JP2021032607A

JP2021032607A - アプタマー固定化半導体センシングデバイス及び非荷電分子の検出方法

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Publication number: JP2021032607A
Application number: JP2019150267A
Authority: JP
Inventors: 逢坂　哲彌; Tetsuya Aisaka; 哲彌逢坂; 大橋　啓之; Hiroyuki Ohashi; 啓之大橋; 黒岩　繁樹; Shigeki Kuroiwa; 繁樹黒岩; 林　宏樹; Hiroki Hayashi; 宏樹林
Original assignee: Waseda University
Current assignee: Waseda University
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2021-03-01

Abstract

【課題】ＦＥＴを用いて簡便かつ高感度に非荷電分子を検出することを可能にする半導体センシングデバイス及び非荷電分子の検出方法を提供する。【解決手段】半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの前記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有する有機単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜に、あらかじめターゲット分子を結合させたプローブ分子であるアプタマーを、前記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させ、その後、該ターゲット分子を該アプタマーから脱離させてなる、アプタマー／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるアプタマー固定化半導体センシングデバイス。【選択図】なし

Description

本発明は、アプタマー固定化半導体センシングデバイス及び非荷電分子の検出方法に関する。

電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）は、生体分子の検出に非常に有望なツールである。ＦＥＴを用いると、生体分子の吸着に伴うゲート表面の電荷密度変化を電気信号として直接検出するため、ラベルフリー検出が可能であり、低コストで迅速な生体分子の検出が可能である。それゆえ、ＦＥＴを用いた生体分子の検出に関する研究が広く行われている。

ＦＥＴバイオセンサは，操作が簡便で小型、安価であるため、医療、食品、環境等の様々な分野での応用が期待されている。ＦＥＴバイオセンサは、電荷検出範囲であるデバイ長内において、受容体に捕捉された生体分子の電荷に起因するゲート電極上の表面電位の変化を測定するデバイスである。そのため、電荷を持たない非荷電分子の検出は困難であった。

そこで、プローブ分子として、測定対象である分子（以下、ターゲット分子ともいう。）の捕捉に伴い構造が変化する核酸分子（アプタマー）を利用して、センサ界面近傍の電荷量を変化させることが有効であった（非特許文献１）。これは、アプタマーがターゲット分子の捕捉に伴い構造変化することを利用して、ターゲット分子の結合により生じるデバイ長内の電荷量の変化を測定し、間接的にターゲット分子を検出する方法である。これにより、非荷電分子を検出することが可能となる。しかし、ターゲット分子の滴下時に隣接するアプタマーが互いに立体障害を起こすことで、十分な電荷量の変化が起こらず、感度が低下することがあった。

N. Nakatsuka et al., Science, 362, pp. 319-324 (2018)

本発明は、前記事情に鑑みなされたもので、ＦＥＴを用いて簡便かつ高感度に非荷電分子を検出することを可能にする半導体センシングデバイス及び非荷電分子の検出方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記目的を達成するため鋭意研究を行った結果、アプタマーをプローブ分子とするＦＥＴバイオセンサにおいて、ターゲット分子を結合させたアプタマーを固定化し、その後、該ターゲット分子を脱離させることで得られるデバイスを用いることで、該ターゲット分子を高感度に検出することが可能となることを見出し、本発明をなすに至った。

したがって、本発明は、下記アプタマー固定化半導体センシングデバイス及び非荷電分子の検出方法を提供する。
１．半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの前記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有する有機単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜に、あらかじめターゲット分子を結合させたプローブ分子であるアプタマーを、前記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させ、その後、該ターゲット分子を該アプタマーから脱離させてなる、アプタマー／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるアプタマー固定化半導体センシングデバイス。
２．前記アプタマーが、ＤＮＡアプタマーである１のアプタマー固定化半導体センシングデバイス。
３．前記半導体上に、更に、参照ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第２の絶縁層が形成され、該第２の絶縁層の上に、前記アプタマー及び非荷電分子のいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜を形成してなる、有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部として備える１又は２のアプタマー固定化半導体センシングデバイス。
４．１〜３のいずれかのアプタマー固定化半導体センシングデバイス上に固定化されたアプタマーと非荷電分子とを相互作用させる工程と、
該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程と
を含む非荷電分子の検出方法。
５．前記非荷電分子が、ステロイド骨格を有する化合物である４の非荷電分子の検出方法。

本発明のデバイスを用いることで、より高感度に非荷電分子を検出することが可能となる。

本発明の半導体センシングデバイスを示す断面図であり、（Ａ）は電界効果トランジスタ、（Ｂ）は電界効果トランジスタのゲート電極の絶縁層上に有機単分子膜を形成した状態、（Ｃ）は有機単分子膜にプローブ分子が固定化された状態を示す。オンチップデバイスのユニット構成例を示し、（Ａ）は部分平面図、（Ｂ）はその拡大断面図である。本発明の半導体センシングデバイスを用いた非荷電分子検出の概念図である。実施例２で測定した電流−電圧曲線である。比較例２で測定した電流−電圧曲線である。

［アプタマー固定化半導体センシングデバイス］
本発明のアプタマー固定化半導体センシングデバイスは、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの前記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有する有機単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜に、あらかじめターゲット分子を結合させたプローブ分子であるアプタマーを、前記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させ、その後、該ターゲット分子を該アプタマーから脱離させてなる、アプタマー／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものである。

前記検出部のうち、絶縁層／半導体構造部分は、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む絶縁層が形成された電界効果トランジスタを利用することができ、その構成は、従来公知のものを利用することができる。前記絶縁層は、シリコン酸化物であることが好ましい。電界効果トランジスタは、ｎ型でもｐ型でもよい。この電界効果トランジスタとしては、例えば、図１（Ａ）に示されるものが挙げられる。なお、図１中、１はシリコン基板、２はシリコン酸化物又は無機酸化物（ガラス、アルミナ等）を含む絶縁層、４はゲート電極、５はソース電極、６はドレイン電極、７はドープ領域を示す。

そして、図１（Ｂ）に示されるように、絶縁層２上に第１の有機単分子膜３が形成される。ここで、本発明においては、基本原理として、絶縁層表面上のプローブ分子とターゲット分子の結合反応に伴う表面電位変化を電気信号として検出する構成とする。なお、前記絶縁層の厚さは、３０〜３００ｎｍ、特に５０〜１５０ｎｍが好ましい。

前記第１の有機単分子膜は、反応性官能基を有する有機単分子膜からなる。前記反応性官能基を有する有機単分子膜は、下記式（１）で表されるアルコキシシランの単分子膜であることが好ましい。

式（１）中、Ｒは、アミノ基、アミノオキシ基、カルボキシ基又はチオール基である。

式（１）中、Ｒ¹は、炭素数３〜２２の直鎖状アルカンジイル基である。前記直鎖状アルカンジイル基は、炭素数が３〜１８であるものが好ましく、炭素数が３〜８であるものがより好ましい。炭素鎖が短い方が、有機単分子膜の有する疎水性が弱くなり、ターゲット分子の疎水性相互作用に起因する非特異的吸着を抑制することができるため好ましい。

Ｒ¹で表される直鎖状アルカンジイル基の具体例としては、プロパン−１,３−ジイル基、ブタン−１,４−ジイル基、ペンタン−１,５−ジイル基、ヘキサン−１,６−ジイル基、ヘプタン−１,７−ジイル基、オクタン−１,８−ジイル基、ノナン−１,９−ジイル基、デカン−１,１０−ジイル基、ウンデカン−１,１１−ジイル基、ドデカン−１,１２−ジイル基、トリデカン−１,１３−ジイル基、テトラデカン−１,１４−ジイル基、ペンタデカン−１,１５−ジイル基、ヘキサデカン−１,１６−ジイル基、ヘプタデカン−１,１７−ジイル基、オクタデカン−１,１８−ジイル基、ノナデカン−１,１９−ジイル基、エイコサン−１,２０−ジイル基、ヘンエイコサン−１,２１−ジイル基、ドコサン−１,２２−ジイル基が挙げられる。これらのうち、炭素数３〜１８のものが好ましく、炭素数３〜８のものがより好ましい。

式（１）中、Ｒ²〜Ｒ⁴は、それぞれ独立に、炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。前記アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。これらのうち、メチル基又はエチル基が好ましい。また、前記アルコキシアルキル基としては、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−エトキシエチル基等が挙げられる。これらのうち、炭素数２〜３のアルコキシアルキル基が好ましい。Ｒ²〜Ｒ⁴としては、特にメチル基、エチル基、２−メトキシエチル基等が好ましい。

前記Ｒがアミノ基、カルボキシ基又はチオール基であるアルコキシシランとしては、市販品を使用し得る。また、前記Ｒがアミノオキシ基であるアルコキシシランは、下記スキームにしたがって合成できる。

（式中、Ｒ¹〜Ｒ⁴は、前記と同じ。Ｒ⁵は、Ｒ¹から炭素数が２減少した直鎖状アルカンジイル基である。）

前記Ｒがアミノオキシ基であるアルコキシシランは、トリアルコキシヒドロシランとＯ−アルケニルヒドロキシアミンとを白金系触媒で処理することによって調製することができる。例えば、窒素雰囲気下、トリアルコキシヒドロシランとＯ−アルケニルヒドロキシアミンとの混合物に、ヘキサクロロ白金(IV)酸等の白金系触媒を加え、１０〜２００℃で１〜１,２００時間、より好ましくは６０〜１２０℃で１２〜４８時間反応させることにより調製できる。成膜操作には、過剰のトリアルコキシヒドロシランを例えば蒸留等の操作により除去したものを使用することが好ましい。

第１の有機単分子膜は、前記アルコキシシランを気相化学反応又は液相反応によって絶縁層上に形成し、その最適化、例えば、有機分子の自己集積化機能によって単分子が最密パッキングされた膜が形成される。気相化学反応によって単分子膜を成膜する場合は、例えば、容器に基板及びアルコキシシランを封入し、ドライルーム中で好ましくは８０〜２００℃で１〜２４時間、より好ましくは１００〜１３０℃で２〜５時間反応させることで成膜できる。液相反応によって単分子膜を成膜する場合は、例えば、アルコキシシランを含む有機溶媒中に基板を浸漬し、好ましくは２０〜８０℃で１分間〜２４時間、より好ましくは５５〜６５℃で５〜２０分間静置することで成膜できる。

前記有機溶媒としては、トルエン、メタノール、エタノール等が挙げられ、特にトルエン、メタノール等が好ましい。

前記電界効果トランジスタの半導体上には、更に、参照ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第２の絶縁層を形成することができる。この第２の絶縁層の上には、第２の有機単分子膜として、プローブ分子であるアプタマー及びターゲット分子である非荷電分子のいずれとも反応しない有機分子で構成された単分子膜を形成し、この単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部とすることができる。なお、反応ゲート絶縁部と参照ゲート絶縁部とを、電位変化測定において互いに影響を与えない程度に離間させれば、反応ゲート絶縁部の第１の絶縁層と参照ゲート絶縁部の第２の絶縁層とを同一層内に設けることもできる。

図２は、有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部９及び参照部８に適用したオンチップデバイスのユニット構成例を示す。なお、図２中、１はシリコン基板、２は絶縁層、１０はテンプレート部である。このデバイスのユニット構成は図示した構成に限定されず、検出部と参照部とは必ずしも１対１の関係で配置する必要はなく、必要に応じて検出部及び参照部の数及び組合せを適宜変更して配置することができる。また、検出部及び参照部は各々数〜数十μｍのサイズで形成可能である。

前記第２の有機単分子膜としては、フッ素化されていてもよい炭素数８〜２２の直鎖状アルキル基を有するアルコキシシランの単分子膜が好ましい。なお、有機単分子膜としてアルコキシシランの単分子膜を用いる場合、前記第２の絶縁層はシリコン酸化物で形成されたものが好ましい。

第２の有機単分子膜は、絶縁層上に均一な膜を形成させるため、自己集積化膜であることが好ましい。具体的には、下記式（２）で表されるトリアルコキシシランの単分子膜であることが好ましい。

式（２）中、Ｒ⁶は、炭素数８〜２２、好ましくは炭素数１０〜１８の直鎖状アルキル基であり、水素原子の一部又は全部がフッ素原子で置換されていてもよい。前記直鎖状アルキル基は、炭素数が１０〜１８であるものが好ましい。前記直鎖状アルキル基として具体的には、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、ｎ−ウンデシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−トリデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ペンタデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−ヘプタデシル基、ｎ−オクタデシル基、ｎ−ノナデシル基、ｎ−エイコシル基、ｎ−ヘンエイコシル基、ｎ−ドコシル基等が挙げられる。

式（２）中、Ｒ⁷〜Ｒ⁹は、それぞれ独立に、炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。前記アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。これらのうち、メチル基又はエチル基が好ましい。また、前記アルコキシアルキル基としては、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−エトキシエチル基等が挙げられる。これらのうち、炭素数２〜３のアルコキシアルキル基が好ましい。

式（２）で表されるトリアルコキシシランとして具体的には、CH₃(CH₂)₇Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₇Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₈Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₈Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₉Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₉Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₁₀Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₁₀Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₁₁Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₁₁Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₁₂Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₁₂Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₁₃Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₁₃Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₁₄Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₁₄Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₁₅Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₁₅Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₁₆Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₁₆Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₁₇Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₁₇Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₁₈Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₁₈Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₁₉Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₁₉Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₂₀Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₂₀Si(OC₂H₅)₃、CH₃(CH₂)₂₁Si(OCH₃)₃、CH₃(CH₂)₂₁Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₅(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₅(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₆(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₆(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₇(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₇(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₈(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₈(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₉(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₉(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₁₀(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₁₀(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₁₁(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₁₁(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₁₂(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₁₂(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₁₃(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₁₃(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₁₄(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₁₄(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₁₅(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₁₅(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₁₆(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₁₆(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₁₇(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₁₇(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₁₈(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₁₈(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃、CF₃(CF₂)₁₉(CH₂)₂Si(OCH₃)₃、CF₃(CF₂)₁₉(CH₂)₂Si(OC₂H₅)₃等が挙げられる。

なお、第１及び第２の有機単分子膜は、パターニングにより所望の位置に形成することができる。特に、オンチップでの集積化デバイスを形成するためには、有機単分子膜のパターニングが有効である。例えば、検出部の絶縁層表面には、プローブ分子固定化のために反応性官能基を有する有機分子で構成された第１の単分子膜を、一方で、参照部、更には非ゲート部（テンプレート部）においては、ターゲット分子の非特異的な吸着を避けるために、プローブ分子及びターゲット分子のいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜を、パターニングにより位置選択的に形成する。

参照部としては、第２の有機単分子膜として第１の有機単分子膜と同様の単分子膜に、ターゲット分子と相互作用しない化合物を固定化したものを利用することも可能である。すなわち、ターゲット分子と相互作用しない化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部とすることもできる。この場合、参照部は、前述した検出部における有機単分子膜形成方法及び後述する化合物固定化方法と同じ方法にしたがって形成することができる。

前記半導体センシングデバイスには、前記検出部の第１の有機単分子膜にプローブ分子であるアプタマーが固定化される。例えば、図１（Ｃ）に示されるように、第１の有機単分子膜３にアプタマー１１が結合される。

本発明において、前記アプタマー固定化半導体センシングデバイスに固定化するアプタマーは、検出する対象にあわせて適宜選択すればよい。すなわち、目的とする非荷電分子と結合するアプタマーを選択すればよい。

本発明で用いるアプタマーとしては、核酸アプタマーが好ましい。核酸アプタマーは、ヌクレオチド残基を含む分子であり、ヌクレオチド残基のみからなる分子でもよく、ヌクレオチド残基を含む分子でもよい。前記ヌクレオチドとしては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及びこれらの誘導体が挙げられる。前記アプタマーとしては、デオキシリボヌクレオチド及び／又はその誘導体を含むもの（ＤＮＡアプタマー）でもよく、リボヌクレオチド及び／又はその誘導体を含むもの（ＲＮＡアプタマー）でもよく、これらの両方を含むもの（ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマー）でもよい。前記アプタマーとしては、ＤＮＡアプタマーが好ましい。また、前記アプタマーは、一本鎖アプタマーでも二本鎖アプタマーでもよい。

前記ヌクレオチドは、塩基として、天然塩基（非人工塩基）及び非天然塩基（人工塩基）のいずれを含んでもよい。前記天然塩基としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル及びこれらの修飾塩基が挙げられる。前記修飾としては、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等が挙げられる。前記非天然塩基としては、例えば、２'−フルオロピリミジン、２'−Ｏ−メチルピリミジン等が挙げられ、具体的には、２'−フルオロウラシル、２'−アミノウラシル、２'−Ｏ−メチルウラシル、２'−チオウラシル等が挙げられる。

前記ヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドでもよい。前記修飾ヌクレオチドとしては、２'−メチル化ウラシルヌクレオチド、２'−メチル化シトシンヌクレオチド、２'−フルオロ化ウラシルヌクレオチド、２'−フルオロ化−シトシンヌクレオチド、２'−アミノ化−ウラシルヌクレオチド、２'−アミノ化−シトシンヌクレオチド、２'−チオ化−ウラシルヌクレオチド、２'−チオ化−シトシンヌクレオチド等が挙げられる。前記アプタマーは、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）等の非ヌクレオチドを含んでもよい。

前記アプタマーの塩基数は、特に限定されないが、通常２５〜２００程度であり、好ましくは３５〜１２０程度であり、より好ましくは４０〜８０程度である。

前記アプタマーを前記有機単分子膜に固定化する前に、あらかじめターゲット分子と結合させてターゲット−アプタマー複合体を形成する。前記複合体の形成方法としては、アプタマーにターゲット分子を結合させる際に用いる溶液にアプタマー及びターゲット分子を加える方法が挙げられる。前記溶液としては、ターゲット分子の検出に用いられている一般的な溶液を用いることができるが、特に生理的条件を満たすものが好ましい。例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＭＥＳ緩衝生理食塩水、ＭＯＰＳ緩衝生理食塩水、ＰＩＰＥＳ緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等が好ましく使用できる。また、前記各種生理食塩水のナトリウムイオンをカリウムイオンに置き換えたものも好適に使用できる。なお、前記溶液のｐＨは、５〜１０が好ましく、６〜８がより好ましい。

また、前記溶液に、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺等のイオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）等のキレート剤、Tween（登録商標）20、Triton（登録商標）X-100、Nonidet（登録商標）P-40等の界面活性剤等を加えてもよい。前記イオンを加える場合、その濃度は、０.１〜１０ｍＭが好ましく、０.５〜５ｍＭがより好ましい。前記キレート剤を加える場合、その濃度は、０.１〜１０ｍＭが好ましく、０.５〜５ｍＭがより好ましい。界面活性剤を加える場合、その濃度は、０.００１〜１０体積％が好ましく、０.０５〜５体積％がより好ましい。

アプタマーの添加量は、前記溶液中の濃度が０.０１〜１０μＭとなる量が好ましく、０.０１〜０.１μＭがより好ましい。また、ターゲット分子の添加量は、アプタマーに対し、モル比で、０.００１〜１ｍＭとなる量が好ましく、０.０１〜０.１ｍＭがより好ましい。

前記複合体を形成させるときの温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３０℃がより好ましく、室温（２０〜２５℃）が更に好ましい。反応時間は、３０秒間〜２時間が好ましく、１分〜１時間がより好ましく、５〜３０分間が更に好ましい。

前記アプタマーは、直接又は架橋分子を介して前記有機単分子膜に固定化される。架橋分子としては、グルタルアルデヒド等が挙げられる。この場合、前記有機単分子膜をグルタルアルデヒドで修飾する方法は、特に限定されないが、例えば０.０１〜２５質量％のグルタルアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、１０〜５０℃で１分〜２４時間反応させればよい。

次に、ターゲット−アプタマー複合体のアプタマー中の反応性官能基をグルタルアルデヒドと反応させることでターゲット−アプタマー複合体を固定化する。具体的には、例えば、前記複合体を含む溶液（溶媒は超純水又はＰＢＳ）中で、好ましくは１０〜５０℃で１分〜２４時間、より好ましくは１０〜３５℃で１分〜６０分間反応させればよい。前記複合体の濃度は、０.０１〜１０μＭが好ましく、０.０１〜０.１μＭがより好ましい。

最後に、前記ターゲット−アプタマー複合体からターゲット分子を脱離させることで、アプタマー固定化半導体センシングデバイスが得られる。前記脱離方法としては、尿素水溶液に浸漬する方法、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム水溶液に浸漬する方法、界面活性剤を含む水溶液に浸漬する方法等が挙げられる。尿素水溶液に浸漬する場合は、例えば、５〜１０Ｍ尿素水溶液に２０〜３０℃で５〜６０分間浸漬すればよい。

［非荷電分子の検出方法］
本発明の非荷電分子の検出方法は、前記アプタマー固定化半導体センシングデバイス上に固定化されたアプタマーと非荷電分子とを相互作用させる工程と、該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程とを含む。

図３に、本発明のアプタマー固定化半導体センシングデバイスを用いたアプタマー−非荷電分子相互作用に基づく非荷電分子の検出方法の概念図を示す。この検出方法では、有機単分子膜上に直接固定化されたアプタマーに対し、非荷電分子を相互作用させ、この相互作用により生じる絶縁層の表面電位変化を電気信号として検出する。なお、図３中、１２は非荷電分子である。また、他の構成は、図１と同一の参照符号を付して、その説明を省略する。

アプタマーはリン酸基を有しているため、デバイス上に固定化されたアプタマーと非荷電分子とが相互作用した場合、ターゲット分子の捕捉に伴いアプタマーの構造が変化することでデバイ長内の電荷量が変化し、ゲート電極上の表面電位がシフトする。この場合、電流一定下においては電位シフトを、電圧一定下においては電流のシフトをシグナルとして検出することができる。なお、ｎ型の電界効果トランジスタを用いた場合もｐ型の電界効果トランジスタを用いた場合も、閾値電圧のシフトは同様の挙動を示す。

デバイス上に固定化されたアプタマーと非荷電分子とを相互作用させるには、該非荷電分子を含む溶液を、必要に応じて希釈して、ゲート電極上に載せればよい。このとき、前記溶液としては、非荷電分子の検出に用いられている一般的な溶液を用いることができるが、特に生理的条件を満たすものが好ましい。例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＭＥＳ緩衝生理食塩水、ＭＯＰＳ緩衝生理食塩水、ＰＩＰＥＳ緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等が好ましく使用できる。また、前記各種生理食塩水のナトリウムイオンをカリウムイオンに置き換えたものも好適に使用できる。なお、前記溶液のｐＨは、５〜１０が好ましく、６〜８がより好ましい。

デバイス上に固定化されたアプタマーと非荷電分子とを相互作用させるときの温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３０℃がより好ましく、室温（２０〜２５℃）が更に好ましい。反応時間は、３０秒間〜２時間が好ましく、１分〜１時間がより好ましく、５〜３０分間が更に好ましい。

本発明において検出の対象となる非荷電分子は、アプタマーと相互作用する性質を有するものであれば特に限定されない。例えば、ステロイド骨格を有する化合物、ペプチド、アミノ酸誘導体、芳香族化合物、糖等が挙げられる。

前記ステロイド骨格を有する化合物としては、コルチゾール、コレステロール、プロゲステロン、１１−デオネシコルチコステロン、コルチコステロン、アルドステロン、コルチゾン、デヒドロエピアンドロステロン、デヒドロエピアンドロステロンサルフェート、ジヒドロテストステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、テストステロン、１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール等が挙げられる。

前記ペプチドとしては、カルシトニン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、バソプレッシン、副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、オキシトシン、グルカゴン、セクレチン等が挙げられる。

前記アミノ酸誘導体としては、メラトニン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン等が挙げられる。

前記芳香族化合物としては、トルエン、エチルベンゼン、クメン、ベンジルアルコール、アニソール、ベンズアルデヒド、アセトフェノン、ニトロベンゼン、チオフェノール、ベンゾニトリル、スチレン、キシレン、ビフェニル、ベンゾフェノン、トリフェニルメタン、ナフタレン、アントラセン、テトラセン、ペンタセン、フェナントレン、クリセン、トリフェニレン、テトラフェン、ピレン、ピセン、ペンタフェン、ペリレン、ヘリセン、コロネン等が挙げられる。

前記糖としては、グルコース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、イドース、セドヘプツロース、コリオース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、アピオース、リブロース、キシルロース、エリトロース、トレオース、エリトルロース、グリセルアルデヒド等の単糖、これらの単糖からなるオリゴ糖又は多糖が挙げられる。

検出可能な非荷電分子の濃度はその種類によって異なるが、通常１０ｎＭ〜１０ｍＭ程度であり、１００ｎＭ〜１ｍＭ程度が好ましい。

本発明のデバイスは、非荷電分子を高感度に検出することが可能である。また、生理的条件下における非荷電分子の検出が可能となる。本発明のデバイスは、生体試料中のバイオマーカー検出等に好適に使用できる。

以下、実施例及び比較例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されない。なお、実施例で使用したアプタマーは、ＮＥＣソリューションイノベータ(株)より提供されたものである。

［１］半導体センシングデバイスの構築
［実施例１］アプタマー固定化半導体センシングデバイスの構築１
（１）有機単分子膜の形成
凸版印刷(株)製の１０μｍ長、１,０００μｍ幅のｎ型ＦＥＴからアセトンを用いて超音波処理することでフォトレジストを除去した。ゲート表面にヒドロキシ基を導入して活性部位を作製するため、プラズマリアクターPR301（ヤマト科学(株)製）を用いて、２００ＷのＯ₂プラズマに１分間暴露した。
アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ、Sigma-Aldrich社製）を１質量％含むトルエン中にデバイスを浸漬し、アルゴン雰囲気下、６０℃で７分間静置することで、ゲート上へ単分子膜を成膜した。単分子膜を形成したＦＥＴをメタノール／トルエン混合溶媒（質量比１：１）を用いて超音波洗浄し、エタノールでリンスし、ゲート表面にＡＰＳの単分子膜が形成されたＦＥＴを作製した。

（２）アプタマーの固定
前記単分子膜のアミノ基とアプタマーとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、２.５質量％のグルタルアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水（１３７ｍＭＮａＣｌ、２.７ｍＭＫＣｌ、８.１ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、１.５ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７.４、以下１×ＰＢＳともいう。）１０μＬを前記単分子膜が形成されたデバイスの検出部に滴下し、室温で３０分間静置することにより行った。

次に、１×ＰＢＳのナトリウムイオンを全てカリウムイオンに置き換えた緩衝液（１４０ｍＭＫＣｌ、８.１ｍＭＫ₂ＨＰＯ₄、１.５ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、以下、１×ＰＢＳＫともいう。）に、アプタマー及びコルチゾールがそれぞれ１００ｎＭ及び５０μＭになるように添加し、室温で６０分間静置し、コルチゾール−アプタマー複合体（Ｃ−Ａ複合体）を形成させた。

グルタルアルデヒドによって架橋を行ったゲート電極部を、前記Ｃ−Ａ複合体を含む１×ＰＢＳＫに１時間浸漬し、Ｃ−Ａ複合体を有機単分子膜上に固定化した。Ｃ−Ａ複合体を固定化したデバイスを、８Ｍ尿素水溶液に浸漬し、室温で１時間静置することでＣ−Ａ複合体からコルチゾールを脱離し、アプタマー固定化デバイス１を構築した。

［比較例１］アプタマー固定化半導体センシングデバイスの構築２
Ｃ−Ａ複合体を含む１×ＰＢＳＫのかわりに、１００ｎＭのアプタマーを含む１×ＰＢＳを用いた以外は、実施例１と同様の方法で、アプタマー固定化デバイス２を構築した。

［２］非荷電分子の検出
［実施例２］
デバイス１を洗浄後、ホルダーに設置し、デバイスの検出部を０.０４×ＰＢＳＫ０.５ｍＬに３分間浸漬した。浸漬後、室温で、アプタマー固定化デバイスの電流−電圧曲線を、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件は、ゲート電圧（Ｖ_g）を−３.０〜０.５Ｖ、ドレイン電圧（Ｖ_d）を０.１Ｖとした。続けて１ｍＭコルチゾールを含む１×ＰＢＳ２０μＬをアプタマー固定化デバイスのゲート表面上に添加し、３０分間静置した後、１×ＰＢＳ３ｍＬ及び０.０４×ＰＢＳＫ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、ゲート表面上に０.０４×ＰＢＳＫを０.５ｍＬ添加して３分間静置した後、コルチゾール吸着デバイスの電流−電圧曲線を測定し、コルチゾール添加前後でのゲート電圧シフトΔＶ_gを評価した。結果を図４に示す。

［比較例２］
デバイス１のかわりにデバイス２を用いた以外は、実施例２と同様の方法でコルチゾール吸着デバイスの電流−電圧曲線を測定し、コルチゾール添加前後でのゲート電圧シフトΔＶ_gを評価した。結果を図５に示す。

図４及び５中、点線はコルチゾール添加前のデバイス特性を表し、実線はコルチゾール添加後のデバイス特性を表す。アプタマー固定化デバイス１にコルチゾールを添加した場合、電流−電圧曲線が正方向に大きくシフトした。Ｃ−Ａ複合体を形成させてからアプタマーを固定化したデバイスを用いた方が、Ｃ−Ａ複合体を形成させずにアプタマーを固定化したデバイスを用いた場合に比べて、検出感度の点で有利であることが示された。

１シリコン基板
２絶縁層
３第１の有機単分子膜
４ゲート電極
５ソース電極
６ドレイン電極
７ドープ領域
８参照部
９検出部
１０テンプレート部
１１アプタマー（プローブ分子）
１２非荷電分子

Claims

半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの前記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有する有機単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜に、あらかじめターゲット分子を結合させたプローブ分子であるアプタマーを、前記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させ、その後、該ターゲット分子を該アプタマーから脱離させてなる、アプタマー／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるアプタマー固定化半導体センシングデバイス。
前記アプタマーが、ＤＮＡアプタマーである請求項１記載のアプタマー固定化半導体センシングデバイス。
前記半導体上に、更に、参照ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第２の絶縁層が形成され、該第２の絶縁層の上に、前記アプタマー及び非荷電分子のいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜を形成してなる、有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部として備える請求項１又は２記載のアプタマー固定化半導体センシングデバイス。
請求項１〜３のいずれか１項記載のアプタマー固定化半導体センシングデバイス上に固定化されたアプタマーと非荷電分子とを相互作用させる工程と、
該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程と
を含む非荷電分子の検出方法。
前記非荷電分子が、ステロイド骨格を有する化合物である請求項４記載の非荷電分子の検出方法。