JP2021056000A

JP2021056000A - 光学分析装置および光学分析方法

Info

Publication number: JP2021056000A
Application number: JP2018007660A
Authority: JP
Inventors: 福武　直樹; Naoki Fukutake; 直樹福武; 武志川野; Takeshi Kawano
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2021-04-08
Also published as: WO2019142907A1

Abstract

【課題】補正が不要なＣＡＲＳスペクトルを検出する。【解決手段】光学分析装置であって、ポンプ光およびストークス光を発生する光源と、分析対象を支持し、ポンプ光およびストークス光を透過させる透明板と、分析対象および光源の間に配され、分析対象および透明板の境界に結ばれる焦点を有する第１の対物レンズと、分析対象および透明板を挟んで第１の対物レンズに対向して配置され、分析対象および透明板の境界に結ばれた焦点を有し、第１の対物レンズの開口数と異なる開口数を有する第２の対物レンズと、分析対象および透明板で発生した散乱光を、第２の対物レンズを通じて受光する分光器とを備える。【選択図】図６

Description

本発明は、光学分析装置および光学分析方法に関する。

コヒーレントアンチストークスラマン散乱光（以降の記載においては「コヒーレントアンチストークスラマン散乱」を「ＣＡＲＳ」と記載する）のスペクトルにより分析対象に含まれる物質を分析する光学分析方法がある（例えば、特許文献１参照）。
特許文献１国際公開第２０１６／００９５４８号

分析対象に励起光を照射した場合、ＣＡＲＳ光の発生と同時に、４光波混合による非共鳴バックグラウンドも発生するので、検出されたスペクトルは、自発ラマンスペクトルと異なるプロファイルを有するものとなる。

本発明の第一態様においては、ポンプ光およびストークス光を発生する光源と、分析対象を支持し、ポンプ光およびストークス光を透過させる透明板と、分析対象および光源の間に配され、分析対象および透明板の境界に結ばれる焦点を有する第１の対物レンズと、分析対象および透明板を挟んで第１の対物レンズに対向して配置され、分析対象および透明板の境界に結ばれた焦点を有し、第１の対物レンズの開口数と異なる開口数を有する第２の対物レンズと、分析対象および透明板で発生した散乱光を、第２の対物レンズを通じて受光する分光器とを備える光学分析装置が提供される。

本発明の第二態様においては、分析対象をポンプ光およびストークス光に対して透明な透明板に支持させ、第１の開口数を有して分析対象および透明板の境界に焦点を結ぶ第１の対物レンズを通じて、ポンプ光およびストークス光を分析対象および透明板に照射し、第１の対物レンズに対向して配置され、第１の対物レンズの開口数と異なる開口数を有し、分析対象および透明板の境界に焦点を結ぶ第２の対物レンズを通じて、分析対象および透明板で発生した散乱光を分光器で受光する光学分析方法が提供される。

上記の発明の概要は、本発明の必要な特徴の全てを列挙したものではない。これらの特徴群のサブコンビネーションもまた発明となり得る。

サンプル１１０の模式的断面図である。レーザ顕微分光器１００の模式図である。ＣＡＲＳ過程を説明する模式図である。四光波混合過程を説明する模式図である。対物レンズの焦点付近を示す模式図である。光線形光学効果による散乱光の点像振幅分布を示す図である。光線形光学効果による散乱光の点像振幅分布を示す図である。光線形光学効果による散乱光の点像振幅分布を示す図である。散乱光の角周波数とＣＡＲＳ光強度との関係を示すグラフである。散乱光の角周波数とＣＡＲＳ光強度との関係を示すグラフである。検出したスペクトルを示す図である。比較例として検出したスペクトルを示す図である。

以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は特許請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。

図１は、レーザ顕微分光器１００によるスペクトルの分析対象となるサンプル１１０の構成を示す模式的断面図である。図示のサンプル１１０は、分析対象１１２を、保護液１１６に浸した状態でサンプル容器１１４に収容して形成される。分析対象１１２は、例えば細胞シートのような生体標本であり、保護液１１６として培養液が用いられている。サンプル容器１１４は、ガラス製も用いることができるが、ガラスに限定されるわけではない。

図２は、レーザ顕微分光器１００の構造を示す模式図である。レーザ顕微分光器１００は、レーザ光源１２０、励起光発生部１３０、光学系１５０、ステージ１６０、ポリクロメータ１７０、および制御部１８０を備える。

レーザ顕微分光器１００において、分析対象となるサンプル１１０は、ステージ１６０に置かれる。レーザ光源１２０が発生したレーザ光は、励起光発生部１３０においてポンプ光およびストークス光に変換された後、励起光側対物レンズ１５２等を通じてサンプル１１０に照射される。励起光を照射されたサンプル１１０において発生した散乱光は、信号光側対物レンズ１５４を通じてポリクロメータ１７０に検出される。ポリクロメータ１７０による検出結果は、制御部１８０において処理され、サンプル１１０の分光スペクトルが出力される。

レーザ顕微分光器１００において、レーザ光源１２０は、ピコ秒パルスレーザを発生して、励起光発生部１３０に入射する。レーザ光源１２０としては、モードロックピコ秒Ｎｄ：ＹＶＯ_４レーザ、モードロックピコ秒イットリビウムレーザー等を用いることができる。また、レーザ光源１２０に、ピコ秒パルスの第２高調波を励起光とする光パラメトリック発振器を設けて、ピコ秒パルスレーザの波長を変化させ出力してもよい。

励起光発生部１３０は、光分岐器１３２、フォトニック結晶ファイバ１３４、反射鏡１３６、および光合波器１３８を有する。光分岐器１３２は、レーザ光源１２０から入射されたピコ秒パルスレーザを２つに分岐させる。

光分岐器１３２の一方の射出端は一対の反射鏡１３６を含む光路に結合される。よって、こちら側に入射したピコ秒パルスレーザは、フォトニック結晶ファイバ１３４を迂回して、光合波器１３８の一方の入射端に結合された光路に誘導さる。これにより、分岐されたピコ秒パルスレーザの一方は、光合波器１３８に到達するまでの時間を調整され、フォトニック結晶ファイバ１３４を経由した他方のピコ秒パルスレーザとタイミングを揃えて光合波器１３８に入射される。

光分岐器１３２の他方の射出端は、フォトニック結晶ファイバ１３４の入射端に結合される。フォトニック結晶ファイバ１３４に入射したピコ秒パルスレーザは、フォトニック結晶ファイバ１３４において生じる自己位相変調により、当初入射したピコ秒パルスレーザよりも波長が長い帯域で広スペクトル化する。フォトニック結晶ファイバ１３４の射出端は、光合波器１３８の他方の入射端に結合される。

広スペクトル化ピコ秒パルスレーザと、それにタイミングを合わせたピコ秒パルスレーザとは、光合波器１３８で合波された後、励起光発生部１３０から合成されたピコ秒パルスレーザとして射出される。励起光発生部１３０から射出されたピコ秒パルスレーザは、最終的に励起光としてサンプル１１０に照射される。ここで、当初の狭帯域のピコ秒パルスレーザはポンプ光として、フォトニック結晶ファイバ１３４で広帯域化されたピコ秒パルスレーザはストークス光として、それぞれサンプル１１０に照射される。

なお、レーザ光源１２０は、単一波長のピコ秒パルスレーザを発生するものに限られず、複数の波長のピコ秒パルスレーザを発生するものを用いてもよい。また、ポンプ光となるピコ秒パルスレーザも、フォトニック結晶ファイバにより波長を変換してから出力してもよい。

レーザ顕微分光器１００の光学系１５０は、励起光発生部１３０とステージ１６０との間に配された励起光側対物レンズ１５２を含む。励起光側対物レンズ１５２は、ステージ１６０に置かれたサンプル１１０の内部に焦点を結び、励起光発生部１３０から伝播した励起光をサンプル１１０内に集光する。これにより、サンプル１１０内の焦点付近において、励起光は非線形効果を生じる。

ステージ１６０は、圧電素子によりステージ１６０を少なくともＸ−Ｙ方向に移動させる駆動部１６２を有する。これにより、光学系を移動させることなく、ステージ１６０上のサンプル１１０を励起光で走査できる。

また、光学系１５０は、ステージ１６０に置かれたサンプル１１０に対して、励起光側対物レンズ１５２と反対側に配された信号光側対物レンズ１５４を有する。信号光側対物レンズ信号光側対物レンズ１５４は、ステージ１６０に置かれたサンプル１１０の内部に焦点を結び、サンプル１１０から射出された散乱光を集光する。なお、レーザ顕微分光器１００において、励起光側対物レンズ１５２と、信号光側対物レンズとは、互いに異なる開口数（ＮＡ）を有するが、この点については、図６、７、８を参照して後述する。

光学系１５０は、更に、信号光側対物レンズ１５４から射出された散乱光の光路上に、光学フィルタ１５６および結像レンズ１５８を有する。光学フィルタ１５６は、サンプル１１０から射出された散乱光から不要な光学的成分を取り除く。

ここで、不要な成分とは、サンプル１１０を透過して射出された照射光の一部の帯域を含む。このため、光学フィルタ１５６は、サンプル１１０の種類、分析対象の組成、検出目的等に応じて変更される。結像レンズ１５８は、後述するポリクロメータ１７０の受光面に、サンプル１１０で発生した散乱光を結像させる。

なお、レーザ顕微分光器１００は、励起光および散乱光の光路上に、反射鏡１４０、１４２を有する。これにより、励起光および散乱光の光路が折り曲げられ、レーザ顕微分光器１００の寸法の拡大を抑制する。

ポリクロメータ１７０は、広帯域の照射光をサンプル１１０に照射した場合に、分析対象１１２から射出された光を回折格子で分光して複数の受光素子で同時に受光する。これにより、ポリクロメータ１７０は、照射光が照射された領域におけるサンプル１１０のスペクトルを検出する検出部として動作する。

なお、ポリクロメータ１７０は、光学系１５０の像面のひとつと共役な位置に配された分光器の入射スリットに相当する狭い領域を通して受光した光を分光して検出する。このため、ポリクロメータを用いて射出光を受光する場合は、サンプル１１０に照射する励起光の光路を変位させることができない。

よって、ポリクロメータ１７０の１回の検出により得られるスペクトルは、分析対象１１２のあるひとつの位置における成分に対応する。しかしながら、レーザ顕微分光器１００は、駆動部１６２により、サンプル１１０を置いたステージ１６０を変位させることができる。よって、レーザ顕微分光器１００では、サンプル１１０の異なる位置のスペクトルも検出することができる。

制御部１８０は、キーボード１８２、マウス１８４、情報処理装置１８６および表示装置１８８を有する。キーボード１８２およびマウス１８４は、情報処理装置１８６に接続され、情報処理装置１８６にユーザの指示を入力する場合に操作される。情報処理装置１８６は、汎用パーソナルコンピュータに制御手順を実行させるプログラムを実装して形成できる。

表示装置１８８は、キーボード１８２およびマウス１８４による操作に対するフィードバックをユーザに返すと共に、情報処理装置１８６が生成した画像または文字列をユーザに向かって表示する。制御部１８０は、レーザ光源１２０、駆動部１６２、ポリクロメータ１７０等の動作を制御すると共に、ユーザによる指示をレーザ顕微分光器１００に設定する。また、ポリクロメータ１７０の検出結果を映像化して、表示装置１８８に表示する画像を生成する。

なお、レーザ顕微分光器１００は、上記の他に、励起光の光路を変位させて固定されたサンプル１１０を励起光により走査するガルバノスキャナや、散乱光によるサンプル１１０のイメージングをする場合に使用する光電子増倍管１９０等を付加的に設けてもよい。光電子増倍管１９０等を付加的に設けてもよい。光電子増倍管１９０等の複数の検出部を設けた場合は、例えば、散乱光の光路において最も下流側に挿抜式反射鏡１４２を設けて、複数の検出部を選択的に使用してもよい。

図３は、サンプル１１０における分析対象１１２に、集光された励起光が照射された場合に生じるＣＡＲＳ過程を説明する図である。ＣＡＲＳ過程は、互いに異なる角周波数ω_ｐ、ω_ｓを有するポンプ光およびストークス光を含む励起光をサンプル１１０に照射して、ポンプ光の光周波数ω_ｐとストークス光の光周波数ω_ｓとの差［ω_ｐ−ω_ｓ］が、サンプルに含まれる分子の固有振動の角振動数ω_０と共鳴した場合に発生する。

ＣＡＲＳ過程により、サンプルに含まれる特定の分子構造の振動モードが励振されると、分子振動が角周波数ω_３を有する第３のレーザ光であるプローブ光と相互作用することにより、三次の非線形分極に由来するＣＡＲＳ光がラマン散乱光として発生する。

更に、ポンプ光はプローブ光としても利用できるので、［ω_ｐ＝ω_３］という条件の下で、ＣＡＲＳ光が発生する。サンプルにおいて発生するＣＡＲＳ光は、［ω_ＣＡＲＳ＝ω_ｐ−ω_ｓ＋ω_３＝２ω_ｐ−ω_ｓ］を満たす光周波数を有する。よって、サンプルから射出されたＣＡＲＳ光を検出することにより、サンプルに含まれる特定の分子構造、例えば官能基の存在を検出できる。更に、照射光をサンプルに照射する位置を変えながら繰り返しＣＡＲＳ光を検出することにより、分析対象１１２における特定の分子構造の分布を画像化することができる。

ここで、ＣＡＲＳ光は自発ラマン散乱光等に比べると光強度が高いので、光電気変換素子を用いて検出する場合に蓄積時間が短く、高速に検出できる。これにより、ビデオレートでの観察も可能になる。また、特定分子構造の分布だけではなく、分布の変化も検出することができる。更に、サンプルに照射する照射光の帯域を、生細胞に与えるダメージが少ない赤外帯域とすることにより、観察対象の生細胞を生かしたまま観察することができる。

また更に、サンプルの特定の位置に照射する照射光の光周波数を変化させることにより、当該照射位置から射出されたラマン散乱光の周波数分布（波数分布）を示すスペクトル画像が得られる。更に、照射光の光路に対して交差する方向にサンプルを移動させながら照射光を繰り返し照射することにより、観察平面における特定の分子の分布を画像化することもできる。

図４は、サンプル１１０における分析対象１１２に、集光された励起光が照射された場合に生じる、ＣＡＲＳ過程とは別の現象である四光波混合を説明する図である。四光波混合は、励起光が照射された場合に、分析対象１１２の３次非線形感受率χ^（３）に起因して、図示のように、ＣＡＲＳ光と同じ角周波数２ω_ｐ−ω_ｓの散乱光がＣＡＲＳ光と同時に発生する現象である。

このような四光波混合過程に起因する散乱光は、試料の分子振動に依存することなく発生するので非共鳴バックグラウンドと呼ばれ、ＣＡＲＳ光像のコントラストを低下させる。また、指紋領域と呼ばれるＣＡＲＳ信号レベルが低い領域では、非共鳴バックグラウンドの影響が相対的に強く、イメージングが困難な場合があった。

更に、レーザ波長を掃引してスペクトルを検出した場合に、ＣＡＲＳ光と非共鳴バックグラウンドとが重畳して検出されるので、自発ラマン散乱により検出したスペクトルとは異なるプロファイルのスペクトルが検出される原因となる。このため、生体内で凝集しやすく分子振動が強い脂質の検出に限られる等、ＣＡＲＳ顕微法の適用範囲が制限されている。スペクトル検出後に画像処理等による後処理でスペクトルを補正することも試みられているが、処理負荷および処理時間が増加するので、有効な検出までの積算時間が短いというＣＡＲＳ信号の利点が損なわれる。

図５は、レーザ顕微分光器１００における励起光側対物レンズ１５２および信号光側対物レンズ１５４の光学的配置を模式的に示す図である。図示のように、励起光側対物レンズ１５２および信号光側対物レンズ１５４は、それぞれ、分析対象１１２とガラス製のサンプル容器１１４との境界に焦点を結ぶ。

このため、励起光側対物レンズ１５２が集光した励起光は、分析対象１１２とサンプル容器１１４の両方において四光波混合を生じる。更に、分析対象１１２においては、励起光の差周波（ω_ｐ−ω_ｓ）が分子振動共鳴周波数と一致した場合に増強されてＣＡＲＳ光が発生する。

よって、分子振動共鳴に依存しない非共鳴バックグラウンドは、３次非線形感受率χ^（３）の実部に起因する。一方、ＣＡＲＳ光強度は｜χ^（３）｜^２に比例するので、３次非線形感受率χ^（３）の実部と虚部の両方を反映する。換言すれば、非線形感受率の虚部Ｉｍ｛χ_ｓ ^（３）｝が、非共鳴バックグラウンドの影響が除かれた自発ラマンスペクトル（自然スペクトル）と同じスペクトルに相当する。

図６は、図５に示した領域Ａにおける点像振幅分布を示す図である。なお、図示の例は、励起光側対物レンズ１５２の開口数ＮＡ_ＥＸが、信号光側対物レンズ１５４の開口数ＮＡ_ＣＬよりも大きい場合を示す。

また、図内の右に、分析対象１１２側の寄与による散乱光と、サンプル容器１１４側の寄与による散乱光のアルガン図を併せて示す。図中上側のアルガン図は、分析対象１１２において発生した散乱光の初期位相に対応する。また、図中下側のアルガン図は、サンプル容器１１４において発生する散乱光の初期位相に対応する。

図７は、図６と同様に、領域Ａにおける点像振幅分布を示す図である。ただし、図７に示した例では、励起光側対物レンズ１５２の開口数ＮＡ_ＥＸが、信号光側対物レンズ１５４の開口数ＮＡ_ＣＬと等しい。また、図７の右に、分析対象１１２側の寄与による散乱光のアルガン図を併せて示す。

図８は、図６、７と同様に、領域Ａにおける点像振幅分布を示す図である。図８に示す例では、励起光側対物レンズ１５２の開口数ＮＡ_ＥＸが、信号光側対物レンズ１５４の開口数ＮＡ_ＣＬよりも小さい。図８の右にも、分析対象１１２側の寄与による散乱光のアルガン図を併せて示す。

図６、７、８に示すアルガン図を比較すると判るように、励起光側対物レンズ１５２の開口数ＮＡ_ＥＸと、信号光側対物レンズ１５４の開口数ＮＡ_ＣＬとの関係の変化は、発生する散乱光の点像振幅分布に反映され、散乱光の偏角θ_Ｆが変化することが判る。よって、励起光側対物レンズ１５２の開口数ＮＡ_ＥＸと、信号光側対物レンズ１５４の開口数ＮＡ_ＣＬとを適切に設定することにより、上記の式（５）を満足できることが判る。

ここで、円形の瞳を有する励起光側対物レンズ１５２の開口数ＮＡ_ｅｘを［ｎ・ｓｉｎθ_ｅｘ（ｎは屈折率）］とし、信号光側対物レンズ１５４の開口数ＮＡ_ｃｏｌを［ｎ・ｓｉｎθ_ｃｏｌ（ｎは屈折率）］とした場合、下記の一連の式（６）に示す条件が満たされることにより上記式（５）が満足される。

また、励起光側対物レンズ１５２が、外径ｎ・ｓｉｎθ_{ｅｘ（ｏｕｔ）、}内径ｎ・ｓｉｎθ_{ｅｘ（ｉｎ）}の環状瞳を有して輪帯照明が形成されている場合は、信号光側対物レンズ１５４が半径ｎ・ｓｉｎθ_ｃｏｌの円形瞳を有するものとすると、下記の一連の式（７）に示す条件が満たされることにより上記式５が満足される。

上記のように、励起光側対物レンズ１５２が環状の瞳を有する場合は、信号光側対物レンズ１５４の円形瞳の半径を大きくとることができる。よって、光学分析装置としての分解能が高くなり、信号光を高効率に集光できる。

図９は、式（５）の関係を満たす開口数ＮＡの組合せの一例として、散乱光の角周波数とＣＡＲＳ光強度との関係を示すグラフである。図示の例は、励起光側対物レンズ１５２の開口数ＮＡ_ＥＸを１とし、信号光側対物レンズ１５４の開口数ＮＡ_ＣＬを０．４として、励起光側対物レンズ１５２の開口数ＮＡ_ＥＸの方が大きくなる開口数を選択した場合を示す。このような開口数の関係が成立している場合、角周波数が低い領域でＣＡＲＳ光の強度がより高くなる傾向がある。よって、指紋領域におけるＣＡＲＳスペクトルの検出に有利である。

図１０は、式（５）の関係を満たす開口数ＮＡの組合せの一例として、散乱光の角周波数とＣＡＲＳ光強度との関係を示すグラフである。図示の例は、励起光側対物レンズ１５２の開口数ＮＡ_ＥＸを１とし、信号光側対物レンズ１５４の開口数ＮＡ_ＣＬを１．３として、信号光側対物レンズ１５４の開口数ＮＡ_ＣＬの方が大きくなる開口数を選択した場合を示す。このような開口数の関係が成立している場合は、角周波数が高い領域でＣＡＲＳ光の強度が高くなる傾向がある。

図１１は、上記式（５）に示した関係が成立する条件下で検出したスペクトルのプロファイルを示すグラフである。図示のプロファイルは、自発ラマンスペクトルのプロファイルと略一致する。

図１２は、比較のために、レーザ顕微分光器１００の励起光側対物レンズ１５２の開口数ＮＡ_ＥＸと、信号光側対物レンズ１５４の開口数ＮＡ_ＣＬとを同じにして測定したスペクトルのプロファイルを示すグラフである。図示のように、このプロファイルは、非共鳴バックグラウンドの影響を受けて、プロファイルが全体に山なりに変形している。また、各ピークの直後にディップが付帯しており、本来のスペクトルとは異なる波形となっている。

このように、励起光側対物レンズ１５２および信号光側対物レンズ１５４の開口数ＮＡを適切に設定することにより、デバイスを付加することなく、自発ラマン散乱光のスペクトルと一致する正確なプロファイルのスペクトルを検出できる。また、付加的な画像処理または信号処理も不要なので、分析器の処理負荷および処理時間が減少して、信号レベルが高いというＣＡＲＳスペクトルの利点を活かすことができ、例えば、正確なスペクトルをビデオレートで検出することも可能になる。

以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。

特許請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示しておらず、また、前の処理の出力を後の処理で用いるのでない限り、任意の順序で実現しうることに留意すべきである。特許請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明したとしても、この順で実施することが必須であることを意味するものではない。

１００レーザ顕微分光器、１１０サンプル、１１２分析対象、１１４サンプル容器、１１６保護液、１２０レーザ光源、１３０励起光発生部、１３２光分岐器、１３４フォトニック結晶ファイバ、１３６、１４０反射鏡、１３８光合波器、１４２挿抜式反射鏡、１５０光学系、１５２励起光側対物レンズ、１５４信号光側対物レンズ、１５６光学フィルタ、１５８結像レンズ、１６０ステージ、１６２駆動部、１７０ポリクロメータ、１８０制御部、１８２キーボード、１８４マウス、１８６情報処理装置、１８８表示装置、１９０光電子増倍管

Claims

ポンプ光およびストークス光を発生する光源と、
分析対象を支持し、前記ポンプ光および前記ストークス光を透過させる透明板と、
前記分析対象および前記光源の間に配され、前記分析対象および前記透明板の境界に結ばれる焦点を有する第１の対物レンズと、
前記分析対象および前記透明板を挟んで前記第１の対物レンズに対向して配置され、前記分析対象および前記透明板の境界に結ばれた焦点を有し、前記第１の対物レンズの開口数と異なる開口数を有する第２の対物レンズと、
前記分析対象および前記透明板で発生した散乱光を、前記第２の対物レンズを通じて受光する分光器と
を備える光学分析装置。
前記第１の対物レンズの開口数が、前記第２の対物レンズの開口数よりも大きい請求項１に記載の光学分析装置。
前記透明板が、前記ポンプ光およびストークス光に対してコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を生じない材料で形成される請求項１または２に記載の光学分析装置。
前記透明板がガラス板である請求項３に記載の光学分析装置。
前記第１の対物レンズの開口数および前記第２の対物レンズの開口数が、前記ポンプ光および前記ストークス光を照射した場合に、前記分析対象において発生した散乱光の位相と前記透明板で発生した散乱光の位相との差２θ_Ｆが、下記の式（１）に示す条件を満たすように選択されている請求項１から４のいずれか一項に記載の光学分析装置。
６５°≦２θ_Ｆ≦１１５° ・・・（１）
分析対象をポンプ光およびストークス光に対して透明な透明板に支持させ、
第１の開口数を有して前記分析対象および前記透明板の境界に焦点を結ぶ第１の対物レンズを通じて、前記ポンプ光および前記ストークス光を前記分析対象および前記透明板に照射し、
前記第１の対物レンズに対向して配置され、前記第１の対物レンズの開口数と異なる開口数を有し、前記分析対象および前記透明板の境界に焦点を結ぶ第２の対物レンズを通じて、前記分析対象および前記透明板で発生した散乱光を分光器で受光する
光学分析方法。