JP2021024852A - 機能不全ミトコンドリアを消去するための複合体、および細胞老化を抑制するための複合体 - Google Patents

Abstract

【課題】老化細胞を死滅させずに酸化傷害（細胞老化関連分泌形質：ＳＡＳＰ）を抑制し、機能回復を狙うための複合体、該複合体を含む医薬組成物の提供。【解決手段】機能不全ミトコンドリア除去のためのミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体に関する。当該複合体は、ミトコンドリア膜電位低下剤と細胞機能（細胞周期）回復のためのｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリアを含む複合体を提供する。また、当該複合体を含む医薬組成物に関する。さらに、ミトコンドリア膜電位低下剤およびｐ５３阻害剤を複合化するための複合化剤に関する。【選択図】なし

Description

本出願は、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体に関する。当該複合体は、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリア、ミトコンドリア膜電位低下剤、およびｐ５３阻害剤を含む。本出願はまた、当該複合体を含む医薬組成物に関する。本出願はさらに、ミトコンドリア膜電位低下剤およびｐ５３阻害剤を複合化するための複合化剤に関する。

正常細胞は細胞分裂を繰り返しながら成長・増殖するが、幹細胞等を除く一般的な細胞は分裂回数に上限が決まっており、その上限に達すると不可逆的な細胞分裂の停止が引き起こされる。細胞分裂ごとに染色体の末端にあるテロメアが短小し、テロメア領域が短くなるとＤＮＡ損傷シグナルが活性化され細胞周期を停止させる。

しかし、細胞分裂を繰り返す過程で、活性酸素種（ＲＯＳ）や炎症物質、放射線等の外因性ストレスによりＤＮＡがダメージを受けると、テロメアの短小を待たずに細胞分裂の不可逆的な停止が引き起こされる。この現象は（早期）細胞老化（cellular senescence）と呼ばれ、上記の細胞分裂回数の増加に伴う継代老化（replicative senescence）とは異なる。

細胞老化は、ＤＮＡ修復酵素やアポトーシス（プログラム的細胞死）と並び、ＤＮＡダメージやミトコンドリア障害により変異した遺伝子が蓄積して生じるがん化からの防御機構の一つとして働いている。特にミトコンドリアの機能不全が細胞の老化に大きく関わることが明らかになってきた（非特許文献１）。

ところが、細胞老化を引き起こした細胞（老化細胞）は正常細胞とは異なり、アポトーシスによる細胞の死滅が行われないため体内に蓄積され、細胞老化関連分泌形質（ＳＡＳＰ）により多量の炎症性物質（炎症性サイトカイン）や過剰量の活性酸素種（ＲＯＳ）を細胞や組織に放出し続ける。その結果、自身の細胞老化の亢進に加え周辺細胞へも影響を与え、体内にＳＡＳＰを発する老化細胞が多量に増える。それにより更なるＳＡＳＰが引き起こされ、過剰な炎症作用が起こり、細胞組織等は機能障害を誘発され、アルツハイマーやパーキンソン病、糖尿病、動脈硬化や心臓疾患等を含む様々な老化関連疾患や炎症性疾患を引き起こして個体の老化を誘発する原因の一つとなっていることが明らかとされている。

このように、元来がん化からの防御機構の１つであると考えられていた細胞老化は、その老化レベルが進行するにつれて老化関連疾患を有することになる。従って、老化関連疾患の発症・進行・誘発を防ぎ治療するためには、細胞老化を抑制することが不可欠かつ有効な手段である。

現在、細胞老化を抑制する方法として、老化細胞を特異的に死滅させる老化細胞融解剤（老化細胞除去薬もしくは老化細胞死誘導剤：senolytics）の開発が行われている（非特許文献２）。

しかしながら、上述の非特許文献の提案にかかる老化細胞除去薬もしくは老化細胞死誘導剤（senolytics）を用いる治療法では、過剰な細胞死により、組織や臓器の機能低下が引き起こされ、免疫不全症候群やパーキンソン病などの神経変性疾患等を誘発する重篤な副作用が懸念される。

そのため、老化細胞を死滅させずにＳＡＳＰを減少させ、細胞機能維持や機能回復を起こす手法の確立が必要であり、それを可能とする治療法や治療薬（細胞老化抑制剤：senostatics）の開発が要望されている（非特許文献３）。

Ermolaeva, M. et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology, 19, 594-610 (2018). Kirkland, J. L. et al., EBioMedicine, 21, 21-28 (2017). Short, S. et al., EBioMedicine, 41, 683-692 (2019).

上述のように、細胞老化に伴う機能不全ミトコンドリアの蓄積と老化細胞による酸化傷害（細胞老化関連分泌形質：ＳＡＳＰ）を抑制するために、老化細胞融解剤を用いた細胞の死滅が行われているが、この方法では過剰な細胞死により、神経変性症や免疫不全症を含む重篤な副作用が懸念される。そのため、老化細胞を死滅させずにＳＡＳＰを抑制し、機能回復を狙う必要があり、機能不全ミトコンドリアの除去と老化細胞による酸化傷害の抑制を同時に治療することを可能にするための、新しい治療法の開発が求められている。

本出願は、細胞老化が関わる老化関連疾患に対して、先ずは機能不全ミトコンドリアの除去を行う。機能不全ミトコンドリアの蓄積が老化細胞による酸化傷害（ＳＡＳＰ）を誘発するため、その除去が可能となれば、酸化傷害の抑制も同時に行うことができる。さらに細胞老化で見られる細胞周期の停止などの回復にも繋がり、最終的には細胞老化の抑制が可能となる。本出願は、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体を提供する。当該複合体は、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリア、ミトコンドリア膜電位低下剤、およびｐ５３阻害剤を含む。本出願はまた、当該複合体を含む医薬組成物を提供する。本出願はさらに、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を複合化するための複合化剤を提供する。

本発明者らは、上記課題を解決するための、細胞老化が関わる老化関連疾患の治療戦略について鋭意研究を行った。細胞老化が関わる老化関連疾患の病理メカニズムとして、マイトファジー不活性化による異常ミトコンドリアの蓄積が提唱されている。このことから、本発明者らは老化関連疾患の治療のために、ミトコンドリア膜電位の低下によるマイトファジーの再活性化および細胞老化誘導因子ｐ５３の阻害による細胞機能（細胞周期）の回復という２種類のターゲットを同時に治療する戦略について検討した。そのために、機能不全ミトコンドリア除去のためのミトコンドリア膜電位低下剤、細胞機能（細胞周期）回復のためのｐ５３阻害剤、および当該ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリア、を含む複合体を用いたところ、老化モデル細胞（ヒト線維芽細胞であるＷＩ−３８に過酸化水素を用いて処理を施して作製）において優れたマイトファジーによる異常ミトコンドリアの排除・マイトファジー誘発効果および細胞周期の回復効果・細胞老化抑制効果が観察された。当該知見に基づいて、本発明は完成された。

すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
［１］ ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体であって、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリア、ミトコンドリア膜電位低下剤、およびｐ５３阻害剤を含む、前記複合体。
［２］ ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリアがリポソームである、上記［１］に記載の複合体。
［３］ リポソームがカチオン性リポソームであり、当該カチオン性リポソームは、以下
：
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
ジドデシルジメチルアンモニウム ブロミド（ＤＤＡＢ）；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；
ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；
ジオクタデシル−ジメチルアンモニウム クロリド（ＤＯＤＡＣ）；
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウム トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；
３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン−カルバモイル−コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；および
Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン クロリド；
からなる群より選択される少なくとも１つのカチオン性脂質、および以下：
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
ジアシルホスファチジルコリン；
リゾホスファチジルコリン；
ジアシルホスファチジルグリセロール；
ジアシルホスファチジン酸；
ジアシルホスファチジルセリン；
スフィンゴミエリン；
セラミド；
ジアシルグリセロール；および
コレステロール；
からなる群より選択される少なくとも１つの非カチオン性脂質（ここで非カチオン性脂質に含まれるアシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基である）、により構成される、上記［２］に記載の複合体。
［４］ ミトコンドリア膜電位低下剤がポルフィリン系ミトコンドリア膜電位低下剤であり、当該ポルフィリン系ミトコンドリア膜電位低下剤は、
下記式（Ｉ）で表されるカチオン性金属ポルフィリン錯体：

（式中、
Ｍ_１は、遷移金属元素または卑金属元素を示し、
Ｒ_１は、以下：

からなる群より選択される基を示し、式中、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、およびＲ_８は、それぞれ同一または異なる基であって、それぞれ水素、アルキル基およびアルコキシ基からなる群より選択される基を示し、
Ｒ_２、Ｒ_３、およびＲ_４は、それぞれ同一または異なる基であって、それぞれ以下：

からなる群より選択される基を示し、式中、Ｒ_９は、それぞれ同一または異なる基であって、それぞれ水素、アルキル基、およびアルコキシ基からなる群より選択される基を示す）
である、上記［１］ないし［３］のいずれか１項に記載の複合体。
［５］ ｐ５３阻害剤が、以下：
ピフィスリン−α臭化水素酸塩（ＰＦＴ−α、別名：２−（２−ルミノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾチアゾール−３−イル）−１−ｐ−トリルエタノン ヒドロブロミ
ド）；
ピフィスリン−μ（ＰＦＴ−μ、別名：ピフィトリン-μ、２−フェニルエチンスルホンアミド）；および
ｐ−ニトロピフィスリン−α臭化水素酸塩（ｐ−nitro−ＰＦＴ−α、別名：１−（４−ニトロフェニル）−２−（４，５，６，７−テトラヒドロ−２−イミノ−３（２Ｈ）−ベンゾチアゾール）エタノン ヒドロブロミド）；
からなる群より選択される、上記［１］ないし［４］のいずれか１項に記載の複合体。
［６］ プラスミドＤＮＡをさらに含む、上記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の複合体。
［７］ 上記［１］ないし［６］のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。
［８］ 細胞老化および／または老化関連疾患を治療するための医薬組成物であって、上記［１］ないし［６］のいずれか１項に記載の複合体を含む、前記医薬組成物。
［９］ 細胞老化および／または老化関連疾患を治療するための医薬組成物であって、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリア、ミトコンドリア膜電位低下剤、およびｐ５３阻害剤を含み、
ここで、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリアが、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）で構成されるリポソームであり、
ミトコンドリア膜電位低下剤が、下記式（ＩＩ）：

で表されるカチオン性Ｍｎポルフィリン錯体であり、そして
ｐ５３阻害剤が、下記式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、または（Ｖ）：

で表されるｐ５３阻害剤（それぞれ、ピフィスリン−α（ＰＦＴ−α）、ピフィスリン−μ（ＰＦＴ−μ）、またはｐ−ニトロピフィスリン−α（ｐ−nitro−ＰＦＴ−α））である、
前記医薬組成物。
［１０］ プラスミドＤＮＡをさらに含む、上記［９］に記載の医薬組成物。
［１１］ プラスミドＤＮＡが、ｐＧＬ３をコードするプラスミドＤＮＡである、上記［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］ ミトコンドリア膜電位低下剤およびｐ５３阻害剤を複合化するための複合化剤であって、カチオン性リポソームからなる群より選択され、ここでカチオン性リポソームは、以下：
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
ジドデシルジメチルアンモニウム ブロミド（ＤＤＡＢ）；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；
ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；
ジオクタデシル−ジメチルアンモニウム クロリド（ＤＯＤＡＣ）；
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウム トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；
３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン−カルバモイル−コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；および
Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン クロリド；
からなる群より選択される少なくとも１つのカチオン性脂質、および以下：
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
ジアシルホスファチジルコリン；
リゾホスファチジルコリン；
ジアシルホスファチジルグリセロール；
ジアシルホスファチジン酸；
ジアシルホスファチジルセリン；
スフィンゴミエリン；
セラミド；
ジアシルグリセロール；および
コレステロール；
からなる群より選択される少なくとも１つの非カチオン性脂質（ここで非カチオン性脂質に含まれるアシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基である）、により構成されるものである、前記複合化剤。
［１３］ 細胞老化を抑制する方法であって、上記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の複合体をインビトロで対象細胞と接触させて、細胞老化を抑制することを含む、前記方法。
［１４］ 細胞老化を抑制することが、細胞サイズ、細胞内部構造の複雑さ、ミトコンドリア膜電位、マイトファジー活性、細胞周期、細胞増殖、ｐ５３の発現、およびｐ２１の発現から選択される１以上の指標により評価される細胞の老化の度合いを低減させることである、上記［１３］に記載の方法。
［１５］ 上記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の複合体を対象細胞と接触させて、老化細胞の割合が減少した細胞群を得る方法。

本発明の複合体は、対象細胞において、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達により、機能不全ミトコンドリアの消去による細胞老化の改善と老化細胞から放出される細胞老化関連分泌形質の抑制を同時に行うことができるものである。したがって、本発明の複合体は、細胞老化と細胞老化関連分泌形質が病理に関わる老化関連疾患に対する根治治療のために有用である。

図１は、リポソームナノキャリアによる老化細胞のミトコンドリア膜電位に対する効果を、フローサイトメトリーにより評価した結果を示す図である。図１−１は、リポソームナノキャリアを添加４時間後に培地交換を行い、さらに２４時間インキュベートした細胞における結果を示す。 図１は、リポソームナノキャリアによる老化細胞のミトコンドリア膜電位に対する効果を、フローサイトメトリーにより評価した結果を示す図である。図１−２は、リポソームナノキャリアを添加４時間後に培地交換を行い、さらに７２時間インキュベートした細胞における結果を示す。 図２は、リポソームナノキャリアによる老化細胞の細胞サイズおよび内部構造の複雑さに対する効果を、フローサイトメトリーにより評価した結果を示す図である。 図３は、リポソームナノキャリアによる老化細胞におけるｐ５３阻害効果を、ウェスタンブロットにより評価した結果を示す図である。 図４は、リポソームナノキャリアによる老化細胞におけるマイトファジーに対する効果を、ウェスタンブロットにより評価した結果を示す図である。 図５は、リポソームナノキャリアによる老化細胞中のｐ２１発現に対する効果を、ウェスタンブロットにより評価した結果を示す図である。 図６は、リポソームナノキャリアによる老化細胞の細胞周期へ与える効果を、フローサイトメトリーにより評価した結果を示す図である。 図７は、ｐ５３阻害剤を変えたリポソームナノキャリアによる老化細胞の細胞増殖に与える効果を、アラマーブルーアッセイにより評価した結果を示す図である。 図８は、プラスミドDNAおよび凍結融解なしで調製されたＭｎｄＭＩｍＰ_３ＰおよびＰＦＴ−α含有リポソームナノキャリアによる老化細胞中のｐ２１発現に対する効果を、ウェスタンブロットにより評価した結果を示す図である。

以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。

細胞老化に伴う機能不全ミトコンドリアの蓄積と老化細胞による酸化傷害（細胞老化関連分泌形質）を抑制するために、老化細胞融解剤を用いた細胞の死滅が行われている。しかし、この方法では過剰な細胞死により、神経変性症や免疫不全症を含む重篤な副作用が懸念される。そのため、老化細胞を死滅させずにＳＡＳＰを抑制し、機能回復を狙う必要がある。

そこで本発明者らは、細胞老化の発症要因・細胞老化を誘発・更新する主要因の一つである「マイトファジー不活性化による機能障害を起こしたミトコンドリア（異常ミトコンドリア）の蓄積」に着目した。

マイトファジーとは、オートファジー（自食作用）を介した異常ミトコンドリアの選択的分解機構である。正常細胞内では、ミトコンドリアに機能障害が生じるとミトコンドリア膜電位の低下が誘発され、細胞質中に存在するＰＩＮＫ１が異常ミトコンドリアに集積し、それに続いてＰａｒｋｉｎが集積することにより、マイトファジーが誘発される。この機構によって、障害を受けた異常ミトコンドリアは細胞から排除される。

しかし、炎症性サイトカインや炎症性ケモカイン等のＳＡＳＰ因子やＲＯＳ（活性酸素種）等の外因性刺激により障害を受けると、細胞質内に細胞老化誘導因子（およびがん抑制遺伝子）であるｐ５３が過剰に発現する。細胞老化が亢進すると、細胞質中に過剰に発現したｐ５３がＰａｒｋｉｎと結合することによって異常ミトコンドリアへのＰａｒｋｉｎの集積を阻害するため、上述のＰＩＮＫ１-Ｐａｒｋｉｎ経路によるマイトファジーが不活性化される。その結果、異常ミトコンドリアが細胞内に蓄積する。

このｐ５３は、ストレス応答によりｐ２１をアップレギュレーションする。ｐ２１はｐＲｂの活性化を介して、細胞周期を正常に回すＣＤＫファミリーの阻害剤として働き、細胞周期を不可逆的に停止させる。

変異体のミトコンドリアＤＮＡを有する異常ミトコンドリアからは、過剰なＲＯＳの産生やＳＡＳＰ因子の分泌、炎症性サイトカインの放出が起こり、染色体異常（ＤＮＡダメージ）を亢進する。さらに、変異体ミトコンドリアＤＮＡはグリコリシス（glycolysis）
と酸化的リン酸化（OXPHOS）のバランスを崩すことにより、エピジェネティクス補酵素の発現を変化させる。それにより、エピジェネティクス変異が引き起こされ、細胞老化の誘発に影響を与え、細胞老化が亢進する。

細胞内にＤＮＡダメージが誘発されると、正のフィードバックとして、エピジェネティクに遺伝子発現を抑制するＤＮＡメチル化酵素ＤＮＭＴ１の発現レベルが低下する。このＤＮＭＴ１にはＤＮＡのメチル化以外にもクロマチンにおいてエピジェネティクに遺伝子発現を制御するヒストンメチル化酵素Ｇ９ａと結合し、Ｇ９ａ／ＧＬＰのプロテアソームに依存的なタンパク質分解が促進され、ＳＡＳＰ遺伝子の転写制御領域におけるヒストンＨ３の9番目のリジン残基のジメチル化レベルの低下をひき起こす。その結果、ＳＡＳＰ遺伝子の発現活性に関してはこの機構が関与している。

このように、マイトファジーの不活化による異常ミトコンドリアの蓄積は、細胞老化誘発の上流段階の概念であるため、老化細胞内に存在するｐ５３の活性を阻害し、かつ異常ミトコンドリア膜電位の低下を亢進し、それに伴うＰａｒｋｉｎ活性を向上させれば、マイトファジーを誘発することができ、細胞老化およびＳＡＳＰの抑制に繋がると考えられる。

本発明者らは、老化細胞に対して特異的にマイトファジーを誘発するための２種類の薬剤を封入したリポソームナノキャリアを調製し、老化モデル細胞（ヒト線維芽細胞であるＷＩ−３８に過酸化水素を用いて処理を施して作製）に対するマイトファジー誘発効果および細胞老化抑制効果を評価した。

本発明者らは、老化細胞に対して特異的にマイトファジーを誘発するための２種類の薬剤を封入したリポソームナノキャリアの代表例として、まず、薬剤を送達するキャリアには高い細胞内取り込み能を有するカチオン性脂質であるＮ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）と非カチオン性脂質（中性脂質）であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）で構成されるリポソームを選択した。そして、マイトファジーを誘発するための２種類の薬剤としては、マイトファジーの引き金となるミトコンドリア膜電位の低下を誘発する為に、ミトコンドリア指向性を有し、ミトコンドリア内にＨ_２Ｏ_２を産生することが可能なイミダゾール型のカチオン性マンガンポルフィリン錯体（ＭｎｄＭＩｍＰ _３ Ｐ）を選択するとともに、ｐ５３によるＰａｒｋｉｎ阻害を抑制する為に、ｐ５３阻害剤であるピフィスリン−αを選択した。

これらの材料により、ミトコンドリア膜電位低下能を有するカチオン性マンガンポルフィリン錯体とｐ５３阻害剤を同一細胞中に共送達可能なリポソームナノキャリアを、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体として合成し、老化細胞のミトコンドリアにおけるマイトファジーの誘発、およびそれによる細胞老化の抑制を試みた。その結果、上記の複合体は、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞への共送達により、ミトコンドリア膜電位低下剤による機能不全ミトコンドリアの消去と、ｐ５３阻害剤による改善を同時に達成することができるものであることを確認した。この知見に基づいて、以下の発明が完成された。

ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体
一態様において、本出願は、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体であって、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリア、ミトコンドリア膜電位低下剤、およびｐ５３阻害剤、を含む、前記複合体に関する。

ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリア、ミトコンドリア膜電位低下剤、およびｐ５３阻害剤としては、以下に詳述するものを用いることができる。

本明細書において、「対象細胞」とは、本発明の複合体を作用させる細胞をいう。細胞の種類は特に限定されないが、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、霊長類、ヒト）の細胞である。好ましい態様において、対象細胞は老化した細胞である。老化した細胞は、細胞の肥大化（細胞サイズの増大）、細胞の高密度化、ミトコンドリア膜電位の低下、ｐ２１の発現増加、およびＧ２／Ｍ期における細胞周期の停止、から選択される細胞老化の指標の少なくとも一つを満たす細胞である。これらの細胞老化の指標は、当業者に周知の手法により、例えばフローサイトメトリーおよび／またはウェスタンブロットにより、計測することが可能である。

本明細書において「共送達」とは、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリアに複合体化されているミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３の両方が、対象細胞内へ移行し、対象細胞内で作用することを意味する。

ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリア、ミトコンドリア膜電位低下剤、およびｐ５３阻害剤で構成される複合体を作製する手順は、これらの成分を含む複合体が形成される限りにおいて特に制限はない。先に任意の二つの成分で複合体を形成した後、残りの一つの成分をさらに追加して複合体を形成してもよい。あるいは、三つの成分すべてを同時に混合して複合体を形成してもよい。複合体を形成する条件は、当業者が適宜選択することができる。

例えば、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリアがリポソームである場合には、以下の手順により複合体を形成することができる。
１．リポソームを構成する脂質とｐ５３阻害剤を先に有機溶媒中で混合した後、有機溶媒を留去して乾燥薄膜を得る；
２．得られた乾燥薄膜に、ミトコンドリア膜電位低下剤を含む水溶液を加え、超音波撹拌を行い、リポソームの分散液を得る。
このような手順で作成した複合体は、リポソームの脂質二重層の内部に疎水性の薬剤であるｐ５３阻害剤を含み、リポソームの内水相に親水性の薬剤であるミトコンドリア膜電位低下剤を含む形態をとると考えられる。

ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体は、さらにデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含んでいてもよい。ＤＮＡは、好ましくはプラスミドＤＮＡであってよい。

ＤＮＡは、リポソームのカチオン性を弱めるために本発明の複合体にさらに複合化するものであってもよい。本発明の複合体または当該複合体を含む医薬組成物を医薬として対象に投与する場合には、リポソームのカチオン性が強いと細胞毒性を生じる可能性がある。本発明の複合体にＤＮＡを含めることで、複合体全体としてのカチオン性を弱めることにより、そのような不利益を低減することが可能である。このような目的で用いられるＤＮＡは、例えば、ｐＧＬ３をコードするプラスミドＤＮＡが挙げられる。

あるいは、ＤＮＡは、本発明の複合体を適用する対象において酵素またはタンパク質の発現量または活性を変調するために、本発明の複合体にさらに複合化するものであってもよい。この場合、本発明の複合体にさらに複合化されるＤＮＡは、例えば、プラスミドＤＮＡであって、酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡ；対象において酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；あるいは酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ；を含むプラスミドＤＮＡが挙げられる。

ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリア／ミトコンドリア膜電位低下剤およびｐ５３阻害剤を複合化するための複合化剤
ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリアは、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の両方を対象に投与する際に保持することができ、そしてミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の両方を対象の細胞内に送達することができるキャリアであれば特に限定されない。ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリアには、例えば、リポソームが含まれる。

ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリアとして用いられるリポソームは、好ましくはカチオン性リポソームである。カチオン性リポソームは、少なくとも１つのカチオン性脂質により構成されるものであってもよい。あるいは、カチオン性リポソームは、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの非カチオン性脂質により構成されるものであってもよい。

カチオン性リポソームを構成するカチオン性脂質は、特に限定されないが、以下：
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
ジドデシルジメチルアンモニウム ブロミド（ＤＤＡＢ）；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；
ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；
ジオクタデシル−ジメチルアンモニウム クロリド（ＤＯＤＡＣ）；
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウム トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；
３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン−カルバモイル−コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；および
Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン クロリド；
からなる群より選択されるものであってもよい。好ましいカチオン性脂質としては、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）が挙げられる。

カチオン性リポソームを構成する非カチオン性脂質は、特に限定されないが、以下：
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
ジアシルホスファチジルコリン；
リゾホスファチジルコリン；
ジアシルホスファチジルグリセロール；
ジアシルホスファチジン酸；
ジアシルホスファチジルセリン；
スフィンゴミエリン；
セラミド；
ジアシルグリセロール；および
コレステロール；
からなる群より選択されるものであってもよく、ここで上記非カチオン性脂質に含まれるアシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基である。例えば、上記非カチオン性脂質に含まれるアシル基は、ドデカノイル基（ラウロイル基）、テトラデカノイル基（ミリストイル基）、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基（パルミトイル基）、９−ヘキサデセノイル基（パルミトレノイル基）、ヘプタデカノイル基（マルガロイル基）、オクタデカノイル基（ステアロイル基）、９−オクタデセノイル基（オレオイル基）、１１−オクタデセノイル基（バクセノイル基）、９，１２−オクタデカジエノイル基（リノレオイル基）、９，１２，１５−オクタデカントリエノイル基（９，１２，１５−リノレノイル基）、６，９，１２−オクタデカトリエノイル基（６，９，１２−リノレノイル基）、エイコサノイル基（アラキジノイル基）、８，１１−エイコサジエノイル基、５，８，１１−エイコサトリエノイル基、５，８，１１−エイコサテトラエノイル基（アラキドノイル基）、などが挙げられる。好ましい非カチオン性脂質としては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。

好ましい態様において、上記ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達可能なキャリアは、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）で構成されるリポソームである。

ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリアとして用いられるリポソームの調製は、当業者に公知の手法により行うことができる。例えば、上記の少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの非カチオン性脂質をクロロホルムなどの有機溶媒に溶解させた後、有機溶媒を留去して乾燥薄膜を作製し、得られた乾燥薄膜に水（または水溶液）を加えて超音波撹拌を行い、リポソームをその分散液として得ることができる。

また、上記ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達可能なキャリアは、ミトコンドリア膜電位低下剤およびｐ５３阻害剤を複合化するための複合化剤としても把握されるものである。

ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリア、またはミトコンドリア膜電位低下剤およびｐ５３阻害剤を複合化するための複合化剤は、さらにＤＮＡ、好ましくはプラスミドＤＮＡを複合化可能、および／または送達可能なものであってもよい。

ミトコンドリア膜電位低下剤
本発明の複合体に含まれるミトコンドリア膜電位低下剤は、ミトコンドリア指向性でミトコンドリア膜電位低下能を有する化合物である限り特に限定されないが、例えば、ポルフィリン系ミトコンドリア膜電位低下剤であってもよい。

ポルフィリン系ミトコンドリア膜電位低下剤として、例えば、カチオン性金属ポルフィリン錯体が挙げられる。好ましい態様において、ポルフィリン系ミトコンドリア膜電位低下剤は、下記式（Ｉ）：

（式中、
Ｍ_１は、遷移金属元素または卑金属元素を示し、
Ｒ_１は、以下：

からなる群より選択される基を示し、式中、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、およびＲ_８は、それぞれ
同一または異なる基であって、それぞれ水素、アルキル基およびアルコキシ基からなる群より選択される基を示し、
Ｒ_２、Ｒ_３、およびＲ_４は、それぞれ同一または異なる基であって、それぞれ以下：

からなる群より選択される基を示し、式中、Ｒ_９は、それぞれ同一または異なる基であって、それぞれ水素、アルキル基、およびアルコキシ基からなる群より選択される基を示す）
で表されるカチオン性金属ポルフィリン錯体であってもよい。

前記式（Ｉ）における中心金属Ｍ_１は、遷移金属元素または卑金属元素であれば特に制限はない。遷移金属元素の例としては、マンガン原子、ニッケル原子、鉄原子、同原子、コバルト原子が挙げられる。卑金属元素の例としては、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子、アルミニウム原子、または亜鉛原子が挙げられる。好ましい態様において、前記式（Ｉ）における中心金属Ｍ_１は遷移金属元素であり、さらに好ましくはマンガン原子である。

式（Ｉ）で表されるカチオン性金属ポルフィリン錯体において、アルキル基は、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは炭素数１〜５の直鎖状または分枝状のアルキル基であってよい。また、アルコキシ基は、前記したアルキル基を含むアルコキシ基であってもよい。

好ましい態様において、式（Ｉ）で表されるカチオン性金属ポルフィリン錯体におけるＲ_１は、

であり、式中、Ｒ_５及びＲ_６は、それぞれ同一または異なる基であって、それぞれ、水素、アルキル基およびアルコキシ基から成る群より選択される基であり、好ましくはＲ_５及びＲ_６は共にメチルである。

別の好ましい態様において、式（Ｉ）で表されるカチオン性金属ポルフィリン錯体におけるＲ_２、Ｒ_３、およびＲ_４は共に

であり、式中、Ｒ_９は、それぞれ同一または異なる基であって、それぞれ水素、アルキル基、およびアルコキシ基からなる群より選択される基であり、好ましくはＲ_９はすべて水素である。

さらに別の好ましい態様において、ミトコンドリア膜電位低下剤は、式（ＩＩ）

で表されるカチオン性マンガンポルフィリン錯体である。
ｐ５３阻害剤
本発明の複合体に含まれるｐ５３阻害剤は、ｐ５３の機能または作用を阻害する化合物である限り特に限定されないが、例えば、下記式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、または（Ｖ）：

で表されるｐ５３阻害剤であってもよい。式（ＩＩＩ）のｐ５３阻害剤は、ピフィスリン−α臭化水素酸塩（ＰＦＴ−α、別名：２−（２−ルミノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾチアゾール−３−イル）−１−ｐ−トリルエタノン ヒドロブロミド）である。式（ＩＶ）のｐ５３阻害剤は、ピフィスリン−μ（ＰＦＴ−μ、別名：ピフィトリン-μ、２−フェニルエチンスルホンアミド）である。式（Ｖ）のｐ５３阻害剤は、ｐ−ニトロピフィスリン−α臭化水素酸塩（ｐ−nitro−ＰＦＴ−α、別名：１−（４−ニトロフェニル）−２−（４，５，６，７−テトラヒドロ−２−イミノ−３（２Ｈ）−ベンゾチアゾール）エタノン ヒドロブロミド）である。

好ましい態様において、本発明の複合体に含まれるｐ５３阻害剤は、ピフィスリン−α臭化水素酸塩（構造式：式（ＩＩＩ））である。
医薬組成物／治療方法
一態様において、本出願は、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体を含む医薬組成物に関する。

本発明のミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体を有効成分とする医薬組成物による予防や治療に適する疾患としては、例えば細胞老化および／または老化関連疾患が挙げられる。老化関連疾患とは、細胞老化によって引き起こされる疾患の総称である。老化関連疾患の例としては、特に限定されないが、呼吸系疾患（ＣＯＰＤなど）、糖尿病、癌（例えば、膵臓癌）、心筋系疾患、アルツハイマー型認知症、等が挙げられる。
別の態様において、本出願は、細胞老化および／または老化関連疾患の治療または予防が必要な対象において当該疾患を治療する方法であって、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体を当該対象に投与することを含む、前記方法、に関する。

また別の態様において、本出願は、細胞老化および／または老化関連疾患の治療または予防が必要な対象において当該疾患を治療するための、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体の使用、に関する。

さらに別の態様において、本出願は、細胞老化および／または老化関連疾患の治療または予防が必要な対象において当該疾患を治療するための医薬組成物の製造における、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体の使用、に関する。

本発明の医薬組成物または複合体は、経口投与、または、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、もしくは経直腸投与などの非経口投与により投与することができる。経口投与に適した製剤には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、シロップ剤などが挙げられる。非経口投与に適した製剤として、本発明の医薬組成物を無菌溶液または坐剤として調製してもよい。本発明の医薬組成物は公知の方法により製剤化することができ、投与方法や患者の属性に応じて適宜製剤化することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、本発明のミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体を有効成分として含有し、これに製薬上許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香料、着色剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などと共に公知の方法により製剤化することができる。

本発明の医薬組成物または複合体の有効投与量または治療有効量は、病態や患者により相違するが、一般的には、１日あたりミトコンドリア膜電位低下剤が１μｇ〜１ｇ、ｐ５３阻害剤が０．６ｍｇ〜６００ｍｇになるように投与することができる。本発明の医薬組成物または複合体は、１回で投与する、１日数回にわけて投与する。あるいは、連続的に投与する。医師をはじめとする医療従事者は、患者の属性および／または病態等に応じて、本発明の医薬組成物または複合体の投与量、投与間隔、投与時間、投与手順、投与部位等の用法または用量を適宜決定することができる。そのようにして適宜決定される用法または用量で投与される本発明の医薬組成物または複合体もまた、本発明の範囲内である。

インビトロでの細胞老化の抑制
一態様において、本出願は、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体を用いて、細胞老化を抑制する方法に関する。具体的には、本発明のミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体を、細胞と接触させることにより、細胞老化を抑制することができる。細胞老化を抑制することには、細胞老化シグナルを低減すること、細胞老化レベルの進行を阻止すること、細胞機能を維持すること、細胞機能を回復させること、細胞中の機能不全ミトコンドリアを除去すること、細胞周期の停止を回復させること、などが含まれる。

好ましい態様において、本発明の細胞老化を抑制する方法は、インビトロで実施される。例えば、本発明のミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体を、培養細胞に添加することにより、細胞老化シグナルが低減した細胞を得ることができる。

この方法が適用される細胞の種類は特に限定されないが、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、霊長類、ヒト）の細胞である。好ましい態様において、対象細胞は老化した細胞（すでに細胞老化を引き起こした細胞）である。老化した細胞は、細胞の肥大化（細胞サイズの増大）、細胞の高密度化、ミトコンドリア膜電位の低下、ｐ２１の発現増加、およびＧ２／Ｍ期における細胞周期の停止、から選択される細胞老化の指標の少なくとも一つを満たす細胞である。別の好ましい態様において、対象細胞は、未だ細胞老化を引き起こした状態とまではいえないが、老化の抑制が望まれる細胞である。具体的には、対象細胞は、培養に伴う細胞老化の抑制が望まれる細胞であることができる。例えば、対象細胞は、幹細胞や免疫細胞であることができる。本発明の方法が適用可能な幹細胞の例としては、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞や、体性幹細胞（造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞などが含まれる）を挙げることができ、免疫細胞としては、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞などを挙げることができる。

細胞老化シグナルの低減は、これらの細胞老化の指標を、正常細胞における同じ指標の程度と対比することにより判定することができる。細胞老化の指標は、当業者に周知の手法により、例えばフローサイトメトリーおよび／またはウェスタンブロットにより、計測することが可能である。例えば、本願実施例記載の方法に準じて、細胞サイズ、細胞内部構造の複雑さ、ミトコンドリア膜電位、マイトファジー活性、細胞周期、細胞増殖、ｐ５３の発現、および／またはｐ２１の発現を観察・計測することで、細胞老化シグナルの低減を判定してもよい。

以下に本発明の具体例を示す。これらの具体例は、本発明を理解するための説明を提供することを目的とするものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１：ミトコンドリア指向性Ｍｎポルフィリン錯体（ＭｎｄＭＩｍＰ _３ Ｐ）の製造
（１）Ｈ_２ＭＩｍＰ_３Ｐ（５−（１−メチルイミダゾール−２−イル）−１０，１５，２０−トリフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリン）の合成
Ｈ_２ＭＩｍＰ_３Ｐの構造式：

１Ｌの三つ口フラスコにプロピオン酸３００ｍＬを加え、窒素下１７０℃に加熱した。ベンズアルデヒド４．３ｍＬ、１−メチルイミダゾール−２−カルボキシアルデヒド２．０ｇを加え、続いて蒸留精製したピロールを４．２ｍＬ加えた。１時間加熱攪拌後、９０℃まで放冷し、エチレングリコール２００ｍＬを滴下した。室温まで放冷した後、氷水浴で冷却した。冷却後の溶液を吸引濾過し、冷メタノールで洗浄して、紫色の固体８６７ｍｇを回収した。得られた固体から、塩基性活性アルミナクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）によりＴＰＰ（テトラフェニルポルフィリン）を溶出した。次いで、得られたポルフィリンの混合物を、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）により分離した。分画の溶媒を留去し、紫色の固体１１８ｍｇを得た。合成の確認はＵＶ-可視吸収スペクトル測定と質量分析および^１Ｈ−ＮＭＲで行った。結果は次に示す。

Ｈ_２ＭＩｍＰ_３Ｐの極大吸収波長：λｍａｘ ４１８ｎｍ（ソーレー帯）、５１５ｎｍ、５５０ｎｍ、５８８ｎｍ（Ｑ帯）
Ｈ_２ＭＩｍＰ_３ＰのＦＡＢ−ＭＳ：６１９
Ｈ_２ＭＩｍＰ_３Ｐの^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：８．９０（２Ｈ）（ピロールのβ位の水素原子），８．８５（４Ｈ）（ピロールのβ位の水素原子），８．７８（２Ｈ）（ピロールのβ位の水素原子），８．２５−８．１５（６Ｈ）（フェニル基の水素原子），７．８０−７．７２（９Ｈ）（フェニル基の水素原子），７．６７（１Ｈ）（イミダゾール基の水素原子），７．４８（１Ｈ）（イミダゾール基の水素原子），３．４７（３Ｈ）（メチル基の水素原子），−２．７６（２Ｈ）（環内部の水素原子）
（２）Ｈ_２ｄＭＩｍＰ_３Ｐ（５−（１，３−ジメチルイミダゾリウム−２−イル）−１０，１５，２０−トリフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリン）の合成
Ｈ_２ｄＭＩｍＰ_３Ｐの構造式：

１００ｍＬの三つ口フラスコに、前記（１）で得たポルフィリンＨ_２ＭＩｍＰ_３Ｐ １
１８ｍｇを加え、クロロホルム２０ｍＬに溶解させ、過剰量のヨウ化メチルを入れ、窒素気流下４０℃で１８時間加熱撹拌した。反応液を室温まで放冷後、ヘキサンを加え、吸引濾過して紫色の固体１２９ｍｇを得た。合成の確認はＵＶ−可視吸収スペクトル測定と質量分析および^１Ｈ−ＮＭＲで行った。結果を次に示す。

Ｈ_２ｄＭＩｍＰ_３Ｐの極大吸収波長：λｍａｘ ４２２ｎｍ（ソーレー帯）、５１５ｎｍ、５５２ｎｍ、５８７ｎｍ（Ｑ帯）
Ｈ_２ｄＭＩｍＰ_３ＰのＦＡＢ−ＭＳ：６３３
Ｈ_２ｄＭＩｍＰ_３Ｐの^１Ｈ−ＮＭＲ：９．０９（２Ｈ）（イミダゾリウム環の４，５位の水素原子）８．８９（４Ｈ）（ピロールのβ位水素原子）８．７２（４Ｈ）（ピロールのβ位の水素原子）８．１９（６Ｈ）（フェニル基の２，６位の水素原子）７．８１−７．７９（９Ｈ）（フェニル基３，４，５位の水素原子）３．９２（６Ｈ）（メチル基の水素原子）−２．６５（２Ｈ）（環内部の水素原子）
（３）Ｈ_２ｄＭＩｍＰ_３ＰへのＭｎ導入
ＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐの構造式：

１００ｍＬの三つ口フラスコに前記（２）で得られたＨ_２ｄＭＩｍＰ_３Ｐ ３４ｍｇを加え、メタノール１７ｍＬに溶解させた後、塩化マンガン６１ｍｇを加え、８０℃で４８時間加熱撹拌した。ＵＶ-可視吸収スペクトルを用いてポルフィリンのソーレー帯のシフトおよび吸光度変化から中心金属の導入を確認した。反応終了後、溶媒を留去し、得られた固体を水に再溶解させ、不溶物を濾過で取り除いた。濾液にヘキサフルオロリン酸アンモニウムを適量加え、析出した紫色固体を吸引濾過により回収し、水で洗浄後、乾燥させた。回収した固体をアセトンに溶解し、テトラブチルアンモニウムクロリドを加え、濾過により析出固体を回収することで紫色の固体３８ｍｇを得た。合成の確認はＵＶ-可視吸収スペクトル測定と質量分析で行った。結果を次に示す。

ＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐの極大吸収波長：λｍａｘ４６５ｎｍ（ソーレー帯）、５５７ｎｍ（Ｑ帯）
ＭｎｄＭＩｍＰ_３ＰのＦＡＢ−ＭＳ：７２１、６８６

実施例２：ＭｎｄＭＩｍＰ _３ ＰおよびＰＦＴ−α含有リポソームナノキャリアの調製（１）
（１）ＭｎｄＭＩｍＰ_３ＰおよびＰＦＴ−α含有リポソームの調製
ナスフラスコに、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）１ｍｇ、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）１ｍｇ、およびＰＦＴ−α１００ｍｇを入れ、クロロホルム２ｍＬに溶解させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、乾燥薄膜を作製した。

得られた乾燥薄膜に、ＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐ １００ｍｇを蒸留水に溶解させた水溶液２ｍＬを加え、３０分間超音波攪拌を行った。
得られたリポソーム分散液を、液体窒素を用いて凍結し、凍結後常温で融解させるステップを三回行うことにより、目的のＭｎｄＭＩｍＰ_３ＰおよびＰＦＴ−α含有リポソーム分散液を得た。粒径は１１７．６±３１．０ｎｍの値を示した。

（２）ＤＮＡとの複合化
上記（１）で調製したリポソームのカチオン性を弱めるために、ＤＮＡを複合化させた。

エッペンドルフチューブ内で上記（１）のリポソーム溶液とｐＧＬ３をコードしたプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）溶液を任意のｍｏｌ比で混合し、常温で１時間静置することでリポソームの構成成分であるカチオン性脂質ＤＯＴＭＡとアニオン性のｐＤＮＡの電荷比（＋／−）が１となるように複合化させた。

粒径は、薬剤を封入していない空のリポソームおよび薬剤を一種、二種封入したリポソームにおいて大きな差は無く、１１０ｎｍ程度の粒径を示した。さらに、薬剤封入率はＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐが３７．１％およびＰＦＴ−αが８７．８％の値を示した。

（３）比較
ＭｎｄＭＩｍＰ_３ＰおよびＰＦＴ−α含有リポソームナノキャリア（MnP PFT）（以後、実施例において「実施例２で調製したリポソームナノキャリア」と表記することがある）、ならびに、リポソームのみ、ＰＦＴ−α含有リポソーム（PFT）、およびＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐ含有リポソーム（MnP）の粒径や薬剤封入率を比較した。結果を下記の表に示す。

実施例３：アラマーブルーアッセイによるリポソームキャリアの細胞毒性評価
ヒト肺胞上皮細胞（Ａ５４９細胞（がん細胞））およびヒト胎児肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８細胞（正常細胞））の培養は、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、Ａ５４９細胞は１×１０^５細胞／ウェルの細胞密度で、ＷＩ−３８細胞は５×１０^４細胞／ウェルの細胞密度で、それぞれ９６ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。

実施例２で調製したリポソームナノキャリアを、脂質濃度が０．１ｍｇ／ｍＬから１．０ｍｇ／ｍＬとなるまで調製し、これらのサンプルを各ウェルに添加し、４時間インキュベートした。その後培地交換を行い、培地１００μＬとアラマーブルー１０μＬ添加し、４時間インキュベート後、蛍光プレートリーダーにより細胞生存率を評価した。

結果
がん細胞であるＡ５４９細胞、および正常細胞であるＷＩ−３８細胞共に、脂質濃度１．０ｍｇ／ｍＬまで細胞生存率にほとんど変化が見られず、このキャリアは脂質濃度１．０ｍｇ／ｍＬまでは細胞毒性がないことが確認された。

実施例４：フローサイトメトリーによる老化モデル細胞の細胞形質変化の評価
（１）過酸化水素濃度の検討
ヒト肺胞上皮細胞（Ａ５４９細胞（がん細胞））の培養は、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、１×１０^５細胞／ウェルの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。

過酸化水素１μＭ〜１００μＭを各細胞・各ウェルに添加し、２４時間インキュベートした。
培地除去後、トリプシンＥＤＴＡ溶液を各ウェルに２００μＬ添加し、５分間インキュベートした。その後、各ウェルに８００μＬのＤＭＥＭ培地を加え、全量１０００μＬをエッペンドルフチューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み除去し１０００μＬの培地を添加してフローサイトメトリーにより評価した。

結果
正常なＡ５４９細胞に過酸化水素を添加すると、１μＭ〜１０μＭでは細胞サイズおよび密度に何も変化を及ぼさなかったが、１００μＭ添加により細胞サイズおよび密度共に急激な上昇が確認された。

（２）インキュベート時間の検討
過酸化水素１００μＭを各細胞・各ウェルに添加し、４時間、２４時間、４８時間インキュベートしたほかは、（１）と同様にヒト肺胞上皮細胞（Ａ５４９細胞（がん細胞））の培養、処理、および評価を行った。

結果
正常なＡ５４９細胞に過酸化水素１００μＭ添加した場合、４時間のインキュベートでは細胞老化の指標の一つである細胞の肥大化および高密度化は確認されたが、過酸化水素添加前と比べ大きな変化は見られなかった。２４時間のインキュベートでは著しいサイズ増大および高密度化が確認された。さらに、４８時間インキュベートした場合ではより大きな増大が確認された。

実施例５：フローサイトメトリーによる正常細胞の細胞形質変化の評価
（１）過酸化水素濃度の検討
ヒト胎児肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８細胞（正常細胞））の培養は、１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、５×１０^４細胞／ウェルの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。

過酸化水素１μＭ〜１００μＭを各細胞・各ウェルに添加し、４時間インキュベートした。
培地除去後、トリプシンＥＤＴＡ溶液を各ウェルに２００μＬ添加し、５分間インキュベートした。その後、各ウェルに８００μＬのＤＭＥＭ培地を加え、全量１０００μＬをエッペンドルフチューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み除去し１０００μＬの培地を添加してフローサイトメトリーにより評価した。

結果
ＷＩ−３８細胞に過酸化水素を１μＭ〜１００μＭ添加し４時間インキュベートした場合では、細胞の肥大化と細胞の高密度化は確認されなかった。

（２）インキュベート時間の検討
過酸化水素１００μＭを各細胞に添加し、４時間または４８時間インキュベートしたほかは、（１）と同様にヒト胎児肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８細胞（正常細胞））の培養、処理、および評価を行った。

結果
４時間インキュベートでは細胞の形質変化に差はほとんど見られなかったが、４８時間インキュベート場合においては細胞のサイズの著しい増大と細胞密度の高密度化が確認された。

実施例６：フローサイトメトリーによる老化モデル細胞のキャリア添加後のミトコンドリア膜電位低下評価
ヒト胎児肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８細胞（正常細胞））の培養は、１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、５×１０^４細胞／ウェルの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。

過酸化水素１００μＭを各細胞に添加し、４８時間インキュベートした。培地交換後、実施例２で調製したリポソームナノキャリアを各ウェルに添加した。４時間後に培地交換を行い、２４時間または７２時間インキュベートした。

アスピレーターにより培地除去後、ＤＭＳＯに溶かしたＪＣ−１を最終添加濃度が３０μＭとなるようにＤＭＥＭの１％ＤＭＳＯ溶液に溶かし、各ウェルに１ｍＬずつ添加し、１０分間インキュベートした。ＰＢＳ（−）による洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡを２００μＬ添加し、３分間インキュベートした。その後、各ウェルに８００μＬのＤＭＥＭ培地を加え、全量１０００μＬをエッペンドルフチューブに移し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み除去し１０００μＬの培地を添加してフローサイトメトリーにより評価した。

結果
実施例２で調製したリポソームナノキャリアを添加し、培地交換を行った後、２４時間インキュベートした細胞での結果を図１−１に、７２時間インキュベートした細胞での結果を図１−２に示す。

上記７２時間インキュベートした細胞では、老化モデル細胞（リポソームナノキャリアを添加しない対照）ではミトコンドリア膜電位が低下した細胞の割合が１７．４％であったのに対し、実施例２で調製したリポソームナノキャリアを添加した老化モデル細胞ではミトコンドリア膜電位が低下した細胞の割合が１２．４％まで低下した。これは異常ミトコンドリアがマイトファジーにより分解されたため、相対的にミトコンドリア膜電位の低下した細胞の割合が減少したことが考えられる。

実施例７：フローサイトメトリーによる老化モデル細胞の細胞形質変化評価（細胞サイズと細胞内部構造（細胞密度）の評価）
ヒト胎児肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８細胞（正常細胞））の培養は、１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、５×１０^４細胞／ウェルの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。

過酸化水素１００μＭを各細胞に添加し、４８時間インキュベートした。培地交換後、実施例２で調製したリポソームナノキャリアを各ウェルに添加した。４時間後に培地交換を行い、７２時間インキュベートした。

ＰＢＳ（−）による洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡを２００μＬ添加し、３分間インキュベートした。その後、各ウェルに８００μＬのＤＭＥＭ培地を加え、全量１０００μＬをエッペンドルフチューブに移し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み除去し１０００μＬの培地を添加してフローサイトメトリーにより評価した。

結果
結果を図２に示す。正常細胞と比較して、作製した老化モデル細胞では、細胞サイズの増大および内部構造の複雑さの増大が確認された。さらに、そこに実施例２で調製したリポソームナノキャリアを添加して、マイトファジーを誘発することにより、細胞サイズおよび複雑さの減少が確認された。このことは、老化細胞の割合が減少し、正常細胞割合が増大したことを示している。

実施例８：ウェスタンブロット法による老化モデル細胞中のp53阻害効果の評価およびLC3-IIによるミトコンドリア膜電位低下誘導能評価
ヒト胎児肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８細胞（正常細胞））の培養は、１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、５×１０^４細胞／ウェルの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。

過酸化水素１００μＭを各細胞に添加し、４８時間インキュベートした。培地交換後、実施例２で調製したリポソームナノキャリアを各ウェルに添加した。４時間後に培地交換を行い、７２時間インキュベートした。

培地除去後、２００μＬの細胞溶解液を各ウェルに添加し、１５分間精静置して細胞溶解液を作製した。得られた細胞溶解液に１０％メルカプトエタノール入りのサンプルバッファー（還元剤（×５）：Ｔｒｉｓ １．８９ｇ，ＳＤＳ ５ｇ，グリセロール１０ｍＬ）を２００μＬ加え、熱湯中に１５分間静置し、ウェスタンブロット用サンプルを作製した。

作製したサンプルを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）（濃縮ゲル：３０％アクリルアミド、Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ、ＤＤＷ；分離ゲル：３０％アクリルアミド、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８、１０％ＳＤＳ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ、ＤＤＷ）によって分離し、タンク式ブロッティング装置を用いて、ゲルからＰＶＤＦ膜へタンパクを転写した。

タンパクを転写した膜に一次抗体（抗ｐ５３ウサギ抗体または抗ＬＣ３Ａ／Ｂウサギ抗体、及び抗β−アクチンウサギ抗体）：ｗａｓｈバッファー＝１：１０００溶液で一次抗体処理を一晩行い、次いで、二次抗体（ＨＲＰ−複合化抗マウス抗体、ＨＲＰ−複合化抗ウサギ抗体）：ｗａｓｈバッファー＝１：１０００溶液で二次抗体処理を行った。Amersharm ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（GEヘルスケア・ジャパン株式会社）を使用し、発光検出することでｐ５３発現量を半定量的に評価した。

その際、ポリアクリルアミドゲル電気泳動用ゲルは以下の表を基にして作製した。

また、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットは、以下の通りに行った。
・SDS-PAGE
SDS-PAGEバッファー(×１０)：Tris 90.0 g, SDS 30 g, Gly 432.3 g, 蒸留水（D.W.） ３Ｌを調製した。分離ゲルを調製し、その上に濃縮ゲルを調製した。ゲルが固まったら、SDS-PAGEバッファーで浸し、サンプルを２０μＬ／レーンでロードした。０．０３Ａで１時間泳動した。
・ブロッティング
転写バッファー(×１０)：Tris 30.3g, Gly 144.2 g, D.W. ３Ｌを調製した。SDS-PAGEで泳動し、分離したタンパク質をPVDF膜に転写した。その際、電圧は１００Ｖで１時間転写を行った。
・ブロッキング
wash バッファー(×１０)：Tris 24.2 g, 塩化ナトリウム 80g, D.W. １Ｌを調製した。スキムミルクを１×washバッファーに分散させ、そこにブロッティングを行ったPVDF膜を浸漬させ、１時間振盪させた。振盪後、washバッファーにより膜を洗浄した。
・一次抗体反応
一次抗体をwashバッファーに添加し、よくタッピングした。袋にPVDF膜と一次抗体溶液を入れ、４℃で一晩静置した。
・二次抗体反応
一次抗体に浸した膜をwashバッファーで洗浄した。続いて、二次抗体をwashバッファーに添加し、一次抗体の場合と同様にPVDF膜を浸し、４℃で一晩静置した。
・検出
膜をwashバッファーで洗浄し、Amersharm ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（GEヘルスケア・ジャパン株式会社）で混合したものを膜全体に行き渡らせた。５分間遮光下で静置した後、EZ capture MG（アトー株式会社）により蛍光バンドを検出した。

結果（１）：ｐ５３阻害効果
結果を図３に示す。ＷＩ−３８細胞（正常細胞）におけるｐ５３／β−アクチン（control）比の値を１．０に合わせた場合、老化モデル細胞のｐ５３／β−アクチン比の値は、６．７まで増加することが確認された。そして、老化モデル細胞に実施例２で調製したリポソームナノキャリアを添加すると、ｐ５３／β−アクチン比の値は１．８まで減少することが確認された。ＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐ含有リポソーム添加の場合では４．５、ＰＦＴ−α含有リポソーム添加の場合では３．０までの減少であった。

結果（２）：マイトファジー評価
結果を図４に示す。ＷＩ−３８細胞（正常細胞）におけるＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉ比の値を１．０に合わせた場合、老化モデル細胞のＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉ比の値は０．８まで減少することが確認された。そして、老化モデル細胞に実施例２で調製したリポソームナノキャリアを添加すると、ＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉ比の値は５．４まで上昇することが確認された。ＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐ含有リポソーム添加の場合では０．９、ＰＦＴ−α含有リポソーム添加の場合では２．１までの上昇であった。

以上の結果から、実施例２で調製したリポソームナノキャリアによるＭｎｄＭＩｍＰ_３ＰとＰＦＴ−αの共送達は、ミトコンドリア膜電位の低下とｐ５３阻害を同時に起こすことにより、効率的にマイトファジーを誘発していることが示唆された。

実施例９：ウェスタンブロット法による細胞老化因子ｐ２１の発現評価
（１）ヒト肺胞上皮細胞（Ａ５４９細胞（がん細胞））の培養および評価
ヒト肺胞上皮細胞（Ａ５４９細胞（がん細胞））の培養は、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、１×１０^５細胞／ウェルの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。

過酸化水素１００μＭを各細胞に添加し、４時間、２４時間、４８時間インキュベートした。
培地除去後、２００μＬの細胞溶解液を各ウェルに添加し、１５分間精静置して細胞溶解液を作製した。得られた細胞溶解液に１０％メルカプトエタノール入りのサンプルバッファー（還元剤(×５)：Ｔｒｉｓ １．８９ｇ、ＳＤＳ ５ｇ、グリセロール１０ｍＬ）を２００μＬ加え、熱湯中に１５分間静置し、ウェスタンブロット用サンプルを作製した。

作製したサンプルを、SDS-PAGEに供し、ウェスタンブロットを行った。SDS-PAGEは実施例８と同様に行った。ウェスタンブロットは、一次抗体として抗ｐ２１ Waf/Cip1ウサギ抗体、及び抗β−アクチンウサギ抗体を用いた他は、実施例８と同様に行った。

結果
過酸化水素１００μＭ添加した細胞では、インキュベート時間が４時間では多少の増大が見られ、４８時間に最も大きな増大が確認された。この結果は、実施例４（２）の細胞形質変化の結果と同様な傾向を示したため、過酸化水素１００μＭ、インキュベート時間４８時間では老化細胞の形成が示唆された。

（２）ヒト胎児肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８細胞（正常細胞））の培養および評価
細胞として、ヒト胎児肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８細胞（正常細胞））を用い、過酸化水素添加後のインキュベート時間を４８時間とした他は、上記（１）と同様に細胞を培養し、ウェスタンブロット用サンプルを作製した。また、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットも上記（１）と同様に行った。

結果
ＷＩ−３８細胞（正常細胞）に過酸化水素１００μＭ添加し、４８時間インキュベートした場合は、サイクリンキナーゼ阻害タンパク質であるｐ２１の発現量が著しく増大した。このことからも過酸化水素１００μＭ添加において細胞老化の傾向が見られた。

（３）まとめ
上記（１）および（２）の結果より、がん細胞であるＡ５４９細胞、正常細胞であるＷＩ−３８細胞共に、過酸化水素１００μＭを添加し４８時間インキュベートした後において、細胞のサイズが増大し、高密度化したことから細胞形質変化が引き起こされたことが確認された。また、細胞周期停止因子であるｐ２１の発現やＧ２／Ｍ期でのセルサイクルの停止も確認された。これは、各細胞に過酸化水素添加することにより、ミトコンドリア機能障害やＤＮＡダメージが誘発され、それに応じて細胞老化誘導因子であるｐ５３が発現し細胞老化が引き起こされたためであると考えられる。ｐ５３の発現により、ｐ５３のカスケードであるｐ２１は発現し、このｐ２１がサイクリンキナーゼ１を阻害したため、細胞はＧ２／Ｍ期でのチェックポイントを通過できず分裂停止が観測されたと考えられる。さらに、Ｇ２期細胞の増大により、肥大化した細胞の割合が増加したため細胞サイズが上昇したと考えられる。さらに老化細胞中では異常なタンパク質合成やマイトファジーの不活性化が引き起こされるため、不要な細胞内オルガネラやタンパク質が増大し、細胞内の高密度化が引き起こされたことが示唆された。

また、過酸化水素濃度の更なる上昇やインキュベート時間の延長は、細胞内に過剰なＲＯＳを発生させて、ｐ５３由来のアポトーシスを引き起こすことが懸念される。したがって、本実施例で検討した、過酸化水素濃度１００μＭ、インキュベート時間４８時間において、効率的な老化モデル細胞の作製に成功した。

実施例１０：ウェスタンブロット法による老化モデル細胞中のｐ２１発現量評価
ヒト胎児肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８細胞（正常細胞））の培養は、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、５×１０^４細胞／ウェルの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。

過酸化水素１００μＭを各細胞に添加し、４８時間インキュベートした。培地交換後、実施例２で調製したリポソームナノキャリアを各ウェルに添加した。４時間後に培地交換を行い、７２時間インキュベートした。

培地除去後、２００μＬの細胞溶解液を各ウェルに添加し、１５分間静置して細胞溶解液を作製した。得られた細胞溶解液に１０％メルカプトエタノール入りのサンプルバッファー（還元剤(×５)：Ｔｒｉｓ １．８９ｇ、ＳＤＳ ５ｇ、グリセロール１０ｍＬ）を２００μＬ加え、熱湯中に１５分間静置し、ウェスタンブロット用サンプルを作製した。

SDS-PAGEおよびウェスタンブロットを、実施例９と同様に行った。
結果
結果を図５に示す。ＷＩ−３８細胞（正常細胞）と比較して、作製した老化モデル細胞（Senescence）では著しいｐ２１発現量の増加が確認された。そして、老化モデル細胞に実施例２で調製したリポソームナノキャリアを添加した細胞（liposome）ではｐ２１発現量の大きな減少が確認された。

実施例１１：フローサイトメトリーによるがん細胞（Ａ５４９細胞）および正常細胞（ＷＩ−３８細胞）に過酸化水素を添加した場合のセルサイクル（細胞周期）評価
ヒト肺胞上皮細胞（Ａ５４９細胞（がん細胞））およびヒト胎児肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８細胞（正常細胞））の培養は、それぞれ、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、１×１０^５細胞／ウェルの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。

過酸化水素１００μＭを各細胞に添加し、４８時間インキュベートした。
培地除去後、トリプシン−ＥＤＴＡを各ウェルに２００μＬずつ添加し、５分間インキュベートした。その後、各ウェルに８００μＬのＤＭＥＭ培地を加え、全量１０００μＬをエッペンドルフチューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離後、−２０℃で７０％エタノールをボルテックスしながら１ｍＬ滴下し、２時間以上４℃で静置した後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、エタノール除去を行った。エタノール除去後、ＰＢＳ（−）を１ｍＬ添加し、再び５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。ＲＮａｓｅ ０．２５ｍｇ／ｍＬ溶液を１ｍＬ添加し、３７℃で３０分間静置した後、ヨウ化プロピジウムを５０μｇ／ｍＬとなるように加え、よくタッピングしフローサイトメトリーにより評価した。

結果
がん細胞（Ａ５４９細胞）ではＧ２／Ｍ期の細胞割合が１３％程度であるのに対し、過酸化水素１００μＭ添加した細胞ではＧ２／Ｍ期の細胞割合が４２％程度まで増加した。

正常細胞（ＷＩ−３８細胞）ではＧ２／Ｍ期の細胞割合が１５％程度であるのに対し、過酸化水素１００μＭ添加した細胞ではＧ２／Ｍ期の細胞割合が２８％程度まで増加した。このことは、過酸化水素の添加により、Ｇ２／Ｍ期において細胞周期が停止したことを示しており、細胞老化が示唆された。

実施例１２：細胞周期評価
ヒト胎児肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８細胞（正常細胞））の培養は、１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、５×１０^４細胞／ウェルの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。

過酸化水素１００μＭを各細胞に添加し、４８時間インキュベートした。培地交換後、
実施例２で調製したリポソームナノキャリアを各ウェルに添加した。４時間後に培地交換を行い、７２時間インキュベートした。

ＰＢＳ（−）による洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡを２００μＬ添加し、３分間インキュベート後、８００μＬ培地を添加し、全量１０００μＬをエッペンドルフチューブに移し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。遠心分離後、−２０℃の７０％エタノールをボルテックスしながら１ｍＬ滴下し、２時間以上４℃で静置した。その後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、エタノール除去を行った。エタノール除去後、ＰＢＳ（−）を１ｍＬ添加し、再び５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行い上澄み除去した。ＲＮａｓｅ ０．２５ｍｇ／ｍＬ溶液を１ｍＬ添加し、３７℃で３０分間静置した。静置後、ヨウ化プロピジウムを５０μｇ／ｍＬとなるように加え、よくタッピングしフローサイトメトリーにより評価した。

結果
結果を図６に示す。正常細胞（ＷＩ−３８細胞）におけるＧ２／Ｍ期の細胞割合は約１５％程度であるのに対し、過酸化水素添加により作製された老化モデル細胞ではＧ２／Ｍ期の細胞割合は２８％程度まで増加していたため、セルサイクルの停止が示唆された。過酸化水素添加により作製された老化モデル細胞に、実施例２で調製したリポソームナノキャリアを添加した細胞ではＧ２／Ｍ期細胞の割合減少が確認された。

実施例１３：ＭｎｄＭＩｍＰ _３ ＰおよびＰＦＴ−μ含有リポソームナノキャリアとＭｎｄＭＩｍＰ _３ Ｐおよびｐ−nitro−ＰＦＴ−α含有リポソームナノキャリアの調製
（１）ＭｎｄＭＩｍＰ _３ ＰおよびＰＦＴ−μ含有リポソームの調製
ナスフラスコに、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）１ｍｇ、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）１ｍｇ、およびＰＦＴ−μ１００ｍｇを入れ、クロロホルム２ｍＬに溶解させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、乾燥薄膜を作製した。

得られた乾燥薄膜に、ＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐ１００ｍｇを蒸留水に溶解させた水溶液２ｍＬを加え、３０分間超音波攪拌を行った。
得られたリポソーム分散液を、液体窒素を用いて凍結し、凍結後常温で融解させるステップを三回行うことにより、目的のＭｎｄＭＩｍＰ_３ＰおよびＰＦＴ−μ含有リポソーム分散液を得た。粒径は９４．４±２３．６ｎｍ（P.I. = 0.323）の値を示した。

（２）ＭｎｄＭＩｍＰ _３ Ｐおよびｐ−nitro−ＰＦＴ−α含有リポソーム
ナスフラスコに、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）１ｍｇ、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）１ｍｇ、およびｐ−nitro−ＰＦＴ−α１００ｍｇを入れ、クロロホルム２ｍＬに溶解させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、乾燥薄膜を作製した。

得られた乾燥薄膜に、ＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐ１００ｍｇを蒸留水に溶解させた水溶液２ｍ
Ｌを加え、３０分間超音波攪拌を行った。
得られたリポソーム分散液を、液体窒素を用いて凍結し、凍結後常温で融解させるステップを三回行うことにより、目的のＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐおよびｐ−nitro−ＰＦＴ−α含有リポソーム分散液を得た。粒径は８９．２±１７．９ｎｍ（P.I. = 0.369）の値を示した。

実施例１４：ｐ５３阻害剤を変えた場合の細胞増殖評価
ヒト胎児肺繊維芽細胞（ＷＩ‐３８細胞（正常細胞））の培養は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、５×１０^３細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。

過酸化水素１００μＭを各細胞に添加し、４８時間インキュベートした。培地交換後、阻害剤をＰＦＴ−αからＰＦＴ−μまたはｐ−nitro−ＰＦＴ−αに変えて実施例１３記載の方法で調製したリポソームナノキャリアを各ウェルに添加した。４時間後に培地交換を行い、４８時間インキュベートした。その後、培地を除去し、培地９０μＬおよびアラマーブルー試薬（invitrogen）１０μＬを添加し、４時間インキュベートした。インキュベート後、プレートリーダー（ＤＴＸ８００、ベックマンコールター）にてＥｘ５５０ｎｍ、Ｅｍ５９７ｎｍの蛍光強度を測定した。過酸化水素を添加して、０，２，４日後の蛍光強度を測定した。

結果
結果を図７に示す。正常細胞と比較して、過酸化水素添加により作製された老化モデル細胞では、細胞増殖の遅れが確認されたのに対し、ＭｎｄＭＩｍＰ_３ＰおよびＰＦＴ−μ含有リポソームナノキャリアやＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐおよびｐ−nitro−ＰＦＴ−α含有リポソームナノキャリアを添加した場合では、老化モデル細胞と比較して、細胞増殖の回復が確認された。

実施例１５：ＭｎｄＭＩｍＰ _３ ＰおよびＰＦＴ−α含有リポソームナノキャリアの調製（２）
実施例２とは異なり、凍結融解工程を含まず、さらにＤＮＡとの複合化もせず、ＭｎｄＭＩｍＰ_３ＰおよびＰＦＴ−αを封入したリポソームナノキャリア（MnP PFT、pDNAおよび凍結融解なし）を調製した。
ナスフラスコに、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）１ｍｇ、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）１ｍｇ、およびＰＦＴ−α １００ｍｇを入れ、クロロホルム２ｍＬに溶解させた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、乾燥薄膜を作製した。

得られた乾燥薄膜に、ＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐ １００ｍｇを蒸留水に溶解させた水溶液２ｍＬを加え、氷水で冷やしながら２０分間ボルテックスを行った。その後、２０分間超音波攪拌を行い、目的のＭｎｄＭＩｍＰ_３ＰおよびＰＦＴ−α含有リポソーム分散液を得た。粒径は４２．７±１０．７ｎｍの値を示した。

実施例１６：ウェスタンブロット法による細胞老化因子ｐ２１の発現評価（実施例１５で作製したリポソームナノキャリアを用いた場合）
実施例１５で調製したリポソームナノキャリアを用いて、老化モデル細胞におけるｐ２１の発現量を評価した。

ヒト胎児肺繊維芽細胞（ＷＩ−３８細胞（正常細胞））の培養は、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、５×１０^４細胞／ウェルの細胞密度で１２ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。

過酸化水素２００μＭを各細胞に添加し、２４時間インキュベートした。培地交換後、実施例１５で調製したリポソームナノキャリアを各ウェルに添加した。４時間後に培地交換を行い、７２時間インキュベートした。

培地除去後、２００μＬの細胞溶解液を各ウェルに添加し、１５分間静置して細胞溶解液を作製した。得られた細胞溶解液に１０％メルカプトエタノール入りのサンプルバッファー（還元剤(×５)：Ｔｒｉｓ １．８９ｇ、ＳＤＳ ５ｇ、グリセロール１０ｍＬ）を２００μＬ加え、熱湯中に１５分間静置し、ウェスタンブロット用サンプルを作製した。

SDS-PAGEおよびウェスタンブロットを、実施例９と同様に行った。

結果
結果を図８に示す。ＷＩ−３８細胞（正常細胞）と比較して、作製した老化モデル細胞ではｐ２１発現量の増加が確認された。そして、老化モデル細胞に実施例１５で調製したリポソームナノキャリアを添加した細胞（７２時間後）では未処理の老化細胞と比較して、ｐ２１発現量の著しい低下が確認された。

本出願の複合体は、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞への共送達により、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤による機能不全ミトコンドリアの消去と酸化傷害の抑制を同時に達成することができるものである。したがって、細胞老化や老化細胞が発する細胞老化関連分泌形質が病理に関わる老化関連疾患（閉塞性肺疾患、糖尿病、アルツハイマー、パーキンソン病や心臓疾患等を含む）の根治治療への応用が期待される。

Claims (15)

1. ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤を対象細胞に共送達するための複合体であって、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリア、ミトコンドリア膜電位低下剤、およびｐ５３阻害剤を含む、前記複合体。
2. ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリアがリポソームである、請求項１に記載の複合体。
3. リポソームがカチオン性リポソームであり、当該カチオン性リポソームは、以下：
   Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
   ジドデシルジメチルアンモニウム ブロミド（ＤＤＡＢ）；
   １，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
   １，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；
   ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；
   ジオクタデシル−ジメチルアンモニウム クロリド（ＤＯＤＡＣ）；
   １，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
   ２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，
   Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウム トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；
   ３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン−カルバモイル−コレステロール）
   （ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；および
   Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン クロリド；
   からなる群より選択される少なくとも１つのカチオン性脂質、および以下：
   ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
   ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
   ジアシルホスファチジルコリン；
   リゾホスファチジルコリン；
   ジアシルホスファチジルグリセロール；
   ジアシルホスファチジン酸；
   ジアシルホスファチジルセリン；
   スフィンゴミエリン；
   セラミド；
   ジアシルグリセロール；および
   コレステロール；
   からなる群より選択される少なくとも１つの非カチオン性脂質（ここで非カチオン性脂質に含まれるアシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基である）、により構成される、請求項２に記載の複合体。
4. ミトコンドリア膜電位低下剤がポルフィリン系ミトコンドリア膜電位低下剤であり、当該ポルフィリン系ミトコンドリア膜電位低下剤は、
   下記式（Ｉ）で表されるカチオン性金属ポルフィリン錯体：
   （式中、
   Ｍ_１は、遷移金属元素または卑金属元素を示し、
   Ｒ_１は、以下：
   からなる群より選択される基を示し、式中、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、およびＲ_８は、それぞれ同一または異なる基であって、それぞれ水素、アルキル基およびアルコキシ基からなる群より選択される基を示し、
   Ｒ_２、Ｒ_３、およびＲ_４は、それぞれ同一または異なる基であって、それぞれ以下：
   からなる群より選択される基を示し、式中、Ｒ_９は、それぞれ同一または異なる基であって、それぞれ水素、アルキル基、およびアルコキシ基からなる群より選択される基を示す）
   である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
5. ｐ５３阻害剤が、以下：
   ピフィスリン−α臭化水素酸塩（ＰＦＴ−α、別名：２−（２−ルミノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾチアゾール−３−イル）−１−ｐ−トリルエタノン ヒドロブロミド）；
   ピフィスリン−μ（ＰＦＴ−μ、別名：ピフィトリン-μ、２−フェニルエチンスルホンアミド）；および
   ｐ−ニトロピフィスリン−α臭化水素酸塩（ｐ−nitro−ＰＦＴ−α、別名：１−（４−ニトロフェニル）−２−（４，５，６，７−テトラヒドロ−２−イミノ−３（２Ｈ）−ベンゾチアゾール）エタノン ヒドロブロミド）；
   からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
6. プラスミドＤＮＡをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。
8. 細胞老化および／または老化関連疾患を治療するための医薬組成物であって、請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体を含む、前記医薬組成物。
9. 細胞老化および／または老化関連疾患を治療するための医薬組成物であって、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリア、ミトコンドリア膜電位低下剤、およびｐ５３阻害剤を含み、
   ここで、ミトコンドリア膜電位低下剤とｐ５３阻害剤の共送達が可能なキャリアが、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）で構成されるリポソームであり、
   ミトコンドリア膜電位低下剤が、下記式（ＩＩ）：
   で表されるカチオン性Ｍｎポルフィリン錯体であり、そして
   ｐ５３阻害剤が、下記式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、または（Ｖ）：
   で表されるｐ５３阻害剤（それぞれ、ピフィスリン−α（ＰＦＴ−α）、ピフィスリン−μ（ＰＦＴ−μ）、またはｐ−ニトロピフィスリン−α（ｐ−nitro−ＰＦＴ−α））である、
   前記医薬組成物。
10. プラスミドＤＮＡをさらに含む、請求項９に記載の医薬組成物。
11. プラスミドＤＮＡが、ｐＧＬ３をコードするプラスミドＤＮＡである、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. ミトコンドリア膜電位低下剤およびｐ５３阻害剤を複合化するための複合化剤であって、カチオン性リポソームからなる群より選択され、ここでカチオン性リポソームは、以下
    ：
    Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
    ジドデシルジメチルアンモニウム ブロミド（ＤＤＡＢ）；
    １，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
    １，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；
    ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；
    ジオクタデシル−ジメチルアンモニウム クロリド（ＤＯＤＡＣ）；
    １，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
    ２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウム トリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；
    ３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン−カルバモイル−コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；および
    Ｏ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミン クロリド；
    からなる群より選択される少なくとも１つのカチオン性脂質、および以下：
    ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
    ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
    ジアシルホスファチジルコリン；
    リゾホスファチジルコリン；
    ジアシルホスファチジルグリセロール；
    ジアシルホスファチジン酸；
    ジアシルホスファチジルセリン；
    スフィンゴミエリン；
    セラミド；
    ジアシルグリセロール；および
    コレステロール；
    からなる群より選択される少なくとも１つの非カチオン性脂質（ここで非カチオン性脂質に含まれるアシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基である）、により構成されるものである、前記複合化剤。
13. 細胞老化を抑制する方法であって、請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体をインビトロで対象細胞と接触させて、細胞老化を抑制することを含む、前記方法。
14. 細胞老化を抑制することが、細胞サイズ、細胞内部構造の複雑さ、ミトコンドリア膜電位、マイトファジー活性、細胞周期、細胞増殖、ｐ５３の発現、およびｐ２１の発現から選択される１以上の指標により評価される細胞の老化の度合いを低減させることである、請求項１３に記載の方法。
15. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体を対象細胞と接触させて、老化細胞の割合が減少した細胞群を得る方法。