JP2021072781A - マーカー系、特にバキュロウイルス発現サブユニット抗原のためのマーカー系 - Google Patents
マーカー系、特にバキュロウイルス発現サブユニット抗原のためのマーカー系 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021072781A JP2021072781A JP2020211194A JP2020211194A JP2021072781A JP 2021072781 A JP2021072781 A JP 2021072781A JP 2020211194 A JP2020211194 A JP 2020211194A JP 2020211194 A JP2020211194 A JP 2020211194A JP 2021072781 A JP2021072781 A JP 2021072781A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- virus
- protein
- sequence identity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 85
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 85
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 97
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 91
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims abstract description 74
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims abstract description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 52
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 34
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 34
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 129
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 117
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 65
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 51
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 47
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 40
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 37
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 31
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 31
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 20
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 20
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 17
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 14
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 11
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 11
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 11
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 8
- 101100382437 Porcine circovirus 2 Cap gene Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 5
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 claims description 5
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 claims description 5
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 5
- 241000114864 ssRNA viruses Species 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims description 2
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 claims 4
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 claims 2
- 241000190534 Inkoo virus Species 0.000 claims 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 56
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 96
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 42
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 13
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 8
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 5
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 5
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 4
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 4
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 2
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241001393742 Simian endogenous retrovirus Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 2
- HFNQLYDPNAZRCH-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O.OC(O)=O HFNQLYDPNAZRCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001903 high density polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004700 high-density polyethylene Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 2
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 2
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 206010046901 vaginal discharge Diseases 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 241001057184 Axion Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000272470 Circus Species 0.000 description 1
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 1
- 108700001097 Insect Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108700005443 Microbial Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N Norphytane Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000005178 buccal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- OXJUJQDEISSCTB-UHFFFAOYSA-N but-3-en-2-imine Chemical compound CC(=N)C=C OXJUJQDEISSCTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940095399 enema Drugs 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 230000005294 ferromagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000003681 parotid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000004915 pus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 210000003670 sublingual gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001913 submandibular gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20051—Methods of production or purification of viral material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Physiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
Abstract
Description
(技術分野)
本発明は、感染個体とワクチン接種個体との識別を可能にするコンプライアンスマーカー及びマーカーワクチンの分野に属する。特に、本発明は、サブユニット抗原を含むワクチンのためのコンプライアンスマーカー、及びDIVA(感染動物をワクチン接種動物と識別する(Differentiating Infected from Vaccinated Animals))系に関する。前記系は、ある病原体に感染した動物と前記病原体に由来するサブユニット抗原で処置された動物とを識別することを可能にし、ここで前記サブユニット抗原は、培養昆虫細胞で、好ましくは遺伝的に操作されたバキュロウイルスの手段によって発現された抗原である。
ワクチン免疫は、特に多くの食用動物が育成される高密度の閉鎖的環境下にある動物群の健康管理のために必須のツールである。疾患の突発的発生がおそらくワクチン免疫されている動物で生じるとき、当該ワクチンが動物の防御に失敗したのか、又はワクチンが適切にデリバーされたかに関して疑問が生じる。ここで、ワクチンの適切なデリバリーに関する後者の可能性はワクチンコンプライアンスと称される。
動物が適切にワクチン免疫されたかどうかを決定するためのコンプライアンスマーカーの使用はしたがって製造者には大いに所望される。WO 2009/058835 A1は例えば精製キシラナーゼの使用を記載し、前記はブタインフルエンザワクチンにコンプライアンスマーカーとして添加された。バキュロウイルス発現サブユニット抗原を含むワクチンに関しては、バキュロウイルス抗原をコンプライアンスマーカーとして使用することが可能である。しかしながらこの場合、従来用いられている系は陽性を試験する動物に限界があり、さらに大量の抗原が必要とされる(Gerber et al. Res Vet Sci. 95:775-81, 2013;Lehnert. Top Agrar 5: S11-S14, 2011)。
DIVA(感染動物をワクチン接種動物と識別する)ワクチン免疫の戦略には世界的レベルで関心が高まっている。例えば、トリインフルエンザ株H5N1に関するWHO/FAO/OIE合同会議HPAIは、感染の拡散をモニターできるように、全てのワクチン接種はDIVAを用いて実施されることを推奨した。しかしながら、従来のDIVAの方法はスケールアップが困難であり、しばしばワクチン免疫と他の循環ウイルス株による感染との識別に関し問題を有する。
従来のモニタリングの方法は、ワクチン接種動物の物理的なタグ付加、見張り動物の使用、及びウイルス学的検査を含む。しかしながら、これらの従来方法は後方支援的及び経済的理由により多くの制限を有する。
ワクチン接種動物の物理的なタグ付加は、物理的手段(例えば耳タグ、脚バンド又は翼タグ)によるワクチン接種個体の時間を要する個体識別を必要とする。さらにまた、非ワクチン接種見張り動物の使用は後方支援的に及び経済的に困難であり、さらに、見張り動物がウイルスに感染する(例えば家禽がH5N1ウイルスに感染する)場合にはヒトへの拡散のリスクが増大するというリスクもまた存在する。個体のウイルス学的検査(生ウイルスのスクリーニング及び検出又はRT-PCR監視検査による)は非常に高価かつインフラ負担の大きいプロセスであり、前記検査はユニットワクチンには応用可能ではなく個体の現在の状態に関する情報を提供するだけで、当該個体の感染歴及び/又はワクチン接種歴の分析は許容されない。
また本発明は組換えバキュロウイルスを提供する。
さらに、本発明は免疫原性組成物(以下ではまた“本発明の免疫原性組成物”と称される)を提供する。
本発明は、培養昆虫細胞でバキュロウイルス発現系によって生成される組換えタンパク質を含む免疫原性組成物を個体が受容したか否かを決定するキット、特に検査キットも提供する。
負のマーカーワクチンは、病原体の抗原性部分を用いることによって、又は病原体から抗原を除去することによって調製される(前記抗原は感染動物で特異抗体を生じる)。負のマーカーワクチンは通常、サブユニットワクチン又は免疫原性抗原を欠く遺伝的に操作された株を含む弱毒化生ワクチンのどちらかである。負のマーカーワクチンの例は、例えば古典的ブタ熱に対するワクチン免疫のためのサブユニット抗原としてのバキュロウイルス発現古典的ブタ熱ウイルス(CSFV)E2タンパク質の使用である。この場合、ワクチン接種ブタの血清におけるCSFVの他の抗原(例えばERNSタンパク質又はNS3タンパク質)に特異的な抗体の検出はCSFVの感染を示す。
正のマーカーワクチンは、ワクチン接種個体で特異的な抗体を誘発するが感染個体では誘発がない追加の抗原を含む。正のマーカーワクチンアプローチの例はWO 2007/053899 A1に記載された。この場合、不活化H6N2トリインフルエンザ(A1)ウイルス及び破傷風毒素(両者は別々に製造される)がトリのワクチン免疫のために1回の注射で一つにまとめられ、続いて、前記トリから得られた血清で当該トリがワクチン免疫されたことを示すマーカーとして破傷風毒素に特異的な抗体が検出された。
しかしながら、ワクチン抗原及びマーカー抗原の両抗原を別々に製造することは比較的高価であり、さらにまた1つのワクチン免疫剤として両成分を一緒にするために混合工程が要求される(このことはまたワクチン成分/抗原の安定性に付加的な影響を与える可能性がある)。
したがって、特にバキュロウイルス発現抗原を含むサブユニットワクチンで、正のマーカーワクチンを安価に製造するために単純なマーカー系が希求される。
さらにまた、少量のバキュロウイルス発現サブユニット抗原による鋭敏なワクチン免疫識別もまた可能にする、有効なコンプライアンスマーカーが希求される。
したがって、本発明は特許請求の範囲にしたがい種々の態様で実施される。
本発明は、バキュロウイルス発現抗原の製造のためにラブドウイルスに感染しているSf+細胞を使用することは、安価で効率的な正のマーカーワクチンの製造、及び容易かつ製品固有のコンプライアンスマーキング(前記は適切なサブユニットワクチンデリバリーを示す鋭敏な方法を許容する)を可能にするという驚くべき発見に基づく。
第一の特徴では、したがって本発明は、発現系によって(特にバキュロウイルス発現系によって)培養細胞で生成される組換えタンパク質を含む免疫原性組成物(特にワクチン)を個体が受容したか否かを決定する方法を提供し、前記方法は、個体から生物学的サンプルを入手する工程及び、当該個体が、昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであるウイルスに由来する1つ以上の抗原を受容したことを示す1つ以上のマーカーの有無を前記生物学的サンプルで決定する工程を含み、ここで、前記生物学的サンプル中の前記1つ以上のマーカーの存在は、前記個体が前記免疫原性組成物を受容したことを示すか、又は前記生物学的サンプルで前記1つ以上のマーカーが存在しないことは、前記個体が前記免疫原性組成物を受容しなかったことを示す。
本明細書で用いられる“組換えタンパク質”という用語は、特に組換えDNA分子から発現されるタンパク質分子、例えば組換えDNA技術によって生成されるポリペプチドを指す。そのような技術の例には、発現されるタンパク質をコードするDNAが適切な発現ベクター(好ましくはバキュロウイルス発現ベクター)に挿入される事例が含まれる。前記ベクターは続いてトランスフェクトされるか、又はバキュロウイルス発現ベクターの場合には宿主細胞に感染して、当該DNAによってコードされるタンパク質又はポリペプチドを生成する。本明細書で用いられる“組換えタンパク質”という用語はしたがって、特に組換えDNA分子から発現されるタンパク質分子を指す。
また別の例にしたがえば、組換えタンパク質は昆虫細胞で組換え発現プラスミドから発現される。この代替例の場合には、バキュロウイルスは必要ではない。
“ある配列から成る組換えタンパク質”という用語はまた、特に当該ポリペプチドが発現される細胞によって影響を受ける配列の翻訳と同時の及び/又は翻訳後の1つ又は複数の任意の改変に関することはさらに理解される。したがって、本明細書に記載の“ある配列から成る組換えタンパク質”はまた、当該ポリペプチドが発現される細胞によって実行される1つ以上の改変、特にタンパク質の生合成で実行されるアミノ酸残基の改変及び/又はタンパク質プロセッシング(好ましくはグリコシル化、リン酸化及びアセチル化から成る群から選択される)を有する配列を指す。
好ましくは、本発明の組換えタンパク質は、バキュロウイルス発現系によって、特に培養細胞で生成されるか又は入手できる。
本明細書で用いられる“バキュロウイルス発現系”という用語は特に、所望のタンパク質の発現のために設計された組換えバキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞で前記タンパク質を生成するための系を意味する。バキュロウイルス発現系は、一般的には、昆虫細胞で組換えタンパク質発現を達成するために必要な全てのエレメントを含み、さらに典型的には所望のタンパク質の発現のためのバキュロウイルスベクターの操作、操作されたバキュロウイルスベクターの昆虫細胞への導入、所望のタンパク質を発現させる適切な増殖培地での操作バキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞の培養、及び当該タンパク質の回収を必要とする。典型的には、バキュロウイルスベクターの操作は、組換えバキュロウイルスの構築及び単離を必要とし、前記組換えバキュロウイルスでは選択された遺伝子のコード配列は非必須遺伝子のためのプロモーターの後ろに挿入され、ここで現在用いられているバキュロウイルス発現系の大半は、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcMNPV)の配列を土台としている(Virology 202 (2), 586-605, 1994(NCBIアクセッション番号NC_001623))。バキュロウイルス発現系は当業界で周知であり、例えば以下に記載されている:“Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual”, David R. O'Reilly, Lois Miller, Verne Luckow, Oxford Univ. Press刊, 1994;“The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide”, Linda A. King, R. D. Possee, Chapman & Hall刊, 1992。組換えタンパク質の生成のためのバキュロウイルス系の例示的な非限定例は、例えばWO2006/072065A2に記載されている。
本明細書で用いられる“昆虫細胞”はある昆虫種に由来する細胞又は細胞培養を意味する。本発明に関して特に関心のあるものは、スポドプテラ・フルギペルダ種及びトリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)種に由来する昆虫細胞である。
本明細書で用いられる“昆虫細胞に感染できるウイルス”は特に、ウイルス又は少なくともウイルスゲノムが昆虫細胞中に取り込まれる程度に昆虫細胞と相互作用できる構造を当該ウイルス表面に保持するウイルスと理解される。
より具体的には、昆虫細胞の前記感染は、ウイルスの宿主細胞への付着、ウイルスの細胞中への侵入、細胞質内でのビリオンの脱外被、ウイルスゲノムの複製及び転写、ウイルスタンパク質の発現及び新しい感染性ウイルス粒子の放出を含む。
本明細書に記載の“マーカーワクチン”という用語は特に免疫生物で免疫に至るワクチンを指し、前記は実際の病原体によって引き起こされる生物の免疫とは異なる。
“正のマーカーワクチン”は特に、ワクチン接種個体に存在する特異抗体の生成を誘発するが、感染個体では誘発しない付加抗原を含むマーカーワクチンに関する。
本発明の関係で用いられる“マーカー”という用語は、好ましくは“バイオマーカー”という用語と同等であり、特に、個体が、免疫原性組成物(好ましくは正のマーカーワクチン)、又はより具体的には正のマーカーワクチンの付加抗原(ワクチン接種対象動物で見出される特異的抗体の生成を誘発するが、感染対象動物では誘発しない)に暴露されたことを示す測定可能な物質又は化合物を指す。
本明細書で用いられるように“免疫原性組成物”という用語は特に、当該組成物に暴露された個体で免疫応答を引き出す組成物を指す。免疫応答には抗体の誘発及び/又はT細胞
応答の誘発が含まれ得る。当該組成物の意図される機能に応じて、1つ以上の抗原を含むことができる。好ましくは、本明細書に記載の免疫原性組成物はワクチンである。
本明細書で用いられる“ワクチン”という用語は、関連技術にしたがって規定され、個々の疾患に対して個体の免疫を誘発するか又は強化する組成物を指す。この目的のために、ワクチンは、当該病原体に類似する化合物又は前記疾患を惹起する前記病原体の化合物を含む。この化合物との接触に際して、個体の免疫系が始動して当該化合物を外来物質と認識しこれを破壊する。免疫系はその後この化合物との接触を記憶し、したがって当該疾患惹起病原体との以後の接触で、当該病原体の容易かつ効率的な認識及び破壊が担保される。本発明にしたがえば、当該ワクチンは、当業界で公知のワクチンの任意の処方であり得る。前記処方は、例えば筋肉内注射用ワクチン、粘膜ワクチン、又は皮下注射若しくは皮内注射用ワクチンの他に吸入用ワクチン(例えばエーロゾル)である。そのようなワクチン処方物は当業界で周知であり、例えば以下に記載されている:Neutra MR et al. 2006 Mucosal vaccines: the promise and the challenge 6(2): 148-58;又はF.P. Nijkamp, Michael J. Parnham 2011; Principles of Immunopharmacology ISBN-13: 978-3034601351。
好ましくは、生物学的サンプルは、当該個体にワクチンを接種した日から又はワクチンを接種したと思われる日からそれぞれ少なくとも14日、もっとも好ましくは14から35日後に前記個体から入手される。
好ましくは、本明細書に言う昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ(Sf)細胞又はスポドプテラ・フルギペルダに由来する細胞株の細胞、より好ましくはSf9細胞及びSf+細胞から成る群から選択される。本明細書に言う昆虫細胞は、それぞれ好ましくはスポドプテラ・フルギペルダ(Sf)細胞又はスポドプテラ・フルギペルダに由来する細胞株の細胞、より好ましくはSf9細胞及びSf+細胞から成る群から選択される。
本明細書に言う、昆虫細胞に感染できるRNAウイルス由来の1つ以上の抗原を個体が受容したことを示す1つ以上のマーカー(以下ではまた“本発明の1つ以上のマーカー”と呼ばれる)は、好ましくは以下から成る群から選択される1つ以上のマーカーである:昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであるウイルスに由来する1つ以上の抗原に特異的な抗体;昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであるウイルスに由来する1つ以上の抗原;及び昆虫細胞に感染できるRNAに特異的な1つ以上の核酸分子。
もっとも好ましくは、本発明の1つ以上のマーカーは、昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであるウイルスに由来する抗原に特異的な抗体である。
好ましくは、本明細書に記載の抗体はポリクローナル抗体である。
本明細書に言う、昆虫細胞に感染できるRNAウイルス由来の1つ以上の抗原(以下ではまた“本発明の1つ以上の抗原”と称される)は、好ましくは配列番号:1の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有する配列を含むか又はこれらのいずれかから成るタンパク質;及び/又は配列番号:7の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有する配列を含むか又はこれらのいずれかから成るタンパク質である。
本発明の関係で言う“少なくとも90%”という用語に関して、前記用語は、好ましくは“少なくとも91%”、より好ましくは“少なくとも92%”、さらに好ましくは“少なくとも93%”、又は特に“少なくとも94%”に対応することは理解されるであろう。
本発明の関係で言う“少なくとも95%”という用語に関して、前記用語は、好ましくは“少なくとも96%”、より好ましくは“少なくとも97%”、さらに好ましくは“少なくとも98%”、又は特に“少なくとも99%”に対応することは理解されるであろう。
本明細書で用いられる“100%配列同一性を有する”という用語は、“同一である”という用語と同等であると理解される。
本明細書で用いられるように、“抗原”という用語は特に、免疫応答を引き起こすことができる任意の分子、部分又は実在物を指す。免疫応答には細胞性及び/又は液性免疫応答が含まれる。
本明細書で用いられるように、“配列番号:Xの配列と配列同一性”という用語は、“配列番号:Xの当該長にわたる配列番号:Xの配列と配列同一性”という用語、又は“配列番号:Xの全長にわたる配列番号:Xの配列と配列同一性”という用語とそれぞれ同等であることは特に理解される。この関係では、“X”は、“配列番号:X”が本明細書に記載の配列番号のいずれかを表すように、1から24から選択される任意の整数である。
好ましくは、本発明の方法は、生物学的サンプルを固体支持体に固定された捕捉試薬と接触させる工程(当該固定捕捉試薬は本発明の1つ以上のマーカーと結合できる);及び当該捕捉試薬と結合する前記1つ以上のマーカーの有無を決定する工程(ここで当該捕捉試薬と結合する前記1つ以上のマーカーの存在は、前記生物学的サンプル中の前記1つ以上のマーカーの存在を示す)を含む。
本明細書で用いられる“捕捉試薬”という用語は特に、マーカーと結合できる分子又は多重分子複合体を指す。捕捉試薬は、実質的に特異的な態様で(好ましくは105M-1を超える又は好ましくは106M-1を超える親和性又はKaで)マーカーと結合できる。捕捉試薬は、場合によって天然に存在する生物分子、組換え生物分子又は合成生物分子であり得る。タンパク質及び核酸リガンド(アプタマー)は捕捉試薬として非常に適切である。ウイルス体全体若しくはウイルスフラグメント又は合成ペプチドは抗体と結合できるので、前記もまた好ましい捕捉試薬として機能し得る。
本明細書に言う、固体支持体に固定される捕捉試薬及び本発明の1つ以上のマーカーに結合できる捕捉試薬(以下ではまた“本発明の捕捉試薬”と称される)は、好ましくは以下から成る群から選択される:配列番号:1から6のいずれか1つの配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれらの配列のいずれかから成るタンパク質;配列番号:7又は配列番号:8の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、特に100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はこれらのアミノ酸配列のいずれかから成るタンパク質;昆虫細胞に感染できるRNAウイルス(前記ウイルスは場合によって不活化されてある);配列番号:9の配列に特徴的な配列と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド;及び配列番号:15の配列に特徴的な配列と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド。
本明細書に記載の“特異的ハイブリダイゼーション”という用語は特にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに関する。前記ハイブリダイゼーション条件は、例えば以下の文献に記載された通常的なプロトコルにしたがって確立することができる:Sambrook, “Molecular Cloning, A Laboratory Handbook”, 2nd edition, 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor, N. Y.;Ausubel,“Current Protocols in Molecular Biology”, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989;又はHiggins and Hames (eds) “Nucleic acid hybridization, a practical approach” IRL Press Oxford, Washington DC, 1985。特異的ハイブリダイゼーション条件の例は、4xSSC及び0.1%のSDS中で65℃のハイブリダイゼーションとその後に続く0.1xSSC及び0.1%のSDS中で65℃の洗浄である。また別には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば42℃での50%ホルムアミド、4xSSCである。
“チップ”は固体の無孔性材料であり、例えば金属、ガラス又はプラスチックである。前記材料は場合によって完全に又は一定の領域を被覆することができる。前記材料の表面に、任意のスポットアレーが目視できるように又は格子状に存在する。各スポットに所定のポリペプチドを(当該材料の表面に対しリンカー又はスペーサーを用いて又は用いないで)固定できる。
配列表の全てのヌクレオチド配列は5’−3’方向で示されている。配列番号:9及び配列番号:15の配列は正の極性を有するcDNA(+鎖)をコードする。“逆相補性”という用語は、配列が参照配列に対してアンチパラレルであることを意味する。
本発明のRNAウイルスは、昆虫細胞で少なくとも2週間以上、好ましくは少なくとも3週間複製できる。
a.当該生物学的サンプルを固体支持体に固定された捕捉試薬と接触させる工程であって、当該捕捉試薬が、配列番号:1から6のいずれか1つの配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有する配列、又は配列番号:7若しくは配列番号:8の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有する配列を含むか又は前記配列のいずれかから成るタンパク質;配列番号:1の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は前記配列のいずれかから成るタンパク質を含む、及び/又は配列番号:7の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は前記配列のいずれかから成るタンパク質を含む、不活化されていてもよいウイルス;配列番号:1の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列のいずれかから成るタンパク質、及び/又は配列番号:7の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有する配列を含むか又は前記配列のいずれかから成るタンパク質、をコードする核酸分子をそのゲノム中に含むウイルスであって、不活化されていてもよいウイルス;配列番号:9の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列、及び/又は配列番号:15の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列、を含むRNA分子をそのゲノム中に含むウイルスであって、前記ウイルスが不活化されていてもよいウイルスから成る群から選択される、前記工程;
b.当該生物学的サンプルを当該固定捕捉試薬から分離する工程;
c.当該固定捕捉試薬-抗体複合体を、当該試薬-抗体複合体の抗体に結合する検出可能な薬剤と接触させる工程;及び
d.当該検出可能な薬剤のための検出手段を用いて、当該捕捉試薬に結合した抗体のレベルを測定する工程、ここで前記測定工程(d)は、当該捕捉試薬に結合した抗体のレベルを決定するために好ましくはさらに標準曲線との比較を含む。
本明細書に記載の捕捉試薬は、好ましくはバキュロウイルス発現タンパク質であり、前記バキュロウイルス発現タンパク質は、好ましくは本発明のバキュロウイルス(前記は本明細書の下記に記載される)によって発現される。
本発明の別の好ましい特徴にしたがえば、本発明の1つ以上のマーカーはまた、本発明のRNAウイルスに特異的な1つ以上のT細胞及び/又は本発明のRNAウイルスに特異的な1つ以上のB細胞、及び/又は前記は本発明の1つ以上の抗原を提示する抗原提示細胞である。前記1つ以上のB細胞及び/又は前記1つ以上のT細胞及び/又は前記1つ以上の抗原提示細胞の有無は、好ましくはフローサイトメトリー分析の手段によって決定され、特に本発明の1つ以上の蛍光標識抗原が、前記1つ以上のB細胞及び/又は前記1つ以上のT細胞の標識に用いられ、及び/又は本発明のRNAウイルスに特異的な蛍光標識抗体が前記1つ以上の抗原提示細胞の標識に用いられる。
本明細書に言う、培養昆虫細胞で発現系によって生成される組換えタンパク質(以下ではまた“本発明の組換えタンパク質”と称される)は、好ましくはPCV2 ORF2タンパク質であり、前記PCV2 ORF2タンパク質は、特に、配列番号:23の配列と少なくとも90%、好ましくは少なくとも91%、より好ましくは少なくとも92%、さらに好ましくは少なくとも93%、又は特に少なくとも94%、又は少なくとも95%配列同一性を有するタンパク質である。
別の好ましい特徴にしたがえば、本発明の組換えタンパク質はインフルエンザヘマグルチニン、特にトリインフルエンザヘマグルチニンであり、ここで前記トリインフルエンザヘマグルチニンは、好ましくはH5N1ウイルスのH5タンパク質であり、ここで前記H5N1ウイルスのH5タンパク質は、より好ましくは配列番号:24の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列のいずれかから成るタンパク質である。
本発明の方法の関係では、免疫原性組成物は好ましくは下記に記載する免疫原性組成物である。
本明細書で用いられる“生物学的サンプル”という用語は、個体(例えばブタ又はトリ)から採取される任意のサンプルを指し、細胞含有体液、末梢血、血漿又は血清、唾液、組織ホモジネート、肺及び他の器官の吸引物、並びに洗浄液及び浣腸溶液、並びに人間又は動物から入手できる他の供給源が含まれるが、これらに限定されない。例えば、“生物学的サンプル”の例には、血液、細胞、糞便、下痢、乳、粘液、痰、膿、唾液、精液、汗、涙液、尿、涙液、眼液、膣分泌物及び吐物(当該動物で存在する場合)が含まれる。
本明細書で言及する生物学的サンプルは、哺乳動物又はトリ(好ましくはブタ又はニワトリ(Gallus gallus domesticus))から単離されてあり、及び/又は特に全血、血漿、血清、尿、及び口腔液から成る群から選択される。本明細書では、“serum(漿液、血清)”という用語は“blood serum(血清)”と同義であることを意味する。
本明細書で用いられる“口腔液”という用語は、特に個々に又は組み合わされて口腔で見出される1つ以上の液体を指す。これらには唾液及び粘膜漏出物が含まれる(ただし前記に限定されない)。口腔液は特に多数の供給源(例えば耳下腺、顎下腺、舌下腺、付属腺、歯肉粘膜、頬粘膜)に由来する液体の組合せを含むことができることは理解され、“口腔液”という用語は、これら供給源の各々に由来する個々の又は組み合わされた液体を含む。“唾液”という用語は、口腔液の組合せ(例えば典型的には口内で特に咀嚼後に見出される)を指す。本明細書で用いられる“粘膜漏出物”という用語は、漿液成分の口腔粘膜間質から口腔中への受動的拡散によって生じる液体を指す。粘膜漏出物はしばしば唾液の一成分を形成する。
本明細書に記載する固定捕捉試薬は、好ましくはマイクロタイタープレートに、特にELISAリーダーによって読み取ることができるマイクロタイタープレートに被覆される。
本発明はベクター、特に導入ベクターを提供し、前記は、配列番号:1から6のいずれか1つの配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列のいずれかから成るタンパク質、及び/又は配列番号:7若しくは配列番号:8の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列のいずれかから成るタンパク質、をコードするDNA配列を含むか;及び/又は前記は、配列番号:9から14のいずれか1つの配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有するDNA配列、及び/又は配列番号:15若しくは配列番号:16の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有するDNA配列を含む。
本発明の関係で導入ベクターは好ましくは“バキュロウイルス導入ベクター”である。
“導入ベクター”という用語は当該技術分野で承知され、第二の核酸が連結されてある第一の核酸を指し、例えばプラスミド、コスミド又はファージが含まれる。
ある種の導入ベクターは転写又は翻訳を制御する調節エレメントを含むことができ、前記エレメントは、一般的には哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫の遺伝子に由来し得る。宿主中で複製する能力は通常複製起点によって付与され、形質転換体の識別を容易にする選別遺伝子を付加的に取り込ませることができる。
ウイルスに由来する導入ベクター(“ウイルスベクター”と称することができる)を本発明のある種の実施態様で用いることができる。いくつかの例には、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスなどが含まれる。ウイルスベクター(特にバキュロウイルスベクター、例えばバキュロウイルス導入ベクター)が、本発明にしたがえば特に好ましい。発現ベクターに関しては、ウイルスベクターは調節エレメントを含むことができる。
いずれの導入ベクターの設計も、形質転換されるべき宿主及び/又は発現を所望されるタンパク質のタイプの選択のような要件に左右され得る。さらにまた、ベクターのコピー数、ベクターによってコードされる任意の他のタンパク質(例えば抗生物質マーカー(例えばアンピシリン))のコピー数及び発現を制御する能力もまた斟酌することができる。
本明細書で用いられる“不活化された”という用語は、哺乳動物宿主に投与されたときに当該抗原が疾患を惹起しないこと、又は宿主細胞で複製しないことを意味する。
多様な物理的及び化学的不活化方法が当業界で公知である。“不活化された”という用語は、以前に病毒性又は非病毒性のウイルスが、照射され(紫外線(UV)、X-線、電子ビーム又はガンマ照射)、加熱され、又は化学的に処理されて、不活化し死滅するが、一方、その免疫原性を維持することを指す。ある実施態様では、本明細書に開示する不活化ウイルスは不活化剤で処理することによって不活化される。適切な不活化剤には、ベータ-プロピオラクトン、バイナリエチレンイミン又はベータ-エチレンイミン又はアセチル-エチレンイミン、グルタルアルデヒド、オゾン、及びホルマリン(ホルムアルデヒド)が含まれる。
ホルマリン又はホルムアルデヒドによる不活化のためには、ホルムアルデヒドは典型的には水及びメチルアルコールと混合されてホルマリンを生じる。メチルアルコールの添加は、不活化プロセス時の分解又は架橋を防止する。
より具体的には、“不活化された”という用語は、ウイルスがin vivo又はin vitroで複製不能であることを意味する。例えば、“不活化された”という用語は、in vitroで増殖していたウイルスが、化学的又は物理的手段を用いてもはや複製できないように脱活性化されてあるウイルスを指すことができる。
好ましくは、不活化されてある本発明のウイルスは、バイナリエチレンイミン(BEI)で不活化されたウイルスである。
さらに別の特徴にしたがえば、本発明は、培養昆虫細胞でバキュロウイルス発現系によって生成される組換えタンパク質を含む免疫原性組成物を個体が受容したか否かを決定するキット、特に検査キットを提供する。前記キットは、固体支持体に固定された1つ以上の捕捉試薬を含み、当該1つ以上の固定捕捉試薬は、本発明の1つ以上の抗原に特異的な抗体、本発明のRNAウイルスに由来する1つ以上の抗原、及び本発明の1つ以上の核酸分子から成る群から選択される1つ以上のマーカーと結合することができ、さらに前記1つ以上の捕捉試薬は、好ましくは以下から成る群から選択される:配列番号:1から6のいずれか1つの配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、又は特に100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列のいずれかから成るタンパク質;配列番号:7又は配列番号:8の配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、特に100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列のいずれかから成るタンパク質;昆虫細胞に感染できるRNAウイルス(前記ウイルスは場合によって不活化されてある);配列番号:9の配列に特徴的な配列と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド;及び配列番号:15の配列に特徴的な配列と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド。
さらにまた、本発明はプライマー又はプライマー対を提供し、それぞれ配列番号:17から22のいずれか1つの配列と少なくとも90%、又は好ましくは少なくとも95%配列同一性を有する配列から成る群から選択される。
i)RNAウイルス、好ましくは本発明のRNAウイルスに感染した昆虫細胞の培養物から上清を入手する工程であって、前記上清が当該RNAウイルスのウイルス粒子及び/又はウイルス様粒子を含み、前記昆虫細胞は、好ましくはバキュロウイルスに感染されていないか、及び/又は好ましくはプラスミドでトランスフェクトされていない、前記工程;
ii)細胞デブリを前記ウイルス粒子及び/又はウイルス様粒子から、少なくとも1枚のフィルター、好ましくは2枚のフィルターによる微小ろ過を含む分離工程を介して分離する工程であって、当該少なくとも1枚のフィルターが、好ましくは前記ウイルス粒子及び/又はウイルス様粒子よりも大きな孔サイズ、特に約0.1μmから約4μm、好ましくは約0.2μmから約2μmの孔サイズを有する、前記分離工程、及びろ液を収集する工程;
iii)及び場合によって、前記ウイルス粒子及び/又はウイルス様粒子を含むii)のろ液をサイズ排除クロマトグラフィーに付す工程であって、好ましくは当該溶離液中のタンパク質の存在が260nm又は280nmで溶離液の光の吸収(A260又はA280)を測定することによって測定され、最初のA260又はA280のピークを示す溶離液が収集される、前記工程。
さらにまた、本発明は前記捕捉試薬を含む組成物を提供し、ここで前記組成物は前記方法によって入手される。
本明細書に記載するサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)では、分子は不活性な多孔性媒体(特に不活性なゲル媒体)の充填床のサイズにしたがって分離される。前記媒体は、好ましくは架橋多糖類、例えば架橋アガロース及びデキストランの球状ビーズ形の合成物である。膨潤ゲルビーズの最大孔より大きな分子はゲルビーズ中には入らず、したがってクロマトグラフィー床を通り抜けて最も速く移動する。より小さな分子では(それらのサイズ及び形状に応じて様々な程度でゲルビーズに進入する)、床の通過は遅くなる。分子はしたがって、一般的には分子サイズの減少順に溶出される。本明細書に記載のサイズ排除クロマトグラフィーに適切な媒体を含むSECカラムは、好ましくはHiPrep 26/60 Sephacryl S300HRカラム(GE Healthcare Bio-Sciences)である。
最初のA260又はA280のピークを示す溶離液は、ii)のろ液に含まれる最大のタンパク質構造物を含むii)のろ液の画分であることは特に理解される。したがって、最初のA260又はA280のピークを示す溶離液は、当該ii)のろ液に含まれるウイルス粒子及び/又はウイルス様粒子の大半を含む溶離液又はその部分である。
実施例
以下の実施例は本発明を例証することのみを意図する。それらは如何なる態様でも特許請求の範囲を制限しない。
SF+及びSf9細胞のラブドウイルス(以下ではまたSfRV又はSFRV(Sf細胞ラブドウイルス)と称する)による感染を確認するために、固有の5’及び3’制限部位を挿入する目的でSFRV G及びN遺伝子の増幅ためのプライマーを設計した。加えて、3’末端プライマーはタバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ切断部位とその後に続く6Xヒスチジンタグを付加するために設計した。前記操作は、Hisタグを用いて発現タンパク質をニッケルカラムで精製し、続いてTEVプロテアーゼを用いてHisタグを切断して自然のままのG又はNタンパク質の生成を可能にするために実施された。
G遺伝子構築物(配列番号:1の配列を含む)のために用いられるプライマーの配列は配列番号:17及び18に示す配列であり、G遺伝子構築のための核酸の配列は配列番号:12に提供され、G遺伝子構築物のためのアミノ酸配列は配列番号:4の配列である。
N遺伝子構築物(配列番号:7の配列を含む)のために用いられるプライマーの配列は配列番号:21及び22に示す配列であり、N遺伝子構築のための核酸の配列は配列番号:16に提供され、N遺伝子構築物のためのアミノ酸配列は配列番号:8の配列である。
さらにまた、SFRV G糖タンパク質のトランスメンブレンドメイン及び細胞内ドメインは、TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)(前記は下記に記載されている:K. Hofmann & W. Stoffel (1993)TMbase - A database of membrane spanning proteins segments, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374,166)、TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)(前記TMHMMは隠れマルコフモデル(Moller S1, Croning MD, Apweiler R., Evaluation of methods for the prediction of membrane spanning regions, Bioinformatics (2001) 17 (7): 646-653)を用いる)、及びSOSUI (http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/)を用いて予測した。TMpred及びTMHMMの結果に基づいて、SERV G配列はアミノ酸550で終了させ、TEV切断部位、6X Hisタグ及びPstI部位を付加した。
そのようなG構築物(配列番号:2の配列を含む)のために有用なプライマーの配列は配列番号:17及び19に示す配列であり、当該G遺伝子構築物のための核酸の配列は配列番号:13に提供され、当該G遺伝子構築物のためのアミノ酸配列は配列番号:5の配列である。
GenBank(アクセッション番号KF947078)に寄託されたMAら(J Virol. 88: 6576-6585, 2014)のSFRVの全ゲノム配列をプライマー設計のための基礎として用いた。同様に、TEV切断部位のために、利用可能な公表情報に基づいて配列ENLYFQGを用いた。
Sf9(付着性細胞)及びSf+細胞(浮遊細胞)の増殖で用いた使用済み培地からSFRVを精製した。すなわち、SFRVを感染させ通常的に増殖させたSf9及びSf+細胞から使用済み培地を収集し、0.2ミクロンフィルターでろ過して細胞デブリを除去した。続いてろ液をNaCl-Tris HCl-EDTA(NTE)緩衝液(pH7.4)中の30%ショ糖クッションにロードし、3時間4℃で32,000rpmの超遠心分離に付した。注意深く上清を吸引し、ペレットを再水和してTNE緩衝液に再懸濁した。総タンパク質含有量をナノドロップマシーンで測定し、アリコットにロット番号を割りあて、更なる使用まで-70℃より下で凍結した。この抗原調製物は、下記に記載するELISAプレート被覆のための半精製ウイルスを含んでいた。
使用済みSF9培地をSFRVウイルスRNA抽出の供給源として用いた。QIAampウイルスRNA抽出キット(Qiagen)を製造業者の指示にしたがって用いた。
G及びN遺伝子を増幅するために、一工程スーパースクリプト(Superscript)IIIキットを製造業者の指示にしたがって用いた。グラジエントRT-PCRを以下の条件で用いた:60℃で30分の1サイクル(RT工程)、続いて94℃で2分の1サイクル。前記の後に94℃で15秒の40サイクル、75℃−50℃で60秒のアニーリンググラジエント、続いて68℃で2分の伸長。最後に、反応を68℃で5分の単一サイクル及び4℃の無制限保持に付した。
増幅生成物をゲルで泳動しサイズを検証した。予想サイズのゲルバンドをゲルから切り出し、Qiaquickゲル抽出キットを製造業者の指示にしたがって用いて精製した(図1)。
以下では、G遺伝子(配列番号:1の配列を含む)を用いる更なる作業のみが記載される。
連結生成物を用いて大腸菌(E. coli)細胞(ワンショットマックスエフィシェンシーDH5aケミカルコンピテントセル(Invitrogen))を形質転換し、アンピシリンを含むLB寒天に細胞をプレートした。次の日にコロニーを採取し、コロニーPCRを用いてプラスミドの取り込みについてスクリーニングしクローン番号を割り当てた。
コロニーPCRの反応条件は以下のとおりであった:98℃で3分の1サイクル、続いて98℃で30秒の変性、58℃で30秒のアニーリング及び72℃で2分の伸長の34サイクル。前記の工程の後に72℃で10分の最終伸長工程及び4℃の最終保持が続いた。
PCR生成物をアガロースゲルで泳動し、プラスミドを含むクローンを同定した(図3参照)。
続いて陽性クローンをLB-アンピシリンブロスで増殖させ、Qiaprepミニプレッププラスミド精製キット(Qiagen)を製造業者の指示にしたがって用いプラスミドを培養から精製した。このようにして作製した導入ベクターはSFRV G遺伝子構築物を含み、アリコットに分割してロット番号を割り当てた。
SFRV G遺伝子構築物を発現する組換えバキュロウイルスを作製するために、当該導入ベクターを線状化flashBAC ULTRAバキュロウイルス骨格DNA(Genway biotech)と一緒にSf9細胞にESCORTトランスフェクション試薬(SAFC)を用いてコトランスフェクトした。1週間後、トランスフェクション由来の上清(pO)を新しいSf9細胞に接種して、生成された一切の組換えバキュロウイルスを増幅させた。
トランスフェクション由来の細胞ペレットを収集してSDSゲルで泳動し、ウェスタンブロットのためにニトロセルロース膜に移した。タンパク質を抗His抗体(Invitrogen)でプローブした。予想されたタンパク質サイズは約71.5KDaである。ゲル(図4)は、62KDaマーカー点とその上に2つの接近したバンドを5つの被検クローン(2、5、7、10及び11)全てについて示すが、細胞コントロール(cc)レーンではバンドは存在しない。
組換えウイルスのクローン2及び5をさらに継代し、スピンナーフラスコで増殖させ、Sf+浮遊培養でタンパク質を大量生産した。上清、可溶性及び不溶性細胞画分を当該タンパク質について探索した。この時点で、タンパク質は不溶性画分にのみ存在した(図5)。結果として、SFRV G糖タンパク質のC-末端切詰め形態がELISAアッセイで使用される次の工程として生成される。
ELISAを開発して、SFRV感染Sf細胞で発現されたPCV2又は他のサブユニットワクチンバキュロウイルスをワクチン接種した動物のSFRVに対する抗体応答の存在を評価した。略記すれば、Sf9又はSf+細胞上清に由来する半精製SFRV抗原(上記に記載)の250ng/ウェルでELISAプレートを被覆した。
−被覆は、抗原を炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.0)で希釈し最終濃度250ng/ウェルを得ることによって実施した。被覆は4℃で一晩実施した。
−次の日にプレートをPBS-Tween(PBST)で洗浄し、10%乳により1時間室温でブロックした。
−PCV2サブユニット抗原、SFRV感染Sf細胞発現バキュロウイルスでワクチン免疫した動物に由来する1:100希釈血清、又は非ワクチン接種コントロールを用いてプレートをプローブした(データセクション参照)。
−プレートを37℃で1時間インキュベートし、続いてPBSTで5回洗浄して未結合抗体を除去した。
−続いて1:10,000希釈の二次抗体(ヤギ抗ブタIgG H+L-HRP複合物(Bethyl laboratories))でプレートをプローブし、37℃で1時間インキュベートし、続いてPBSTで5回洗浄して未結合抗体を除去した。
−最後に、SureBlue TMB基質(KPL)を添加し、プレートを室温で5分間インキュベートし、続いてTMB停止溶液(KPL)で停止させた。
−続いてプレートを450nmで読み取った。
ELISAプレートのセットアップ:
−a行、ウェル1−10はSf9由来SFRVで被覆。
−b行、ウェル1−10はSf+由来SFRVで被覆。
−ブタ血清を二組で評価し、PCV2(A、B)サブユニット抗原でワクチン免疫した動物が下線で示される。これらは、当該動物がワクチン接種によりSFRVに邂逅しSFRVに対する抗体を生成した場合に陽性の読取りを示す。
−陰性コントロールは点線の下線で示される(C及びD)。
−9及び10列は緩衝液コントロールである(一次抗体無し)。
ELISAの結果は表1に示される。
データの解釈:
−ELISAの出力に基づけば、PCV2サブユニット抗原でワクチン免疫された動物(A及びBグループ)は半精製SFRVに対して良好な免疫を示す。
−陰性コントロール動物(C及びDグループ)は半精製SFRVに対して反応を示さない。
−これらの結果は固有のコンプライアンスマーキング及びDIVAアプローチのためにSFRVの有用性を示す。
SCOPE:SFRV抗原に対する抗体の存在についての試験血清(又は口腔液)サンプル
材料と方法
A.器具
−ELISA洗浄器
−ELISAリーダー
−細胞培養用WFI、USP(Gibco、カタログ番号A12873-02)
−炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.6)錠剤(Sigma、カタログ番号C3041-100CAP)
−96ウェルのイムノプレート(丸底又は平底プレート、Nunc Maxisorb)
−12チャンネルピペッター、1μLから1mLの容量を有する雑多なピペッター
−ピペットチップ
−37℃インキュベーター
−4℃冷蔵庫
−ボルテクサー
−プレート蓋(Thermo、カタログ番号AB-0752)
−s-ブロック2mL希釈ブロック(Phenix、カタログ番号M-1810S又は同等なもの)
−試薬槽
−タイマー
B.試薬
1.被覆緩衝液:炭酸-重炭酸緩衝液
−100mLのWFI
−1カプセルの炭酸-重炭酸緩衝液
−カプセルを開封して散剤をWFIに入れ溶解するまで混合
−0.2μmのフィルターを用いて溶液をろ過滅菌
−4℃で保存
−期限:1週間
−1アッセイ(4プレート)につき必要量:50mL
2.10X PBS
−1包みのPBS濃縮物(Fisher BP665-1)
−適量のGenPur H2O(又は同等なもの)で1Lにする
−室温で保存
−期限:1年
3.洗浄緩衝溶液:ダルベッコ(Dulbeccos)PBSに0.05%のTween20
−0.5mLのTween20(Fisher BP337又は同等なもの)
−100mLの10X D-PBS(pH7.4)
−適量のGenPur H2O(又は同等なもの)で1Lにする
−pHを7.2±0.1にする
−室温で保存
−期限:6カ月
−1アッセイ(4プレート)につき必要量:2L
4.PBST
−500mLの1X PBS(pH7.4)(Gibco、カタログ番号10010-023)
−0.3mLのTween20(Fisher BP337又は同等なもの)
−室温で保存
−期限:6カ月
−1アッセイ(4プレート)につき必要量:100mL
5.ブロック溶液:PBS溶液に10%脱脂粉乳
−20gのブロッティング級ブロック(Bio-Rad 170-6404、又は同等なもの)
−200mLのPBST
−4℃で保存
−期限:0日
−1アッセイ(4プレート)につき必要量:200mL
6.SFRV抗原
−非感染SF又はSF+細胞培養上清を0.2ミクロンフィルター(Thermo cat 456-0020)でろ過する。この関係では、“非感染SF又はSF+細胞培養上清”は培養中のSF又はSF+細胞(はバキュロウイルスに感染されていないが、SFRVに感染されている)の上清を意味する。
さらにまた、本開示に記載の細胞の関係では、“SF”という用語は“Sf”という用語と同等であり、“SF+”という用語は“Sf+”という用語と等価であり、“SF9”という用語は
“Sf9”という用語とそれぞれ等価である。
−ろ液を30%ショ糖クッションにロードし、28,000−34,000rpmで、2−4時間4℃で遠心分離した。
−遠心分離後、上清を注意深く吸引し、ペレットをNaCl-Tris-EDTA緩衝液(pH7.4)に懸濁する。
−前記は半精製抗原である。
−タンパク質濃度を分光光度計により概算し、タンパク質をアリコットに分割し、使用まで-70℃で凍結した。
7.二次抗体:ヤギ抗ブタIgG h+l HRP複合物(Bethyl Labs Cat. No. A100-105P)、4℃±3.0℃で保存
8.基質:SureBlue TMB 1-成分マイクロウェルペルオキシダーゼ基質(Kirkgaard and Perry Laboratories Cat No. 52-00-01又は同等なもの)。基質は4℃±3.0℃で保存、25℃±2.0℃で予備インキュベーション、25℃±3.0℃で使用。
9.停止溶液:TMB停止溶液(Kirkgaard and Perry Laboratories Cat No. 50-85-04又は同等なもの)。室温で保存。
C.手順
1.上記B1に列挙したレシピを用いて被覆緩衝液を調製する。
2.SFRV抗原を被覆緩衝液で250ng/ウェルに希釈する。10回抗原を逆さにすることによって混合する。250ng/100μL(すなわち2.5μg/mL=250ng/ウェル)で被覆する。
3.希釈したSFRV抗原の100μLを全ウェルに添加する。
4.試験プレートをプレート蓋で閉じ、一晩4℃でインキュベートし、冷蔵庫の一番下に置いて動揺を最小限にする。
次の日
5.目下のアッセイのためにのみ十分なブロック溶液を調製する。4プレートには200mLブロックが推奨される。必要になるまで4℃で保存する。
6.ウルトラウォッシュプラスマイクロタイタープレート洗浄器又は同等なもので、試験プレートを5回洗浄緩衝液で洗浄する。
7.100μLのブロック溶液を試験プレートの全ウェルに加える。試験プレートに蓋をして、37℃±2.0℃で1時間インキュベートする。
8.ブロックインキュベーションの間、s-ブロック中のブロックで試験サンプルを1:100に希釈する。口腔液については、ブロック中でサンプルを1:2に希釈する。各サンプルを個々に試験する。陽性及び陰性コントロールを同じ態様で希釈する。
9.試験プレートを9回洗浄する。最後の洗浄後、ペーパータオル上で軽くプレートを叩く。
10.予め希釈した試験サンプルを対応するプレートの各ウェルに100μL添加する。ピペットチップがウェルに接触しないようにする。試験サンプル毎にチップを交換する。試験プレートに蓋をし、血清サンプルについては37℃±2.0℃で1時間インキュベートする。口腔液については4℃±2.0℃で16.0時間インキュベートする。
11.試験プレートの洗浄直前に、二次抗体バイアルを冷蔵庫から取り出し、ブロック中で1:10,000に希釈する。連続希釈を実施して1:10,000希釈を達成することが推奨される(4希釈物)。10回逆さまにして希釈抗体を混合する。
12.試験プレートを5回洗浄する。
13.100μLの希釈検出抗体を試験プレートの全ウェルに添加する。試験プレートに蓋をし、37℃±2.0℃で1.0時間インキュベートする。
14.直ちにSureBlue TMB 1-成分マイクロウェルペルオキシダーゼ基質を冷蔵庫(4℃±3℃)から取り出し、適切な体積を褐色又は不透明の高密度ポリエチレン(HDPE)容器に移し、25℃±2.0℃で1時間±15分間インキュベートする(ベンチトップ)。
15.試験プレートを5回洗浄する。最後の洗浄後、ペーパータオル上で軽くプレートを叩く。プレートを洗浄している間にプレートリーダーの電源を入れることを推奨する。
16.試験プレートの全ウェルに100μLの基質を添加する。
17.25℃±3℃で5分間インキュベートする。
18.100μLの停止溶液を全ウェルに添加して反応を停止させる。
19.450nmで吸収を測定する。
D.受け入れ基準/結果
−陽性コントロール:SFRV/SRFV G糖タンパク質で高免疫されたブタ由来の血清(又は対応する口腔液)
−ナイーブブタ血清(又は対応する口腔液)、又はSFRV抗原に対して無視し得るか若しくは反応しない非ワクチン接種ブタに由来する血清(又は対応する口腔液)
半精製ラブドウイルスの作製:
カラムにロードする前に、以下のように半精製ラブドウイルスを作製した:中空線維を用いて5リットルから800mLに濃縮したSfRV感染Sf+昆虫細胞の細胞培養上清(40mL)を1.2μmのシリンジフィルターでろ過した。得られたろ液が、本実施例の“半精製ラブドウイルス”である。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC):
HiPrep26/60セファクリルS300HRカラム(GE Healthcare Bio-Sciences)搭載AKTAエクスプロアーで定組成条件を用い1mL/分の流速で、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した。カラムは、1.5カラム体積の緩衝液(IXリン酸緩衝食塩水、pH7.4(Gibco))で平衡化し、続いて(i)にしたがって作製した半精製ラブドウイルスの清澄化サンプル(約5%カラム体積)を注入した。分離は1.5カラム体積の緩衝液の1.0mL/分の流速で生じ、注入時から全分離工程を通して画分(8mL)を収集した。カラムからのタンパク質溶出は280nmにおけるUV吸収でモニターした(図6)。
ピーク画分をTCA/アセトン沈殿を用いて濃縮した後、4−12%のDSDS-PAGE(Thermo Fisher)によって画分を分析した。略記すれば、各画分の1mLを氷上で1時間TCA(200μL)により沈殿させた。サンプルを20,000xgで2分間遠心分離し、上清を除去した。画分を500μLの氷冷アセトンで洗浄し、ボルテックスして混合し、続いて20,000xgで2分間の遠心分離を実施した。遠心分離及びアセトン工程を合計3回のアセトン洗浄のために繰り返した。ペレットを20分間乾燥させ、20μLのゲルローディング緩衝液に懸濁し、ゲルにロードした。インペリアルタンパク質染色(Thermo Fisher)を用いて1時間ゲルを染色し、さらに少なくとも3時間脱イオン水で脱染した。ゲル分析の後、画分のタンパク質濃度を標準物としてウシ血清アルブミンを用いてBCAアッセイ(Thermo Fisher)によって決定した。
リアルタイムPCR
以下のリアルタイムPCRのための方法及び配列を用いて、(i)の半精製ラブドウイルス(ろ液)及び(ii)のSEC収集画分中のSfRV RNAの存在を検出/定量した。
プライマー/プローブ/G-ブロックコントロール:
* GenBank参照株KF947078を基準にしたゲノム上の位置。全配列がSfRV糖タンパク質をコードする領域を標的とする。
サイクル条件:
50℃で10分間の1サイクル、95℃で3分間の1サイクル、95℃で15秒、57℃で15秒の40サイクル**データ収集(FAM)
実施した工程の簡単な記載:
増幅は、製造業者の推奨にしたがい、BioRad iTaqユニバーサルプローブ一工程キット(Cat # 172-5141)を用いて実施される。プライマーは、25μLの反応物に0.4μMの最終濃度で添加されるが、プローブは0.16μMの最終濃度で添加される。各運転で、標準曲線は、当該伸長アンプリコンに対応する合成二本鎖g-ブロック(IDT)配列を含んでいた。反応は、以下の条件下でCFX96リアルタイムPCR検出系(BioRad)を用いて実施された:最初の逆転写は50℃で10分、続いて最初の変性が95℃で3分、続いて95℃で15秒の変性及び57℃で15秒のアニーリングと伸長の40サイクル、データ収集はFAMチャンネル。光学データはCFXマネージャーソフトウェア(バージョン2.1,BioRad)を用いて分析された。運転は以下を基準にして有効とみなされた:標準曲線の定常性、0.99を超えるr-二乗値及び80−120%の計算効率。各決定について、サイクル閾値(Ct)決定モードの回帰設定を用いて、閾値ラインが自動的に計算された。基準線除去モードを用いて基準線除去が自動的に実施された。
リアルタイムPCRの結果は図7に示される。
図7では:
1列目はウェルの番号を示す。2列目はこのリアルタイムPCRで用いられた特異的プローブに連結した発蛍光団6-カルボキシフルオレセイン(FAM)を示す。3列目は、サイズ排除クロマトグラフィーに由来するSfRV抗原の画分(画分A11、A12、B1、B5、B12及びC6)又は標準曲線作成に用いられた既知量のSfRV特異的核酸の標準物(ウェル7−14)を示す。ウェル15は陰性コントロール(鋳型無し)として機能し、ウェル16は、捕捉(SEC)による分画前の濃縮SfRV抗原を含む陽性コントロールとして機能する。
定量サイクル(Cq)は蛍光が検出されるサイクルである。低いCq値はサンプル中に特異的標的のコピー数が高いことを示す。このデータは4列目に示される。外挿のゲノムコピー数は5列目に配列定量(SQ)として示され、1mL当たりのゲノムコピー数を示す。
データは、出発物質が6logのSfRV特異的ゲノムコピー/mLを有し(ウェル16)、同様に画分A11及びA12が6logのゲノムコピー/mLを有することを示す。これら2つの画分は、テール末端画分B1とともに大半のSfRVウイルス粒子/ビリオン及びウイルス様粒子(VLP)を含むはずである。他の画分B5、B12及びC6はSECでサブウイルス粒子を含むはずで、したがって(もし存在するとしても)より少量のウイルスRNAを含むであろう。
電子顕微鏡試験:
(ii)のSECによって収集された画分を、電子顕微鏡試験のために2.5%のリンタングステン酸(PTA)で3分間染色した(ネガティブ染色)。画分A11及びA12では(図6参照)、約30−35nmの粒子が観察され、前記はSfRVのウイルス粒子と考えられる。
ELISA:
実施例2に記載したようにELISAを実施した。ここでは実施例3に記載の材料と方法が用いられたが、“SFRV抗原”の代わりに(i)の半精製ラブドウイルス(ろ液)及びSECにより収集された画分A11、A12及びB1が用いられたという違いがある(実施例3のB.6.)。前記はそれぞれ被覆緩衝液中で100μLに250ngの濃度に希釈され、続いて前記抗原の各々の100μLで1ウェルを被覆した。
試験血清サンプルとして、実験的ワクチンで免疫した動物の血清が用いられ、前記ワクチンは、培養SfRV感染昆虫細胞でバキュロウイルス発現系によって生成された組換えタンパク質を含む。当該血清は、実験的ワクチンの投与後28日目に当該動物から採取した血液から得られた。
陰性コントロールとして、対応する非免疫動物の血清をそれぞれ用いた。
ELISAの結果は図8に示される。
ELISAプレートは以下を含む4つの異なる抗原で被覆された:半精製SfRV(パネルA)、サイズ排除画分A11(パネルB)、A12(パネルC)及びB1(パネルD)。陰性コントロール動物由来血清(逆三角)又はSfRVを含む実験的ワクチンを投与された動物の28日目血清(丸)を用いてプレートをプローブした。
結果は、ワクチン接種動物由来血清は被覆抗原と反応したが、陰性コントロール血清は最小限の反応しか示さなかったことを示している。さらにまた、ワクチン接種動物は、OD値の増加によって立証されるように、画分A11、A12及びB1(パネルB、C及びD)で被覆したウェルと強く反応し、半精製SfRV(パネルA)と比較してこれらの画分により緊密に集まった。これは、当該抗原(画分A11、A12及びB1)に対するより強い認識及びより特異的な応答を示す。
配列表では:
配列番号:1はSFRV Gタンパク質の配列と一致する;
配列番号:2は切詰めSFRV Gタンパク質の配列と一致する;
配列番号:3はN-末端メリチン配列を有する切詰めSFRV Gタンパク質の配列と一致する;
配列番号:4は改変を有する配列番号:1と一致する(6xHisタグを含む);
配列番号:5は改変を有する配列番号:2と一致する(6xHisタグを含む);
配列番号:6は改変を有する配列番号:3と一致する(6xHisタグを含む);
配列番号:7はSFRV Nタンパク質の配列と一致する;
配列番号:8は改変を有する配列番号:7と一致する(6xHisタグを含む);
配列番号:9は配列番号:1をコードする配列と一致する;
配列番号:10は配列番号:2をコードする配列と一致する;
配列番号:11は配列番号:3をコードする配列と一致する;
配列番号:12は配列番号:4をコードする配列と一致する;
配列番号:13は配列番号:5をコードする配列と一致する;
配列番号:14は配列番号:6をコードする配列と一致する;
配列番号:15は配列番号:7をコードする配列と一致する;
配列番号:16は配列番号:8をコードする配列と一致する;
配列番号:17は、構築物配列番号:12又は配列番号:13に対するフォワードプライマーと一致する;
配列番号:18は、構築物配列番号:12又は配列番号:14に対するリバースプライマーと一致する;
配列番号:19は構築物配列番号:13に対するリバースプライマーと一致する;
配列番号:20は構築物配列番号:14に対するフォワードプライマーと一致する;
配列番号:21は構築物配列番号:16に対するフォワードプライマーと一致する;
配列番号:22は構築物配列番号:16に対するリバースプライマーと一致する;
配列番号:23はPCV2 ORF2タンパク質の配列と一致する;
配列番号:24はヘマグルチニンH5タンパク質(インフルエンザウイルス)の配列と一致する。
Claims (32)
- 培養昆虫細胞中の発現系によって生成される組換えタンパク質を含む免疫原性組成物を個体が受容したか否かを決定する方法であって、個体から入手された生物学的サンプルにおいて1つ以上のマーカーの有無を決定する工程を含み、前記マーカーは、昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであるウイルスに由来する1つ以上の抗原を当該個体が受容したことを示し、前記生物学的サンプル中の前記1つ以上のマーカーの存在は前記個体が前記免疫原性組成物を受容したことを示す、前記方法。
- 発現系がバキュロウイルス発現系であり、及び/又は当該個体が昆虫細胞に感染できるRNAウイルス由来の1つ以上の抗原を受容したことを示す前記1つ以上のマーカーが、
a.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであるウイルスに由来する1つ以上の抗原に特異的な抗体;
b.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであるウイルスに由来する1つ以上の抗原;及び
c.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスに特異的な1つ以上の核酸分子;
から成る群から選択される1つ以上のマーカーである、請求項1に記載の方法。 - 昆虫細胞に感染できるRNAウイルスに由来する1つ以上の抗原が、以下の配列を含むか又は以下の配列からなるタンパク質である、請求項1又は2に記載の方法。
a.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列;及び/又は
b.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列。 - 昆虫細胞に感染できるRNAウイルスに特異的な1つ以上の核酸分子が、
a.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質をコードする核酸分子;及び/又は
b.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質をコードする核酸分子;及び/又は
c.配列番号:9の配列と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列を有するRNA;及び/又は
d.配列番号:15の配列と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列を有するRNA;
である請求項2又は3に記載の方法。 - 以下の工程を含む、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法:
a.生物学的サンプルを固体支持体に固定された捕捉試薬と接触させる工程であって、当該固定捕捉試薬が1つ以上のマーカーと結合することができる、前記工程;及び
b.当該捕捉試薬に結合する前記1つ以上のマーカーの有無を決定する工程であって、当該捕捉試薬に結合する前記1つ以上のマーカーの存在が、前記生物学的サンプルにおける前記1つ以上のマーカーの存在を示す、前記工程。 - 捕捉試薬が以下から成る群から選択される、請求項5に記載の方法:
a.配列番号:1から6のいずれか1つから成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:1から6のいずれか1つから成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質;
b.配列番号:7又は配列番号:8の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:7又は配列番号:8の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質;
c.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであって、前記ウイルスが不活化されていてもよい、及び/又は前記ウイルスが半精製のウイルス体全体であってもよい、前記RNAウイルス;d.配列番号:9の配列に特徴的な配列と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド;及び
e.配列番号:15の配列に特徴的な配列と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド。 - RNAウイルスが以下のものである、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法:
a.(-)ssRNAウイルス、好ましくはラブドウイルス科に属するウイルス;及び/又は
b.以下を含む、昆虫細胞に感染できるRNAウイルス:
i.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は前配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質を含むウイルス;及び/又は
ii.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質を含むウイルス;及び/又は
iii.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質をコードする核酸分子、をゲノム中に含むウイルス;及び/又は
iv.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質を含むウイルス;及び/又は
v.配列番号:9の配列と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列を有するRNA分子、をゲノム中に含むウイルス;及び/又は
vi.配列番号:15の配列と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列を有するRNA分子、をゲノム中に含むウイルス。 - 以下の工程を含む、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法:
a.1つ以上のマーカーの有無を生物学的サンプル中で決定する工程であって、前記マーカーが、
i.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質に特異的な抗体、又は
ii.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質に特異的な抗体、
である、前記工程、及び
b.当該生物学的サンプルを固体支持体に固定された捕捉試薬と接触させる工程であって、当該捕捉試薬が、
i.配列番号:1から6のいずれか1つから成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列又は配列番号:7若しくは配列番号:8の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:1から6のいずれか1つから成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列又は配列番号:7若しくは配列番号:8の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質;
ii.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質を含む、不活化されていてもよいウイルス;
iii.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質;及び/又は
iv.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質、をコードする核酸分子、をゲノム中に含むウイルス;及び/又は
v.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質であって、前記ウイルスが場合によって不活化されてある、前記タンパク質;
vi.配列番号:9の配列と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列を含むRNA分子、をゲノム中に含むウイルス;
vii.配列番号:15の配列と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列を含むRNA分子、をゲノム中に含むウイルスであって、前記ウイルスが場合によって不活化されてある、前記ウイルス;及び/又は
viii.配列番号:1又は配列番号:7の5から11の連続するアミノ酸残基から成る配列から選択される配列を有する合成ペプチド、
から成る群から選択される、前記工程;
c.当該生物学的サンプルを当該固定捕捉試薬から分離する工程;
d.当該固定捕捉試薬-抗体複合体を、当該試薬-抗体複合体の抗体と結合する検出可能な薬剤と接触させる工程;及び
e.当該検出可能な薬剤のための検出手段を用いて、当該捕捉試薬に結合した抗体のレベルを測定する工程。 - 測定工程(d)がさらに、当該捕捉試薬に結合した抗体のレベルを決定するために標準曲線との比較を含む、請求項8に記載の方法。
- 試薬-抗体複合体の抗体に結合する検出可能薬剤が検出可能抗体、好ましくは標識二次抗体である、請求項8又は9に記載の方法。
- 捕捉試薬がバキュロウイルス発現タンパク質であり、前記バキュロウイルス発現タンパク質が好ましくは請求項18に記載のバキュロウイルスによって発現される、請求項5から10のいずれか1項に記載の方法。
- 組換えタンパク質に特異的な抗体、組換えタンパク質に特異的なポリペプチド、組換えタンパク質をコードするDNA配列に特異的なヌクレオチド配列から成る群から選択される1つ以上の分析物の存在を前記生物学的サンプル中で決定する工程をさらに含む、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 組換えタンパク質が、PCV2 ORF2タンパク質(前記PCV2 ORF2タンパク質は、好ましくは配列番号:23の配列と少なくとも90%配列同一性を有するタンパク質)及びインフルエンザヘマグルチニン、好ましくはトリインフルエンザヘマグルチニン、特にH5N1ウイルスのH5タンパク質(前記トリインフルエンザヘマグルチニン又はH5N1ウイルスのH5タンパク質は、好ましくは配列番号:24の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列から成るタンパク質)から成る群から選択される、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
- 免疫原性組成が請求項20から23のいずれか1項に記載の組成物である、請求項1から13のいずれか1項に記載の方法。
- 生物学的サンプルが、哺乳動物又はトリから、好ましくはブタ又はニワトリから単離された、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 生物学的サンプルが、全血、血漿、血清、尿、及び口腔液から成る群から選択される、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
- 固定捕捉試薬がマイクロタイタープレート上に被覆されている、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。
- a.i.配列番号:1から6から成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、配列番号:1から6から成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、及び/又は
ii.配列番号:7又は配列番号:8の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、配列番号:7又は配列番号:8の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、
をコードするDNA配列を含む;及び/又は
b.i.配列番号:9から14から成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含む、又は、配列番号:9から14から成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列からなるDNA配列、及び/又は
ii.配列番号:15又は16の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含む、又は、配列番号:15又は16の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列かなるDNA配列、
を含む、
組換えバキュロウイルス。 - a.配列番号:1から6から成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:1から6から成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNA配列、及び/又はb.i.配列番号:7又は配列番号:8の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:7又は配列番号:8の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNA配列、及び/又は
c.配列番号:9から14から成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有するDNA配列、及び/又は配列番号:15又は16の配列と少なくとも70%配列同一性を有するDNA配列、
を含むベクター、特に導入ベクター。 - バキュロウイルス発現系によって培養昆虫細胞で生成される組換えタンパク質、及び昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであるウイルスに由来する1つ以上の抗原を含む免疫原性組成物。
- 昆虫細胞に感染できるRNAウイルスが不活化されている、請求項20又は21に記載の免疫原性組成物。
- 組換えタンパク質が以下から成る群から選択される、請求項20又は21に記載の免疫原性組成物:
a.PCV2 ORF2タンパク質、好ましくは配列番号:23の配列と少なくとも90%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:23の配列と少なくとも90%配列同一性を有する配列から成るPCV2 ORF2タンパク質、
b.インフルエンザヘマグルチニン、好ましくはトリインフルエンザヘマグルチニン、特にH5N1ウイルスのH5タンパク質であって、好ましくは
i.配列番号:24の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:24の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質、及び
ii.配列番号:1から8から成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:1から8から成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質、
である、前記インフルエンザヘマグルチニン。 - RNAウイルスが以下を含む、請求項20から22のいずれか1項に記載の免疫原性組成物:
a.(-)ssRNAウイルス、好ましくはラブドウイルス科に属するウイルス及び/又は前記昆虫細胞に感染できるRNAウイルスが、
i.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質、及び/又は
ii.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質、
を含むウイルス;及び/又は
b.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであって、前記ウイルスのゲノムが、
i.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質、及び/又は
ii.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質、
をコードする核酸分子を含む、前記RNAウイルス;及び/又は
c.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであって、前記ウイルスのゲノムが、
i.配列番号:9の配列と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列を有するRNA分子、及び/又は
ii.配列番号:15と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列を有するRNA分子、
を含む、昆虫細胞に感染できるRNAウイルス。 - 以下の工程を含む、請求項20から23のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を製造する方法:
a.組換えタンパク質をコードする組換えバキュロウイルスを、昆虫細胞に感染できるRNAウイルスで感染されている昆虫細胞に導入し、前記組換えバキュロウイルス及び前記RNAウイルスを保持している前記昆虫細胞を培養する工程;及び
b.前記組換えタンパク質及び前記ウイルスを、好ましくは上清中に回収する工程。 - 組換えタンパク質をコードするDNA配列を、前記配列をバキュロウイルスのゲノムに導入することができる導入ベクターに挿入する工程をさらに含む、請求項24に記載の方法。
- バキュロウイルス発現系によって培養昆虫細胞で生成される組換えタンパク質を含む免疫原性組成物を個体が受容したか否かを決定するキットであって、固体支持体に固定された1つ以上の捕捉試薬を含み、当該1つ以上の固定捕捉試薬が以下から成る群から選択される1つ以上のマーカーと結合することができる、前記キット:
a.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであるウイルスに由来する1つ以上の抗原に特異的な抗体;
b.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであるウイルスに由来する1つ以上の抗原;及び
c.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスに特異的な1つ以上の核酸分子。 - 1つ以上の捕捉試薬が以下から成る群から選択される、請求項26に記載のキット:
a.配列番号:1から6から成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:1から6から成る群から選択される配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質;
b.配列番号:7又は配列番号:8の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:7又は配列番号:8の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質;
c.昆虫細胞に感染できるRNAウイルス(前記ウイルスは不活化されてある)、配列番号:9の配列に特徴的な配列と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド;及び
d.配列番号:15の配列に特徴的な配列と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド。 - RNAウイルスが以下を含むか又は以下から成る、請求項のいずれか1項に記載のキット:a.(-)ssRNAウイルス、好ましくはラブドウイルス科に属するウイルス;及び/又は
b.i.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は、配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質、及び/又は、
ii.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は、配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質、
を含む、昆虫細胞に感染できるRNAウイルス:及び/又は
c.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであって、前記RNAウイルスのゲノムが、
i.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は前記配列から成るンパク質、及び/又は
ii.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は前記配列から成るタンパク質、
をコードする核酸分子を含む、前記RNAウイルス;及び/又は
d.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであって、前記RNAウイルスのゲノムが、
i.配列番号:9の配列と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列を有するRNA分子、及び/又は
ii.配列番号:15の配列と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列を有するRNA分子、
を含む、前記RNAウイルス。 - 昆虫細胞に感染できるRNAウイルスに由来する1つ以上の抗原が以下である、請求項26から28のいずれか1項に記載のキット:
a.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質;及び/又は
b.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質;及び/又は
c.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスに特異的な1つ以上の核酸分子であって、
i.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質、及び/又は
ii.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質、
をコードする、前記核酸分子;及び/又は
d.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスに特異的な1つ以上の核酸分子であって、
i.配列番号:3の配列と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性を含む配列、及び/又は
ii.配列番号:4の配列と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性を含む配列、
をコードするRNAである、前記核酸分子。 - 昆虫細胞が、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera Frugiperda(Sf))細胞、又はスポドプテラ・フルギペルダに由来する細胞株の細胞、好ましくはSf9細胞及びSf+細胞から成る群から選択される細胞である、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法、請求項20から23のいずれか1項に記載の免疫原性組成物、請求項24又は25のいずれか1項に記載の方法、又は請求項26から29のいずれか1項に記載のキット。
- 捕捉試薬を含む組成物、請求項5から17又は30のいずれか1項に記載の方法、又は請求項26から30のいずれか1項に記載のキットであって、前記捕捉試薬が昆虫細胞に感染できるRNAウイルスのウイルス粒子及び/又はウイルス様粒子を含むか又はRNAウイルスのウイルス粒子及び/又はウイルス様粒子から成り、さらに前記組成物又は前記捕捉試薬が下記工程を含む方法によって入手できる、前記組成物、方法又はキット:
i)昆虫細胞に感染できるRNAウイルスに感染した昆虫細胞の培養物から上清を入手する工程であって、前記上清が当該RNAウイルスのウイルス粒子及び/又はウイルス様粒子を含み、昆虫細胞に感染できるRNAウイルスに感染した前記昆虫細胞は、好ましくはバキュロウイルスに感染されていないか、及び/又は好ましくはプラスミドでトランスフェクトされていない、前記入手工程;
ii)細胞デブリを前記ウイルス粒子及び/又はウイルス様粒子から少なくとも1枚のフィルター、好ましくは2枚のフィルターによる微小ろ過を含む分離工程を介して分離する工程であって、当該少なくとも1枚のフィルターが、好ましくは前記ウイルス粒子及び/又はウイルス様粒子よりも大きな孔サイズ、特に約0.1μmから約4μm、好ましくは約0.2μmから約2μmの孔サイズを有する、前記分離工程;
iii)場合によって、前記ウイルス粒子及び/又はウイルス様粒子を含むii)のろ液をサイズ排除クロマトグラフィーに付す工程であって、当該溶離液中のタンパク質の存在が、260nm又は280nmで光の吸収(A260又はA280)を測定することによって測定され、好ましくは最初のA260又はA280のピークを示す溶離液が収集される、前記工程。 - RNAウイルスが以下を含むか又は以下から成る、組成物、キット、又は請求項31に記載の方法:
a.(-)ssRNAウイルス、好ましくはラブドウイルス科に属するウイルス;及び/又は
b.i.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質、及び/又は
ii.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又は配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質、を含む、昆虫細胞に感染できるRNAウイルス;及び/又は
c.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであって、前記RNAウイルスのゲノムが、
i.配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:1の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列からなるタンパク質、及び/又は
ii.配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列を含むか又は配列番号:7の配列と少なくとも70%配列同一性を有する配列から成るタンパク質、
をコードする核酸分子を含む、前記RNAウイルス;及び/又は
d.昆虫細胞に感染できるRNAウイルスであって、前記RNAウイルスのゲノムが、
i.配列番号:9の配列と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列を有するRNA分子、及び/又は
ii.配列番号:15の配列と少なくとも70%配列同一性を有する核酸配列と逆相補性の配列を有するRNA分子、
を含む、前記RNAウイルス。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562128744P | 2015-03-05 | 2015-03-05 | |
US62/128,744 | 2015-03-05 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017545578A Division JP6814739B2 (ja) | 2015-03-05 | 2016-03-04 | マーカー系、特にバキュロウイルス発現サブユニット抗原のためのマーカー系 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021072781A true JP2021072781A (ja) | 2021-05-13 |
JP7237913B2 JP7237913B2 (ja) | 2023-03-13 |
Family
ID=55587370
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017545578A Active JP6814739B2 (ja) | 2015-03-05 | 2016-03-04 | マーカー系、特にバキュロウイルス発現サブユニット抗原のためのマーカー系 |
JP2020211194A Active JP7237913B2 (ja) | 2015-03-05 | 2020-12-21 | マーカー系、特にバキュロウイルス発現サブユニット抗原のためのマーカー系 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017545578A Active JP6814739B2 (ja) | 2015-03-05 | 2016-03-04 | マーカー系、特にバキュロウイルス発現サブユニット抗原のためのマーカー系 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10168330B2 (ja) |
EP (1) | EP3265121B1 (ja) |
JP (2) | JP6814739B2 (ja) |
KR (1) | KR102564081B1 (ja) |
CN (2) | CN107533066B (ja) |
AU (1) | AU2016226003B2 (ja) |
CA (1) | CA2977405A1 (ja) |
DK (1) | DK3265121T3 (ja) |
EA (1) | EA038831B1 (ja) |
ES (1) | ES2818148T3 (ja) |
HU (1) | HUE051827T2 (ja) |
MX (1) | MX2017011322A (ja) |
PT (1) | PT3265121T (ja) |
WO (1) | WO2016141338A2 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2977405A1 (en) | 2015-03-05 | 2016-09-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Marker system, in particular for baculovirus-expressed subunit antigens |
CN108048476B (zh) * | 2017-11-21 | 2020-09-08 | 浙江迪福润丝生物科技有限公司 | 一种制备区分免疫和感染动物h9亚型禽流感疫苗株的方法及应用 |
US10718771B2 (en) | 2018-02-09 | 2020-07-21 | Chung Yuan Christian University | Recombinant baculoviruses and their uses in detecting arthropod-borne virus |
CN109536456B (zh) * | 2018-10-26 | 2021-07-30 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心) | 识别pcv2病毒样颗粒的单克隆抗体及其在定性及定量检测pcv2病毒样颗粒中的应用 |
CN115768784A (zh) | 2020-02-06 | 2023-03-07 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 用于检测抗弹状病毒抗体的多肽 |
CN116064649B (zh) * | 2022-11-24 | 2023-11-21 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种在本氏烟草中表达猪瘟病毒e2蛋白的方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6814739B2 (ja) * | 2015-03-05 | 2021-01-20 | ベーリンガー・インゲルハイム・アニマル・ヘルス・ユーエスエー・インコーポレイテッドBoehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc. | マーカー系、特にバキュロウイルス発現サブユニット抗原のためのマーカー系 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5283173A (en) | 1990-01-24 | 1994-02-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | System to detect protein-protein interactions |
US7700285B1 (en) * | 2005-12-29 | 2010-04-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
US7833707B2 (en) | 2004-12-30 | 2010-11-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2 |
WO2007053899A1 (en) | 2005-11-10 | 2007-05-18 | Diva Solutions Pty Ltd | Differentiating therapeutic composition |
CN105769931B (zh) * | 2006-09-15 | 2021-04-27 | 渥太华医院研究机构 | 溶瘤弹状病毒 |
US20090110698A1 (en) | 2007-10-31 | 2009-04-30 | Newport Laboratories, Inc. | Method of determining vaccine compliance |
CN101884787A (zh) * | 2010-07-22 | 2010-11-17 | 洛阳普莱柯生物工程有限公司 | 猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法 |
US20150290314A1 (en) | 2012-08-29 | 2015-10-15 | Intervet Inc. | Marker vaccine |
JP2016533172A (ja) | 2013-10-03 | 2016-10-27 | タケダ ワクチン,インコーポレイテッド | 細胞株からラブドウイルスを検出および除去する方法 |
-
2016
- 2016-03-04 CA CA2977405A patent/CA2977405A1/en active Pending
- 2016-03-04 CN CN201680013955.8A patent/CN107533066B/zh active Active
- 2016-03-04 US US15/061,690 patent/US10168330B2/en active Active
- 2016-03-04 KR KR1020177028087A patent/KR102564081B1/ko active IP Right Grant
- 2016-03-04 WO PCT/US2016/021003 patent/WO2016141338A2/en active Application Filing
- 2016-03-04 JP JP2017545578A patent/JP6814739B2/ja active Active
- 2016-03-04 PT PT167110808T patent/PT3265121T/pt unknown
- 2016-03-04 AU AU2016226003A patent/AU2016226003B2/en active Active
- 2016-03-04 CN CN202110085632.2A patent/CN113156135A/zh active Pending
- 2016-03-04 HU HUE16711080A patent/HUE051827T2/hu unknown
- 2016-03-04 ES ES16711080T patent/ES2818148T3/es active Active
- 2016-03-04 EA EA201791957A patent/EA038831B1/ru unknown
- 2016-03-04 DK DK16711080.8T patent/DK3265121T3/da active
- 2016-03-04 MX MX2017011322A patent/MX2017011322A/es unknown
- 2016-03-04 EP EP16711080.8A patent/EP3265121B1/en active Active
-
2018
- 2018-11-08 US US16/184,018 patent/US10545148B2/en active Active
-
2020
- 2020-12-21 JP JP2020211194A patent/JP7237913B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6814739B2 (ja) * | 2015-03-05 | 2021-01-20 | ベーリンガー・インゲルハイム・アニマル・ヘルス・ユーエスエー・インコーポレイテッドBoehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc. | マーカー系、特にバキュロウイルス発現サブユニット抗原のためのマーカー系 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
VACCINE, vol. 28, JPN6019051486, 1 November 2009 (2009-11-01), pages 3047 - 3054, ISSN: 0004836525 * |
VACCINE, vol. 29, JPN6019051488, 4 January 2011 (2011-01-04), pages 1830 - 1835, ISSN: 0004836526 * |
VECTOR-BORNE AND ZOONOTIC DISEASES, vol. 14, JPN6019051484, 2014, pages 746 - 756, ISSN: 0004836524 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR102564081B1 (ko) | 2023-08-08 |
JP6814739B2 (ja) | 2021-01-20 |
US10545148B2 (en) | 2020-01-28 |
KR20170122262A (ko) | 2017-11-03 |
US20160258953A1 (en) | 2016-09-08 |
JP7237913B2 (ja) | 2023-03-13 |
US10168330B2 (en) | 2019-01-01 |
CA2977405A1 (en) | 2016-09-09 |
CN113156135A (zh) | 2021-07-23 |
EP3265121B1 (en) | 2020-06-17 |
HUE051827T2 (hu) | 2021-03-29 |
AU2016226003B2 (en) | 2021-07-29 |
JP2018516533A (ja) | 2018-06-28 |
WO2016141338A2 (en) | 2016-09-09 |
CN107533066A (zh) | 2018-01-02 |
CN107533066B (zh) | 2021-02-12 |
EP3265121A2 (en) | 2018-01-10 |
PT3265121T (pt) | 2020-08-31 |
US20190154688A1 (en) | 2019-05-23 |
MX2017011322A (es) | 2017-12-07 |
EA038831B1 (ru) | 2021-10-26 |
WO2016141338A3 (en) | 2016-10-06 |
EA201791957A1 (ru) | 2018-03-30 |
AU2016226003A1 (en) | 2017-08-24 |
ES2818148T3 (es) | 2021-04-09 |
DK3265121T3 (da) | 2020-08-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7237913B2 (ja) | マーカー系、特にバキュロウイルス発現サブユニット抗原のためのマーカー系 | |
Richt et al. | Vaccination of pigs against swine influenza viruses by using an NS1-truncated modified live-virus vaccine | |
JPH06509710A (ja) | バキュロウイルスにおけるインフルエンザaのm2蛋白の改良発現及びm2蛋白の使用 | |
CN106456741B (zh) | 包含e2蛋白tav表位中的取代的重组经典猪瘟病毒(csfv) | |
KR101652962B1 (ko) | 돼지열병 바이러스 생마커백신주 접종 돼지와 돼지열병 바이러스 야외주 감염 돼지의 항체 감별용 키트 및 이를 이용한 감별방법 | |
JP2021072793A (ja) | 新規なパラミクソウイルスおよびその使用 | |
Kumar et al. | Evaluation of surface glycoproteins of classical swine fever virus as immunogens and reagents for serological diagnosis of infections in pigs: A recombinant Newcastle disease virus approach | |
KR20140064884A (ko) | 개선된 백신 진단 | |
JP7213507B2 (ja) | 組換え豚パルボウイルス抗原タンパク質及びその用途 | |
Clavijo et al. | Development of a competitive ELISA using a truncated E2 recombinant protein as antigen for detection of antibodies to classical swine fever virus | |
KR20190096965A (ko) | 선천적 진전 a를 야기하는 신규한 페스티바이러스의 단리 | |
KR101920961B1 (ko) | 다중 진단 키트 | |
JP3262273B2 (ja) | ブタコレラを含むペスチウイルス感染の如き感染に対する保護法、ヌクレオチド配列およびワクチンの開発および診断に使用されるポリペプチド | |
US10067130B2 (en) | Infectious genomic DNA clone and serological profile of torque teno sus virus 1 and 2 | |
KR20230123463A (ko) | 재조합 고전적 돼지 열 바이러스 e2 단백질 | |
M Salem et al. | Molecular and serological identification of foot-and-mouth disease virus serotypes in cattle of Basrah province | |
TWI490229B (zh) | 豬瘟病毒封套醣蛋白Erns之特異性單株抗體CW813及其於間接三明治ELISA抗體檢測之應用 | |
Luo et al. | Expression and Characterization of HA 1 Protein of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza Virus for Use in a Serodiagnostic Assay | |
RU2765658C9 (ru) | Выделение нового пестивируса, вызывающего врожденный тремор а | |
TWI393778B (zh) | Recombinant swine fever virus E2 glycoprotein, its single source antibody and its application in diagnostic reagents and subunit vaccines (2) | |
WO2006025218A1 (ja) | 鳥インフルエンザ感染の検査方法 | |
KR20170101655A (ko) | 효소면역기법을 이용한 일본뇌염바이러스에 대한 항체 검출 방법 | |
JP2006118970A (ja) | 抗原蛋白質を発現した細胞を利用する抗体測定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210119 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210119 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211213 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220310 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220727 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221019 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230130 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230301 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7237913 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |