CZ2021345A3 - Cyklohexanové lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití - Google Patents

Cyklohexanové lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ2021345A3
CZ2021345A3 CZ2021-345A CZ2021345A CZ2021345A3 CZ 2021345 A3 CZ2021345 A3 CZ 2021345A3 CZ 2021345 A CZ2021345 A CZ 2021345A CZ 2021345 A3 CZ2021345 A3 CZ 2021345A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
transfection
lipidoid
general formula
nucleic acid
groups
Prior art date
Application number
CZ2021-345A
Other languages
English (en)
Inventor
Petr CĂ­gler
Cígler Petr Mgr., Ph.D.
Klára GRANTZ ŠAŠKOVÁ
Grantz Šašková Klára Mgr., Ph.D.
Václav Vaněk
Vaněk Václav Mgr., Ph.D.
Zuzana Hejdánková
Zuzana Mgr. Hejdánková
Original Assignee
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i.
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ăšstav organickĂ© chemie a biochemie AV ÄŚR, v. v. i., Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i. filed Critical Ăšstav organickĂ© chemie a biochemie AV ÄŚR, v. v. i.
Priority to CZ2021-345A priority Critical patent/CZ2021345A3/cs
Priority to BR112023025647A priority patent/BR112023025647A2/pt
Priority to PCT/CZ2022/050065 priority patent/WO2023001323A1/en
Priority to AU2022314101A priority patent/AU2022314101A1/en
Priority to CN202280050919.4A priority patent/CN117677603A/zh
Priority to KR1020247003222A priority patent/KR20240027760A/ko
Priority to CA3221027A priority patent/CA3221027A1/en
Priority to EP22755064.7A priority patent/EP4373804A1/en
Publication of CZ2021345A3 publication Critical patent/CZ2021345A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/57—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/57—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C233/62—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/57—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C233/63—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C237/10—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/16—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms acylated on ring nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/16—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms acylated on ring nitrogen atoms
    • C07D295/18—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms acylated on ring nitrogen atoms by radicals derived from carboxylic acids, or sulfur or nitrogen analogues thereof
    • C07D295/182—Radicals derived from carboxylic acids
    • C07D295/185—Radicals derived from carboxylic acids from aliphatic carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

Předmětem předkládaného řešení je lipidoid obecného vzorce I, kde X je zvoleno ze skupiny, sestávající z -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=S)O-, -C(=O)S-, -C(=S)S-, -C(=O)NHNH-, -CH2-, -O-, -OC(=O), -S-, -SC(=O)-, -NH-, -NHNH-, -NHC(=O)-, -NHNHC(=O)-, -C≡C-, -CH=CH-, pětičlenného heterocyklu obsahujícího alespoň 2 atomy dusíku, -CH2C(=O)NH-, -CH2C(=O)O-, CH2C(=S)O-, CH2C(=S)S-, -CH2C(=O)NHNH-, -N=CH-, -CH=N-; Y je alkylenový řetězec C2-C10, ve kterém může být nahrazena jedna nebo více skupin CH2 jedním nebo více atomy O a/nebo S; Z jsou vzájemně stejné nebo různé, přičemž každé Z je zvoleno ze skupiny, zahrnující atom vodíku zahrnující atom vodíku, -OH, -CH3, -CH2OH, -NH2, -C(=O)NH2, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, -CONHCH(CH2OH)2, -CONH(CH2)2C(=O)NH2, -CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONHCH[C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -N+(CH3)2-(CH2)3-SO3 , -N+(CH3)2-(CH2)2-COO-, a R jsou vzájemně stejné nebo různé, přičemž každé R je zvoleno ze skupiny alkyl C8-C20, alkenyl C8-C20, alkynyl C8-C20, přičemž v uvedeném alkylu, alkenylu nebo alkynylu může být volitelně jedna nebo více -CH2- skupin nahrazeno jednou nebo více skupinami vybranými z -CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -SS-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)-, -O-, -S-; a jeho farmaceuticky přijatelné soli, adiční soli a solváty. Tento lipidoid je využitelný jako transfekční agens. Řešení dále popisuje transfekční činidla, transfekční částice obsahující tento lipidoid, a jejich použití.

Description

Cyklohexanové lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
Oblast techniky
Vynález se týká nových ionizovatelných lipidoidů a využití těchto látek pro transfekci a administraci nukleotidů a nukleových kyselin a jejich syntetických analogů do buněk a tkání.
Dosavadní stav techniky
Vývoj terapií založených na nukleových kyselinách (NK) zažívá v posledních letech nebývalou renesanci. Díky vysoké účinnosti a zároveň nízkému riziku nežádoucích vedlejších účinků oproti drive testovaným terapeutickým deoxyribonukleovým kyselinám (DNA), se nyní prosazují terapie využívající ribonukleové kyseliny (RNA). Již několik takových léků dosáhlo klinického použití, například patisiran na hereditámí transthyretinovou amyloidózu, dále eteplirsen pro určité typy Duchennovy svalové dystrofie či nusinersen pro léčbu spinální svalové atrofie. Všechna tato onemocnění jsou život ohrožující a neexistuje pro ně alternativní léčba. Případné léky cílící na ribonukleovou kyselinu (RNA) či její využití lze rozdělit do tří kategorií podle toho, zda cílí na NK, nebo proteiny, či proteiny kódují. Do první kategorie patří jednořetězcové antisensní oligonukleotidy o 13-25 nukleotidech (nt), které blokují translaci mediátorové RNA (mRNA) nebo RNA sestřih (nusinersen, eteplirsen); a dále malé interferující RNA (siRNA, 21 -23nt), které mRNA degradují (patisiran). Terapeutické molekuly RNA cílící proteiny používají typ molekuly známý jako RNA aptamer. Ten je navržen tak, že moduluje fúnkci konkrétního proteinu. Příkladem takového léku je pegaptanib, používaný k léčbě neovaskulámí věkem podmíněné makulámí degenerace, který byl v roce 2004 prvním schváleným léčivem svého druhu. Terapie používající mRNA se používají zejména k přípravě tzv. personalizovaných vakcín proti rakovině, či vakcín proti infekčním chorobám (např. viru Zika). Právě u virových onemocnění se u kandidátů na profylaktickou vakcínu na bázi mRNA proti vzteklině a pandemické chřipce prokázala bezpečná indukovaná tvorba protilátek u zdravých dobrovolníků. V preklinických fázích vývoje jsou také mRNA terapie nahrazující proteiny, například pro léčbu hemofilie.
Obrovský rozkvět nyní zažívají molekulární technologie umožňující přímou editaci genomu, zejména ty založené na systému CRISPR-Cas9. CRISPR technologie je nástroj, který umožňuje měnit sekvence DNA a modifikovat fúnkci genu. Potenciální aplikace zahrnují opravu genetických defektů, léčbu a prevenci šíření chorob či zlepšení zemědělských plodin. CRISPR-Cas9 systém je testován v celé řadě preklinických a klinických studií zahrnující léčbu HIV, léčbu hematologických malignit i genetických poruch včetně srpkovité anémie a β-thalassémie. Editaci RNA pak umožňuje systém ADARs (adenosin deaminasy cílící RNA), který se zatím z klinického hlediska zdá být bezpečnější. Molekulární technologie pro přímou editaci genomu mohou být doručeny na místo účinku v podobě mRNA, která kóduje příslušný enzym zodpovědný za editaci.
Klíčovým faktorem umožňujícím bezpečné použití všech výše zmíněných technologií (případně dalších, založených na NK) je jejich bezpečný a efektivní transport na místo účinku. Kritickým krokem je přitom průnik negativně nabitých NK přes fosfolipidovou membránu buňky; proces záměrného vnášení NK do eukaryotických buněk se nazývá transfekce. V posledních desetiletích dochází k intenzivnímu vývoji nosičů (tzv. vektorů), které by byly schopné NK přes buněčnou membránu efektivně transportovat, a zároveň zajistily ochranu NK před degradací in vivo (Stewart, Μ. P.: Chem. Rev. 2018,118, 7409-7531).
Pro transfekci NK jsou využívány jak virové, tak nevirové (fyzikální, chemické) vektory. Přestože cca 70 % klinických testů v oblasti genové terapie bylo dosud prováděno za pomoci virových vektorů, tento přístup s sebou nese četná rizika (karcinogenicitu, vyvolání imunitní reakce, tkáňovou nespecifičnost, omezenou kapacitu inkorporace NK i výrobní náročnost). Fyzikální metody (např. elektroporaci) lze jen obtížně systémově využít v humánní medicíně.
- 1 CZ 2021 - 345 A3
Oproti tomu syntetické chemické vektory většinou vykazují nižší imunogenicitu, jsou schopny dopravovat větší množství genetického materiálu a vzhledem k tomu, že jsou tvořeny přesně definovanými molekulami, lze podle potřeby ovlivňovat jejich strukturu, zvýšit tím jejich účinnost a potlačit toxicitu. Jako chemické vektory jsou využívány kationické polymery nebo kationické lipidy, které vytváří s negativně nabitou NK komplex. Tento komplex je schopný proniknout přes buněčnou membránu a zároveň chrání NK před degradací v extracelulámím prostředí.
Ze strukturního hlediska jsou v současné době nej perspektivnější a klinicky nej pokročilejší formou těchto komplexů tzv. lipidické nanočástice (LNP). V nich jsou kationické lipidy obvykle formulovány s PEGylovaným lipidem, který brání agregaci, ovlivňuje velikost částic a jejich transfekční účinnost, pomocným lipidem a cholesterolem, které jsou nezbytné pro stabilní enkapsulaci NK, jak bylo ukázáno např. na systému pro transfekci siRNA (Kulkami, J.: Nanoscale, 2019,77, 21733-21739). LNP mohou pojmout molekuly NK o velikosti od několika nukleotidových jednotek až po miliony.
Syntetické kationické lipidy a lipidoidy (syntetické molekuly podobné lipidům lišící se větším množstvím hydrofobních řetězců) jsou tvořeny kationickou a hydrofobní doménou. Do dnešní doby bylo vyvinuto velké množství těchto látek s vysokou strukturní variabilitou obou domén, a to jak pomocí cíleného designu, tak testováním kombinatoriálně generovaných knihoven.
K transfekci siRNA byly speciálně vyv inuty lipidy a lipidoidy jako D-Lin-MC3-DMA, Cl 2-200, cKK- E12, SA2-SC8 a další (Dong, Y.: Adv. Drug Deliv. Rev. 2019,144, 133 147). Formulace obsahující D- Lin-MC3-DMA byla nedávno (srpen 2018) uvedena pod názvem Onpattro (původně Patisiran) do klinické praxe, a stala se tak prvním schváleným siRNA léčivem vůbec (Zhang, X.: J. Clin. Pharmacol. 2020, 60 (1), 37-49). Formulace vyvinuté pro siRNA však nemusí být efektivní v případě mRNA, a cílená optimalizace je proto nezbytná (Cullis, P.: Mol. Ther. 2017, 25 (7), 1467-1475).
Pro transfekci mRNA se užívají ionizovatelné lipidy a lipidoidy jako D-Lin-MC3-DMA, C12-200, CKK-E12, a TT3 (Zhong, Z.: Nano Today 2018. 23, 16-39; Kowalski, P.: Mol. Ther. 2019, 27 (4), 1-19; Li, B.: Nano Lett. 2015, 75, 8099-8107). Ionizovatelné lipidy jsou využívány i pro transfekci DNA. Opět je nutno zdůraznit, že transfekční systémy optimalizované pro transfekci malých molekul (siRNA) nejsou vždy vhodné pro transfekci DNA, a dokonce ani formulace vyvinuté pro mRNA nemusí být efektivní v případě DNA (Buck, J.: ACSNano 2019,73, 3754-3782).
Vzhledem k tomu, že dosud jen velmi málo syntetických vektorů založených na ionizovatelných lipidech bylo - navzdory enormnímu terapeutickému potenciálu - dovedeno až do fáze klinického využití, je nezbytné vyvíjet nové systémy s vyšší efektivitou, které zároveň budou vykazovat co nejnižší in vivo toxicitu.
Podstata vynálezu
Předmětný vynález řeší problém efektivity transfekce a cíleného dopravování nukleotidů a nukleových kyselin a jejich syntetických analogů za použití ionizovatelných (kationických) lipidů a také problém toxicity těchto lipidů pro cílový organismus anebo buňku. Zjistili jsme překvapivě, že pokud se jako centrální jádro ionizovatelného lipidoidu využije cyklohexan, významně se zvýší transfekční účinnost takovýchto lipidoidů oproti dosud známým řešením. Zároveň tyto lipidoidy obsahující cyklohexan vykazují při relevantních dávkách extrémně nízkou cytotoxicitu. Specifickými vlastnostmi cyklohexanového jádra, užitého jako centrální strukturní motiv nových ionizovatelných lipidoidů, jsou v porovnání s dosud vyvinutými ionizovatelnými lipidy a lipidoidy sterická náročnost v jeho blízkosti a široké možnosti substituce.
Předmětem vynálezu jsou ionizovatelné lipidoidy obecného vzorce I
-2CZ 2021 - 345 A3 ν>ΐ' S ' A
V
J (I), kde X je zvoleno ze skupiny, zahrnující -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=S)O-, -C(=O)S-, -C(=S)S-, C(=O)NHNH-, -CH2-, -0-, -OC(=O)-, -S-, -SC(=O)-, -NH-, -NHNH-, -NHC(=O), NHNHC(=O)-, -C=C-, -CH=CH-, pětičlenný heterocyklus obsahující alespoň 2 atomy dusíku, -CH2C(=O)NH-, -CH2C(=O)O-, -CH2C(=S)O-, -CH2C(=S)S-, -CH2C(=O)NHNH-, -n=ch-, -CH=N-;
Y je alkylenový řetězec C2-Cio, ve kterém může být nahrazena jedna nebo více skupin CH2 jedním nebo více atomy O a/nebo S;
Z jsou vzájemně stejné nebo různé, přičemž každé Z je zvoleno ze skupiny, zahrnující atom vodíku, -OH, -CH3, -CH2OH, -NH2, -C(=O)NH2, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, CONHCH(CH2OH)2, -CONHCH2CH(-OH)CH2OH, -CONH(CH2)2C(=O)NH2, CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONHCH[C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -N+(CH3)2» l ° X (CH2)3-SO3-,-N+(CH3)2-(CH2)2-COO; u v 7 ; a R jsou vzájemně stejné nebo různé, přičemž každé R je zvoleno ze skupiny, zahrnující alkyl CxC20, alkenyl Cs-C2o, alkynyl Cs-C2o, přičemž v uvedeném alkylu, alkenylu nebo alkynylu může být volitelně jedna nebo více z -CH2- skupin nahrazena jednou nebo více skupinami vybranými z -CH(OH)-, -OC(O)-, -C(=O)O-, -S-S-, -C(=0)NH-, -NHC(=0)-, -0-, -S-;
a jejich farmaceuticky přijatelné soli, adiční soli a solváty.
Termín „alkyl“ znamená nasycený uhlovodíkový řetězec, který může být přímý, větvený nebo cyklický nebo cyklus obsahující.
Termín „alkenyl znamená uhlovodíkový řetězec obsahující alespoň jednu dvojnou vazbu mezi atomy uhlíku, který může být přímý, větvený nebo cyklický nebo cyklus obsahující.
Termín „alkynyl“ znamená uhlovodíkový řetězec obsahující alespoň jednu trojnou vazbu mezi atomy uhlíku, a popřípadě navíc i jednu nebo více dvojných vazeb mezi atomy uhlíku, který může být přímý, větvený nebo cyklický nebo cyklus obsahující.
Termín „alkylenový řetězec“ znamená nasycený uhlovodíkový řetězec, který může být přímý, větvený nebo cyklický nebo cyklus obsahující, ale s výhodou je přímý. Tento řetězec má dvě valence, tedy váže se jako linker nebo můstek dvěma vazbami.
V případě, že molekula obecného vzorce I má kladný náboj, je součástí sloučeniny protiont, což může být farmaceuticky přijatelný anion organické nebo anorganické kyseliny, čímž vzniká farmaceuticky přijatelná sůl. Takový anion může být vybrán například ze skupiny zahrnující acetát, aspartát, benzesulfonát, benzoát, besylát, bikarbonát, bitartarát, bromid, kamsylát, karbonát,
-3 CZ 2021 - 345 A3 chlorid, citrát, dekanoát, edetát, esylát, fumarát, gluceptát. glukonát, glutamát, glykolát, hexanoát, jodid, laktát, malát, maleát, mandelát, mesylát, methansulfát, napsylát, nitrát, oktanoát, oleát, palmoát, pantothenát, fosfát, polygalakturonát, propionát, salicylát, stearát, sukcinát, sulfát, tartarát, tosylát.
Pokud sloučenina vzorce I obsahuje chirální centra, pak vzorec I zahrnuje čisté enantiomery i směsi enantiomerů včetně racemátu.
Vzorec I zahrnuje sloučeniny vzorce I ve volné formě, i ve formě solí, adičních solí (s kyselinami nebo bázemi) a/nebo solvátů, včetně hydrátů či alkoholových solvátů.
Spojka X ve vzorci I je vytvořena reakcí navázání aminových částí molekuly k centrálnímu cyklohexanovému jádru. Může se proto jednat o různé spojky, v závislosti na zvolené reakci, např. tvorbě esteru, amidu a jejich analogů, click reakci (např. azido-alkynovou cykloadici), atd. X je tedy zvoleno ze skupiny, zahrnující -C(=0)NH-, -C(=O)O-, -C(=S)O-, -C(=O)S-, -C(=S)S-, C(=0)NHNH-, -CH2-, -O-, -OC(=O)-, -S-, -SC(=O)-, -NH-, -NHNH-, -NHC(=0)-, NHNHC(=0)-, -C=C-, -CH=CH-, pětičlenný heterocyklus obsahující alespoň 2 atomy dusíku, CH2C(=0)NH- , -CH2C(=O)O-, -CH2C(=S)O-, -CH2C(=S)S-, -CH2C(=0)NHNH-, -n=ch-, CH=N-. S výhodou je X zvoleno z -C(=0)NH-, pětičlenný heterocyklus obsahující alespoň 2 atomy dusíku, -C(=O)O-.
Spojka Y je alkylenový řetězec zajišťující alespoň minimální vzdálenost aminu od spojky X a cyklohexanového jádra. Y je alkylenový řetězec C2-Cio, ve kterém může být nahrazena jedna nebo více skupin CH2 jedním nebo více atomy O a/nebo S, s výhodou C2-Cx.
Substituent Z může dále upravovat vlastnosti látky vzorce I. S výhodou je Z methylová skupina.
Řetězce Rmohou být vzájemně stejné nebo různé, s výhodou jsou stejné, nebojsou všechny atomy dusíku substituovány shodně (dvěma stejnými R nebo dvěma různými R), z důvodu syntetické jednoduchosti. Rjsou mastné řetězce, a jsou vybrány ze skupiny zahrnující alkyl C8-C2o, alkenyl C8-C20, alkynyl C8-C2o, přičemž v uvedeném alkylu, alkenylu nebo alkynylu může být volitelně jedna nebo více -CH2- skupin nahrazeno jednou nebo více skupinami vybranými z -CH(OH)-, OC(=O)-, -C(=O)O- , -SS-, -C(=0)NH-, -NHC(=0)-, -O-, -S-. S výhodou jsou R vybrány ze skupiny, zahrnující alkyl C8-C2o, alkenyl C8-C2o, alkynyl C8-C2o, přičemž v uvedeném alkylu, alkenylu nebo alkynylu může být volitelně jedna nebo více -CH2- skupin nahrazeno jednou nebo více skupinami vybranými z -CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-.
Látky obecného vzorce I se připraví odpovídající reakcí cyklohexanového prekurzoru, substituovaného skupinami Z v polohách 1,3,5 a prekurzorovými skupinami spojky X v polohách 1, 3, 5 s aminem obecného vzorce X'-Y-NR2, kde X'je prekurzorová skupina spojky X. Amin lze připravit odborníkovi známými reakcemi a postupy, a některé vhodné aminy jsou i komerčně dostupné.
V konkrétnějším příkladu se látky obecného vzorce I s výhodou připraví tak, že se nechá reagovat látka obecného vzorce II
Z
(Π),
-4CZ 2021 - 345 A3 kde A je vodík, s diaminem obecného vzorce III (III) za přítomnosti kondenzačního činidla a báze, nebo se nechá reagovat látka obecného vzorce II, kde A je halogen, s diaminem obecného vzorce III za přítomnosti báze. R, Y a Z ve vzorcích II a III odpovídají výše uvedenému popisu vzorce I.
Předmětem předkládaného vynálezu je také transfekční činidlo obsahující alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I, a alespoň jeden pomocný lipid. Transfekční činidlo lze připravit ve formě roztoku rozpuštěním a smísením složek nebo lze připravit ve formě částic pomocí technik běžně užívaných v technologii nanočástic, např. pomocí mikrofluidního míšení. Částicemi se rozumí obvykle nanočástice o průměru 1 až 500 nm. Ve výhodném provedení mohou mít částice průměr 30 až 250 nm, v ještě výhodnějším provedení 40 až 150 nm.
S výhodou transfekční činidlo obsahuje alespoň jeden lipidoid obecného vzorce 1 v množství 10 až 50 molámích procent, a alespoň jeden pomocný lipid v množství 50 až 90 molámích procent. S výhodou obsahuje transfekční činidlo alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I v množství 15 až 30 molámích procent, a alespoň jeden pomocný lipid v množství 70 až 85 molámích procent. V některých výhodných provedeních obsahuje transfekční činidlo alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I v množství 15 až 30 molámích procent, cholesterol v množství 30 až 55 molámích procent, a alespoň jeden další pomocný lipid v množství 20 až 50 molámích procent.
Ve zvláště výhodném provedení transfekční činidlo obsahuje alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I v množství 15 až 30 molámích procent, cholesterol v množství 30 až 55 molámích procent, l,2-dioleoyl-5«-glycero-3-fosfoethanolamin v množství 20 až 45 molámích procent a 1,2dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylenglykol-2000 v množství 0,5 až 5 molámích procent.
Předmětem předkládaného vynálezu je také transfekční částice obsahující alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I, alespoň jednu nukleovou kyselinu a/nebo její kratší úsek a/nebo její derivát, a s výhodou dále alespoň jeden pomocný lipid. Transfekční částice lze připravit například tak, že se roztok lipidoidu obecného vzorce I, obsahující případně pomocné lipidy, smísí s roztokem nukleové kyseliny a/nebo jejího kratšího úseku a/nebo jejího derivátu. Míšení může být provedeno pomocí technik běžně užívaných v technologii nanočástic, např. pomocí mikrofluidního míšení.
Hmotnostní poměr celkového množství nukleové kyseliny a/nebo jejího derivátu ku celkovému množství lipidoidu obecného vzorce I a pomocných lipidů v transfekční částici je s výhodou v rozmezí l:2až 1:500, výhodněji 1:5 až 1:100. Konkrétně a pro ilustraci: v částicích, jejichž příprava je popsána v příkladech, byl tento poměr pro mRNA kolem 1:9 a pro siRNA kolem 1:68.
Transfekční částice jsou obvykle nanočástice, čímž jsou obecně rozuměny částice mající rozměry v rozmezí 1 až 500 um. Typicky jsou rozměry transfekčních nanočástic v rozmezí 50 až 250 nm, výhodněji 40 až 150 nm.
Struktura transfekčních částic byla pozorována metodou kryogenní transmisní elektronové mikroskopie, a pozorování ukázala, že se jedná o kompaktní vrstevnaté lipidické nanočástice obsahující uvnitř nukleovou kyselinu.
-5CZ 2021 - 345 A3
Pomocnými lipidy jsou v transfekčních činidlech a transfekčních částicích zejména neutrální lipidy, steroly či konjugáty lipidů s hydrofilními polymery.
Neutrální lipidy mají při fyziologických podmínkách celkový náboj rovný nule a mohou existovat v nenabité nebo elektroneutrální zwitteriontové formě. Neutrální lipidy mohou být například vybrány z l,2-dioleoyl-5«-glycero-3-fosfoethanolaminu (DOPE), l,2-dioleoyl-5«-glycero-3fosfocholinu (DOPC), l,2-distearoyl-5«-glycero-3-fosfocholinu (DSPC), 1.2-dipalmitoyl-swglycero-3-fosfocholinu (DPPC), l,2-dimyristoyl-5«-glycero-3-fosfocholinu (DMPC), a 1,2dioleoyl-5«-glycero-3-fosfoethanolamin-A-(Cyaninu 5).
Steroly mohou být například vybrány z cholesterolu, β-sitosterolu, stigmastanolu, campesterolu, fucosterolu, avenasterolu, fecosterolu, brassicasterolu, ergosterolu, 9,11-dehydroergosterolu. S výhodou je sterol cholesterol.
Konjugáty lipidů s hydrofilními polymery obsahují lipidickou část a polymemí část, jako je například poly(ethylenglykol), poly(2-ethyl-2-oxazolin), poly(2-methyl-2-oxazolin), poly(glycerol), poly(A-(2- hydroxypropyl) methakrylamid), poly(sarcosin) nebo glykol chitosan. S výhodou je polymemí část tvořena poly(ethylenglykolem) o molekulové hmotnosti v rozmezí přibližně 500 až 10 000 Da, s výhodou 1 000 až 5 000 Da. Konjugáty lipidů s hydrofilními polymery mohou být vybrány například z l,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxy poly(ethylenglykolu)-2000, 1,2-di myristoyl -sw-glycero-S-fosfoethanolam i npoly(ethylenglykolu)-2000, l,2-distearoyl-5«-glycero-3-fosfoethanol-amin-poly(ethylenglykolu)2000, l,2-dipalmitoyl-5«-glycero-3-fosfoethanolamin poly(ethylenglykolu)-2000, a podobných konjugátů. Konjugátem lipidu s hydrofilními polymery je s výhodou 1,2- dimyristoyl-rac-glycero3-methoxy poly(ethylenglykol)-2000.
Vlákno nukleové kyseliny a její kratší úseky obsahují jeden nebo více nukleotidů a/nebo deoxynukleotidů. Nukleová kyselina a její kratší úseky mohou mít povahu terapeutického, diagnostického či profylaktického agens nebo mohou zajistit značení buněk či tkání, do nichž jsou transfekovány. Sloučeniny obecného vzorce I tedy mají zejména terapeutické nebo biotechnologické využití.
Termín „vlákno nukleové kyseliny ajejí kratší úseky“ představuje jeden nebo více typů nukleových kyselin, které být s výhodou vybrány z oligonukleotidů (1-100 nukleotidů, např. aptainerů), cyklických dinukleotidů (např. 2’,3’-cGAMP), antisenzních oligonukleotidů, deoxyribonukleové kyseliny (jednořetězcové DNA, dvouřetězcové DNA, cDNA, plasmidové DNA kódující gen nebo geny), ribonukleové kyseliny, typicky mediátorové RNA (mRNA), transferové RNA (tRNA), malé interferující RNA (siRNA), dvouřetězcové RNA, mikro-RNA (miRNA), piwi-RNA (piRNA), antisensní RNA (asRNA), tzv. guide RNA (gRNA) systému CRISPR a jejich kombinací (typicky např. gRNA a mRNA kódující Cas9 nukleasu, Casl3a/C2c2 a Casl3b, či analogické nukleasy vhodné pro využití v systému CRISPR, CRISPRi a dalších variací a následné úpravě genomu hostitelské buňky či tkání či úpravě transkriptomu hostitelské buňky či tkání). Všechny zde uvedené nukleové kyseliny (NK) dále mohou být tvořené či upravené pomocí syntetických analogů bází, například za účelem zvýšení stability v biologických systémech. Syntetické analogy NK zahrnují zejména tyto substituce: 2’-O-methyl, 2’-O-methoxy-ethyl, 2’-fluoro, methylenový můstek mezi 2’-kyslíkem a 4’-uhlíkem pentosového kruhu (tzv. locked nucleic acid), fosforylaci na 5’ a/nebo 3’ konci vlákna, boranofosfonáty, fosforothioáty.
Předkládaný vynález dále zahrnuje použití lipidoidů obecného vzorce I nebo transfekčních činidel nebo transfekčních částic pro transfekci buněk či tkání nukleovou kyselinou a/nebo jejím kratším úsekem a/nebo jejím derivátem in vitro. Kromě toho vynález zahrnuje lipidoidy obecného vzorce I nebo transfekční částice pro použití pro transfekci buněk či tkání nukleovou kyselinou a/nebo jejím kratším úsekem a/nebo jejím derivátem in vivo (kromě transfekce lidských embryí pro využití pro průmyslové či komerční účely, a kromě modifikace lidské zárodečné linie).
-6CZ 2021 - 345 A3
Transfekční částice obsahující lipidoidy obecného vzorce I jsou využitelné pro řadu biologických aplikací v základním výzkumu, zejména pro transfekce buněčných kultur či zvířat s cílem doručení aktivní NK a následného umlčení či aktivace chromozomálního genu či genů, editaci genomu (vystřižení genu, vložení genu či zavedení mutace genu) nebo transkriptomu či umožnění exprese daného proteinu kódovaného NK vloženou pomocí transfekční částice, tzv. „in trans
Ve veterinární a humánní medicíně lze transfekční částice obsahující lipidoidy obecného vzorce I s výhodou využít pro terapeutické účely či profylaktické účely. Částice obsahující terapeutickou NK lze do zvířete či člověka administrovat s cílem umlčení či aktivace chromozomálních genu/ů, umlčení nebo aktivace imunogenů, inhibice či aktivace signálních drah, editace genomu (vystřižení genu, vložení genu či zavedení mutace genu) nebo transkriptomu či umožnění exprese daného proteinu/ů kódovaného NK.
Předkládaný vynález rovněž zahrnuje lipidoidy obecného vzorce I nebo transfekční činidla nebo transfekční částice pro použití jako léčiva, zejména pro genovou terapii. Zejména jsou vhodné pro použití pro léčbu malignit a/nebo genetických poruch.
Lipidoidy obecného vzorce I nebo transfekční částice lze formulovat pro terapeutické, kosmetické či biotechnologické použití ve formě přípravků s farmaceuticky přijatelnými excipienty. Přípravky mohou být v kapalné formě či pevné formě. Kapalné formy zahrnují roztoky, suspense, disperze, upravené například pro injekční či perorální podání, gely, masti. Pevné formy zahrnují například kapsle, tablety, potahované tablety, prášky, čípky, a další formy.
Kapalné formulace mohou být nebulizovány pomocí inertních plynů. Nebulizované suspenze mohou být vdechovány přímo nebo z nebulizátoru nebo může být nebulizátor připojen k obličejové masce nebo k dýchacímu přístroji. Pevné formy mohou být aplikovány pomocí práškových inhalátorů. Suspenzní nebo práškové formulace mohou být aplikovány orálně nebo nasálně pomocí vhodných zařízení.
Pro aplikace na pokožku nebo sliznici mohou být přípravky formulovány jako ve formě krému, gelu, masti, pasty, balzámu, tekutiny a dalších a aplikovány na místo zásahu.
Farmaceuticky přijatelné excipienty zahrnují rozpouštědla, činidla regulující rozpustnost, činidla regulující pH, nosiče, plniva, pojivá, kluzné látky, disintegranty, konzervační činidla, sorbenty, činidla regulující viskozitu, činidla ovlivňující senzorické vlastnosti, jako je chuť, vůně či barva přípravku.
Lipidoidy obecného vzorce I nebo transfekční činidla nebo transfekční částice mohou být dále s výhodou využity pro účely kosmetického průmyslu za účelem doručení aktivní látky na místo účinku. Takto mohou být transfekční částice s aktivní látkou připraveny v podobě krému, gelu, masti, pasty, balzámu, tekutiny a dalších a použity dále jako make-up, vlasová kosmetika, či produkt osobní hygieny.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1. Schéma syntézy lipidoidů 3 a 7.
Obrázek 2. Schéma syntézy lipidoidů 8 a 11.
Obrázek 3. Schéma syntézy lipidoidů 15.
-7 CZ 2021 - 345 A3
Příklady uskutečnění vynálezu
Seznam zkratek:
ekv. R/ TLC RVO rt v/v br s s d m dd ekvivalent retenční faktor chromatografie na tenké vrstvě rotační vakuová odparka teplota místnosti objem/objem široký signál singlet dublet multiplet dublet dubletu interakční konstanta
δ HRMS ESI MALDI IR NMR CE5 CE20 CE50 Dl D2 D2/3 D3 D4 TFA DIPEA DME DCM ACN DIC DMAP LNP NK DNA RNA mRNA siRNA tRNA miRNA ssDNA/RNA dsDNA/RNA DMG-PEG2000 DOPE DOPC DSPC DOPE-Cy5 Lip2000 h chemický posun hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením ionizace elektrosprejem ionizace laserem za přítomnosti matrice infračervená spektroskopie nukleární magnetická rezonance směs cyklohexan-ethylacetát 95:5 (v/v) směs cyklohexan-ethylacetát 80:20 (v/v) směs cyklohexan-ethylacetát 50:50 (v/v) směs dichlormethan-methanol-25% vodný NH3 75:22:3 (v/v/v) směs dichlormethan-methanol-25% vodný NH3 175:22:3 (v/v/v) směs dichlormethan-methanol-25% vodný NH3 125:22:3 (v/v/v) směs dichlormethan-methanol-25% vodný NH3 275:22:3 (v/v/v) směs dichlormethan-methanol-25% vodný NH3 375:22:3 (v/v/v) trifluoroctová kyselina N, A-diisopropylethylamin Λζ/V-dimethylformamid dichlormethan acetonitril diisopropylkarbodiimid 4-dimethylaminopyridin lipidické nanočástice nukleová kyselina deoxyribonukleová kyselina ribonukleová kyselina mediátorová RNA malá interferující RNA transferová RNA mikro RNA jednořetězcová DNA/RNA dvouřetězcová DNA/RNA l,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylenglykol-2000 l,2-dioleoyl-5«-glycero-3-phosphoethanolamin l,2-dioleoyl-5«-glycero-3-fosfocholin l,2-distearoyl-5«-glycero-3-fosfocholin l,2-dioleoyl-5«-glycero-3-fosfoethanolamin-A-(Cyanine 5) Lipofectamine® 2000 (Invitrogen) hodina
-8CZ 2021 - 345 A3
Příklad 1
Ν',Ν'-Didodecylhexan-l,6-diamin 2
Do 500ml baňky s kulatým dnem opatřené chlorkalciovým uzávěrem a magnetickým míchadlem byl vložen roztok JVLterc-butyloxykarbonyl-ftó-diaminohexanu (5,0 g, 23,11 mmol) v DCM (100 ml) a ochlazen na 0 °C v ledové lázni. Za intenzivního míchání byl přidán n-dodecylaldehyd (15,38 ml, 69,34 mmol, 3 ekv.), a následně triacetoxyborohydrid sodný (14,70 g, 69,34 mmol, 3 ekv.) ve třech dávkách v průběhu 10 minut. Chladicí lázeň byla odstraněna, a reakční směs byla míchána 2 h při teplotě místnosti (rt). Průběh reakce byl sledován pomocí TLC za použití mobilní fáze hexan-ethylacetát 80:20 (v/v) na TLC-destičce předem saturované amoniakem (detekce ninhydrinem). Po skončení reakce byl přidán vodný roztok NaOH (1 mol.I1, 200 ml), reakční směs byla míchána 15 min, poté přelita do dělicí nálevky a naředěna vodou (300 ml). Produkt byl extrahován DCM (300 ml, 2x50 ml), spojená organická fáze promyta solankou (50 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Tmavý olej ovitý odparek byl přečištěn chromatografií na silikagelové koloně za použití lineárního gradientu ethylacetátu v hexanu (10-30 %). Byl získán amin 1 (3,67 g, 28,7 %) ve formě nažloutlého oleje.
K roztoku látky 1 v DCM (10 ml) ochlazenému za míchání v ledové lázni na 0 °C byla přidána trifluoroctová kyselina (10 ml), a reakční směs byla ponechána při 0 °C 3 hod. Poté byl roztok přelit do dělicí baňky o objemu 1 litr, naředěn 20% vodným roztokem Na2CO; (300 ml), a produkt byl extrahován DCM (250 ml, 2x50 ml). Spojená organická fáze promyta solankou (100 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Surový produkt byl přečištěn chromatografií na silikagelové koloně za použití lineárního gradientu Dl v DCM (0-70 %). Byl získán diamin 2 (2,17 g, 72,2% výtěžek; Rf 0,31 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje. Ή NMR (600 MHz, CDC13): δ = 2,73, 2,65, 2,57, 1,56, 1,52, 1,51, 1,36, 1,31, 1,28, 1,251,29, 1,24, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDC13): δ = 53,51, 53,20, 41,62, 32,40, 31,89, 29,63, 29,61, 29,57, 29,44, 29,32,27,39, 27,09,26,53,25,65,25,02, 22,66, 14,10 ppm. IR (film): ν^χ/αη 1 = 3374 w a 3294 w (v NH2), 2797 m (vs N- CH2). 2956 s (vas CH3), 2924 vs (vas CH2), 2853 s (vs CH2), 1467 m a 1455 m, sh (βδ CH2 a das CH3), 1378 w a 1367 w (ds CH3), 721 m (pas CH2). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro C3oH6sN2 [M + H]+ 453,51423; nalezeno 453,51340.
cZsjcZs-JVÚVjA^-Trisíó^didodecylaininojhexyljcyklohexan-l^S-trikarboxamid 3
K czycz5-l,3,5-cyklohexantrikarboxylově kyselině (17 mg, 0,079 mmol) byl přidán DMF (2 μΐ), thionylchlorid (300 μΐ), a suspenze byla míchána 30 min při 70 °C v uzavřené vialce, přičemž postupně došlo k vyčeření reakční směsi na homogenní bezbarvý roztok. Přebytečný SOC12 byl při 70 °C odfoukán proudem suchého dusíku, residuum bylo vysušeno vakuem (10 min), a ochlazeno na rt. Poté byl injekční stříkačkou přes septum přidán roztok V./C-didodccylhcxan-1.6-diaminu 2 (142 mg, 0,315 mmol, 4 ekv.) a DIPEA (137 μΐ, 0,786 mmol, 10 ekv.) ve směsi DCM (1,5 ml) a DMF (0,5 ml), a reakční směs byla míchána 10 min. Následně byla reakční směs sorbována na chromatografický silikagel (10 g), a rozpouštědla byla odstraněna na RVO. Odparek byl přečištěn chromatografií na silikagelové koloně (40 g) za použití lineárního gradientu Div DCM (0-55 %). Byl získán lipidoid 3 (81 mg, 67,7% výtěžek; Rf 0,36 v mobilní fázi D2, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlé polotuhé látky. Ή NMR (600 MHz, CDC13): δ = 7,80, 3,20, 3,02-2,96, 2,60, 2,07, 1,81-1,74, 1,37, 1,325, 1,28- 1,23, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDC13): δ = 175,90, 52,85, 52,22, 42,83, 39,42, 31,87, 31,66, 29,58, 29,48, 29,43, 29,30, 29,08, 26,84, 26,18, 26,00, 23,50, 23,16, 22,65, 14,09 ppm. IR (CCL): Vm^/crn 1 = 3293 m (v NH), 1640 s (amid I) a 1550 m (amid II), 2964 s, sh (vas CH3), 2871 m, sh (vs CH3), 2927 vs (vas CH2), 2856 s, sh (vs CH2), 1468 m a 1460 m, 1445 w (βδ CH2 a das CH3), 1378 w (δδ CH3), 721 w (β3δ CH2 a das CH2); HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro CggHiggNeCL [M + H]+ 1520,5598; nalezeno 1520,5598.
-9CZ 2021 - 345 A3
Příklad 2
Ν',Ν'-Di((hexyloxykarbonyl)butyl)hexan-l,6-diamin 6
K roztoku 5-brompentanové kyseliny (3,00 g, 16,57 mmol) v DCM (60 ml) byl přidán 1-hexanol (2,48 ml, 19,89 mmol, 1,2 ekv.), DMAP (61 mg, 0,50 mmol, 0,03 ekv.) a DIC (3,37 ml, 21,54 mmol, 1,3 ekv.), a reakční směs byla míchána 1 h při rt. Následně byla reakční směs sorbována na chromatografický silikagel (16 g), rozpouštědla byla odstraněna na RVO, a odparek byl přečištěn chromatografií na silikagelové koloně (80 g) za použití lineárního gradientu ethylacetátu v cyklohexanu (0-10 %). Byl získán hexyl 5-brompentanoát 4 (3,938 g, 89,6% výtěžek; R/0,31 v mobilní fázi CE5, detekce KMnO4) ve formě bezbarvé kapaliny.
K roztoku V7-íerc-butyloxykarbonyl-l,6-diaminohexanu (0,50 g, 2,31 mmol) v bezvodém ACN (10 ml) byl přidán hexyl 5-brompentanoát 4 (1,53 g, 5,78 mmol, 2,5 ekv.) a bezvodý K.2CO3 (3,19 g, 23,11 mmol, 10 ekv.), a reakční směs byla intenzivně míchána při 35 °C po dobu 2 dnů. Následně byla reakční směs sorbována na chromatografický silikagel (16 g), rozpouštědla byla odstraněna na RVO, a odparek byl přečištěn chromatografií na silikagelové koloně (40 g) za použití lineárního gradientu ethylacetátu v cyklohexanu (0-100 %). Byl získán amin 5 (1,080 g, 79,9% výtěžek; Rf 0,31 v mobilní fázi CE50 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve slabě nažloutlého oleje.
K roztoku látky 5 v DCM (4 ml) ochlazenému za míchání v ledové lázni na 0 °C byla přidána trifluoroctová kyselina (4 ml), a reakční směs byla ponechána 1 h při 0 °C. Poté byl roztok přelit do 500 ml dělicí baňky, naředěn 20% vodným roztokem NaHCCf (200 ml), a produkt byl extrahován DCM (150 ml, 2x50 ml). Spojená organická fáze promyta solankou (50 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, sorbována na chromatografický silikagel (16 g), rozpouštědla byla odstraněna na RVO, a odparek byl přečištěn chromatografií na silikagelové koloně (40 g) za použití lineárního gradientu Div DCM (0-80 %). Byl získán diamin 6 (0,788 g, 86,9% výtěžek; R/0,14 v mobilní fázi D2, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje. Ή NMR (600 MHz, CDCh): δ = 4,05, 3,63, 3,21, 3,15, 2,79, 2,68, 2,60, 2,51, 2,42, 2,32, 1,61, 1,50, 1,36-1,28, 0,88 ppm.13C NMR (150,9 MHz, C D C 13) : δ = 173,62, 64.52, 53,68, 53,29, 41,22, 40,26, 34.03, 31,41, 28,58, 25,75, 25,57, 22,80, 22,51, 13,98 ppm. HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro C28H57O4N2 [M + H]+ 485,43128; nalezeno 485,43052.
cřycřs-AÚAý/V-Trisíó-ídifihexyloxykarbonyllbutyllaminolhexyllcyklohexan-lAStrikarboxamid 7
Lipidoid 7 byl připraven z czyc75-l,3,5-cyklohexantrikarboxylové kyseliny (21 mg, 0,097 mmol), A7,A7-di((hexyloxykarbonyl)butyl)hexan-l,6-diaminu6 (188 mg, 389 mmol, 4 ekv.) a DIPEA (169 pl, 0,971 mmol, 10 ekv.) podle procedury popsané pro lipidoid 3 v Příkladu 1. Byl získán lipidoid 7 (55 mg, 35 %; Rf 0,42 v mobilní fázi D2, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlé polotuhé látky. Ή NMR (600 MHz, CDCh): δ = 6,23,4,05, 3,205,2,65,2,34, 2,30, 2,085, 1,63-1,60, 1,49,1,33-1,29,0,88 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCh): δ = 174,35, 173,37, 64,60, 53,35, 52,88, 43,98, 39,12, 33,79, 31,94, 31,40, 29,21, 28,57, 26,62, 26,33, 25,56, 22,58, 22,51, 13,98 ppm. IR (CC14): vmax/cm 1 = 1736 vs (vs C=O), 1173 m, 1075 w (vs C-O), 3293 m (v NH), 1640 s (amid I) a 1551 m (amid II), 2955 s (vas CH3), 2933 vs (vas CH2), 2875 m, sh (vs CH3), 2860 m (vs CH2), 1467 m a 1460 m ((βδ CH2 a das CH3), 1379 w (δ s CH3), 724 w (pas CH2 a yas CH2). HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro C^HnsNeOis [M + H]+ 1616,3110; nalezeno 1616,3095.
Příklad 3 cřycřs-AÚAý/V-Trisíó-ídidodecylaminolhexyll-lAS-triniethylcyklohexan-lAStrikarboxaniid 8
Lipidoid 8 byl připraven z C75,cz5-l,3,5-trimethyl-l,3,5-cyklohexantrikarboxylové kyseliny (20 mg,
-10 CZ 2021 - 345 A3
0,077 mmol), A7,A7-di(dodecyl)hexan-l,6-diaminu 2 (140 mg, 310 mmol, 4 ekv.) a DIPEA (135 μΐ, 0,774 mmol, 10 ekv.) podle procedury popsané pro lipidoid 3 v Příkladu 1. Byl získán lipidoid 8 (64 mg, 53 %; Rf 0,43 v mobilní fázi D2, detekce ninhydrinem) ve formě slabě nažloutlého tuhého oleje. IR (CCE): Vmax/cm 1 = 3288 w, br (v NH), 1651 m (amid I), 1585 w, br, sh a 1559 m, br (amid II), 2956 s (vas CH3), 2927 vs (vas CH2), 2878 m, sh (vs CH3), 2855 s (vs CH2), 1468 m, a 1459 m, sh, 1448 m, sh (βδ CH2 a 5as CH3) 1378 w (5S CH3); 721 w (pas CH2 a yas CH2). HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro Cio2H2osN603 [M + H]+ 1562,6068; nalezeno 1562,6011.
Příklad 4
N1,^-Didodecylpropan-l,3-dianiin 10
Amin 9 byl připraven z A7-terc-butyloxykarbonyl-l,3-diaminopropanu (6,0 g, 34,43 mmol), ndodecylaldehydu (22,91 ml, 103,30 mmol, 3 ekv.) a triacetoxyborohydridu sodného (21,89 g, 103,30 mmol, 3 ekv.) podle procedury popsané pro látku 1 v Příkladu 1. Amin 9 byl získán ve formě nažloutlého oleje (7,72 g, 43,9% výtěžek).
Odchránění aminu 9 bylo provedeno podle procedury popsané pro látku 2 v Příkladu 1; byl získán diamin 10 (4,26 g, 68,6% výtěžek; R/0,35 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje. 1H NMR (600 MHz, CDC13): δ = 3,07, 2,70,2,50,1,81,1,46,1,28,1,26, 1,25-1,29, 1,24,0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDC13): δ = 53,70, 53,30,41,18, 31,90, 29,64,29,62, 29,60,29,58,29,48, 29,33, 27,42,25,71, 23,87, 22,67, 14,10 ppm. IR (film): v^x/cm1 = 3361 w a 3274 w (v NH2), 2803 m (vs N-CH2). 2954 s (vas CH3), 2924 vs (vas CH2), 2853 s (vs CH2), 1467 m a 1456 m, sh (βδ CH2 a das CH3), 1378 w a 1364 w (ds CH3), 720 m (β3δ CH2). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro C27H59N2 [M + H]+ 411,46728; nalezeno 411,46652.
cZs,cZs-JV7,A5,JV5-Tris(3-(didodecylaniino)propyl)-l,3,5-trimethylcyklohexan-l,3,5trikarboxamid 11
Lipidoid 11 byl připraven z c/yc/5-l,3,5-trimethyl-l ,3,5-cyklohexantrikarboxylové kyseliny (20 mg, 0,077 mmol), A7,A7-di(dodecyl)propan-l,3-diaminu 10 (127 mg, 310 mmol, 4 ekv.) a DIPEA (135 pl, 0,774 mmol, 10 ekv.) podle procedury popsané pro lipidoid 3 v Příkladu 1. Byl získán lipidoid 11 (41 mg, 37% výtěžek; R/0,36 v mobilní fázi D2, detekce ninhydrinem) ve formě slabě nažloutlého tuhého oleje. IR (CCE): Vm^/crn-1 = 3303 w, vbr (v NH), 1679 s, sh (amid I), 1513 w, br, sh (amid II), 2956 s (vas CH3), 2927 vs (vas CH2), 2878 m, sh (vs CH3), 2855 s (vs CH2), 1464 m, sh (βδ CH2 a das CH3), 1380 w (ds CH3); 721 w (β3δ CH2 a yas CH2). HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro C^H^NeCE [M + H]+ 1436,4665; nalezeno 1436,4629.
Příklad 5
Linoleylaldehyd 12
K roztoku linoleylalkoholu (2,50 ml, 8,07 mmol) v DCM (120 ml) ochlazenému na 0 °C ledovou lázní byl přidán Dess-Martinův perjodinan (4,45 g, 10,49 mmol, 1,3 ekv.), a směs byla míchána 4 h při teplotě 0 °C. Poté byla reakce zastavena přídavkem roztoku thiosíranu sodného (20 g Na2S203.5H20/100 ml H2O) a nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (50 ml), a byla 1 h míchána při rt, až se původně mléčný roztok změnil na čirý. Roztok byl přelit do 1000 ml dělicí baňky, naředěn vodou (150 ml), a produkt byl extrahován DCM (150 ml, 2x50 ml). Spojená organická fáze byla promyta solankou (150 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Surová látka byla přečištěna chromatografíí na silikagelové koloně (isokratické podmínky, 5 % ethylacetátu v cyklohexanu). Byl získán aldehyd 12 (1,271 g, 59,6% výtěžek; Rf 0,36 v mobilní fázi CE5, detekce KMnO4) ve
-11 CZ 2021 - 345 A3 formě bezbarvého oleje.
JV7,JV7-Di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-l-yl)hexan-l,6-diamin 14
Amin 13 byl připraven z A7-terc-butyloxykarbonyl-Có-diaminohexanu (0,345 g, 1,59 mmol), aldehydu 12 (1,27 g, 4,78 mmol, 3 ekv.) a triacetoxyborohydridu sodného (1,01 g, 4,78 mmol, 3 ekv.) podle procedury popsané pro látku 1 v Příkladu 1. Amin 13 byl získán ve formě nažloutlého oleje (1,08 g, 94,9% výtěžek; Λ/0,18 v mobilní fázi CE20, detekce ninhydrinem).
Odchránění aminu 13 bylo provedeno ve směsi TFA (4 ml) a DCM (5 ml) podle procedury popsané pro látku 2 v Příkladu 1; byl získán diamin 14 (0,594 g, 64,0 %; Λ/0,13 v mobilní fázi D2, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje. Ή NMR (600 MHz, CDC13): δ = 5,30-5,40, 2,765, 2,73, 2,67,2,59, 2,04, 1,51, 1,385, 1,37, 1,34, 1,295, 1,29, 1,28-1,34, 1,28,0,88 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCIý. δ = 130,19, 130,06, 127,99, 127,89,53,49,53,45,41,67, 32,52,31,50, 29,62, 29,46, 29,20- 29,48, 27,37, 27,20, 27,18, 26,52, 25,61, 22,56, 14,06 ppm. IR (CC14): ν^/απ1 = 3011 s (vas =CH); 1646-1673 m (v C=C); 3455 w (vas NH2); 3394 (vs NH2); 1620 w (βδ NH2); 1087 m (v C-NH2); 2957 s, sh (vas CH3); 2928 vs (vas CH2); 2873 s, sh (vs CH3); 2856 vs (vs CH2); 2801 m (vs N-CH2); 1467 m a 1457 m, sh (βδ CH2 a bas OL); 1378 m (δδ CH3): 721 m (β3δ a Yas CH2). HRMS: m/z vypočítáno pro C42HsiN2 [M + H]+ 613,63943; nalezeno 613,63899.
cís,cís-JV7,A5,JV5-Tris(6-(di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-l-yl)amino)hexyI)-l,3,5trimethylcyklohexan-l,3,5-trikarboxamid 15
Lipidoid 15 byl připraven z czycz5-l,3,5-trimethyl-l,3,5-cyklohexantrikarboxylové kyseliny (17 mg, 0,066 mmol), A7,A7-di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-l-yl)hexan-l,6-diaminu 14 (161 mg, 273 mmol, 4 ekv.) a DIPEA (115 pl, 0,658 mmol, 10 ekv.) podle procedury popsané pro lipidoid 3 v Příkladu 1. Byl získán lipidoid 15 (86 mg, 64% výtěžek; Rf 0,36 v mobilní fázi D2, detekce ninhydrinem) ve formě slabě nažloutlého tuhého oleje. IR (CC14): Vm^/crn-1 = 3348 w, br, sh a 3302 w, br (v NH), 1656 m a 1635 m, sh (amid I + v C=C), 1565 w, sh a 1557 w, br (amid II), 3011 m (vas =C-H), 2956 s (vas CH3), 2929 vs (vas CH2), 2875 m, sh (vs CH3), 2856 s (vs CH2), 1467 m a 1450 m, sh, (βδ CH2 a bas CH3), 1379 w (6s CH3); 720 w (β3δ CH2 + Yas CH2 + γ C=H). HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro Ci38H253NeO3 [M + H]+ 2042,9829; nalezeno 2042,9861.
Příklad 6
Příprava transfekčních činidel
Činidla byla vytvořena smísením jednotlivých složek uvedených v Tabulce 1 a Tabulce 2. Obě tabulky obsahují finální molámí koncentrace v transfekčním činidle. Pro přípravu byly použity zásobní 5 mmol.l1 roztoky jednotlivých komponent v 99,7% (v/v) ethanolu. Pouze zásobní roztok DOPE-Cy5 měl koncentraci 0,79mmol.l1 a byl připraven v chloroformu. TT3 je lipid podle patentu WO 2016/187531, zde použitý pro srovnání.
-12 CZ 2021 - 345 A3
Tabulka 1. Složení transfekčních činidel A01-A6.
iátka Wco WeWAdnWWh ste/ek v t
A02 i ACM A55 ACS
3 u — —
7 — 1.1 — J........-........L —
8 i ----- 1 1 ...v —
li i ; -
15 -
ú TT3 xxxx i El
cholesterol 2,18 2,18 3,1$ i 2,18 248 2,18
KM 1,54 1,54 1.84 i w 154 1W
ĎhW W;sK (WS WS- íW 0,873 0.078 WS
Tabulka 2. Složení transfekčních činidel A07-A12.
AC? í .........AOS AW AU All
3 1,1 ΐ -......... ......... ...............A...............I...........,27............;
7 14 -- .............01.............
3 1,1 — ________________.............................V.............
11 14 ..........................
---· — 1.1
m - 1 — ...............
2 0' ϊ w «χ,Αν <·' > X W 3,18 2,18
DOPí 1 , 1 I M 1A4 :W 1,84 1,84
0071 i jN f > > X* 0,078 0,87 5 (W5
: i
HOPS CA ^'x'J i,ww l.WW i U9^WS 1,15x10s
Příklad 7
Příprava lipidických nanočástic obsahujících nukleové kyseliny
LNP obsahující siRNA (siRNA-LNP) byly připraveny následovně: 300 pl roztoku každého z transfekčních činidel A01-A06 připravených v Příkladu 6 bylo smí seno s roztokem 1,2 nmol siRNA (katalogové číslo 4392420, Ambion) v 300 μΐ 10 mmol.I1 citrátového pufiru (pH 3,0) pomocí mikrofluidního zařízení tvaru “ypsilon” se dvěma vstupy a jedním výstupem pro sběr vzorku. Lipidická směs a roztok siRNA byly vháněny separátně do každého vstupu lineární pumpou konstantním průtokem 300 μΐ/min. Vzniklý roztok nanočástic o objemu 600 μΐ byl jímán a ihned naředěn přídavkem 600 μΐ PBS; z transfekčních činidel A01-A06 tak vznikly odpovídající vzorky nanočástic označené B01-B06.
DNA kódující fluorescenční protein mKate2 byla amplifikována z plasmidu pmKate2-C (Evrogen) pomocí primem (5’-ATCAACATATGGTGAGCGAGCTG-3’ (SE Q ID NO. 1); 5’AAGAATTCCTATCATCTGTGCCCCAG-3’ (SEQ ID NO. 2)) a nakloňována do vektoru pET24a (Invitrogen) pod promotorem T7. Mediátorová RNA (mRNA) kódující mKate2 byla transkribována in vitro s použitím transkripční soupravy Ampliscribe T7-Flash (Lucigen) podle protokolu výrobce. Do in vitro transkripční reakce byl přidán analog RNA čepičky ARCA (Jena
-13 CZ 2021 - 345 A3
Bioscience) a poly(A) konec byl syntetizován pomocí poly(A) polymerasy (New England Biolabs) podle standardního protokolu.
LNP obsahující mRNA (mRNA-LNP) byly připraveny následovně: 300 pl roztoku každého z transfekčních činidel A07-A12 připravených v Příkladu 6 bylo smíseno s roztokem 120 pg mRNA v 300 μΐ 10 mmol.l1 citrátového pufru (pH 3,0), příprava probíhala analogicky jako u siRNA-LNP. Z transfekčních činidel A07-A12 tak vznikly odpovídající vzorky nanočástic označené B07-B12.
Každý ze vzorků LNP (B01-B12) byl připraven v triplikátu. Hydrodynamický průměr čerstvě vytvořených LNP byl změřen pomocí dynamického rozptylu světla (NanoZS Zetasizer, Malvem, Worcestershire, UK) pod úhlem rozptylu 173° při teplotě 25 °C. Hydrodynamický průměr siRNALNP se pohyboval v rozmezí 67-110 nm, hydrodynamický průměr mRNA-LNP v rozmezí 82-158 nm (Tab. 3.). V této podobě byly částice použity k následným biologickým testům.
Tabulka 3. Hydrodynamický průměr LNP včetně směrodatné odchylky změřený pomocí dynamického rozptylu světla.
líF Frajer LNP Přemír
ÚO1 \ A A · F 4 0 0=0 4 & í Λ>
BOó n do 1 i G X <· Λ .·>
í ? KXU . IW Xů
ξ4 X L 3,8 BIO W3 A 3 J
hiri ť. W·: Β ί 1 I ^7· 7 ..$·, X 5
BOS $5$ A v ·:·· ·χ ·χ & š. 5 i.
Příklad 8
Účinnost inkorporace nukleové kyseliny do lipidických nanočástic
Účinnost sbalení siRNA způsobující degradaci mRNA kódující tyrosyl-DNA fosfodiesterasu 2 (TDP2) do siRNA-LNP B01-B06 připravených v Příkladu 7 byla stanovena pomocí soupravy Qubit microRNA Assay Kit (Life Technologies) podle protokolu výrobce. Účinnost sbalení mRNA kódující fluorescenční protein mKate2 do mRNA-LNP B07-B12 připravených v Příkladu 7 byla stanovena pomocí soupravy Qubit RNA HS Assay Kit (Life Technologies) podle protokolu výrobce. Účinnost inkorporace byla stanovena porovnáním koncentrace siRNA a mRNA volně dostupné v roztoku nanočástic a koncentrace siRNA a mRNA uvolněné z nanočástic po jejich rozložení. LNP byly rozloženy pomocí pufru obsahujícího Triton X-100 (10 mmol.l1 Tris-HCl, pH 8,0; 0,1 mmol.l1 EDTA, 2% Triton X-100). Byla prokázána vysoká účinnost sbalení siRNA, která se pohybovala v rozmezí 76-91%. Účinnost sbalení mRNA se pohybovala v rozmezí 64-88% (Tab. 4).
Tabulka 4. Účinnost sbalení siRNA proti tyrosyl-DNA fosfodiesterase 2 (TDP2) a účinnost sbalení mRNA kódující fluorescenční protein mKate2 do LNP včetně směrodatných odchylek z triplikátů.
-14 CZ 2021 - 345 A3
I NF Sbaim 1 NF Shsksss mRN A f
100 ). O X» ± 0 b
802 4 O v 70 ± 03
803 70 ± 4,0 70,4 ± 6,0
804 »0 ± 6,9 BIO SOV x Ob
B05 75,6 ± 2 72 m 1 64,3 A 3,4
BOS 30.9 i. tkl 02 ό 3,2
Příklad 9
Buněčná toxicita LNP
Lidská buněčná linie odvozená z embryonálních buněk ledvin exprimující SV40 velký T antigen (HEK293T) a buněčná linie odvozená z lidského hepatocelulámího karcinomu (HepG2) byly kultivovány na 96-jamkových destičkách (5 x 104 buněk ve 100 pl kultivačního média na jamku) v Dulbeccovu modifikovaném médiu (DMEM) doplněném 10% fetálním hovězím sérem (FBS) při 37 °C v 5% CO2. Buňky byly transfekovány 2 μΐ LNP B07-B12 vytvořenými v triplikátech v Příkladu 7 (finální souhrnná koncentrace všech lipidických složek v jamce byla 20 pmol.l’1) nebo 10 μΐ LNP (finální koncentrace všech lipidických složek v jamce byla 100 pmol.l1) a následně inkubovány 24 hodin. Cytotoxicita LNP byla analyzována pomocí testu životaschopnosti buněk CellTiterGlo 2,0 (Promega, USA). Životaschopnost buněk byla normalizována na netransfekované buňky (kontrola). Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 5 a 6.
V případě obou použitých linií nevykazuje žádný druh nových LNP signifikatní toxicitu ve srovnání se 100 pmol.l1 směsí s lipidem TT3, u které je životaschopnost buněk HEK293T aHepG2 snížena na pouhých 27 a 15% (Tab. 6).
Tabulka 5. Cytotoxicita LNP vyjádřená jako životaschopnost buněk (%) po přídavku 20 pmol.l1 transfekční směsi B07-B12 pro jednotlivé typy buněčných linií.
1W 10
KíwOí 0X600 4,29 0)9» 3,44
067 B93 905 95 >90 4,34 6,14 93,49 0X645 9; £ 4,23 6,36
W 0)239 5,75 0)346 W
BIO 0X649 3J2 IW3 .Ý. 5,0
BU KB,51 ;Ť: 5,79 0)074 A >71
•07 5 957 194.55
Tabulka 6. Cytotoxicita LNP vyjádřená jako životaschopnost buněk (%) po přídavku 100 pmol.l’ 1 transfekční směsi B07-12 pro jednotlivé typy buněčných linií.
-15 CZ 2021 - 345 A3
Příklad 10
Transfekce siRNA pomocí nových LNP in vitro
Částice siRNA-LNP obsahující malou interferující RNA (siRNA, katalogové číslo 4392420, Ambion) způsobující degradaci mRNA kódující tyrosyl-DNA fosfodiesterasu 2 (TDP2) byly připraveny podle Příkladu 7. Jako kontrolní transfekční činidlo určené specificky pro transfekci siRNA byl použit Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen). Pro knock-down siRNA-LNP byly použity lidská buněčná linie HEK293T a buněčná linie odvozená od lidského mnohočetného myelomu, která je velmi obtížně transfekovatelná dostupnými transfekčními činidly (Brito J.L.R., Brown N., Morgan G.J. (2010) Transfection of siRNAs in Multiple Myeloma Cell L.ines. In: Min WP., Ichim T. (eds) RNA Interference. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 623. Humana Press). Buňky byly kultivovány na 96-jamkových destičkách (5 x 104 buněk ve 100 μΐ kultivačního média na jamku) v DMEM médiu doplněném 10% FBS při 37 °C v 5% CO2 Buňky byly transfekovány 2 μΐ siRNA-LNP (o finální souhrnné koncentraci všech lipidických složek 20 pmol.l1 a finální koncentraci siRNA 16 nmol.l1) a následně inkubovány 24 hodin. Transfekce byly provedeny ve třech biologických opakováních. RNA byla izolována pomocí RNAeasy Plus Micro Kit (Qiagen). cDNA byla připravena za použití TATAA GrandScript cDNA Supermix (TATAAbiocenter) podle doporučení výrobce. Kvantitativní RT-PCR byla provedena za použití LightCycler 480 (Roche Life Science). Primery pro amplifikaci mRNA kódující TDP2 byly následující: 5-CGAGAGGAGGGTCTCAAAGAG-3’ (SEQ ID NO. 3) a 5’ATTTCGGGAAGGCTGCTGTC-3’ (SEQ ID NO. 4). Pro normalizaci dat byla použita mRNA kódující GAPDH (Primery: 5’-AATCCCATCACCATCTTCCA-3’ (SEQ ID NO. 5) a 5’TGGACTCCACGACGTACTCA-3’ (SEQ ID NO. 6)).
Ve všech uvedených případech signifikantně snížily nové siRNA-LNP hladinu mRNA TDP2 v buňkách oproti komerčnímu transfekčnímu činidlu RNAiMax. V buněčné linii HEK293T mají nové LNP B02- B05 téměř 3krát větší účinnost než RNAiMax. V myelomové linii OPM-2 snižuje B03 expresi mRNA 13krát lépe v porovnání s komerčním činidlem určeným pro transfekci siRNA (Tab. 7).
Tabulka 7. Snížení hladiny mRNA endogenně exprimované TDP2 v buňkách pomocí nových siRNA- LNP (B01-B06) v porovnání s komerčním transfekčním činidlem RNAiMax v buněčné linii HEK293T a OPM-2. Statistika byla vyhodnocena Studentovým nepárovým t-testem. Hodnoty p jsou vztaženy na kontrolní transfekční směs Lipofectamine RNAiMax; hodnoty p < 0,001 značeny písmenem „a“, hodnoty p < 0,05 značeny písmenem „c“.
-16 CZ 2021 - 345 A3
LNP HEK293T P 0
L.ontróU BOJ L00 4 0,10 0,24 4 OJ? 1,00 4 OJ O 052 4 0,05
B02 0,04 4 0,0? e OJÍ 4 0,01 š
BOJ 0,95 4 0,00 c 0,04 4 0.01 s
B04 0,00 4 9,(12 < 058 4 052 &
BOS 0,05 4. 0,01 c 0,05 4 0,0 i g
B06 0,05 4 0,0 i c 0,0? 4 052 a
RNAÍNta OJ5 4 0,09 0,52 4 0,02
Příklad 11
Transfekce mRNA pomocí nových LNP in vitro
Lidská buněčná linie odvozená z embryonálních buněk ledvin exprimující SV40 velký T antigen (HEK293T), buňky jatemího karcinomu (HepG2) a buněčná linie odvozená z lidského osteosarkomu (U20S) byly kultivovány na 96-jamkových destičkách (5 x 104 buněk ve 100 pl kultivačního média na jamku) v Dulbeccovu modifikovaném médiu (DMEM) doplněném 10% fetálním hovězím sérem (FBS) při 37° C v 5% CO2. Buňky byly transfekovány 2 μΐ mRNA-LNP B07 až B12 vytvořenými v Příkladu 7 (finální souhrnná koncentrace všech lipidických složek v jamce byla 20 pmol.l1), nesoucích mRNA kódující fluorescenční protein mKate2 a následně inkubovány 24 hodin. Jako kontrolní transfekční činidlo byl použit Lipofectamine® 2000. Transfekce byly provedeny ve třech biologických opakováních, přičemž každé biologické opakování mělo tři technická opakování. Procento buněk pozitivních pro fluorescenci Cy5 indikující vstup LNP do buněk (Tab. 8), procento buněk exprimujících fluorescenční protein mKate2 a intenzita fluorescence mKate2 (Tab. 9) byly analyzovány pomocí cytometru BD LSR Fortessa. V případě intenzity fluorescence jsou data normalizována ke komerčnímu transfekčnímu činidlu Lipofectamine® 2000. Podle fluorescence Cy5 je patrné, že všechny LNP vstupují do buněk s účinností přesahující 90% (Tab. 8). Nové LNP B05 navíc produkují z transfekované mRNA 2,13krát více fluorescenčního proteinu mKate2 než buňky s kontrolní transfekcí Lipofectamine® 2000 (Tab. 9).
Tabulka 8. Transfekční účinnost nových mRNA-LNP (B07-B12) zobrazená jako procento buněk pozitivních pro Cy5 u buněčné linie HEK293T a HepG2. Transfekčních směsi obsahují lipid značený fluorescenční barvou Cy5, díky kterému je možné pozorovat vstup LNP do buněk.
LNP Krpí S Λ
-n- sáíg 98,59 A 0,15
BO? 09 J 9 4 9,09 94,7 3 A 0,88
B03 97,82 a 9,93 99,52 a 2,39
B04 97,79 a 0J6 92,93 A 0,77
B05 98,59 A 9,4? 90,49 4 1,79
BOB 97,94 A 9,94 95J 9 4 0,94
- 17 CZ 2021 - 345 A3
Tabulka 9. Účinnost transfekce nových mRNA-LNP vyjádřená jako procento buněk exprimujících fluorescenční protein mKate2 a intenzita fluorescence mKate2 z mRNA transfekované částicemi pro buněčnou linii U20S. Statistika byla vyhodnocena Studentovým nepárovým t-testem. Hodnoty p jsou vztaženy na kontrolní transfekční směs Lipofectamine2000; hodnoty p < 0,001 značeny písmenem „a“.
INF % hussěk exprimujL F F
20* i LU 0.W ± 0,66
BOŽ 83.62 i 0,60 a 1,88 a 0,07
B83 88,38 * O a 1,70 & 8.2' a
B04 84,40 ± O* 8,88 a ACS
803 813? * 243 a 2,13 a 0,14
B48 40,83 ± 8,82 a L86 a ó,3 í &
LipWíj 47,67 ± 1,2.$ 1.08 a 0,05
Průmyslová využitelnost
Transfekční částice obsahující lipidoidy podle předkládaného vynálezu jsou využitelné pro řadu biologických aplikací v základním výzkumu, zejména pro transfekce buněčných kultur či zvířat s cílem doručení aktivní NK a následného umlčení či aktivace chromozomálního genu či genů, editaci genomu nebo transkriptomu či umožnění exprese daného proteinu kódovaného NK vloženou pomocí transfekční částice.
Ve veterinární a humánní medicíně lze transfekční částice obsahující lipidoidy obecného vzorce I s výhodou využít pro terapeutické účely či profylaktické účely. Částice obsahující terapeutickou NK lze do zvířete či člověka administrovat s cílem umlčení či aktivace chromozomálních genu/ů, umlčení nebo aktivace imunogenů, inhibice či aktivace signálních drah, editace genomu nebo transkriptomu či umožnění exprese daného proteinu/ů kódovaného NK.
Lipidoidy obecného vzorce I nebo transfekční činidla nebo transfekční částice lze rovněž použít jako léčiva, zejména pro genovou terapii, jsou vhodné pro použití pro léčbu malignit a/nebo genetických poruch. Také je lze formulovat pro kosmetické či biotechnologické použití.

Claims (13)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Lipidoid obecného vzorce
    (I), kde
    X je zvoleno ze skupiny, zahrnující -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=S)O-, -C(=O)S-, -C(=S)S-, C(=O)NHNH-, -CH2-, -0-, -OC(=O)-, -S-, -SC(=O)-, -NH-, -NHNH-, -NHC(=O), -NHNHC(=0)-, -C^C-, -CH=CH-, pětičlenný heterocyklus obsahující alespoň 2 atomy dusíku, -CH2C(=O)NH-, CH2C(=O)O-, -CH2C(=S)O-, -CH2C(=S)S-, -CH2C(=0)NHNH-, -N=CH-, -CH=N-;
    Y je alkylenový řetězec C2-Cio, ve kterém může být nahrazena jedna nebo více skupin CH2 jedním nebo více atomy O a/nebo S;
    Z jsou vzájemně stejné nebo různé, přičemž každé Z je zvoleno ze skupiny, zahrnující atom vodíku, -OH, -CH3, -CH2OH, -NH2, -C(=O)NH2, -CONH(CH2)2OH, -CON[(CH2)2OH]2, CONHCH(CH2OH)2, -CONHCH2CH(-OH)CH2OH, -CONH(CH2)2C(=O)NH2, CON[CH2C(=O)NH2]2, -CONHCH[C(=O)NH2]2, -CONH(CH2)2NHC(=O)NH2, -N+(CH3)2(CH2)3-SO3,-N+(CH3)2-(CH2)2-COO-,
    Rjsou stejné nebo různé, přičemž každé Rje zvoleno ze skupiny, zahrnující alkyl C8-C2o, alkenyl C8-C2o, alkynyl C8-C2o, kdy v uvedeném alkylu, alkenylu nebo alkynylu může být volitelně jedna nebo více z -CH2- skupin nahrazena jednou nebo více skupinami, vybranými z -CH(OH)-, OC(=O)-, -C(=O)O-, -S-S-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)-, -0-, -S-;
    a jejich farmaceuticky přijatelné soli, adiční soli a solváty.
    - 19CZ 2021 - 345 A3
  2. 2. Lipidoid podle nároku 1, kde X je vybráno ze skupiny, zahrnující -C(=0)NH-, pětičlenný heterocyklus obsahující alespoň 2 atomy dusíku a -C(=O)O-.
  3. 3. Lipidoid podle nároku 1 nebo 2, kde Rjsou nezávisle vybrány ze skupiny alkyl C8-C20 a alkenyl C8-C20, přičemž v uvedeném alkylu nebo alkenylu může být volitelně jedna nebo více z CH2- skupin nahrazena jednou nebo více skupinami, vybranými z -CH(OH)-, -OC(=O)-, C(=O)O-.
  4. 4. Lipidoid podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde všechna Rjsou stejná, nebo jsou všechny atomy dusíku substituovány shodně dvěma stejnými R nebo dvěma různými R.
  5. 5. Transfekční činidlo, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 v množství 10 až 50 molámích procent, a alespoň jeden pomocný lipid v celkovém množství 50 až 90 molámích procent.
  6. 6. Transfekční činidlo podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I v množství 15 až 30 molámích procent, cholesterol v množství 30 až 55 molámích procent, a alespoň jeden další pomocný lipid v množství 20 až 50 molámích procent.
  7. 7. Transfekční částice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, alespoň jednu nukleovou kyselinu a/nebo její kratší úsek a/nebo její derivát, a s výhodou dále alespoň jeden pomocný lipid.
  8. 8. Použití lipidoidu obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo transfekčního činidla podle nároku 5 nebo 6, nebo transfekční částice podle nároku 7 pro in vitro transfekci buněk či tkání nukleovou kyselinou a/nebo jejím kratším úsekem a/nebo jejím derivátem.
  9. 9. Použití podle nároku 8 pro umlčení či aktivaci chromozomálního/ch genu/ů, umlčení nebo aktivaci imunogenů, inhibici či aktivaci signálních drah, editaci genomu nebo transkriptomu, či umožnění exprese proteinu/ů kódovaného nukleovou kyselinou.
  10. 10. Lipidoid obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo transfekční činidlo podle nároku 5 nebo 6, nebo transfekční částice podle nároku 7 pro použití pro transfekci buněk či tkání nukleovou kyselinou a/nebo jejím kratším úsekem a/nebo jejím derivátem in vivo, kromě transfekce lidských embryí pro využití pro průmyslové či komerční účely, a kromě modifikace lidské zárodečné linie.
  11. 11. Lipidoid obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo transfekční činidlo podle nároku 5 nebo 6, nebo transfekční částice podle nároku 7 pro použití podle nároku 10 pro umlčení či aktivaci chromozomálních genu/ů, umlčení nebo aktivaci imunogenů, inhibici či aktivace signálních drah, editace genomu nebo transkriptomu, či umožnění exprese daného proteinu/ů kódovaného nukleovou kyselinou.
  12. 12. Lipidoid obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo transfekční činidlo podle nároku 5 nebo 6, nebo transfekční částice podle nároku 7 pro použití jako léčivo, zejména pro genovou terapii, s výhodou pro léčbu malignit a/nebo genetických poruch.
  13. 13. Použití lipidoidu obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo transfekčního činidla podle nároku 5 nebo 6, nebo transfekční částice podle nároku 7 v kosmetických přípravcích pro doručení aktivní látky na místo účinku.
CZ2021-345A 2021-07-19 2021-07-19 Cyklohexanové lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití CZ2021345A3 (cs)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021-345A CZ2021345A3 (cs) 2021-07-19 2021-07-19 Cyklohexanové lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
BR112023025647A BR112023025647A2 (pt) 2021-07-19 2022-07-15 Lipidóides, agente e partícula de transfecção, e, uso do lipidóide
PCT/CZ2022/050065 WO2023001323A1 (en) 2021-07-19 2022-07-15 Cyclohexane lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof
AU2022314101A AU2022314101A1 (en) 2021-07-19 2022-07-15 Cyclohexane lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof
CN202280050919.4A CN117677603A (zh) 2021-07-19 2022-07-15 用于核酸转染的环己烷类脂质及其用途
KR1020247003222A KR20240027760A (ko) 2021-07-19 2022-07-15 핵산 형질감염을 위한 사이클로헥산 리피도이드 및 그 용도
CA3221027A CA3221027A1 (en) 2021-07-19 2022-07-15 Cyclohexane lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof
EP22755064.7A EP4373804A1 (en) 2021-07-19 2022-07-15 Cyclohexane lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2021-345A CZ2021345A3 (cs) 2021-07-19 2021-07-19 Cyklohexanové lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2021345A3 true CZ2021345A3 (cs) 2023-02-01

Family

ID=82939774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2021-345A CZ2021345A3 (cs) 2021-07-19 2021-07-19 Cyklohexanové lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP4373804A1 (cs)
KR (1) KR20240027760A (cs)
CN (1) CN117677603A (cs)
AU (1) AU2022314101A1 (cs)
BR (1) BR112023025647A2 (cs)
CA (1) CA3221027A1 (cs)
CZ (1) CZ2021345A3 (cs)
WO (1) WO2023001323A1 (cs)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116082184B (zh) * 2023-04-12 2023-06-30 山东大学 基于环己二胺的可电离脂质、脂质纳米颗粒及其制备方法与应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3297637T3 (da) 2015-05-21 2021-08-02 Ohio State Innovation Foundation Benzen-1,3,5-tricarboxamidderivater og anvendelser deraf
US11622942B2 (en) * 2017-11-14 2023-04-11 Ohio State Innovation Foundation Benzene-1,3,5-tricarboxamide derived ester lipids and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
BR112023025647A2 (pt) 2024-02-27
KR20240027760A (ko) 2024-03-04
CN117677603A (zh) 2024-03-08
WO2023001323A1 (en) 2023-01-26
EP4373804A1 (en) 2024-05-29
AU2022314101A1 (en) 2023-12-21
CA3221027A1 (en) 2023-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11858884B2 (en) Compositions and methods for modulating gene or gene product in cells
Hattori et al. siRNA delivery into tumor cells by lipid-based nanoparticles composed of hydroxyethylated cholesteryl triamine
CZ2021345A3 (cs) Cyklohexanové lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
Yue et al. Synthesis of bifunctional molecules containing [12] aneN 3 and coumarin moieties as effective DNA condensation agents and new non-viral gene vectors
Swami et al. Effect of homobifunctional crosslinkers on nucleic acids delivery ability of PEI nanoparticles
JP7260717B2 (ja) 核酸トランスフェクションのためのリピドイドおよびその使用
CA3215509A1 (en) All-in-one dendrimer-based lipid nanoparticles enable precise hdr-mediated gene editing in vivo
US11479769B2 (en) Technique for treating cancer using structurally-reinforced S-TuD
US10087465B2 (en) Trans-acting elements for intracellular delivery of nucleic acid sequences
WO2023216232A1 (zh) 一种含有二硫键的脂质化合物及其组合物
US20230081736A1 (en) Lipid-polymer based complexation and delivery of nucleic acids
WO2023190166A1 (ja) ジスルフィド結合を有するカチオン性脂質、これを含む脂質膜構造体、これらのいずれかを含む核酸導入剤及び医薬品組成物、核酸を細胞又は標的細胞内へ導入する方法、及び細胞医薬品の製造方法
CA3227705A1 (en) Use of fa-type lipid compounds in preparation of nucleic acid delivery reagent and related product
Qian et al. Synthesis of Novel Cholesterol-Based Ionizable Lipids for Mrna Delivery