JP5816618B2 - 細菌のクオラムセンシングの共有結合阻害 - Google Patents
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Description
式中、nは、炭素の数(多くの実施形態では、この範囲は変化することがあるが、選択的にnは1乃至18であり;以下に更に詳しく述べるが、用語「n=a−b」は、nが、a、a+1・・・bからなる群より選択される任意の数であることを意味し;本明細書で使用する用語「m」は、提供された数の範囲に類似する意味を与える)を表し、R1は、任意の適切な反応性求電子官能基である。選択的に、R1は、チオール基、イソシアナート、イソチオシアナート、イソセレノシアナート、置換又は非置換反応性アミド官能基、NHC(=0)C=N−NH2、反応性置換環状基、(選択的に少なくとも一の不飽和結合を有する)反応性置換又は非置換複素環基、アルキルスルホナート(アルキルスルホナートは、B部分と組み合わせてアルキルスルホン酸エステルを形成する)、置換アルケニル、反応性アミノ、及びR3からなる基より選択される。本明細書では、用語「環状」は、芳香族及び非芳香族の両方を包含する。
;
式中、mは1乃至6;mは1が好ましく;及び
からなる群より選択される。
の場合は、nは選択的に1乃至14であり、nは7乃至11がより好ましく、(構造−5に示すように)nは8乃至10がもっとも好ましい。
の場合は、nは3乃至7が好ましく、nは4乃至6がより好ましく;(構造−6に示すように)nは4乃至6及びmは1がもっとも好ましい。
の場合は、(構造−15に示すように)nは9乃至11が好ましい。
の化合物を提供する。ここでR1は、選択的に上記の任意の群であり、R6は、アルキルアミノ、ピリジル、ピロリル、アリールアミノ、イミダゾリル、又はピペリジニル;n1は0乃至8;n2は0乃至8(n1とn2は独立的に選択される)であってもよい。典型的な構造を、構造−P1、構造−P2、構造−P3、構造−P4、及び構造−P5として示す。
本発明による組成物及び方法の原理及び作用は、添付の詳細な説明を参照するとより良く理解できるであろう。
この非限定的な実施例は、イソチオシアネートitc−11、12、13、ハロアセトアミドhal−11、12、13−Br、及びハロアセトアミドhal−11、12、13−Clに関する。この合成の概略図を図3Aに示す;図3bは、化学式Iのイソチオシアネート化合物に関する更に詳しい合成を示す(DCMはジクロロメタン、DMFはジメチルホルムアミド、DCCはN,N’ジシクロヘキシルカルボジイミド、DMAPは4−ジメチルアミノピリジン);図3cは、化学式Iのハロアセトアミド化合物についての更に詳しい合成を示す(DCMはジクロロメタン、DMFはジメチルホルムアミド、DCCはN,N’ジシクロヘキシルカルボジイミド、DMAPは4−ジメチルアミノピリジン、TCAはトリフルオロ酢酸)。
[9−Bromanoic acid(4a)−]
濃硝酸溶液(10mL、258mmol)に9−ブロモノナナール(bromononanol)(1gr、4.48mmol)を30分にわたって、25乃至30℃の温度を維持して添加した。この溶液を4時間室温で撹拌し、次いで80℃に加熱して、更に1時間撹拌した。次いで、反応混合物を室温に冷却して、100mLの蒸留水で慎重に希釈した。生成物をジエチルエーテル(4×25mL)で抽出し、有機相と結合させて硫酸マグネシウム上で乾燥させた。混合物を濾過して、真空で濃縮させ、生成物4aを定量的に生成させた。1H−NMR(プロトン核磁気共鳴)(200MHz、CDCl3):1.3−1.5(m;8H)、1.59−1.71(m;2H)、1.78−1.92(m;2H)、2.36(t;J=7.4Hz;2H)、3.40(t;J=6.8Hz;2H)、9.8(m、1H)
9−ブロモノナン酸(4a)(1.062gr、4.48mmol)を15mLの乾燥ジクロロメタンに溶解させた。次いで、アジ化ナトリウム(914mg、14mmol)を添加して、混合物を60℃で6時間撹拌した。この溶液を冷却して、50mLのジクロロメタンで希釈し、その後1MのHCl(5×50mL)、ブライン(2×50mL)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。次いで、混合物を濾過し、真空で濃縮させて、白色固体として90%の生成物5aを得た。1H−NMR(200MHz、CDCl3):1.3−1.5(m;8H)、1.5−1.7(m;4H)、2.33(t;J=7.4Hz;2H)、3.25(t;J=6.86Hz;2H)
10−ブロモデカン酸(1.125gr、4.48mmol)を、生成物5aについて説明したように反応させて、91%の生成物5bを得た。1H−NMR(200MHz、CDCl3):1.2−1.5(m;10H)、1.5−1.7(m;4H)、2.35(t;J=7.41Hz;2H)、3.24(t;J=6.81Hz;2H)
アジ化ナトリウム(2.38gr、44.3mmol)を7.5mLの水に溶解させて、15mLのジクロロメタンを含む丸底フラスコに添加した。フラスコを0℃に冷却して、トリフルオロメタンスルホン酸無水物(1.5mL、8.9mmol)を液滴で添加した。得られた溶液を室温まで温めて、2時間撹拌した。水層をジクロロメタン(3×8mL)で抽出して、結合有機相を炭酸ナトリウムの飽和溶液で洗浄した。次いで、得られた溶液を11−アミノウンデカン酸(892mg、4.43mmol)と、K2CO3(915mg、6.62mmol)と、及び15mLの水及び22.5mLのエタノール中のCuSO4・5H2O(11mg、0.0044mmol)との懸濁液にゆっくりと添加した。混合物を一晩撹拌し、真空で濃縮させた。この溶液を1MのHCl溶液で酸性化して、ジクロロメタン(4×50mL)で抽出した。結合させて、硫酸マグネシウムで乾燥させた有機相を濾過し、真空で濃縮させて、92%の5cを得た。1H−NMR(200MHz、CDCl3):1.25−1.4(m;12H)、1.5−1.7(m;4H)、2.35(t;J=7.43Hz;2H)、3.25(t;J=6.88Hz;2H)
水(9mL)、NaOH(800mg、19.5mmol)、tertブタノール(9mL)、及びBoc無水物(4.3gr、19.5mmol)を含む丸底フラスコに、所望のアミン(18.55mmol)を添加した。次いで、混合物を室温で16時間撹拌し、その後、水(20mL)及び1MのHCL(10mL)で希釈した。得られた溶液を、酢酸エチル(1×60mL+2×20mL)で抽出し、ブラインで洗浄して、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。粗混合物を濾過して、真空で濃縮させた。
9−ブロモデカン酸(2.0052gr、8.46mmol)を、80mLの含水水酸化アンモニウム(25%のNH3)を含む丸底フラスコに添加した。得られた混合物を室温で24時間撹拌し、その後、水溶液を減圧下で蒸発させて、定量的収率で白色固体として生成物8aを得た。1H−NMR(200MHz、CD3OD):1.25−1.4(m;8H)、1.5−1.7(m;4H)、2.23(t;J=7.31 Hz;2H)、2.87(t;J=7.45Hz;2H)
10−ブロモデカン酸(2.51gr、10mmol)を、80mLの含水水酸化アンモニウム(25%のNH3)を含む丸底フラスコに添加した。得られた混合物を室温で24時間撹拌し、その後、水溶液を減圧下で蒸発させて、定量的収率で白色固体として生成物8bを得た。1H−NMR(200MHz、CD3OD):1.25−1.4(m;10H)、1.5−1.7(m;4H)、2.15(t;J=7.38Hz;2H)、2.89(t;J=7.48Hz;2H)
9−アミノノナン酸(8.46mmol)は、上記のようにBocで保護され、86%の収率で7.26mmolの無菌の生成物を得た。1H−NMR(200MHz、CDCl3):1.25−1.7(m;21H)、2.30(t;J=7.4Hz、2H)、3.05(t;J=6.8Hz、2H)、4.53(s、1H)
10−アミノデカン酸(5.57mmol)は、上記のようにBocで保護され、77%の収率で4.27mmolの無菌の生成物を得た。1H−NMR(200MHz、CDCl3):1.25−1.7(m;23H)、2.34(t;J=7.33Hz、2H)、3.07(t;J=6.25Hz、2H)、4.53(s、1H)
11−アミノウンデカン酸(18.55mmol)は、上記のようにBocで保護され、98%の収率で17.4mmolの無菌の生成物を得た。1H−NHR(200MHz、CDCl3):1.25−1.7(m;25H)、2.34(t;J=7.35Hz、2H)、3.1(t;J=6.2Hz、2H)、4.52(s、1H)
N−(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)(0.257gr、2.1mmol)、N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(0.454gr、2.2mmol)、所望のアルキルカルボン酸(2mmol)、及びメルドラム酸(0.288gr、2mmol)を20mLのジクロロメタンに溶解させた。得られた溶液を一晩攪拌し、それから濾過して反応で形成されたN,N−ジシクロヘキシル尿素を除去した。濾液を真空で濃縮させた。得られた残渣をDMF(15mL)に溶解し、α−アミノ−γ−ブチロラクトンヒドロブロミド(0.364gr、2mmol)を添加した。混合物を室温で1時間攪拌し、60℃で更に4時間攪拌した。得られた溶液を酢酸エチル50mLで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム、1M硫酸水素ナトリウム溶液、及びブラインで洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過して真空で濃縮させた。更に、フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
生成物5aを上記のメルドラム酸で反応させ、得られた粗混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、収率66%で生成物6aを得た。1H−NMR(200MHz、CDCl3):1.2−1.4(m;8H)、1.5−1.7(m;4H)、2.1−2.3(m;1H)、2.51(t;J=7.3;2H)、2.6−2.75(m;1H)、3.21(t;J=6.85Hz;2H)、3.44(s;2H)、4.2−4.3(m;1H)、4.4(dt;J1=9Hz、J2=1.4Hz;1H)、4.5−4.65(m;1H)、7.7(d;J=6.6Hz;1H)
生成物5bを、上記のメルドラム酸で反応させ、得られた粗混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、収率38%で生成物6bを得た。1H−NMR(200MHz、CDCl3):1.2−1.4(m;10H)、1.5−1.7(m;4H)、2.1−2.3(m;1H)、2.50(t;J=7.2Hz;2H)、2.6−2.75(m;1H)、3.20(t;J=6.85Hz;2H)、3.44(s;2H)、4.2−4.3(m;1H)、4.4(dt;J1=9Hz、J2=1.4Hz;1H)、4.5−4.7(m;1H)、7.75(d;J=6.7;1H)
生成物5cを上記のメルドラム酸で反応させ、得られた粗混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、収率66%で生成物6cを得た。1H−NMR(200MHz、CDCl3):1.2−1.4(m;12H)、1.5−1.7(m;4H)、2.1−2.3(m;1H)、2,52(t;J=7.3Hz;2H)、2.6−2.8(m;1H)、3.24(t;J=6.8Hz;2H)、3.46(s;2H)、4.2−4.3(m;1H)、4.4.(dt;J1=9Hz、J2=1.4Hz;1H)、4.5−4.65(m;1H)、7.85(d;J=6.9;1H)
トルエン(10mL)中の6aの溶液(0.24mmol)に、トリフェニルホスフィン(69mg、0.26mmol)の一部を室温で添加した。溶液を50℃に加熱して、1時間攪拌した。溶液を室温に冷却した後、二硫化炭素(30μL、0.48mmol)を液滴で添加した。次いで、溶液を50℃に加熱し戻して、更に2時間攪拌した。粗混合物を真空で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーにより精製して93%で7aを得た。1H−NMR(500MHz、CDCl3):1.22−1.31(m;6H)、1.32−1.4(m;2H)、1.52−1.57(m;2H)、1.62−1.68(m;2H)、2.3−2.3(m;1H)、2.52(t;J=7.3Hz;2H)、2.66−2.72(m;1H)、3.45(s;2H)、3.48(t;J=6.82Hz;2H)、4.22−4.28(m;1H)、4.45(t;J=8.9Hz;1H)、4.52−4.61(m;1H)、7.7(d;J=6.3;1H)。13C−NMR(カーボンサーティーン核磁気共鳴)(500MHz、CDCl3):23.2、26.4、28.5、28.7、29.1、29.5、29.8、43.7、45.0、48.4、49.0、66.0、129.3、166.6、175.1、206.4。MS(ESI)m/z:計算値:[M+]341.2、測定値:[M+]341.06。
トルエン10mL中の6bの溶液(0.24mmol)に、トリフェニルホスフィン(69mg、0.26mmol)の一部を室温で添加した。溶液を50℃に加熱して、1時間攪拌した。溶液を室温に冷却した後、二硫化炭素(30μL、0.48mmol)を液滴で添加した。次いで、溶液を50℃に加熱し戻して、更に2時間攪拌した。粗混合物を真空で濃縮ささせ、カラムクロマトグラフィーにより精製して66%で7bを得た。1H−NMR(500MHz、CDCl3):1.25−1.32(m;8H)、1.33−1.41(m;2H)、1.53−1.59(m;2H)、1.64−1.7(m;2H)、2.2−2.28(m;1H)、2.52(t;J=7.3Hz;2H)、2.7−2.76(m;1H)、3.46(s;2H)、3.49(t;J=6.82Hz;2H)、4.24−4.3(m;1H)、4.46(t;J=8.9Hz;1H)、4.55−4.61(m;1H)、7.6(d;J=6.3Hz;1H)。13C−NMR(500MHz、CDCl3):23.2、26.4、28.6、28.8、29.1、29.7、29.8、43.8、45.0、48.2、49.0、65.9、129.3、166.4、174.9、206.5。MS(ESI)m/z:計算値:[M+]355.1、測定値:[M+]355.05。
トルエン10mL中の6c(0.24mmol)の溶液に、トリフェニルホスフィン(69mg、0.26mmol)の一部を、室温で添加した。溶液を50℃に加熱して、1時間攪拌した。溶液を室温に冷却した後、二硫化炭素(30μL、0.48mmol)を液滴で添加した。次いで、溶液を50℃に加熱し戻して、更に2時間攪拌した。粗混合物を真空で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーにより精製して57%で7cを得た。1H−NMR(500MHz、CDCl3):1.22−1.30(m;10H)、1.34−1.40(m;2H)、1.51−1.58(m;2H)、1.63−1.7(m;2H)、2.2−2.28(m;1H)、2,51(t;J=7.35Hz;2H)、2.67−2.73(m;1H)、3.45(s;2H)、3.48(t;J=6.66Hz;2H)、4.22−4.28(m;1H)、4.45(t;J=8.97Hz;1H)、4.55−4.61(m;1H)、7.7(d;J=6.3Hz;1H)。13C−NMR(500MHz、CDCl3):23.2、26.5、28.7、28.9、29.2、29.5、29.8、43.7、45.0、48.3、49.0、65.9、129.3、166.5、175.0、206.5。MS(ESI)m/z:計算値:[M+]367.2、測定値:[M+]369.06。
生成物9aを上記のメルドラム酸で反応させて、得られた粗混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、36%で生成物10aを得た。1H−NMR(200MHz、CDCl3):1.24−1.32(m;10H)、1.27(s;9H)、1.58−1.7(m;2H)、2.10−2.29(br s;1H)、2.52(t;J=7.31;2H)、2.62−2.80(br s;1H)、3.07(t;J=6.90Hz;2H)、3.46(s;2H)、4.23−4.34(m;1H)、4.46(dt;J1=9.15、J2=0.9;1H)、4.54−4.64(m;1H)、7.7(d;J=4.81;1H)
生成物9bを上記のメルドラム酸で反応させて、得られた粗混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、32%で生成物10bを得た。1H−NMR(200MHz、CDCl3):1.24−1.32(m;12H)、1.43(s;9H)、1.5−1.62(m;2H)、2.10−2.30(br s;1H)、2.52(t;J=7.27Hz;2H)、2.66−2.82(br s;1H)、3.07(t;J=6.91Hz;2H)、3.46(s;2H)、4.22−4.34(m;1H)、4.47(dt;J1=9.15Hz、J2=1.4Hz;1H)、4.54−4.64(m;1H)、7.6(d;J=4.84Hz;1H)
生成物9cを上記のメルドラム酸で反応させて、得られた粗混合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、59%で生成物10cを得た。1H−NMR(200MHz、CDCl3):1.22−1.32(m;14H)、1.43(s;9H)、1.53−1.62(m;2H)、2.10−2.30(br s;1H)、2.51(t;J=7.27Hz;2H)、2.66−2.8(br;1H)、3.08(t;J=6.91Hz;2H)、3.45(s;2H)、4.22−4.33(m;1H)、4.46(dt;J1=9.16Hz、J2=0.56Hz;1H)、4.54−4.64(m;1H)、7.7(d;J=4.93;1H)
化合物10a−c(0.705mmol)をジクロロメタン4mLに溶解させる。トリフルオロ酢酸(4mL)を一部分添加して、得られた溶液を室温で20分間撹拌し、その後Boc部分を完全に除去した(NMRによって確認した)。溶媒を蒸発させて、ジクロロメタン(5mL)を得られた残渣に添加した。トリエチルアミンを添加することによってpHを7までに調整して、ピリジン(62μL、0.785mmol)を添加した。反応混合物を、氷浴上で0℃に冷却して、ジクロロメタン(4.5mL)中のブロモアセチルブロミド溶液(64μL、0.74mmol)(生成物11d−g用に塩化クロロアセチルを使用した)を5分間にわたり液滴で添加した。反応混合物を、1時間氷上に置いたままにし、その後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(100mL)で希釈してクロロホルム(3×30mL)で抽出した。結合した有機相をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過して真空で濃縮させた。最終生成物(11a−g)をRP−HPLC(逆相高速液体クロマトグラフィー)で精製した。
1.22−1.32(br;8H)、1.51(t;J=6.81Hz;2H)、1.56(t;J=6.78Hz;2H)、2.18−2.28(m;1H)、2.51(t;J=7.25 Hz;2H)、2.7−2.76(m;1H)、3.25(q;J=6.71Hz;2H)、3.45(s;2H)、3.86(s;2H)、4.22−4.29(m;1H)、4.46(t;J=8.93Hz;1H)、4.55−4.61(m;1H)、6.49(br、1H)、7.67(br;1H)。13C−NMR(500MHz、CDCl3):23.20、26.56、28.74、28.85、29.04、29.16、29.34、29.86、40.20、43.81、48.14、49.08、65.91、165.38、166.39、174.78、206.51。MS(ESI)m/z:計算値:[M+]419.3、測定値:[M+]419.04。
1.23−1.31(br;10H)、1.51(t;J=7.13Hz;2H)、1.55(t;J=7.31Hz;2H)、2.18−2.28(m;1H)、2.51(t;J=7.33Hz;2H)、2.69−2.75(m;1H)、3.25(q;J=6.75Hz;2H)、3.45(s;2H)、3.86(s;2H)、4.23−4.29(m;1H)、4.45(dt、J1=9.08Hz、J2=1.44Hz;1H)、4.55−4.61(m;1H)、6.54(br、1H)、7.73(d;J=6.47Hz;1H)。13C−NMR(500MHz、CDCl3):23.24,26.67、28.83、29.02、29.13、29.39、29.70、40.21、43.77、48.30、49.04、65.93、165.39、166.48、174.92、206.47。MS(ESI)m/z:計算値:[M+]433.3、測定値:[M+]435.03。
1.22−1.32(br;12H)、1.52(t;J=7.02Hz;2H)、1.57(t;J=7.03Hz;2H)、2.18−2.28(m;1H)、2.52(t;J=7.34Hz;2H)、2.71−2.78(m、1H)、3.27(q;J=6.75Hz:2H)、3.46(s;2H)、3.87(s;2H)、4.23−4.30(m;1H)、4.47(dt、J1=9.07Hz、J2=1.27Hz;1H)、4.55−4.61(m;1H)、6.51(br、1H)、7.70(d;J=5.76Hz;1H)。13C−NMR(500MHz、CDCl3):23.29、26.73、28.88、29.11、29.21、29.30、29.40、29.82、40.26、43.87、48.12、49.06、65.89、165.30、166.39、174.79、206.54。MS(ESI)m/z:計算値:[M+]447.1、測定値:[M+]447.17。
1.25−1.33(br;10H)、1.5−1.59(br;4H)、2.19−2.29(m;1H)、2.52(t;J=7.29Hz;2H)、2.70−2.76(m、1H)、3.28(q;J=6.75Hz:2H)、3.46(s;2H)、4.04(s;2H)、4.24−4.30(m;1H)、4.47(t、J1=9.00Hz;1H)、4.56−4.62(m;1H)、6.61(br、1H)、7.72(br;1H)。13C−NMR(500MHz、CDCl3):23.17、26.59、28.72、28.84、29.03、29.19、29.69、39.80、42.67、43.69、48.25、49.02、65.88、165.83、166.42、174.85、206.37。MS(ESI)m/z:計算値:[M+]375.8、測定値:[M+]375.07。
1.22−1.30(br;12H)、1.48−1.58(br;4H)、2.17−2.27(m;1H)、2.50(t;J=7.35Hz;2H)、2.68−2.75(m、1H)、3.26(q;J=6.78Hz:2H)、3.44(s;2H)、4.02(s;2H)、4.22−4.29(m;1H)、4.45(dt、J1=9.06Hz、J2=1.30Hz;1H)、4.54−4.61(m;1H)、6.58(br、1H)、7.71(d;J=6.20Hz;1H)。13C−NMR(500MHz、CDCl3):23.25、26.71、28.86、29.08、29.19、29.70、39.85、42.67、43.78、48.22、48.99、65.87、165.77、166.40、174.85、206.46。MS(ESI)m/z:計算値:[M+]388.9、測定値:[M+]389.1。
1.22−1.30(br;12H)、1.48−1.58(br;4H)、2.17−2.27(m;1H)、2.50(t;J=7.35Hz;2H)、2.68−2.75(m;1H)、3.26(q;J=6.78Hz:2H)、3.44(s;2H)、4.02(s;2H)、4.22−4.29(m;1H)、4.45(dt、J1=9.06、J2=1.30;1H)、4.54−4.61(m;1H)、6.58(br、1H)、7.71(d;J=6.20;1H)。13C−NMR(500MHz、CDCl3):23.25、26.71、28.86、29.08、29.19、29.70、39.85、42.67、43.78、48.22、48.99、65.87、165.77、166.40、174.85、206.46。MS(ESI)m/z:計算値:[M+]402.9、測定値:[M+]403.08。
[材料と方法]
[化学合成]
イソチオシアネートitc−11、12、13、ハロアセトアミドhal−11、12、13−Br及びハロアセトアミドhal−11、12、13−Clの合成を上記のように行った。
全てのMS分析を、ESI源を具えるLCQ Fleet質量分析(Thermo Scientific社)上で実行した。陽イオンモードでスペクトルを回収して、Xcalibur及びPromassソフトウェア(Thermo Scientific社)により分析した。LC/MS(液体クロマトグラフィー質量分析)の分析に関して、0.1%の含水ギ酸(溶媒A)及び0.1%のギ酸(溶媒B)を含有するCH3CNの移動相の直線的な傾きを用いて、流速0.5mL/分の5μm(150×4.6mm)カラムであるLuna C18を具えるSurveyor Plus HPLCシステム(Thermo Scientific社)を使用した。
全長LasRの発現が、天然リガンドである3−オキソ−C12−HSLの有無にかかわらず、ほとんど不溶性であるタンパク質を生じさせることは、以前から知られていた(Bottomley,M.J.,Muraglia,E.,Bazzo,R.& Carfi,A.。その自己誘導物質に結合した毒性調節遺伝子LasRの構造由来のヒト病原緑膿菌クオラムセンシングへの分子的洞察。J Biol Chem 282,13592−600(2007))。従って、発現は、短縮型で、His6で標識されたLasR構造体、LasR−LBD(リガンド結合ドメイン)をコードするpETM−11ベクターを用いて形質転換された株を使用して行われ、これは残基Met−1からLys−173に及んだ。プラスミドを大腸菌BL21株に導入して、細胞を1mLの栄養分豊富なLB培地中で1時間インキュベートした。次いで、細胞をカナマイシン(50マイクログラム/mL)を含有する、LB寒天培地上で培養した。発現用に、単一のコロニーを選択して、カナマイシンを含有する栄養豊富なLB培地5mLに導入し、一晩培養した。タンパク質を、上記の通り、天然3−オキソ−C12−HSL又はさまざまな阻害剤の存在下で発現させ、Ni2+アフィニティークロマトグラフィーで精製し(Bottomley,M.J.,Muraglia,E.,Bazzo,R.& Carfi,A.。その自己誘導物質に結合した毒性調節遺伝子LasRの構造由来のヒト病原緑膿菌クオラムセンシングへの分子的洞察。J Biol Chem 282、13592−600(2007))、大量発現条件を用いてLB培地1リットルあたり70mgまでの精製タンパク質を生成し、少量発現条件を用いて50mLのLB培地から0.5未満乃至1mgの精製タンパク質を生成した。精製プロセスをSDS−PAGE電気泳動により観察して、精製タンパク質の分子量を質量分析法により確定した。
カナマイシン(50マイクログラム/mL)、10乃至100マイクロMの3−オキソ−C12−HSL又は阻害剤7a−c若しくは11a−gを含有する栄養豊富なLB培地1リットルあたりつき、一晩培養した細胞培養物1mLを接種した。細胞を、光学密度(OD600nm)が0.4になるまで培養し、その後、0.2mMのイソプロピル1−チオ−ベータ−D−ガラクトピラノシド(IPTG)を添加することにより21℃で発現が誘導されたら、追加的にリガンド/阻害剤を培地に添加した。OD600nmが1.4に達した(だいたい6−8時間)ら、細胞は、1分間あたり6000rpmで遠心分離し、5mMのイミダゾール、300mMのNaCl、50mMのTris−HClを含有するpH8の溶解バッファで洗浄し、再懸濁した。細胞は、70%の振幅で2分間超音波処理を2回繰り返した。溶解物を、1分間あたり12,000rpmで30分間遠心分離し、上澄みをNi2+アフィニティークロマトグラフィーで精製した。
発光系luxCDABE(Duan,K.& Surette,M.G.Environmental緑膿菌PA01のLas及びRh1クオラムセンシングシステムの調節遺伝子。J Bacteriol 189,4827−36(2007))に結合したLasIレポータを含有するプラスミドpKD201を内包する緑膿菌野生型PA01株を、トリメトプリムを300マイクログラム/ml含有するLB培地で一晩インキュベートした。96ウェルのブラックマイクロタイタープレート(Greiner社)を阻害剤の望ましい濃度(成長阻害が観察される1mM超まで)で処理し、最終吸光度(OD600nm)が0.015に達するまで細菌を添加した。次いで、このプレートを37℃で12時間インキュベートした。その間に、発光測定を10分間隔で行なった。それから相対的な発光を、追加した阻害剤の濃度に対してプロットした;IC50値をGrafit6.0(Erithacus Software社)を用いて計算した。
luxCDABE発光系(上記を参照されたい)に結合するLasIレポータ含有のプラスミドpKD201を内包するlasI/rhlI欠損株であるPAO−JP2を、トリメトプリムを300マイクログラム/ml含有するLB培地で一晩インキュベートした。96ウェルのブラックマイクロタイタープレート(Greiner社)を、PA01阻害試験用に上記のように準備した。それから相対的な発光を、追加された阻害剤の濃度に対してプロットした;IC50値をGrafit6.0(Erithacus Software社)を用いて計算した。アンタゴニスト実験では、最終濃度50nMの3−オキソ−C12−HSLを使用した。
LasR発現ベクター、pJN105L及びプラスミド媒介PlasI−lacZ融合(pSCII)を内包する大腸菌DH5α(Lee,J.H.,Lequette,Y.& Greenberg,E.P.精製QscRの活性、緑膿菌オーファンクオラムセンシング転写因子。Mol Microbiol 59,602−9(2006))を用いて、β−ガラクトシダーゼの発現レベルを測定することにより、クオラムセンシング阻害を定量化した。アンピシリン100マイクログラム/mL及びゲンタマイシン15マイクログラム/mL含有するLB培地で、細菌を一晩インキュベートした。新鮮培地を用いて容量1:10の比率で培養物を希釈し、更にOD600nmが0.3に達するまでインキュベートした。96ウェルのマイクロタイタープレート(Greiner社)を望ましい濃度の阻害剤で準備して、最終吸光度(OD600nm)が0.3に達するまで細菌を添加した。発現は、L−(+)−アラビノース(4mg/mL)のエディションにて誘導され、プレートを37℃で4時間インキュベートした(0.45−0.5のOD600nm)。次いで、Miller検定方法46により培養物をβ−ガラクトシダーゼ活性測定した:200mL分量を清潔な96ウェルのマイクロタイタープレートに移してOD600nmを記録した。次いで、各ウェルの100mLを、200mLのZ−バッファ、10mLのクロロホルム、及び5mLの0.1%のSDS(重量/容量)を含むポリプロピレンベースの96ウェルのマイクロタイタープレートに添加した。ウェルを、ピペット操作してよくすすぎ、その後クロロホルムを定着させた。水性上層の100mLを96ウェルのマイクロタイタープレートに移し、20mLのオルト−ニトフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(pH7のリン酸バッファ中の4mg/mLのONPG)を添加した。プレートを28℃で35分間インキュベートした。1Mの炭酸ナトリウム溶液を添加して反応を停止させ、二つの波長(550nm、429nm)における吸収を記録した。Millerユニットを、標準方法(Miller、J.H.分子遺伝学における実験、352−355(Cold Spring Harbor Laboratories、1972)を用いて計算した。アンタゴニスト実験では、最終濃度50nMの3−オキソ−C12−HSLを使用した。
LasR質量比1:100の酵素中で、トリプシン(Promega工業)を、0.1%のSDS、3mMのβ−メルカプトエタノール、及び10%のアセトニトリル含有の50mMのTrisバッファ(pH=8)に溶解させた。LasRを所望の量を添加し、溶液を37℃で2時間インキュベートした。混合物を−20℃で保管して、トリプシンを失活させた。サンプルをLC−MSにより分析して、所望のピークは、以下のように配列ごとにMS2を受けた。
タンパク質−リガンドの画像をPyMOLで処理した。LasR−LBD−QSIの相互作用のモデリングでは、水素原子をLasRに添加して、pH7.4をシミュレーションした。マイクロモデルバージョン9.0(Schrodinger LLC software社)に実装されるメルク分子力場(MMFF−S)を用いて、最初にタンパク質の骨格を、次にAHL構造を硬化させて、これらの水素とタンパク質の側鎖の位置を、エネルギーを最小化(5000最急降下ステップ)させることにより最適化した。
化学式I(特に、例えば、図2で示すような化学式Iのハロアセトアミド化合物)の化合物のいくつかの非限定的な例とともにLasRを発現する細菌をインキュベートしたところ、可溶性LasR−LBDを得ることができた(図4a)。重要なことには、ハロアセトアミドの大部分が存在する場合は、LasRが過剰発現して、可溶性LasR−LBDがほんの少量の発生したのに対し、プローブ又は3−オキソ−C12−HSLがない場合には、可溶性LasR−LBDが観察されなかった。同様に、細胞を4−Br−PHLでインキュベートしたときは、Bottomleyらの以前の結果(上記参照)を裏付けるように、可溶性LasRは全く観察されなかった(データは示さず)。
LasR−LBDを、3−オキソ−C12−HSL又はitc−12(若しくはitc−11)の存在下で発現させ、続いてタンパク質の精製とトリプシンの消化をした。システイン含有のフラグメント(72−VDPTVSHCTQSVLPIFWEPSIYQTR−96)を、単一のピーク(2903.4Da)としてLC−MSによって確認したと同時に、増加した保持時間とともに修飾されたペプチドとitc−12(又はitc−11)に対応する質量増加も確認した(データ示さず)。修飾された又は修飾されないLasR−LBD上のタンデムMS/MS測定は正しくCys79が、共有結合プローブと反応したことを裏付けた(データは示さず)。
上記実験データを補足するべく、コンピュータ構造分析及びLasRへのイソチオシアネートの結合をシミュレーションするドッキング計算を行った。ドッキング手法を確認する対照群として、天然3−オキソ−C12−HSLリガンドをその結合部位から取り除き、首尾よく再度ドッキングした。すなわち、結晶構造中のリガンドに対応する構造は、全ての非水素原子が平均二乗偏差<0.2Åで、出力ポーズの相当上位に位置していた。次いで、三つのイソチオシアネート化合物をLasR−結合部位へドッキングした。一リガンドごとの最も高いポーズが、剛体と考えられているタンパク質との関係において、詳細な配座解析に提示された。この分析により、最長のイソチオシアネート、すなわちitc−13を、タンパク質を伴う極性頭部基の相互作用を崩壊させずに、結合部位で適合させることはできないことが明らかなった。それに対し、より短い化合物、すなわちitc−11及びitc−12は、全ての有益なタンパク質を伴う極性相互作用を維持しながら、適合され得る。興味深いことに、エネルギーを最小化した配座異性体は、二つのグループに分けられたitc−11及びitc−12の双方で観察され、それらのイシチオシアネート基の配向においてのみ大幅に異なるものである(図5)。他の配向が、この反応にとって不十分であるのに対し、ある配向は、Cys79の硫黄原子による求核攻撃にとって理想的な事前構築を提示する。itc−12では、個体群のおおよそ66%が、反応に適した配座を選ぶのに対し、itc−11では、配座異性体の個体群は均等に分割(50/50)された。itc化合物へのCys79側鎖の再度の配向により、求核攻撃を強化し;LasRの結晶構造は、この回転異性体が容認されるのを示唆する。
共有結合プローブの活性を、いくつかのレポータ株、すなわち、発光PA01−luxABCDE野生型株及びPA01 lasI−rhlIの二つの突然変異体(PAO−JP−luxABCDE)、並びに大腸菌β−ガラクトシダーゼ−LasR−ベースのレポータ株を用いて評価した。プローブのいくつかが、PAO−JP2−及び大腸菌株とともに行なった分析中で、アゴニスト及びアンタゴニスト活性の双方を示した(図6c、d)のに対し、いくつかのイソチオシアネート及びブロモアセトアミドは、野生型株中の発光(luminescense)を強く阻害した(図6a、b)。このデータを、既知の強力なQS阻害剤と報告されるそれらと比較するために、Blackwell及び共同研究者により、最も活性のある緑膿菌QSアンタゴニストの一つとして同定された(Geske,G.D.,O’Neill,J.C.,Miller,D.M.,Mattmann,M.E.& Blackwell,H.E.合成リガンドでの細菌のクオラムセンシングの調節:多重種におけるN−アシル化ホモセリンラクトン統計的評価とそれらの活性のメカニズムに対する洞察。J Am Chem Soc129,13613−25(2007))対照群のアンタゴニストである、2−(4−ブロモフェニル)−N−(2−オキソ−テトラヒドロフラン−3−イル)−アセトアミド(4−Br−PHL)を合成した。
この反応性プローブが、バイオフィルム形成やピオシアニン生成といったQSで調節された活性を阻害するかを評価するべく、野生型緑膿菌PA01株を、itc−12及び4−Br−PHLの存在下(両方50マイクロ−M)で、又はコントロールとしてDMSO存在下でインキュベートした。マイクロタイタープレート中24時間でバイオフィルム形成の分析、バイアル中36時間でピオシアニン生成の測定をした。図8a、bに示すように、両活性は、イソチアネート存在下で、並びにQS阻害剤として知られる4−Br−PHL存在下で著しく阻害された。いずれの表現型の完全阻害は、めったに見られず、これは、QS関連のメカニズムによる調節が部分的なものであることを示している。しかし、バイオフィルム形成が、部分的な減縮であっても、QSの崩壊の影響を受ける総バイオフィルムの質量だけでなく、その構造、多孔性の度合い、及びその柔軟性及び堅牢性の程度のように細菌が宿主反応を受けやすい状態にするのに十分である。
本発明の少なくともいくつかの実施形態による一連の化合物を、緑膿菌のQSの調節遺伝子、LasRを標的にすること、及びQSがこのタンパク質の共有結合を介して阻害され得るかどうかを試験することもできる。イソチオシアネートベースのプローブが、LasR結合ポケットに見られるCys79に共有的に及び選択的に結合したと結論付けられた。更に、いくつかのよく特徴付けられたレポータ株を用いることで、遺伝子発現に関連する緑膿菌のクオラムセンシングにおける九つの合成阻害剤の影響を評価することができる。レポータアッセイ間で測定した活性に相違が認められたが、QSの強力な阻害は、イソチオシアネート類似体で観察した。
この非限定的な実施例は、本発明の少なくともいくつかの実施態様によるジスルフィド結合を含有する化合物の合成に関し、構造−Cの化合物を含む。一般的な合成は、上記実施例1のとおりである。合成手順の非限定的な特定の実施例を以下に示す。
チオ尿素(282mg,3.54mmol、1.5等量)と10−ブロモデカン酸(641mg、2.4mmol)の混合物をEtOH(5mL)中で20時間還流させた。溶媒を真空で取り除いて、7.5MのNaOH(水溶液)(5mL、1.4g、3.54mmol、1.5等量)を添加した。この混合物をさらに16時間90℃で、窒素下で撹拌した。次いで、氷浴上で冷却し、2MのH2SO4を撹拌しながらゆっくり添加した。有機生成物をCH2Cl2(2×50mL)で抽出し、MgSO4で乾燥させ、真空で蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2:PrOH=99:1)を介して原油を精製し、白色固体としてチオール中間体を得た(398mg、81%の収率:1H NMR(CDCl3、200MHz)δ1.29−1.40(m、10H)、1.53−1.66(m、4H)、2.34(t、7.6Hz、2H)、2.51(q、7.4Hz、2H)。
10−メルカプトデカン酸(122mg、0.56mmol)を、NaOH(24mg、0.6mmol)と4mLのH2O:DMF(1:1)中のKI(29.8mg、0.18mmol)の溶液に滴下した。I2(75.8mg、0.29mmol)を黄色が持続するまで添加し、次いで溶液が完全に脱色するまでNa2SO3を添加した。得られた懸濁液をHCl(1N)で酸性化して、水相をCHCl3(4×20mL)で抽出した。有機相をブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥させて溶媒を真空で蒸発させた。定量的収率で、白色固体の中間体ジスルフィド化合物を得た。1H NMR(CDC13、400MHz)δ1.25−1.40(m、10H)、1.55−1.70(m、4H)、2.33(t、6.4Hz、2H)2.66(t、7.4Hz、2H)。
N−(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)(77mg、0.62mmol)、N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(136mg、0.65mmol)、ジカルボン酸(121mg、0.3mmol)、及びメルドラム酸(85mg、0.6mmol)を6mLのジクロロメタンに溶解させた。得られた溶液を一晩攪拌して、次いで濾過して、反応で形成されるN,N−ジシクロヘキシル尿素を除去した。ろ液を真空で濃縮させた。得られた残渣をDMF(5mL)に溶解させて、α−アミノ−γ−ブチロラクトンヒドロブロミド(109mg、0.6mmol)を添加した。混合物を室温で1時間攪拌し、更に60℃で4時間攪拌した。得られた溶液を酢酸エチル30mLで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、1Mの硫酸水素ナトリウム溶液、ブラインで洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過して真空で濃縮させた。更に、フラッシュクロマトグラフィーで精製した(収率33%)。MS(ESI)m/z:計算値:[M+H+]657.32、測定値:[M+H+]657.22。
この非限定的な実施例は、構造−D(本明細書では「チオール−11」ともいう)の化合物などのチオール含有化合物の化合物に関する。
12−メルカプト−3−オキソ−N−(2−オキソテトラヒドロフラン−3−イル)ドデカンアミド(29mg、0.04mmol)の二量体を0.5mLのTHFに溶解させ、水中(0.5mL)のトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(50mg、0.17mmol)を添加した。混合物を窒素化で一晩攪拌し、5mLの水で希釈してEt2O(2×5mL)で抽出した。有機相をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させて濾過して濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の化合物を、白色固体として生じさせた(収率70%)。MS(ESI)m/z:計算値:[M+H+]330.17、測定値:[M+H+]330.06。
実施例4のチオール-11化合物を、PAO−luxCDABE中のlasI発現の阻害を検査する上記のシステムにおいて、化学式Iの化合物(上に示した)であるitc−12で検査した。図9に示すように、チオール−11及びitc−12の両方が、緑膿菌の毒性を用量依存的に阻害し、これによって、これらの化合物の特異性を示した。
少なくともいくつかの実施形態では、本発明の少なくともいくつかの実施形態による化合物を、選択的にバイオフィルム形成を阻害又は減少させるための抗バイオフィルム組成物において使用した。
少なくともいくつかの実施形態では、本発明の少なくともいくつかの実施形態による化合物を、選択的に用いてバイオフィルム形成阻害用の医療機器を扱う。医療機器は、選択的に吸収性物質、非吸収性物質、及びそれらの組み合わせから形成されることがある。医療機器を形成するのに利用される適切な吸収性物質は、トリメチレンカーボネート、カプロラクトン、ジオキサノン、グリコール酸、乳酸、グリコリド、ラクチド、これらのホモポリマ、及びこれらの組み合わせを含み、化合物は、選択的にこの物質へ吸収され、又はこの物質とともに形成される。医療機器を形成するのに利用する適切な非吸収性物質は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン及びポリプロピレンのコポリマ、及びポリエチレン及びポリプロピレンのブレンドポリオレフィンを含み、化合物を、選択的にこの機器にコーティングする。もちろん任意の他の適切なポリマも医療機器用に選択して利用してもよい。
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Claims (9)
- 化学式Iの化合物であって:
式中、nは炭素の数を示し、nは1乃至18であり、R1はイソシアナート、イソチオシアナート及びイソセレノシアナートからなる群より選択されることを特徴とする化合物。 - R 1 がイソチオシアナートである請求項1記載の化合物。
- nが8乃至10である請求項2記載の化合物。
- 下記化学式
で表される化合物である請求項3記載の化合物。 - グラム陰性細菌のクオラムセンシングを阻害する抗細菌剤製造のための請求項1乃至4のいずれかに記載の化合物の使用において、当該細菌が、アシネトバクター、アクチノバチルス、アグロバクター、ボルデテラ、ブルセラ、カンピロバクター、シアノバクテリア、エンテロバクター、エルウィニア、大腸菌、フランシセラ、ヘリコバクター、ヘモフィルス菌、クレブシエラ菌、レジオネラ菌、モラクセラ、ナイセリア、パスツレラ菌、プロテウス、シュードモナス菌、サルモネラ菌、セラチア菌、赤痢菌、トレポネーマ、ビブリオ、及びエルシニアの一又はそれ以上を含むことを特徴とする使用。
- 請求項5に記載の使用において、アシネトバクター、アクチノバチルス、アグロバクター、ボルデテラ、ブルセラ、カンピロバクター、シアノバクテリア、エンテロバクター、エルウィニア、大腸菌、フランシセラ、ヘリコバクター、ヘモフィルス菌、クレブシエラ菌、レジオネラ菌、モラクセラ、ナイセリア、パスツレラ菌、プロテウス、シュードモナス菌、サルモネラ菌、セラチア菌、赤痢菌、トレポネーマ、ビブリオ、及びエルシニアの一又はそれ以上に起因する植物又は動物の疾患を治療、医療機器、液体を運ぶ及び/又は液体に配置されるあらゆるタイプの構造物、膜、繊維、又は包装材料を処理する、又は、あらゆるタイプのバイオフィルムの形成の防止又は減少させるための使用。
- 請求項6に記載の使用において、前記動物が、ヒトではない哺乳類又はヒトを含む哺乳類、魚類、爬虫類、又は鳥類のいずれも含むことを特徴とする使用。
- 請求項6に記載の使用において、前記医療機器が、自然組織上のコーティング、カテーテル、ペースメーカー、コンタクトレンズ、ステント、心臓弁置換又は増強機器、植え込み型自動除細動器、人工心臓補助機器、植え込み型輸液ポンプ、ドレナージ機器、人工関節、骨ピン、スクリュー及びその他の整形外科的機器、歯冠、歯牙充填物、人工歯根、歯の又は整形外科的、歯内器具、外科縫合、クリップ及びステープル若しくは締結具、手術用メッシュ、眼内レンズ、バットレス、ラップバンド、包帯、グラフト、ステント/グラフト、無結節創縫合、シーリング材、接着剤、組織スキャフォールド、柔組織代替若しくは増強インプラントを含むことを特徴とする使用。
- 自然組織が歯である請求項8に記載の使用。
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