JP2021048812A - 淋菌のdnaジャイレースのサブユニットaの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセット、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセット、及びそれらの使用 - Google Patents
淋菌のdnaジャイレースのサブユニットaの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセット、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセット、及びそれらの使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
<1> LAMP法により、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセットであって、下記(i)〜(iv)のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセットである。
(i) 下記配列番号:1で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー:
・ 5’−CGGCGACGTCATCGGTAA−3’(配列番号:1)
(ii) 下記配列番号:2で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー:
・ 5’−AGATTTTCGCCATGCGGATT−3’(配列番号:2)
(iii) 下記式(1)で表されるプライマー:
・ 5’−(A)−(B)−(C)−3’(式(1))
前記式(1)中、前記(A)は、下記配列番号:3で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記(B)は、塩基数0〜50の任意の塩基配列を表し、前記(C)は、(c−1)下記配列番号:4で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:4で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列、(c−2)下記配列番号:5で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:5で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列、及び(c−3)下記配列番号:6で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:6で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す。
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCA−3’(配列番号:3)
・ 5’−ACCCCCACGGCGAGTC−3’(配列番号:4)
・ 5’−ACCCCCACGGCGACTC−3’(配列番号:5)
・ 5’−ACCCCCACGGCGAATC−3’(配列番号:6)
(iv) 下記式(2)で表されるプライマー:
・ 5’−(D)−(E)−(F)−3’(式(2))
前記式(2)中、前記(D)は、下記配列番号:7で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記(E)は、塩基数0〜50の任意の塩基配列を表し、前記(F)は、下記配列番号:8で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ 5’−GTGCTGATAGACGGACAGGGC−3’(配列番号:7)
・ 5’−GGTATAGCGCATGGCTGC−3’(配列番号:8)
<2> 淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法であって、
前記<1>に記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、LAMP法によってDNAの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が無く、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が有ると評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法である。
<3> LAMP法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセットであって、下記(i)〜(iv)のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセットである。
(i) 下記配列番号:1で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー:
・ 5’−CGGCGACGTCATCGGTAA−3’(配列番号:1)
(ii) 下記配列番号:2で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー:
・ 5’−AGATTTTCGCCATGCGGATT−3’(配列番号:2)
(iii) 下記式(1)で表されるプライマー:
・ 5’−(A)−(B)−(C)−3’(式(1))
前記式(1)中、前記(A)は、下記配列番号:3で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記(B)は、塩基数0〜50の任意の塩基配列を表し、前記(C)は、(c−1)下記配列番号:4で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:4で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列、(c−2)下記配列番号:5で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:5で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列、及び(c−3)下記配列番号:6で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:6で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す。
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCA−3’(配列番号:3)
・ 5’−ACCCCCACGGCGAGTC−3’(配列番号:4)
・ 5’−ACCCCCACGGCGACTC−3’(配列番号:5)
・ 5’−ACCCCCACGGCGAATC−3’(配列番号:6)
(iv) 下記式(2)で表されるプライマー:
・ 5’−(D)−(E)−(F)−3’(式(2))
前記式(2)中、前記(D)は、下記配列番号:7で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記(E)は、塩基数0〜50の任意の塩基配列を表し、前記(F)は、下記配列番号:8で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ 5’−GTGCTGATAGACGGACAGGGC−3’(配列番号:7)
・ 5’−GGTATAGCGCATGGCTGC−3’(配列番号:8)。
<4> 淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法であって、
前記<3>に記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、LAMP法によってDNAの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有し、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有さないと評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法である。
<5> LAMP法により、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのキットであって、
前記<1>に記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキットである。
<6> LAMP法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのキットであって、
前記<3>に記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキットである。
本発明の、LAMP法により、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセット(以下、「変異検出用プライマーセット」と称することがある。)は、下記(i)〜(iv)のプライマーを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
LAMP法は、4種類〜6種類のプライマーを用いて、等温反応により標的遺伝子を増幅し、反応液の濁度によって標的遺伝子の存在を検出する遺伝子増幅法である(例えば、国際公開第2000/028082号参照)。LAMP法は、等温反応であることから簡単な装置で実施することができ、また、肉眼で結果を判断することができることから、臨床検査で使用することも可能である。
前記F3プライマーは、前記F3c領域と相補的な塩基配列であるF3領域の塩基配列を持つように設計する。
前記BIPプライマーは、前記B2領域の塩基配列を3’末端側に持ち、5’末端側に前記B1領域と相補的な塩基配列であるB1c領域の塩基配列を持つように設計する。
前記B3プライマーは、前記B3領域の塩基配列を持つように設計する。
前記LFプライマーは、前記F1c領域と相補的な塩基配列であるF1領域と、前記F2領域との間の塩基配列に相補的な塩基配列を持つように設計する。前記LBプライマーは、前記B1領域と、前記B2領域との間の塩基配列に相補的な塩基配列を持つように設計する。これらのプライマーを追加で用いることにより、LAMP法による核酸増幅における核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる。前記LFプライマー、前記LBプライマーは、例えば、設計支援ソフト(http://primerexplorer.jp/)などを利用して設計することができる。
淋菌のフルオロキノロンに対する耐性は、主にDNAジャイレースのサブユニットA(gyrA)をコードする遺伝子(アクセッション番号:U08817.1(GeneBank)における83番目のアミノ酸(Ser)をコードする塩基配列(TCC)及び87番目のアミノ酸(Asp)をコードする塩基配列(GAC)のミスセンス変異により生じることが報告されている(Deguchi T et al. Antimicrob Agents Chemother, 1995)。しかも、国内分離株のほぼ全ては、83番目のアミノ酸(Ser)をコードする塩基配列(TCC)における遺伝子変異(一塩基変異)により生じる(Ser(TCC)→Phe(TTC))。
以上の事実を鑑み、本発明では、上記した83番目のアミノ酸(Ser)をコードする塩基配列(TCC)を含む遺伝子領域を増幅することができるプライマーセットを設計し、かつ上記した83番目のアミノ酸(Ser)をコードする塩基配列(TCC)における2番目の塩基である「C」の遺伝子変異(一塩基変異)の有無を精緻に区別してLAMP反応を引き起こす系を開発した。
本発明のプライマーセットを用いたLAMP反応によれば、フルオロキノロン感受性淋菌(83番目のアミノ酸がSer(TCC))でのみLAMP反応が陽性となり、淋菌の同定と、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性を迅速かつ同時に判定することができる。
前記(i)のプライマー(以下、「F3プライマー」と称することがある。)は、下記配列番号:1で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマーである。
・ 5’−CGGCGACGTCATCGGTAA−3’(配列番号:1)
前記(ii)のプライマー(以下、「B3プライマー」と称することがある。)は、下記配列番号:2で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマーである。
・ 5’−AGATTTTCGCCATGCGGATT−3’(配列番号:2)
前記(iii)のプライマー(以下、「FIPプライマー」と称することがある。)は、下記式(1)で表されるプライマーである。
・ 5’−(A)−(B)−(C)−3’(式(1))
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCA−3’(配列番号:3)
・ 5’−ACCCCCACGGCGAGTC−3’(配列番号:4)
上記配列番号:4において下線を付した塩基は、上記した保持される塩基を表す。
・ 5’−ACCCCCACGGCGACTC−3’(配列番号:5)
上記配列番号:5において下線を付した塩基は、上記した保持される塩基を表す。
・ 5’−ACCCCCACGGCGAATC−3’(配列番号:6)
上記配列番号:6において下線を付した塩基は、上記した保持される塩基を表す。
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCAACCCCCACGGCGAGTC−3’(配列番号:10)
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCAACCCCCACGGCGACTC−3’(配列番号:11)
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCAACCCCCACGGCGAATC−3’(配列番号:12)
前記(iv)のプライマー(以下、「BIPプライマー」と称することがある。)は、下記式(2)で表されるプライマーである。
・ 5’−(D)−(E)−(F)−3’(式(2))
・ 5’−GTGCTGATAGACGGACAGGGC−3’(配列番号:7)
・ 5’−GGTATAGCGCATGGCTGC−3’(配列番号:8)。
・ 5’−GTGCTGATAGACGGACAGGGCGGTATAGCGCATGGCTGC−3’(配列番号:13)
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、LFプライマー、LBプライマーなどが挙げられる。
本発明の淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法(以下、「変異検出方法」と称することがある。)は、増幅反応工程と、評価工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記増幅反応工程は、上記した本発明の変異検出用プライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、LAMP法によってDNAの増幅反応を行う工程である。
前記試料としては、鋳型となる核酸を含有する試料であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、尿、尿道分泌物、膣分泌物等の泌尿器又は生殖器由来の検体などが挙げられる。また、前記検体を熱処理したものや、前記検体から抽出した核酸を試料としてもよい。
前記核酸を抽出する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記増幅反応は、前記試料、前記プライマーセット、DNAポリメラーゼ、緩衝液、基質であるdNTP等を含む反応液を等温でインキュベートし、実施することができる。
前記評価工程は、前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が無く、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が有ると評価する工程である。
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られたか否かを判断する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、反応後の反応液を肉眼で観察し、反応液の白濁が確認された場合に増幅産物が得られたと判断する方法、反応後の反応液の濁度を測定し、濁度(吸光度)が上がった場合に増幅産物が得られたと判断する方法、反応液にSYBR Green I等の蛍光インターカレーターを加え、UV照射下で核酸の増幅を示す発光が確認された場合に増幅産物が得られたと判断する方法などが挙げられる。
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記試料を調製する試料調製工程などが挙げられる。
前記試料を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
本発明の、LAMP法により、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのキット(以下、「変異検出用キット」と称することがある。)は、上記した本発明の変異検出用プライマーセットを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記変異検出用プライマーセットは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットであり、好ましい態様も同様である。
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、DNAポリメラーゼ、緩衝液、基質であるdNTP、陰性コントロール、陽性コントロール、DNA抽出試薬などが挙げられる。
本発明の、LAMP法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセット(以下、「フルオロキノロン感受性評価用プライマーセット」と称することがある。)は、下記(i)〜(iv)のプライマーを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記LAMP法は、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの<LAMP法>の項目に記載したものと同様である。
前記淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無は、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの<淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異>の項目に記載したように、主にDNAジャイレースのサブユニットA(gyrA)をコードする遺伝子における83番目のアミノ酸(Ser)をコードする塩基配列(TCC)及び87番目のアミノ酸(Asp)をコードする塩基配列(GAC)のミスセンス変異により生じることが報告されており、国内分離株のほぼ全ては、83番目のアミノ酸(Ser)をコードする塩基配列(TCC)における遺伝子変異(一塩基変異)により生じる(Ser(TCC)→Phe(TTC))。
前記(i)のプライマーは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの<(i)のプライマー>の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記(ii)のプライマーは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの<(ii)のプライマー>の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記(iii)のプライマーは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの<(iii)のプライマー>の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記(iv)のプライマーは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの<(iv)のプライマー>の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの<その他の構成>の項目に記載したものと同様のものなどが挙げられる。
本発明の淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法(以下、「フルオロキノロン感受性評価方法」と称することがある。)は、増幅反応工程と、評価工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記増幅反応工程は、上記した本発明のフルオロキノロン感受性評価用プライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、LAMP法によってDNAの増幅反応を行う工程であり、上記した本発明の変異検出方法の<増幅反応工程>の項目に記載したものと同様にして行うことができ、好ましい態様も同様である。
前記評価工程は、前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有し、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有さない(耐性を有する)と評価する工程である。
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られたか否かを判断する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の変異検出方法の<増幅反応工程>の項目に記載したものと同様にして行うことができる。
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の変異検出方法の<その他の工程>の項目に記載したものと同様の工程などが挙げられる。
本発明の、LAMP法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのキット(以下、「フルオロキノロン感受性評価用キット」と称することがある。)は、上記した本発明のフルオロキノロン感受性評価用プライマーセットを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記フルオロキノロン感受性評価用プライマーセットは、上記した本発明のフルオロキノロン感受性評価用プライマーセットであり、好ましい態様も同様である。
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の変異検出用キットの<その他の構成>の項目に記載したものと同様のものなどが挙げられる。
<試験例1−1>
NCBIのゲノム・データベースにおける、淋菌のゲノム・データベースのシーケンス情報をもとにプライマーを設計した。具体的には、淋菌に配列特異的であり、フルオロキノロンの耐性化に関連するgyrA遺伝子のキノロン耐性決定領域(Quinolone Resistance−Determining Regions ; QRDR)が標的となるように、プライマーを設計した。プライマーの設計には、DNAジャイレースのサブユニットA(gyrA)遺伝子における配列保存領域を明らかにし、Primer Explorer V5(http://primerexplorer.jp)を用いておよそ120のプライマーセットの候補を選定した。
具体的には、F1c領域及びB1c領域の5’末端、並びにF2領域及びB2領域の3’末端塩基のdG値が最も低い組合せから順にプライマーセットを試作した。
そして、淋菌標準株(国立研究開発法人理化学研究所バイオリソース研究センターより譲渡、株名:Neisseria gonorrhoeae(Zopf 1885) Trevisan 1885、菌株番号 JCM no. 2885)から、QIAamp DNA Mini Kit(キアゲン社製)を用いて抽出したDNAを鋳型DNAに用い、LAMP反応によるDNAの検出感度が1pg/μL若しくはそれ以上となる組合せのプライマーセットを発見できるまで、候補プライマーセットの試作を継続した。
この際、LAMP反応には「Loopamp(登録商標) DNA増幅試薬キット」(栄研化学株式会社製)を使用し、前記キットの添付文書にしたがって各プライマー濃度を調整した。反応温度は推奨温度である65℃とし、増幅産物の有無は濁度測定装置「LoopAmp LA−200」(栄研化学株式会社製)を使用し、反応時間60分間の観察時間で増幅産物の有無を判定した。
<F3プライマー>
5’−CGGCGACGTCATCGGTAA−3’(配列番号:1)
<B3プライマー>
5’−AGATTTTCGCCATGCGGATT−3’(配列番号:2)
<FIPプライマー>
5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCAACCCCCACGGCGATTC−3’(配列番号:9)
配列番号:9中、下線がない部分はF1c領域を表し、下線を付した部分はF2領域を表す。
<BIPプライマー>
・ 5’−GTGCTGATAGACGGACAGGGCGGTATAGCGCATGGCTGC−3’(配列番号:13)
配列番号:13中、下線がない部分はB1c領域を表し、下線を付した部分はB2領域を表す。
フルオロキノロン感受性淋菌(3株、国立感染症研究所より入手。)から、QIAamp DNA Mini Kit (キアゲン社製)を用いてDNAを抽出した。
LAMP反応には「Loopamp(登録商標) DNA増幅試薬キット」(栄研化学株式会社製)を使用し、前記キットの添付文書にしたがって各プライマー濃度を調整した。反応温度は64℃とし、増幅産物の有無は濁度測定装置「LoopAmp LA−200」(栄研化学株式会社製)を使用し、反応時間60分間の観察時間で増幅産物の有無を判定した。
図1Aの結果から、前記プライマーセット−1を用いた場合には、淋菌DNAの量が1pgまでの場合に検出が可能であることが確認できた。
前記プライマーセット−1の<FIPプライマー>の塩基配列は、上述したように、下記配列番号:9で表されるものである。下記配列番号:9で表される塩基配列の3’末端(伸長末端)の「C」は、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸であるSerをコードする塩基配列(TCC)の第2塩基に一致する。
前記第2塩基の「C」は、多くのフルオロキノロン耐性菌において、「T」に置換されることが知られている。なお、「T」に置換された場合(TTC)には、アミノ酸がSerからPheに変わる。
この場合、フルオロキノロン耐性菌の塩基配列と、下記配列番号:9で表されるFIPプライマーの塩基配列とがミスマッチとなり、LAMP法において、フルオロキノロン耐性菌での増幅効率の低下が懸念される。
5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCAACCCCCACGGCGATTC−3’(配列番号:9)
図1Bの結果から、前記FIPプライマーの伸長末端の塩基が異なる(即ち、フルオロキノロン耐性変異が生じている)ことにより、各鋳型DNA濃度において増幅効率が若干低下するものの、フルオロキノロン感受性淋菌と同様に淋菌DNAの量が1pgまでの場合に検出が可能であることが確認できた。つまり、前記プライマーセット−1を用いることで、フルオロキノロン感受性に関係なく、淋菌DNAの量が1pgまでの場合に検出が可能であることを確認した。
前記試験例1の結果から、FIPプライマーの伸長末端での配列特異性は決して高くはないといえる。一方、FIPプライマーの配列の特異性を顕著に向上できれば、前記FIPプライマーの伸長末端の塩基と異なる場合(即ち、フルオロキノロン耐性菌の場合)には、LAMP反応が阻止され増幅産物が生じず、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無や、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法として活用できるのではないかと考えられた。
前記プライマーセット−1におけるFIPプライマーの3’末端から5’末端方向における3番目の塩基「T」に対して人為的にミスマッチ塩基を導入した以下の3種類のFIPプライマーを作製し、LAMP法による増幅の特異性が向上するか否かを検証した。
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCAACCCCCACGGCGAGTC−3’(配列番号:10)
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCAACCCCCACGGCGACTC−3’(配列番号:11)
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCAACCCCCACGGCGAATC−3’(配列番号:12)
配列番号:10〜12中の下線を付した塩基は、前記ミスマッチ塩基を表す。
プライマーセットとして、前記プライマーセット−1におけるFIPプライマーを前記配列番号:10〜12のいずれかに変更したものを用いた。
上記した鋳型DNA及びプライマーセットを用い、LAMP反応の時間を90分間とした以外は、前記<試験例1−2>と同様にして、LAMP法を行った。
したがって、FIPプライマーの3’末端の塩基の2塩基上流の塩基「T」を他の塩基に置換することで、LAMP法による増幅産物の有無により、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無や、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価できることが示された。
前記プライマーセット−2を用いた場合のLAMP反応の検証を以下のようにして実施した。
プライマーセットとして、前記プライマーセット−2を用いた。
上記した鋳型DNA及びプライマーセットを用いた以外は、前記<試験例1−2>と同様にして、LAMP法を行った。
以上の結果からも、FIPプライマーの3’末端の塩基の2塩基上流の塩基「T」を置換することで、LAMP法による増幅産物の有無により、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無や、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価できることが示された。
前記FIPプライマーの末端特異性の向上に、前記FIPプライマーの3’末端側の配列構造が寄与していることを明らかにするため、FIPプライマーの構成要素中のF2領域の5’末端側の塩基に変異(欠失)を導入した場合に、反応特異性がどのように影響を受けるのかを以下のようにして検証した。
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCAACCCCCACGGCGAGTC−3’(配列番号:10)
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCACCCCACGGCGAGTC−3’(配列番号:14)
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCACCACGGCGAGTC−3’(配列番号:15)
配列番号:10、14、及び15中、下線を付した部分は、F2領域を示す。配列番号:10で表される塩基配列と比較して、配列番号:14で表される塩基配列では、F2領域の5’末端側の塩基が2塩基欠失しており、配列番号:15で表される塩基配列では、F2領域の5’末端側の塩基が4塩基欠失している。
プライマーセットとして、前記プライマーセット−2、前記プライマーセット−2におけるFIPプライマーを前記配列番号:14で表される塩基配列のFIPプライマーに代えたプライマーセット(以下、「プライマーセット−2−A」と称することがある。)、又は前記プライマーセット−2におけるFIPプライマーを前記配列番号:15で表される塩基配列のFIPプライマーに代えたプライマーセット(以下、「プライマーセット−2−B」と称することがある。)を用いた。
上記した鋳型DNA及びプライマーセットを用い、反応時間を60分間又は90分間とした以外は、前記<試験例1−2>と同様にして、LAMP法を行った。
本発明のプライマーセットを用いたLAMP反応が淋菌に特異的であることを検証するために、以下に示したヒトへの病原性をもつ細菌から抽出したDNAを鋳型として、LAMP反応性の有無を検証した。
<細菌>
以下の各菌はナショナルバイオリソースより譲渡を受けた標準菌株である。カッコ内は、JNBP番号を表す。
・ Staphylococcus aureus(05252)
・ S. epidermidis(05340)
・ Streptococcus mutans(05653)
・ S. pyogenes(05698)
・ S. agalactiae(05521)
・ S. pneumoniae(05681)
・ Klebsiella pneumoniae(02775)
・ Haemophilus influenza(06934)
・ Acinetobactor baumanii(01112)
・ Burkholderia pseudomallei(01443)
・ Escherichia coli(02019)
・ Pseudomonas aeruginosa(04211)
・ Proteus mirabilis(04166)
・ Moraxella catarrhalis(03104)
・ Corynebacterium diphtheriae(01754)
・ Stenotrophomonas maltophilia(05488)
・ Citrobacter farmeri(01568)
・ Serratia marcescens(05051)
・ Enterobacter cloacae(01922)
・ Legionella pneumophila(02860)
・ Mycoplasma pneumonia(03925)
・ Mycobacterium tuberculosis(臨床分離株)
・ M. microti(03828)
・ M. kansasii(03463)
・ M. avium(03179)
・ M. gordonae(03326)
・ M. intracellulare(03370)
・ M. marinum(03537)
・ M. chelonae(03231)
・ M. fortuitum(03282)
・ M. scrofulaceum(03611)
プライマーセットとして、前記プライマーセット−2を用いた。
上記した鋳型DNA及びプライマーセットを用いた以外は、前記<試験例1−2>と同様にして、LAMP法を行った。
本発明のプライマーセットを用いたLAMP反応が淋菌の臨床分離株から抽出したDNAでも利用できることを検証するために、国立感染症研究所 細菌第一室において分離され、保管される国内淋菌株(フルオロキノロン感受性菌20株、フルオロキノロン耐性菌19株)から抽出したDNAを鋳型として、LAMP反応性の有無を検証した。
プライマーセットとして、前記プライマーセット−2を用いた。
上記した鋳型DNA及びプライマーセットを用いた以外は、前記<試験例1−2>と同様にして、LAMP法を行った。
淋菌を検出する既存のLAMP法として、グルタミンシンテターゼ遺伝子(glutamine synthetase gene)におけるオープンリーディングフレーム1(open reading frame 1:ORF1)を標的とするLAMP法が報告されている(Edwards T, Burke PA, Smalley HB, Gillies L, Hobbs G. Loop−mediated isothermal amplification test for detection of Neisseria gonorrhoeae in urine samples and tolerance of the assay to the presence of urea. J Clin Microbiol 2014 Jun;52(6):2163−5.以下、「参考文献1」と称することがある。)。
そこで、前記<試験例1−2>と同様にして抽出したフルオロキノロン感受性菌のDNAを鋳型DNAとし、本発明のLAMP反応系との比較を行った。
前記鋳型DNAと、前記参考文献1に記載のプライマーセットとを用い、反応温度を前記参考文献1に記載の63℃とした以外は、前記<試験例1−2>と同様にして、LAMP法を行った。
<1> LAMP法により、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセットであって、下記(i)〜(iv)のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセットである。
(i) 下記配列番号:1で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー:
・ 5’−CGGCGACGTCATCGGTAA−3’(配列番号:1)
(ii) 下記配列番号:2で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー:
・ 5’−AGATTTTCGCCATGCGGATT−3’(配列番号:2)
(iii) 下記式(1)で表されるプライマー:
・ 5’−(A)−(B)−(C)−3’(式(1))
前記式(1)中、前記(A)は、下記配列番号:3で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記(B)は、塩基数0〜50の任意の塩基配列を表し、前記(C)は、(c−1)下記配列番号:4で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:4で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列、(c−2)下記配列番号:5で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:5で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列、及び(c−3)下記配列番号:6で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:6で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す。
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCA−3’(配列番号:3)
・ 5’−ACCCCCACGGCGAGTC−3’(配列番号:4)
・ 5’−ACCCCCACGGCGACTC−3’(配列番号:5)
・ 5’−ACCCCCACGGCGAATC−3’(配列番号:6)
(iv) 下記式(2)で表されるプライマー:
・ 5’−(D)−(E)−(F)−3’(式(2))
前記式(2)中、前記(D)は、下記配列番号:7で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記(E)は、塩基数0〜50の任意の塩基配列を表し、前記(F)は、下記配列番号:8で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ 5’−GTGCTGATAGACGGACAGGGC−3’(配列番号:7)
・ 5’−GGTATAGCGCATGGCTGC−3’(配列番号:8)
<2> 前記(iii)の式(1)で表されるプライマーにおける(C)が、(c−1)前記配列番号:4で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ前記配列番号:4で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列である前記<1>に記載のプライマーセットである。
<3> 前記(iii)の式(1)で表されるプライマーにおける(C)が、前記配列番号:4で表される塩基配列である前記<2>に記載のプライマーセットである。
<4> 淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法であって、
前記<1>から<3>のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、LAMP法によってDNAの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が無く、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が有ると評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法である。
<5> LAMP法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセットであって、下記(i)〜(iv)のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセットである。
(i) 下記配列番号:1で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー:
・ 5’−CGGCGACGTCATCGGTAA−3’(配列番号:1)
(ii) 下記配列番号:2で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー:
・ 5’−AGATTTTCGCCATGCGGATT−3’(配列番号:2)
(iii) 下記式(1)で表されるプライマー:
・ 5’−(A)−(B)−(C)−3’(式(1))
前記式(1)中、前記(A)は、下記配列番号:3で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記(B)は、塩基数0〜50の任意の塩基配列を表し、前記(C)は、(c−1)下記配列番号:4で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:4で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列、(c−2)下記配列番号:5で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:5で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列、及び(c−3)下記配列番号:6で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:6で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す。
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCA−3’(配列番号:3)
・ 5’−ACCCCCACGGCGAGTC−3’(配列番号:4)
・ 5’−ACCCCCACGGCGACTC−3’(配列番号:5)
・ 5’−ACCCCCACGGCGAATC−3’(配列番号:6)
(iv) 下記式(2)で表されるプライマー:
・ 5’−(D)−(E)−(F)−3’(式(2))
前記式(2)中、前記(D)は、下記配列番号:7で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記(E)は、塩基数0〜50の任意の塩基配列を表し、前記(F)は、下記配列番号:8で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ 5’−GTGCTGATAGACGGACAGGGC−3’(配列番号:7)
・ 5’−GGTATAGCGCATGGCTGC−3’(配列番号:8)
<6> 前記(iii)の式(1)で表されるプライマーにおける(C)が、(c−1)前記配列番号:4で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ前記配列番号:4で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列である前記<5>に記載のプライマーセットである。
<7> 前記(iii)の式(1)で表されるプライマーにおける(C)が、前記配列番号:4で表される塩基配列である前記<5>に記載のプライマーセットである。
<8> 淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法であって、
前記<5>から<7>のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、LAMP法によってDNAの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有し、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有さないと評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法である。
<9> LAMP法により、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのキットであって、
前記<1>から<3>のいずれかに記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキットである。
<10> LAMP法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのキットであって、
前記<5>から<7>のいずれかに記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキットである。
Claims (10)
- ループ介在等温増幅法(LAMP法)により、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセットであって、下記(i)〜(iv)のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセット:
(i) 下記配列番号:1で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー:
・ 5’−CGGCGACGTCATCGGTAA−3’(配列番号:1)
(ii) 下記配列番号:2で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー:
・ 5’−AGATTTTCGCCATGCGGATT−3’(配列番号:2)
(iii) 下記式(1)で表されるプライマー:
・ 5’−(A)−(B)−(C)−3’(式(1))
前記式(1)中、前記(A)は、下記配列番号:3で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記(B)は、塩基数0〜50の任意の塩基配列を表し、前記(C)は、(c−1)下記配列番号:4で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:4で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列、(c−2)下記配列番号:5で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:5で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列、及び(c−3)下記配列番号:6で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:6で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す:
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCA−3’(配列番号:3)
・ 5’−ACCCCCACGGCGAGTC−3’(配列番号:4)
・ 5’−ACCCCCACGGCGACTC−3’(配列番号:5)
・ 5’−ACCCCCACGGCGAATC−3’(配列番号:6)
(iv) 下記式(2)で表されるプライマー:
・ 5’−(D)−(E)−(F)−3’(式(2))
前記式(2)中、前記(D)は、下記配列番号:7で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記(E)は、塩基数0〜50の任意の塩基配列を表し、前記(F)は、下記配列番号:8で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表す:
・ 5’−GTGCTGATAGACGGACAGGGC−3’(配列番号:7)
・ 5’−GGTATAGCGCATGGCTGC−3’(配列番号:8)。 - 前記(iii)の式(1)で表されるプライマーにおける(C)が、(c−1)前記配列番号:4で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ前記配列番号:4で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列である請求項1に記載のプライマーセット。
- 前記(iii)の式(1)で表されるプライマーにおける(C)が、前記配列番号:4で表される塩基配列である請求項2に記載のプライマーセット。
- 淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法であって、
請求項1から3のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、LAMP法によってDNAの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が無く、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が有ると評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法。 - LAMP法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセットであって、下記(i)〜(iv)のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセット:
(i) 下記配列番号:1で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー:
・ 5’−CGGCGACGTCATCGGTAA−3’(配列番号:1)
(ii) 下記配列番号:2で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー:
・ 5’−AGATTTTCGCCATGCGGATT−3’(配列番号:2)
(iii) 下記式(1)で表されるプライマー:
・ 5’−(A)−(B)−(C)−3’(式(1))
前記式(1)中、前記(A)は、下記配列番号:3で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記(B)は、塩基数0〜50の任意の塩基配列を表し、前記(C)は、(c−1)下記配列番号:4で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:4で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列、(c−2)下記配列番号:5で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:5で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列、及び(c−3)下記配列番号:6で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号:6で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す:
・ 5’−CGCATAGCGAAATTTTGCGCCA−3’(配列番号:3)
・ 5’−ACCCCCACGGCGAGTC−3’(配列番号:4)
・ 5’−ACCCCCACGGCGACTC−3’(配列番号:5)
・ 5’−ACCCCCACGGCGAATC−3’(配列番号:6)
(iv) 下記式(2)で表されるプライマー:
・ 5’−(D)−(E)−(F)−3’(式(2))
前記式(2)中、前記(D)は、下記配列番号:7で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記(E)は、塩基数0〜50の任意の塩基配列を表し、前記(F)は、下記配列番号:8で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列を表す:
・ 5’−GTGCTGATAGACGGACAGGGC−3’(配列番号:7)
・ 5’−GGTATAGCGCATGGCTGC−3’(配列番号:8)。 - 前記(iii)の式(1)で表されるプライマーにおける(C)が、(c−1)前記配列番号:4で表される塩基配列における3’末端の塩基と、前記3’末端の塩基から5’末端方向の3番目の塩基を保持し、かつ前記配列番号:4で表される塩基配列と少なくとも75%の配列同一性を有する塩基配列である請求項5に記載のプライマーセット。
- 前記(iii)の式(1)で表されるプライマーにおける(C)が、前記配列番号:4で表される塩基配列である請求項5に記載のプライマーセット。
- 淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法であって、
請求項5から7のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、LAMP法によってDNAの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有し、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有さないと評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法。 - LAMP法により、淋菌のDNAジャイレースのサブユニットAの83番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのキットであって、
請求項1から3のいずれかに記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキット。 - LAMP法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのキットであって、
請求項5から7のいずれかに記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキット。
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PERERA SR ET AL.: ""Multiplex Real-Time PCRAssay for Simultaneous Identification of Neisseria gonorrhoeae and ItsCipro", JOURNAL OFCLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 55, no. 11, JPN6023029482, 16 August 2017 (2017-08-16), pages 3201 - 3209, ISSN: 0005113061 * |
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