DE102014213654A1

DE102014213654A1 - Synergistische antibiotische Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE102014213654A1
Application number: DE102014213654.7A
Authority: DE
Inventors: Eduard Stange; Lutz Zabel; Sabine Nuding
Original assignee: Robert Bosch Gesellschaft fuer Medizinische Forschung mbH
Current assignee: Robert Bosch Gesellschaft fuer Medizinische Forschung mbH
Priority date: 2014-07-14
Filing date: 2014-07-14
Publication date: 2016-03-24

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von menschlichen antimikrobiellen Peptiden für die Behandlung von Infektionskrankheiten, insbesondere Kombinationen von menschlichen antimikrobiellen Peptiden und antibakteriellen Agenzien sowie ihre Verwendung in der Behandlung von durch anaerobe Bakterien, insbesondere durch Clostridium spec., verursachten Infektionskrankheiten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Kombinationen von antimikrobiellen Peptiden und Antibiotika, insbesondere ihre Verwendung als Arzneimittel und ihre Verwendung in der Behandlung von durch bakterielle Mikroorganismen verursachten Infektionskrankheiten.
Anaerobe Mikroorganismen, insbesondere Bakterien und Hefen, d. h. einzellige Mikroorganismen, die ohne Sauerstoff leben oder sauerstofftolerant sind, können verschiedene klinische Bilder verursachen, zum Beispiel Wundinfektionen sowie Abszesse, Sepsis, Infektionen, insbesondere in der Bauchhöhle, im Urogenitaltrakt oder in der Kieferregion. Diese pathogenen Spezies finden sich häufig bereits in der Mundhöhlenregion, insbesondere im entzündeten Periodontalbereich, sowie in der Magenregion in den Schleimhautfalten des Magens, und im Zwölffingerdarm, und sie können dann lokale, unter Umständen auch systemische akute und chronische Entzündungen verursachen. Sogar im relativ schwach besiedelten Dünndarm können verschiedene fakultative Anaerobier pathologische Veränderungen der hochempfindlichen Schleimhaut des Dünndarms verursachen; im Rektum, dem wichtigsten Ort des Vorkommens der Bakterienflora, herrschen zwar aerobe Bakterien vor, es können jedoch auch hier Vertreter der Anaerobier schwere entzündliche Reaktionen der Kolonschleimhaut verursachen.
Insbesondere sind Clostridium-difficile-Infektionen (CID) ein immer wichtigeres Problem in der Gesundheitsversorgung geworden; sie treten häufig während oder nach der Antibiotikumtherapie auf. Die Übertragung von C. difficile in der nosokomialen Umwelt wird in erster Linie durch die Aufnahme von Sporen verursacht, die von anderen Patienten direkt, über die Hände der Pflegekräfte oder indirekt von unbelebten Dingen erworben worden sein können. Die Schwere der Infektionen, das immer schnellere Wiederauftreten und die Entstehung von Resistenz gegen Antibiotika hat eine wirksame Antibiotikumtherapie von C. difficile-Infektionen in den letzten Jahren eingeschränkt.
Derzeit werden Infektionskrankheiten mit Antibiotika, die in erster Linie die Zellwand der Bakterien angreifen und zerstören, behandelt. Ein großes Problem, das entsteht, wenn diese Entzündungserkrankungen mit Antibiotika behandelt werden, ist die Entstehung von Resistenz gegen die verwendeten Antibiotika, die in jüngster Zeit noch stärker vorangeschritten ist. Dies gestattet es den pathogenen Bakterien/Mikroorganismen, die Wirkung von antibiotischen Substanzen zu schwächen oder vollständig aufzuheben. Erweist sich dann ein Mikroorganismus als gegen die üblicherweise verwendeten Antibiotika resistent, so können die Erkrankungen lebensbedrohend werden. Der Grund dafür, dass die Anzahl der multiresistenten Bakterienstämme in der Vergangenheit stark angestiegen ist, ist, dass die Bakterien aufgrund ihres raschen Wachstums und ihres kurzen Kulturzeitraums ständig dazu fähig sind, neue Strategien zu entwickeln, um die Antibiotika wirkungslos zu machen. Derzeit werden daher zusätzlich zu Antibiotika zum Beispiel auch natürliche, insbesondere pflanzliche, und synthetische Öle und Emulsionen verwendet.
Vor diesem Hintergrund ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein neues Arzneimittel zur Behandlung von Infektionskrankheiten bereitzustellen, insbesondere zum Überwinden des Problems der Antibiotika des Stands der Technik.
Erfindungsgemäß werden diese und andere Ziele durch Bereitstellen einer Zusammensetzung erreicht, die a) mindestens ein natürliches, rekombinantes oder synthetisches menschliches antimikrobielles Peptid oder funktionelle Fragmente des menschlichen antimikrobiellen Peptids sowie b) mindestens ein antibakterielles Agens umfasst, zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von durch anaerobe Bakterien verursachten, insbesondere durch anaerobe grampositive Bakterien, vorzugsweise durch Clostridium spec. verursachten Infektionskrankheiten.
Hier und allgemein versteht man unter einem „menschlichen antimikrobiellen Peptid” ein beliebiges antimikrobiell wirksames Peptid menschlichen Ursprungs, oder das sich von solchen antimikrobiell wirksamen Peptiden menschlichen Ursprungs ableitet oder anderweitig hergestellt, synthetisiert oder erzeugt wird und die Struktur und Funktion von solchen antimikrobiell wirksamen Peptiden menschlichen Ursprungs aufweist. Es handelt sich hierbei um eine einzigartige und vielfältige Gruppe von Molekülen, die aufgrund ihrer Aminosäurezusammensetzung und -struktur in Untergruppen eingeteilt werden. Antimikrobielle Peptide verfügen im Allgemeinen über zwischen 12 und 50 Aminosäuren.
So zum Beispiel stellen „Defensine” menschliche antimikrobielle Peptide dar. In der vorliegenden Erfindung und wie allgemein auf dem Fachgebiet definiert, bedeuten „Defensine” eine Familie von hochwirksamen antimikrobiellen Peptiden, die durch drei Disulfidbrücken gekennzeichnet sind und die wichtige Schlüsselmoleküle der angeborenen Immunität darstellen, die Menschen gegen Mikroorganismen schützen und die weiterhin die Zusammensetzung der Mikrobioten von Schleimhäuten bilden. Es ist bekannt, dass Defensine gegen Bakterien, Pilze und Viren wirksam sind. Aufgrund ihrer Sequenzhomologie und der Cysteinreste, die in jedem Fall vorliegen, werden die menschlichen Defensine in alpha-Defensine und beta-Defensine eingeteilt.
Ebenso versteht man unter einem „funktionellen Fragment” eines menschlichen antimikrobiellen Peptids hier und allgemein ein Fragment dieser Peptide, das noch eine wesentliche antimikrobielle Aktivität aufweist, die ungefähr mit derjenigen des entsprechenden nichtfragmentierten Peptids vergleichbar ist.
Demgemäß gilt weiterhin, dass nicht nur das vollständige menschliche antimikrobielle Peptid, z. B. Defensine, sondern auch Fragmente davon, die noch die antimikrobielle Aktivität und Funktion des/der jeweils verwendeten menschlichen antimikrobiellen Peptids/Peptide besitzen, z. B. Defensine, geeignete antimikrobielle Peptide darstellen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung erfindungsgemäß sein können. Dem Fachmann sind ausreichend Mittel und Methoden zum Auffinden von geeigneten Fragmenten von vollständigen menschlichen antimikrobiellen Peptiden, z. B. Defensinen, insbesondere durch C- oder N-terminales Verkürzen des vollständigen menschlichen antimikrobiellen Peptids, z. B. von Defensinen, sowie zum Testen ihrer antimikrobiellen Wirksamkeit bekannt.
Ein „antibakterielles Agens” wie derzeit verwendet und allgemein verstanden ist jegliche Substanz, die fähig ist, Bakterien abzutöten oder ihr Wachstum oder ihre Funktion zu hemmen. Im Allgemeinen sind antibakterielle Agenzien Zellwandsynthesehemmer, Zellmembranhemmer, Proteinsynthesehemmer, Nukleinsäuresynthesehemmer oder -Funktionshemmer sowie kompetitive Hemmer.
Eine große Klasse von antibakteriellen Agenzien beinhaltet Antibiotika. Während früher von diesem Ausdruck Substanzen, die Bakterien abtöten, die jedoch von den Mikroorganismen nicht produziert werden, ausgeschlossen wurden, beinhaltet der Ausdruck Antibiotikum derzeit allgemein auch halbsynthetische Modifikationen von verschiedenen natürlichen Verbindungen, wie zum Beispiel die beta-Lactamantibiotika, zu denen die Penicilline (die von Pilzen der Gattung Penicillium produziert werden), die Cephalosporine und die Carbapeneme zählen. Verbindungen, die noch aus lebenden Organismen isoliert werden, sind die Aminoglykoside, während andere antibakterielle Agenzien – zum Beispiel die Sulfonamide, die Chinolone und die Oxazolidinone – nur durch chemische Synthese erzeugt werden. Demgemäß werden viele antibakterielle Verbindungen aufgrund ihres chemisch/biosynthetischen Ursprungs in natürliche, halbsynthetische und synthetische Verbindungen eingeteilt. Demgemäß werden in der vorliegenden Erfindung die Ausdrücke „antibakterielles Agens” und „Antibiotikum” synonym verwendet und sollen, falls nicht anders definiert, natürliche, halbsynthetische und synthetische Verbindungen umfassen.
Antibiotika, die zum Abtöten oder Hemmen eines breiten Bakterienspektrums wirksam sind, werden als Breitspektrumantibiotika bezeichnet. Andere Arten von Antibiotika wirken in erster Linie nur gegen grampositive oder gegen gramnegative Bakterien. Diese Arten von Antibiotika werden als Schmalspektrumantibiotika bezeichnet. Andere Antibiotika, die gegen einen einzigen Organismus oder eine einzige Krankheit und nicht gegen andere Arten von Bakterien wirksam sind, werden als Antibiotika mit begrenztem Spektrum bezeichnet.
In der vorliegenden Erfindung gilt, dass jeweils nicht nur ein menschliches antimikrobielles Peptid und/oder antibakterielles Agens erfindungsgemäß verwendet werden kann, sondern auch eine Kombination von jeweils zwei oder mehr, d. h. das menschliche antimikrobielle Peptid oder antibakterielle Agens oder beide können erfindungsgemäß verwendet und eingesetzt werden.
Hier und allgemein gilt, dass der Ausdruck „natürlich” jegliches Peptid umfasst, das von einem Ausgangsmaterial, wo das Peptid natürlich vorkommt/erzeugt wird, entnommen worden ist; ein natürliches Peptid ist also im Allgemeinen aus seinem Ausgangsmaterial isoliert, wobei „isoliert” „von menschlicher Hand” aus seinem natürlichen Zustand verändert bedeutet, d. h. dass, wenn es in der Natur vorkommt, es aus seiner ursprünglichen Umwelt entnommen oder entfernt wurde, oder beides. So zum Beispiel ist ein Polynukleotid oder ein Polypeptid, das auf natürliche Weise in einem lebendigen Organismus vorliegt, nicht „isoliert”, dasselbe Polynukleotid oder Polypeptid, das aus den gleichzeitig vorkommenden Materialien seines natürlichen Zustands getrennt ist, ist jedoch im vorliegenden Sinne „isoliert”. Auf ähnliche Art und Weise bedeutet im vorliegenden Zusammenhang eine „synthetische” Sequenz jegliche Sequenz, die synthetisch erzeugt und nicht direkt aus einem natürlichen Ausgangsmaterial isoliert worden ist. „Rekombinant” bedeutet gentechnisch veränderte DNA, die durch Verpflanzen oder Spleißen von Genen von einer Art in Zellen eines Wirtsorganismus einer anderen Art präpariert wurde. Solch eine DNA wird zu einem Teil des genetischen Materials des Wirts und wird repliziert. Jegliches Protein/Peptid, das von solch einer DNA aus exprimiert wird, kann anschließend aus der Wirtszelle isoliert und erfindungsgemäß verwendet werden.
Zum Isolieren von natürlich vorkommenden Defensinen und für die Herstellung von rekombinant oder synthetisch hergestellten Defensinen ist sich ein Fachmann ausreichender Möglichkeiten des Stands der Technik bewusst, die alle zu seiner Fähigkeit und seinem Wissen zählen und die übliche Vorgehensweisen auf dem jeweiligen Gebiet darstellen.
Das erfindungsgemäße menschliche antimikrobielle Peptid kann mittels DNA-Rekombinationstechnik unter Verwendung von gut fachbekannten Techniken hergestellt werden. Man kann sich dem Fachmann gut bekannter Verfahren bedienen, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die die Sequenzen, die für ein Peptid von Interesse und entsprechende Transkriptionstranslationskontrollsignale codieren, enthalten. Zu diesen Verfahren zählen zum Beispiel in-vitro-DNA-Rekombinationstechniken, Synthesetechniken und die genetische Rekombination in vivo; siehe zum Beispiel die bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) beschriebenen Techniken.
Es sind auch viele unterschiedliche Syntheseverfahren zum Erzeugen der menschlichen antimikrobiellen Peptide fachbekannt, zu denen zum Beispiel die Flüssigphasensynthese, die Festphasensynthese, Fmoc-, BOC-Schutz usw. zählen, und diesbezüglich ist eine Vielzahl von Literaturstellen verfügbar wie auch viele Firmen Peptide in Auftragsarbeit produzieren, wie zum Beispiel Sigma Aldrich. Beispielsweise sei auf Kent, „Chemical Synthesis of Proteins and Peptides", (1988) Ann. Rev. Biochem. 57: 957–989, und Albericio und Martin, „Solid supports for the Synthesis of Peptides", (2008) Ergänzung zu Chimica Oggi/CHEMISTRY TODAY, 26: 29–34 verwiesen.
Der Ausdruck ”Kombination” bezeichnet im vorliegenden Zusammenhang eine Kombination von mindestens zwei, d. h. mindestens einem menschlichen antimikrobiellen Peptid und mindestens einem antibakteriellen Agens, und dieser Ausdruck wird in der gesamten Erfindung synonym mit dem Ausdruck „Zusammensetzung” verwendet.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird das mindestens eine menschliche antimikrobielle Peptid aus einem menschlichen Defensin oder einem Cathelicidin, funktionellen Fragmenten davon oder Kombinationen von einem oder mehreren davon ausgewählt.
Bezüglich dem Ausdruck „Defensin” sei auf die Definition und Erklärung oben verwiesen.
In diesem Zusammenhang sei auch festgestellt, dass derzeit bekannt ist, dass zwei Arten von Defensinen vom Menschen produziert werden, und zwar die alpha- und die beta-Defensine. Derzeit sind sechs alpha-Defensine und vier beta-Defensine beim Menschen charakterisiert sowie 31 Defensingene identifiziert worden. Während die beta-Defensine an mehreren Stellen im Magen-Darm-Trakt exprimiert werden, werden die alpha-Defensine großteils im Dünndarm exprimiert. Reife menschliche Defensine enthalten zwischen 30 und 40 Aminosäurereste, und jedes Defensin verfügt über 3 Disulfidbrücken. Unter den sechs menschlichen alpha-Defensinen werden vier in den Neutrophilen und zwei primär in den Paneth-Zellen, die sekretorische Epithelzellen und die Hauptquelle für antimikrobielle Peptide im Dünndarm sind, exprimiert.
Unter einem „Cathelicidin” versteht man mit Cathelicidin verwandte antimikrobielle Peptide, bei denen es sich um eine Familie von Polypeptiden, die sich in Lysosomen von Macrophagen und polymorphkernigen Leukozyten (PMNs) finden, handelt. Die Cathelicidine spielen eine kritische Rolle in der Säugern angeborenen Immunabwehr gegen eindringende bakterielle Infektion. Mitglieder der Cathelicidinfamilie von antimikrobiellen Polypeptiden sind durch eine stark konservierte Region (Cathelindomäne) und eine hochvariable Cathelicidinpeptiddomäne gekennzeichnet. Die Cathelicidine wurden ursprünglich in den Neutrophilen gefunden, sind jedoch seit damals in vielen anderen Zellen gefunden worden, darunter Epithelzellen und Macrophagen nach Aktivierung durch Bakterien, Viren, Pilze oder das Hormon 1,25-D, das die hormonell aktive Form von Vitamin D ist. Die Cathelicidine liegen größenmäßig im Bereich von 12 bis 80 Aminosäureresten und weisen verschiedenste Strukturen auf. Die meisten Cathelicidine sind lineare Peptide mit 23–37 Aminosäureresten und falten sich zu amphiphatischen alpha-Helices.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist das menschliche Defensin, Cathelicidin und/oder Fragment davon aus der Gruppe umfassend natürliche(s), isolierte(s) und aufgereinigte(s) Defensine/Cathelicidin, rekombinante(s) Defensine/Cathelicidin, synthetische(s) Defensine/Cathelicidin, funktionelle Fragmente davon oder Kombinationen von einem oder mehreren davon ausgewählt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist das menschliche Defensin aus menschlichem beta-Defensin-1 (hBD-1), menschlichem beta-Defensin-2 (hBD-2), menschlichem beta-Defensin-3 (hBD-3), menschlichem alpha-Defensin-5 (hBD-5) oder Cathelidicin LL-37, oder Fragmenten davon, oder Kombinationen von einem oder mehreren davon, ausgewählt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wiederum ist das antibakterielle Agens in der Zusammensetzung/Kombination der Erfindung aus Glycylcyclinen, Chinolonen, beta-Lactamantibiotika ausgewählt.
Glycylcycline sind eine neue Klasse von Antibiotika, die sich von Tetracyclin ableiten. Diese Tetracyclinanaloge sind spezifisch dazu entwickelt, dass sie zwei häufig auftretende Mechanismen der Tetracyclinresistenz überwinden, nämlich Resistenz, die durch erworbene Effluxpumpen vermittelt wird und/oder ribosomalen Schutz. Derzeit ist Tigecyclin das einzige Glycylcyclin, das zur Verwendung als Antibiotikum genehmigt ist.
Die Chinolone sind eine Familie von synthetischen antibakteriellen Breitspektrumarzneistoffen. Chinolone üben ihre antibakterielle Wirkung dadurch aus, dass sie Bakterien-DNA am Entwickeln und Duplizieren hindern. Der Großteil der Chinolone, die klinisch verwendet werden, gehört zu der Untergruppe der Fluorchinolone, die ein Fluoratom an das zentrale Ringsystem gebunden enthalten, und zwar typischerweise in 6-Stellung oder C-7-Stellung.
Die beta-Lactamantibiotika sind eine breite Antibiotikaklasse und bestehen aus allen antibiotischen Mitteln, die einen beta-Lactamring in ihren Molekülstrukturen enthalten. Dazu zählen Penicillinderivate (Pename), Cephalosporine (Cepheme), Monobactame und Carbapeneme. Die meisten beta-Lactamantibiotika funktionieren dadurch, dass sie die Zellwandbiosynthese in dem bakteriellen Organismus hemmen; sie sind die am häufigsten verwendete Antibiotikagruppe.
Die Ureidopenicilline sind eine Untergruppe von Penicillinen, die gegen Pseudomonas aeruginosa wirksam sind. Es werden drei Ureidopenicilline klinisch verwendet, nämlich Azlocillin, Piperacillin, Mezlocillin. Es handelt sich hauptsächlich um Ampicillinderivate, in denen die D-Aminoseitenkette umgewandelt worden ist.
Demgemäß und gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist das antibakterielle Agens in der Kombination/Zusammensetzung aus Carbapenemantibiotika, Fluorchinolonen, Penicillinen, insbesondere Ureidopenicillinen, Cephalosporinen (Cephemen), Monobactamen und Carbapenemen, oder Kombinationen von einem oder mehreren davon, ausgewählt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wiederum ist das antibakterielle Agens in der Zusammensetzung/Kombination der Erfindung aus Tigecyclin, Moxifloxacin, Piperacillin/Tazobactam oder Meropenem ausgewählt.
Wie am Anfang erwähnt, wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung gemäß ihren unterschiedlichen Aspekten vorzugsweise für die Behandlung von Infektionskrankheiten, stärker bevorzugt insbesondere für die Behandlung von durch anaerobe Mikroorganismen verursachten Infektionskrankheiten, verwendet.
Hier und allgemein bedeutet der Begriff „anaerobe” oder „anaerob” lebende „Bakterien” einen beliebigen bakteriellen Organismus, der keinen Sauerstoff für sein Wachstum benötigt. Wenn Sauerstoff vorhanden ist, kann er negativ reagieren, ja sogar absterben. Anaerobe Bakterien lassen sich daher in obligate Anaerobier, die durch das Vorhandensein von Sauerstoff beschädigt werden, aerotolerante Organismen, die Sauerstoff nicht für das Wachstum verwenden können, jedoch sein Vorhandensein tolerieren, und fakultative Anaerobier, die ohne Sauerstoff wachsen können, jedoch Sauerstoff verwerten, wenn dieser vorhanden ist, einteilen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die erfindungsgemäße Kombination für die Behandlung von Krankheiten, die durch obligate anaerobe Bakterien verursacht werden, verwendet.
In der folgenden nichteinschränkenden Aufzählung sind bestimmte obligate anaerobe Bakterien beschrieben: zu gramnegativen Anaerobiern und manchen der Infektionen, die sie verursachen, zählen Bacteroides, das intraabdominale Infektionen verursacht; Fusobacterium, das Abszesse, Wundinfektionen, Lungeninfektionen und intrakraniale Infektionen verursacht; Porphyromonas, der Aspirationspneumonie und Periodontitis verursacht; Prevotella, die intraabdominale Infektionen und Weichgewebeinfektionen verursacht. Zu grampositiven Anearobiern und manchen Infektionen, die sie verursachen, zählen Actinomyces, der Kopf-, Hals-, Abdomen- und Beckeninfektionen und Aspirationspneumonie verursacht; Clostridium, das durch C. perfringens bedingten Gasbrand, durch C. perfringens Typ A bedingte Nahrungsmittelvergiftung, durch C. botulinum bedingten Botulismus, durch C. tetani bedingten Tetanus und durch C. difficile verursachte Diarrhö (pseudomemranöse Colitis) verursacht; Peptostreptococcus, der orale Infektionen, respiratorische Infektionen und intraabdominale Infektionen verursacht; Propionibacterium, das Fremdkörperinfektionen verursacht (z. B. in einem Liquor-Shunt, einer Gelenksprothese oder einer kardialen Vorrichtung).
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die erfindungsgemäße Kombination für die Behandlung von Erkrankungen, die durch anaerobe grampositive Bakterien verursacht werden, verwendet. Einige nichteinschränkende Beispiele für grampositive Bakterien sind im Absatz oben angeführt.
Grampositive Bakterien sind eine Bakterienklasse, die in der Gram-Färbemethode der Bakteriendifferenzierung den Kristallviolett-Farbstoff aufnehmen. Die dicke Peptidoglycanschicht in der Zellwand, die ihre Zellmembran umhüllt, hält den Farbstoff zurück und ermöglicht so eine definitive Identifikation. Im Gegensatz zu den grampositiven Bakterien können die gramnegativen Bakterien den violetten Farbstoff nach dem Entfärbungsschritt nicht zurückhalten; der im Entfärbevorgang verwendete Alkohol baut die äußere Membran der gramnegativen Zellen ab, wodurch die Zellwand poröser wird und nicht mehr fähig ist, den Farbstoff Kristallviolett zurückzubehalten.
Gemäß einem weiteren Aspekt wiederum wird die erfindungsgemäße Kombination für die Behandlung von Krankheiten verwendet, die durch Clostridium spec., insbesondere durch Clostridium difficile, verursacht werden.
Clostridium ist eine grampositive Bakteriengattung, die zu den Firmicutes zählt. Es handelt sich um obligate Anaerobier, die fähig sind, Endosporen zu produzieren. Die einzelnen Zellen sind stäbchenförmig, wodurch sie ihren Namen erhalten, der vom griechischen Wort „kloster”, oder „Spindel”, stammt.
Wie zu Beginn erwähnt, können C. difficile-Infektionen zu Symptomen von Diarrhö bis schwerer pseudomembranöser Colitis und toxischem Megakolon führen. Bei diesen Magen-Darm-Infektionen ist die Ausgewogenheit zwischen der Darmflora und der Abwehr des Wirts gestört.
Trotz zahlreicher Studien, in denen die Auswirkungen von antimikrobiellen Peptiden auf ein breites Bakterienartenspektrum untersucht wurde, sind Informationen bezüglich ihrer Auswirkung auf die Lebensfähigkeit von C. difficile begrenzt gewesen.
Demgemäß und gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die Infektionskrankheit, die mit der erfindungsgemäßen Kombination/Zusammensetzung zu behandeln ist, aus intraabdominalen Infektionen, Weichgewebeinfektionen, Magen-Darm-Infektionen, Lungeninfektionen, intrakranialen Infektionen, Krankheiten des Urogenitaltrakts, Krankheiten des weiblichen Reproduktionssystems, Abszessen, Wundinfektionen, Periodontitis und Diarrhö ausgewählt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform richtet sich die Erfindung auch auf die Verwendung der Zusammensetzung/Kombination der Erfindung für die Behandlung von Infektionskrankheiten, insbesondere von durch anaerobe Bakterien verursachten Infektionskrankheiten, stärker bevorzugt durch anaerobe grampositive Bakterien verursachten Infektionskrankheiten, und stärker bevorzugt von durch Clostridium spec., insbesondere Clostridium difficile, verursachten Infektionskrankheiten.
Die Erfindung richtet sich allgemein auch auf die Verwendung eines menschlichen Defensins zur Behandlung von durch Clostridium difficile verursachten Infektionen, wobei das menschliche Defensin aus HBD3, HBD2 und HBD1 ausgewählt ist.
In einer weiteren Ausführungsform wiederum wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung/Kombination in Kombination mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger verwendet.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung eines Individuums bereit, das an einem mit einer antibiotikaresistenten Bakterieninfektion assoziierten Leiden erkrankt ist. Demgemäß beinhaltet die vorliegende Erfindung die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Kombination von mindestens einem Antibiotikum und mindestens einem natürlichen, rekombinanten oder synthetischen menschlichen antimikrobiellen Peptids an ein Individuum.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutisch unbedenkliche Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge an einer oder mehreren der hierin beschriebenen Verbindungen und/oder Zusammensetzungen in gemeinsamer Formulierung mit einem oder mehreren pharmazeutisch unbedenklichen Trägern (Zusatzstoffen) und/oder Verdünnungsmitteln umfassen. Zu Beispielen für die Verabreichung zählen die parenterale, z. B. intravenöse, intradermale, subkutane, transdermale, transmukosale Verabreichung. Die Bestimmung der Mengen und der Dosierungsformen sowie der Verabreichungswege, die sich in jedem Fall eignen, zählt zur Fähigkeit und zum Wissen des Fachmanns. Sie können in Bezug auf den Patienten, die jeweilige Erkrankung und unter Berücksichtigung anderer Faktoren schwanken. Die Wirkstoffmenge, die mit einem Trägermaterial vereinigt werden kann, um eine Einzeldosisform zu erzeugen, wird im Allgemeinen diejenige Menge der Verbindung und/oder der Zusammensetzung sein, die zu einer therapeutischen Wirkung führt. Im Allgemeinen wird diese Menge im Bereich von ungefähr 1% bis ungefähr 99% Wirkstoff, vorzugsweise von ungefähr 5% bis ungefähr 70%, am stärksten bevorzugt von ungefähr 10% bis ungefähr 30%, liegen. Die tatsächlichen Dosierungsniveaus der Wirkstoffe in pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung können variieren, so dass man zu derjenigen Wirkstoffmenge gelangt, die wirksam ist, um die gewünschte therapeutische Reaktion bei einem bestimmten Patienten, einer bestimmten Zusammensetzung und einem bestimmten Verabreichungsweg zu erzielen, ohne für den Patienten toxisch zu sein.
Das ausgewählte Dosierungsniveau wird von verschiedenen Faktoren abhängen, darunter der Aktivität der eingesetzten jeweiligen pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung oder des Esters, Salzes oder Amids davon, dem Verabreichungsweg, dem Zeitpunkt der Verabreichung, der Ausscheidungsrate oder dem Metabolismus der jeweiligen eingesetzten pharmazeutischen Zusammensetzungen, der Behandlungsdauer, anderen Arzneistoffen, Verbindungen und/oder Zusammensetzungen und/oder Materialien, die in Kombination mit den jeweiligen eingesetzten pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht, dem Zustand, der allgemeinen Gesundheit und der Anamnese des behandelten Patienten, sowie ähnlichen Faktoren, die auf dem Gebiet der Medizin gut bekannt sind. Es kann eine tägliche, wöchentliche oder monatliche Dosierung (oder ein anderes Zeitintervall) verwendet werden.
Der im vorliegenden Text verwendete Ausdruck „pharmazeutisch unbedenklich” bezieht sich auf diejenigen Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosisformen, die im Rahmen einer soliden medizinischen Beurteilung zur Verwendung im Kontakt mit den Geweben von Menschen und Tieren ohne schwere Toxizität, Reizwirkung, allergische Reaktion oder andere Probleme oder Komplikationen entsprechend einem angemessenen Nutzen-Risiko-Verhältnis geeignet sind.
Der Ausdruck „pharmazeutisch unbedenklicher Träger” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang ein pharmazeutisch unbedenkliches Material, eine pharmazeutisch unbedenkliche Zusammensetzung oder einen pharmazeutisch unbedenklichen Grundstoff, wie einen flüssigen oder festen Füllstoff, ein Verdünnungsmittel/Streckmittel, ein Exzipiens oder ein lösungsmittelverkapselndes Material, das am Übertragen oder Transportieren der vorliegenden Verbindung und/oder Zusammensetzung von einem Organ oder Körperteil zu einem anderen Organ oder Körperteil beteiligt ist. Jeder Träger muss in dem Sinn „unbedenklich” sein, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist und für den Patienten nicht schädlich ist.
Pharmazeutisch unbedenkliche Träger mit gegebenenfalls weiteren Zusatzstoffen sind allgemein im Stand der Technik bekannt und werden zum Beispiel in der Arbeit von Kibbe A., Handbook of Pharmaceutical Excipients, dritte Ausgabe, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press 2000 beschrieben. Gemäß der Erfindung umfassen Zusatzstoffe eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, die für die therapeutische Verwendung der Zusammensetzung vorteilhaft ist, was Salze, Bindemittel, Lösungsmittel, Dispergiermittel und andere Substanzen, die üblicherweise im Zusammenhang mit der Formulierung von medizinischen Produkten eingesetzt werden, beinhaltet.
Der Ausdruck „therapeutisch wirksame Menge” bedeutet im vorliegenden Zusammenhang diejenige Menge einer Verbindung und/oder einer Zusammensetzung, eines Materials oder einer Zusammensetzung umfassend eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die wirksam ist, um in zumindest einer Unterpopulation von Zellen in einem Tier eine gewisse gewünschte therapeutische Wirkung hervorzurufen, und zwar entsprechend einem Nutzen-Risiko-Verhältnis, das für jegliche medizinische Behandlung angemessen ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Zusammensetzung/Kombination/Verbindung der Erfindung für die Behandlung von Infektionen, die durch antibiotikaresistente Bakterien verursacht werden, verwendet.
Ein Verfahren zum Fördern der Wirksamkeit eines Antibiotikums umfassend den Schritt des Kombinierens des Antibiotikums mit einem menschlichen antimikrobiellen Peptid.
Die vorliegende Erfindung ist in ihrer Anwendung nicht auf die Details der Erstellung und Anordnung der Komponenten, die in der Beschreibung dargestellt oder in den Zeichnungen veranschaulicht sind, beschränkt. Die Erfindung ermöglicht andere Ausbildungsformen und kann auf verschiedene Art und Weise durchgeführt werden. Auch dient die hier verwendete Ausdrucksweise und Terminologie Beschreibungszwecken und ist nicht als einschränkend zu betrachten. Die Verwendung von „einschließlich”, „umfassend” oder „aufweisend”, „enthaltend”, „beinhaltend” und Variationen davon soll im vorliegenden Text das danach Aufgezählte sowie Äquivalente davon und Zusätzliches mit umfassen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die keinesfalls als weiter einschränkend aufzufassen sind, weiter veranschaulicht. Der gesamte Inhalt aller in der vorliegenden Anmeldung zitierten Angaben (einschließlich Literaturstellen, ausgegebener Patente, veröffentlichter Patentanmeldungen und mitanhängiger Patentanmeldungen) wird hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen. Im Falle eines Konfliktes ist die vorliegende Beschreibung, einschließlich beliebiger Definitionen hierin, vorrangig.
Es folgt die Beschreibung der Figuren.
1 zeigt die Ergebnisse einer durchflusscytometrischen Analyse der antimikrobiellen Wirksamkeit der Defensine HBD2 und HBD3 und des Cathelicidins LL-37 gegen vegetative Zellen von C. difficile 109. Das grau gefüllte Histogramme zeigt die grüne Fluoreszenz von unbehandelten Bakterien, die Linien die Fluoreszenz von Bakterien, die mit antimikrobiellen Peptiden in einer Konzentration von 15 μg/ml (Linie B: HBD1, Linie C: HBD2, Linie D: HBD3, Linie E: HD5 und Linie F: mit LL-37 inkubiert ) inkubiert wurden. Zellschädigung führt zu einer Aufnahme des membranpotentialsensitiven Farbstoffs DiBAC4(3) in den Bakterien und daher zu einer ansteigenden Fluoreszenz 1 im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle (A); 1(B) zeigt eine Elektronenmikroskopie von C. difficile-Zellen, die mit 200 μg HBD3/ml inkubiert worden waren. Unbehandelte Kontrolle (Tafeln links) und Porenbildung nach Behandlung mit HBD3 (Tafeln rechts, Messbalken 0,2 μm). HBD3 führte zu Störungen in der Zellmembran (Pfeile) und zu einer Verringerung der Cytoplasmadichte;
2 zeigt ein Diagramm, das die Aktivität von antimikrobiellen Peptiden in nativer (oxidierter) oder reduzierter Form in einer Konzentration von 15 μg/ml gegen 5 C. difficile-Stämme zeigt. Die Reduktion von HBD3 führte zu einer verringerten antimikrobiellen Aktivität (*p < 0,05), während die antibakterielle Aktivität von LL-37 bei beiden Formen nicht signifikant verschieden war;
3 zeigt Tabelle 1, in der die bakterielle Abtötung von toxinogenen (n = 10) und nichttoxinogenen (n = 10) C. difficile-Stämmen nach Inkubation mit antimikrobiellen Peptiden, Antibiotika oder der Kombination von beiden zusammengefasst ist;
4 zeigt Tabelle 2, in der die Mengen an Toxin A und B von 10 toxinogenen C. difficile-Stämmen nach Inkubation mit antimikrobiellen Peptiden, Antibiotika oder der Kombination von beiden zusammengefasst ist;
5 zeigt zusätzliche Werte in Form von Tabellen, in denen die bakterielle Abtötung von toxinogenen (n = 10) und nichttoxinogenen (n = 10) C. difficile-Stämmen nach Inkubation mit antimikrobiellen Peptiden, Antibiotika oder der Kombination von beiden zusammengefasst ist, A): Tigecyclin, B): Moxifloxacin, C): Piperacillin, D): Imipenem;
6 zeigt Diagramme, in denen der Prozentsatz der depolarisierten Bakterien (Mittel + SD) von 10 toxinogenen Stämmen (A) und 10 nichttoxinogenen Stämmen (B), die jeweils mit 1 μg/ml der antimikrobiellen Peptide HBD1 (oben rechts), HBD2 (Mitte links) HBD3 (Mitte rechts), HD5 (unten links), LL-37 (oben links), subinhibitorischen Konzentrationen der Antibiotika Tigecyclin, Moxifloxacin, Piperacillin/Tazobactam und Meropenem oder der Kombination von antimikrobiellen Peptiden und Antibiotika inkubiert wurden, zusammengefasst ist. Für die unbehandelte Kontrolle, siehe erster Graph, erster Balken. Für den Vergleich von Mittelwerten der bakteriellen Abtötung wurde der Mann-Whitney-Test verwendet (****:p < 0,0001, ***:p < 0,0005, **:p < 0,005, *:p < 0,05).
BEISPIELE
Material und Methoden
Bakterienstämme
Aus routinemäßigen Laboratoriumstests des Instituts für Laboratoriummedizim des ALB FILS KLINIKEN-Krankenhauses wurden 10 nichttoxinogene und 9 toxinogene klinische Isolate erhalten. Als 10. toxinogener Stamm diente C. difficile DSM 1296. Alle Stämme wurden auf Columbia-Agar mit 5% entfibrinisiertem Schafblut (BD, Sparks, USA) gezüchtet. Die Toxinproduktion der toxinogenen Stämme wurde mittels Toxin-A/B-ELISA (Ridascreen Clostridium difficile^®, R-biopharm, Darmstadt, Deutschland) verifiziert. Die Stämme wurden molekulargenetisch mit Genotype CDiff (Hain Lifescience, GmbH Nehren, Deutschland) charakterisiert.
MHK-Bestimmung
Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) der C. difficile-Isolate gegen Tigecyclin, Moxifloxacin, Piperacillin/Tazobactam und Imipenem wurden mittels Etest^® (BioMerieux Nürtingen, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Als Kontrollstämme dienten S. aureus ATCC 25923, B. fragilis ATCC 25285 und B. thetaiotaomicron ATCC 29741. Kurz umrissen wurde ein Inoculum von ungefähr 1,5 × 10 kolonienbildenden Einheiten auf Müller-Hinton-Agar mit einem Zusatz von 5% Schafblut (BD, Sparks, USA) ausplattiert. Die Etest^®-Streifen wurden auf den Agar gelegt und die Platten wurden 48 h lang unter anaeroben Bedingungen inkubiert (Anaero Gen, Oxoid Limited, Hampshire, GB). Die MHK wurde als diejenige Konzentration verzeichnet, bei der der elliptische Hemmhof auf den Etest-Streifen traf. Um subinhibitorische Konzentrationen mit dem durchflusscytometrischen Test zu bestimmen, wurden 1,5 × 10⁶ KBE/ml C. difficile in der mittleren logarithmischen Phase mit Antibiotika in den folgenden Konzentrationen inkubiert: Moxifloxacin 64, 32, 16, 8 und 4 μg/ml, Tigecyclin 2, 1, 0,512, 0,256, 0,128 und 0,0064 μg/ml, Piperacillin 6, 3, 1,5, 0,75, 0,375 μg/ml in Kombination mit 4 μg Tazobactam sowie Meropenem 512, 256, 128, 64, 16 und 4 μg/ml, 8 Stunden lang bei 37°C unter anaeroben Bedingungen (AnaeroGen, Oxoid Limited, Hampshire, GB). Anschließend wurden die Suspensionen 10 Minuten lang mit 1 μg/ml des membranpotentialempfindlichen Farbstoffs DiBAC4(3)[Bis-(1,3-dibutylbarbitursäure)trimethinoxonol] (Invitrogen, Carlsbad, CA) inkubiert. Zellschädigung führt zum Versagen des Membranpotentials, woran sich die Aufnahme des Farbstoffs in die Bakterienzellen anschließt, und zu einer erhöhten Fluoreszenz.¹³ Die Suspensionen wurden 10 Minuten bei 4500 × g zentrifugiert, die Bakterienpellets wurden in 300 μl PBS resuspendiert und durchflusscytometrisch wie unten beschrieben analysiert. Für mehrere Stämme wurden die durchflusscytometrischen Ergebnisse durch Ausplattieren bestätigt.
Auswirkung von Defensinen und LL-37 auf C. difficile
Für insgesamt 10 toxinogene oder nichttoxinogene C. difficile-Stämme wurden die subinhibitorischen Konzentrationen der antimikrobiellen Peptide bestimmt. C. difficile-Suspensionen mit einer Konzentration von 1,5 × 10⁶ KBE/ml wurden mit den antimikrobiellen Peptiden HBD1, HBD2, HBD3, HD5 (alle Peptide vom Peptide Institute, Osaka, Japan) und LL-37 (Innovagen, Lund, Schweden) in unterschiedlichen Konzentrationen im Bereich von 0,5 bis 15 μg/ml 90 min bei –37°C unter anaeroben Bedingungen inkubiert (AnaeroGen, Oxoid Limited, Hampshire, Großbritannien). Dann wurde mit 1 μg/ml DiBAC₄(3) (Invitrogen, Carlsbad, CA) versetzt, und nach 10 Minuten wurden die Suspensionen 10 Minuten lang bei 4 500 × g zentrifugiert, die Pellets wurden in 300 μl PBS resuspendiert und durchflusscytometrisch analysiert.
Aktivität der reduzierten antimikrobiellen Peptide
Um die antimikrobiellen Peptide zu reduzieren, wurden diese 2 Stunden lang bei 37°C mit 10 mM DTT vorinkubiert (13). Die Peptide wurden in nativer/oxidierter oder in reduzierter Form mit 5 C. difficile-Stämmen in einer Konzentration von 15 μg/ml wie oben beschrieben inkubiert und durchflusscytometrisch analysiert.
Kombinierte Auswirkung von Antibiotika und antimikrobiellen Peptiden
Die Synergismusuntersuchungen wurden mit einer Konzentration von 1 μg/100 μl der verschiedenen antimikrobiellen Peptide durchgeführt, da bei dieser Peptidkonzentration allein keine signifikante Depolarisierung der Bakterien beobachtet wurde. Aufgrund von Pilotversuchen verwendeten wir Tigecyclin in einer Konzentration von 0,512 μg/ml, Moxifloxacin in einer Konzentration von 32 μg/ml, Piperacillin/Tazobactam in einer Konzentration von 6 μg/ml/4 μg/ml und Meropenem bei einer Konzentration von 64 μg/ml in diesen Studien, da diese Konzentrationen zu keiner signifikanten Depolarisierung führen.
Suspensionen mit 1,5 × 10⁶ KBE/ml wurden 30 Minuten bei 37°C mit den antimikrobiellen Peptiden inkubiert. Anschließend wurde mit den antimikrobiellen Substanzen versetzt. Nach 8-stündigem Weiterinkubieren bei 37°C unter anaeroben Bedingungen (AnaeroGen, Oxoid Limited, Hampshire, Großbritannien) wurden die Suspensionen 10 Minuten lang mit 1 μg/ml DiBAC₄(3) inkubiert. Die Suspensionen wurden 10 Minuten lang bei 4 500 × g zentrifugiert und die Bakterienpellets wurden jeweils in 300 μl PBS resuspendiert. Der Prozentsatz der depolarisierten fluoreszierenden Bakterien in der Suspension wurde durchflusscytometrisch wie unten beschrieben bestimmt.
Alle Versuche wurden mindestens in zweifacher Wiederholung durchgeführt und wiederholt.
Durchflusscytometrie
In jeder Probe wurden 10000 Events mit einem FACSCalibur^TM-Durchflusscytometer (BD, Sparks, MD) unter Verwendung der Software Cell Quest (BD) analysiert. Mit den Parametern Forward Scatter und Side Scatter, die sich auf die relative Zellgröße und Granularität beziehen, wurde die Bakterienpopulation für die Auswertung der Fluoreszenz 1 (DiBAC₄(3)) in einem entsprechenden Histogramm getort. Die antibakterielle Aktivität wurde als Prozentsatz der fluoreszierenden Bakterien in Bezug auf die unbehandelte Bakterienkontrolle bestimmt.
Elektronenmikroskopie
Um die Auswirkung der antimikrobiellen Peptide auf C. difficile-Zellen sichtbar zu machen, wurden 1,5 × 10⁷ Bakterien/ml gegenüber HBD3 in einer Konzentration von 200 μg/ml exponiert und 4 Stunden bei 37°C inkubiert. (Aufgrund einer zehnfachen Bakterienkonzentration für die Mikroskopie wurde die Konzentration der antimikrobiellen Peptide ebenfalls um das 10-Fache erhöht.) Unbehandelte Bakterien dienten als Kontrolle. Nach dem Zentrifugieren wurden die Bakterienpellets mit Karnovsky-Fixiermittel fixiert. Die Pellets wurden bei 37°C in 3,5%ige Agarose eingebettet, bei Raumtemperatur festwerden gelassen und nochmals mit Karnovsky-Fixiermittel fixiert. Die Nachfixierung erfolgte 2 Stunden lang mit 1% Osmiumtetroxid, das 1,5% Kaliumhexacyanoferrat in 0,1 M Cacodylatpuffer enthielt. Anschließend wurden die Proben in Glycidether eingebettet. Ultradünnschnitte mit einer Dicke von 20–30 nm wurden auf unbeschichtete Kupfergitter aufgezogen und mit einem LIBRA-120-Mikroskop von Zeiss (Carl Zeiss Oberkochen, Deutschland) wurde eine elektronenmikroskopische Aufnahme erzeugt.
Einfluss der antimikrobiellen Peptide und Antibiotika auf die Toxinfreisetzung
Für die antimikrobiellen Peptide, die einen Synergismus mit Antibiotika aufwiesen, nämlich HBD3 und LL-37, sowie für HNP1 wurde der Einfluss auf die Toxinfreisetzung durch C. difficile untersucht.
Die 10 toxinogenen Stämme wurden über Nacht in Schaedler-Bouillon herangezüchtet und mit Schaedler-Bouillon (BD, Sparks, USA), 1:3 mit dH₂O verdünnt, auf 4,5 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Die Verdünnung wurde deshalb durchgeführt, weil der Salzgehalt in unverdünnter Schaedler-Bouillon eine Hemmwirkung auf die Aktivität von manchen antimikrobiellen Peptiden ausübt. Die Suspensionen wurden 30 Minuten bei 37°C mit dem jeweiligen antimikrobiellen Peptid in einer Konzentration von 10 μg/ml inkubiert. Die antimikrobiellen Substanzen wurden in den folgenden Konzentrationen zugesetzt: Tigecyclin 0,512 μg/ml; Moxifloxacin 32 μg/ml; Piperacillin/Tazobactam in einer Konzentration von 4 bzw. 6 μg/ml und Meropenem 64 μg/ml. Die Bakteriensuspensionen wurden 8 h lang unter anaeroben Bedingungen inkubiert (AnaeroGen, Oxoid Limited, Hampshire, Großbritannien). 100 μl der Suspension wurden in einem Toxin-A- und -B-ELISA verwendet, der entsprechend den Anweisungen des Herstellers (R-biopharm, Darmstadt, Deutschland) durchgeführt wurde.
Statistik
Die Erstellung von Graphen und die statistischen Analysen erfolgten mit einer Prism 5.0 Software. Die Werte werden als Mittelwerte mit dem Standardfehler des Mittelwerts (Standard Error of the Mean, SEM) dargestellt. Um die Abtötung der Bakterien mit oder ohne Vorinkubation mit antimikrobiellen Peptiden zu vergleichen, verwendete man den Mann-Whitney-Test. Werte von p < 0,05 galten als statistisch signifikant.
Eine Depolarisierungsrate der Kombination des antimikrobiellen Peptids und eines Antibiotikums, die der Summe ihrer einzelnen Abtötungsraten äquivalent war, wurde als additiv definiert, während ein Prozentsatz, der höher als die Summe der einzelnen Raten war, als synergistisch galt.
Ergebnisse
MHK-Bestimmung
Für die Kontrollstämme S. aureus ATCC 25923, B. fragilis ATCC 25285 und B. thetaiotaomicron ATCC 29741 wurde die mittels E-Test bestimmte MHK für alle Testantibiotika (Tigecyclin, Piperacillin, Moxifloxacin und Imipenem) innerhalb des vom Hersteller bereitgestellten Bereichs bestimmt. Für die C. difficile-Stämme betrug die MHK für Tigecyclin 0,016 mg/l oder weniger. Die MHK für Piperacillin lag im Bereich von 0,75 mg/l bis > 32 mg/l, wobei die MHK der meisten Stämme (n = 13) zwischen 3 und 6 mg/l lag. Die MHK für Moxifloxacin betrug für 15 Stämme über 32 mg/l, und nur 5 Stämme waren mit einer MHK von 0,38 oder 0.75 mg/l empfindlich. Für Imipenem wiesen ebenfalls 17 Stämme eine MHK von oberhalb 32 mg/l auf, und nur drei Stämme waren mit einer MHK von 2, 6 oder 12 mg/l anfällig (siehe 5).
Auswirkung von Defensinen und LL-37 auf C. difficile
Bei Konzentrationen von 0,5 oder 1 μg/ml wurde bei allen Testpeptiden keine antibakterielle Wirkung beobachtet. Unter Verwendung von höheren Konzentrationen von 2,5–15 μg/ml wurde beim Inkubieren der Stämme mit dem konstitutiven Defensin HBD1 keine Auswirkung auf die Integrität von C. difficile beobachtet. Manche Stämme wurden durch das induzierbare HBD2 oder durch HD5 leicht beeinflusst. Im Gegensatz dazu depolarisierten bei Konzentrationen von > 5 μg/ml sowohl LL-37 als auch HBD3 vegetative Zellen wirksam (1A) und reduzierten die kolonienbildenden Einheiten in Kulturen von allen getesteten C. difficile-Stämmen signifikant (Werte nicht dargestellt).
An C. difficile mit dem Defensin HBD3 durchgeführte Elektronenmikroskopie zeigte ein Aufbrechen der Zellwand und weniger dichte zytoplasmatische Regionen, ja sogar die Auflösung des Zytoplasmas (1B). Nach Reduktion der antimikrobiellen Peptide war die Aktivität von HBD3 niedriger als die Aktivität der nativen (oxidierten) Form. Dieser Effekt wurde beim Reduzieren von LL-37 nicht beobachtet. Bezüglich der Aktivität von reduziertem HBD1, HBD2 und HD5 gegen C. difficile traten im Vergleich zu der nativen Form dieser Peptide keine signifikanten Unterschiede auf (2).
Synergismus zwischen Antibiotika und antimikrobiellen Peptiden
Mit einem Durchschnitt von 3,83% (Bereich 0,89–9.73%) wurde bei den unbehandelten Kontrollen keine signifikante Depolarisierung der Bakterienzellen beobachtet. Wurde mit subinhibitorischen Konzentrationen der verschiedenen Antibiotika inkubiert, so betrug der Prozentsatz der depolarisierten Zellen durchschnittlich 9,02% (Bereich Tigecyclin 3,69–29,6%, Moxifloxacin 1,03–12,69%; Piperacillin/Tazobactam 1,07–12,69% und Meropenem 0,29–26,5%), wobei zwischen den verschiedenen Antibiotika kein statistisch signifikanter Unterschied auftrat. Die subinhibitorischen Konzentrationen von HBD1–3, HD5 und LL-37 zeigten durchschnittlich Depolarisierungsraten von 11,16% (Bereich 0,02–39,12%).
Wurden die Antibiotika kombiniert, so übten sie mit beinahe allen antimikrobiellen Peptiden eine additive Wirkung aus. Nur HD5 zeigte bei nichttoxinogenen Stämmen eine additive Wirkung mit Tigecyclin, jedoch nicht mit Moxifloxacin, Piperacillin/Tazobactam oder Meropenem. Weiterhin wiesen alle Antibiotika in Kombination mit HBD3 oder LL-37 signifikante synergistische Wirkungen auf (siehe 3 und 6). Bei 15 von 20 getesteten Stämmen konnte nach Versetzen mit HBD3 eine synergistische Wirkung beobachtet werden, wobei die depolarisierten Zellen von 9,02% mit den verschiedenen Antibiotika allein auf durchschnittlich 41,42% in Kombination mit HBD3 anstiegen. Mit LL-37 wurde diese Wirkung bei 16 Stämmen beobachtet, der durchschnittliche Anstieg der depolarisierten Zellen war nach Zugabe von LL-37 jedoch allgemein mit 29,12% niedriger. Der Grad der additiven oder synergistischen Wirkungen von Antibiotika in Kombination mit antimikrobiellen Peptiden war in erster Linie stammspezifisch.
Wurden die Durschnitte von depolarisierten Bakterien mit den verschiedenen Antibiotika/LL-37- oder Antibiotika/HBD3-Kombinationen verglichen, so bestanden keine signifikanten Unterschiede.
Im Gegensatz zu LL-37 und HBD3 zeigten die Peptide HBD1 und HBD2 bei toxigenen und nichttoxigenen Stämmen keine synergistische Wirkung. HD5 zeigte nur mit Meropenem in toxinpositiven Stämmen einen statistisch signifikanten Synergismus (P < 0,01).
Einfluss von Antibiotika und antimikrobiellen Peptiden auf die Toxinproduktion
Wurden die Antibiotika in subinhibitorischer Konzentration getestet, so hemmte keines die Toxinproduktion von toxinogenen Stämmen, und es wurde auch keine Konversion bei den toxinnegativen Stämmen beobachtet. Bei drei toxinogenen Stämmen wurde als Reaktion auf subinhibitorische Konzentrationen an Piperacillin/Tazobactam und Meropenem eine Erhöhung beim nachweisbaren Toxin beobachtet. Dieselben Stämme reagierten ähnlich, wenn nur HBD3 oder LL-37 zugesetzt wurden. Der Zusatz von HBD3 oder LL-37 zu Piperacillin/Tazobactam oder Meropenem erhöhte die Toxinfreisetzung nicht weiter. Bei anderen Stämmen konnten nach Zugabe von Antibiotika oder antimikrobiellen Peptiden keine signifikant erhöhten Toxinmengen gemessen werden. C. difficile-Toxine waren bei allen Stämmen bei Inkubation mit dem alpha-Defensin HNP1 allein nicht im Toxin-ELISA nachweisbar (siehe 4). Dies wurde auch für alle Stämme beobachtet, die mit Moxifloxacin oder Tigecyclin in Kombination mit HNP1 getestet wurden. Bei Behandlung mit Piperacillin/Tazobactam oder Meropenem jedoch konnte die Toxinfreisetzung derjenigen Stämme, die eine Induktion zeigten, nicht durch die applizierte HNP1-Konzentration neutralisiert werden.
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass, kombiniert mit Antibiotika, Defensine oder das Cathelicidin LL-37 zu einem additiven oder synergistischen Effekt führten, mit Meropenem und Moxifloxacin sogar gegen diejenigen C. difficile-Stämme, die am stärksten resistent gegen diese beiden Antibiotika waren. Die erhöhte Bakterienabtötung war für die Kombination von Antibiotika mit dem Defensin HBD3 oder dem Cathelicidin LL-37 am deutlichsten. Wie die elektronenmikroskopischen Untersuchungen mit HBD3 zeigten, kann angenommen werden, dass der Eintritt von Antibiotika in die Bakterienzelle durch die Störung der Membran durch antimikrobielle Peptide unterstützt werden kann. Die beobachtete Wirkung war von der Wirkungsweise der unterschiedlichen Antibiotika und davon, ob die Antibiotika bakterizid oder bakteriostatisch, wie Tigecyclin, wirken, unabhängig.
Mit der vorliegenden Erfindung wurde also gezeigt, dass antimikrobielle Peptide die Abtötung von Bakterien durch Antibiotika, insbesondere gegen C. difficile, erhöhen, und zwar unabhängig von der Wirkungsweise der Antibiotika. Die Kombination von Antibiotika mit antimikrobiellen Peptiden stellt daher einen vielversprechenden neuen Ansatz für die Behandlung von Infektionen, insbesondere C. difficile-Infektionen, dar.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) [0017]
Kent, „Chemical Synthesis of Proteins and Peptides”, (1988) Ann. Rev. Biochem. 57: 957–989 [0018]
Albericio und Martin, „Solid supports for the Synthesis of Peptides”, (2008) Ergänzung zu Chimica Oggi/CHEMISTRY TODAY, 26: 29–34 [0018]
Kibbe A., Handbook of Pharmaceutical Excipients, dritte Ausgabe, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press 2000 [0052]

Claims

Zusammensetzung, die a) mindestens ein natürliches, rekombinantes oder synthetisches menschliches antimikrobielles Peptid oder funktionelle Fragmente des menschlichen antimikrobiellen Peptids sowie b) mindestens ein antibakterielles Agens umfasst, zur Verwendung als Arzneimittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine menschliche antimikrobielle Peptid aus einem menschlichen Defensin oder einem Cathelicidin, funktionellen Fragmenten davon oder Kombinationen von einem oder mehreren davon ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das menschliche Defensin, Cathelicidin und/oder das Fragment davon aus der Gruppe umfassend natürliche, isolierte und aufgereinigte Defensine/Cathelicidine, rekombinante Defensine/Cathelicidine, synthetische Defensine/Cathelicidine, funktionelle Fragmente davon, oder Kombinationen von einem oder mehreren davon ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das menschliche Defensin aus menschlichem beta-Defensin-1, menschlichem beta-Defensin-2, menschlichem beta-Defensin-3, menschlichem alpha-Defensin-5 oder Cathelicidin LL-37, oder Fragmenten davon, oder Kombinationen von einem oder mehreren davon, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das antibakterielle Agens aus Glycylcyclinen, Chinolonen, beta-Lactamantibiotika ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das antibakterielle Agens aus Carbapenemantibiotika, Fluorchinolonen, Penicillinen, insbesondere Ureidopenicillinen, Cephalosporinen (Cephemen), Monobactamen und Carbapenemen, oder Kombinationen von einem oder mehreren davon, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das antibakterielle Agens aus Tigecyclin, Moxifloxacin, Piperacillin/Tazobactam oder Meropenem ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie für die Behandlung von Infektionskrankheiten verwendet wird.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie für die Behandlung von durch anaerobe Mikroorganismen verursachten Infektionskrankheiten verwendet wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie für die Behandlung von durch Clostridium spec. verursachten Infektionskrankheiten verwendet wird.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie für die Behandlung von durch Clostridium difficile verursachten Infektionskrankheiten verwendet wird.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Infektionskrankheit aus intraabdominalen Infektionen, Weichgewebeinfektionen, Magen-Darm-Infektionen, Lungeninfektionen, intrakranialen Infektionen, Krankheiten des Urogenitaltrakts, Krankheiten des weiblichen Reproduktionssystems, Abszessen, Wundinfektionen, Periodontitis und Diarrhö ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Kombination mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger verwendet wird.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 für die Behandlung von Infektionskrankheiten.
Verfahren zum Fördern der Wirksamkeit eines antibakteriellen Agens, umfassend den Schritt, dass man das antibakterielle Agens mit einem natürlichen, rekombinanten oder synthetischen menschlichen antimikrobiellen Peptid kombiniert.
Verwendung eines menschlichen Defensins für die Behandlung von durch Clostridium difficile verursachten Infektionen, wobei das menschliche Defensin aus HBD3, HBD2 und HBD1 ausgewählt ist.