JP2023127206A - 小型非荷電分子の検出方法 - Google Patents
小型非荷電分子の検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023127206A JP2023127206A JP2022030843A JP2022030843A JP2023127206A JP 2023127206 A JP2023127206 A JP 2023127206A JP 2022030843 A JP2022030843 A JP 2022030843A JP 2022030843 A JP2022030843 A JP 2022030843A JP 2023127206 A JP2023127206 A JP 2023127206A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- small uncharged
- molecule
- molecules
- detecting
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 58
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 claims abstract description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 8
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 claims description 67
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 66
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 31
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 13
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 11
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229910052809 inorganic oxide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000005669 field effect Effects 0.000 claims description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 44
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 44
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 38
- -1 pentane-1,5-diyl group Chemical group 0.000 description 36
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 17
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 16
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 11
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 8
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 8
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 125000004183 alkoxy alkyl group Chemical group 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 6
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 5
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000004200 2-methoxyethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002344 aminooxy group Chemical group [H]N([H])O[*] 0.000 description 3
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 3
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 3
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 2
- 125000005745 ethoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 125000004184 methoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- LQILVUYCDHSGEU-UHFFFAOYSA-N 4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexane-1-carboxylic acid Chemical compound C1CC(C(=O)O)CCC1CN1C(=O)C=CC1=O LQILVUYCDHSGEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 1
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 1
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N anastrozole Chemical compound N#CC(C)(C)C1=CC(C(C)(C#N)C)=CC(CN2N=CN=C2)=C1 YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002932 anastrozole Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 190000008236 carboplatin Chemical compound 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- 238000011898 label-free detection Methods 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 229920002120 photoresistant polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- WFWLQNSHRPWKFK-ZCFIWIBFSA-N tegafur Chemical compound O=C1NC(=O)C(F)=CN1[C@@H]1OCCC1 WFWLQNSHRPWKFK-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- 229960001674 tegafur Drugs 0.000 description 1
- 125000000383 tetramethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 125000003258 trimethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N vinorelbine Chemical compound C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N 0.000 description 1
- 229960002066 vinorelbine Drugs 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
Abstract
【課題】ＦＥＴを用いて簡便かつ高感度に小型非荷電分子を検出することを可能にする方法を提供する。【解決手段】（Ａ）小型非荷電分子と、半導体センシングデバイス上に固定化された該小型非荷電分子と相互作用するプローブ分子とを相互作用させる工程、（Ｂ）工程（Ａ）後、更に、前記小型非荷電分子が修飾されたタンパク質を、前記プローブ分子と相互作用させる工程、及び（Ｃ）工程（Ｂ）後、前記相互作用によるゲートチャネル領域の電位変化を検出する工程を含む小型非荷電分子の検出方法。【選択図】なし
Description
本発明は、小型非荷電分子の検出方法に関する。
電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）型バイオセンサ（以下ＦＥＴバイオセンサと略す。）は、生体試料中の分子の検出に非常に有望なツールである。ＦＥＴバイオセンサを用いると、対象分子の吸着に伴うゲート表面の電荷密度変化を電気信号として直接検出するため、ラベルフリー検出が可能であり、低コストで迅速な生体分子の検出が可能である。それゆえ、ＦＥＴバイオセンサを用いた分子の検出に関する研究が広く行われている。
ＦＥＴバイオセンサは、電荷検出範囲であるデバイ長内において、プローブ分子に捕捉された検出対象分子（以下、ターゲット分子ともいう。）の電荷に起因するゲートチャネル領域の電位の変化を測定するデバイスである。そのため、電荷を有しない小型非荷電分子の直接的な検出が困難であった。小型非荷電分子を検出するため、これまでに２種類の抗体を利用したサンドイッチアッセイの適用が試みられてきた（非特許文献１、２）。しかし、小型分子は、分子サイズが小さく、分子が抗原認識ドメイン内に包み込まれることから、複数の抗体が同時に結合できず、サンドイッチアッセイを利用したＦＥＴバイオセンサによる検出が困難であった。
ガン治療の化学療法に幅広く使用される抗がん剤である５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）は、患者の体表面積換算によって投与量が決定されている。しかし、その代謝速度は肝機能に依存するため個人差があり、至適濃度範囲で投与されている患者は２０％程度である。さらに、現行法（例えば、ＥＬＩＳＡやＨＰＬＣ）は、測定時間や費用がかかることも問題となっている。そのため、迅速な血中濃度モニタリングが必要とされている。
Anal. Chem., 2017, Vol. 89, pp. 11325-11331
ACS Omega, 2019, Vol. 4, pp. 14765-14771
本発明は、前記事情に鑑みなされたもので、ＦＥＴバイオセンサを用いて簡便かつ高感度に小型非荷電分子を検出することを可能にする方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、前記目的を達成するため鋭意研究を行った結果、小型非荷電分子と該小型非荷電分子が修飾されたタンパク質との間のゲート絶縁膜上に固定化された該小型非荷電分子と相互作用するプローブ分子への競合を利用することによって、ＦＥＴバイオセンサを用いた小型非荷電分子の検出が可能となることを見出し、本発明をなすに至った。
したがって、本発明は、下記小型非荷電分子の検出方法を提供する。
１．（Ａ）小型非荷電分子と、半導体センシングデバイス上に固定化された該小型非荷電分子と相互作用するプローブ分子とを相互作用させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）後、更に、前記小型非荷電分子が修飾されたタンパク質を、前記プローブ分子と相互作用させる工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ）後、前記相互作用によるゲートチャネル領域の電位変化を検出する工程
を含む小型非荷電分子の検出方法。
２．前記プローブ分子が固定化された半導体センシングデバイスが、半導体上に反応ゲート絶縁膜としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成されたＦＥＴの前記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有する有機単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜にプローブ分子を前記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させてなる、プローブ分子／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものである１の小型非荷電分子の検出方法。
３．前記前記プローブ分子が、Ｆａｂである１又は２の小型非荷電分子の検出方法。
４．生体試料中に含まれる小型非荷電分子を検出する方法である１～３のいずれかの小型非荷電分子の検出方法。
５．前記小型非荷電分子が含まれた生体試料が、血清である４の小型非荷電分子の検出方法。
６．前記小型非荷電分子が含まれた生体試料を、工程（Ａ）の前に界面活性剤で前処理する工程を含む４又は５の小型非荷電分子の検出方法。
７．前記小型非荷電分子が、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）である１～５のいずれかの小型非荷電分子の検出方法。
１．（Ａ）小型非荷電分子と、半導体センシングデバイス上に固定化された該小型非荷電分子と相互作用するプローブ分子とを相互作用させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）後、更に、前記小型非荷電分子が修飾されたタンパク質を、前記プローブ分子と相互作用させる工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ）後、前記相互作用によるゲートチャネル領域の電位変化を検出する工程
を含む小型非荷電分子の検出方法。
２．前記プローブ分子が固定化された半導体センシングデバイスが、半導体上に反応ゲート絶縁膜としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成されたＦＥＴの前記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有する有機単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜にプローブ分子を前記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させてなる、プローブ分子／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものである１の小型非荷電分子の検出方法。
３．前記前記プローブ分子が、Ｆａｂである１又は２の小型非荷電分子の検出方法。
４．生体試料中に含まれる小型非荷電分子を検出する方法である１～３のいずれかの小型非荷電分子の検出方法。
５．前記小型非荷電分子が含まれた生体試料が、血清である４の小型非荷電分子の検出方法。
６．前記小型非荷電分子が含まれた生体試料を、工程（Ａ）の前に界面活性剤で前処理する工程を含む４又は５の小型非荷電分子の検出方法。
７．前記小型非荷電分子が、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）である１～５のいずれかの小型非荷電分子の検出方法。
本発明によれば、ＦＥＴバイオセンサを用いて小型非荷電分子を高感度で検出することが可能となる。
本発明の小型非荷電分子の検出方法は、（Ａ）小型非荷電分子と、半導体センシングデバイス上に固定化された該小型非荷電分子と相互作用するプローブ分子とを相互作用させる工程、（Ｂ）工程（Ａ）後、更に、前記小型非荷電分子が修飾されたタンパク質を、前記プローブ分子と相互作用させる工程、及び（Ｃ）工程（Ｂ）後、前記相互作用によるゲートチャネル領域の電位変化を検出する工程を含むものである。なお、本発明において小型非荷電分子とは、分子量が概ね１,０００以下の電荷を有しない分子を意味する。
本発明で用いる半導体センシングデバイスは、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成されたＦＥＴの前記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有する有機単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜にプローブ分子を前記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させてなる、プローブ分子／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものが好ましい。
前記検出部のうち、絶縁層／半導体構造部分は、通常のＦＥＴからゲート電極を取り除くことで得られ、その構成は、従来公知のものを利用することができる。前記絶縁層は、シリコン酸化物であることが好ましい。このＦＥＴ構造は、ｎ型でもｐ型でもよい。このＦＥＴとしては、例えば、図１（Ａ）に示されるものが挙げられる。なお、図１中、１はシリコン基板、１ａはゲートチャネル領域、２はシリコン酸化物又は無機酸化物（ガラス、アルミナ等）を含む絶縁層、４はゲート電極、５はソース電極、６はドレイン電極、７はドープ領域を示す。
そして、図１（Ｂ）に示されるように、絶縁層２上に第１の有機単分子膜３が形成される。ここで、本発明においては、基本原理として、絶縁層表面上のプローブ分子とターゲット分子の結合反応に伴うゲートチャネル領域の電位変化を電気信号として検出する構成とする。なお、前記絶縁層の厚さは、３０～３００ｎｍ、特に５０～１５０ｎｍが好ましい。
前記第１の有機単分子膜は、反応性官能基を有する有機単分子膜からなる。前記反応性官能基を有する有機単分子膜は、下記式（１）で表されるアルコキシシランの単分子膜であることが好ましい。
式（１）中、Ｒは、アミノ基、アミノオキシ基、カルボキシ基又はチオール基である。
式（１）中、Ｒ1は、炭素数３～２２の直鎖状アルカンジイル基である。前記直鎖状アルカンジイル基は、炭素数が３～１８であるものが好ましく、炭素数が３～８であるものがより好ましい。炭素鎖が短い方が、有機単分子膜の有する疎水性が弱くなり、ターゲット分子の疎水性相互作用に起因する非特異的吸着を抑制することができるため好ましい。
Ｒ1で表される直鎖状アルカンジイル基の具体例としては、プロパン－１,３－ジイル基、ブタン－１,４－ジイル基、ペンタン－１,５－ジイル基、ヘキサン－１,６－ジイル基、ヘプタン－１,７－ジイル基、オクタン－１,８－ジイル基、ノナン－１,９－ジイル基、デカン－１,１０－ジイル基、ウンデカン－１,１１－ジイル基、ドデカン－１,１２－ジイル基、トリデカン－１,１３－ジイル基、テトラデカン－１,１４－ジイル基、ペンタデカン－１,１５－ジイル基、ヘキサデカン－１,１６－ジイル基、ヘプタデカン－１,１７－ジイル基、オクタデカン－１,１８－ジイル基、ノナデカン－１,１９－ジイル基、エイコサン－１,２０－ジイル基、ヘンエイコサン－１,２１－ジイル基、ドコサン－１,２２－ジイル基が挙げられる。これらのうち、炭素数３～１８のものが好ましく、炭素数３～８のものがより好ましい。
式（１）中、Ｒ2～Ｒ4は、それぞれ独立に、炭素数１～５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２～５の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。前記アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられる。これらのうち、メチル基又はエチル基が好ましい。また、前記アルコキシアルキル基としては、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２－メトキシエチル基、２－エトキシエチル基等が挙げられる。これらのうち、炭素数２～３のアルコキシアルキル基が好ましい。Ｒ2～Ｒ4としては、特にメチル基、エチル基、２－メトキシエチル基等が好ましい。
前記Ｒがアミノ基、カルボキシ基又はチオール基であるアルコキシシランとしては、市販品を使用し得る。また、前記Ｒがアミノオキシ基であるアルコキシシランは、下記スキームにしたがって合成できる。
（式中、Ｒ1～Ｒ4は、前記と同じ。Ｒ5は、Ｒ1から炭素数が２減少した直鎖状アルカンジイル基である。）
前記Ｒがアミノオキシ基であるアルコキシシランは、トリアルコキシヒドロシランとＯ－アルケニルヒドロキシアミンとを白金系触媒で処理することによって調製することができる。例えば、窒素雰囲気下、トリアルコキシヒドロシランとＯ－アルケニルヒドロキシアミンとの混合物に、ヘキサクロロ白金(IV)酸等の白金系触媒を加え、１０～２００℃で１～１,２００時間、より好ましくは６０～１２０℃で１２～４８時間反応させることにより調製できる。成膜操作には、過剰のトリアルコキシヒドロシランを例えば蒸留等の操作により除去したものを使用することが好ましい。
第１の有機単分子膜は、前記アルコキシシランを気相化学反応又は液相反応によって絶縁層上に形成し、その最適化、例えば、有機分子の自己集積化機能によって単分子が最密パッキングされた膜が形成される。気相化学反応によって単分子膜を成膜する場合は、例えば、容器に基板及びアルコキシシランを封入し、アルゴン不活性雰囲気中で好ましくは８０～２００℃で１～２４時間、より好ましくは１００～１３０℃で２～５時間反応させることで成膜できる。液相反応によって単分子膜を成膜する場合は、例えば、アルゴン不活性雰囲気中でアルコキシシランを含む有機溶媒中に基板を浸漬し、好ましくは２０～８０℃で１分間～２４時間、より好ましくは５５～６５℃で５～２０分間静置することで成膜できる。
前記有機溶媒としては、トルエン、メタノール、エタノール等が挙げられ、特にトルエン、メタノール等が好ましい。
前記ＦＥＴの半導体上には、更に、参照ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第２の絶縁層を形成することができる。この第２の絶縁層の上には、第２の有機単分子膜として、プローブ分子及びターゲット分子である小型非荷電分子のいずれとも反応しない有機分子で構成された単分子膜を形成し、この単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部とすることができる。なお、反応ゲート絶縁部と参照ゲート絶縁部とを、電位変化測定において互いに影響を与えない程度に離間させれば、反応ゲート絶縁部の第１の絶縁層と参照ゲート絶縁部の第２の絶縁層とを同一層内に設けることもできる。
図２は、有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部９及び参照部８に適用したオンチップデバイスのユニット構成例を示す。なお、図２中、１はシリコン基板、２は絶縁層、１０はテンプレート部である。このデバイスのユニット構成は図示した構成に限定されず、検出部と参照部とは必ずしも１対１の関係で配置する必要はなく、必要に応じて検出部及び参照部の数及び組合せを適宜変更して配置することができる。また、検出部及び参照部は各々数～数十μｍのサイズで形成可能である。
前記第２の有機単分子膜としては、フッ素化されていてもよい炭素数８～２２の直鎖状アルキル基を有するアルコキシシランの単分子膜が好ましい。なお、有機単分子膜としてアルコキシシランの単分子膜を用いる場合、前記第２の絶縁層はシリコン酸化物で形成されたものが好ましい。
第２の有機単分子膜は、絶縁層上に均一な膜を形成させるため、自己集積化膜であることが好ましい。具体的には、下記式（２）で表されるトリアルコキシシランの単分子膜であることが好ましい。
式（２）中、Ｒ6は、炭素数８～２２、好ましくは炭素数１０～１８の直鎖状アルキル基であり、水素原子の一部又は全部がフッ素原子で置換されていてもよい。前記直鎖状アルキル基は、炭素数が１０～１８であるものが好ましい。前記直鎖状アルキル基として具体的には、ｎ－オクチル基、ｎ－ノニル基、ｎ－デシル基、ｎ－ウンデシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－トリデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ペンタデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－ヘプタデシル基、ｎ－オクタデシル基、ｎ－ノナデシル基、ｎ－エイコシル基、ｎ－ヘンエイコシル基、ｎ－ドコシル基等が挙げられる。
式（２）中、Ｒ7～Ｒ9は、それぞれ独立に、炭素数１～５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２～５の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。前記アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられる。これらのうち、メチル基又はエチル基が好ましい。また、前記アルコキシアルキル基としては、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２－メトキシエチル基、２－エトキシエチル基等が挙げられる。これらのうち、炭素数２～３のアルコキシアルキル基が好ましい。
式（２）で表されるトリアルコキシシランとして具体的には、CH3(CH2)7Si(OCH3)3、CH3(CH2)7Si(OC2H5)3、CH3(CH2)8Si(OCH3)3、CH3(CH2)8Si(OC2H5)3、CH3(CH2)9Si(OCH3)3、CH3(CH2)9Si(OC2H5)3、CH3(CH2)10Si(OCH3)3、CH3(CH2)10Si(OC2H5)3、CH3(CH2)11Si(OCH3)3、CH3(CH2)11Si(OC2H5)3、CH3(CH2)12Si(OCH3)3、CH3(CH2)12Si(OC2H5)3、CH3(CH2)13Si(OCH3)3、CH3(CH2)13Si(OC2H5)3、CH3(CH2)14Si(OCH3)3、CH3(CH2)14Si(OC2H5)3、CH3(CH2)15Si(OCH3)3、CH3(CH2)15Si(OC2H5)3、CH3(CH2)16Si(OCH3)3、CH3(CH2)16Si(OC2H5)3、CH3(CH2)17Si(OCH3)3、CH3(CH2)17Si(OC2H5)3、CH3(CH2)18Si(OCH3)3、CH3(CH2)18Si(OC2H5)3、CH3(CH2)19Si(OCH3)3、CH3(CH2)19Si(OC2H5)3、CH3(CH2)20Si(OCH3)3、CH3(CH2)20Si(OC2H5)3、CH3(CH2)21Si(OCH3)3、CH3(CH2)21Si(OC2H5)3、CF3(CF2)5(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)5(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)6(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)6(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)7(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)7(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)8(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)8(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)9(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)9(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)10(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)10(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)11(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)11(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)12(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)12(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)13(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)13(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)14(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)14(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)15(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)15(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)16(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)16(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)17(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)17(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)18(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)18(CH2)2Si(OC2H5)3、CF3(CF2)19(CH2)2Si(OCH3)3、CF3(CF2)19(CH2)2Si(OC2H5)3等が挙げられる。
なお、第１及び第２の有機単分子膜は、パターニングにより所望の位置に形成することができる。特に、オンチップでの集積化デバイスを形成するためには、有機単分子膜のパターニングが有効である。例えば、検出部の絶縁層表面には、プローブ分子固定化のために反応性官能基を有する有機分子で構成された第１の単分子膜を、一方で、参照部、更には非ゲート部（テンプレート部）においては、ターゲット分子の非特異的な吸着を避けるために、プローブ分子及びターゲット分子のいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜を、パターニングにより位置選択的に形成する。
参照部としては、第２の有機単分子膜として第１の有機単分子膜と同様の単分子膜に、ターゲット分子と相互作用しない化合物を固定化したものを利用することも可能である。すなわち、ターゲット分子と相互作用しない化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部とすることもできる。この場合、参照部は、前述した検出部における有機単分子膜形成方法及び後述する化合物固定化方法と同じ方法にしたがって形成することができる。
前記半導体センシングデバイスには、前記検出部の第１の有機単分子膜にプローブ分子が固定化される。例えば、図１（Ｃ）に示されるように、第１の有機単分子膜３にプローブ分子１１が結合される。
前記プローブ分子は、直接又は架橋分子を介して前記有機単分子膜に固定化される。架橋分子としては、例えば、グルタルアルデヒド等が挙げられる。この場合、前記有機単分子膜をグルタルアルデヒド修飾する方法は、特に限定されないが、例えば０.０１～２５質量％のグルタルアルデヒド水溶液中で、１０～５０℃で１分～２４時間反応させればよい。
次に、プローブ分子中のアミノ基等の反応性官能基をグルタルアルデヒドと反応させることでプローブ分子を固定化する。具体的には、例えば、プローブ分子を含む溶液（溶媒は超純水、リン酸緩衝生理食塩水等）中で、１０～５０℃で１分～２４時間反応させればよい。好ましくは、１０～３５℃で１分～６０分間反応させればよい。前記プローブ分子の濃度は、１ｐｇ/ｍＬ～１ｍｇ/ｍＬが好ましく、１００ｎｇ/ｍＬ～１００μｇ/ｍＬがより好ましい。
前記プローブ分子は、検出対象となる小型非荷電分子と結合するものを適宜選択すればよい。前記プローブ分子としては、例えば、抗体が挙げられる。本発明において抗体とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等の免疫グロブリンや、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')2）を含むものとする。また、抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。本発明においては、特にプローブ分子としてＦａｂを用いることが好ましい。
図３に、本発明の半導体センシングデバイスを用いた小型非荷電分子の検出方法の概念図を示す。この検出方法では、有機単分子膜上に直接固定化された固定化されたプローブ分子と小型非荷電分子とを相互作用させた後、前記小型非荷電分子が修飾されたタンパク質を前記プローブ分子と相互作用させ、前記相互作用によるゲートチャネル領域１ａの電位変化を検出する。なお、図３中、１２は小型非荷電分子であり、１３は小型非荷電分子が修飾されたタンパク質であり、また、他の構成は、図１と同一の参照符号を付して、その説明を省略する。
小型非荷電分子は電荷を有していないため、プローブ分子との相互作用によってデバイ長内の電荷量は変化しないが、小型非荷電分子とプローブ分子とを相互作用させた後、更に該小型非荷電分子が修飾されたタンパク質とプローブ分子とを相互作用させることで、測定対象の小型非荷電分子の濃度に依存して小型非荷電分子が修飾されたタンパク質のセンサ表面への吸着量が変化する。すなわち、測定対象の小型非荷電分子の濃度に依存してゲートチャネル領域の電位が変化する。この場合、電流一定下においては電位シフトを、電圧一定下においては電流のシフトをシグナルとして検出することができる。なお、ｎ型のＦＥＴを用いた場合とｐ型のＦＥＴを用いた場合とでは、閾値電圧のシフトは互いに逆になる。
工程（Ａ）において、デバイス上に固定化されたプローブ分子と小型非荷電分子とを相互作用させるには、該小型非荷電分子を含む溶液を、必要に応じて希釈して、ゲート電極上に載せればよい。このとき、前記溶液としては、分子の検出に用いられている一般的な溶液を用いることができるが、特に生理的条件を満たすものが好ましい。例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＭＥＳ緩衝生理食塩水、ＭＯＰＳ緩衝生理食塩水、ＰＩＰＥＳ緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等が好ましく使用できる。なお、前記溶液のｐＨは、５～１０が好ましく、６～８がより好ましい。
また、前記溶液に、Ｃａ2+、Ｍｇ2+等のイオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）等のキレート剤、Tween（登録商標）20、Triton（登録商標）X-100、Nonidet（登録商標）P-40等の界面活性剤等を加えてもよい。前記イオンを加える場合、その濃度は、０.１～１０ｍＭが好ましく、０.５～５ｍＭがより好ましい。前記キレート剤を加える場合、その濃度は、０.１～１０ｍＭが好ましく、０.５～５ｍＭがより好ましい。界面活性剤を加える場合、その濃度は、０.００１～１０体積％が好ましく、０.０５～５体積％がより好ましい。
工程（Ａ）において、デバイス上に固定化されたプローブ分子と小型非荷電分子とを相互作用させるときの温度は、０～４０℃が好ましく、１０～３０℃がより好ましく、室温（２０～２５℃）が更に好ましい。反応時間は、３０秒間～２時間が好ましく、１分～１時間がより好ましく、５～３０分間が更に好ましい。
検出可能な小型非荷電分子の濃度はその種類によって異なるが、通常０～１,０００ｎｇ/ｍＬ程度であり、０～５００ｎｇ/ｍＬ程度が好ましく、０～２００ｎｇ/ｍＬがより好ましい。
工程（Ａ）の後、工程（Ｂ）の前に洗浄工程を設けてもよい。前記洗浄工程において使用する洗浄液は、前述したデバイス上に固定化されたプローブ分子とタンパク質とを相互作用させるときに用いる生理的条件を満たす溶液が好ましい。また、前記洗浄液には、更に前述したイオン、キレート剤、界面活性剤等を加えてもよい。この場合、前述した濃度になるように添加することが好ましい。
次に、工程（Ｂ）において、有機単分子膜上に固定化されたプローブ分子と小型非荷電分子とを相互作用させた後添加する小型非荷電分子が修飾されたタンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カチオン化ウシ血清アルブミン（カチオン化ＢＳＡ）キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、Blue Carrierタンパク質、オボアルブミン（ＯＶＡ）等に前記小型非荷電分子が修飾されたものが好ましい。
小型非荷電分子をタンパク質に修飾する方法としては、公知の方法を採用することができる。例えば、１－エチル－３－[３－(ジメチルアミノ)プロピル]カルボジイミド、４－(Ｎ－マレイミドメチル)シクロヘキサン－１－カルボン酸３－スルホ－Ｎ－スクシンイミジルナトリウム、グルタルアルデヒド等の架橋剤を介して小型非荷電分子をタンパク質に結合させる方法が挙げられる。また、必要に応じて小型非荷電分子に前記架橋剤と反応する官能基を導入して、前記架橋剤を用いて小型非荷電分子をタンパク質に結合させてもよく、例えば、５－ＦＵをＢＳＡに結合させる場合は、Macromol. Biosci. 2014, Vol.14, pp. 428-439に記載された方法を参考にすることができる。小型非荷電分子が修飾されたタンパク質としては、市販品を使用することもできる。
小型非荷電分子が修飾されたタンパク質を添加する場合は、該小型非荷電分子が修飾されたタンパク質を含む溶液を、必要に応じて希釈して、ゲート電極上に載せればよい。このとき、前記溶液としては、特に限定されないが、生理的条件を満たすものが好ましい。例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＭＥＳ緩衝生理食塩水、ＭＯＰＳ緩衝生理食塩水、ＰＩＰＥＳ緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等が好ましく使用できる。なお、前記溶液のｐＨは、５～１０が好ましく、６～８がより好ましい。
前記溶液中の小型非荷電分子が修飾されたタンパク質の濃度は、１～１００μｇ/ｍＬが好ましく、２０～５０μｇ/ｍＬがより好ましい。
また、前記溶液に、Ｃａ2+、Ｍｇ2+等のイオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）等のキレート剤、Tween（登録商標）20、Triton（登録商標）X-100、Nonidet（登録商標）P-40等の界面活性剤等を加えてもよい。前記イオンを加える場合、その濃度は、０.１～１０ｍＭが好ましく、０.５～５ｍＭがより好ましい。前記キレート剤を加える場合、その濃度は、０.１～１０ｍＭが好ましく、０.５～５ｍＭがより好ましい。界面活性剤を加える場合、その濃度は、０.００１～１０体積％が好ましく、０.０５～５体積％がより好ましい。
工程（Ｂ）において、デバイス上に固定化されたプローブ分子と前記小型非荷電分子が修飾されたタンパク質とを相互作用させるときの温度は、０～４０℃が好ましく、１０～３０℃がより好ましく、室温（２０～２５℃）が更に好ましい。反応時間は、３０秒間～２時間が好ましく、１分間～１時間がより好ましく、５～３０分間が更に好ましい。
工程（Ｂ）の後、工程（Ｃ）の前に洗浄工程を設けてもよい。前記洗浄工程において使用する洗浄液は、前述したデバイス上に固定化されたプローブ分子とタンパク質とを相互作用させるときに用いる生理的条件を満たす溶液が好ましい。また、前記洗浄液には、更に前述したイオン、キレート剤、界面活性剤等を加えてもよい。この場合、前述した濃度になるように添加することが好ましい。
工程（Ｃ）において、小型非荷電分子が修飾されたタンパク質に由来するゲートチャネル領域の電位変化を、前記半導体センシングデバイスを用いて検出する。具体的には、例えば、検出部とゲート電極との間に電解液を満たし、ゲート電圧を印加してゲートチャネル領域の電位変化を検出する。前記電解液としては、リン酸緩衝液や、前述したデバイス上に固定化されたプローブ分子とタンパク質とを相互作用させるときに用いる生理的条件を満たす溶液が挙げられる。工程（Ａ）においてプローブ分子と相互作用した小型非荷電分子が少ない（すなわち、測定試料中の小型非荷電分子の濃度が小さい）場合は、プローブ分子と相互作用する小型非荷電分子が修飾されたタンパク質が多いため、大きな電位変化が観測される。一方、工程（Ａ）においてプローブ分子と相互作用した小型非荷電分子が多い（すなわち、測定試料中の小型非荷電分子の濃度が大きい）場合は、その逆であり、電位変化は小さくなる。これによって、定量的に測定試料中の小型非荷電分子を検出することが可能となる。
本発明の方法によれば、小型非荷電分子を高感度に検出することが可能である。また、生理的条件下における小型非荷電分子の検出が可能となる。前記小型非荷電分子としては、プローブ分子と相互作用する性質を有するものであれば特に限定されないが、例えば、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、マイトマイシンＣ、シクロホスファミド、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、ビノレルビン、テガフール、メトトレキサート、アナストロゾール、ゲフィチニブ、イマチニブ、ウベニメクス等の抗がん剤、エストラジオール、プロゲステロン、コルチゾール、甲状腺ホルモン、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミン等が挙げられる。
本発明の方法は、特に、生体試料中の小型非荷電分子の検出に好適に使用できる。前記生体試料としては、血清、血液、尿、汗、唾液、間質液、組織抽出物、細胞抽出物等が挙げられる。これらのうち、特に血清、尿、汗、唾液中の小型非荷電分子の検出に有用である。これらの生体試料中の小型非荷電分子を検出する場合は、工程（Ａ）において生体試料をそのまま前記デバイスのゲート電極上に添加してもよいが、必要に応じて希釈してから小型非荷電分子のゲート電極上に添加してもよい。希釈するための溶液としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＭＥＳ緩衝生理食塩水、ＭＯＰＳ緩衝生理食塩水、ＰＩＰＥＳ緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等が好ましく使用できる。なお、前記溶液のｐＨは、５～１０が好ましく、６～８がより好ましい。
また、前記希釈するための溶液に、Ｃａ2+、Ｍｇ2+等のイオン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）等のキレート剤、Tween（登録商標）20、Triton（登録商標）X-100、Nonidet（登録商標）P-40等の界面活性剤等を加えてもよい。前記イオンを加える場合、その濃度は、０.１～１０ｍＭが好ましく、０.５～５ｍＭがより好ましい。前記キレート剤を加える場合、その濃度は、０.１～１０ｍＭが好ましく、０.５～５ｍＭがより好ましい。界面活性剤を加える場合、その濃度は、０.００１～１０体積％が好ましく、０.０５～５体積％がより好ましい。特に、生体試料中の夾雑因子の影響を抑える観点から、界面活性剤を加えることが好ましい。
以下、製造例、実施例及び比較例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されない。
［製造例１］
有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備える半導体センシングデバイスを構築した。絶縁層としてはシリコン酸化物を用いた。検出部の第１の有機単分子膜として、アミノプロピルトリエトキシシランを用いて単分子膜を形成した。以下にデバイス作製方法について記載する。
有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備える半導体センシングデバイスを構築した。絶縁層としてはシリコン酸化物を用いた。検出部の第１の有機単分子膜として、アミノプロピルトリエトキシシランを用いて単分子膜を形成した。以下にデバイス作製方法について記載する。
凸版印刷(株)製の１０μｍ長、１,０００μｍ幅のｎ型ＦＥＴからアセトンを用いて超音波処理することでフォトレジスト膜を除去した。ゲート表面にヒドロキシ基を導入して活性部位を作製するため、プラズマリアクターＰＲ３０１（ヤマト科学(株)製）を用いて、２００ＷのＯ2プラズマに１分間暴露した。
アミノプロピルトリエトキシシラン（シグマアルドリッチ社製）を１質量％含むトルエン中にデバイスを浸漬し、アルゴン雰囲気下、６０℃で７分間静置することで、ゲート電極上に単分子膜を成膜した。単分子膜を形成したＦＥＴをメタノール/トルエン混合溶媒（質量比１：１）を用いて超音波洗浄し、エタノールでリンスした。基板洗浄後、アルゴン雰囲気下、１６０℃で６０分静置した。
アミノプロピルトリエトキシシラン（シグマアルドリッチ社製）を１質量％含むトルエン中にデバイスを浸漬し、アルゴン雰囲気下、６０℃で７分間静置することで、ゲート電極上に単分子膜を成膜した。単分子膜を形成したＦＥＴをメタノール/トルエン混合溶媒（質量比１：１）を用いて超音波洗浄し、エタノールでリンスした。基板洗浄後、アルゴン雰囲気下、１６０℃で６０分静置した。
［参考例１］
アミノ系単分子膜を修飾されている検出部のゲート電極に抗５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）抗体由来の抗体フラグメント（Ｆａｂ）を固定化したデバイスによる５－ＦＵ修飾ＢＳＡ（ＢＳＡ/５－ＦＵ、コスモ・バイオ(株)製）添加時の応答を以下のとおり評価した。
まず、有機単分子膜のアミノ基とＦａｂとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、２.５質量％のグルタルアルデヒド水溶液０.０１ｍＬ中に、末端がアミノ基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を、室温で３０分間浸漬することにより実施した。その後、デバイスをホルダーに設置し、グルタルアルデヒドによって架橋を行ったゲート電極部を、５０μｇ/ｍＬのＦａｂを含むリン酸緩衝生理食塩水（137 mM NaCl、2.682 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4・12H2O、1.469 mM KH2PO4、pH7.4、以下、ＰＢＳという。）に１時間浸漬した。基板洗浄後、１０ｍＭエタノールアミン含有ＰＢＳによるキャッピング処理を１時間施した。
その後、デバイスの検出部をリン酸緩衝液（0.12 mM NaH2PO4・2H2O、0.51 mM Na2HPO4・12H2O、pH7.4、以下、ＰＢという。）０.５ｍＬに３分間浸漬した後、室温で、Ｆａｂ固定化デバイスの電流－電圧曲線を、Ａｇ/ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧－３Ｖ～０.５Ｖ、ドレイン電圧０.１Ｖとした。
続いて、２５μｇ/ｍＬの５－ＦＵ修飾ＢＳＡ（ＢＳＡ/５－ＦＵ）を含むＰＢＳ２０μＬをＦａｂ固定化デバイスのゲート表面上に添加し、３０分静置した後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、ゲート表面上にＰＢを０.５ｍＬ添加して３分間静置した後、ＢＳＡ/５－ＦＵ吸着デバイスの電流－電圧曲線を測定し、ＢＳＡ/５－ＦＵ添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
アミノ系単分子膜を修飾されている検出部のゲート電極に抗５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）抗体由来の抗体フラグメント（Ｆａｂ）を固定化したデバイスによる５－ＦＵ修飾ＢＳＡ（ＢＳＡ/５－ＦＵ、コスモ・バイオ(株)製）添加時の応答を以下のとおり評価した。
まず、有機単分子膜のアミノ基とＦａｂとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、２.５質量％のグルタルアルデヒド水溶液０.０１ｍＬ中に、末端がアミノ基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を、室温で３０分間浸漬することにより実施した。その後、デバイスをホルダーに設置し、グルタルアルデヒドによって架橋を行ったゲート電極部を、５０μｇ/ｍＬのＦａｂを含むリン酸緩衝生理食塩水（137 mM NaCl、2.682 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4・12H2O、1.469 mM KH2PO4、pH7.4、以下、ＰＢＳという。）に１時間浸漬した。基板洗浄後、１０ｍＭエタノールアミン含有ＰＢＳによるキャッピング処理を１時間施した。
その後、デバイスの検出部をリン酸緩衝液（0.12 mM NaH2PO4・2H2O、0.51 mM Na2HPO4・12H2O、pH7.4、以下、ＰＢという。）０.５ｍＬに３分間浸漬した後、室温で、Ｆａｂ固定化デバイスの電流－電圧曲線を、Ａｇ/ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧－３Ｖ～０.５Ｖ、ドレイン電圧０.１Ｖとした。
続いて、２５μｇ/ｍＬの５－ＦＵ修飾ＢＳＡ（ＢＳＡ/５－ＦＵ）を含むＰＢＳ２０μＬをＦａｂ固定化デバイスのゲート表面上に添加し、３０分静置した後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、ゲート表面上にＰＢを０.５ｍＬ添加して３分間静置した後、ＢＳＡ/５－ＦＵ吸着デバイスの電流－電圧曲線を測定し、ＢＳＡ/５－ＦＵ添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
［比較参考例１］
対照実験として、Ｆａｂ固定化デバイスに対して、特異性を示さないタンパク質ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）添加時の応答を以下のとおり評価した。
まず、有機単分子膜のアミノ基とＦａｂとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、２.５質量％のグルタルアルデヒド水溶液０.０１ｍＬ中に、末端がアミノ基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を、室温で３０分間浸漬することにより実施した。その後、デバイスをホルダーに設置し、グルタルアルデヒドによって架橋を行ったゲート電極部を、５０μｇ/ｍＬのＦａｂを含むＰＢＳに１時間浸漬した。基板洗浄後、１０ｍＭエタノールアミン含有ＰＢＳによるキャッピング処理を１時間施した。
その後、デバイスの検出部をＰＢ０.５ｍＬに３分間浸漬した後、室温で、Ｆａｂ固定化デバイスの電流－電圧曲線を、Ａｇ/ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧－３Ｖ～０.５Ｖ、ドレイン電圧０.１Ｖとした。
続いて、１,０００μｇ/ｍＬのＨＳＡを含むＰＢＳ２０μＬをＦａｂ固定化デバイスのゲート表面上に添加し、３０分静置した後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、ゲート表面上にＰＢを０.５ｍＬ添加して３分間静置した後、ＨＳＡ吸着デバイスの電流－電圧曲線を測定し、ＨＳＡ添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
対照実験として、Ｆａｂ固定化デバイスに対して、特異性を示さないタンパク質ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）添加時の応答を以下のとおり評価した。
まず、有機単分子膜のアミノ基とＦａｂとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、２.５質量％のグルタルアルデヒド水溶液０.０１ｍＬ中に、末端がアミノ基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を、室温で３０分間浸漬することにより実施した。その後、デバイスをホルダーに設置し、グルタルアルデヒドによって架橋を行ったゲート電極部を、５０μｇ/ｍＬのＦａｂを含むＰＢＳに１時間浸漬した。基板洗浄後、１０ｍＭエタノールアミン含有ＰＢＳによるキャッピング処理を１時間施した。
その後、デバイスの検出部をＰＢ０.５ｍＬに３分間浸漬した後、室温で、Ｆａｂ固定化デバイスの電流－電圧曲線を、Ａｇ/ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧－３Ｖ～０.５Ｖ、ドレイン電圧０.１Ｖとした。
続いて、１,０００μｇ/ｍＬのＨＳＡを含むＰＢＳ２０μＬをＦａｂ固定化デバイスのゲート表面上に添加し、３０分静置した後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、ゲート表面上にＰＢを０.５ｍＬ添加して３分間静置した後、ＨＳＡ吸着デバイスの電流－電圧曲線を測定し、ＨＳＡ添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
Ｆａｂ固定化デバイスに対する、ＢＳＡ/５－ＦＵ又はＨＳＡ添加前後の半導体特性のシフト量の評価結果を図４に示す。Ｆａｂ固定化デバイスにＢＳＡ/５－ＦＵを添加した場合、半導体特性である電流－電圧曲線におけるゲート電圧シフトΔＶgが＋３９ｍＶとなった。一方で、Ｆａｂ固定化デバイスにＨＳＡを添加した場合、電流－電圧曲線の変化はほとんど確認されなかった。このことより、Ｆａｂ固定化デバイスはＢＳＡ/５－ＦＵに特異性を有することが確認された。
［実施例１］
Ｆａｂ固定化デバイスによる５－ＦＵ検出として、５－ＦＵ及びＢＳＡ/５－ＦＵの順次添加による応答測定を以下のとおり評価した。
まず、有機単分子膜のアミノ基とＦａｂとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、２.５質量％のグルタルアルデヒド水溶液０.０１ｍＬ中に、末端がアミノ基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を、室温で３０分間浸漬することにより実施した。その後、デバイスをホルダーに設置し、グルタルアルデヒドによって架橋を行ったゲート電極部を、５０μｇ/ｍＬのＦａｂを含むＰＢＳに１時間浸漬した。基板洗浄後、１０ｍＭエタノールアミン含有ＰＢＳによるキャッピング処理を１時間施した。
その後、デバイスの検出部をＰＢ０.５ｍＬに３分間浸漬した後、室温で、Ｆａｂ固定化デバイスの電流－電圧曲線を、Ａｇ/ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧－３Ｖ～０.５Ｖ、ドレイン電圧０.１Ｖとした。
続いて、０～１,０００ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含むＰＢＳ２０μＬをゲート表面に添加し、３０分間静置した後、ＰＢＳ５ｍＬを用いてリンスを行った。
その後、２５μｇ/ｍＬのＢＳＡ/５－ＦＵを含むＰＢＳ２０μＬをＦａｂ固定化デバイスのゲート表面上に添加し、３０分静置した後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。そして、ゲート表面上にＰＢを０.５ｍＬ添加して３分間静置した後、ＢＳＡ/５－ＦＵ吸着デバイスの電流－電圧曲線を測定し、５－ＦＵ及びＢＳＡ/５－ＦＵ添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
Ｆａｂ固定化デバイスによる５－ＦＵ検出として、５－ＦＵ及びＢＳＡ/５－ＦＵの順次添加による応答測定を以下のとおり評価した。
まず、有機単分子膜のアミノ基とＦａｂとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、２.５質量％のグルタルアルデヒド水溶液０.０１ｍＬ中に、末端がアミノ基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を、室温で３０分間浸漬することにより実施した。その後、デバイスをホルダーに設置し、グルタルアルデヒドによって架橋を行ったゲート電極部を、５０μｇ/ｍＬのＦａｂを含むＰＢＳに１時間浸漬した。基板洗浄後、１０ｍＭエタノールアミン含有ＰＢＳによるキャッピング処理を１時間施した。
その後、デバイスの検出部をＰＢ０.５ｍＬに３分間浸漬した後、室温で、Ｆａｂ固定化デバイスの電流－電圧曲線を、Ａｇ/ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧－３Ｖ～０.５Ｖ、ドレイン電圧０.１Ｖとした。
続いて、０～１,０００ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含むＰＢＳ２０μＬをゲート表面に添加し、３０分間静置した後、ＰＢＳ５ｍＬを用いてリンスを行った。
その後、２５μｇ/ｍＬのＢＳＡ/５－ＦＵを含むＰＢＳ２０μＬをＦａｂ固定化デバイスのゲート表面上に添加し、３０分静置した後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。そして、ゲート表面上にＰＢを０.５ｍＬ添加して３分間静置した後、ＢＳＡ/５－ＦＵ吸着デバイスの電流－電圧曲線を測定し、５－ＦＵ及びＢＳＡ/５－ＦＵ添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
Ｆａｂ固定化デバイスに対する５－ＦＵ及びＢＳＡ/５－ＦＵの順次添加による半導体特性のシフト量の評価結果を図５に示す。Ｆａｂ固定化デバイスへの０～１,０００ｎｇ/ｍＬの各濃度の５－ＦＵを添加した後、ＢＳＡ/５－ＦＵ添加に由来するゲート電圧シフトΔＶgを取得したところ、濃度増加に伴いシフト量が減少することが確認された。これは、５－ＦＵ濃度増加に伴いＦＥＴゲート表面上の未反応Ｆａｂ分子量が減少することによって、ＢＳＡ/５－ＦＵの吸着量が変化したことを意味する。したがって、Ｆａｂ固定化デバイスに対する５－ＦＵ及びＢＳＡ/５－ＦＵの順次添加による５－ＦＵ定量検出性が示された。
［実施例２］
Ｆａｂ固定化デバイスによる血清中５－ＦＵ検出時の血清試料の前処理として、Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水による希釈を以下のとおり行い、血清中の夾雑因子の影響評価を実施した。
まず、有機単分子膜のアミノ基とＦａｂとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、２.５質量％のグルタルアルデヒド水溶液０.０１ｍＬ中に、末端がアミノ基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を、室温で３０分間浸漬することにより実施した。その後、デバイスをホルダーに設置し、グルタルアルデヒドによって架橋を行ったゲート電極部を、５０μｇ/ｍＬのＦａｂを含むＰＢＳに１時間浸漬した。基板洗浄後、１０ｍＭエタノールアミン含有ＰＢＳによるキャッピング処理を１時間施した。
その後、デバイスの検出部をＰＢ０.５ｍＬに３分間浸漬した後、室温で、Ｆａｂ固定化デバイスの電流－電圧曲線を、Ａｇ/ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧－３Ｖ～０.５Ｖ、ドレイン電圧０.１Ｖとした。
続いて、５００ｎｇ/ｍＬ又は０ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含むヒト血清を０.０５体積％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で５倍希釈した後、ＦＥＴゲート表面に２０μＬ添加し、３０分間静置した。その後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、５００ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含む希釈済みヒト血清添加時においてのみ、２５μｇ/ｍＬのＢＳＡ/５－ＦＵを含むＰＢＳ２０μＬをＦａｂ固定化デバイスのゲート表面上に添加し、３０分静置した後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。そして、ゲート表面上にＰＢを０.５ｍＬ添加して３分間静置した後、デバイスの電流－電圧曲線を測定し、ＰＢＳ－Ｔ希釈ヒト血清添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
Ｆａｂ固定化デバイスによる血清中５－ＦＵ検出時の血清試料の前処理として、Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水による希釈を以下のとおり行い、血清中の夾雑因子の影響評価を実施した。
まず、有機単分子膜のアミノ基とＦａｂとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、２.５質量％のグルタルアルデヒド水溶液０.０１ｍＬ中に、末端がアミノ基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を、室温で３０分間浸漬することにより実施した。その後、デバイスをホルダーに設置し、グルタルアルデヒドによって架橋を行ったゲート電極部を、５０μｇ/ｍＬのＦａｂを含むＰＢＳに１時間浸漬した。基板洗浄後、１０ｍＭエタノールアミン含有ＰＢＳによるキャッピング処理を１時間施した。
その後、デバイスの検出部をＰＢ０.５ｍＬに３分間浸漬した後、室温で、Ｆａｂ固定化デバイスの電流－電圧曲線を、Ａｇ/ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧－３Ｖ～０.５Ｖ、ドレイン電圧０.１Ｖとした。
続いて、５００ｎｇ/ｍＬ又は０ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含むヒト血清を０.０５体積％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で５倍希釈した後、ＦＥＴゲート表面に２０μＬ添加し、３０分間静置した。その後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、５００ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含む希釈済みヒト血清添加時においてのみ、２５μｇ/ｍＬのＢＳＡ/５－ＦＵを含むＰＢＳ２０μＬをＦａｂ固定化デバイスのゲート表面上に添加し、３０分静置した後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。そして、ゲート表面上にＰＢを０.５ｍＬ添加して３分間静置した後、デバイスの電流－電圧曲線を測定し、ＰＢＳ－Ｔ希釈ヒト血清添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
［実施例３］
Ｆａｂ固定化デバイスによる血清中５－ＦＵ検出時の血清試料の前処理として、ＰＢＳによる希釈を以下のとおり行い、血清の夾雑因子の影響評価を実施した。
まず、有機単分子膜のアミノ基とＦａｂとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、２.５質量％のグルタルアルデヒド水溶液０.０１ｍＬ中に、末端がアミノ基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を、室温で３０分間浸漬することにより実施した。その後、デバイスをホルダーに設置し、グルタルアルデヒドによって架橋を行ったゲート電極部を、５０μｇ/ｍＬのＦａｂを含むＰＢＳに１時間浸漬した。基板洗浄後、１０ｍＭエタノールアミン含有ＰＢＳによるキャッピング処理を１時間施した。
その後、デバイスの検出部をＰＢ０.５ｍＬに３分間浸漬した後、室温で、Ｆａｂ固定化デバイスの電流－電圧曲線を、Ａｇ/ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧－３Ｖ～０.５Ｖ、ドレイン電圧０.１Ｖとした。
続いて、５００ｎｇ/ｍＬ又は０ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含むヒト血清をＰＢＳで５倍希釈した後、ＦＥＴゲート表面に２０μＬ添加し、３０分間静置した。その後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、５００ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含む希釈済みヒト血清添加時においてのみ、２５μｇ/ｍＬのＢＳＡ/５－ＦＵを含むＰＢＳ２０μＬをＦａｂ固定化デバイスのゲート表面上に添加し、３０分静置した後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。そして、ゲート表面上にＰＢを０.５ｍＬ添加して３分間静置した後、ＢＳＡ/５－ＦＵ吸着デバイスの電流－電圧曲線を測定し、ＰＢＳ希釈ヒト血清添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
Ｆａｂ固定化デバイスによる血清中５－ＦＵ検出時の血清試料の前処理として、ＰＢＳによる希釈を以下のとおり行い、血清の夾雑因子の影響評価を実施した。
まず、有機単分子膜のアミノ基とＦａｂとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、２.５質量％のグルタルアルデヒド水溶液０.０１ｍＬ中に、末端がアミノ基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を、室温で３０分間浸漬することにより実施した。その後、デバイスをホルダーに設置し、グルタルアルデヒドによって架橋を行ったゲート電極部を、５０μｇ/ｍＬのＦａｂを含むＰＢＳに１時間浸漬した。基板洗浄後、１０ｍＭエタノールアミン含有ＰＢＳによるキャッピング処理を１時間施した。
その後、デバイスの検出部をＰＢ０.５ｍＬに３分間浸漬した後、室温で、Ｆａｂ固定化デバイスの電流－電圧曲線を、Ａｇ/ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧－３Ｖ～０.５Ｖ、ドレイン電圧０.１Ｖとした。
続いて、５００ｎｇ/ｍＬ又は０ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含むヒト血清をＰＢＳで５倍希釈した後、ＦＥＴゲート表面に２０μＬ添加し、３０分間静置した。その後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、５００ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含む希釈済みヒト血清添加時においてのみ、２５μｇ/ｍＬのＢＳＡ/５－ＦＵを含むＰＢＳ２０μＬをＦａｂ固定化デバイスのゲート表面上に添加し、３０分静置した後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。そして、ゲート表面上にＰＢを０.５ｍＬ添加して３分間静置した後、ＢＳＡ/５－ＦＵ吸着デバイスの電流－電圧曲線を測定し、ＰＢＳ希釈ヒト血清添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
Ｆａｂ固定化デバイスによる血中５－ＦＵ濃度測定時の血清試料の前処理として、ＰＢＳ－Ｔ又はＰＢＳによる希釈処理を施した５００ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含む血清及びＢＳＡ/５－ＦＵの順次添加又は各希釈処理を施した０ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含む血清添加前後の半導体特性のシフト量の評価結果を図６に示す。ＰＢＳ－Ｔによる希釈を施した血清を滴下した場合、ゲート電圧シフトΔＶgの変化幅が小さくなった一方、ＰＢＳ希釈を施した血清を滴下した際は、ΔＶgは大きな変化幅を示した。したがって、ＰＢＳ－Ｔによる希釈操作によって、血清中の夾雑因子がセンサ応答に与える影響を抑制できることが示された。
［実施例４］
本デバイスを利用した血清中５－ＦＵ濃度測定として、５－ＦＵ及びＢＳＡ/５－ＦＵの順次添加による応答測定を以下のとおり評価した。
まず、有機単分子膜のアミノ基とＦａｂとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、２.５質量％のグルタルアルデヒド水溶液０.０１ｍＬ中に、末端がアミノ基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を、室温で３０分間浸漬することにより実施した。その後、デバイスをホルダーに設置し、グルタルアルデヒドによって架橋を行ったゲート電極部を、５０μｇ/ｍＬのＦａｂを含むＰＢＳに１時間浸漬した。基板洗浄後、１０ｍＭエタノールアミン含有ＰＢＳによるキャッピング処理を１時間施した。その後、デバイスの検出部をＰＢ０.５ｍＬに３分間浸漬した後、室温で、Ｆａｂ固定化デバイスの電流－電圧曲線を、Ａｇ/ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧－３Ｖ～０.５Ｖ、ドレイン電圧０.１Ｖとした。
続いて、０～１,０００ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含むヒト血清をＰＢＳ－Ｔで５倍希釈した後、ＦＥＴゲート表面に２０μＬ添加し、３０分間静置した。その後、ＰＢＳ５ｍＬを用いてリンスを行った。そして、２５μｇ/ｍＬのＢＳＡ/５－ＦＵを含むＰＢＳ２０μＬをＦａｂ固定化デバイスのゲート表面上に添加し、３０分静置した後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。そして、ゲート表面上にＰＢを０.５ｍＬ添加して３分間静置した後、ＢＳＡ/５－ＦＵ吸着デバイスの電流－電圧曲線を測定し、５－ＦＵ含有ヒト血清及びＢＳＡ/５－ＦＵ添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
本デバイスを利用した血清中５－ＦＵ濃度測定として、５－ＦＵ及びＢＳＡ/５－ＦＵの順次添加による応答測定を以下のとおり評価した。
まず、有機単分子膜のアミノ基とＦａｂとを架橋するための架橋分子として、グルタルアルデヒドを反応させた。反応は、２.５質量％のグルタルアルデヒド水溶液０.０１ｍＬ中に、末端がアミノ基の単分子膜が形成されたデバイスの検出部を、室温で３０分間浸漬することにより実施した。その後、デバイスをホルダーに設置し、グルタルアルデヒドによって架橋を行ったゲート電極部を、５０μｇ/ｍＬのＦａｂを含むＰＢＳに１時間浸漬した。基板洗浄後、１０ｍＭエタノールアミン含有ＰＢＳによるキャッピング処理を１時間施した。その後、デバイスの検出部をＰＢ０.５ｍＬに３分間浸漬した後、室温で、Ｆａｂ固定化デバイスの電流－電圧曲線を、Ａｇ/ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧－３Ｖ～０.５Ｖ、ドレイン電圧０.１Ｖとした。
続いて、０～１,０００ｎｇ/ｍＬの５－ＦＵを含むヒト血清をＰＢＳ－Ｔで５倍希釈した後、ＦＥＴゲート表面に２０μＬ添加し、３０分間静置した。その後、ＰＢＳ５ｍＬを用いてリンスを行った。そして、２５μｇ/ｍＬのＢＳＡ/５－ＦＵを含むＰＢＳ２０μＬをＦａｂ固定化デバイスのゲート表面上に添加し、３０分静置した後、ＰＢＳ３ｍＬ及びＰＢ３ｍＬを用いてリンスを行った。そして、ゲート表面上にＰＢを０.５ｍＬ添加して３分間静置した後、ＢＳＡ/５－ＦＵ吸着デバイスの電流－電圧曲線を測定し、５－ＦＵ含有ヒト血清及びＢＳＡ/５－ＦＵ添加前後でのゲート電圧シフトΔＶgを評価した。
Ｆａｂ固定化デバイスに対するＰＢＳ－Ｔ希釈５－ＦＵ含有血清及びＢＳＡ/５－ＦＵの順次添加による半導体特性のシフト量の評価結果を図７に示す。Ｆａｂ固定化デバイスへ、ＰＢＳ－Ｔ希釈により、０～２００ｎｇ/ｍＬの範囲に濃度を調整した５－ＦＵ含有血清を添加した後、ＢＳＡ/５－ＦＵ添加を順次添加した。その結果、５－ＦＵ血清及びＢＳＡ/５－ＦＵ添加前後におけるゲート電圧シフトΔＶgが、５－ＦＵ濃度増加に伴い減少することが確認された。このことから、本発明の方法によって、血清中５－ＦＵ濃度の定量検出性が示された。
１ シリコン基板
１ａ ゲートチャネル領域
２ 絶縁層
３ 第１の有機単分子膜
４ ゲート電極
５ ソース電極
６ ドレイン電極
７ ドープ領域
８ 参照部
９ 検出部
１０ テンプレート部
１１ プローブ分子
１２ 小型非荷電分子
１３ 小型非荷電分子が修飾されたタンパク質
１ａ ゲートチャネル領域
２ 絶縁層
３ 第１の有機単分子膜
４ ゲート電極
５ ソース電極
６ ドレイン電極
７ ドープ領域
８ 参照部
９ 検出部
１０ テンプレート部
１１ プローブ分子
１２ 小型非荷電分子
１３ 小型非荷電分子が修飾されたタンパク質
Claims (7)
- （Ａ）小型非荷電分子と、半導体センシングデバイス上に固定化された該小型非荷電分子と相互作用するプローブ分子とを相互作用させる工程、
（Ｂ）工程（Ａ）後、更に、前記小型非荷電分子が修飾されたタンパク質を、前記プローブ分子と相互作用させる工程、及び
（Ｃ）工程（Ｂ）後、前記相互作用によるゲートチャネル領域の電位変化を検出する工程
を含む小型非荷電分子の検出方法。 - 前記プローブ分子が固定化された半導体センシングデバイスが、半導体上に反応ゲート絶縁膜としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの前記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有する有機単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜にプローブ分子を前記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させてなる、プローブ分子／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものである請求項１記載の小型非荷電分子の検出方法。
- 前記前記プローブ分子が、Ｆａｂである請求項１又は２記載の小型非荷電分子の検出方法。
- 生体試料中に含まれる小型非荷電分子を検出する方法である請求項１～３のいずれか１項記載の小型非荷電分子の検出方法。
- 前記小型非荷電分子が含まれる生体試料が、血清である請求項４記載の小型非荷電分子の検出方法。
- 前記小型非荷電分子が含まれた生体試料を、工程（Ａ）の前に界面活性剤で前処理する工程を含む請求項４又は５記載の小型非荷電分子の検出方法。
- 前記小型非荷電分子が、５－フルオロウラシルである請求項１～５のいずれか１項記載の小型非荷電分子の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022030843A JP2023127206A (ja) | 2022-03-01 | 2022-03-01 | 小型非荷電分子の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022030843A JP2023127206A (ja) | 2022-03-01 | 2022-03-01 | 小型非荷電分子の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023127206A true JP2023127206A (ja) | 2023-09-13 |
Family
ID=87971397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022030843A Pending JP2023127206A (ja) | 2022-03-01 | 2022-03-01 | 小型非荷電分子の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2023127206A (ja) |
-
2022
- 2022-03-01 JP JP2022030843A patent/JP2023127206A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tarasov et al. | Understanding the electrolyte background for biochemical sensing with ion-sensitive field-effect transistors | |
| US10962501B2 (en) | Floating gate based sensor apparatus and related floating gate based sensor applications | |
| Carrara et al. | Memristive-biosensors: A new detection method by using nanofabricated memristors | |
| US9810660B2 (en) | Fin-FET sensor with improved sensitivity and specificity | |
| US20170273608A1 (en) | Ionic barrier for floating gate in vivo biosensors | |
| Janata et al. | Chemically sensitive field effect transistors | |
| US20130221346A1 (en) | Zinc Oxide-Based Thin Film Transistor Biosensors with High Sensitivity and Selectivity | |
| Lee et al. | Device considerations for development of conductance-based biosensors | |
| KR102632025B1 (ko) | 센서 장치용 전극의 중합체-코팅 | |
| Kwon et al. | The role of graphene patterning in field-effect transistor sensors to detect the tau protein for Alzheimer's disease: Simplifying the immobilization process and improving the performance of graphene-based immunosensors | |
| WO2016025743A1 (en) | Electrolyte-gated transistors for detection of molecules | |
| JP2023127206A (ja) | 小型非荷電分子の検出方法 | |
| Nguy et al. | Affinity driven ion exchange EG-OFET sensor for high selectivity and low limit of detection of cesium in seawater | |
| Bhat et al. | AlGaN/GaN high electron mobility transistor for various sensing applications: a review | |
| TW201005286A (en) | Field effect transistor based sensor | |
| Rubtsova et al. | Biosensor based on a nanowire field-effect transistor for the determination of prostate specific antigen | |
| Hlukhova et al. | Highly sensitive aptamer-based method for the detection of cardiac biomolecules on silicon dioxide surfaces | |
| JP6277633B2 (ja) | アミロイドの検出方法及びアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイス | |
| JP2009092647A (ja) | 陰イオン濃度測定装置及び陰イオン濃度測定素子 | |
| JP7268411B2 (ja) | レクチン固定化半導体センシングデバイス及び糖化合物の検出方法 | |
| Lee et al. | Fabrication and Characterization of an Extended-Gate AlGaN/GaN-Based Heterostructure Field-Effect Transistor-Type Biosensor for Detecting Immobilized Streptavidin-Biotin Protein Complexes | |
| JP7276774B2 (ja) | アプタマー固定化半導体センシングデバイス及び非荷電分子の検出方法 | |
| Liu et al. | Field-effect transistor bioassay for ultrasensitive detection of folate receptor 1 by ligand-protein interaction | |
| JP2017009612A (ja) | タンパク質の検出方法 | |
| JP2005526973A (ja) | 有機シリコンハイブリッド電界効果トランジスタ構造体の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20220331 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20220331 |
|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20220902 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20220902 |