の菌種である、請求項１５に記載の使用。
19. 前記化合物は、哺乳動物細胞に対して非毒性の量で治療効果のある抗生物質である、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の使用。

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