JP2021024831A - アミロイドβタンパク質オリゴマーと結合するヒト化抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
アミロイドβタンパク質(Aβ)オリゴマーと結合するヒト化モノクローナル抗体であって、
CDR1として配列番号1に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号2に記載のアミノ酸配列、及びCDR3として配列番号3に記載のアミノ酸配列を有する重鎖と、
CDR1として配列番号4に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号5に記載のアミノ酸配列、及びCDR3として配列番号6に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖と
を含むヒト化モノクローナル抗体。
項2.
配列番号7に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖と、
配列番号8に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖と
を含む、項1に記載のヒト化モノクローナル抗体。
項3.
配列番号7に記載のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有する重鎖と、
配列番号8に記載のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有する軽鎖と
を含む、請求項1に記載のヒト化モノクローナル抗体。
項4.
Aβオリゴマーに選択的結合を示す、項1〜3のいずれ一項に記載のヒト化モノクローナル抗体。
項5.
項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含有する、抗認知機能障害剤。
項6.
項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含有する、アルツハイマー病治療剤。
項7.
項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含有する、老人班形成抑制剤。
項8.
項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含有する、Aβアミロイド線維形成阻害剤。
項9.
項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を用いて、被験者から採取された試料に含まれるAβオリゴマーを検出する工程を含み、
Aβオリゴマーの検出量を、基準値より多い場合にはアルツハイマー型認知症(AD)であり、基準値より少ない場合にはアルツハイマー型認知症(AD)ではない、という基準と比較することにより、前記被検者がADを発症しているか否かを試験する方法。
項10.
項9に記載の方法のために用いられる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含むキット。
本発明のヒト化モノクローナル抗体は、アミロイドβタンパク質(Aβ)オリゴマーと結合するヒト化抗体であって、CDR1として配列番号1に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号2に記載のアミノ酸配列、及びCDR3として配列番号3に記載のアミノ酸配列を有する重鎖と、CDR1として配列番号4に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号5に記載のアミノ酸配列、及びCDR3として配列番号6に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含むヒト化モノクローナル抗体である。
本発明のヒト化モノクローナル抗体は、Aβオリゴマーに特異的に結合する性質を有する。この性質を利用して、本発明のヒト化モノクローナル抗体を有効成分として含む医薬を提供できる。
本発明の試験方法は、
本発明のヒト化モノクローナル抗体を用いて、被験者から採取された試料に含まれるAβオリゴマーを検出する工程を含み、
Aβオリゴマーの検出量を、基準値より多い場合にはアルツハイマー型認知症(AD)であり、基準値より少ない場合にはアルツハイマー型認知症(AD)ではない、という基準と比較することにより、前記被検者がADを発症しているか否かを試験する方法である。
本発明のキットは、本発明の試験方法のために用いられる、本発明のヒト化モノクローナル抗体を含むキットである。
抗Aβオリゴマー抗体ヒト化抗体の作製
(1)抗Aβオリゴマー6H4ヒト化抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列の設計
始めに、IMGTとKabat [Sequences of Proteins of Immunological Internet, US Dept. Health and Human Services (1991)]の報告に基づいて、以前に作製した抗Aβオリゴマーマウスモノクローナル抗体6H4のVHのアミノ酸配列(配列番号7)のCDR配列を決定した。その結果、VHのCDR1〜3を配列番号1〜3とした。
抗Aβオリゴマーヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードするDNAは、6H4VHおよび6H4VLのアミノ酸配列をコードするDNA(配列番号17、18)で用いられているコドンを利用し、アミノ酸改変を行う場合は、哺乳動物細胞において高頻度で使用されるコドンを用いて、作製した。
上記(1)で設計した配列番号7に表される抗Aβオリゴマーヒト化抗体のVHのアミノ酸配列6H4VH0、および上記(2)の方法により設計した図1に示されるVH1、VH2、VH3、VH4をコードするcDNAを全合成にて作成した。
上記(1)で設計した配列番号8に表される抗Aβオリゴマーヒト化抗体のVLのアミノ酸配列6H4VL0、および上記(2)の方法により設計した図2に示されるVL1、VL2、VL3、VL4をコードするcDNAを全合成にて作成した。
ヒト化抗体発現用ベクターpVITRO-DHFR3の適当な位置に上記(3)および(4)で得られた6H4VH0またはVH1、VH2、VH3、VH4をコードするcDNA、並びに6H4VL0、VL1、VL2、VL3、VL4のいずれか1つをコードするcDNAを挿入し、各種抗Aβオリゴマーヒト化抗体発現ベクターを構築した。
上記(5)で得られた抗Aβオリゴマーヒト化抗体発現ベクターを用いて抗Aβオリゴマーヒト化抗体の動物細胞での発現を、常法[Antibody Engineering, A Practical Guide, W.H. Freeman and Company(1992)]により行い、抗Aβオリゴマーキメラ抗体(VH0VL0)と抗Aβオリゴマーヒト化抗体(VH1VL1、VH1VL2、VH1VL3,VH1VL4、VH2VL1,VH2VL2,VH2VL3,VH2VL4, VH3VL1,VH3VL2,]VH3VL3,VH3VL4, VH4VL1,VH4VL2、VH4VL3,VH4VL4)を産生する形質転換株を取得した。
本実施例(6)で得られた形質転換株を、CHO-S細胞を用いて通常の培養法で培養した後、培養上清を回収し、Protein A精製でIgG1抗Aβオリゴマーヒト化抗体画分を取得し、透析後蛋白濃度を測定した。
このアッセイ法に用いたAβオリゴマーは合成Aβ1-40(HCl form)をPBSにより0.1mg/mlの濃度に希釈し37℃で1時間保温することで調整した。Aβモノマーは合成Aβ1-40(TFA form)をPBSにより0.1mg/mlの濃度に希釈し37℃で1時間保温することで調整した。まず、96well-immunoplateにAβオリゴマー400ng/wellを固相化し、続いてBSAを用いてブロッキングを行った。ヒト化抗体及び6H4抗体及びコントロールとして抗Aβ抗体(6E10)を100pg/ml〜100μg/mlの範囲で段階希釈したAβモノマーあるいはAβオリゴマーをそれぞれ混合し2時間保温後、上記96well-immunoplateにそれぞれ添加し室温にて10分間保温した。固相化Aβオリゴマーと各抗体の結合力は、HRP標識抗マウスもしくは抗ヒトIgG抗体とTMB溶液を用いた発色反応を450nmの吸光度を測定することで検出した。
また、6H4抗体及びそのヒト化抗体(VH0VL0と、そのキメラ抗体に劣るKd値の一つであるヒト化抗体VH1VL4、ほぼ同等のKd値である5種類のVH2VL3、VH2VL4、VH3VL1、VH3VL2とVH4VL1、一方で勝るKd値である2種類のVH3VL4とVH4VL3のAβオリゴマー誘発性神経毒性中和活性は以下の方法を用いて評価した。まず、ヒト神経芽種細胞(SH-SY5Y) を24well plateに15,000個/wellの密度で10%FBSを含むDMEM中で24時間培養した。次に、培地を抗体添加または無添加のAβ1-42(37.5μg 12.5μM)+Tamura標識Aβ1-40(12.5μg 12.5μM) を含む血清不含培地に置き換えてさらに24時間培養した。Aβオリゴマーが惹起する細胞死は、培地中に放出された死細胞由来のLDHの量をCytoTox96キット(Promega社製) により測定した(図4左半参照)。Aβオリゴマーが惹起する細胞毒性は、Live/Dead二色蛍光アッセイを製造元の指示(Molecular Probes, Eugene, Oregon) に従って評価した(図4右半参照:代表例として6H4, VH0VL, VH4VL3を提示)。
配列番号2;HCDR2のアミノ酸配列
配列番号3;HCDR3のアミノ酸配列
配列番号4;LCDR1のアミノ酸配列
配列番号5;LCDR2のアミノ酸配列
配列番号6;LCDR3のアミノ酸配列
配列番号7;6H4VH0のアミノ酸配列
配列番号8;6H4VL0のアミノ酸配列
配列番号9;6H4VH1のアミノ酸配列
配列番号10;6H4VH2のアミノ酸配列
配列番号11;6H4VH3のアミノ酸配列
配列番号12;6H4VH4のアミノ酸配列
配列番号13;6H4VL1のアミノ酸配列
配列番号14;6H4VL2のアミノ酸配列
配列番号15;6H4VL3のアミノ酸配列
配列番号16;6H4VL4のアミノ酸配列
配列番号17;6H4VH0をコードするDNA配列
配列番号18;6H4VL0をコードするDNA配列
Claims (10)
- アミロイドβタンパク質(Aβ)オリゴマーと結合するヒト化モノクローナル抗体であって、
CDR1として配列番号1に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号2に記載のアミノ酸配列、及びCDR3として配列番号3に記載のアミノ酸配列を有する重鎖と、
CDR1として配列番号4に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号5に記載のアミノ酸配列、及びCDR3として配列番号6に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖と
を含むヒト化モノクローナル抗体。 - 配列番号7に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖と、
配列番号8に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖と
を含む、請求項1に記載のヒトモノクローナル化抗体。 - 配列番号7に記載のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有する重鎖と、
配列番号8に記載のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有する軽鎖と
を含む、請求項1に記載のヒト化モノクローナル抗体。 - Aβオリゴマーに選択的結合を示す、請求項1〜4のいずれ一項に記載のヒト化モノクローナル抗体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含有する、抗認知機能障害剤。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含有する、アルツハイマー病治療剤。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含有する、老人班形成抑制剤。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含有する、Aβアミロイド線維形成阻害剤。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を用いて、被験者から採取された試料に含まれるAβオリゴマーを検出する工程を含み、
Aβオリゴマーの検出量を、基準値より多い場合にはアルツハイマー型認知症(AD)であり、基準値より少ない場合にはアルツハイマー型認知症(AD)ではない、という基準と比較することにより、前記被検者がADを発症しているか否かを試験する方法。 - 請求項9に記載の方法のために用いられる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含むキット。
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