JP2021052703A - アミノ酸の測定方法、及びそのためのキット - Google Patents

Abstract

【課題】アミノ酸、好ましくはアスパラギン酸、又はアラニンを一つの試験管内で連続して反応させることによって精度良く測定する方法を提供する。
【解決手段】下記（Ａ）及び（Ｂ）を含有する、試料中のアスパラギン酸、又はアラニンを測定するためのキットおよび方法を開示する。（Ａ）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、及びカタラーゼを含む、反応液Ｉ、（Ｂ）アスパラギン酸トランスアミナーゼ、又はアラニントランスアミナーゼ、及びカタラーゼ失活剤を含む反応液ＩＩ、ただし、反応液Ｉ及びＩＩは、いずれか一方がカプラー化合物を含み、他方が新トリンダー試薬を含む。また、いずれか一方がペルオキシダーゼを含み、かつ、いずれか一方がα−ケトグルタル酸を含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、アスパラギン酸、又はアラニンの測定のための方法、及びそのためのキットに関する。本発明の方法及びキットは、生体由来の試料や食品中のアスパラギン酸、又はアラニンを定量するのに適している。

従来、アミノ酸の測定方法としては、アミノ酸分析計などの高速液体クロマトグラフィーを用いる方法や、酵素を利用した方法が利用されてきた。高速液体クロマトグラフィーで分析する方法は、正確に測定することが可能である一方で、機器が非常に高価であり又機器の操作に専門的な注意が必要になることから、果実・野菜の栽培現場や各種の食品加工の製造現場で、特別な技術を持たない人が安価に簡便に測定するためには向いていない。

酵素を利用したアミノ酸の測定方法としては、各種の脱水素酵素や脱炭酸酵素を利用した方法が知られている。またアミノ酸転移酵素（トランスアミナーゼ）を利用した方法としては、試料中のＧＡＢＡに対してＧＡＢＡトランスアミナーゼを作用させてＬ−グルタミン酸とし、次にこの反応液に含まれるＬ−グルタミン酸を別途購入したＬ−グルタミン酸測定キットで測定してからＧＡＢＡの定量値を算出する方法（特許文献１）が知られている。しかし、この方法は同一試験管内で行う、一つの連続的なＧＡＢＡの測定キットとして成立しておらず、また試料中に共存するＬ−グルタミン酸を除去できないために、別途市販のキットによりＬ−グルタミン酸だけを測定して差し引かなければならない。また、この方法では、多くの食品試料中に含まれるアスコルビン酸及びエリソルビン酸の還元力による色素の退色作用を排除する工程が無く、実際のトマトや加工食品などの測定では大きな誤差が生じる可能性が高い。さらに、この方法ではＧＡＢＡからＬ−グルタミン酸への変換反応が完了していないため、検量線は曲線となっており、ＧＡＢＡのエンドポイント法による測定方法ではない。測定試薬の安定性の記載も無い。

また別の酵素法として、試料中のＧＡＢＡに対してＧＡＢＡトランスアミナーゼを作用させて、生成するコハク酸セミアルデヒドに、ＧＡＢＡトランスアミナーゼと共存する脱水素酵素を作用させる過程で、添加した補酵素の酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（ＮＡＤＰ）を還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（ＮＡＤＰＨ）とし、この生成したＮＡＤＰＨによりテトラゾリウム塩存在下で電子伝達体を作用させて、生成するホルマザン色素を測定する方法（特許文献２）があるが、補酵素と脱水素酵素が非常に不安定であり、試薬溶液の成分として強い刺激性のある２−メルカプトエタノールを使用している。さらに、この方法は、反応の途中で反応停止液を添加していることから、エンドポイント法による測定ではなく、一定時間内の反応増加量を測定する、いわゆるレイト法と言える。また、反応停止液に危険物である１Ｍ硫酸を使用していることから、安全に使用することができる測定キットを構築できていない。

ＧＡＢＡの測定のためには、他にも固定化酵素を使用した蛍光分析法があるが、前述のＮＡＤＰからホルマザン色素を導いて測定する方法と同様に、ＮＡＤＰＨが直接的に反応に関与している。ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨは試料中に共存する各種酸化還元酵素の補酵素として働く可能性があり、目的とするＧＡＢＡの測定に誤差を与える可能性がある。さらに、ＮＡＤＰやＮＡＤＰＨは不安定な物質であることから、酵素反応に細心の注意が必要であり、結果としてこれらのＮＡＤＰやＮＡＤＰＨが測定の工程に含まれる方法では、安定で使いやすいＧＡＢＡ測定キットを提供することは難しい。

なお、前述の酵素法によるＧＡＢＡ測定は、いずれもハロゲンランプあるいはキセノンランプ等を光源とする吸光度計により、特定波長での吸光度を測定する方法となっている。純緑色ＬＥＤ光源とフォトトランジスタ受光部を組み合わせた簡易比色計により、呈色度と電圧値との関係式を求め、これをＧＡＢＡの簡易測定へ応用した例は全く知られていない。

一方で、アスコルビン酸を含む試料であっても、アスコルビン酸を除去しつつＬ−グルタミン酸濃度を測定することができるキット（特許文献３）、Ｌ−グルタミン酸を除去しつつＬ−グルタミンを測定することができるキット（特許文献４）が開発されている。

特開２０１１−１３０６８８号公報 国際公開ＷＯ２００９／１２８４６１（特許第５４１３７８１号） 特開２０１７−１２１６９号公報 特開２０１５−２０４８２５号公報 特願２０１８−１４３８８３号（本出願時には未公開）

本発明が解決すべき課題は、アミノ酸、特にＧＡＢＡ、アスパラギン酸、又はアラニンを簡易な方法によって精度よく測定することである。また、本発明の別の課題は、Ｌ−グルタミン酸及びアスコルビン酸又はエリソルビン酸を含む試料であっても、一つの試験管内で連続して行う反応工程により、Ｌ−グルタミン酸及びアスコルビン酸又はエリソルビン酸を除去しつつ、アミノ酸をエンドポイント法によって測定することができ、室温で長期保存できる液体状の反応試薬を用いる測定キットを提供することである。

上記の課題を解決すべく、第一段階の反応工程において、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼにより試料中に共存するＬ−グルタミン酸を分解して過酸化水素を生じせしめると同時に、この過酸化水素をカタラーゼで分解して水にすることにより、試料に共存するＬ−グルタミン酸の影響を除去した。さらに、食品試料中に含まれることが多いアスコルビン酸又はエリソルビン酸の還元力による発色の退色作用を排除するため、上記第一段階の反応工程において、アスコルビン酸オキシダーゼを加えることにより、アスコルビン酸又はエリソルビン酸を分解した。

また、本発明者は、ＧＡＢＡの測定に際しては、次の第二段階の反応工程においては、第一段階の反応工程と同じ試験管内で、ＧＡＢＡトランスアミナーゼにより検体中のＧＡＢＡからＬ−グルタミン酸生じせしめるとともに、第一段階の反応工程から移行したＬ−グルタミン酸オキシダーゼによって、このＬ−グルタミン酸を分解してＧＡＢＡトランスアミナーゼの基質となるαーケトグルタル酸を生成させる一種の酵素サイクルを回すことにより、結果的にＧＡＢＡと等モルの過酸化水素を生じせしめた。さらにこの過酸化水素を、新トリンダー試薬及びカプラー化合物ならびにペルオキシダーゼの反応によって発色を生じせしめた。また、同一試験管内で連続する第二段階の反応工程で、ＧＡＢＡと等モル生成した過酸化水素が、第一段階から移行してきたカタラーゼによって分解しないように、カタラーゼ失活剤を存在させることにより、完全にカタラーゼを失活させた。この第二段階の発色反応は、室温又は３０℃で１０分〜３０分間放置することにより停止することが分かった。すなわち、発色による吸光度の上昇はエンドポイントに到達し、到達後３０分間は低下のない安定な状態を維持し、反応液の吸光度が安定化することを見出した。

さらに詳細な検討を行うことにより、発明者は、下記（ｉ）及び（ｉｉ）を含むＧＡＢＡ測定キットにおいて、反応液ＩにＬ−グルタミン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、カプラー化合物及び防腐剤を含み、反応液ＩＩにＧＡＢＡトランスアミナーゼ、ＧＡＢＡトランスアミナーゼの安定化に寄与する補酵素ピリドキサールリン酸、新トリンダー試薬、α−ケトグルタル酸及びカタラーゼ失活剤を含み、酵素を含む各種試薬を２つの反応試薬溶液として液体状態で保存した場合に、保存時間経過に伴う試薬ブランク吸光度の上昇が抑制され、かつ発色反応が短時間でエンドポイントに到達することができ、しかも２８℃で長期間安定した測定値を提供できるような、酵素試薬を溶液の形で使用するＧＡＢＡ測定キットが製造・使用できることを見出した。

また、下記（ｉｉｉ）、（ｉｖ）を含む測定キットにおいても、上記の（ｉ）及び（ｉｉ）を含むＧＡＢＡ測定キットと同等のＧＡＢＡ測定キットが製造・使用できることを見出した。

（ｉ）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン及び防腐剤を含む反応液Ｉ、
（ｉｉ）ＧＡＢＡトランスアミナーゼ、新トリンダー試薬、α−ケトグルタル酸、ピリドキサールリン酸及びカタラーゼ失活剤を含む反応液ＩＩ、
（ｉｉｉ）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、α−ケトグルタル酸、４−アミノアンチピリン及び防腐剤を含む反応液Ｉ、
（ｉｖ）ＧＡＢＡトランスアミナーゼ、新トリンダー試薬、ピリドキサールリン酸及びカタラーゼ失活剤を含む反応液ＩＩ。

また、上記のＧＡＢＡの測定方法（特許文献５）は、他のアミノ酸、例えばアスパラギン酸、又はアラニンにも応用できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］ 下記（Ａ）及び（Ｂ）を含有する、試料中のアスパラギン酸、又はアラニンを測定するためのキット：
（Ａ）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、及びカタラーゼを含む、反応液Ｉ
（Ｂ）アスパラギン酸トランスアミナーゼ、又はアラニントランスアミナーゼ、及びカタラーゼ失活剤を含む反応液ＩＩ
ただし、反応液Ｉ及びＩＩは、下記も満たす：
・いずれか一方がカプラー化合物を含み、他方が新トリンダー試薬を含み、
・いずれか一方がペルオキシダーゼを含み；かつ
・いずれか一方がα−ケトグルタル酸を含む。
［２］ 反応液ＩＩが、さらにピリドキサールリン酸を含む、１に記載のキット。
［３］ カプラー化合物が、４−アミノアンチピリンである、１又は２に記載のキット。
［４］ 新トリンダー試薬が、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）、又はＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）である、１〜３のいずれか１項に記載のキット。
［５］ 反応液Ｉが、カプラー化合物を含み、反応液ＩＩが新トリンダー試薬を含み、かつ反応液Ｉがペルオキシダーゼを含む、１〜４のいずれか１項に記載のキット。
［６］ 下記（１）、及び（２）を含む、試料中のアスパラギン酸、又はアラニンを測定する方法：
（１）容器内で、試料中のＬ−グルタミン酸に、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、及びカタラーゼを作用させ、Ｌ−グルタミン酸を分解し、かつ試料中のアスコルビン酸又はエリソルビン酸に、アスコルビン酸オキシダーゼを作用させ、アスコルビン酸又はエリソルビン酸を分解する工程
（２）（１）に続いて同じ容器内で行われる工程であって、該カタラーゼに、カタラーゼ失活剤を作用させ、カタラーゼを失活させ、かつ試料中のアスパラギン酸、又はアラニンに、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カプラー化合物、及び新トリンダー試薬存在下で、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、又はアラニントランスアミナーゼを作用させ、Ｌ−グルタミン酸を生成し、生成したＬ−グルタミン酸に、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カプラー化合物、及び新トリンダー試薬を作用させ、色素を形成させる工程。
［７］ （１）及び（２）の工程が、２５〜４０℃で行われる。６に記載の方法。
［８］ （２）において、試料中のアスパラギン酸、又はアラニンが完全に消費される、６又は７に記載の方法。
［９］ ６〜８のいずれか１項に記載の方法を実施するための、１〜５のいずれか１項に定義した反応液I及び反応液II、並びに生じた色素の量を測定するためのＬＥＤ光源を用いた装置を含む、キット。

本発明のキットは、反応停止剤を用いることなく同一試験管内で連続して反応を行うエンドポイント法によって、アミノ酸を簡便かつ精度よく測定することができる。また、試料中にＬ−グルタミン酸やアスコルビン酸又はエリソルビン酸が含まれているものであっても、これらの影響を完全に除去して、精度よくアミノ酸を測定することができる。さらに、複数の酵素を液体試薬として供給しているものであるため、酵素が凍結乾燥品として提供されている場合に見られる溶解時の泡立ち等の課題が解決されており、かつ長期間の時間経過に伴う発色剤の自然着色や、酵素の失活による測定試薬自体の不安定化が軽減され、当該反応液Ｉ及び反応液ＩＩを安定な状態で保管することができる。加えて、エンドポイント法による測定が可能になったことによって、硫酸、塩酸あるいはトリクロロ酢酸等の危険物を反応停止剤として使用する必要がなく、測定者の安全が確保されるという長所がある。

Ｌ−グルタミン酸及びアスコルビン酸共存下での対象アミノ酸の測定。Ｌ−Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸、Ａｓｃ：アスコルビン酸、Ｌ−Ａｓｐ：アスパラギン酸、Ｌ−Ａｌａ：アラニン、ＧＬＯＤ：Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、ＡＳＯＤ：アスコルビン酸オキシダーゼ、ＣＡＴ：カタラーゼ、ＯｘｄＡｓｃ：酸化型アスコルビン酸、Ｌ−Ａｓｐ／Ｌ−Ａｌａ−Ｔ：アスパラギン酸／アラニントランスアミナーゼ、ＰＬＰ：ピリドキサールリン酸、α−ＫＧ：α−ケトグルタル酸、ＰＯＤ：ペルオキシダーゼ、４−ＡＡ：４−アミノアンチピリン、ＴＯＯＳ：Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩 吸光度のタイムコース ＧＡＢＡ検量線 ＧＡＢＡ測定における共存するアスコルビン酸の影響 ＧＡＢＡ測定における共存するＬ−グルタミン酸の影響 ＧＡＢＡ検量線 吸光度のタイムコース Ｌ−アスパラギン酸検量線

（アミノ酸測定キット）
本発明は、下記（Ａ）及び（Ｂ）を含有する、試料中の対象アミノ酸を測定するためのキットを提供する：
（Ａ）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、及びカタラーゼを含む、反応液Ｉ
（Ｂ）対象アミノ酸に特異的なトランスアミナーゼ、及びカタラーゼ失活剤を含む反応液ＩＩ
ただし、反応液Ｉ及びＩＩは、下記も満たす：
・いずれか一方がカプラー化合物を含み、他方が新トリンダー試薬を含み、
・いずれか一方がペルオキシダーゼを含み；かつ
・いずれか一方がα−ケトグルタル酸を含む。

反応液Ｉは、さらに防腐剤を含んでもよい。反応液ＩＩは、トランスアミナーゼの補酵素であるピリドキサールリン酸を酵素の安定化のためにさらに含んでもよい。特に好ましい態様の一つは、反応液Ｉが、カプラー化合物を含み、反応液ＩＩが新トリンダー試薬を含み、かつ反応液Ｉがペルオキシダーゼを含むものである。

すなわち、本発明のアミノ酸測定キットは、下記（ｉ）及び（ｉｉ）の試薬構成、 又は（ｉｉｉ）及び（ｖｉ）の試薬構成とすることができる。
（ｉ）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、及びカプラー化合物、及び防腐剤を含む、反応液Ｉ、
（ｉｉ）対象アミノ酸に特異的なトランスアミナーゼ、ピリドキサールリン酸、新トリンダー試薬、α−ケトグルタル酸、カタラーゼ失活剤を含む、反応液ＩＩ。
（ｉｉｉ）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、カプラー化合物、α−ケトグルタル酸、及び防腐剤を含む、反応液Ｉ、
（ｉｖ）対象アミノ酸に特異的なトランスアミナーゼ、ピリドキサールリン酸、新トリンダー試薬、及びカタラーゼ失活剤を含む反応液ＩＩ。

本発明の方法は、対象アミノ酸に特異的に作用し、対象アミノ酸からα−グルタル酸へアミノ基を転移してＬ−グルタミン酸を生じる反応を触媒するトランスアミナーゼが入手可能な、種々のアミノ酸に適用することができる。本発明は特に、特異性の高いトランスアミナーゼが入手可能なアミノ酸に適用するのに適している。このような対象アミノ酸の特に好ましい例は、ＧＡＢＡ、アラニン、およびアスパラギン酸である。なお、以下では、対象アミノ酸のうち、ＧＡＢＡを例に説明することがあるが、当業者であれば、その説明に準じて、アラニン、アスパラギン酸、及びその他の対象アミノ酸の場合も理解することができる。なお、特定のアミノ酸Ａに特異的なトランスアミナーゼを、Ａトランスアミナーゼと表す。例えば、ＧＡＢＡに特異的なトランスアミナーゼは、ＧＡＢＡトランスアミナーゼと表し、アラニンに特異的なトランスアミナーゼは、アラニントランスアミナーゼと表し、アスパラギン酸に特異的なトランスアミナーゼは、アスパラギン酸トランスアミナーゼと表す。

本発明で使用するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及び対象アミノ酸に特異的なトランスアミナーゼは、公知のものを利用することができる。
具体的には、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． Ｘ−１１９−６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｎｄｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｚ−１１−６、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ などの微生物由来のＬ−グルタミン酸オキシダーゼを挙げることができる。
ペルオキシダーゼとして西洋わさび由来のペルオキシダーゼを挙げることができる。
アスコルビン酸オキシダーゼとしては、カボチャ、キュウリ由来のアスコルビン酸オキシダーゼを挙げることができる。
カタラーゼとしては、ウシ肝臓由来カタラーゼの他に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒなどの微生物由来のカタラーゼを挙げることができる。

また、ＧＡＢＡトランスアミナーゼとしては、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｏｙｏｎａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｃｏｙｉｃｕｓなどの微生物由来のＧＡＢＡトランスアミナーゼを挙げることができる。

また、アスパラギン酸トランスアミナーゼとしては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓなどの微生物由来のアスパラギン酸トランスアミナーゼを挙げることができる。

また、アラニントランスアミラーゼとしては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ、Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｏｎｇｗｏｏｄｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ｓｐ．Ｋ２１１５、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの微生物由来のアラニントランスアミラーゼを挙げることができる。

また、本発明で使用する新トリンダー試薬としては、発色試薬として公知のものを使用することができ、例えばＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）などを利用することが可能である。中でも、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）のいずれかを用いるのが好ましく、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）を用いるのがより好ましい。

本発明で使用するカプラー化合物としては、新トリンダー試薬との組み合わせで発色を生じる化合物として任意のものを用いればよく、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）、アミノジフェニルアミン−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−５−ピラゾロン（ＣＰ２−４）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン又はその誘導体などを用いることができる。中でも、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）を用いるのが好ましい。

本発明で使用する反応液Ｉは、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、ぺルオキシダーゼ、カプラー化合物及び防腐剤を含有する。また、α−ケトグルタル酸が反応液ＩＩに含まれない場合においては、反応液Ｉにα−ケトグルタル酸を含む。反応液Ｉに上記酵素及びカプラー化合物等を含有させる液としては、各種緩衝液を利用することができる。緩衝液としては、酢酸、リン酸、クエン酸、ホウ酸、トリスアミノメタン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−トリス、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ及びこれらの塩などを利用することができる。本発明において、反応液Ｉは、新トリンダー試薬を含まないようにすることができる。本発明において、反応液Ｉが「新トリンダー試薬を含まない」とは、反応液Ｉに実質的に新トリンダー試薬を含まないことを意味する。より具体的には、本発明において、語句「新トリンダー試薬を含まない反応液Ｉ」には、新トリンダー試薬を全く含まない反応液Ｉだけでなく、本発明の効果を棄損しない限度でごく微量の新トリンダー試薬を含む反応液Ｉも包含される。

反応液Ｉにおける緩衝液等への各酵素及びカプラー化合物等の含有量としては、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ０．２〜２Ｕ／ｍＬ、アスコルビン酸オキシダーゼ５〜３０Ｕ／ｍＬ、カタラーゼ５００〜２，０００Ｕ／ｍＬ、ペルオキシダーゼ５〜２０Ｕ／ｍＬ、カプラー化合物０．２〜１．２μｍｏｌ／ｍＬの範囲にあることが好ましく、特にＬ−グルタミン酸オキシダーゼ０．４〜１．０Ｕ／ｍＬ、アスコルビン酸オキシダーゼ１０〜２０Ｕ／ｍＬ、カタラーゼ１０００〜１，５００Ｕ／ｍＬ、ペルオキシダーゼ１０〜１５Ｕ／ｍＬ、カプラー化合物０．４〜０．８μｍｏｌ／ｍＬの範囲にあることがより好ましい。また、防腐剤を含む場合、防腐剤としてはプロクリン３００の溶液を２０００倍希釈になるように添加することが好ましい。なお、α−ケトグルタル酸が反応液ＩＩに含まれない場合においては、反応液Ｉにα−ケトグルタル酸１〜６μｍｏｌ／ｍＬを含み、特にα−ケトグルタル酸２〜３μｍｏｌ／ｍＬの濃度が好ましい。

次に本発明で使用する反応液ＩＩは、対象アミノ酸に特異的なトランスアミナーゼ、ピリドキサールリン酸、新トリンダー試薬及びカタラーゼ失活剤を含有する。また、α−ケトグルタル酸を反応液Ｉに添加しない場合は、上記の反応液ＩＩにα−ケトグルタル酸を含む。上記酵素、ピリドキサールリン酸、新トリンダー試薬、α−ケトグルタル酸及びカタラーゼ失活剤を含有させる液としては、各種緩衝液を利用することができる。緩衝液の例としては、酢酸、リン酸、クエン酸、ホウ酸、トリスアミノメタン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−トリス、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ及びこれらの塩などを利用することができる。本発明において、反応液ＩＩは、カプラー化合物を含まないことが好ましい。本発明において、反応液ＩＩが「カプラー化合物を含まない」とは、反応液ＩＩに実質的にカプラー化合物を含まないことを意味する。より具体的には、本発明において、語句「カプラー化合物を含まない反応液ＩＩ」には、カプラー化合物を全く含まない反応液ＩＩだけでなく、本発明の効果を棄損しない限度でごく微量のカプラー化合物を含む反応液ＩＩも包含される。

カタラーゼ失活剤としては、カタラーゼを速やかに失活させる作用を有する物質であれば任意のものを用いればよく、例えばアジ化ナトリウムや３−アミノ−１，２，４−トリアゾールなどを用いることができる。

反応液ＩＩにおける緩衝液への酵素、新トリンダー試薬、ピリドキサールリン酸及びカタラーゼ失活剤の含有量は、ＧＡＢＡ測定のためには、ＧＡＢＡトランスアミナーゼ１．５〜１０Ｕ／ｍＬ、ピリドキサールリン酸１〜３μｍｏｌ／ｍＬ、新トリンダー試薬０．２〜１．２μｍｏｌ／ｍＬ、カタラーゼ失活剤０．０１〜０．１％の範囲にあることが好ましく、特にＧＡＢＡトランスアミナーゼ２〜４Ｕ／ｍＬ、ピリドキサールリン酸１．５〜２．５μｍｏｌ／ｍＬ、新トリンダー試薬０．４〜０．８μｍｏｌ／ｍＬ、カタラーゼ失活剤０．０５〜０．０９％の範囲にあることが好ましい。なお、α−ケトグルタル酸が反応液Ｉに含まれない場合においては、反応液ＩＩにα−ケトグルタル酸１〜６μｍｏｌ／ｍＬを含み、特にα−ケトグルタル酸２〜３μｍｏｌ／ｍＬの濃度が好ましい。アスパラギン酸、又はアラニンの測定の場合には、反応液ＩＩにおいて上述のＧＡＢＡトランスアミナーゼに代えて、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、又はアラニントランスアミナーゼを用いればよく、またそれぞれの成分の含有量は、当業者であれば、ＧＡＢＡ測定の場合に準じて適宜設計できる。

本発明で使用する反応液Ｉに使用する防腐剤としては、プロクリン３００、プロクリン９５０、クロラムフェニコールなど公知のものを用いることができる。なお、反応液ＩＩには防腐効果のあるカタラーゼ失活剤が含まれていることから、反応液ＩＩへの防腐剤の添加はなくてもよい。

本発明のキットには、上記反応液Ｉ及び反応液ＩＩのほかに、試料、対象アミノ酸標準液、反応液Ｉ及び反応液ＩＩの採取用スポイト、ＬＥＤを光源とする簡易比色計と測定のためのプラスティック製セル等を添付することもできる。

本発明のアミノ酸測定キットは、酵素を溶液状態で保存することができる。具体的には、ＧＡＢＡ測定のための好ましい実施形態において、本発明のキットは、冷蔵庫又は２８℃の恒温器で４週間保管した反応液Ｉ及び反応液ＩＩをこの順にＧＡＢＡを５０ｍｇ／Ｌ又は１００ｍｇ／Ｌの濃度で含む検体溶液に添加したときの吸光度と、保管０日目の反応液Ｉ及び反応液ＩＩをこの順に前記溶液と同一のＧＡＢＡ溶液に添加した吸光度との差が、±５％以内という安定性を有する。アスパラギン酸、又はアラニンの測定キットの場合も同様である。

本発明のキットによる試料中のアミノ酸を測定する反応は、下記の工程で表される。
（１）容器内で、試料中のＬ−グルタミン酸に、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、及びカタラーゼを作用させ、Ｌ−グルタミン酸を分解し、かつ試料中のアスコルビン酸又はエリソルビン酸に、アスコルビン酸オキシダーゼを作用させ、アスコルビン酸又はエリソルビン酸を分解する工程；
（２）（１）に続いて同じ容器内で行われる工程であって、該カタラーゼに、カタラーゼ失活剤を作用させ、カタラーゼを失活させ、かつ試料中の対象アミノ酸に、トランスアミナーゼを作用させ、Ｌ−グルタミン酸を生成し、生成したＬ−グルタミン酸に、Ｌグルタミン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カプラー化合物、及び新トリンダー試薬を作用させ、色素を形成させる工程。なお、トランスアミナーゼの反応により、対象アミノ酸がＧＡＢＡである場合はコハク酸セミアルデヒドが、アラニンの場合はピルビン酸が、アスパラギン酸の場合はオキサロ酢酸が生成する。

好ましい態様において、上記の工程（１）及び（２）の少なくともいずれか一方の工程、好ましくは双方の工程は、２５〜４０℃で行われる。また工程（２）は、試料中の対象アミノ酸が完全に消費されるように実施されることが好ましい。

本発明では、対象アミノ酸を測定するため、まず試料に反応液Ｉを添加する。試料中に内在性のＬ−グルタミン酸及びアスコルビン酸又はエリソルビン酸が存在する場合、当該工程によりこれを除去する。当該反応条件は、使用する酵素の至適ｐＨ及び酵素反応が効率的に進む温度に従って設定すればよいが、おおむね、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、温度２５℃〜４０℃の条件下で、１０分〜２０分ほど反応を実施すればよい。

上記反応液Ｉによる反応が十分に進行した後、反応液ＩＩを添加することにより、対象アミノ酸をＬ−グルタミン酸に変換させ、さらにこれを反応液Ｉから移行したＬ−グルタミン酸オキシダーゼにより分解し、過酸化水素を生じせしめ、当該過酸化水素と発色剤、ペルオキシダーゼを反応させることにより発色を生じる。この第２段階の反応時、第１段階の反応液Ｉから移行したカタラーゼは、反応液ＩＩに含まれているカタラーゼ失活剤により完全に失活しているので、カタラーゼによる発色反応の阻害は起きない。当該反応条件は、使用する酵素の至適ｐＨ及び酵素反応が効率的に進む温度に従って設定すればよいが、おおむね、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０、温度２５℃〜４０℃の条件下で、１０分〜３０分ほど反応を実施すればよい。

上記反応液Ｉ及び反応液ＩＩによる反応は、一つの試験管内で連続して進行した後、反応は終了してエンドポイントに到達して停止する。結果として、対象アミノ酸の量に比例した色素が生成する。最後に生じた発色の程度を、ごく一般的な手法としては、ハロゲンランプあるいはキセノンランプ等の光源を用いた吸光度計により、特定波長の吸光度を測定して対象アミノ酸濃度を算出することができる。別の新しい比色分析の手段として、特定範囲の波長のＬＥＤを光源とし、受光部にフォトトランジスター等を用いる簡易比色計で、発色の程度を電気信号（例えば、電圧値）として測定して、試料中の対象アミノ酸濃度を算出することもできる。これらの発色を測定する光源の波長は用いる発色剤の種類に応じて選択すればよい。

（用途、その他）
本発明による測定対象となる試料としては、対象アミノ酸を含有することが予想されるものであれば、特に限定されない。具体的には、トマトや玄米などの農産物、酒やビールなどの酒類、食品原料、加工食品、細胞又は微生物等の培養液、生化学実験試料及び組織抽出物等の生体試料等を挙げることができる。

本発明において、ハロゲンランプ等を光源とする一般的な吸光度計を用いる場合は、標準物質を用いた検量線を作成するため、標準溶液として濃度既知の対象アミノ酸溶液（３ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌの対象アミノ酸溶液）を用いて、発色液の吸光度を測定する。当該実施形態においては、試料の吸光度を測定した後は、試料の替わりに水を用いたブランクの吸光度を差し引き、正味の吸光度と濃度の関係を検量線として作成して、対象アミノ酸を算出することができる。

また、ＬＥＤを光源とし受光部にフォトトランジスターを用いる簡易比色計を使って発色の程度を電気信号（電圧値）として測定する場合は、濃度既知の対象アミノ酸溶液（例えば、２５ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／ＬのＧＡＢＡ溶液）を用いた発色の程度すなわち対象アミノ酸濃度とフォトトランジスターにより受光した光の量（電圧の対数値）との関係を検量線として得た後に、当該検量線をプログラムしたマイクロコンピューターを組み込んだ簡易比色計を作成することによって、試料中の対象アミノ酸濃度を簡便に測定することができる。特に、反応液ＩＩに含まれる新トリンダー試薬としてＴＯＯＳを用いた場合、生じた色素の吸収極大が５５５ｎｍであることから、光源として５５５ｎｍの純緑色ＬＥＤを用いた簡易比色計による測定が適している。

本発明においては、アミノ酸のトランスアミナーゼの反応に際して、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの反応、及びペルオキシダーゼの反応がカップリングされている。このような方法を提案するのは本願が初めてである。

３つの酵素反応をカップリングすることにより、いわゆるエンドポイント法による対象アミノ酸の測定が可能になる。すなわち、対象アミノ酸に対するＫｍ値がそれほど低くないトランスアミナーゼにより、対象アミノ酸とα−ケトグルタル酸が消費され、Ｌ−グルタミン酸が生成するが、この生成したＬ−グルタミン酸が、Ｋｍ値が小さくかつ活性の高いＬ−グルタミン酸オキシダーゼによって速やかに酸化分解されることにより、トランスアミナーゼの反応がより効率的にＬ−グルタミン酸を生成する方向へ進行すると考えられる。また、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの反応ではα−ケトグルタル酸が生成され、再びトランスアミナーゼの反応に利用される（図１参照）。そのため、最終的には、試料中のすべての対象アミノ酸が完全に分解され、試料中の対象アミノ酸全量に応じた量の色素が形成され、対象アミノ酸量と色素量（通常、吸光度として測定される。）との間に高い相関が得られる（後述の実施例、図３、及び図６参照）。

本願発明の測定方法により、エンドポイント法が達成できることは、反応のタイムコースによっても裏付けられる（後述の実施例、及び図２参照）。なお、前掲特許文献１に記載の方法は、図１に示された検量線が直線性に乏しいことから、ＧＡＢＡは完全に消費されておらず、エンドポイント法ではないと推測される。なお、酵素を用いたエンドポイントアッセイにおいて、エンドポイントに到達するまでの時間は、使用する酵素のＫｍ値が小さく、Ｖｍａｘが大きいほど短くなるとことが知られている。一般に、トランスアミナーゼのＫｍ値はエンドポイント法に好適であるＫｍ値とはいえない。例えば、前述の放線菌由来のＧＡＢＡ−ＴのＫｍは３ｍＭ以上である（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４６，１０１−１０６（１９８５）、要約参照）。

また、一般に、トランスアミナーゼの反応は可逆的である（酵素ハンドブック第３版、朝倉書店（２００８）、第４１４頁、ＥＣ２．６．１．１９参照）。そのため、従来はトランスアミナーゼを用いて対象アミノ酸のエンドポイント測定が達成できるとは考えられていなかった。

すなわち、トランスアミナーゼの反応、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの反応、及びペルオキシダーゼの反応をカップリングし、３つの酵素反応を同時に進行しうるものとする本願発明の構成は、新規かつ進歩性を有するものである。

以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないのは明らかである。

（実施例１）反応液Ｉ及び反応液ＩＩにおける酵素と各試薬の組み合わせ検討
発明者は、本発明と類似の「Ｌ−グルタミン測定キット」の発明（特許文献３）において、カプラー化合物と新トリンダー試薬の組み合わせを検討した結果、カプラー化合物と新トリンダー試薬を共存させることは、発色試薬の自然着色生じるとともに、反応液に含まれる酵素活性の低下をもたらすとの結果を得ている。また、本発明の特徴として、ＧＡＢＡトランスアミナーゼの基質であるα−ケトグルタル酸を反応液Ｉ又は反応液ＩＩへ添加する必要があるが、反応液Ｉによる第一段階の反応工程において、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼによって試料中に共存するＬ−グルタミン酸を除去する際のＬ−グルタミン酸から生成するα−ケトグルタル酸に加えて、ＧＡＢＡトランスアミナーゼの基質として比較的高濃度のα−ケトグルタル酸を反応液Ｉへ添加することは、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ反応のプロダクト阻害になる可能性も考えられる。従って、α−ケトグルタル酸は反応液ＩＩへの添加が好ましいと考えられるが、一方ではα−ケトグルタル酸とカプラー化合物又は新トリンダー試薬の共存による化学的反応あるいは各種酵素との共存によるブランク吸光度への影響など、予期しない現象が懸念される。そこで、下記表１に示す試験１〜８の各組成の反応液Ｉ及び反応液ＩＩを調製して、保存試験を実施した。なお、反応液Ｉ及び反応液ＩＩに添加する酵素の組み合わせは、第一段階の反応工程に必須な酵素反応、及び第二段階の反応工程との関連等を考慮し、アスコルビン酸オキシダーゼ、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ及びカタラーゼは反応液Ｉへ添加し、ＧＡＢＡトランスアミナーゼは反応液ＩＩへ添加した。また、ＧＡＢＡトランスアミナーゼを５０℃で３０分間熱処理した場合、ピリドキサールリン酸を共存させると残存酵素活性が無添加の場合よりも２倍以上高くなったことから、補酵素であるピリドキサールリン酸を安定化剤として反応液ＩＩへ添加した。

ペルオキシダーゼは発色反応を触媒することから、反応液ＩＩに添加することが常識的かつ妥当であるが、各種酵素と試薬を混合した場合の安定性は予測できないので、反応液Ｉへ添加した場合（試験５〜８）も試験した。各成分を溶解する緩衝液にはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を使用した。

表中「ＡＳＯＤ」はアスコルビン酸オキシダーゼ、「ＧＬＯＤ」はＬ−グルタミン酸オキシダーゼ、「ＣＡＴ」はカタラーゼ、「ＴＯＯＳ」はＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩、「Ｐｒｏｃｌｉｎ３００」はプロクリン３００、「ＧＡＢＡ−Ｔ」はγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ、「ＰＯＤ」はペルオキシダーゼ、「４−ＡＡ」は４−アミノアンチピリン、「α−ＫＧ」はα−ケトグルタル酸、「ＰＬＰ」はピリドキサールリン酸、「ＮａＮ₃」はアジ化ソーダを示す。

《保存方法》
調製した試験１〜８の各反応液Ｉ及び各反応液ＩＩを各々等量ずつポリプロピレン遠沈管に分注し、５℃〜８℃の冷蔵庫及び２８℃の恒温器で保存し、保存開始後０日目と４週目に、各反応試薬液を用いて標準ＧＡＢＡ溶液を検体として測定を実施することで、冷蔵庫保存及び２８℃保存での安定性を評価した。

《測定方法》
検体測定は、以下のような手順に従って実施した。まず、ガラス試験管に反応液Ｉを０．５ｍＬ、検体としてＧＡＢＡ濃度が５０ｍｇ／Ｌ又は１００ｍｇ／Ｌの試料０．０５ｍＬを入れ、３０℃で１０分間反応させた。その後、反応液ＩＩを０．５ｍＬ添加し、３０℃で２０分間反応させた。反応終了後、分光光度計で純水を対照として５５５ｎｍの吸光度を測定した。ブランクを差し引き、保存開始０日目の吸光度に対する保存開始４週間目の吸光度の％を算出した。

《結果及び考察》

測定結果を表２に示した。試験１〜８のいずれの場合でも、ブランクの吸光度は０．０２〜０．０３程度であり、冷蔵庫又は２８℃恒温器で４週間保存した後でも、ブランク吸光度の目立った上昇は無かった。試験１、試験２、試験５及び試験６の組み合わせの場合、４℃ではほぼ安定であったが、２８℃で４週間の保存ではＧＡＢＡ５０ｍｇ／Ｌの試料測定の場合は吸光度が５％以上低くなった。また、試験３及び試験４では、２８℃保存において吸光度が１０％程度も低下した。しかし、試験７及び試験８の組み合わせの場合だけは、すなわちペルオキシダーゼと４−アミノアンチピリンが反応液Ｉに含有された場合においてのみ、２８℃で４週間保存した後も、保存開始後０日目とほぼ同等の吸光度（９６％以上）が測定された。従って、反応液Ｉ及び反応液ＩＩの組成は、当業者の通念を超えて、ペルオキシダーゼとカプラー化合物が反応液Ｉに、新トリンダー試薬が反応液ＩＩに含有される試験７及び試験８の組み合わせが、最も安定であることが見出された。

（実施例２）各種新トリンダー試薬の検討
各種新トリンダー試薬の違いによる感度、安定性及び着色等の差を検討するため、新トリンダー試薬としては、下記表３に示す（１）〜（６）の新トリンダー試薬を、それぞれ０．８μモル／ｍＬとなるように実施例１試験８の反応液ＩＩに添加し、３７℃で１週間保管した。新トリンダー試薬としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）を用いた。

《測定》
ガラス試験管に反応液Ｉを０．５ｍＬ入れ、検体として表４に示す濃度の（ａ）〜（ｃ）のＧＡＢＡ溶液を０．０５ｍＬ添加し、３０℃で１０分間反応後、反応液ＩＩを０．５ｍＬ添加して、３０℃で２０分間反応させた。反応終了後、分光光度計で吸光度を測定した。測定波長は、各新トリンダー試薬に応じ、表３に示すとおりの波長とした。また、ブランクとして水を検体として吸光度を測定した。

《結果及び考察》
下記表５は、各新トリンダー試薬を用いて検体（ａ）〜（ｃ）を測定したときの吸光度の値を示す。いずれの新トリンダー試薬でも着色が無く、３７℃で１週間安定であり、ＧＡＢＡ測定キットに使用するのに適していた。とくにＴＯＯＳとＡＬＰＳは、感度良く測定できた。また、ＴＯＯＳを用いた場合は、測定波長が５５５ｎｍであることから、純緑色ＬＥＤ（波長５５５ｎｍ）を光源として用いる簡易比色計による測定にも最適であることが示唆された。

（実施例３）試料中に共存するＧＡＢＡ関連物質との測り分け
ＧＡＢＡはＬ−グルタミン酸からＬ−グルタミン酸脱炭酸酵素によって生成し、Ｌ−グルタミン酸はグルタミナーゼによってＬ−グルタミンから作られるルートの他にも、ＧＡＢＡトランスアミナーゼによってＧＡＢＡからも生成される。またＬ−グルタミン合成酵素によって、Ｌ−グルタミン酸からＬ−グルタミンが生成される。そこで、これらのアミノ酸が共存している検体試料での測り分け試験を実施した。

《測定方法》
本発明ＧＡＢＡ測定キット（実施例１試験８）、本発明者らが考案したＬ−グルタミン酸測定キット（特許文献３）及びＬ−グルタミン測定キット（特許文献４）の３種類の測定試薬キットを用いて、上記の三つのアミノ酸の単独溶液又は混合溶液を検体として５５５ｎｍの吸光度を測定した。なお、いずれの測定キットでも、各キットの反応液Ｉ及び反応液ＩＩは０．５ｍＬ、検体試料は０．０５ｍＬを使用し、各測定吸光度からブランク（水０．０５ｍＬを検体として使用）を差し引いた。

《結果及び考察》
下記の表６に示すように、本発明によるＧＡＢＡ測定キットはＧＡＢＡ溶液のみに反応して発色し、Ｌ−グルタミン酸やＬ−グルタミンには全く反応しないことが分かった。従って、本発明のＧＡＢＡ測定は、ＧＡＢＡに対して特異性の高い測定方法であることが証明された。

（実施例４）ＧＡＢＡ測定反応のエンドポイントの検討
本発明のＧＡＢＡ測定キットは、ＧＡＢＡから各種酵素反応によって最終的に色素を生成するが、一つの試験管内での連続的な反応によりＧＡＢＡから色素形成への転換反応が完全にエンドポイントに到達していることを確認するため、室温（２７℃〜２８℃）における発色のタイムコースを調べた。

《測定方法》
吸光度計（島津ＵＶｍｉｎｉ１２４０）用のセミミクロセルに、実施例１試験８の反応液Ｉ及び反応液ＩＩを各々０．５ｍＬ、計１．０ｍＬを入れ、０．０５ｍＬのＧＡＢＡ検体溶液を添加して反応を開始した。室温で４０分間、１分毎に吸光度を測定して発色反応のタイムコースを調べた。ＧＡＢＡ溶液は、濃度が１２．５ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌの各濃度の溶液を使用した。

《結果及び考察》
図２は、ＧＡＢＡの各濃度における吸光度のタイムコースを示す。添加したＧＡＢＡ溶液の濃度が１２．５ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌのいずれの場合も、ＧＡＢＡ濃度に依存して、吸光度は反応開始後約１０分〜２０分で一定になった。従って、本発明のＧＡＢＡ測定キットによる測定は、いわゆるエンドポイント法によるＧＡＢＡの酵素分析であることを示している。すなわち、ＧＡＢＡに対するＫｍ値がそれほど低くないＧＡＢＡトランスアミナーゼにより、検体中のＧＡＢＡ と反応液ＩＩに含まれるα−ケトグルタル酸からＬ−グルタミン酸が生成するが、この生成Ｌ−グルタミン酸が、Ｋｍ値が小さく活性の高いＬ−グルタミン酸オキシダーゼによって、速やかに酸化分解されることにより、ＧＡＢＡトランスアミナーゼの反応がより効率的にＬ−グルタミン酸生成の方向へ進行すると考えられる（図１参照）。また、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ反応によって生成するα−ケトグルタル酸は、再びＧＡＢＡトランスアミナーゼ反応に利用される。最終的には、検体中のすべてのＧＡＢＡが完全に分解され、検体中のＧＡＢＡ量と５５５ｎｍの吸光度とは、非常に高い相関関係が成立することになる。この連続的な一種の酵素サイクル反応によって、ＧＡＢＡのエンドポイント法による検量線は直線となり、簡便な酵素分析が可能であることが示唆された。

（実施例５）ＧＡＢＡの検量線（フォトメーターによる５５５ｎｍの吸光度測定）
本発明の反応液Ｉ及び反応液ＩＩ（新トリンダー試薬はＴＯＯＳ）を用いて、ＧＡＢＡ濃度と５５５ｎｍの吸光度による検量線を作成した。
《測定方法》
ＧＡＢＡの濃度が６．２５ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌの各濃度の溶液を検体として検量線を作成した。なお、測定は、以下のような手順に従って実施した。まず、ガラス試験管に反応液Ｉを０．５ｍＬ入れ、検体として各濃度のＧＡＢＡ溶液を０．０５ｍＬ添加し、３０℃で１０分間反応置後、反応液ＩＩを０．５ｍＬ添加して、さらに２０分間反応させた。反応終了後、分光光度計で５５５ｎｍの吸光度を測定した。また、ブランクとして水を検体として吸光度を測定した。検量線はブランクを引いた値で作成した。

《結果及び考察》
ＧＡＢＡの濃度と５５５ｎｍの吸光度との関係は、図３に示すように相関係数１．０の直線となり、エンドポイント法によるＧＡＢＡの定量が初めて可能となった。

（実施例６）試料中に共存するアスコルビン酸の影響の除去
検体試料中に、ＧＡＢＡと共にアスコルビン酸又はその異性体であるエリソルビン酸が存在した場合、アスコルビン酸又はエリソルビン酸の還元力による発色抑制あるいは減色の影響が考えられる。そこで、ＧＡＢＡとアスコルビン酸又はその異性体であるエリソルビン酸が共存した場合の発色液の吸光度変化を検討した。

《測定方法》
ＧＡＢＡの濃度が１００ｍｇ／Ｌの水溶液に、アスコルビン酸又はその異性体であるエリソルビン酸を５０ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌになるように添加して検体を調製した。測定は以下のように実施した。プラスティック製のディスポーザルセルに反応液Ｉ（実施例１試験８）を０．５ｍＬ入れ、各濃度のアスコルビン酸又はその異性体であるエリソルビン酸とＧＡＢＡ１００ｍｇ／Ｌを含む検体を０．０５ｍＬ添加し、室温（２６℃〜２８℃）で１０分間放置後、反応液ＩＩ（実施例１試験８）を０．５ｍＬ添加して、室温で２０分間反応させた。反応終了後、５５５ｎｍの吸光度を測定して、アスコルビン酸又はその異性体であるエリソルビン酸が無添加のときの吸光度を１００％として、吸光度の変化を測定した。

《結果及び考察》
以下の図４に示すように、試料中にアスコルビン酸がＧＡＢＡの５倍の濃度で共存している場合においても、本発明の測定キットによるＧＡＢＡ測定値は影響を受けないことが判明した。また、エリソルビン酸の場合も図５と同様になり、影響を受けない結果を得た。

（実施例７）試料中に共存するＬ−グルタミン酸濃度による影響
食品試料中には、ＧＡＢＡとＧＡＢＡを生成する母体物質であるＬ−グルタミン酸が多量に共存している場合が多い。実施例３の結果から、ＧＡＢＡと共に１００ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン酸存在した場合においても、ＧＡＢＡの測定値は影響を受けないことが明らかになっているが、さらに高濃度のＬ−グルタミン酸の共存による発色液の吸光度の変化を検討した。

《測定方法》
ＧＡＢＡの濃度が１００ｍｇ／Ｌの水溶液に、Ｌ−グルタミン酸を５０ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌになるように添加して検体を調製した。測定は以下のように実施した。プラスティック製のディスポーザルセルに０．５ｍＬの反応液Ｉ（実施例１試験８）を入れ、各濃度のＬ−グルタミン酸とＧＡＢＡ１００ｍｇ／Ｌを含む検体を０．０５ｍＬ添加し、室温（２７℃〜２９℃）で１０分間放置後、反応液ＩＩ（実施例１試験８）を０．５ｍＬ添加して２０分間室温で反応させた。反応終了後、５５５ｎｍの吸光度を測定して、Ｌ−グルタミン酸が無添加のときの吸光度を１００％として、吸光度の変化をグラフ（図５）に示した。

《結果及び考察》
以下の図５に示すように、試料中にＬ−グルタミン酸がＧＡＢＡの５倍の濃度で共存している場合においても、本発明の測定キットによるＧＡＢＡ測定値は全く影響を受けないことが判明した。

（実施例８）トマトのＧＡＢＡを測定する場合の信頼性
トマトには、ＧＡＢＡ、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−グルタミンの、３種の関連アミノ酸が多く含まれていることが知られている。そこで、トマト抽出液中のＧＡＢＡを測定すると同時に、既知量の標準ＧＡＢＡをトマト抽出液に添加して、ＧＡＢＡ測定値の回収率実験を実施しすることにより、本発明によるＧＡＢＡ測定キットの信頼性を検討をした。

《測定方法》
本発明の反応液Ｉ及び反応液ＩＩを用いて、実施例１と同様に吸光度を測定することによりＧＡＢＡを測定した。トマトの抽出と測定は以下のように実施した。トマト２０ｇ〜３０ｇに対して、その１０倍量（Ｖ／Ｗ）の水を加え、ミキサーで１分間破砕した。このトマト抽出液を、コーヒーフィルターでろ過して被検液とした。各トマト抽出液に、ＧＡＢＡ５０ｍｇ／Ｌ分の濃度が増加するＧＡＢＡ量を添加し、添加相当分の加算されたＧＡＢＡ測定値が得られるかを検討した。

《結果及び考察》
以下の表７に示すように、トマトＡ及びトマトＢの抽出液について、ＧＡＢＡが測定可能であった。すなわち、最終的にトマト抽出液のＧＡＢＡ濃度が５０ｍｇ／Ｌ分増加するように標準ＧＡＢＡを添加した検体の測定で、元々のトマト中のＧＡＢＡ量に加えて、添加したＧＡＢＡの量が上乗せされて測定できた。添加分の測定回収率は９７％〜９９％であったことから、本発明の測定キットによるトマト中のＧＡＢＡ測定は可能であることが実証された。

（実施例９）液体クロマトグラフィーによるトマトのＧＡＢＡ測定値との比較
ＧＡＢＡの測定方法としては、アミノ酸分析計などの高速液体クロマトグラフィーを用いる方法が広く行われている。そこで、本発明のＧＡＢＡ測定キットによるトマトのＧＡＢＡ測定値と高速液体クロマトグラフィー法によるトマトのＧＡＢＡ値との相関性を検討した。

《測定方法》
本発明の反応液Ｉ及び反応液ＩＩを用いて、実施例１と同様に吸光度を測定することにより、試料トマト１〜８のＧＡＢＡ含有量を測定した。トマトの抽出と測定は実施例８と同様に実施した。また、同じ試料トマト１〜８のＧＡＢＡ含有量を、一般的な高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。

《結果及び考察》
以下の表８に示すように、本発明のＧＡＢＡ測定キットによる８種類のトマトのＧＡＢＡ測定値は、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製）による同トマト試料のＧＡＢＡ測定値とほぼ一致し、高い相関性を有していた。

（実施例１０）ＬＥＤ簡易比色計によるＧＡＢＡの検量線
反応液ＩＩの新トリンダー試薬としてＴＯＯＳを用いて、本発明における標準試料のＧＡＢＡ濃度と、純緑色ＬＥＤ（５５５ｎｍ）を光源とした簡易比色計のフォトトランジスター受光部の電圧値（ｌｏｇ値）との相関関係を、検量線として作成した。

《測定方法》
ＧＡＢＡの濃度が２５ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌの各濃度の溶液を検体として検量線を作成した。なお、測定は、以下のような手順に従って実施した。まず、ガラス試験管に反応液Ｉを０．５ｍＬ入れ、検体として各濃度のＧＡＢＡ溶液を０．０５ｍＬ添加し、３０℃で１０分間反応後、反応液ＩＩを０．５ｍＬ添加して、さらに２０分間反応させた後、ディスポーザルセルへ移して、純緑色ＬＥＤ簡易比色計によって電圧値を測定し、水を測定した電圧値を差し引いた後に、Ｅ＝−ｌｏｇ（Ｔ／Ｔ₀）の式に代入して得た値を用いて検量線を作成した。なお、純緑色ＬＥＤ簡易比色計は、本発明者が設計して自作したものを用いた。

《結果及び考察》
ＧＡＢＡの濃度とｌｏｇ転換した電圧値との関係は、図６に示すように相関係数０．９９９の直線となり、純緑色ＬＥＤ簡易比色計によるＧＡＢＡの定量が可能であった。

（実施例１１）Ｌ−アスパラギン酸測定反応のエンドポイントの確認
実施例４に準じて、３０分間、１分毎に吸光度を測定して発色反応のタイムコースを調べた。Ｌ−アスパラギン酸トランスアミナーゼとして、大腸菌由来Ｌ−アスパラギン酸トランスアミナーゼ遺伝子（遺伝子番号：eco
０９２８）を組込んだ組換え大腸菌（E. coli Rosetta II DE3 pLysS pET26b(+)-GOT ）をLB培地で３７℃、
１２時間培養し、得られた菌体の破砕液をイオン交換カラムクロマトグラフィーで精製した酵素液を用いた。

《測定方法》
吸光度計（島津ＵＶｍｉｎｉ１２４０）用のセミミクロセルに、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ０．８U/ｍｌ、アスコルビン酸オキシダーゼ１０U/ｍｌ、カタラーゼ１２００U/ｍｌ、４−アミノアンチピリン０．８μmole/ml、ペルオキシダーゼ１０U/ｍｌ及びプロクリン９５０（２０００倍希釈）を含む反応液Ｉ及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ２U/ｍｌ、新トリンダー試薬０．８μmole/ｍｌ、α−ケトグルタル酸２μmole/ｍｌ、ピリドキサールリン酸２μmole/ｍｌ及びカタラーゼ失活剤０．０９％を含む反応液ＩIを各々０．５ｍＬ、計１．０ｍＬを入れ、０．０５ｍＬのL−アスパラギン酸検体溶液を添加して反応を開始した。室温で３０分間、１分毎に吸光度を測定して発色反応のタイムコースを調べた。L−アスパラギン酸溶液は、濃度が０．５ｍMの溶液を使用した。

《結果及び考察》
図７は、吸光度のタイムコースを示す。吸光度は反応開始後約１５分〜２０分で一定になった。従って、本発明のＬ−アスパラギン酸の測定キットによる測定は、ＧＡＢＡを測定する場合と同様、いわゆるエンドポイント法による酵素分析であることを示している。

（実施例１２）Ｌ−アスパラギン酸の検量線（フォトメーターによる５５５ｎｍの吸光度測定）
実施１１に準じて、Ｌ−アスパラギン酸の濃度が０．０６２５〜１ｍＭの各濃度の溶液を検体として検量線を作成した。反応時間は２０分とした。

Ｌ−アスパラギン酸の濃度と５５５ｎｍの吸光度との関係は、図８に示すように相関係数０．９９９７の直線となり、エンドポイント法によるＬ−アスパラギン酸の定量が可能であることが示された。

（実施例１３）アスパラギン酸測定キット
下表の構成とすることができる。

（実施例１４）アラニン測定キット
下表の構成とすることができる。

Claims (9)

1. 下記（Ａ）及び（Ｂ）を含有する、試料中のアスパラギン酸、又はアラニンを測定するためのキット：
   （Ａ）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、及びカタラーゼを含む、反応液Ｉ
   （Ｂ）アスパラギン酸トランスアミナーゼ、又はアラニントランスアミナーゼ、及びカタラーゼ失活剤を含む反応液ＩＩ
   ただし、反応液Ｉ及びＩＩは、下記も満たす：
   ・いずれか一方がカプラー化合物を含み、他方が新トリンダー試薬を含み、
   ・いずれか一方がペルオキシダーゼを含み；かつ
   ・いずれか一方がα−ケトグルタル酸を含む。
2. 反応液ＩＩが、さらにピリドキサールリン酸を含む、請求項１に記載のキット。
3. カプラー化合物が、４−アミノアンチピリンである、請求項１又は２に記載のキット。
4. 新トリンダー試薬が、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）、又はＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキット。
5. 反応液Ｉが、カプラー化合物を含み、反応液ＩＩが新トリンダー試薬を含み、かつ 反応液Ｉがペルオキシダーゼを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキット。
6. 下記（１）、及び（２）を含む、試料中のアスパラギン酸、又はアラニンを測定する方法：
   （１）容器内で、試料中のＬ−グルタミン酸に、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、及びカタラーゼを作用させ、Ｌ−グルタミン酸を分解し、かつ試料中のアスコルビン酸又はエリソルビン酸に、アスコルビン酸オキシダーゼを作用させ、アスコルビン酸又はエリソルビン酸を分解する工程
   （２）（１）に続いて同じ容器内で行われる工程であって、該カタラーゼに、カタラーゼ失活剤を作用させ、カタラーゼを失活させ、かつ試料中のアスパラギン酸、又はアラニンに、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カプラー化合物、及び新トリンダー試薬存在下で、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、又はアラニントランスアミナーゼを作用させ、Ｌ−グルタミン酸を生成し、生成したＬ−グルタミン酸に、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カプラー化合物、及び新トリンダー試薬を作用させ、色素を形成させる工程。
7. （１）及び（２）の工程が、２５〜４０℃で行われる。請求項６に記載の方法。
8. （２）において、試料中のアスパラギン酸、又はアラニンが完全に消費される、請求項６又は７に記載の方法。
9. 請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法を実施するための、請求項１〜５のいずれか１項に定義した反応液I及び反応液II、並びに生じた色素の量を測定するためのＬＥＤ光源を用いた装置を含む、キット。

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