KR20240027760A - 핵산 형질감염을 위한 사이클로헥산 리피도이드 및 그 용도 - Google Patents

핵산 형질감염을 위한 사이클로헥산 리피도이드 및 그 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20240027760A
KR20240027760A KR1020247003222A KR20247003222A KR20240027760A KR 20240027760 A KR20240027760 A KR 20240027760A KR 1020247003222 A KR1020247003222 A KR 1020247003222A KR 20247003222 A KR20247003222 A KR 20247003222A KR 20240027760 A KR20240027760 A KR 20240027760A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
conh
nhc
lipidoid
transfection
glycero
Prior art date
Application number
KR1020247003222A
Other languages
English (en)
Inventor
페트르 치글러
사스코바 클라라 그란츠
바츨라브 바넥
주자나 헤이단코바
렌카 루코토바
파벨 스벡
아나스타시아 프리스
실비아 페트레젤요바
Original Assignee
우스타브 오르가니케 케미에 아 비오케미에 아베 쩨에르, 베.베.이
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 우스타브 오르가니케 케미에 아 비오케미에 아베 쩨에르, 베.베.이 filed Critical 우스타브 오르가니케 케미에 아 비오케미에 아베 쩨에르, 베.베.이
Publication of KR20240027760A publication Critical patent/KR20240027760A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/57—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C233/62—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/57—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/57—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C233/63—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C237/10—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/16—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms acylated on ring nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/16—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms acylated on ring nitrogen atoms
    • C07D295/18—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms acylated on ring nitrogen atoms by radicals derived from carboxylic acids, or sulfur or nitrogen analogues thereof
    • C07D295/182—Radicals derived from carboxylic acids
    • C07D295/185—Radicals derived from carboxylic acids from aliphatic carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 일반식 I의 리피도이드, 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 부가 염 및 용매화물에 관한 것이다. 리피도이드는 형질감염제로서 유용하다. 본 발명은 추가적으로 이러한 리피도이드를 함유한 형질감염 시약, 형질감염 입자 및 그 용도를 기술한다.

상기 식에서, X는 -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=S)O-, -C(=O)S-, -C(=S)S-, -C(=O)NHNH-, -CH2-, -O-, -OC(=O)-, -S-, -SC(=O)-, -NH-, -NHNH-, -NHC(=O)-, -NHNHC(=O)-, -C≡C-, -CH=CH-, 질소 원자 2개 이상을 함유한 5원성 헤테로사이클, -CH2C(=O)NH-, -CH2C(=S)O-, -CH2C(=S)S-, -CH2C(=O)NHNH-, -N=CH-, -CH=N-, -NH-N=CH- 및 -CH=N-NH-로부터 선택되고; Y는 알킬렌 C2-C10 쇄이고; R1은 알킬 C1-C46, 알케닐 C2-C46, 알키닐 C2-C46로부터 선택되고; Z는 H, -OH, -CH3, -CH2OH, -NH2, -C(=O)NH2, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, -CONHCH(CH2OH)2, -CONHCH2CH(-OH)CH2OH, -CONH(CH2)2C(=O)NH2, -CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, -COO(CH2)2-O-P(=O)(O-)-O(CH2)2-N+(CH3)3, -N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, 식 (II) 및 식 (III)으로부터 선택되되, 여기서 R2는 독립적으로 수소 및 -CH3로부터 선택되고; E는 독립적으로 O 및 S 원자로부터 선택되고; n은 1-5 범위의 정수이고; T는 -X-Y-N(R1)2, -C(=O)O(C1-C3 알킬), -C(=O)OCH2CH2OH, 식 (IV), 식 (V), 식 (VI), -C(=O)OH, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, -CONHCH(CH2OH)2, CONH(CH2)2C(=O)NH2, -CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONHCH[C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -C(=O)NH2, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, -NH2, -NHC(=O)CH3, -COO(CH2)2-O-P(=O)(O-)-O(CH2)2-N+(CH3)3, -OH, -O(C1-C3 알킬), -NHC(=O)NH(CH3), -NHC(=S)N(CH3)2, -NHC(=S)NH(CH3), -NHC(=N-CN)NH2, -NHC(=N-CN)NH(CH3), -NHC(=N-CN)N(CH3)2, -NHC[=N-S(=O)2NH2]NH2, -N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -N+(CH3)2-(CH2)2-COO-로부터 선택되되, 여기서 R2, E 및 n은 상기에서 정의된 바와 같이 정의되고; 및/또는 만일 Z가 -OH 또는 -CH2OH이고 T가 -C(=O)OH이면, Z는 T 및 이들 사이의 탄소 원자 3개와 함께 탄소수 4-5의 사이클릭 락톤을 형성할 수 있다.

Description

핵산 형질감염을 위한 사이클로헥산 리피도이드 및 그 용도
본 발명은 새로운 이온화 가능한 리피도이드 및 뉴클레오티드 및 핵산 및 이의 합성 유사체를 세포 및 조직에 형질감염 및 투여하기 위한 이들 화합물의 용도에 관한 것이다.
핵산 (NA)-기반 요법의 개발은 최근 수년간 전례 없는 르네상스를 겪고 있다. 이제 리보핵산 (RNA) 요법이, 높은 효율과 동시에 기존에 검사한 치료학적 데옥시리보핵산 (DNA) 대비 낮은 유해한 부작용 위험으로 인해, 기반을 다지고 있다. 이러한 약물 수종이 이미 임상적인 사용에 이르렀으며, 예를 들어 유전성 트랜스티레틴 아밀로이드증에 대한 파티시란 (patisiran), 임의 유형의 뒤센 근위축증에 대한 에테플리르센 (eteplirsen) 또는 척수 근위축증 치료용으로 누시네르센 (nusinersen)이 있다. 이러한 질환들 모두 생명에 위협적이며, 이에 대한 대안 치료법은 없다. 리보핵산 (RNA)을 표적화하는 잠재적인 약물 또는 이의 용도는 이것이 NA 또는 단백질을 표적화하는지 또는 단백질을 코딩하는지에 따라 3가지 범주로 나뉠 수 있다. 첫번째 범주는 메신저 RNA (mRNA)의 번역 또는 RNA 스플라이싱 (누시네르센, 에테플리르센)을 차단하는 뉴클레오티드 (nt) 13-25개로 된 단일 가닥 안티센스 올리뉴클레오티드; 및 mRNA를 분해하는 소형 간섭 RNA (siRNA, 21-23nt)(파티시란)를 망라한다. 단백질을 표적으로 하는 치료학적 RNA 분자는 RNA 앱타머로 알려진 유형의 분자를 이용한다. 이는 특정 단백질의 기능을 조절하기 위해 설계된 것이다. 이러한 약물에 대한 일 예가 페갑타닙 (pegaptanib)으로, 이는 2004년에 이러한 유형으로 최초로 승인된 약물로서 신혈관 노화-관련 황반 변성을 치료하기 위해 사용된다. mRNA를 이용하는 요법은 주로 소위 맞춤형 암 백신 또는 감염성 질환 (예, 지카바이러스)에 대한 백신을 제조하는데 활용된다. 바이러스 질환에서 광견병 및 유행성 인플루엔자에 대한 mRNA 기반의 예방학적 후보 백신이 건강한 지원자들에서 안전한 항체 생산을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 단백질-대체 mRNA 요법 역시 예를 들어 혈우병 치료 용도로 전-임상 개발 단계에 있다.
직접 게놈 편집을 가능하게 하는 분자 기술, 특히 CRISPR-Cas9 시스템에 기반한 기술이 현재 호황을 누리고 있다. CRISPR 기술은 DNA 서열 변경 및 유전자 기능의 수정을 가능케 하는 도구이다. 잠재적인 용도로는 유전자 결함 복구, 질환 치료 및 전파 방지 또는 농작물 개선을 포함한다. CRISPR-Cas9 시스템은 HIV 치료, 혈액 악성의 치료 및 겸상 세포 질환 및 β-지중해 빈혈 등의 유전자 장애의 치료를 비롯한 다수의 전-임상 및 임상 실험들에서 조사되었다. RNA 편집은 ADAR 시스템 (RNA에 작용하는 아데노신 데아미나제)에 의해 구현될 수 있는데, 지금까지 전-임상 관점에서 더 안전한 것으로 보인다. 직접 게놈 편집을 위한 분자 기술은 편집을 담당하는 적절한 효소를 암호화하는 mRNA 형태로 작용 부위에 전달될 수 있다.
이러한 모든 기술 (또는 NA에 기반한 기타 기술)을 안전하게 사용할 수 있게 하는 핵심적인 요소는 작용 부위로의 이의 안전하고 효과적인 수송이다. 결정적인 단계는 세포의 인지질 막을 통해 음으로 하전된 NA를 통과시키는 것이며; NA를 진핵생물 세포로 의도적으로 도입하는 공정을 형질감염이라 한다. 최근 수십년간 생체내 NA 분해를 방지하면서 세포막을 통해 효율적으로 NA를 수송하기 위한 캐리어 (소위 벡터)가 집중적으로 개발되어 왔다 (Stewart, M. P.: Chem . Rev. 2018, 118, 7409-7531).
바이러스성 및 비-바이러스성 (물리적, 화학적) 벡터 둘다 NA 형질감염에 이용된다. 지금까지 유전자 요법 분야에서 임상 실험의 약 70%가 바이러스 벡터를 이용해 수행되었지만, 이러한 방식은 수많은 위험 (발암원성, 면역 반응 유발, 조직 비-특이성, 제한된 NA 통합력 및 제조 복합성)을 수반한다. 물리적 방법 (예를 들어, 전기천공)은 인간 의학에서 전신으로 사용하기 어렵다.
반면, 합성 화학 벡터는 통상적으로 면역원성이 낮으며, 유전 물질을 대규모 수송할 수 있으며, 잘-정의된 분자들로 구성되므로 이의 구조는 필요에 따라 조정하여 이의 효율을 높이고 독성을 억제할 수 있다. 양이온성 폴리머 또는 양이온성 지질이 화학적 벡터로 이용되는데, 이는 음으로 하전된 NA와 복합체를 형성한다. 이 복합체는 세포막을 침투할 수 있으며, 동시에 세포외 환경에서 NA를 분해로부터 보호할 수 있다.
구조적인 관점에서 살펴보면, 소위 지질 나노입자 (LNP)는 현재 이러한 복합체에 대해 가장 기대되고 임상적으로 진전된 형태이다. 이중, 양이온성 지질은, 예를 들어, siRNA 형질감염 시스템 (Kulkarni, J.: Nanoscale, 2019, 11, 21733-21739)에서 입증된 바와 같이, 통상적으로 응집을 방지하고, 안정한 NA 캡슐화에 필수적인 헬퍼 지질 및 콜레스테롤과 함께 입자 크기와 형질감염 효율에 영향을 미치는 페길화된 지질과 함께 제형화된다. LNP는 뉴클레오티드 단위 수개에서 수백만개에 이르는 NA 분자를 수용할 수 있다.
합성 양이온성 지질 및 리피도이드 (소수성 쇄가 많다는 점에서 상이하지만 지질과 비슷한 합성 분자)는 양이온성 도메인 및 소수성 도메인에 의해 형성된다. 현재까지 이들 물질 다수가 표적 설계 및 조합 생성된 라이브러리 검사를 통해 양쪽 도메인에 상당한 구조적인 가변성을 가진 형태로 개발되었다.
지질 및 리피도이드, 예를 들어, D-Lin-MC3-DMA, C12-200, cKK-E12, SA2-SC8 및 기타 등이 siRNA 형질감염 용도로 특별히 개발되었다 (Dong, Y.: Adv . Drug Deliv. Rev. 2019, 144, 133-147). 현재 (2018년 8월) D-Lin-MC3-DMA를 함유한 제형이 Onpattro (종래에 파티시란)라는 명칭으로 임상 실무에 돌입하였으며, 역사상 최초로 허가된 siRNA 약물이 되었다 (Zhang, X.: J. Clin . Pharmacol . 2020, 60 (1), 37-49). 그러나, siRNA에 대해 개발된 제형은 mRNA에 대해서는 효과적이지 않을 수 있으며, 따라서 표적화된 최적화가 필요하다 Cullis, P.: Mol . Ther . 2017, 25 (7), 1467-1475).
이온화 가능한 지질 및 리피도이드, 예를 들어 D-Lin-MC3-DMA, C12-200, cKK-E12 및 TT3는 mRNA의 형질감염에 이용된다 (Zhong, Z.: Nano Today 2018, 23, 16-39; Kowalski, P.: Mol . Ther . 2019, 27 (4), 1-19; Li, B.: Nano Lett . 2015, 15, 8099-8107). 이온화 가능한 지질은 DNA 형질감염에도 이용된다. 재차, 소분자 (siRNA) 형질감염에 대해 최적화된 형질감염 시스템이 DNA 형질감염에 항상 적합한 것은 아니며, 심지어 mRNA에 대해 개발된 제형도 DNA에 효과적이지 않을 수 있음을 유념하여야 한다 (Buck, J.: ACS Nano 2019, 13, 3754-3782).
막대한 치료학적 잠재성에도 불구하고, 지금까지 이온화 가능한 지질에 기반한 합성 벡터는 극소수만 임상 사용 단계에 도달하였으므로, 효율이 더 우수하고 또한 생체내 독성이 매우 낮은 새로운 시스템에 대한 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 뉴클레오티드 및 핵산 및 이의 합성 유사체를 이온화 가능한 (양이온성) 지질을 이용하여, 형질감염 및 표적 전달하는 효율과 관련한 문제와, 표적 유기체 또는 세포에 대한 이들 지질의 독성 문제에 대해, 해법을 제공한다. 본 발명자들은, 사이클로헥산을 이온화 가능한 리피도이드의 중심 코어로 이용할 경우, 이러한 리피도이드의 형질감염 효율이 기존에 공지된 해법과 비교해 현저하게 높아진다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 동시에, 이러한 사이클로헥산-함유 리피도이드는 해당 용량에서 세포독성이 매우 낮았다. 새로운 이온화 가능한 리피도이드의 중심적인 구조 모티프로 이용되는 사이클로헥산 코어의 특이적인 특성은 그 주변에서의 입체적인 복합성과 지금까지 알려진 이온화 가능한 지질 및 리피도이드와 비교해 광범위한 치환성이다.
본 발명의 과제는 일반식 I의 이온화 가능한 리피도이드이다.
상기 식에서,
X는 -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=S)O-, -C(=O)S-, -C(=S)S-, -C(=O)NHNH-, -CH2-, -O-, -OC(=O)-, -S-, -SC(=O)-, -NH-, -NHNH-, -NHC(=O)-, -NHNHC(=O)-, -C≡C-, -CH=CH-, 질소 원자 2개 이상을 함유한 5원성 헤테로사이클, -CH2C(=O)NH-, -CH2C(=O)O-, -CH2C(=S)O-, -CH2C(=S)S-, -CH2C(=O)NHNH-, -N=CH-, -CH=N-, -NH-N=CH- 및 -CH=N-NH-를 포함하는 군으로부터 선택되고;
Y는 알킬렌 C2-C10 쇄를 포함하는 군으로부터 선택되고, 여기서 알킬렌 쇄에서 하나 이상의 -CH2- 기는 하나 이상의 O 및/또는 S 원자로 선택적으로 치환될 수 있으며; 바람직하게는, Y는 알킬렌 C2-C10 쇄, 특히 알킬렌 C3-C6 쇄, 바람직하게는 프로필렌 (-(CH2)3-), 펜틸렌 (-(CH2)5-), 헥실렌 (-(CH2)6-)을 포함하는 군으로부터 선택되고;
R1은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각의 R1은 독립적으로 알킬 C1-C46, 알케닐 C2-C46, 알키닐 C2-C46을 포함하는 군으로부터 선택되고, 여기서 알킬, 알케닐 또는 알키닐은 직선형 또는 분지형일 수 있으며, 알킬, 알케닐 또는 알키닐에서 하나 이상의 -CH2- 기는 선택적으로 -CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -S-S-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)-, -O- 및 -S-로부터 선택되는 하나 이상의 기로 치환될 수 있으며;
여기서, 만일 알킬, 알케닐 또는 알키닐이 분지형이면, 하나 이상의 >CH- 기는 선택적으로 >C(OH)-로 치환될 수 있으며;
만일 R1이 알킬 C1-C4이면, 말단-CH3 기로부터의 수소 하나가 Z로 치환될 수 있되;
단, 하나 이상의 R1은 탄소 원자 적어도 8개, 바람직하게는 탄소 원자 적어도 10개, 더 바람직하게는 탄소 원자 적어도 12개를 함유하고; 더 바람직하게는, 2 이상의 R1 치환기는 적어도 8개의 탄소 원자, 바람직하게는 적어도 10개의 탄소 원자, 더 바람직하게는 적어도 12개의 탄소 원자를 함유하며;
Z는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각의 Z는 독립적으로 수소, -OH, -CH3, -CH2OH, -NH2, -C(=O)NH2, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, -CONHCH(CH2OH)2, -CONHCH2CH(-OH)CH2OH, -CONH(CH2)2C(=O)NH2, -CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONHCH[C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, -COO(CH2)2-O-P(=O)(O-)-O(CH2)2-N+(CH3)3, -N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, 및 을 포함하는 군으로부터 선택되고,
여기서,
R2는 독립적으로 수소 및 -CH3로부터 선택되고;
E는 독립적으로 O 및 S 원자로부터 선택되고;
n은 1-5 범위의 정수이고;
T는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각의 T는 독립적으로 -X-Y-N(R1)2, -C(=O)O(C1-C3 알킬), -C(=O)OCH2CH2OH, -C(=O)NH2, , -C(=O)OH, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, -CONHCH(CH2OH)2, -CONHCH2CH(-OH)CH2OH, -CONH(CH2)2C(=O)NH2, -CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONHCH[C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, -COO(CH2)2-O-P(=O)(O-)-O(CH2)2-N+(CH3)3, , -OH, -O(C1-C3 알킬), -NH2, -NHC(=O)CH3, -NHS(=O)2CH3, -NHC(=O)N(CH3)2, -NHC(=O)NH(CH3), -NHC(=S)N(CH3)2, -NHC(=S)NH(CH3), -NHC(=N-CN)NH2, -NHC(=N-CN)NH(CH3), -NHC(=N-CN)N(CH3)2, -NHC[=N-S(=O)2NH2]NH2, -N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, 을 포함하는 군으로부터 선택되고, 여기서, R2, E 및 n은 상기에서 정의된 바와 같이 정의되고;
및/또는 만일 Z가 -OH 또는 -CH2OH이고 T가 -C(=O)OH이면, Z는 T와 이들 사이의 탄소 원자 3개와 함께 탄소 원자 4-5개를 함유한 사이클릭 락톤을 형성할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기에서 정의되는 리피도이드의 약제학적으로 허용가능한 염, 부가 염 및 용매화물을 망라한다.
용어 "알킬"은 알칸으로부터 수소 원자 하나의 제거에 의해 파생되는, 직선형, 분지형 또는 사이클릭 또는 사이클-함유성일 수 있는, 포화 탄화수소 쇄를 의미한다.
용어 "알케닐"은 알켄으로부터 수소 원자 하나의 제거에 의해 파생되며, 탄소-탄소 이중 결합을 하나 이상 가진, 탄화수소 쇄를 의미한다. 탄화수소 쇄는 직선형, 분지형 또는 사이클릭 또는 사이클-함유성일 수 있다.
용어 "알키닐"은 알킨으로부터 수소 원자 하나의 제거에 의해 파생되며, 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합과 선택적으로 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 가진, 탄화수소 쇄를 의미한다. 탄화수소 쇄는 직선형, 분지형 또는 사이클릭 또는 사이클-함유성일 수 있다.
용어 "알킬렌"은 직선형, 분지형 또는 사이클릭 또는 사이클-함유성일 수 있으며, 바람직하게는 직선형인, 2가 포화 탄화수소 쇄를 의미한다. 쇄는, 즉 서로 다른 탄소 원자에서 수소 원자 2개의 제거에 의해 알칸으로부터 유래하며 단일 결합 2개를 통해 연결되거나 또는 링커로서 결합되는, 2개의 원자가를 가진다.
용어 "분지형 알킬", "분지형 알케닐", "분지형 알키닐"은 탄화수소 주쇄에 결합된 분지 (탄화수소 쇄)를 1-5개 포함하는 알킬, 알케닐 또는 알키닐을 의미한다.
일반식 I의 분자가 양전하를 띨 경우, 화합물은 유기 산 또는 무기 산의 약제학적으로 허용가능한 음이온일 수 있는 반대 이온을 함유하여, 약제학적으로 허용가능한 염을 형성한다. 이러한 음이온은, 예를 들어, 아세테이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 베실레이트, 바이카보네이트, 바이타르트레이트, 브로마이드, 캄실레이트, 카보네이트, 클로라이드, 사이트레이트, 데카노에이트, 에데테이트, 에실레이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜레이트, 헥사노에이트, 아이오다이드, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 만델레이트, 메실레이트, 메탄설페이트, 납실레이트, 나이트레이트, 옥타노에이트, 올리에이트, 팔모에이트, 판토테네이트, 포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트 및 토실레이트를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
식 I의 화합물이 키랄 센터를 가질 경우, 식 I은 순수한 거울상 이성질체뿐 아니라 라세메이트 등의 거울상 이성질체들의 혼합물을 포함한다.
식 I은 유리 형태뿐 아니라 염, (산 또는 염기와의) 부가 염 및/또는 수화물 또는 알코올 용매화물 등의 용매화물 형태의 식 I의 화합물 망라한다.
일 구현예에서, X는 -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=O)NHNH-, -OC(=O)-, -O-, -NHC(=O)-, -NHNHC(=O)- 및 질소 원자 2개 이상을 함유한 5원성 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, X는 -C(=O)NH- 또는 -NHC(=O)-이다.
R1 쇄들은 전체 분자 (whole molecule)에서 동일할 수 있거나 또는 서로 상이할 수 있거나, 또는 R1 쇄들은 하나의 질소 원자에 대해서는 동일하지만 전체 분자에서는 동일하지 않다. 바람직하게는, R1 쇄들은 전체 분자에서 동일하거나, 또는 모든 질소 원자가 합성 편의성을 위해 (2개의 동일한 R1 또는 2개의 서로 다른 R1으로) 실질적으로 동일하게 치환된다. 하나 이상의 R1 치환기는 탄소수 적어도 8의 지방쇄이고, R1은 알킬 C1-C46, 알케닐 C2-C46, 알키닐 C2-C46을 포함하는 군으로부터 선택되고, 여기서 알킬, 알케닐 또는 알키닐은 직선형 또는 분지형일 수 있으며, 알킬, 알케닐 또는 알키닐에서 하나 이상의 -CH2- 기는 선택적으로 -CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -S-S-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)-, -O- 및 -S-로부터 선택되는 하나 이상의 기로 치환될 수 있으며;
여기서, 만일 알킬, 알케닐 또는 알키닐이 분지형이면, 하나 이상의 >CH- 기는 선택적으로 >C(OH)-로 치환될 수 있으며;
만일 R1이 알킬 C1-C4이면, 말단-CH3 기로부터의 수소 하나는 Z로 치환될 수 있다.
일 구현예에서, R1은 독립적으로 알킬 C1-C46 및 알케닐 C2-C46을 포함하는 군으로부터 선택되되, 알킬 또는 알케닐에서 하나 이상의 -CH2- 기는 선택적으로 -CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-로부터 선택되는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
바람직하게는, R1은 독립적으로 직선형 또는 분지형 알킬 C8-C20 및 직선형 또는 분지형 알케닐 C8-C20을 포함하는 군으로부터 선택되되, 알킬 또는 알케닐에서 하나 이상의 -CH2- 기는 선택적으로 -OC(=O)-, -C(=O)O-로부터 선택되는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다. 더 바람직하게는, R1은 -OC(=O)-, -C(=O)O-로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있는 직선형 또는 분지형 알킬 C10-C15; 및 -OC(=O)-, -C(=O)O-로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있는 직선형 또는 분지형 알케닐 C12-C18을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 알케닐 쇄는 탄소-탄소 이중 결합을 1-5개 포함한다.
일 구현예에서, 분자에서 모든 R1들이 동일하다.
일 구현예에서, R1 기를 가진 분자에서 각 질소 원자는 2개의 동일한 R1에 의해 동일하게 치환된다 (그러나, 동일한 리피도이드 구조에서 서로 다른 질소 원자에 결합된 R1은 동일하지 않을 수 있음).
일 구현예에서, 2개의 동일한 R1가 하나의 질소 원자에 결합된다.
리피도이드 구조에서 하나 이상의 R1은 분자의 지질-유사 특성을 가능하게 하기 위해 적어도 8개의 탄소 원자, 바람직하게는 적어도 10개의 탄소 원자, 더 바람직하게는 적어도 12개의 탄소 원자를 가져야 한다. 바람직하게는, 리피도이드 구조에서 2개의 R1은 적어도 8개의 탄소 원자, 바람직하게는 적어도 10개의 탄소 원자, 더 바람직하게는 적어도 12개의 탄소 원자를 가진다.
일 구현예에서, 하나의 치환기 T는 -X-Y-N(R1)2이다.
다른 구현예에서, 치환기 T 둘다 -X-Y-N(R1)2이다.
후자의 경우, 수득되는 리피도이드 분자는 일반식 II를 가진다.
상기 식에서, X, Y, Z 및 R1은 상기에 정의된 바와 동일하게 정의된다.
일반식 II의 구조는 바람직하게는 하기 치환기를 가진다:
X는 -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=S)O-, -C(=O)S-, -C(=S)S-, -C(=O)NHNH-, -CH2-, -O-, -OC(=O)-, -S-, -SC(=O)-, -NH-, -NHNH-, -NHC(=O)-, -NHNHC(=O)-, -C≡C-, -CH=CH-, 질소 원자 2개 이상을 함유한 5원성 헤테로사이클, -CH2C(=O)NH-, -CH2C(=O)O-, -CH2C(=S)O-, -CH2C(=S)S-, -CH2C(=O)NHNH-, -N=CH-, -CH=N-을 포함하는 군으로부터 선택되고;
Y는 알킬렌 쇄 C2-C10이고, 여기서 하나 이상의 -CH2- 기는 하나 이상의 O 및/또는 S 원자로 선택적으로 치환될 수 있으며;
Z는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각의 Z는 수소 원자, -OH, -CH3, -CH2OH, -NH2, -C(=O)NH2, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, -CONHCH(CH2OH)2, -CONHCH2CH(-OH)CH2OH, -CONH(CH2)2C(=O)NH2, -CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONHCH[C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, , 로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
R1은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각의 R1은 알킬 C8-C20, 알케닐 C8-C20, 알키닐 C8-C20로 이루어진 군으로부터 선택되되, 알킬, 알케닐 또는 알키닐에서 하나 이상의 -CH2- 기는 선택적으로 -CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -S-S-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)-, -O-, -S-로부터 선택되는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
링커 X는 분자의 아민 모이어티를 중심 사이클로헥산 코어에 부착하는 반응을 통해 형성된다. 따라서, 이는 선택 반응, 예를 들어, 클릭 반응 (예, 아지도-알킨 고리 부가) 등을 통한, 에스테르 형성, 아미드 형성 및 이의 유사 형태 형성에 따라 서로 다른 링커일 수 있다.
따라서, X는 -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=S)O-, -C(=O)S-, -C(=S)S-, -C(=O)NHNH-, -CH2-, -O-, -OC(=O)-, -S-, -SC(=O)-, -NH-, -NHNH-, -NHC(=O)-, -NHNHC(=O)-, -C≡C-, -CH=CH-, 질소 원자 2개 이상을 함유한 5원성 헤테로사이클, -CH2C(=O)NH-, -CH2C(=O)O-, -CH2C(=S)O-, -CH2C(=S)S-, -CH2C(=O)NHNH-, -N=CH-, -CH=N-, -NH-N=CH- 및 -CH=N-NH-를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, X는 -C(=O)NH-, -NHC(=O)-, 질소 원자 2개 이상을 함유한 5원성 헤테로사이클, -OC(=O)- 및 -C(=O)O-로부터 선택된다.
링커 Y는 링커 X의 아민과 사이클로헥산 코어 사이에 적어도 최소 거리를 제공하는 알킬렌 쇄이다. Y는 C2-C10 알킬렌 쇄이고, 바람직하게는 C2-C8 알킬렌 쇄이며, 여기서 하나 이상의 -CH2- 기는 하나 이상의 O 및/또는 S 원자로 선택적으로 치환될 수 있다.
치환기 Z는 식 I 및 II의 화합물의 특성을 추가로 수정할 수 있다.
일 구현예에서, Z는 수소, -OH, -CH3, -CH2OH, -NH2, -C(=O)NH2, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, -CONHCH(CH2OH)2, -CONHCH2CH(-OH)CH2OH, -CONH(CH2)2C(=O)NH2, -CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONHCH[C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R2, E 및 n은 상기에 정의된 바와 동일하게 정의된다. 바람직하게는, Z는 H, -CH3, -CH2OH이거나, 또는 Z가 -OH 또는 -CH2OH이고 T가 -C(=O)OH이면 Z는 T 및 이들 사이의 탄소 원자 3개와 함께 탄소수 4-5의 사이클릭 락톤을 형성할 수 있다.
치환기 T는 식 I 및 II의 화합물의 특성을 추가로 수정할 수 있다. 일 구현예에서, T는 -X-Y-N(R1)2, -C(=O)O(C1-C3 알킬), -C(=O)OCH2CH2OH, -C(=O)NH2, , -C(=O)OH, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, -CONHCH(CH2OH)2, -CONHCH2CH(-OH)CH2OH, -CONH(CH2)2C(=O)NH2, -CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONHCH[C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, -COO(CH2)2-O-P(=O)(O-)-O(CH2)2-N+(CH3)3, 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 R2, E 및 n은 상기에 정의된 바와 동일하게 정의된다. 더 바람직하게는, T는 -X-Y-N(R1)2, -C(=O)O(C1-C3 알킬), , -C(=O)OH로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, T는 -X-Y-N(R1)2, -C(=O)OCH3, , -C(=O)OH로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 특정 구현예에서, 식 I의 리피도이드는 수소, -OH, -CH3, -CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되는 Z; 및 -X-Y-N(R1)2, -C(=O)O(C1-C3 알킬), , -C(=O)OH로 이루어진 군으로부터 선택되는 T를 가지거나; 및/또는 만일 Z가 -OH 또는 -CH2OH이고 T가 -C(=O)OH이면, Z는 T 및 이들 사이에 존재하는 탄소 원자 3개와 함께 탄소수 4-5의 사이클릭 락톤을 형성할 수 있다. 바람직하게는, 식 I의 리피도이드는 하기 치환기를 가진다:
X는 -C(=O)NH- 또는 -NHC(=O)-이고;
Y는 -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5- 및 -(CH2)6-로부터 선택되고;
R1은 -OC(=O)-, -C(=O)O-로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있는 직선형 또는 분지형 알킬 C10-C15; 및 -OC(=O)-, -C(=O)O-로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있는 직선형 또는 분지형 알케닐 C12-C18를 포함하는 군으로부터 선택되고;
T는 -X-Y-N(R1)2, -C(=O)OCH3, 및 -C(=O)OH로부터 선택되고;
Z는 H, -CH3 및 -CH2OH로부터 선택된다.
구체적으로, 하기 리피도이드가 바람직하다:
cis,cis-N 1,N 3,N 5-트리스(6-(다이도데실아미노)헥실)사이클로헥산-1,3,5-트리카르복사미드 (3);
cis,cis-N 1,N 3,N 5-트리스(6-(다이((헥실옥시카르보닐)부틸)아미노)헥실)사이클로헥산-1,3,5-트리카르복사미드 (7);
cis,cis-N 1,N 3,N 5-트리스(6-(다이도데실아미노)헥실)-1,3,5-트리메틸사이클로헥산-1,3,5-트리카르복사미드 (8);
cis,cis-N 1,N 3,N 5-트리스(3-(다이도데실아미노)프로필)-1,3,5-트리메틸사이클로헥산-1,3,5-트리카르복사미드 (11);
cis,cis-N 1,N 3,N 5-트리스(6-(다이((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일)아미노)헥실)-1,3,5-트리메틸사이클로헥산-1,3,5-트리카르복사미드 (15);
헥사(옥탄-2-일) cis,cis-6,6',6'',6''',6'''',6'''''-((((사이클로헥산-1,3,5-트리카르보닐)트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일))트리스(아잔트리틸))헥사헥사노에이트 (19);
헥사키스(3-메틸헥실) cis,cis-7,7',7'',7''',7'''',7'''''-((((사이클로헥산-1,3,5-트리카르보닐)트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일))트리스(아잔트리틸))헥사헵타노에이트 (23);
헥사키스((E)-3,7-다이메틸옥타-2,6-다이엔-1-일) cis,cis-5,5',5'',5''',5'''',5'''''-((((사이클로헥산-1,3,5-트리카르보닐)트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일))트리스(아잔트리틸))헥사펜타노에이트 (27);
헥사키스((Z)-3,7-다이메틸옥타-2,6-다이엔-1-일) cis,cis-5,5',5'',5''',5'''',5'''''-((((사이클로헥산-1,3,5-트리카르보닐)트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일))트리스(아잔트리틸))헥사펜타노에이트 (31);
테트라(옥탄-2-일) cis,cis-6,6',6'',6'''-((((5-(메톡시카르보닐)사이클로헥산-1,3-다이카르보닐)비스(아잔다이일))비스(헥산-6,1-다이일))비스(아잔트리틸))테트라헥사노에이트 (32);
테트라키스(3-메틸헥실) cis,cis-7,7',7'',7'''-((((5-(메톡시카르보닐)사이클로헥산-1,3-다이카르보닐)비스(아잔다이일))비스(헥산-6,1-다이일))비스(아잔트리틸))테트라헵타노에이트 (33);
cis,cis-3,5-비스((6-(비스(6-(옥탄-2-일옥시)-6-옥소헥실)아미노)헥실)카바모일)사이클로헥산-1-카르복시산 (35);
테트라(옥탄-2-일) cis,cis-6,6',6'',6'''-((((5-(피롤리딘-1-카르보닐)사이클로헥산-1,3-다이카르보닐)비스(아잔다이일))비스(헥산-6,1-다이일))비스(아잔트리틸))테트라헥사노에이트 (36);
헥사키스(3-메틸헥실) cis,cis-7,7',7'',7''',7'''',7'''''-((((1,3,5-트리메틸사이클로헥산-1,3,5-트리카르보닐)트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일))트리스(아잔트리틸))헥사헵타노에이트 (40);
cis,cis-6,6',6'',6''',6'''',6'''''-((((1,3,5-트리메틸사이클로헥산-1,3,5-트리카르보닐)트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일))트리스(아잔트리틸))헥사헥사노에이트 (41);
cis,cis-3,5-비스((6-(비스(6-(옥탄-2-일옥시)-6-옥소헥실)아미노)헥실)카바모일)-1,3,5-트리메틸사이클로헥산-1-카르복시산 (42);
테트라(옥탄-2-일) cis,cis-6,6',6'',6'''-((((1,3,5-트리스((벤질옥시)메틸)-5-(비스(6-(옥탄-2-일옥시)-6-옥소헥실)카바모일)사이클로헥산-1,3-다이카르보닐)비스(아잔다이일))비스(헥산-6,1-다이일))비스(아잔트리틸))테트라헥사노에이트 (45);
cis,cis-1,3,5-트리스((벤질옥시)메틸)-3,5-비스((6-(비스(6-(옥탄-2-일옥시)-6-옥소헥실)아미노)헥실)카바모일)사이클로헥산-1-카르복시산 (46);
헥사(옥탄-2-일) cis,cis-6,6',6'',6''',6'''',6'''''-((((1,3,5-트리스(하이드록시메틸)사이클로헥산-1,3,5-트리카르보닐)트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일))트리스(아잔트리틸))헥사헥사노에이트 (47);
cis,cis-3,5-비스((6-(비스(6-(옥탄-2-일옥시)-6-옥소헥실)아미노)헥실)카바모일)-1,3,5-트리스(하이드록시메틸)사이클로헥산-1-카르복시산 (48);
테트라(옥탄-2-일) cis,cis-6,6',6'',6'''-((((1,3,5-트리스((벤질옥시)메틸)-5-(피롤리딘-1-카르보닐)사이클로헥산-1,3-다이카르보닐)비스(아잔다이일))비스(헥산-6,1-다이일))비스(아잔트리틸))테트라헥사노에이트 (49);
테트라(옥탄-2-일) cis,cis-6,6',6'',6'''-((((1,3,5-트리스(하이드록시메틸)-5-(피롤리딘-1-카르보닐)사이클로헥산-1,3-다이카르보닐)비스(아잔다이일))비스(헥산-6,1-다이일))비스(아잔트리틸))테트라헥사노에이트 (50);
cis,cis-N 1,N 7-비스(6-(다이도데실아미노)헥실)-5,7-비스(하이드록시메틸)-4-옥소-3-옥사바이사이클로[3.3.1]노난-1,7-다이카르복사미드 (52);
cis,cis-N,N',N''-(사이클로헥산-1,3,5-트리일)트리스(6-(다이도데실아미노)헥산아미드) (56).
식 I 및 II의 화합물은 1, 3 및 5번 위치에서 기 Z로 치환된 사이클로헥산 전구체 및 1번; 1번 및 3번; 또는 1번, 3번 및 5번 위치에 링커 X를 가진 전구체를, 일반식 X´-Y-N(R1)2의 터셔리 아민과 상응하는 반응에 반응시켜, 제조되며, 여기서 X´은 링커 X의 전구체 기이다. 바람직하게는, X´은 -NH2 또는 활성화된 카르복시 기이다. 일반식 X´-Y-N(R1)2의 터셔리 아민은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 반응 및 절차에 의해 제조할 수 있으며, 일부 적절한 아민은 상업적으로도 입수가능하다.
일 구현예에서, 식 I의 화합물은 바람직하게는 A가 H, 할로겐 또는 벤질인 식 III의 화합물을, 식 IV의 다이아민 및 선택적으로, MeOH, BnOH로부터 선택되는 알코올의 존재 하에, 선택적으로 피롤리딘, 축합제 및/또는 염기의 존재 하에 반응시켜 제조되며, 선택적으로는 수소 첨가 분해가 후속적으로 또는 선행적으로 이루어진다:
식 III 및 IV에서, R1, Y 및 Z는 식 I에 대해 전술한 바와 같이 정의된다.
보다 구체적인 예에서, 식 II의 화합물은 바람직하게는 A가 수소인 식 III의 화합물을 식 IV의 다이아민과 축합제 및 염기의 존재 하에 반응시켜 제조되거나, 또는 A가 할로겐인 식 III의 화합물을 식 IV의 다이아민과 염기의 존재 하에 반응시켜 제조된다. 식 III 및 IV에서, R1, Y 및 Z는 식 II에 대해 전술한 바와 같이 정의된다.
본 발명의 다른 과제는 일반식 I 또는 II의 하나 이상의 리피도이드 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하는 형질감염제 (transfection agent)이다. 형질감염제는 구성성분들을 용해 및 혼합함으로써 용액 형태로 제조될 수 있거나, 또는 통례적인 나노입자 기술에 적용되는 기술을 이용함으로써, 예를 들어 미세유체 혼합에 의해 입자 형태로 제조될 수 있다. 입자는 일반적으로 1 내지 500 nm 범위 크기의 나노 입자를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 나노입자 크기는 30 내지 250 nm 범위, 심지어 더 바람직하게는 40 내지 150 nm 범위이다.
일 구현예에서, 형질감염제는 일반식 I의 하나 이상의 리피도이드를 10 내지 50 mol.%의 함량으로, 그리고 하나 이상의 헬퍼 지질을 50 내지 90 mol.%의 함량으로 포함한다. 바람직하게는, 형질감염제는 일반식 I의 하나 이상의 리피도이드를 15 내지 40 mol.% 함량으로, 하나 이상의 헬퍼 지질을 60 내지 85 mol.% 함량으로 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 형질감염제는 일반식 I의 하나 이상의 리피도이드를 15 내지 40 mol.% 함량으로, 콜레스테롤을 30 내지 55 mol.% 함량으로, 그리고 하나 이상의 기타 헬퍼 지질을 20 내지 50 mol.% 함량으로 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 형질감염제는 일반식 I의 하나 이상의 리피도이드를 15 내지 40 mol.% 함량으로, 콜레스테롤을 30 내지 55 mol.% 함량으로, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 20 내지 45 mol.% 함량으로, 그리고 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000을 0.5 내지 5 mol.% 함량으로 포함한다.
또한, 본 발명은 식 I의 하나 이상의 리피도이드, 하나 이상의 핵산 및/또는 이의 일부 및/또는 핵산 유도체를 포함하고, 바람직하게는 하나 이상의 헬퍼 지질을 또한 포함하는 형질감염 입자 (transfection particle)에 관한 것이다. 형질감염 입자는, 예를 들어, 선택적으로 헬퍼 지질을 함유한 일반식 I의 리피도이드의 용액을 핵산 및/또는 이의 일부 및/또는 핵산 유도체의 용액과 혼합함으로써, 제조될 수 있다. 혼합은 통례적인 나노입자 기술에 적용되는 기법을 이용해, 예를 들어 미세유체 혼합에 의해 수행될 수 있다.
형질감염 입자에서 핵산 및/또는 이의 일부 및/또는 핵산 유도체의 총량 : 일반식 I의 리피도이드 및 헬퍼 지질의 총량의 중량비는, 1:2 내지 1:500, 더 바람직하게는 1:5 내지 1:100의 범위이다. 구체적으로, 예시적으로, 후술한 실시예에서 제조되는 입자의 경우, 그 비율은 mRNA의 경우 약 1:9이고, siRNA의 경우 약 1:68이다.
형질감염 입자는 통상적으로 나노입자이며, 이는 일반적으로 1 내지 500 nm 범위의 크기를 가진 입자를 의미하는 것으로 이해된다. 전형적으로, 형질감염 나노입자의 크기는 50 내지 250 nm, 더 바람직하게는 40 내지 150 nm 범위이다.
형질감염 입자의 구조는 극저온 투과전자현미경에 의해 관찰한 바, 형질감염 입자는 핵산이 내부에 함유된 압축된 층상 지질 나노입자인 것으로 확인되었다.
형질감염 시약 및 형질감염 입자에서 헬퍼 지질은 주로 중성 지질, 스테롤 또는 지질과 친수성 폴리머의 지질 접합체이다.
중성 지질은 생리학적 조건에서 순 전하가 0이며, 이는 비-하전된 형태이거나 또는 전기중립의 양쪽성 형태로 존재할 수 있다. 중성 지질은 예를 들어 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC) 및 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(시아닌 5)로부터 선택될 수 있다.
스테롤은 예를 들어 콜레스테롤, β-시토스테롤, 스티그마스타놀, 캄페스테롤, 푸코스테롤, 아베나스테롤, 페코스테롤, 브라시카스테롤, 에르고스테롤 및 9,11-데하이드로에르고스테롤로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 스테롤은 콜레스테롤이다.
친수성 폴리머와의 지질 접합체는 지질 부분과 폴리머 부분, 예를 들어 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리(2-메틸-2-옥사졸린), 폴리(글리세롤), 폴리(사코신)을 포함한다. 바람직하게는, 폴리머 부분은 500 내지 약 10,000 Da, 더 바람직하게는 약 1,000 내지 약 5,000 Da 범위일 수 있는 분자량의 폴리(에틸렌글리콜)로 구성된다. 친수성 폴리머와의 지질 접합체는 예를 들어 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시 폴리(에틸렌글리콜)-2000, 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리(에틸렌글리콜)-2000, 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 폴리(에틸렌글리콜)-2000, 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 폴리(에틸렌글리콜)-2000 및 유사한 접합체로부터 선택될 수 있다. 친수성 폴리머와의 지질 접합체는 바람직하게는 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시 폴리(에틸렌글리콜)-2000일 수 있다.
핵산 또는 이의 일부는 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 데옥시뉴클레오티드를 함유한다. 핵산 또는 이의 일부는 치료학적, 진단학적 또는 예방학적 물질일 수 있거나, 또는 이것이 형질감염되는 세포 또는 조직에 대해 표지를 제공할 수 있다. 따라서, 식 I의 화합물은 주로 치료학적 또는 생물공학적 용도를 가진다.
용어 "핵산 또는 이의 일부"는 하나 이상의 타입의 핵산, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 (뉴클레오티드 1-100개, 예를 들어, 앱타머), 사이클릭 다이뉴클레오티드 (예, 2',3'-cGAMP), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 데옥시리보핵산 (단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, cDNA, 유전자 또는 유전자들을 코딩하는 플라스미드 DNA), 리보핵산, 전형적으로 메신저 RNA (mRNA), tRNA (transfer RNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA, micro-RNA (miRNA), piwi-RNA (piRNA), 안티센스 RNA (asRNA), CRISPR 시스템을 위한 가이드 RNA (gRNA) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 타입의 핵산을 의미하는 것으로 이해된다 (전형적으로, 예를 들어, CRISPR, CRISPRi 및 기타 변형 및 숙주 세포 또는 조직 트랜스크립톰의 변형 또는 숙주 세포 또는 조직 게놈의 후속적인 변형에 이용하기 적합한, Cas9 뉴클레아제, Cas13a/C2c2 및 Cas13b, 또는 유사한 뉴클레아제를 코딩하는 gRNA 및 mRNA). 아울러, 본원에 개시된 모든 핵산 (NA)은, 예를 들어 생물학적 시스템에서 안정성을 높이기 위해, 합성 기반의 유사체를 이용해 형성되거나 또는 변형될 수 있다. 합성 NA 유사체는 특히 다음과 같은 치환기를 수반한다: 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시-에틸, 2'-플루오로, 펜토스 고리의 2'-산소와 4'-탄소 간의 메틸렌 브릿지 (소위 잠긴 핵산), 가닥의 5' 및/또는 3' 말단에서 인산화, 보라노포스포네이트, 또는 포스포로티오에이트.
본 발명은 추가적으로 시험관내에서 핵산 및/또는 이의 일부 및/또는 핵산 유도체로 세포 또는 조직을 형질감염하기 위한 식 I의 리피도이드 또는 형질감염제 또는 형질감염 입자의 용도를 포함한다. 아울러, 본 발명은 생체내 핵산 및/또는 이의 일부 및/또는 핵산 유도체로 세포 또는 조직을 형질감염하는데 이용하기 위한 식 I의 리피도이드 또는 형질감염 입자를 포함한다 (상업적인 또는 시판 용도의 인간 배아에 대한 형질감염 제외, 인간 배아 계열에 대한 변형 제외).
식 I의 리피도이드를 함유한 형질감염 입자는, 활성 핵산을 전달하여 염색체 유전자 또는 유전자들의 침묵화 또는 활성화, 게놈 편집 (유전자 삭제 (gene excision), 유전자 삽입 또는 돌연변이 도입) 또는 트랜스크립톰 편집을 달성하거나, 또는 소위 "인 트랜스"로 지칭되는 형질감염 입자를 이용해 삽입된 핵산에 의해 코딩된 주어진 단백질의 발현을 달성하기 위해, 기초 연구, 특히 세포 배양 또는 동물의 형질감염에 대한 기초 연구에 수많은 생물학적 용도로 이용가능하다.
수의학 및 인간 의학에서, 일반식 I의 리피도이드를 함유한 형질감염 입자는 바람직하게는 치료학적 또는 예방학적 목적으로 이용될 수 있다. 치료학적 핵산을 함유한 입자는 동물 또는 인간에 투여해, 염색체 유전자(들)를 침묵화하거나 또는 활성화하거나, 면역원을 침묵화 또는 활성화하거나, 신호전달 경로를 저해 또는 활성화하거나, 게놈을 편집하거나 (유전자 삭제, 유전자 삽입 또는 돌연변이 도입) 또는 트랜스크립톰을 편집하거나, 또는 핵산에 의해 코딩된 단백질(들)의 발현을 구현할 수 있다.
또한, 본 발명은 의약제로서 이용하기 위한, 구체적으로 유전자 요법을 위한 식 I의 리피도이드 또는 형질감염제 또는 형질감염 입자를 제공한다. 특히, 이는 악성 및/또는 유전자 장애를 치료하는데 이용하기 적합하다.
또한, 본 발명에 따른 일반식 (I)의 리피도이드 또는 형질감염제 또는 형질감염 입자는 예방 백신으로 이용하기에, 바람직하게는 감염성 질환을 예방하는데 적합하다.
식 I의 리피도이드 또는 형질감염 입자는 약제학적으로 허용가능한 부형제와의 조제물 형태로 치료학적, 미용학적 또는 생물공학적 사용을 위해 제형화 될 수 있다. 제형은 액체 또는 고체 형태일 수 있다. 액체 형태로는 예를 들어 주사 또는 경구 투여용으로 조정된 용액, 현탁액, 분산액, 겔, 연고제를 포함한다. 고체 형태로는, 예를 들어, 캡슐제, 정제, 코팅 정제, 산제, 좌제 및 기타 형태를 포함한다.
액체 제형은 불활성 기체에 의해 분무화될 수 있다. 분무화된 현탁제는 직접 흡입되거나, 또는 분무 장치로부터 흡입될 수 있으며, 또는 분무 장치가 안면 마스크 또는 호흡기에 부착될 수 있다. 고체 형태는 건조-분말 흡입기를 이용해 투여될 수 있다. 현탁제 또는 건조 분말 제형은 적절한 기구로부터 구강을 통해 또는 코를 통해 투여될 수 있다.
피부 또는 점막에 적용하는 경우, 조제물은 또한 크림, 젤, 연고, 페이스트, 밤, 액체 및 기타 형태로 제조될 수 있으며, 작용 부위에 직접 적용될 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 부형제로는 용매, 용해성 조절제, pH-조정제, 담체, 충전제, 결합제, 활택제, 붕해제, 보존제, 흡착제, 점성 조절제, 제형의 맛, 냄새 및 색상 등의 감각 기능에 영향을 미치는 물질을 포함한다.
아울러, 식 I의 리피도이드 또는 형질감염제 또는 형질감염 입자는 바람직하게는 활성 물질을 작용 부위에 전달하기 위해 미용 산업계의 목적으로 이용될 수 있다. 활성 물질을 가진 형질감염 입자는 크림, 겔, 연고, 페이스트, 밤, 액체 또는 기타 형태로 제조될 수 있으며, 메이크업, 미용 헤어 제품 또는 개인 위생 제품으로 이용될 수 있다.
도 1. 리피도이드 3 및 7의 합성 계획.
도 2. 리피도이드 8 및 11의 합성 계획.
도 3. 리피도이드 15의 합성 계획.
도 4. 리피도이드 19 및 23의 합성 계획.
도 5. 리피도이드 27 및 31의 합성 계획.
도 6. 리피도이드 32, 33, 35 및 36의 합성 계획.
도 7. 전구체 39 및 44 및 리피도이드 40-42의 합성 계획.
도 8. 리피도이드 47, 48, 50 및 52의 합성 계획.
도 9. 리피도이드 56의 합성 계획.
도 10. 조직학적으로 분석한 기준 (benchmark) LNP (B45) 대비, 뮤라인 간에서 mRNA-LNP (B40)의 기능적인 전달.
도 11. 게놈 DNA의 PCR 증폭에 의해 분석한 기준 LNP (B45) 대비 뮤라인 간에서 mRNA-LNP (B40)의 기능적인 전달. 표시된 1-4번 레인은 B40에 대한 것이다. 표시된 5-8번 레인은 B45에 대한 것이다.
실시예
약어 목록:
eq. 당량
R f 체류 인자
TLC 박막 크로마토그래피
RVE 회전식 진공 증발기
rt에서 실온
v/v 부피/부피
br s 넓은 신호
s 싱글렛
d 더블렛
t 트리플렛
m 멀티플렛
dd 이중 더블렛
J 상호작용 상수
δ 화학적 쉬프트
HRMS 고-해상 질량 분광 측정
EI 전자 이온화
ESI 전자분무 이온화
MALDI 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화
GC-MS 기체 크로마토그래피 - 질량 분광 측정
IR 적외선 분광법
NMR 핵 자기 공명
CE5 95:5 (v/v) 사이클로헥산-에틸아세테이트 혼합물
CE20 80:20 (v/v) 사이클로헥산-에틸아세테이트 혼합물
CE50 50:50 (v/v) 사이클로헥산-에틸아세테이트 혼합물
D1 75:22:3 (v/v/v) 다이클로로메탄-메탄올-25% 수성 NH3 혼합물
D2 175:22:3 (v/v/v) 다이클로로메탄-메탄올-25% 수성 NH3 혼합물
D3 275:22:3 (v/v/v) 다이클로로메탄-메탄올-25% 수성 NH3 혼합물
D4 375:22:3 (v/v/v) 다이클로로메탄-메탄올-25% 수성 NH3 혼합물
TFA 트리플루오로아세트산
DIPEA N,N- 다이이소프로필에틸아민
DMF N,N- 다이메틸포름아미드
DCM 다이클로로메탄
ACN 아세토니트릴
DIC 다이이소프로필카르보디이미드
DMAP 4-다이메틸아미노피리딘
PyBroP 브로모트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트
TCE 1,1,2,2-테트라클로로에탄
LNP 지질 나노입자
NA 핵산
DNA 데옥시리보핵산
RNA 리보핵산
mRNA 메신저 RNA
siRNA 소형 간섭 RNA
tRNA 전달 RNA
miRNA micro RNA
ssDNA/RNA 단일 가닥 DNA/RNA
dsDNA/RNA 이중 가닥 DNA/RNA
DMG-PEG2000 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000
DOPE 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민
DOPC 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린
DSPC 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린
DOPE-Cy5 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(시아닌 5)
Lip2000 리포펙타민® 2000 (Invitrogen)
h hour
실시예 1
N 1 , N 1 - 다이도데실에탄 -1,6- 다이아민 2
칼슘 클로라이드 건조관 및 자기 교반기가 장착된 500 ㎖ 둥근 바닥형 플라스크에 DCM (100 ㎖) 중의 N 1-terc-부틸옥시카르보닐-1,6-다이아미노헥산 (5.0 g, 23.11 mmol) 용액을 넣고, 얼음조에서 0℃로 냉각하였다. 강하게 교반하면서, n-도데실알데하이드 (15.38 ㎖, 69.34 mmol, 3 eq.)를 첨가한 다음 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 (14.70 g, 69.34 mmol, 3 eq.)를 10분간 3번에 나누어 투입하였다. 냉각조를 제거하고, 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응의 진행을 암모니아 (닌하이드린으로 검출)로 사전-포화된 TLC 플레이트에서 80:20 (v/v) 헥산-에틸아세테이트 이동상을 적용해 TLC에 의해 모니터링하였다. 반응 완료 후, NaOH 수용액 (1 M, 200 ㎖)을 첨가하여, 반응 혼합물을 15분간 교반한 다음 분별 깔때기로 부어 물 (300 ㎖)로 희석하였다. 생산물을 DCM (300 ㎖, 2x50 ㎖)으로 추출하고, 조합한 유기상을 브린 (50 ㎖)으로 헹군 후 무수 소듐 설페이트 상에서 건조하였으며, 이를 S2 프릿을 통해 여과한 다음 RVE에서 용매를 증발시켰다. 어두운 오일 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 헥산 (10-30%) 중의 에틸 아세테이트의 직선형 농도 구배를 적용해 정제하였다. 아민 1 (3.67 g, 28.7%)을 노란색이 도는 오일로 수득하였다.
트리플루오로아세트산 (10 ㎖)을 DCM (10 ㎖) 중의 화합물 1 용액에 첨가하고 얼음조에서 교반하면서 0℃로 냉각한 다음 반응 혼합물을 3시간 동안 0℃에서 두었다. 그런 후, 용액을 1 ℓ분액 플라스크 (separatory flask)에 부어 20% Na2CO3 수용액 (300 ㎖)으로 희석하였으며, 생산물을 DCM (250 ㎖, 2 x 50 ㎖)으로 추출하였다. 조합한 유기상을 브린 (100 ㎖)으로 헹구고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조한 다음 S2 프릿을 통해 여과한 후 RVE에서 용매를 증발시켰다. 조산물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 DCM 중의 선형적인 D1 농도 구배 (0-70%)를 적용해 정제하였다. 다이아민 2 (2.17 g, 72.2% 수율; 암모니아로 미리 포화 처리된 TLC 플레이트에서 이동상 D2 중에 R f 0.31, 닌하이드린으로 검출)가 노란색이 도는 오일 형태로 수득되었다.
1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 2.73, 2.65, 2.57, 1.56, 1.52, 1.51, 1.36, 1.31, 1.28, 1.25-1.29, 1.24, 0.87 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 53.51, 53.20, 41.62, 32.40, 31.89, 29.63, 29.61, 29.57, 29.44, 29.32, 27.39, 27.09, 26.53, 25.65, 25.02, 22.66, 14.10 ppm. IR (film): υmax/cm-1 = 3374 w 및 3294 w (υ NH2), 2797 m (υs N-CH 2), 2956 s (υas CH3), 2924 vs (υas CH2), 2853 s (υs CH2), 1467 m 및 1455 m, sh (βs CH2 및 δas CH3), 1378 w 및 1367 w (δs CH3), 721 m (βas CH2). HRMS (ESI): C30H65N2에 대한 m/z 계산치 [M + H]+ 453.51423; 실측치 453.51340.
cis , cis - N 1 , N 3 , N 5 -트리스(6-(다이도데실아미노)헥실)사이클로헥산-1,3,5-트리카르복사미드 3
DMF (2 ㎕) 및 티오닐클로라이드 (300 ㎕)를 cis,cis-1,3,5-사이클로헥산트리카르복시산 (17 ㎎, 0.079 mmol)에 첨가하여, 현탁물을 70℃에서 30분간 밀폐된 바이얼에서 교반하였으며, 반응 혼합물이 점차적으로 균질한 무색 용액으로 맑아졌다. 과량의 SOCl2를 드라이 질소 스트림을 이용해 70℃에서 발산 (blown off)시키고, 잔류물을 진공 하에 (10분) 건조한 다음 rt로 냉각하였다. DCM (1.5 ㎖) 및 DMF (0.5 ㎖) 혼합물 중의 N 1,N 1-다이도데실헥산-1,6-다이아민 2 (142 ㎎, 0.315 mmol, 4 eq.) 및 DIPEA (137 ㎕, 0.786 mmol, 10 eq.) 용액을 시린지를 이용해 셉텀을 통해 첨가한 다음 반응 혼합물을 10분간 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 크로마토그래피 실리카 겔 (10 g)에 흡착시키고, RVE에서 용매를 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (40 g)에 의해 DCM 중의 선형적인 D1 농도 구배 (0-55%)를 적용해 정제하였다. 리피도이드 3 (81 ㎎, 67.7% 수율; R f 0.36/이동상 D2, 닌하이드린으로 검출)가 노란색이 도는 반고체 형태로 수득되었다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 7.80, 3.20, 3.02-2.96, 2.60, 2.07, 1.81-1.74, 1.37, 1.325, 1.28-1.23, 0.87 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 175.90, 52.85, 52.22, 42.83, 39.42, 31.87, 31.66, 29.58, 29.48, 29.43, 29.30, 29.08, 26.84, 26.18, 26.00, 23.50, 23.16, 22.65, 14.09 ppm. IR (CCl4): υmax/cm-1 = 3293 m (υ NH), 1640 s (아미드 I) 및 1550 m (아미드 II), 2964 s, sh (υas CH3), 2871 m, sh (υs CH3), 2927 vs (υas CH2), 2856 s, sh (υs CH2), 1468 m 및 1460 m, 1445 w (βs CH2 및 δas CH3), 1378 w (δs CH3), 721 w (βas CH2 및 δas CH2); HRMS (MALDI): C99H199N6O3에 대한 m/z 계산치 [M + H]+ 1520.5598; 실측치 1520.5598.
실시예 2
N 1 , N 1 - 다이((헥실옥시카르보닐)부틸)헥산 -1,6- 다이아민 6
1-헥사놀 (2.48 ㎖, 19.89 mmol, 1.2 eq), DMAP (61 ㎎, 0.50 mmol, 0.03 eq.) 및 DIC (3.37 ㎖, 21.54 mmol, 1.3 eq.)를 DCM (60 ㎖) 중의 5-브로모펜탄산 (3.00 g, 16.57 mmol) 용액에 첨가하여, 반응 혼합물을 1시간 동안 rt에서 교반하였다. 그런 후, 반응 혼합물을 크로마토그래피 실리카 겔 (16 g)에 흡착시키고, RVE에서 용매를 제거한 다음 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (80 g)에서 사이클로헥산 중의 선형적인 에틸 아세테이트 농도 구배 (0-10%)를 적용해 정제하였다. 헥실 5-브로모펜타노에이트 4 (3.938 g, 89.6% 수율; R f 0.31/이동상 CE5, 검출 KMnO4)가 무색 액체로 수득되었다.
헥실 5-브로모펜타노에이트 4 (1.53 g, 5.78 mmol, 2.5 eq.) 및 무수 K2CO3 (3.19 g, 23.11 mmol, 10 eq.)을 무수 ACN (10 ㎖) 중의 N 1-tert-부틸옥시카르보닐-1,6-다이아미노헥산 (0.50 g, 2.31 mmol) 용액에 첨가하여, 반응 혼합물을 35℃에서 2일간 왕성하게 교반하였다. 그런 후, 반응 혼합물을 크로마토그래피 실리카 겔 (16 g)에 흡착시키고, RVE에서 용매를 제거한 다음 및 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (40 g)에서 사이클로헥산 중의 선형적인 에틸 아세테이트 농도 구배 (0-100%)를 적용해 정제하였다. 아민 5 (1.080 g, 79.9% 수율; 암모니아로 미리 포화 처리된 TLC 플레이트에서, R f 0.31/이동상 CE50, 닌하이드린으로 검출)가 약간 노란색이 도는 오일 형태로 수득되었다.
얼음조에서 교반하면서 0℃로 냉각시킨 DCM (4 ㎖) 중의 화합물 5 용액에 트리플루오로아세트산 (4 ㎖)을 첨가한 다음, 반응 혼합물을 1시간 동안 0℃에 두었다. 그런 후, 용액을 500 ㎖ 분액 플라스크에 부어 20% NaHCO3 수용액 (200 ㎖)으로 희석한 다음 생산물을 DCM (150 ㎖, 2 x 50 ㎖)으로 추출하였다. 조합한 유기상을 브린 (50 ㎖)으로 헹구고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조한 다음 S2 프릿을 통해 여과한 후, 크로마토그래피 실리카 겔 (16 g)에 흡착시키고, RVE에서 용매를 제거하였으며, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (40 g)에 의해 DCM 중의 선형적인 D1 농도 구배 (0-80%)를 적용해 정제하였다. 다이아민 6 (0.788 g, 86.9% 수율; R f 0.14/이동상 D2, 닌하이드린으로 검출)이 노란색이 도는 오일로 수득되었다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 4.05, 3.63, 3.21, 3.15, 2.79, 2.68, 2.60, 2.51, 2.42, 2.32, 1.61, 1.50, 1.36-1.28, 0.88 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 173.62, 64.52, 53.68, 53.29, 41.22, 40.26, 34.03, 31.41, 28.58, 25.75, 25.57, 22.80, 22.51, 13.98 ppm. HRMS (ESI): C28H57O4N2에 대한 m/z 계산치 [M + H]+ 485.43128; 실측치 485.43052.
cis , cis - N 1 , N 3 , N 5 - 트리스(6-(다이((헥실옥시카르보닐) 부틸)아미노) 헥실 ) 사이클로헥산 -1,3,5-트리카르복사미드 7
실시예 1에서 리피도이드 3에 대해 기술된 절차에 따라, cis,cis-1,3,5-사이클로헥산트리카르복시산 (21 ㎎, 0.097 mmol), N 1,N 1-다이((헥실옥시카르보닐) 부틸)헥산-1,6-다이아민 6 (188 ㎎, 389 mmol, 4 eq.) 및 DIPEA (169 ㎕, 0.971 mmol, 10 eq.)로부터 리피도이드 7을 제조하였다. 리피도이드 7 (55 ㎎, 35%; R f 0.42/이동상 D2, 닌하이드린으로 검출)이 노란색이 도는 반고체로 수득되었다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 6.23, 4.05, 3.205, 2.65, 2.34, 2.30, 2.085, 1.63-1.60, 1.49, 1.33-1.29, 0.88 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 174.35, 173.37, 64.60, 53.35, 52.88, 43.98, 39.12, 33.79, 31.94, 31.40, 29.21, 28.57, 26.62, 26.33, 25.56, 22.58, 22.51, 13.98 ppm. IR (CCl4): υmax/cm-1 = 1736 vs (υs C=O), 1173 m, 1075 w (υs C-O), 3293 m (υ NH), 1640 s (아미드 I) 및 1551 m (아미드 II), 2955 s (υas CH3), 2933 vs (υas CH2), 2875 m, sh (υs CH3), 2860 m (υs CH2), 1467 m 및 1460 m (βs CH2 및 δas CH3), 1379 w (δs CH3), 724 w (βas CH2 및 γas CH2). HRMS (MALDI): C93H175N6O15에 대한 m/z 계산치 [M + H]+ 1616.3110; 실측치 1616.3095.
실시예 3
cis , cis - N 1 , N 3 , N 5 - 트리스 (6-( 다이도데실아미노 ) 헥실 )-1,3,5- 트리메틸사이클로헥산 -1,3,5-트리카르복사미드 8
실시예 1에서 리피도이드 3에 대해 기술된 절차에 따라, cis,cis-1,3,5-트리메틸-1,3,5-사이클로헥산트리카르복시산 (20 ㎎, 0.077 mmol), N 1,N 1-다이(도데실)헥산-1,6-다이아민 2 (140 ㎎, 310 mmol, 4 eq.) 및 DIPEA (135 ㎕, 0.774 mmol, 10 eq.)로부터 리피도이드 8을 제조하였다. 리피도이드 8 (64 ㎎, 53%; R f 0.43/이동상 D2, 닌하이드린으로 검출)이 약간 노란색이 도는 고체 오일 형태로 수득되었다. IR (CCl4): υmax/cm-1 = 3288 w, br (υ NH), 1651 m (아미드 I), 1585 w, br, sh 및 1559 m, br (아미드 II), 2956 s (υas CH3), 2927 vs (υas CH2), 2878 m, sh (υs CH3), 2855 s (υs CH2), 1468 m 및 1459 m, sh, 1448 m, sh (βs CH2 및 δas CH3), 1378 w (δs CH3); 721 w (βas CH2 및 γas CH2). HRMS (MALDI): C102H205N6O3에 대한 m/z 계산치 [M + H]+ 1562.6068; 실측치 1562.6011.
실시예 4
N 1 , N 1 - 다이도데실프로판 -1,3- 다이아민 10
실시예 1에서 화합물 1에 대해 기술된 절차에 따라 N 1-tert-부틸옥시카르보닐-1,3-다이아미노프로판 (6.0 g, 34.43 mmol), n-도데실알데하이드 (22.91 ㎖, 103.30 mmol, 3 eq.) 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 (21.89 g, 103.3 mmol, 3 eq.)로부터 아민 9를 제조하였다. 아민 9가 노란색이 도는 오일로 수득되었다 (7.72 g, 43.9%).
실시예 1에서 화합물 2에 대해 기술된 절차에 따라 아민 9에 대해 탈보호를 수행하였다; 다이아민 10 (4.26 g, 68.6%; 암모니아로 미리 포화 처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.35/이동상 D2, 닌하이드린으로 검출)이 노란색이 도는 오일 형태로 수득되었다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 3.07, 2.70, 2.50, 1.81, 1.46, 1.28, 1.26, 1.25-1.29, 1.24, 0.87 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 53.70, 53.30, 41.18, 31.90, 29.64, 29.62, 29.60, 29.58, 29.48, 29.33, 27.42, 25.71, 23.87, 22.67, 14.10 ppm. IR (필름): υmax/cm-1 = 3361 w 및 3274 w (υ NH2), 2803 m (υs N-CH 2), 2954 s (υas CH3), 2924 vs (υas CH2), 2853 s (υs CH2), 1467 m 및 1456 m, sh (βs CH2 및 δas CH3), 1378 w 및 1364 w (δs CH3), 720 m (βas CH2). HRMS (ESI): C27H59N2에 대한 m/z 계산치 [M + H]+ 411.46728; 실측치 411.46652.
cis , cis - N 1 , N 3 , N 5 - 트리스 (3-( 다이도데실아미노 )프로필)-1,3,5- 트리메틸사이 클로헥산-1,3,5-트리카르복사미드 11
실시예 1에서 리피도이드 3에 대해 기술된 절차에 따라, cis,cis-1,3,5-트리메틸-1,3,5-사이클로헥산트리카르복시산 (20 ㎎, 0.077 mmol), N 1,N 1-다이(도데실)프로판-1,3-다이아민 10 (127 ㎎, 310 mmol, 4 eq.) 및 DIPEA (135 ㎕, 0.774 mmol, 10 eq.)로부터 리피도이드 11을 제조하였다. 리피도이드 11 (41 ㎎, 37% 수율; R f 0.36/이동상 D2, 닌하이드린으로 검출)이 약간 노란색이 도는 고체 오일 형태로 수득되었다. IR (CCl4): υmax/cm-1 = 3303 w, vbr (υ NH), 1679 s, sh (아미드 I), 1513 w, br, sh (아미드 II), 2956 s (υas CH3), 2927 vs (υas CH2), 2878 m, sh (υs CH3), 2855 s (υs CH2), 1464 m, sh (βs CH2 및 δas CH3), 1380 w (δs CH3); 721 w (βas CH2 및 γas CH2). HRMS (MALDI): C93H187N6O3에 대한 m/z 계산치 [M + H]+ 1436.4665; 실측치 1436.4629.
실시예 5
리놀레일알데하이드 12
얼음조를 이용해 0℃로 냉각한 DCM (120 ㎖) 중의 리놀레일알코올 (2.50 ㎖, 8.07 mmol) 용액에 데스-마틴 퍼아이오디난 (4.45 g, 10.49 mmol, 1.3 eq.)을 첨가하여, 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반하였다. 그 후, 소듐 티오설페이트 용액 (20 g Na2S2O3.5H2O/100 ㎖ H2O)과 소듐 바이카보네이트 포화 수용액 (50 ㎖)을 첨가해 반응물을 퀀칭하고, 밀키한 용액이 투명해질 때까지 1시간 동안 rt에서 교반하였다. 용액을 1000 ㎖ 분액 플라스크에 부어 물 (150 ㎖)로 희석한 다음 생산물을 DCM (150 ㎖, 2x50 ㎖)으로 추출하였다. 조합한 유기상을 브린 (150 ㎖)으로 헹구고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조한 다음 S2 프릿을 통해 여과하였으며, 이후 RVE에서 용매를 증발시켰다. 조산물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (등용매 조건, 5% 에틸 아세테이트/사이클로헥산)에 의해 정제하였다. 알데하이드 12 (1.271 g, 59.6% 수율; R f 0.36/이동상 CE5, KMnO4로 검출)가 무색 오일로 수득되었다.
N 1 , N 1 - 다이((9Z,12Z) - 옥타데카 -9,12-다이엔-1-일) 헥산 -1,6- 다이아민 14
실시예 1에서 화합물 1에 대해 기술된 절차에 따라 N 1-tert-부틸옥시카르보닐-1,6-다이아미노헥산 (0.345 g, 1.59 mmol), 알데하이드 12 (1.27 g, 4.78 mmol, 3 eq.) 및 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 (1.01 g, 4.78 mmol, 3 eq.)로부터 아민 13을 제조하였다. 아민 13이 노란색이 도는 오일로 수득되었다 (1.08 g, 94.9% 수율; R f 0.18 /CE20 이동상, 닌하이드린으로 검출).
실시예 1에서 화합물 2에 대해 기술된 절차에 따라 TFA (4 ㎖) 및 DCM (5 ㎖)의 혼합물 중에 아민 13의 탈보호를 수행하였으며; 다이아민 14 (0.594 g, 64.0%; R f 0.13/이동상 D2, 닌하이드린으로 검출)가 노란색이 도는 오일로 수득되었다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 5.30-5.40, 2.765, 2.73, 2.67, 2.59, 2.04, 1.51, 1.385, 1.37, 1.34, 1.295, 1.29, 1.28-1.34, 1.28, 0.88 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 130.19, 130.06, 127.99, 127.89, 53.49, 53.45, 41.67, 32.52, 31.50, 29.62, 29.46, 29.20-29.48, 27.37, 27.20, 27.18, 26.52, 25.61, 22.56, 14.06 ppm. IR (CCl4): υmax/cm-1 = 3011 s (υas =CH); 1646-1673 m (υ C=C); 3455 w (υas NH2); 3394 (υs NH2); 1620 w (βs NH2); 1087 m (υ C-NH2); 2957 s, sh (υas CH3); 2928 vs (υas CH2); 2873 s, sh (υs CH3); 2856 vs (υs CH2); 2801 m (υs N-CH 2); 1467 m 및 1457 m, sh (βs CH2 및 δas CH3); 1378 m (δs CH3); 721 m (βas 및 γas CH2). HRMS : C42H81N2에 대한 m/z 계산치 [M + H]+ 613.63943; 실측치 613.63899.
cis , cis - N 1 , N 3 , N 5 - 트리스 (6-( 다이((9Z,12Z) - 옥타데카 -9,12-다이엔-1-일)아미노) 헥실 )-1,3,5-트리메틸사이클로헥산-1,3,5-트리카르복사미드 15
실시예 1에서 리피도이드 3에 대해 기술된 절차에 따라 cis,cis-1,3,5-트리메틸-1,3,5-사이클로헥산트리카르복시산 (17 ㎎, 0.066 mmol), N 1,N 1-다이((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일)헥산-1,6-다이아민 14 (161 ㎎, 273 mmol, 4 eq.) 및 DIPEA (115 ㎕, 0.658 mmol, 10 eq.)로부터 리피도이드 15를 제조하였다. 리피도이드 15 (86 ㎎, 64% 수율; R f 0.36/이동상 D2, 닌하이드린으로 검출)가 옅은 노란색 고형물로 수득되었다. IR (CCl4): υmax/cm-1 = 3348 w, br, sh 및 3302 w, br (υ NH), 1656 m 및 1635 m, sh (아미드 I + υ C=C), 1565 w, sh 및 1557 w, br (아미드 II), 3011 m (υas =C-H), 2956 s (υas CH3), 2929 vs (υas CH2), 2875 m, sh (υs CH3), 2856 s (υs CH2), 1467 m 및 1450 m, sh, (βs CH2 및 δas CH3), 1379 w (δs CH3); 720 w (βas CH2 + γas CH2 + γ =C-H). HRMS (MALDI): C138H253N6O3에 대한 m/z 계산치 [M + H]+ 2042.9829; 실측치 2042.9861.
실시예 6
화합물 18
DCM (30 ㎖) 중의 6-브로모헥산산 (3.50 g, 17.9 mmol) 및 옥탄-2-올 (3.51 g, 26.9 mmol, 1.5 eq.) 용액에 DIC (4.41 ㎖, 28.7 mmol, 1.6 eq.) 및 DMAP (88 ㎎, 0.72 mmol, 0.04 eq.)를 첨가하여, 혼합물을 밤새 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (16 g)에 흡착시키고, 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (80 g, 용출: 선형적인 에틸 아세테이트 농도 구배/사이클로헥산, 0-10%), 화합물 16 (4.02 g, 77%; R f 0.41/CE5, KMnO4에 의해 가시화)을 무색 오일로 수득하였다.
브로모에스테르 16 (4.00 g, 13.1 mmol, 2.6 eq.) 및 포타슘 카보네이트 (7.23 g, 52.3 mmol, 10 eq.)을 무수 ACN (10 ㎖) 중의 N-Boc-1,6-헥산다이아민 (1.13 g, 5.23 mmol, 1 eq.) 용액에 첨가하고, 혼합물을 40℃에서 3일간 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (16 g)에 흡착시키고, 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (80 g, 용출: 선형적인 에틸 아세테이트 농도 구배/사이클로헥산, 0-100%), 화합물 17 (2.80 g, 80%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.58/CE50, 닌하이드린에 의해 가시화)을 옅은 노란색 오일로 수득하였다.
염산 / 다이옥산 (4 ㎖, 4 M)을 무수 DCM (4 ㎖) 중의 화합물 17 (2.75 g, 4.11 mmol) 용액에 첨가하여, 반응 혼합물을 rt에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 500 ㎖ 분액 깔때기에 부어 NaHCO3 포화 수용액 (100 ㎖)으로 희석한 다음 생산물을 다이에틸 에테르 (100 ㎖, 2 x 50 ㎖)로 추출하였다. 유기상을 조합하여 브린 (75 ㎖)으로 헹구고, 무수 소듐 설레이트 상에서 건조한 다음 S2 소결 유리를 통해 여과하여 RVE에서 용매를 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 DCM 중의 선형적인 D1 농도 구배 (0-70%)를 적용해 정제하였다. 아민 18 (1.74 g, 74%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.25 / D2, 닌하이드린에 의해 가시화)이 옅은 노란색 오일로 수득되었다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 4.90-4.77 (m), 2.72-2.62 (m), 2.39-2.29 (m), 2.21 (t, J = 7.5 Hz), 1.64-1.44 (m), 1.47-1.32 (m), 1.30-1.17 (m), 1.15-1.08 (m), 0.86-0.78 (m) ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 173.42, 70.83, 53.89, 41.87, 35.98, 31.77, 29.13, 27.41, 27.17, 26.84, 26.69, 25.40, 25.09, 22.60, 20.04, 14.09 ppm. HRMS (ESI): C34H68N2O4에 대한 m/z 계산치 [M + H]+ 569.5252; 실측치 569.5247.
헥사 (옥탄-2-일) cis , cis -6,6',6'',6''',6'''',6'''''-((((사이클로헥산-1,3,5-트리카르보닐)트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일))트리스(아잔트리틸))헥사헥사노에이트 19
티오닐클로라이드 (700 ㎕) 및 DMF (6 ㎕)를 cis,cis-사이클로헥산-1,3,5-트리카르복시산 (80 ㎎, 370 mmol)에 첨가하여, 현탁물을 밀폐된 바이얼에 넣어 70℃에서 3시간 동안 교반하였으며; 이 때 현탁물이 투명한 용액으로 바뀌었다. 과량의 SOCl2를 드라이 질소 스트림을 이용해 70℃에서 제거하고, 잔류물을 진공 하에 rt에서 (20분) 건조하였으며, 수득한 고형물을 아르곤 하에 무수 TCE (2.5 ㎖) 및 DIPEA (645 ㎖, 3.70 mmol)에 용해하였다. 그런 후, 무수 TCE (2.5 ㎖) 중의 아민 18 (1.05 g, 1.85 mmol, 5 eq.) 용액을 첨가하여 반응 혼합물을 40분간 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 진공 증발시켜 DCM에 다시 용해하고, 이를 실리카 (10 g)에 흡착시킨 다음 DCM을 진공 제거하였다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (용출: 선형적인 D1 농도 구배 / DCM, 5-35%), 표적 화합물 19 (489 ㎎, 71%)을 노란색 왁스형 반고체로 수득하였다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 5.75, 4.88, 3.21, 2.42, 2.27, 2.22, 2.11, 1.62, 1.58, 1.56, 1.47, 1.46, 1.30, 1.28, 1.27, 1.26, 1.19, 0.87 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): 173.88, 173.39, 70.82, 53.87, 53.77, 44.10, 39.44, 35.93, 34.67, 31.86, 31.73, 29.51, 29.09, 27.08, 26.74, 25.36, 25.01, 22.56, 20.01, 14.06 ppm. HRMS (MALDI): C111H211N6O15 m/z 계산치 [M + H]+ 1868.5927; 실측치 1868.5906.
실시예 7
화합물 22
DIC (3.60 ㎖, 23.0 mmol, 1.6 eq.) 및 DMAP (70 ㎎, 0.58 mmol, 0.04 eq.)를 DCM (30 ㎖) 중의 7-브로모헵타노익산 (3.00 g, 14.4 mmol) 및 3-메틸헥산-1-올 (2.50 g, 21.5 mmol, 1.5 eq.) 용액에 첨가하여, 혼합물을 밤새 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (16 g)에 흡착시키고, 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (80 g, 용출: 선형적인 에틸 아세테이트 농도 구배 / 사이클로헥산, 0-10%), 화합물 20 (3.64 g, 83%; R f 0.27 / CE5, KMnO4에 의해 가시화)을 무색 오일로 수득하였다.
브로모에스테르 20 (3.63 g, 11.8 mmol, 2.6 eq.) 및 포타슘 카보네이트 (6.29 g, 45.5 mmol, 10 eq.)를 무수 ACN (10 ㎖) 중의 N-Boc-헥산-1,6-다이아민 (0.98 g, 4.55 mmol, 1 eq.) 용액에 첨가하여, 혼합물을 40℃에서 3일간 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (16 g)에 흡착시키고, 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (80 g, 용출: 선형적인 에틸 아세테이트 농도 구배 / 사이클로헥산, 0-100%), 화합물 21 (2.90 g, 95%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.54 / CE50, 닌하이드린에 의해 가시화)을 옅은 노란색 오일로 수득하였다.
무수 DCM (4 ㎖) 중의 화합물 21 (2.85 g, 4.26 mmol) 용액에 염산 / 다이옥산 (4 ㎖, 4 M)을 첨가하여, 반응 혼합물을 rt에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 500 ㎖ 분액 깔때기에 부어 NaHCO3 포화 수용액 (100 ㎖)으로 희석한 다음 생산물을 다이에틸 에테르 (100 ㎖, 2 x 50 ㎖)로 추출하였다. 유기상을 조합하여 브린 (75 ㎖)으로 헹구고, 무수 소듐 설레이트 상에서 건조한 다음 S2 소결 유리를 통해 여과한 후 RVE에서 용매를 증발시켰다. 조산물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 DCM 중의 선형적인 D1 농도 구배 (0-70%)를 적용해 정제하였다. 아민 22 (2.38 g, 96%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.48 / D2, 닌하이드린에 의해 가시화)를 옅은 노란색 오일로 수득하였다.
1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 4.08-3.96 (m), 2.63-2.58 (m), 2.33-2.26 (m), 2.21 (t, J = 7.5 Hz), 1.61-1.50 (m), 1.49-1.40 (m), 1.40-1.30 (m), 1.30-1.14 (m), 1.14-1.00 (m), 0.85-0.76 (m) ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): 173.85, 62.77, 54.13, 42.19, 38.98, 35.55, 34.35, 33.79, 29.56, 29.15, 27.49, 27.29, 26.88, 25.01, 19.95, 19.48, 14.26 ppm. HRMS (ESI): C34H68N2O4에 대한 m/z 계산치 [M + H]+ 569.5252; 실측치 569.5250.
헥사키스 (3- 메틸헥실 ) cis , cis -7,7',7'',7''',7'''',7'''''-(((( 사이클로헥산 -1,3,5-트리카르보닐) 트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일) ) 트리스 ( 아잔 트리틸))헥사헵타노에이트 23
티오닐클로라이드 (500 ㎕) 및 DMF (4 ㎕)를 cis,cis-사이클로헥산-1,3,5-트리카르복시산 (60 ㎎, 278 mmol)에 첨가하여, 현탁물을 밀폐된 바이얼에 넣어 3시간 동안 70℃에서 교반하였으며; 이때 현탁물이 투명한 용액으로 바뀌었다. 과량의 SOCl2를 드라이 질소 스트림을 이용해 70℃에서 제거하고, 잔류물을 진공 하에 rt에서 (20분) 건조하였으며, 수득한 고형물을 아르곤 하에 무수 TCE (2 ㎖) 및 DIPEA (483 ㎖, 2.78 mmol, 10 eq.)에 용해하였다. 그 후, 무수 TCE (2 ㎖) 중의 아민 22 (632 ㎎, 1.11 mmol, 4 eq.) 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 40분간 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 진공 증발시키고 DCM에 다시 용해해 실리카 (10 g)에 흡착시킨 다음 DCM을 진공 제거하였다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (용출: 선형적인 D1 농도 구배 / DCM, 0-46%), 표적 화합물 23 (346 ㎎, 67%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.66 / D2, 닌하이드린에 의해 가시화)을 노란색 왁스형 반고체로 수득하였다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 5.75, 4.09, 3.21, 2.41, 2.28, 2.22, 2.11, 1.64, 1.62, 1.61, 1.58, 1.54, 1.48, 1.44, 1.42, 1.33, 1.32, 1.29, 1.28, 1.13, 0.89, 0.88 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 173.92, 173.87, 62.64, 53.90, 44.10, 39.45, 39.14, 35.51, 34.23, 31.86, 29.54, 29.52, 29.09, 27.22, 27.13, 26.77, 24.97, 19.94, 19.47, 14.26 ppm. HRMS (MALDI): C111H211N6O15 m/z 계산치 [M + H]+ 1868.5927; 실측치 1868.5905.
실시예 8
화합물 24
N,N '-다이이소프로필카르보디이미드 (4.07 ㎖, 24.9 mmol, 1.6 eq.)를, 무수 DCM (150 ㎖) 중의 6-브로모펜탄산 (3.00 g, 16.6 mmol), DMAP (81 ㎎, 0.66 mmol, 0.04 eq.) 및 게라니올 (4.36 ㎖, 24.9 mmol, 1.5 eq.) 함유 용액에 첨가하였다. 혼합물을 밤새 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (20 g)에 흡착시켜 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (120 g, 용출: 선형적인 에틸 아세테이트 농도 구배 / 사이클로헥산, 0-10%), 표적 화합물 24 (4.80 g, 91%; R f 0.39 / CE5, KMnO4에 의해 가시화)를 옅은 노란색 오일로 수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.37 - 5.30 (m, 1H), 5.11 - 5.05 (m, 1H), 4.60 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 3.41 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.35 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.15 - 2.01 (m, 4H), 1.95 - 1.86 (m, 2H), 1.83 - 1.74 (m, 2H), 1.70 (s, 3H), 1.68 (s, 3H), 1.60 (s, 3H).
화합물 26
브로모에스테르 24 (4.80 g, 15.1 mmol, 2.3 eq.) 및 포타슘 카보네이트 (7.27 g, 52.3 mmol, 8 eq.)를 무수 ACN (30 ㎖) 중의 N-Boc-1,6-헥산다이아민 (1.42 g, 6.58 mmol, 1 eq.) 용액에 첨가하여, 혼합물을 45℃에서 24시간 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (20 g)에 흡착시켜 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (120 g, NH3 기체로 컬럼 전처리, 용출: 선형적인 에틸 아세테이트 농도 구배 / 사이클로헥산, 0-100%), 화합물 25 (2.80 g, 54%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.58 / CE50, KMnO4에 의해 가시화)를 옅은 노란색 오일로 수득하였다.
자기 교반 막대가 장착된 플라스크에 화합물 25 (2.80 g, 4.06 mmol)를 투입하고, 고무 셉텀으로 막은 후 아르곤으로 플러싱하였다. ACN (10 ㎖) 및 DCM (20 ㎖)을 바늘 및 주사기를 사용해 셉텀을 통해 첨가하고, 교반을 개시한 다음 ACN (20 ㎖) 중의 4-톨루엔설폰산 일수화물 (2.32 g, 12.2 mmol, 3 eq.) 용액을 5분에 걸쳐 바늘과 주사기를 사용해 셉텀을 통해 rt에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 6시간 동안 교반한 다음, 암모니아 기체 스트림을 이용해 중화하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (20 g)에 흡착시키고, 조산물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 DCM 중의 선형적인 D1 농도 구배 (10-43%)를 적용해 정제하였다. 아민 26 (810 ㎎, 34%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.45 / D2, 닌하이드린에 의해 가시화)이 노란색 오일로 수득되었다. HRMS (ESI): C36H64N2O4 m/z 계산치 [M + H]+ 589.4939; 실측치 589.4936.
헥사키스 ((E)-3,7- 다이메틸옥타 -2,6-다이엔-1-일) cis , cis -5,5',5'',5''',5'''',5'''''-((((사이클로헥산-1,3,5-트리카르보닐)트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일))트리스(아잔트리틸))헥사펜타노에이트 27
티오닐클로라이드 (700 ㎕) 및 DMF (6 ㎕)를 cis,cis-사이클로헥산-1,3,5-트리카르복시산 (45 ㎎, 208 mmol)에 첨가하여, 현탁물을 밀폐된 바이얼에 넣어 3시간 동안 70℃에서 교반하였으며; 이때 현탁물이 투명한 용액으로 바뀌었다. 과량의 SOCl2를 드라이 질소 스트림을 이용해 70℃에서 제거하고, 잔류물을 진공 하에 rt에서 (20분) 건조하였으며, 수득한 고형물을 아르곤 하에 무수 TCE (1.5 ㎖) 및 DIPEA (363 ㎖, 2.08 mmol, 10 eq.)에 용해하였다. 그 후, 무수 TCE (1.0 ㎖) 중의 아민 26 (490 ㎎, 833 mmol, 4 eq.) 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 40분간 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 진공 증발시키고 DCM에 다시 용해해 실리카 (10 g)에 흡착시킨 다음 DCM을 진공 제거하였다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (용출: 선형적인 D1 농도 구배 / DCM, 0-31%), 표적 화합물 27 (262 ㎎, 65%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.59 / D2, 닌하이드린에 의해 가시화)을 노란색 왁스형 반고체로 수득하였다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 5.72, 5.32, 5.08, 4.58, 3.21, 2.44, 2.41, 2.32, 2.22, 2.11, 2.10, 2.09, 2.03, 1.69, 1.68, 1.61, 1.60, 1.59, 1.58, 1.47, 1.45, 1.29 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 173.85, 173.60, 142.16, 131.80, 123.72, 118.32, 62.25, 53.79, 53.45, 44.12, 39.52, 39.42, 34.14, 31.85, 29.48, 27.03, 26.72, 26.29, 25.67, 22.90, 17.68, 16.46 ppm. HRMS (MALDI): C117H199N6O15 m/z 계산치 [M + H]+ 1928.4988; 실측치 1928.4967.
실시예 9
화합물 28
N,N '-다이이소프로필카르보디이미드 (4.07 ㎖, 24.9 mmol, 1.6 eq.)를, 무수 DCM (60 ㎖) 중에 6-브로모펜탄산 (3.00 g, 16.6 mmol), DMAP (81 ㎎, 0.66 mmol, 0.04 eq.) 및 네롤 (4.38 ㎖, 24.9 mmol, 1.5 eq.)을 함유한 용액에 첨가하였다. 혼합물을 밤새 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (20 g)에 흡착시켜 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (120 g, 용출: 선형적인 에틸 아세테이트 농도 구배 / 사이클로헥산, 0-10%), 표적 화합물 28 (4.75 g, 90%; R f 0.39 / CE5, KMnO4에 의해 가시화)을 옅은 노란색 오일로 수득하였다. 1 H NMR (401 MHz, CDCl3) δ 5.35 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 5.12 - 5.06 (m, 1H), 4.57 (dd, J = 7.2, 1.1 Hz, 2H), 3.40 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.15 - 2.03 (m, 4H), 1.94 - 1.86 (m, 2H), 1.82 - 1.74 (m, 5H), 1.68 (d, J = 1.4 Hz, 3H), 1.60 (s, 3H).
화합물 30
브로모에스테르 28 (4.75 g, 15.0 mmol, 2.3 eq.) 및 포타슘 카보네이트 (7.20 g, 52.1 mmol, 8 eq.)를 무수 ACN (45 ㎖) 중의 N-Boc-1,6-헥산다이아민 (1.41 g, 6.51 mmol, 1 eq.) 용액에 첨가하여, 혼합물을 48℃에서 24시간 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (20 g)에 흡착시켜 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (120 g, NH3 기체로 컬럼 전처리, 용출: 선형적인 에틸 아세테이트 농도 구배 / 사이클로헥산, 0-100%), 화합물 29 (3.62 g, 81%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.54 / CE50, 닌하이드린에 의해 가시화)를 옅은 노란색 오일로 수득하였다.
자기 교반 막대가 장착된 플라스크에 화합물 29 (3.62 g, 5.25 mmol)를 투입하고, 고무 셉텀으로 막은 다음 아르곤으로 플러싱하였다. DCM (10 ㎖)을 바늘과 주사기를 이용해 셉텀을 통해 투입하고, 교반을 개시한 다음 ACN (25 ㎖) 중의 4-톨루엔설폰산 일수화물 (2.50 g, 13.1 mmol, 2.5 eq.) 용액을 rt에서 바늘과 주사기를 이용해 셉텀을 통해 5분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 rt에서 5시간 동안 교반한 다음 암모니아 기체 스트림으로 중화하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (20 g)에 흡착시키고, 조산물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 DCM 중의 선형적인 D1 농도 구배 (10-43%)를 적용해 정제하였다. 아민 30 (1.36 g, 44%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.46 / D2, KMnO4에 의해 가시화)이 노란색 오일로 수득되었다. HRMS (ESI): C36H64N2O4 m/z 계산치 [M + H]+ 589.4939; 실측치 589.4937.
헥사키스 ((Z)-3,7- 다이메틸옥타 -2,6-다이엔-1-일) cis , cis -5,5',5'',5''',5'''',5'''''-((((사이클로헥산-1,3,5-트리카르보닐)트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일))트리스(아잔트리틸))헥사펜타노에이트 31
티오닐클로라이드 (700 ㎕) 및 DMF (6 ㎕)를 cis,cis-사이클로헥산-1,3,5-트리카르복시산 (65 ㎎, 301 mmol)에 첨가하여, 현탁물을 밀폐된 바이얼에 넣어 3시간 동안 70℃에서 교반하였으며; 이때 현탁물이 투명한 용액으로 바뀌었다. 과량의 SOCl2를 드라이 질소 스트림을 이용해 70℃에서 제거하고, 잔류물을 진공 하에 rt에서 (20분) 건조하였으며, 수득한 고형물을 아르곤 하에 무수 TCE (2 ㎖) 및 DIPEA (524 ㎖, 3.01 mmol, 10 eq.)에 용해하였다. 그 후, 무수 TCE (2.0 ㎖) 중의 아민 30 (796 ㎎, 1.35 mmol, 4.5 eq.) 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 30분간 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 진공 증발시키고 DCM에 다시 용해해 실리카 (10 g)에 흡착시킨 다음 DCM을 진공 제거하였다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (용출: 선형적인 D1 농도 구배 / DCM, 5-29%), 표적 화합물 31 (351 ㎎, 51%)을 노란색 왁스형 반고체로 수득하였다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 5.69, 5.34, 5.08, 4.55, 3.21, 2.41, 2.38, 2.30, 2.22, 2.10, 2.06, 1.75, 1.67, 1.60, 1.59, 1.58, 1.47, 1.28 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 173.81, 173.58, 142.44, 132.12, 123.56, 119.22, 60.96, 53.82, 53.48, 44.12, 39.44, 34.17, 32.15, 31.85, 29.50, 27.07, 26.75, 26.63, 25.68, 23.50, 22.91, 17.65 ppm. HRMS (MALDI): C117H199N6O15 m/z 계산치 [M + H]+ 1928.4988; 실측치 1928.4963.
실시예 10
테트라 (옥탄-2-일) cis , cis -6,6',6'',6'''-((((5-( 메톡시카르보닐 ) 사이클로헥산 -1,3-다이카르보닐) 비스(아잔다이일))비스(헥산-6,1-다이일) ) 비스 (아잔트리틸))테트라헥사노에이트 32
티오닐클로라이드 (700 ㎕) 및 DMF (6 ㎕)를 cis,cis-사이클로헥산-1,3,5-트리카르복시산 (60 ㎎, 278 mmol)에 첨가하여, 현탁물을 밀폐된 바이얼에 넣어 3시간 동안 70℃에서 교반하였으며; 이때 현탁물이 투명한 용액으로 바뀌었다. 과량의 SOCl2를 드라이 질소 스트림을 이용해 70℃에서 제거하고, 잔류물을 진공 하에 rt에서 (20분) 건조하였으며, 수득한 고형물을 아르곤 하에 무수 TCE (2 ㎖) 및 DIPEA (483 ㎖, 2.78 mmol, 10 eq.)에 용해하였다. 그 후, 무수 TCE (1.0 ㎖) 중의 아민 18 (632 ㎎, 1.11 mmol, 4 eq.) 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 40분간 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 진공 증발시키고 DCM에 다시 용해해 실리카 (10 g)에 흡착시킨 다음 DCM을 진공 제거하였다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (용출: 선형적인 D1 농도 구배 / DCM, 5-29%), 화합물 32 (242 ㎎, 65%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.68 / D2, 닌하이드린에 의해 가시화)를 노란색 오일로 수득하였다. 생산물 32는 아민 18에서 MeOH가 완전히 제거되지 않은 결과물이다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 5.68, 5.29, 4.88, 3.67, 3.22, 2.43, 2.40, 2.27, 2.20, 2.19, 2.18, 2.09, 1.62, 1.59, 1.57, 1.56, 1.48, 1.47, 1.46, 1.30, 1.28, 1.27,1.19, 0.87 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 174.64, 173.75, 173.38, 70.83, 53.82, 53.76, 51.84, 43.99, 42.09, 39.43, 35.93, 34.66, 31.81, 31.73, 31.20, 29.50, 29.09, 27.06, 26.72, 25.36, 24.99, 22.56, 20.00, 14.05 ppm. HRMS (MALDI): C78H146N4O12 m/z 계산치 [M + H]+ 1332.1010; 실측치 1332.0987.
실시예 11
테트라키스 (3- 메틸헥실 ) cis , cis -7, 7',7'',7''' -((((5-( 메톡시카르보닐 )사이클로헥산-1,3-다이카르보닐) 비스(아잔다이일))비스(헥산-6,1-다이일) )비스(아잔트리틸))테트라헵타노에이트 33
티오닐클로라이드 (700 ㎕) 및 DMF (6 ㎕)를 cis,cis-사이클로헥산-1,3,5-트리카르복시산 (55 ㎎, 254 mmol)에 첨가하여, 현탁물을 밀폐된 바이얼에 넣어 3시간 동안 70℃에서 교반하였으며; 이때 현탁물이 투명한 용액으로 바뀌었다. 과량의 SOCl2를 드라이 질소 스트림을 이용해 70℃에서 제거하고, 잔류물을 진공 하에 rt에서 (20분) 건조하였으며, 수득한 고형물을 아르곤 하에 무수 TCE (2 ㎖) 및 DIPEA (443 ㎖, 2.54 mmol, 10 eq.)에 용해하였다. 그 후, TCE (0.5 ㎖) 중의 MeOH (10.3 ㎖, 254 mmol, 1.0 eq.) 용액을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 승온시켜 1시간 동안 교반한 후, 무수 TCE (2.0 ㎖) 중의 아민 22 (376 ㎎, 661 mmol, 2.6 eq.) 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 40분간 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 진공 증발시키고 DCM에 다시 용해해 실리카 (10 g)에 흡착시킨 다음 DCM을 진공 제거하였다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (용출: 선형적인 D1 농도 구배 / DCM, 5-29%), 표적 화합물 33 (87 ㎎, 26%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.75 / D2, 닌하이드린에 의해 가시화)을 옅은 노란색 오일로 수득하였다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 5.68, 5.29, 4.09, 3.67, 3.22, 2.43, 2.40, 2.28, 2.20, 2.18, 2.09, 1.64, 1.61, 1.57, 1.53, 1.48, 1.45, 1.42, 1.34, 1.31, 1.28, 1.13, 0.89, 0.88 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 174.65, 173.91, 173.76, 62.85, 53.85, 51.85, 43.98, 42.09, 39.42, 39.15, 35.52, 34.22, 31.89, 31.19, 29.55, 29.51, 29.06, 27.20, 27.10, 26.72, 24.95, 19.94, 19.47, 14.26 ppm. HRMS (MALDI): C78H147N4O12 m/z 계산치 [M + H]+ 1332.1010; 실측치 1332.0984.
실시예 12
화합물 34
티오닐클로라이드 (1.2 ㎖) 및 DMF (10 ㎕)를 cis,cis-사이클로헥산-1,3,5-트리카르복시산 (160 ㎎, 740 mmol)에 첨가하여, 현탁물을 밀폐된 바이얼에 넣어 3시간 동안 70℃에서 교반하였으며; 이때 현탁물이 투명한 용액으로 바뀌었다. 과량의 SOCl2를 드라이 질소 스트림을 이용해 70℃에서 제거하고, 잔류물을 진공 하에 rt에서 (20분) 건조하였으며, 수득한 고형물을 아르곤 하에 무수 TCE (3 ㎖) 및 DIPEA (1.29 ㎖, 7.40 mmol, 10 eq.)에 용해하였다. 그 후, TCE (0.5 ㎖) 중의 BnOH (76 ㎖, 740 mmol, 1.0 eq.) 용액을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 승온시켜 2시간 동안 교반한 후, 무수 TCE (3.0 ㎖) 중의 아민 18 (1.09 g, 1.92 mmol, 2.6 eq.) 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 40분간 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 진공 증발시키고 DCM에 다시 용해해 실리카 (10 g)에 흡착시킨 다음 DCM을 진공 제거하였다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (용출: 선형적인 D1 농도 구배 / DCM, 5-29%), 화합물 34 (150 ㎎, 14%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.67 / D2, 닌하이드린에 의해 가시화)를 옅은 노란색 오일로 수득하였다. HRMS (MALDI): C84H151N4O12 m/z 계산치 [M + H]+ 1408.1323; 실측치 1408.1283.
cis , cis -3,5- 비스((6-(비스(6-(옥탄-2-일옥시) -6- 옥소헥실 )아미노) 헥실 ) 카바모일 )사이클로헥산-1-카르복시산 35
배-형상의 플라스크에 자기 교반 막대를 장착하고, 팔라듐/탄소 (10% Pd/C, 25 ㎎)를 투입하였다. 플라스크를 고무 셉텀으로 막은 다음 바늘을 통해 슈렝크 라인과 연결하고, vac-Ar 사이클 3회를 통해 플라스크 안의 분위기를 아르곤으로 교체하였다. 그런 후, MeOH (3 ㎖) 중의 화합물 34 (150 ㎎, 107 mmol) 용액을 바늘과 주사기를 이용해 셉텀을 통해 투입하고, 교반을 개시하였다. 플라스크를 제2 바늘을 이용해 연속적인 수소 스트림과 연결하고, 슈렝크 라인으로의 메인 아르곤 유입구를 닫았다 (과량의 수소가 슈렝크 라인 버블러를 통해 플라스크로부터 계속 방출됨). 반응 혼합물을 왕성하게 rt에서 4시간 동안 교반하였다. 그 후, 플라스크를 아르곤으로 충분히 플러싱하고, PTFE 시린지 필터를 통한 여과로 팔라듐/탄소를 제거하였다. 휘발성 물질은 이후 진공 하에 제거하여 생산물 35 (110 ㎎, 79%, NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.27 / D2, 닌하이드린에 의해 가시화)를 무색 오일로 수득하였다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 6.59, 4.88, 3.20, 3.15, 2.71, 2.67, 2.27, 2.24, 2.20, 2.13, 2.02, 1.64, 1.63, 1.60, 1.58, 1.57, 1.56, 1.54, 1.47, 1.45, 1.32, 1.28, 1.27, 1.26, 1.18, 0.87 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 180.09, 175.19, 173.10, 70.94, 53.01, 52.06, 44.36, 44.32, 39.22, 35.91, 34.43, 32.48, 32.16, 31.72, 29.15, 29.08, 26.72, 26.62, 26.30 25.36, 24.69, 24.11, 22.55, 19.99, 14.06 ppm. HRMS (MALDI): C77H145N4O12 m/z 계산치 [M + H]+ 1318.0854; 실측치 1318.0842.
테트라 (옥탄-2-일) cis , cis -6, 6',6'',6''' -((((5-( 피롤리딘 -1-카르보닐)사이클로헥산-1,3-다이카르보닐) 비스(아잔다이일))비스(헥산-6,1-다이일) )비스(아잔트리틸))테트라헥사노에이트 36
자기 교반 막대가 구비된 바이얼에 화합물 35 (60 ㎎, 45.5 mmol), NH4Cl (12.2 ㎎, 228 mmol, 5 eq.)을 투입하고, 바늘로 셉텀을 뚫어 아르곤으로 플러싱하였다. 그런 후, 무수 DMF (1.5 ㎖) 및 DIPEA (48 ㎖, 273 mmol, 6 eq.)를 바늘과 주사기를 사용해 첨가하였다. 형성된 현탁물을 10분간 rt에서 교반한 다음 무수 DMF (0.5 ㎖) 중의 PyBroP (53 ㎎, 114 mmol, 2.5 eq.) 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 rt에서 90분간 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 진공 증발시키고 DCM에 다시 용해해 실리카 (10 g)에 흡착시킨 다음 DCM을 진공 제거하였다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (용출: 선형적인 D1 농도 구배 / DCM, 5-29%), 화합물 36 (18 ㎎, 29%; NH3-전처리된 TLC 플레이트에서 R f 0.42 / D2, 닌하이드린에 의해 가시화)을 주 산물로서 옅은-노란색 오일 형태로 수득하였다. 화합물 36은 PyBroP 가수분해로 인해 생기는 PyBroP 중의 피롤리딘 불순물 산물이다. 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 6.08, 4.88, 3.48, 3.43, 3.35, 3.25, 3.26, 3.20, 3.16, 2.72, 2.50, 2.32, 2.28, 2.15, 1.98, 1.95, 1.85, 1.69, 1.68, 1.66, 1.65, 1.60, 1.57, 1.50, 1.46, 1.34, 1.28, 1.26, 1.19, 0.88 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 174.39, 173.14, 172.79, 70.97, 53.37, 47.44, 47.40, 47.22, 47.19, 46.43, 46.30, 46.27, 45.90, 44.03, 41.39, 39.09, 35.92, 34.44, 32.08, 31.73, 31.20, 29.10, 26.70, 26.14, 25.37, 24.69, 24.24, 22.57, 20.00, 14.06. HRMS (MALDI): C81H152N5O11 m/z 계산치 [M + H]+ 1371.1483; 실측치 1371.1467.
실시예 13
트리메틸 cis , cis - l,3 ,5- 사이클로헥산트리카르복실레이트 37
칼슘 클로라이드 건조관 및 자기 교반기가 구비된 둥근 바닥형 플라스크에 담긴 무수 메탄올 (150 ㎖) 중의 cis,cis-l,3,5-사이클로헥산트리카르복시산 (9.90 g, 45.8 mmol) 용액에, 티오닐 클로라이드 (15.29 ㎖, 210.8 mmol, 4.6 eq.)를 고무 셉텀을 통해 주사기를 사용해 천천히 첨가하였다. 격렬한 발열 반응이 끝난 후, 용액을 동안 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 용매를 이후 진공 제거한 다음 오일성 잔류물을 500 ㎖ 분액 플라스크에 부어 NaHCO3 포화 수용액 (250 ㎖)으로 희석하고, 생산물을 다이에틸 에테르 (2x100 ㎖)로 추출하였다. 조합한 유기상을 브린 (100 ㎖)으로 헹구고, 무수 소듐 설레이트 상에서 건조한 다음 S2 소결 유리를 통해 여과하고, RVE에서 용매를 증발시켜 37을 옅은 노란색 오일로 수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 3.68 (s, 9H), 2.44 - 2.32 (m, 3H), 2.31 - 2.21 (m, 3H), 1.59 - 1.45 (m, 3H) ppm. HRMS (ESI): C12H19O6에 대한 m/z 계산치 [M + H]+ 259.11761; 실측치 259.11766.
트리메틸 cis , cis -1,3,5- 트리메틸사이클로헥산 -1,3,5- 트리카르복실레이트 38
사용하기 전 소듐 하이드록사이드에서 다이이소프로필아민을 증류하였다. 무수 다이에틸 에테르 (10 ㎖) 중의 다이이소프로필아민 (2.19 ㎖, 15.5 mmol, 4 eq.) 용액을, 2.0 M n-부틸리튬 (7.74 ㎖, 15.5 mmol, 4 eq.) 용액에 0℃에서 점적 첨가하여, 리튬 다이이소프로필아미드를 인 시추로 수득하였다. 무수 다이에틸 에테르 (10 ㎖) 중의 37 (1.00 g, 3.87 mmol; 1 eq.) 용액을 반응 혼합물에 0℃에서 점적 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 0℃에서 교반하였다. 다이메틸 설페이트 (2.20 ㎖, 23.2 mmol, 6 eq.)를 첨가하고, 밤새 rt에서 계속 교반하였다. 생산물을 물, 1 M HCl 및 브린으로 헹군 다음 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, S2 소결 유리를 통해 여과하여 RVE에서 용매를 증발시켰다. GC-MS 분석에서 조산물내 이성질체 2종의 비율은 cis,cis/cis,trans = 7:1인 것으로 나타났다. 다이에틸 에테르 및 펜탄 혼합물 중의 분별 결정으로 cis,cis 이성질체 38 (225 ㎎, 19%)을 백색 결정으로 수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 3.65 (s, 9H), 2.74 (d, J = 13.4 Hz, 3H), 1.21 (s, 9H), 0.97 (d, J = 14.8 Hz, 3H) ppm. HRMS (EI): C15H24O6 m/z 계산치 [M]+ 300.1567; 실측치 300.1565.
cis , cis -1,3,5- 트리메틸사이클로헥산 -1,3,5- 트리카르복시산 39
트리메틸 cis,cis-1,3,5-트리메틸사이클로헥산-1,3,5-트리카르복실레이트 38 (220 ㎎, 0.73 mmol, 1 eq.)을 메탄올 (3.0 ㎖)에 용해하였다. 물 (2.0 ㎖) 중의 리튬 하이드록사이드 일수화물 (369 ㎎, 6.59 mmol, 9 eq.) 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 rt에서 밤새 교반하였다. 메탄올을 RVE에서 증발시켜 제거하였다. 용액을 얼음조에서 냉각시키고, 진한 HCl을 사용해 pH 1로 적정하였다. 즉시 백색 석출물이 형성되었으며, 이를 흡인 여과에 의해 수집해 39 (60 ㎎, 32%)를 수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 11.96 (br s, 3H), 2.52 (d, 3H, 일부 용매 신호와 중첩), 1.20 (d, J = 14.7 Hz, 3H), 1.19 (s, 9H) ppm.
헥사키스 (3- 메틸헥실 ) cis , cis -7,7',7'',7''',7'''',7'''''-((((1,3,5-트리메틸사이클로헥산-1,3,5-트리카르보닐)트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일))트리스(아잔트리틸))헥사헵타노에이트 40
티오닐클로라이드 (0.50 ㎖) 및 DMF (2 ㎕)를 cis,cis-1,3,5-트리메틸사이클로헥산-1,3,5-트리카르복시산 39 (34 ㎎, 0.13 mmol)에 첨가하여, 현탁물을 밀폐된 바이얼에 넣어 밤새 70℃에서 교반하였다. 과량의 SOCl2를 드라이 질소 스트림을 이용해 발산시키고, 잔류물을 (10분간) 진공 건조한 다음 rt로 냉각시켜 잔류물을 무수 TCE (0.5 ㎖)에 용해하였다. 그 후, 무수 TCE (1.00 ㎖) 중의 아민 22 (337 ㎎, 0.59 mmol, 4.5 eq.) 및 DIPEA (229 ㎕, 1.32 mmol, 10 eq.) 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 15분간 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (4 g)에 흡착시키고, 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (40 g, 용출: 선형적인 D1 농도 구배 / DCM, 0-30%), 표적 화합물 40 (6 ㎎, 5%; R f 0.26 / D4, 닌하이드린에 의해 가시화)을 점성의 옅은 노란색 오일로 수득하였다. HRMS (MALDI): C114H216N6O15 m/z 계산치 [M + H]+ 1910.6396; 실측치 1910.6368.
실시예 14
헥사 (옥탄-2-일) cis , cis -6,6',6'',6''',6'''',6'''''-((((1,3,5-트리메틸사이클로헥산-1,3,5-트리카르보닐) 트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일) )트리스(아잔트리틸))헥사헥사노에이트 41 및 cis , cis -3,5-비스((6-(비스(6-(옥탄-2-일옥시)-6-옥소헥실)아미노)헥실)카바모일)-1,3,5-트리메틸사이클로헥산-1-카르복시산 42
티오닐클로라이드 (0.50 ㎖) 및 DMF (2 ㎕)를 39 (28 ㎎, 0.11 mmol)에 첨가하여, 현탁물을 밀폐된 바이얼에 넣어 2시간 동안 70℃에서 교반하였다. 과량의 SOCl2를 드라이 질소 스트림을 이용해 발산시키고, 잔류물을 (10분간) 진공 건조한 다음 rt로 냉각시켜 잔류물을 무수 TCE (0.25 ㎖)에 용해하였다. 그 후, 무수 TCE (0.75 ㎖) 중의 아민 18 (278 ㎎, 0.49 mmol, 4.5 eq.) 및 DIPEA (180 ㎕, 1.08 mmol, 10 eq.) 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 15분간 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (4 g)에 흡착시키고, 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (40 g, 용출: 선형적인 D1 농도 구배 / DCM, 0-30%), 표적 화합물 41 (49 ㎎, 24%; R f 0.30 / D4, 닌하이드린에 의해 가시화)을 점성의 옅은 노란색 오일로 수득하고, 화합물 42 (52 ㎎, 45%; R f 0.28 in D4, 닌하이드린에 의해 가시화)를 옅은 노란색 오일로 수득하였다.
41 1 H NMR (600 MHz, CDCl3): δ = 7.98, 4.88, 3.12, 2.88, 2.75, 2.68, 2.27, 1.64, 1.56, 1.46, 1.45, 1.28, 1.27, 1.26, 1.23, 1.19, 1.12, 0.87 ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 184.26, 177.45, 173.06, 70.96, 52.45, 51.68, 43.03, 43.00, 42.38, 38.83, 35.92, 34.43, 34.17, 33.21, 31.72, 29.08, 28.95, 22.56, 19.99, 14.05 ppm. HRMS (MALDI): C114H216N6O15 m/z 계산치 [M + H]+ 1910.6396; 실측치 1910.6364.
42 HRMS (MALDI): C80H150N4O12 m/z 계산치 [M + H]+ 1360.1323; 실측치 1360.1875.
실시예 15
트리메틸 cis , cis -1,3,5- 트리스((벤질옥시)메틸)사이클로헥산 -1,3,5- 트리카르복실레이트 43
다이이소프로필아민을 사용하기 전 소듐 하이드록사이드로부터 증류하였다. 무수 다이에틸 에테르 (30 ㎖) 중의 다이이소프로필아민 (6.56 ㎖, 46.5 mmol, 4 eq.) 용액을 2.0 M n-부틸리튬 (23.2 ㎖, 46.5 mmol, 4 eq.) 용액에 0℃에서 점적 첨가하여, 리튬 다이이소프로필아미드를 인 시추로 수득하였다. 무수 다이에틸 에테르 (30 ㎖) 중의 트리메틸 사이클로헥산-1,3,5-트리카르복실레이트 37 (3.00 g, 11.6 mmol; 1 equiv.) 용액을 반응 용액에 0℃에서 점적 첨가하여, 혼합물을 2시간 동안 0℃에서 교반하였다. 벤질 클로로메틸 에테르 (9.69 ㎖, 69.7 mmol, 6 eq.)를 첨가하고, 밤새 rt에서 계속 교반하였다. 생산물을 물, 1 M HCl 및 브린으로 헹구고, 소듐 설페이트 상에서 건조하였으며, 이를 S2 소결 유리를 통해 여과한 다음 용매를 RVE에서 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (200 g, 용출: 선형적인 에틸 아세테이트 농도 구배 / 사이클로헥산, 0-20%). 다이에틸 에테르 (3.0 ㎖) 및 펜탄 (18.0 ㎖) 혼합물에서 분별 결정을 통해 cis,cis 이성질체 43 (1.52 ㎎, 22%)을 백색 결정으로 수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.36-7.22 (m, 15H, 용매 신호와 일부 중첩), 4.46 (s, 6H), 3.69 (s, 9H), 3.39 (s, 6H), 2.68 (d, J = 14.2 Hz, 3H), 1.18 (d, J = 14.9 Hz, 3H) ppm. HRMS (ESI): C36H42O9 m/z 계산치 [M + Na]+ 641.2721; 실측치 641.2719.
cis , cis -1,3,5- 트리스((벤질옥시)메틸)사이클로헥산 -1,3,5- 트리카르복시산 44
화합물 43 (250 ㎎, 0.40 mmol, 1 eq.)을 메탄올 (4.0 ㎖)에 용해하였다. 물 (2.0 ㎖) 중의 리튬 하이드록사이드 일수화물 (152 ㎎, 3.64 mmol, 9 eq.) 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 rt에서 밤새 교반하였다. 메탄올을 RVE에서 증발시켜 제거하였다. 용액을 얼음조에서 냉각시키고, 진한 HCl을 사용해 pH 1로 적정하였다. 즉시 백색 석출물이 형성되었으며 이를 흡인 여과에 의해 수집해 44 (200 ㎎, 86%)를 수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 12.12 (br s, 3H), 7.37-7.18 (m, 15H), 4.39 (s, 6H), 3.39 (s, 6H), 2.36 (d, J = 14.9 Hz, 3H), ppm.
테트라 (옥탄-2-일) cis , cis -6,6',6'',6'''-((((1,3,5-트리스((벤질옥시)메틸)-5-(비스(6-(옥탄-2-일옥시)-6-옥소헥실)카바모일)사이클로헥산-1,3-다이카르보닐)비스(아잔다이일))비스(헥산-6,1-다이일)) 비스 ( 아잔트리틸 )) 테트라헥사노에이 트 45 및 cis , cis -1,3,5- 트리스 (( 벤질옥시 ) 메틸 )-3,5- 비스((6-(비스(6-(옥탄-2-일옥시) -6-옥소헥실)아미노)헥실)카바모일)사이클로헥산-1-카르복시산 46
티오닐클로라이드 (0.50 ㎖) 및 DMF (2 ㎕)를 44 (100 ㎎, 0.17 mmol, 1 eq.)에 첨가하고, 현탁물을 밀폐된 바이얼에 넣어 밤새 70℃에서 교반하였다. 과량의 SOCl2를 드라이 질소 스트림을 이용해 발산시키고, 잔류물을 (10분간) 진공 건조한 다음 rt로 냉각시켜 잔류물을 무수 TCE (0.5 ㎖)에 용해하였다. 그 후, 무수 TCE (1.50 ㎖) 중의 아민 18 (444 ㎎, 0.78 mmol, 4.5 eq.) 및 DIPEA (302 ㎕, 1.73 mmol, 10 eq.) 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 15분간 rt에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (4 g)에 흡착시키고, 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (80 g, 용출: 선형적인 D1 농도 구배 / DCM, 0-20%), 표적 화합물 45 (46 ㎎, 12%; R f 0.46 / D4, 닌하이드린에 의해 가시화)를 점성의 옅은 노란색 오일로 수득하였으며, 화합물 46 (37 ㎎, 13%; R f 0.39 / D4, 닌하이드린에 의해 가시화)을 옅은 노란색 오일로 수득하였다.
45 HRMS (MALDI): C135H234N6O18 m/z 계산치 [M + H]+ 2228.7652; 실측치 2228.7702.
46 HRMS (MALDI): C101H168N4O15 m/z 계산치 [M]+ 1677.2506; 실측치 1677.2479.
헥사 (옥탄-2-일) cis , cis -6,6',6'',6''',6'''',6'''''-((((1,3,5-트리스(하이드록시메틸)사이클로헥산-1,3,5-트리카르보닐)트리스(아잔다이일))트리스(헥산-6,1-다이일))트리스(아잔트리틸))헥사헥사노에이트 47
35에 대해 기술된 절차에 따라, 표적 화합물 47을 리피도이드 45 (20 ㎎, 0.008 mmol, 1 eq.), 팔라듐/탄소 (10% Pd/C, 19 ㎎, 0.018 mmol, 2 eq.) 및 아세트산 (80 ㎕, 1.73 mmol)으로부터 제조하여, 리피도이드 47 (5 ㎎, 30%)을 걸쭉한 옅은 노란색 오일로 수득하였다. HRMS (MALDI): C114H216N6O18 m/z 계산치 [M + H]+ 1958.6244; 실측치 1958.6314.
cis , cis -3,5- 비스 ((6-( 비스(6-(옥탄-2-일옥시)-6-옥소헥실)아미노 )헥실)카바모일)-1,3,5-트리스(하이드록시메틸)사이클로헥산-1-카르복시산 48
35에 대해 기술된 절차에 따라, 표적 화합물 48을 리피도이드 46 (15 ㎎, 0.009 mmol, 1 eq.), 팔라듐/탄소 (19 ㎎, 0.018 mmol, 2 eq.) 및 아세트산 (80 ㎕, 1.73 mmol)으로부터 제조하여, 리피도이드 48 (7 ㎎, 59%)을 걸쭉한 옅은 노란색 오일로 수득하였다. HRMS (MALDI): C80H150N4O15 m/z 계산치 [M]+ 1407.1098; 실측치 1407.1042.
실시예 16
테트라 (옥탄-2-일) cis , cis -6,6',6'',6'''-((((1,3,5- 트리스 (( 벤질옥시 ) 메틸 )-5-(피롤리딘-1-카르보닐) 사이클로헥산 -1,3- 다이카르보닐 ) 비스 ( 아잔다이일 ))비 스(헥산-6,1-다이일) )비스(아잔트리틸))테트라헥사노에이트 49
화합물 44 (100 ㎎, 0.17 mmol, 1 eq.)를 무수 DMF (1.0 ㎖) 및 DMAP (3 ㎎, 0.02 mmol, 0.15 eq.)에 용해하고, DIPEA (450 ㎕, 2.60 mmol, 10 eq.)를 첨가하였다. 무수 DMF (1.0 ㎖) 중의 PyBroP (363 ㎎, 0.78 mmol, 4.5 eq.) 용액을 점적 첨가하여 반응 혼합물을 1.5시간 동안 rt에서 아르곤 분위기 하에 교반하였다. 그 후, 무수 DMF (1.0 ㎖) 중의 아민 18 (444 ㎎, 0.78 mmol, 4.5 eq.) 용액을 첨가하여, 반응 혼합물을 1시간 동안 rt에서 아르곤 분위기 하에 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (4 g)에 흡착시키고, 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 (80 g, 용출: 선형적인 D1 농도 구배 / DCM, 0-30%), 표적 화합물 49 (146 ㎎, 51%; R f 0.58 / D3, 닌하이드린에 의해 가시화)를 옅은 노란색 오일로 수득하였다. HRMS (MALDI): C105H175N5O14 m/z 계산치 [M + Na]+ 1753.3028; 실측치 1753.3044.
테트라 (옥탄-2-일) cis , cis -6,6',6'',6'''-((((1,3,5-트리스(하이드록시메틸)-5-(피롤리딘-1-카르보닐)사이클로헥산-1,3-다이카르보닐)비스(아잔다이일))비스(헥산-6,1-다이일))비스(아잔트리틸))테트라헥사노에이트 50
35에 대해 기술된 절차에 따라, 표적 화합물 50을 리피도이드 49 (70 ㎎, 0.04 mmol, 1 eq.), 팔라듐/탄소 (86 ㎎, 0.40 mmol, 2 eq.) 및 아세트산 (80 ㎕, 1.73 mmol)으로부터 제조하여, 리피도이드 50 (57 ㎎, 96%)을 걸쭉한 옅은 노란색 오일로 수득하였다. HRMS (MALDI): C84H157N5O14 m/z 계산치 [M + Na]+ 1483.1619; 실측치 1483.1656.
실시예 17
cis , cis - N 1 , N 7 - 비스 (6-( 다이도데실아미노 ) 헥실 )-5,7- 비스 ( 하이드록시메틸 )-4-옥소-3-옥사바이사이클로 [3.3. 1]노난 -1,7- 다이카르복사미드 52
PyBroP (0.323 g, 0.694 mmol, 5 eq.), N,N-다이이소프로필에틸아민 (DIPEA, 0.483 ㎖, 2.77 mmol, 20 eq.) 및 아민 10 (0.314 g, 0.694 mmol, 5 eq.)을 트리산 44 (80 ㎎, 0.139 mmol) 중의 무수 TCE (4 ㎖) 용액에 첨가하여, 반응 혼합물을 rt에서 12시간 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (10 g)에 흡착시킨 다음 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 DCM 중의 선형적인 D1 농도 구배 (20-80%)를 적용해 정제하였다. 다이아미드 51 (16 ㎎, 8.0%; R f 0.56 / 이동상 D3, 닌하이드린으로 검출)을 점성의 노란색 오일 형태로 수득하였다.
팔라듐/차콜 (10%)을 메탄올-에틸 아세테이트 혼합물 (10+10 ㎖) 중의 다이아미드 51 용액에 아르곤 분위기 하에 첨가하였다. 이후, 반응 혼합물을 수소 분위기 하에 rt에서 12시간 동안 교반하였다. 현탁물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 증발시켜, 리피도이드 52를 무색 오일로 수득하였다 (5.5 ㎎, 42.9%, R f 0.61 / 이동상 D3, 닌하이드린으로 검출) HRMS (MALDI): C72H141N4O6 m/z 계산치 [M + H]+ 1158.0846; 실측치 1158.0822.
실시예 18
6-( 다이도데실아미노 ) 헥산산 53
칼슘 클로라이드 건조관 및 자기 교반기가 장착된 500 ㎖ 둥근 바닥형 플라스크에 ACN (150 ㎖) 중의 6-아미노헥산산 (2.00 g, 15.2 mmol) 용액과 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드 (12.93 g, 61.0 mmol, 4 eq.)를 첨가하였다. 강하게 교반하면서, n-도데실알데하이드 (10.16 ㎖, 45.7 mmol, 3 eq.)를 주사기를 이용해 고무 셉텀을 통해 천천히 첨가하고, 형성되는 백색 현탁물을 5일간 실온에서 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (25 g)에 흡착시킨 다음 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 DCM 중의 선형적인 D1 농도 구배 (0-100%)를 적용해 정제하였다. 아미노산 53 (3.203 g, 44.9%)을 무색 오일로 수득하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.88-2.84 (m, 6H), 2.24 (t, 2H), 1.62-1.72 (m, 2H), 1.42-1.26 (m, 44H) 0.89 (t, 6H) ppm. 13 C NMR (150.9 MHz, CDCl3): δ = 178.65, 51.37, 36.22, 31.90, 29.61-29.20, 27.07, 26.74, 25.45, 23.78, 23.31, 22.67, 14.10 ppm. HRMS (ESI): C30H60O2N에 대한 m/z 계산치 [M - H]- 466.46295; 실측치 466.46286.
cis , cis -1,3,5- 트리아미노사이클로헥산 트리하이드로브로마이드 55
Bowen, T. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 6, No. 7, 1996, 807-810에 따르고 일부 수정하여 합성을 수행하였다. cis,cis-l,3,5-사이클로헥산트리카르복시산 (2.0 g, 9.25 mmol)을 톨루엔 (75 ㎖)에 현탁하고, DIPEA (4.83 ㎖, 27.75 mmol, 3 eq.)를 첨가한 다음 다이페닐 포스포릴 아지드 (5.97 ㎖, 27.75 mmol, 3 eq.)를 첨가하였다. 혼합물을 0.5시간 동안 rt에서 교반한 다음 90℃까지 0.5시간 동안 가열하였다. 벤질 알코올 (3.20 ㎖, 30.81 mmol, 3.33 eq.)을 첨가하여 용액을 90℃까지 18시간 동안 가열하였다. rt로 냉각한 후, 진공 여과를 통해 생산물을 수집하고, 이를 차가운 톨루엔 최소량으로 헹군 다음 진공 건조하여 cis,cis-1,3,5-트리(N-벤질옥시카르보닐)사이클로헥산 54 0.386 g (7.85%)을 수득하였다.
화합물 54 (0.386 g, 0.726 mmol)를 아세트산 (5 ㎖) 중의 33% HBr 용액에 현탁하여, 12시간 동안 rt에서 교반하였다. 이후, 노란색 현탁물을 다이에틸 에테르 (20 ㎖)로 희석하고, 이를 S2 소결 유리를 통해 여과하여, 트리하이드로브로마이드 55을 노란색 고형물로 수득하였다 (0.248 g, 91.8%).
cis , cis - N , N' , N'' - (사이클로헥산-1,3,5-트리일)트리스 (6-( 다이도데실아미노 )헥산아미드) 56
PyBroP (0.752 g, 1.61 mmol, 6 eq.), DIPEA (0.937 ㎖, 5.38 mmol, 20 eq.) 및 산 53 (0.755 g, 1.61 mmol, 6 eq.)을 무수 TCE (3 ㎖) 및 무수 DMF (3 ㎖) 혼합물 중의 트리아민 염 55 (0.100 g, 0.269 mmol) 용액에 첨가하여, 반응 혼합물을 rt에서 12시간 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 실리카 (10 g)에 흡착시킨 다음 용매를 진공 증발시켰다. 조산물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 DCM 중의 선형적인 D1 농도 구배 (20-30%)를 적용해 정제하였다. 리피도이드 56 (113 ㎎, 28.4%; R f 0.65/이동상 D2, 닌하이드린으로 검출)을 점성의 노란색 오일 형태로 수득하였다. HRMS (ESI): C96H193O6N3에 대한 m/z 계산치 [M + H]+ 1478.5134; 실측치 1478.5162.
실시예 19
형질감염 시약의 제조
표 1 - 표 4에 열거된 각각의 구성성분들을 혼합해 시약을 준비하였다. 표들에는 형질감염 시약에서의 최종 몰 농도가 기재되어 있다. A01 내지 A16, A21, A22, A24, A28 및 A29를 제조하는데 개개 구성성분은 99.7% 에탄올 (v/v) 중의 5 mM 원액 용액으로 이용하였다. 리피도이드, DOPE 및 DMG-PEG2000의 5 mM 원액과 콜레스테롤의 10 mM 원액은 모두 99.7% 에탄올 (v/v) 중에 준비하여, A17 내지 A20, A23 및 A25 내지 A27을 제조하는데 사용하였다. DOPE-Cy5 원액은 농도 0.79 mM이었으며, 클로로포름에서 준비하였다. TT3는 본 발명에서 비교 용도로 이용한, WO 2016/187531에 따른 지질이다. 기준 D- Lin -MC3-DMA 지질 (MedChemExpress Europe) 역시 비교 목적으로 이용하였다.
표 1. 형질감염 시약 A01-A06의 비교.
표 2. 형질감염 시약 A07-A12의 비교.
표 3. 형질감염 시약 A13-A22의 비교.
표 4. 형질감염 시약 A23-A29의 비교.
실시예 20
핵산을 함유한 지질 나노입자 ( LNP ) 제조
siRNA를 함유한 LNP (siRNA-LNP)를 다음과 같이 제조하였다: 실시예 19에서 제조한 A01-A06 형질감염 시약 각 용액 300 ㎕를, 10 mM 사이트레이트 완충제 (pH 3.0) 300 ㎕ 중의 1.2 nmol siRNA (카탈로그 번호 4392420, Ambion) 용액과, 샘플용 유입구 2개와 유출구 1개를 가진 "Y" 미세유체 기구를 사용해, 혼합하였다. 직선형 펌프를 고정된 유속 300 ㎕/min으로 사용해 지질 혼합물 및 siRNA 용액을 각각의 유입구를 통해 각각 분리하여 주입하였다. 형성된 나노입자 용액 600 ㎕를 수집한 다음 즉시 PBS 600 ㎕를 첨가해 희석하였으며; 이로써 형질감염 시약 A01-A06으로부터 B01-B06으로 명명된 상응하는 나노입자 샘플이 제조되었다.
플라스미드 pmKate2-C (Evrogen)로부터 프라이머 (5'-ATCAACATATGGTGAGCGAGCTG-3' (서열번호 1); 5'-AAGAATTCCTATCATCTGTGCCCCAG-3' (서열번호 2))를 이용해 형광 단백질 mKate2를 코딩하는 DNA를 증폭시킨 후 pET24a 벡터 (Invitrogen)에 T7 프로모터 하에 클로닝하였다. mKate2를 코딩하는 메신저 RNA (mRNA)를 Ampliscribe T7-Flash 전사 키트 (Lucigen)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용해 시험관내에서 전사하였다. RNA 캡 유사체 ARCA (Jena Bioscience)를 시험관내 전사 반응물에 첨가하고, 폴리(A) 중합효소 (New England Biolabs)를 표준 프로토콜에 따라 적용해 폴리(A) 말단을 합성하였다.
mRNA를 함유한 LNP (mRNA-LNP)를 다음과 같이 제조하였다: 실시예 19에서 제조한 A07-A29 형질감염 시약 각 용액 300 ㎕를, 10 mM 사이트레이트 완충제 (pH 3.0) 300 ㎕ 중의 mRNA 120 ㎍ 용액과 혼합한 다음 siRNA-LNP와 유사한 방식으로 제조하였다. 이로써 형질감염 시약 A07-A29로부터 B07-B29로 명명된 상응하는 나노입자 샘플을 제조하였다. 형질감염 시약 A02 및 A05로부터 각각 B08a 및 B11a로 명명된 나노입자 샘플을 제조하였다.
LNP 샘플 (B01-B29)을 각각 3세트로 제조하였다. 신선하게 제조한 LNP의 유체역학적 직경을 산란각 173°에서 동적 광 산란 (NanoZS Zetasizer, Malvern, Worcestershire, UK)을 이용해 25℃에서 측정하였다. siRNA-LNP의 유체역학적 직경은 67 내지 110 nm 범위였으며, mRNA-LNP의 유체역학적 직경은 82 내지 288 nm 범위였다 (표 5). 이 형태로 입자를 후속적인 생물학적 검사에 이용하였다.
표 5. 동적 광 산란에 의해 측정한, 표준편차를 비롯한 LNP의 유체역학적 직경.
실시예 21
siRNA 및 mRNA의 지질 나노입자에의 병합 효율
(티로실-DNA 포스포다이에스테라제 (TDP2)를 코딩하는 mRNA의 분해를 유발하는 siRNA의, 실시예 20에서 제조한 siRNA-LNP B01-B06에의 패키징 효율을 Qubit microRNA 분석 키트 (Life Technologies)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용해 확인하였다. 실시예 20에서 제조한 mRNA-LNP B07-B29에의 (형광 단백질 mKate2를 코딩하는) mRNA 패키징 효율을 Qubit RNA HS 분석 키트 (Life Technologies)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용해 확인하였다. 병합 효율은, 나노입자 용액에서 자유롭게 이용가능한 siRNA 및 mRNA의 농도를, 나노입자로부터 이의 분해 후 방출되는 siRNA 및 mRNA의 농도를 비교함으로써, 결정하였다. LNP는 Triton X-100을 함유한 완충제 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.1 mM EDTA, 2% Triton X-100)로 분해하였다. siRNA의 높은 패키징 효율이 76 내지 91%로 입증되었다. mRNA 패키징 효율은 60 내지 96% 범위였다 (표 6).
표 6. 3세트로부터 수득한 표준편차를 비롯하여, 티로실-DNA 포스포다이에스테라제 2 (TDP2)에 대한 siRNA 및 형광 단백질 mKate2를 코딩하는 mRNA의 LNP에의 패키징 효율.
실시예 22
LNP의 세포성 독성
SV40 거대 T 항원을 발현하는 배아 신장 세포로부터 유래한 인간 세포주 (HEK293T) 및 인간 간세포 암종 세포주 (HepG2)를 10% 소 태아 혈청 (FBS)이 첨가된 둘베코의 변형된 배지 (DMEM) 하에 96웰 플레이트 (웰당 배양 배지 100 ㎕ 당 세포 5 x 104개)에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 세포에 실시예 20에서 3세트로 제조한 LNP B07-B12 2 ㎕ (웰에서 모든 지질 성분들의 최종 총 농도는 20 μM임) 또는 LNP 10 ㎕ (웰에서 모든 지질 성분들의 최종 총 농도는 100 μM임)를 형질감염시킨 후, 24시간 인큐베이션하였다. LNP 세포독성을 CellTiterGlo 2.0 세포 생존성 분석 (Promega, USA)으로 분석하였다. 세포 생존성은 비-형질감염 세포 (대조군)에 대해 표준화하였다. 그 결과를 표 7 및 8에 요약 개시한다.
이용한 세포주 둘다에서 신생 LNP들은 TT3 지질과의 100 μM 혼합물과 비교해 현저한 독성을 나타내지 않았으며, HEK293T 및 HepG2 세포의 생존성은 불과 27 및 15% 감소하였다 (표 8).
표 7. 개별 세포주 타입들에서 20 μM 형질감염 혼합물 B07-B12를 첨가한 후 세포 생존성 (%)으로 나타낸 LNP 세포독성.
표 8. 개별 세포주 타입들에서 100 μM 형질감염 혼합물 B07-B12를 첨가한 후 세포 생존성 (%)으로 나타낸 LNP 세포독성.
실시예 23
신생 LNP를 이용한 siRNA의 시험관내 형질감염
티로실-DNA 포스포다이에스테라제 2 (TDP2)를 코딩하는 mRNA의 분해를 유발하는 소형 간섭 RNA (siRNA, 카탈로그 번호 4392420, Ambion)를 함유한 siRNA-LNP 입자를 실시예 20에 따라 제조하였다. 리포펙타민 RNAiMax (Invitrogen)를 siRNA 형질감염을 위한 특수 대조군 형질감염 시약으로 사용하였다. 인간 세포주 HEK293T 및 이용가능한 형질감염 시약을 이용해 형질감염하기 매우 어려운 인간 다발성 골수종으로부터 유래한 세포주를 siRNA-LNP 넉-다운에 이용하였다 (Brito J.L.R., Brown N., Morgan G.J. (2010) The transfection of siRNAs in Multiple Myeloma Cell Lines. In: Min WP., Ichim T. (eds) RNA Interference. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 623. Humana Press). 세포를 10% FBS 첨가된 DMEM 배지 하에 96웰 플레이트 (웰당 배양 배지 100 ㎕ 당 세포 5 x 104개)에서 37℃ 및 5% CO2 하에 배양하였다. 세포에 siRNA-LNP 2 ㎕ (웰에서 모든 지질 성분들의 최종 총 농도 20 μM 및 최종 siRNA 농도 16 nM)를 형질감염시킨 후, 24시간 인큐베이션하였다. 형질감염은 생물학적 트리플리케이트로 수행하였다. RNA를 RNAeasy Plus Micro Kit (Qiagen)를 사용해 단리하였다. cDNA를 TATAA GrandScript cDNA Supermix (TATAAbiocenter)를 제조사의 권고안에 따라 사용해 제조하였다. 정량적인 RT-PCR을 LightCycler 480 (Roche Life Science)에서 수행하였다. TDP2를 코딩하는 mRNA 증폭용 프라이머는 다음과 같다: 5'-CGAGAGGAGGGTCTCAAAGAG-3' (서열번호 3) 및 5'-ATTTCGGGAAGGCTGCTGTC-3' (서열번호 4). GAPDH를 코딩하는 mRNA를 이용해 데이터를 표준화하였다 (프라이머: 5'-AATCCCATCACCATCTTCCA-3' (서열번호 5) 및 5'-TGGACTCCACGACGTACTCA-3' (서열번호 6)).
이러한 모든 경우들에, 신생 siRNA-LNP들은 시판 형질감염 시약 RNAiMax와 비교해 세포에서 TDP2 mRNA 수준을 현저하게 감소시켰다. HEK293T 세포주에서, 신생 LNP B02-B05는 RNAiMax에 비해 효율이 거의 3배 높았다. OPM-2 골수종 세포주에서, B03는 mRNA 발현을 시판 siRNA 형질감염 시약에 비해 13배 우수하게 감소시켰다 (표 9).
표 9. HEK293T 및 OPM-2 세포주에서 시판 형질감염 시약 RNAiMax 대비 신생 siRNA-LNP (B01-B06)에 의한 세포에서 내인성으로 발현되는 TDP2 mRNA의 감소. 스튜던트 비-대응 t-검정으로 통계학적으로 분석하였다. P 값은 리포펙타민 RNAiMax 대조군 형질감염 혼합물을 기반으로 하였으며; p 값 <0.001은 문자 "a"로, p 값 <0.05는 문자 "c"로 표시하였다.
실시예 24
시험관내 신생 LNP를 이용한 mRNA 형질감염
거대 SV40 T 항원을 발현하는 배아 신장 세포로부터 유래한 인간 세포주 (HEK293T), 간 암종 세포 (HepG2) 및 인간 골육종-유래 세포주 (U2OS)를 10% 소 태아 혈청 (FBS)이 첨가된 둘베코의 변형된 배지 (DMEM) 하에 96웰 플레이트 (웰당 배양 배지 100 ㎕ 당 세포 5 x 104개)로 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 세포에, 실시예 20에서 제조한 mRNA-LNP B07 - B12 2 ㎕를 형질감염한 다음 24시간 동안 인큐베이션하였다. 웰에서 지질 성분들의 최종 총 농도는 20 μM였으며, 형광 단백질 mKate2를 코딩하는 mRNA의 양은 100 ng이었다. 리포펙타민® 2000을 대조군 형질감염 시약으로 이용하였다. 형질감염을 생물학적 레플리케이트 3개로 수행하였으며, 각 생물학적 레플리케이트에는 기술적 레플리케이트 3개를 이용하였다. Cy5 및 mKate2 형광성을 BD LSR Fortessa 세포측정기를 사용해 검출하고, 세포내 LNP 도입을 의미하는 Cy5 형광성 (표 10), 형광 단백질 mKate2를 발현하는 세포의 % 및 mKate2의 형광 강도 (표 11)를 계산하였다. 형광 강도에 대한 데이터를 시판 형질감염 시약 리포펙타민® 2000에 대해 표준화하였다. Cy5 형광성에 따르면, 모든 LNP가 90%를 초과하는 효율로 세포에 유입되었음이 명백하였다 (표 10). 아울러, 신생 LNP B11은 형질감염된 mRNA로부터 형광성 mKate2 단백질을, 리포펙타민® 2000 형질감염 대조군으로 형질감염된 세포와 비교해, 2.13배 더 높게 생산하였다 (표 11).
표 10. HEK293T 및 HepG2 세포주에서 Cy5 양성 세포의 %로 나타낸 신생 mRNA-LNP (B07-B12)의 형질감염 효율. 형질감염 혼합물은 세포로의 LNP 도입을 관찰할 수 있게 하는 형광 염료 Cy5로 표지된 지질을 함유한다.
표 11. U2OS 세포주에서 입자를 이용해 형질감염한 mRNA로부터 mKate2의 형광 강도 및 mKate2 형광 단백질을 발현하는 세포의 %로 나타낸 신생 mRNA-LNP의 형질감염 효율. 스튜던트 비-대응 t-검정으로 통계학적으로 분석하였다. P 값은 대조군 형질감염 혼합물 리포펙타민 2000에 대한 것이며; p 값 <0.001은 문자 "a"로 표시하였다.
실시예 25
시험관내 신생 LNP를 이용한 mRNA 형질감염
거대 SV40T 항원을 발현하는 배아 신장 세포로부터 유래한 인간 세포주 (HEK293T)를 10% 소 태아 혈청 (FBS)이 첨가된 둘베코의 변형된 배지 (DMEM) 하에 96웰 플레이트 (2.5 x 104 세포 / 배양 배지 100 ㎕ / 웰)에서 37℃ 및 5% CO2 하에 배양하였다. 실시예 20에서 제조한 mRNA-LNP B08a, B11a, B13 - B18, B20 - B25 및 B29를 세포에 형질감염한 다음 24시간 동안 인큐베이션하였다. 웰에서 전제 지질 성분들의 최종 총 농도는 20 μM였으며, 형광 단백질 mKate2를 코딩하는 mRNA의 양은 100 ng이었다. 기준 D-Lin-MC3-DMA 지질을 함유한 B29 LNP를 대조군으로 사용하였다. 형질감염을 트리플리케이트로 수행하였다. 형광 단백질 mKate2를 발현하는 세포의 % 및 mKate2의 형광 강도 (표 12)를 BD LSR Fortessa 세포측정기에서 파장 561-610/20 nm 하에 분석하였다. 형광 강도에 대한 데이터는 기준 D-Lin-MC3-DMA 함유 LNP (B29)에 대해 표준화하였다. 기준 D-Lin-MC3-DMA LNP와 비교해 현저하게 증가된 형광 강도뿐 아니라 형질감염된 세포의 %가 현저하게 높은 것으로 입증된 바와 같이, 모든 신생 LNP가 HEK293T 세포에 보다 효율적으로 형질감염되었음이 분명하였다. 특히, 신생 LNP B22는 기준 D-Lin-MC3-DMA 지질을 함유한 B29 LNP로 형질감염된 세포와 비교해 형질감염된 mRNA로부터 mKate2 형광 단백질을 13.66배 더 많이 생산하였다 (표 12).
표 12. LNP에 의해 전달된 mRNA로부터 유래한 mKate2 형광 단백질을 발현하는 세포의 %로서 나타낸 HEK293T 세포에서 신생 mRNA-LNP의 형질감염 효율. 스튜던트 비-대응 t-검정으로 통계학적으로 분석하였다. P 값은 대조군 D-Lin-MC3-DMA (B29) LNP에 대한 것이며; p 값 <0.0001은 문자 "a"로, p <0.001은 "b"로, p <0.01은 "c"로 각각 표시하였다.
실시예 26
Cre -기반의 재조합을 통해 모니터링한 신생 mRNA - LNP의 형질감염 효율
글로벌 듀얼 Cre 리포터를 가진 마우스 모델로부터 유래한 마우스 배아 섬유모세포 세포 (MEF)(Mazumdar, M.D.: Genesis 2007, 45:593-605)를 96웰 플레이트에 (2.5 x 104 세포 / 배양 배지 100 ㎕ / 웰) 접종하여, 10% FBS 첨가된 DMEM에서 37℃ 및 5% CO2 하에 24시간 동안 배양하였다. Cre 재조합효소를 코딩하는 메신저 RNA (mRNA)를 실시예 20에서와 비슷한 방식으로 선형화된 플라스미드로부터 시험관내 제조한 다음, 다음과 같이 LNP에 패키징하였다: 형질감염 시약 A13 - A25, A02 및 A27 및 기준 D-Lin-MC3-DMA 지질을 비롯한 대조군 형질감염 시약 A29 샘플 300 ㎕와, 10 mM 사이트레이트 완충제 (pH 3.0) 300 ㎕ 중의 mRNA 120 ㎍을, 실시예 20에서와 비슷한 방식으로 미세유체 기구를 이용해 LNP로 조립하였다. 생성된 mRNA-LNP를 바로 PBS 600 ㎕에 희석하고; 상응하는 나노입자를 B31 - B43 (형질감염 시약 A13 - A25로부터 제조), 나노입자 B30 (형질감염 시약 A02로부터 제조), 나노입자 B44 (형질감염 시약 A27로부터 제조)로 표시하였으며, 마찬가지로, 형질감염 시약 A29로부터 기준 나노입자 B45를 제조하였다.
세포에, Cre 재조합 효소를 코딩하는 mRNA 100 ng을 운반하는 각각의 mRNA-LNP (웰에서 전제 지질 성분들의 최종 총 농도는 20 μM)를 형질감염시킨 후 48시간 동안 인큐베이션하였다. 기준 D-Lin-MC3-DMA 지질을 함유한 B45 LNP를 대조군으로 사용하였다. 형질감염은 4세트 (quadruplicate)로 수행하였다. GFP를 발현하는 세포의 %를 BD LSR Fortessa 세포측정기 (파장 488 - 530/30 nm)를 사용해 분석하였다. 재차, 기준 D-Lin-MC3-DMA LNP (B45)로 형질감염된 세포와 비교해 현저하게 더 높은 GFP 발현 세포 %에 의해 입증된 바와 같이, 모든 신생 LNP가 mT/mG 세포에 보다 효율적으로 형질감염되었음이 명백하였다. 흥미롭게도, GFP를 발현하는 세포의 %는 검사한 모든 신생 LNP들에서 95%보다 항상 높았지만 (B44 제외), 기준 D-Lin-MC3-DMA 지질을 함유한 LNP의 경우 재조합된 세포는 21%에 불과하였다 (표 13).
표 13. mT/mG 리포터 마우스 배아로부터 유래한 MEF에서 td Tomato를 GFP로 변환하는, 신생 Cre mRNA-LNP의 효율 비교. 스튜던트 비-대응 t-검정으로 통계학적으로 분석하였다. P 값은 대조군 D-Lin-MC3-DMA (B45) LNP에 대한 것이며; p 값 <0.0001은 문자 "a"로 표시한다.
실시예 27
생체내 신생 mRNA - LNP의 생체분포
Cre 재조합효소를 코딩하는 메신저 RNA (mRNA)를 선형화된 플라스미드로부터 실시예 20과 유사한 방식으로 시험관내에 준비하였으며, 다음과 같이 LNP에 패키징하였다: 형질감염 시약 A22 및 기준 지질 D-Lin-MC3-DMA를 함유한 대조군 형질감염 시약 A29의 샘플 300 ㎕과 10 mM 사이트레이트 완충제 (pH 3.0) 300 ㎕ 중의 mRNA 120 ㎍을 실시예 20에서의 유사한 방식으로 미세유체 기구를 이용해 LNP로 조립하였다. 형성된 mRNA-LNP를 바로 PBS 600 ㎕로 희석하여; 상응하는 B40으로 표시된 나노입자를 형질감염 시약 A22으로부터 제조하였다. 마찬가지로, B45로 표시된 기준 나노입자를 형질감염 시약 A29로부터 제조하였다. mRNA-LNP를 PBS에서 투석한 다음 여과하였다. 내독소 수준은 < 2 EU/ml이었다. mRNA-LNP (B40 및 B45)를, 성공적인 재조합을 분석할 수 있는 글로벌 듀얼 Cre 리포터와 함께 마우스 4마리에 각각의 경우에 2.0 ㎎ mRNA/kg 농도로 정맥내 투여하였다 (Mazumdar, M.D.: Genesis 2007, 45:593-605) (교배 BIOCEV, Vestec). Cre 재조합효소 mRNA를 운반하는 mRNA-LNP가 성공적으로 전달된 세포에서, 염색체 재조합 및 후속적인 막 레드 단백질 유전자 (소위 red tomato)의 삭제 및 막 그린 단백질 (GFP) 유전자의 전사 "착수 (turning on)"가 발생하였다. 비-입자 대조군 마우스 (non-particulate control mice)를 비롯한 마우스를 입자 적용 후 5일차에 희생시키고, 특정 장기 (간, 심장, 신장, 폐 및 비장)를 표준 프로토콜에 따라 조직학적으로 분석하였다. 조직학적 사진 분석에서 간내 B40 나노입자의 완전한 분포가 드러났으며, 이로써 레드 막 단백질을 발현하는 세포는 적용 후 5일차에 그린 막 단백질을 발현하는 세포로 50-80% 변환되었다. D-Lin-MC3-DMA 지질을 함유한 LNP B45의 경우, 변환율은 약 20%였다 (도 10).
게놈 DNA (gDNA) PCR 분석을 통해 mT/mG 마우스의 간에서 tdTomato/GFP 변환을 평가함으로써 조직학적 분석을 추가로 보완하였다. 간략하게는, 각각의 간 샘플에서 단리한 gDNA 주형 50 ng에 대해 다음과 같은 프라이머를 이용해 PCR 반응을 실시하였다: (5'-AACGTGCTGGTTATTGTGCTG-'3 (서열번호 7); 5'-AAGTCGTGCTGCTTCATGTG-'3 (서열번호 8)). 도 11에서, 간 샘플에서 수득한 gDNA PCR 증폭을 전기영동에 의해 분석한 바, tdTomato/tGFP 유전자 좌에서 활성 Cre 재조합효소의 경우 530 bp PCR 산물이 관찰되었으며, Cre 재조합이 발생하지 않은 경우에는 2943 bp (상위 밴드)에서 PCR 산물이 관찰되었다. 명명한 B40 mRNA-LNP는 검사한 마우스 4마리 모두에서 완전한 Cre 재조합을 보인 반면, 기준 LNP (B45)의 경우 검사한 마우스의 단 50%에서만 재조합이 이루어졌다.
실시예 28
생체내 신생 mRNA - LNP 효율
hEPO (인간 에리트로포에틴)를 코딩하는 메신저 RNA (mRNA)를 선형화된 플라스미드로부터 실시예 20과 유사한 방식으로 시험관내에 준비하였으며, 다음과 같이 LNP에 패키징하였다: 형질감염 시약 A23 또는 기준 지질 D-Lin-MC3-DMA를 함유한 대조군 형질감염 시약 A29의 샘플 300 ㎕과 10 mM 사이트레이트 완충제 (pH 3.0) 300 ㎕ 중의 mRNA 120 ㎍을 실시예 20에서와 유사한 방식으로 미세유체 기구를 이용해 LNP로 조립하였다. 형성된 mRNA-LNP를 바로 PBS 600 ㎕로 희석하여; 상응하는 B46으로 표시된 나노입자를 형질감염 시약 A23으로부터 제조하였다. 마찬가지로, B47로 표시된 기준 나노입자를 형질감염 시약 A29로부터 제조하였다. mRNA-LNP를 PBS에서 투석한 다음 여과하였다. 내독소 수준은 < 0.3 EU/ml이었다. mRNA-LNP (B46 및 B47)를, 성공적인 재조합을 분석할 수 있는 글로벌 듀얼 Cre 리포터와 함께 C57B1/6 마우스 (BIOCEV, Vestec) 3마리에 각 경우에 0.5 ㎎ mRNA/kg 농도로 정맥내 투여하였으며, 대조군 C57B1/6 마우스 3마리에는 PBS를 투여하였다. 투여 후 6시간 경과시 마우스 꼬리 정맥으로부터 채혈하여, 혈청 분리기 관에 넣어 실온에서 응고되게 두었다. 그런 후, 시험관을 7000 rpm에서 7분간 원심분리한 다음 혈청 샘플을 분액하여 분석하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. hEPO ELISA 분석 (Catalog #DEP00; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 제조사의 지침에 따라 이용해 hEPO 농도를 결정하였다. 혈액학적 프로파일을 표준화된 프로토콜을 이용해 결정하였다.
B46으로 명명된 나노입자는 대조군 B47 LNP와 비교해 투여 후 6시간 경과시 인간 EPO 단백질을 통계학적으로 유의하진 않았지만 더 많이 생산하였다. 중요한 점은, 신생 리피도이드 (B46)를 함유한 LNP는 대조군 B47 LNP와 대조적으로 혈액학적 프로파일을 변형하지 않았다는 것이다. 신생 LNP 투여 후 혈액 검사는 PBS 대조군과 비슷하게 유지되었다 (표 14).
표 14. 투여 후 6시간 경과시 신생 인간 EPO mRNA-LNP의 단백질 생산에서의 생체내 효율 비교.
실시예 29
생체내 신생 siRNA - LNP 효율
실시예 19에서 유래한 형질감염 시약 A02, A14, A16, A17, A22, A23 및 A29를 이용해, 각각 B48 - B54로 명명된 siRNA-LNP를, (여기서 siRNA는 콜레스테롤 수송 (카탈로그 번호 238055 Apob 마우스 siPOOL-40 키트, siTOOLs Biotech GmbH)에 참여하는 간세포-발현되는 유전자인 마우스 아포지단백질 B (ApoB) 유전자를 표적으로 함), 그리고 대안적으로 대조군 비-표적화된 siRNA-LNP (238055 Apob 마우스 siPOOL-40 키트에 동봉됨, siTOOLs Biotech GmbH)를 이용한 siRNA-LNP (B55 - B60)를, 실시예 20에 기술된 바와 같이, 조립하였다. 동적 광 산란에 의해 측정한 유체역학 직경은 103 nm 내지 154 nm 범위였으며, siRNA 풀의 패키징 효율은 59% 내지 99% 범위였다. siRNA-LNP를 PBS에 대해 투석하였다. 내독소 수준은 < 2 EU/ml이었다. 마우스는 안와후 채혈 (retroorbital bleed)을 통해 혈장을 수집하기 전 4시간 동안 금식시켰다. ApoB를 표적으로 하는 siRNA-LNP를 C57B1/6 마우스 (BIOCEV, Czech Center of Phenogenomics, Vestec) 3마리에 siRNA 농도 16 ㎍으로 정맥내 투여하였으며, 대조군 마우스 3마리에는 비-표적 siRNA-LNP 16 ㎍을 투여하고, 다른 3마리에는 PBS 대조군을 투여하였다. 마우스 모두 LNP 적용 후 2일차에 희생시켰다. 혈장내 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 LDL-C 수준을 Czech Center of Phenogenomics 사에서 표준화된 프로토콜에 따라 자동 시스템을 이용해 측정하였다.
ApoB 넉-다운에 의해 영향을 받는 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 LDL-C 등의 혈장 마커들에 대한 임상적인 생화학적 특징들이 대조군 동물과 비교해 현저하게 감소하였으며, 이는 새로운 LNP에 의해 ApoB siRNA가 간으로 효율적으로 전달되었음을 입증해준다 (표 15).
표 15. 간에서 효과적인 ApoB 넉-다운을 보여주는 혈장 마커들에 대한 임상적인 생화학적 분석. 스튜던트 비-대응 t-검정으로 통계학적으로 분석하였다. p1 값은 항상 PBS 주사한 대조군 마우스를 기준으로 하였으며; p2 값은 항상 대조군 비-표적화된 siRNA를 함유한 각각의 LNP (B55 - B60)가 투여된 마우스를 기준으로 하였으며; p 값 <0.0001은 "a"로 표시하고, p <0.001은 "b"로 표시하고, p <0.01은 "c"로 표시하고, p <0.05는 "d"로 표시하였다. 평가하지 않은 경우는 "n.e."로 표시하였다.
신생 siRNA-LNP의 독성을, 식염수-주사한 대조군 (PBS) 및 지질 D-Lin-MC3-DMA를 함유한 대조군 LNP (B54)과 비교해, 장기 부전 및 혈액학 프로파일을 나타내는, 혈장 마커들에 대해 임상적으로 생화학적으로 분석함으로써, 추가로 평가하였다. 특히, B49로 명명된 신생 siRNA-LNP가 대조군 B54 LNP와 비교해 더 나은 독성 프로파일을 나타내었다 (표 16).
표 16. 기준 지질 D-Lin-MC3-DMA를 함유한 대조군 siRNA-LNP (B54) 대비, B49로 명명된 신생 siRNA-LNP의 혈장 마커 및 혈액학 프로파일에 대한 임상적인 생화학적 분석. 스튜던트 비-대응 t-검정으로 통계학적으로 분석하였다. p1 값은 항상 PBS 주사한 대조군 마우스를 기준으로 하였으며; p2 값은 항상 대조군 B54 LNP를 투여한 마우스를 기준으로 하였으며; p <0.01은 "c"로 표시하고, p <0.05는 "d"로 표시하였다.
본 발명의 리피도이드를 함유한 형질감염 입자는 활성 NA를 전달하여 염색체 유전자 또는 유전자들의 침묵화 또는 활성화, 게놈 또는 트랜스크립톰을 편집하거나, 또는 형질감염 입자를 이용해 삽입된 NA에 의해 코딩된 단백질의 발현을 달성하기 위해, 기초 연구, 특히 세포 배양 또는 동물의 형질감염에 대한 기초 연구에 수많은 생물학적 용도로 이용 가능하다.
수의학 및 인간 의학에서, 식 I의 리피도이드를 함유한 형질감염 입자는 바람직하게는 치료학적 또는 예방학적 목적으로 활용할 수 있다. 치료학적 NA를 함유한 입자는 동물 또는 인간에 투여해, 염색체 유전자(들)를 침묵화하거나 또는 활성화하거나, 면역원을 침묵화 또는 활성화하거나, 신호전달 경로를 저해 또는 활성화하거나, 게놈 또는 트랜스크립톰을 편집하거나, 또는 NA-코딩된 단백질(들)의 발현을 구현할 수 있다.
식 I의 리피도이드 또는 형질감염제 또는 형질감염 입자는 의약제로서, 특히 유전자 요법을 위한 의약제로서 이용할 수 있으며, 악성 및/또는 유전자 장애를 치료하는데 이용하기 적합하다. 이는 또한 미용학적 또는 생물공학적 용도로 제형화할 수 있다.
<110> Ustav organicke chemie a biochemie AV CR, v.v.i. <120> Cyclohexane lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof <130> P1976PC00 <150> PY 2021-345 <151> 2021-07-19 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 1 atcaacatat ggtgagcgag ctg 23 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 2 aagaattcct atcatctgtg ccccag 26 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 3 cgagaggagg gtctcaaaga g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 4 atttcgggaa ggctgctgtc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 5 aatcccatca ccatcttcca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 6 tggactccac gacgtactca 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 7 aacgtgctgg ttattgtgct g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 8 aagtcgtgct gcttcatgtg 20

Claims (21)

  1. 일반식 (I)의 리피도이드 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 부가 염 및 용매화물:

    상기 식에서,
    X는 -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=S)O-, -C(=O)S-, -C(=S)S-, -C(=O)NHNH-, -CH2-, -O-, -OC(=O)-, -S-, -SC(=O)-, -NH-, -NHNH-, -NHC(=O)-, -NHNHC(=O)-, -C≡C-, -CH=CH-, 질소 원자 2개 이상을 함유한 5원성 헤테로사이클, -CH2C(=O)NH-, -CH2C(=O)O-, -CH2C(=S)O-, -CH2C(=S)S-, -CH2C(=O)NHNH-, -N=CH-, -CH=N-, -NH-N=CH- 및 -CH=N-NH-를 포함하는 군으로부터 선택되고;
    Y는 알킬렌 C2-C10 쇄를 포함하는 군으로부터 선택되되, 알킬렌 쇄에서 하나 이상의 -CH2- 기는 하나 이상의 O 및/또는 S 원자로 선택적으로 치환될 수 있으며;
    R1은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각의 R1은 독립적으로 알킬 C1-C46, 알케닐 C2-C46, 알키닐 C2-C46을 포함하는 군으로부터 선택되고, 여기서 알킬, 알케닐 또는 알키닐은 직선형 또는 분지형일 수 있으며, 알킬, 알케닐 또는 알키닐에서 하나 이상의 -CH2- 기는 -CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -S-S-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)-, -O- 및 -S-로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있으며;
    알킬, 알케닐 또는 알키닐이 분지형인 경우, 하나 이상의 >CH- 기는 선택적으로 >C(OH)-로 치환될 수 있으며;
    R1이 알킬 C1-C4인 경우, 말단-CH3 기로부터의 수소 하나는 Z로 치환될 수 있되;
    단, 하나 이상의 R1은 탄소 원자 적어도 8개, 바람직하게는 탄소 원자 적어도 10개, 더 바람직하게는 탄소 원자 적어도 12개를 함유하고;
    Z는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각의 Z는 독립적으로 수소, -OH, -CH3, -CH2OH, -NH2, -C(=O)NH2, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, -CONHCH(CH2OH)2, -CONHCH2CH(-OH)CH2OH, -CONH(CH2)2C(=O)NH2, -CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONHCH[C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, -COO(CH2)2-O-P(=O)(O-)-O(CH2)2-N+(CH3)3, -N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, 및 을 포함하는 군으로부터 선택되고,
    여기서,
    R2는 독립적으로 수소 및 -CH3로부터 선택되고;
    E는 독립적으로 O 및 S 원자로부터 선택되고;
    n은 1-5 범위의 정수이고;
    T는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각의 T는 독립적으로 -X-Y-N(R1)2, -C(=O)O(C1-C3 알킬), -C(=O)OCH2CH2OH, -C(=O)NH2, , -C(=O)OH, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, -CONHCH(CH2OH)2, -CONHCH2CH(-OH)CH2OH, -CONH(CH2)2C(=O)NH2, -CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONHCH[C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, -COO(CH2)2-O-P(=O)(O-)-O(CH2)2-N+(CH3)3, , -OH, -O(C1-C3 알킬), -NH2, -NHC(=O)CH3, -NHS(=O)2CH3, -NHC(=O)N(CH3)2, -NHC(=O)NH(CH3), -NHC(=S)N(CH3)2, -NHC(=S)NH(CH3), -NHC(=N-CN)NH2, -NHC(=N-CN)NH(CH3), -NHC(=N-CN)N(CH3)2, -NHC[=N-S(=O)2NH2]NH2, -N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, 을 포함하는 군으로부터 선택되되, 여기서 R2, E 및 n은 상기에서 정의된 바와 동일하고;
    및/또는
    Z가 -OH 또는 -CH2OH이고 T가 -C(=O)OH인 경우, Z는 T 및 이들 사이의 탄소 원자 3개와 함께 탄소수 4-5의 사이클릭 락톤을 형성할 수 있음.
  2. 제1항에 있어서, X가 -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=O)NHNH-, -OC(=O)-, -O-, -NHC(=O)-, -NHNHC(=O)-, 질소 원자 2개 이상을 함유한 5원성 헤테로사이클로 이루어진 군으로부터 선택되는, 리피도이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1이 독립적으로 알킬 C1-C46 및 알케닐 C2-C46로 이루어진 군으로부터 선택되되, 알킬 또는 알케닐에서 하나 이상의 -CH2- 기는 선택적으로 -CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-로부터 선택되는 하나 이상의 기로 치환될 수 있는, 리피도이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분자에서 모든 R1들이 동일하거나 또는 분자에서 R1 기를 가진 모든 질소 원자들이 동일한 R1 2개 또는 서로 다른 R1 2개에 의해 동등하게 치환된, 리피도이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 수소, -OH, -CH3, -CH2OH, -NH2, -C(=O)NH2, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, -CONHCH(CH2OH)2, -CONHCH2CH(-OH)CH2OH, -CONH(CH2)2C(=O)NH2, -CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONHCH[C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, 및 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    여기서, R2, E 및 n은 제1항에서 정의된 바와 동일하게 정의되는, 리피도이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, T가 -X-Y-N(R1)2, -C(=O)O(C1-C3 알킬), -C(=O)OCH2CH2OH, -C(=O)NH2, , -C(=O)OH, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, -CONHCH(CH2OH)2, -CONHCH2CH(-OH)CH2OH, -CONH(CH2)2C(=O)NH2, -CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONHCH[C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 -, -CONH(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, -COO(CH2)2-O-P(=O)(O-)-O(CH2)2-N+(CH3)3, 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    여기서 R2, E 및 n은 제1항에서 정의된 바와 동일하게 정의되는, 리피도이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 치환기 T가 -X-Y-N(R1)2이고; 바람직하게는 치환기 T 둘다 -X-Y-N(R1)2인, 리피도이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    Z가 수소, -OH, -CH3, -CH2OH로 이루어진 군으로부터 선택되고; T가 -X-Y-N(R1)2, -C(=O)O(C1-C3 알킬), , -C(=O)OH로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및/또는
    Z가 -OH 또는 -CH2OH이고 T가 -C(=O)OH이면, Z는 T 및 이들 사이의 탄소 원자 3개와 함께 탄소수 4-5의 사이클릭 락톤을 형성할 수 있는, 리피도이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    X가 -C(=O)NH- 또는 -NHC(=O)-이고;
    Y가 -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5- 및 -(CH2)6-로부터 선택되고;
    R1이 -OC(=O)-, -C(=O)O-로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있는 직선형 또는 분지형 알킬 C10-C15; 및 -OC(=O)-, -C(=O)O-로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있는 직선형 또는 분지형 알케닐 C12-C18을 포함하는 군으로부터 선택되고;
    T가 -X-Y-N(R1)2, -C(=O)OCH3, 및 -C(=O)OH로부터 선택되고;
    Z가 H, -CH3 및 -CH2OH로부터 선택되는, 리피도이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일반식 (I)의 리피도이드가 2 이상의 R1 치환기를 포함하고, 상기 치환기가 각각 적어도 8개의 탄소 원자, 바람직하게는 적어도 10개의 탄소 원자, 더 바람직하게는 적어도 12개의 탄소 원자를 함유한, 리피도이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 일반식 (I)의 리피도이드 및 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하는 형질감염제 (transfection agent)로서,
    바람직하게는, 상기 헬퍼 지질이 콜레스테롤, 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC), 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시 폴리(에틸렌글리콜)-2000, 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리(에틸렌글리콜)-2000, 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 폴리(에틸렌글리콜)-2000 및 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 폴리(에틸렌글리콜)-2000을 포함하는 군으로부터 선택되는, 형질감염제.
  12. 제11항에 있어서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 일반식 (I)의 리피도이드를 10 내지 50 mol.%의 함량으로 포함하고, 하나 이상의 헬퍼 지질을 50 내지 90 mol.%의 함량으로 포함하는, 형질감염제.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 일반식 (I)의 리피도이드를 15 내지 40 mol.%의 함량으로, 콜레스테롤을 30 내지 55 mol.%의 함량으로, 하나 이상의 헬퍼 지질을 20 내지 50 mol.%의 함량으로 포함하고; 바람직하게는, 상기 헬퍼 지질이 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC), 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시 폴리(에틸렌글리콜)-2000, 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리(에틸렌글리콜)-2000, 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 폴리(에틸렌글리콜)-2000 및 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 폴리(에틸렌글리콜)-2000을 포함하는 군으로부터 선택되는, 형질감염제.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 일반식 (I)의 리피도이드, 하나 이상의 핵산 및/또는 이의 일부 및/또는 핵산 유도체; 및 바람직하게는 추가적으로 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하는, 형질감염 입자.
  15. 세포 또는 조직에 핵산 및/또는 이의 일부 및/또는 핵산 유도체를 시험관내 형질감염하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 일반식 (I)의 리피도이드, 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 형질감염제, 또는 제14항에 따른 형질감염 입자의 용도.
  16. 제15항에 있어서, 염색체 유전자(들)를 침묵화 또는 활성화하거나, 면역유전자를 침묵화 또는 활성화하거나, 신호전달 경로를 저해 또는 활성화하거나, 게놈 또는 트랜스크립톰을 편집하거나, 또는 핵산에 의해 코딩된 단백질(들)의 발현을 구현하기 위한 것인, 용도.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 산업적인 또는 상업적인 목적으로 이용하기 위한 인간 배아의 형질감염 또는 인간 생식계열의 변형을 제외한, 세포 또는 조직을 핵산 및/또는 이의 일부 및/또는 핵산 유도체로 생체내 형질감염하는데 이용하기 위한 것인, 일반식 (I)의 리피도이드 또는 형질감염제 또는 형질감염 입자.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 염색체 유전자(들)를 침묵화 또는 활성화하거나, 면역유전자를 침묵화 또는 활성화하거나, 신호전달 경로를 저해 또는 활성화하거나, 게놈 또는 트랜스크립톰을 편집하거나, 또는 핵산에 의해 코딩된 단백질(들)의 발현을 구현하기 위한 것인, 일반식 (I)의 리피도이드 또는 형질감염제 또는 형질감염 입자.
  19. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 요법, 바람직하게는 악성 및/또는 유전자 장애를 치료하기 위한 의약제로서 사용하기 위한 것인, 일반식 (I)의 리피도이드 또는 형질감염제 또는 형질감염 입자.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 예방 백신으로서, 바람직하게는 감염성 질환을 예방하기 위한 예방 백신으로 이용하기 위한 것인, 일반식 (I)의 리피도이드 또는 형질감염제 또는 형질감염 입자.
  21. 활성 성분을 작용 부위에 전달하기 위한 미용학적 조제물 (cosmetic preparation)에서의, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 일반식 (I)의 리피도이드, 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 형질감염제, 또는 제14항에 따른 형질감염 입자의 용도.
KR1020247003222A 2021-07-19 2022-07-15 핵산 형질감염을 위한 사이클로헥산 리피도이드 및 그 용도 KR20240027760A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021-345A CZ2021345A3 (cs) 2021-07-19 2021-07-19 Cyklohexanové lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
CZPV2021-345 2021-07-19
PCT/CZ2022/050065 WO2023001323A1 (en) 2021-07-19 2022-07-15 Cyclohexane lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240027760A true KR20240027760A (ko) 2024-03-04

Family

ID=82939774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247003222A KR20240027760A (ko) 2021-07-19 2022-07-15 핵산 형질감염을 위한 사이클로헥산 리피도이드 및 그 용도

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP4373804A1 (ko)
KR (1) KR20240027760A (ko)
CN (1) CN117677603A (ko)
AU (1) AU2022314101A1 (ko)
BR (1) BR112023025647A2 (ko)
CA (1) CA3221027A1 (ko)
CZ (1) CZ2021345A3 (ko)
WO (1) WO2023001323A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116082184B (zh) * 2023-04-12 2023-06-30 山东大学 基于环己二胺的可电离脂质、脂质纳米颗粒及其制备方法与应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10369122B2 (en) * 2015-05-21 2019-08-06 Ohio State Innovation Foundation Benzene-1,3,5-tricarboxamide derivatives and uses thereof
EP3709987A4 (en) * 2017-11-14 2021-08-25 Ohio State Innovation Foundation LIPIDS OF ESTERS DERIVED FROM BENZENE-1,3,5-TRICARBOXAMIDE AND RELATED USES

Also Published As

Publication number Publication date
BR112023025647A2 (pt) 2024-02-27
CA3221027A1 (en) 2023-01-26
CN117677603A (zh) 2024-03-08
AU2022314101A1 (en) 2023-12-21
CZ2021345A3 (cs) 2023-02-01
EP4373804A1 (en) 2024-05-29
WO2023001323A1 (en) 2023-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6807900B2 (ja) アミン含有トランスフェクション試薬ならびにそれを生成および使用するための方法
JP6948313B2 (ja) 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
EA032088B1 (ru) Аминокислотные производные, функционализованные на n-конце, способные образовывать микросферы, инкапсулирующие лекарственное средство
Ilies et al. Pyridinium cationic lipids in gene delivery: an in vitro and in vivo comparison of transfection efficiency versus a tetraalkylammonium congener
TW201021852A (en) Releasable fusogenic lipids for nucleic acids delivery systems
Ding et al. Gemini-type tetraphenylethylene amphiphiles containing [12] aneN3 and long hydrocarbon chains as nonviral gene vectors and gene delivery monitors
Damen et al. Transfection by cationic gemini lipids and surfactants
Falamarzian et al. Effective down‐regulation of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) by polyplexes of siRNA and lipid‐substituted polyethyleneimine for sensitization of breast tumor cells to conventional chemotherapy
KR20230144574A (ko) 폴리옥사졸린-지질 접합체, 및 이를 포함하는 지질 나노입자 및 제약 조성물
CN115667207A (zh) 基于酚酸脂质的阳离子脂质
CA3193347A1 (en) Piperazine-based cationic lipids
KR20230051553A (ko) 지질 나노입자
KR20240027760A (ko) 핵산 형질감염을 위한 사이클로헥산 리피도이드 및 그 용도
CN114904003B (zh) 可电离的阳离子脂质类似物材料在作为核酸药物递送载体或转染试剂中的应用
Gosangi et al. Evolution of new “Bolaliposomes” using novel α-tocopheryl succinate based cationic lipid and 1, 12-disubstituted dodecane-based bolaamphiphile for efficient gene delivery
AU2021348717B2 (en) Lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof
JP6774965B2 (ja) カチオン性脂質としての化合物
CN113214171B (zh) 两亲性树形分子、合成及其作为药物递送系统的应用
JP7043411B2 (ja) カチオン性脂質としての化合物
CA2951119A1 (en) Ckap5-gene-silencing rnai pharmaceutical composition
EP2543659A1 (en) Dendrimers as non-viral vehicles for gene therapy
WO2023216232A1 (zh) 一种含有二硫键的脂质化合物及其组合物
Qian et al. Synthesis of novel cholesterol-based ionizable lipids for mRNA delivery
Fenton Design, synthesis, and biological evaluation of diketopiperazine based ionizable lipids for the in vivo delivery of messenger RNA
Falamarzian et al. LIPID-SUBSTITUTED POLYETHYLENEIMINE POLYPLEXES OF STAT3 siRNA FOR SENSITIZATION OF BREAST TUMOR CELLS TO CONVENTIONAL CHEMOTHERAPY