JP2021023256A - Composition for autophagy promotion, method for promoting autophagy, composition for suppressing infection of bacteria, and method for suppressing infection of bacteria - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、飲食品、医薬、培地、培地添加物等の形態であることのできるオートファジー促進用組成物に関する。
本発明はまた、培養細胞においてオートファジーを促進する方法に関する。
本発明はまた、動物又は植物の生体内に存在する細胞への細菌の感染を抑制するための組成物に関する。
本発明はまた、細胞への細菌の感染を抑制する方法に関する。
The present invention relates to an autophagy-promoting composition that can be in the form of foods and drinks, pharmaceuticals, media, culture media additives and the like.
The present invention also relates to a method of promoting autophagy in cultured cells.
The present invention also relates to compositions for suppressing bacterial infection of cells present in the body of an animal or plant.
The present invention also relates to methods of suppressing bacterial infection of cells.
Ｌ−エルゴチオネイン（本明細書では「ＥＧＴ」と表記する場合がある）は含硫アミノ酸の一種であり、抗酸化能をはじめとする多様な生理活性を有することが知られている。 L-ergothioneine (sometimes referred to as "EGT" in the present specification) is a kind of sulfur-containing amino acid, and is known to have various physiological activities including antioxidant ability.
例えば非特許文献１では、ＥＧＴが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）とアジュバントとからなるガンワクチンによる免疫治療の効果を向上させる作用を有することが記載されている。特許文献１では、ＥＧＴが細菌による感染症を治療する作用を有することが記載されている。特許文献１の実験１では、５ｍＭ及び５０ｍＭのＥＧＴが大腸菌の増殖を抑制することが確認されていることから、特許文献１に記載の細菌の感染症抑制は、ＥＧＴが細菌の増殖を直接に抑制することによるものだと理解できる。 For example, Non-Patent Document 1 describes that EGT has an action of improving the effect of immunotherapy with a cancer vaccine consisting of a tumor-related antigen (TAA) and an adjuvant. Patent Document 1 describes that EGT has an action of treating bacterial infections. In Experiment 1 of Patent Document 1, it was confirmed that 5 mM and 50 mM EGT suppressed the growth of Escherichia coli. Therefore, in the suppression of bacterial infection described in Patent Document 1, EGT directly suppresses the growth of bacteria. It can be understood that it is due to suppression.
非特許文献２では、トールライク受容体リガンドによる刺激条件下でのマウス骨髄由来マクロファージによるサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０）の生産が、１０ｍＭのＥＧＴにより促進され、１ｍＭのＥＧＴでは促進されないこと、及び、Ｆ４／８０マクロファージとＯＴ−ＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞との共培養において、ＯＴ−ＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１７極性化が３０ｍＭのＥＧＴにより促進されることが記載されている。このように非特許文献２では、１０ｍＭ以上の高濃度のＥＧＴがマクロファージを活性化させることが記載されている。 In Non-Patent Document 2, 10 mM EGT promoted the production of cytokines (IL-6, IL-12p40, IL-1β, IL-10) by mouse bone marrow-derived macrophages under stimulation conditions with tall-like receptor ligands. It is not promoted by 1 mM EGT, and Th17 polarization of OT-II CD4 + T cells is promoted by 30 mM EGT in co-culture of F4 / 80 macrophages and OT-II CD4 + T cells. Have been described. As described above, Non-Patent Document 2 describes that a high concentration of EGT of 10 mM or more activates macrophages.
非特許文献３は、ＥＧＴの生理活性についての総説である。非特許文献３ではＥＧＴは動物及び植物の体内に吸収・蓄積されることが記載されている。 Non-Patent Document 3 is a review article on the physiological activity of EGT. Non-Patent Document 3 describes that EGT is absorbed and accumulated in the bodies of animals and plants.
一方、オートファジーは細胞が、細胞内のタンパク質やオルガネラを分解・代謝する細胞現象である。オートファジーは細胞の機能維持のために重要な役割を担っており、飢餓ストレス等で誘導される生体防御機構の一つと考えられている。オートファジーは外来物質の侵入や変性タンパク質が生成した場合等にも誘導され、細胞内浄化に関与することから、様々な疾病との関わりが注目されている。 On the other hand, autophagy is a cellular phenomenon in which cells decompose and metabolize intracellular proteins and organelles. Autophagy plays an important role in maintaining cell function, and is considered to be one of the biological defense mechanisms induced by starvation stress and the like. Autophagy is also induced when foreign substances invade or denatured proteins are produced, and is involved in intracellular purification. Therefore, its involvement with various diseases is drawing attention.
特許文献２では、梅肉エキスの疎水性有機溶媒抽出物等がオートファジーを誘導する作用を有することが開示されている。 Patent Document 2 discloses that a hydrophobic organic solvent extract of ume meat extract or the like has an action of inducing autophagy.
非特許文献４には、植物においてもオートファジーが細胞死や免疫応答に関与すること、オートファジーが植物の生存に必要であることが記載されている。 Non-Patent Document 4 describes that autophagy is involved in cell death and immune response even in plants, and that autophagy is necessary for plant survival.
動物、植物、微生物等の細胞でのオートファジーを促進することで様々な疾患又は症状を改善することができる。また細胞のオートファジーを促進することができれば、オートファジーの研究において有益である。 Various diseases or symptoms can be improved by promoting autophagy in cells of animals, plants, microorganisms and the like. It would also be beneficial in the study of autophagy if it could promote cell autophagy.
そこで本発明は、オートファジーを促進する作用を有する組成物、細胞においてオートファジーを促進する方法、オートファジーを促進することで細菌の感染を抑制するための組成物、並びに、オートファジーを促進して細菌の感染を抑制する方法を提供する。 Therefore, the present invention relates to a composition having an action of promoting autophagy, a method of promoting autophagy in cells, a composition for suppressing bacterial infection by promoting autophagy, and promoting autophagy. To provide a method of suppressing bacterial infection.
本発明者は鋭意検討し、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体が細胞におけるオートファジーを促進する作用を有することを見出し、以下の発明を完成した。
本発明の第一の態様は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含む、オートファジー促進用組成物である。
The present inventor has studied diligently and found that L-ergothioneine or an analog of L-ergothioneine has an action of promoting autophagy in cells, and completed the following invention.
A first aspect of the present invention is an autophagy-promoting composition comprising L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog.
本発明の第二の態様は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含む培地中で細胞を培養することを含む、細胞においてオートファジーを促進する方法である。 A second aspect of the invention is a method of promoting autophagy in cells, comprising culturing the cells in a medium containing L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog.
本発明の第三の態様は、動物又は植物の生体内に存在する細胞への細菌による感染を抑制するための組成物であって、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含有すること、及び、前記細胞の周囲に、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体が送達されるように、動物又は植物に投与されることを特徴とする組成物である。 A third aspect of the present invention is a composition for suppressing bacterial infection of cells existing in the living body of an animal or plant, which contains L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog, and , A composition characterized in that it is administered to an animal or plant such that L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog having a concentration of 0.05 mM to 2.0 mM is delivered around the cells.
本発明の第四の態様は、ヒト生体内に存在する細胞以外の細胞への細菌の感染を抑制する方法であって、前記細胞を、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体と接触させることを含む方法である。 A fourth aspect of the present invention is a method for suppressing bacterial infection of cells other than cells existing in a human body, wherein the cells are subjected to L-ergothioneine at a concentration of 0.05 mM to 2.0 mM or. A method comprising contacting with an L-ergothioneine analog.
本発明の第一の態様に係る組成物は、生体内又は生体外で、細胞のオートファジーを促進することができる。
本発明の第二の態様に係る方法によれば、培養細胞においてオートファジーを促進することができる。
本発明の第三の態様に係る組成物は、動物又は植物の生体内に存在する細胞への、細菌による感染を抑制することができる。
本発明の第四の態様に係る方法によれば、細胞への細菌の感染を抑制することができる。
The composition according to the first aspect of the present invention can promote autophagy of cells in vivo or in vitro.
According to the method according to the second aspect of the present invention, autophagy can be promoted in cultured cells.
The composition according to the third aspect of the present invention can suppress bacterial infection of cells existing in the living body of an animal or a plant.
According to the method according to the fourth aspect of the present invention, bacterial infection of cells can be suppressed.
Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体
Ｌ−エルゴチオネインは、ヒスチジン誘導体（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｌ−２−チオヒスチジン）であり、その構造は次式で表される。
L-ergothioneine or L-ergothioneine analog L-ergothioneine is a histidine derivative (N, N, N-trimethyl-L-2-thiohistidine), and its structure is represented by the following formula.
Ｌ−エルゴチオネイン類縁体とは、Ｌ−エルゴチオネインと同等機能を有する化合物であれば良く、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−２−チオヒスチジンが例示でき、その構造は次式で表される。 The L-ergothioneine analog may be a compound having the same function as L-ergothioneine. Specifically, N, N-dimethyl-L-2-thiohistidine can be exemplified, and its structure is represented by the following formula. Will be done.
本発明で用いるＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体は、遊離体の形態であってもよく、塩の形態であってもよい。塩は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体のカルボキシル基で形成された塩であってもよいし、トリメチルアミノ基又はジメチルアミノ基で形成された塩であってもよい。また、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体は水和物等の溶媒和物であってもよい。 The L-ergothioneine or L-ergothioneine analog used in the present invention may be in the form of a free form or in the form of a salt. The salt may be a salt formed of a carboxyl group of L-ergothioneine or an analog of L-ergothioneine, or a salt formed of a trimethylamino group or a dimethylamino group. Further, the L-ergothioneine or the L-ergothioneine analog may be a solvate such as a hydrate.
本発明において「Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体」とは、Ｌ−エルゴチオネイン及びＬ−エルゴチオネイン類縁体から選択される少なくとも１種を指し、複数種の組み合わせも包含する。 In the present invention, "L-ergothioneine or L-ergothioneine analog" refers to at least one selected from L-ergothioneine and L-ergothioneine analog, and includes a combination of a plurality of types.
オートファジー
オートファジーは、自食作用とも呼ばれ、細胞内の主要な分解経路である。
Autophagy Autophagy, also called autophagy, is the major intracellular degradation pathway.
オートファジーは、細胞質中の一部で不要なタンパク質とリン脂質とが集まりオートファゴソームと呼ばれる二重膜構造を形成することと、オートファゴソームにライソソームが融合ししてオートライソソームを形成し、オートライソソームの内部でライソソームに由来する分解酵素の働きで不要なタンパク質が消化されることを含む。 In autophagy, unnecessary proteins and phospholipids gather in a part of the cytoplasm to form a bilayer structure called autophagosome, and autophagosomes are fused with lysosomes to form autophagosomes, which form autophagosomes. It involves the digestion of unwanted proteins by the action of degrading enzymes derived from lysosomes inside the body.
本発明において、オートファジーの促進は、オートファゴソームに特徴的なＬＣ３Ｂ−ＩＩ（ＬＣ３Ｂ−Ｉにフォスファチジルエタノールアミンが結合したもの）の細胞内での増加を指標として評価してもよいし、オートライソソームの増加を指標として評価してもよい。細胞内のＬＣ３Ｂ−ＩＩ量の測定方法は特に限定されないが、例えば、細胞の溶解液中のＬＣ３Ｂ−ＩＩを、抗ＬＣ３Ｂ抗体を用いた免疫学的方法により定量する方法が例示できる。細胞内のオートライソソーム量の測定方法は特に限定されないが、例えば、生細胞内のオートライソソームを特異的に染色することができる試薬（例えばＤＡＬＧｒｅｅｎ）を用いて定量する方法が例示できる。 In the present invention, the promotion of autophagy may be evaluated using the intracellular increase of LC3B-II (LC3B-I bound to phosphatidylethanolamine) characteristic of autophagosomes as an index. The increase in autophagosomes may be used as an index for evaluation. The method for measuring the amount of LC3B-II in cells is not particularly limited, and examples thereof include a method for quantifying LC3B-II in a cell lysate by an immunological method using an anti-LC3B antibody. The method for measuring the amount of autolysosomes in cells is not particularly limited, and for example, a method for quantifying using a reagent capable of specifically staining autolysosomes in living cells (for example, DALGreen) can be exemplified.
オートファジー促進用組成物
本発明のオートファジー促進用組成物は、生体内又は生体外において、細胞のオートファジーを促進する作用を有する。
Composition for promoting autophagy The composition for promoting autophagy of the present invention has an action of promoting autophagy of cells in vivo or in vitro.
本発明のオートファジー促進用組成物が投与又は適用される対象は、動物又は植物の生体、動物又は植物に由来する細胞、或いは、酵母等のオートファジーの機能を有する微生物の細胞であることができる。動物はヒト又は非ヒト動物（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ等）であることができる。 The subject to which the composition for promoting autophagy of the present invention is administered or applied is a living body of an animal or plant, cells derived from an animal or plant, or cells of a microorganism having an autophagy function such as yeast. it can. The animal can be a human or non-human animal (eg, dog, cat, horse, cow, etc.).
オートファジー促進用組成物は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を少なくとも含有し、他の成分を更に含んでいても良い。 The composition for promoting autophagy contains at least L-ergothioneine or an analog of L-ergothioneine, and may further contain other components.
オートファジー促進用組成物は、医薬組成物、飲食品組成物、肥料組成物、植物生長調節用組成物、飼料組成物、細胞培養用の培地、細胞培養用の培地に添加するための培地添加用組成物等の形態であることができる。 The composition for promoting autophagy is a pharmaceutical composition, a food or drink composition, a fertilizer composition, a composition for controlling plant growth, a feed composition, a medium for cell culture, and a medium addition for addition to a medium for cell culture. It can be in the form of a composition or the like.
オートファジー促進用組成物が医薬組成物である場合、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体に加えて、医薬として許容される他の成分、例えば賦形剤、担体等を更に含んでいてよい。 When the composition for promoting autophagy is a pharmaceutical composition, in addition to L-ergothioneine or an analog of L-ergothioneine, other pharmaceutically acceptable components such as excipients and carriers may be further contained.
医薬組成物の剤形は限定されない。医薬組成物の剤形は、例えば、注射剤、輸液剤、経口液剤、ローション等の液体であってもよいし、クリーム、パスタ、軟膏等の半固体であってもよいし、錠剤、粉末、顆粒、トローチ、座薬等の固体であってもよいし、用時調製可能な乾燥粉末の形態であってもよい。 The dosage form of the pharmaceutical composition is not limited. The dosage form of the pharmaceutical composition may be, for example, a liquid such as an injection, an infusion solution, an oral solution, a lotion, or a semi-solid such as a cream, pasta, or ointment, or a tablet, powder, or the like. It may be a solid such as granules, troches, suppositories, or it may be in the form of a dry powder that can be prepared at the time of use.
医薬組成物の投与経路は限定されないが、例えば、経口投与、皮下注射、筋肉注射、皮内注射、静脈注射、輸液、経皮投与、経粘膜投与、経肛門投与等が挙げられる。 The route of administration of the pharmaceutical composition is not limited, and examples thereof include oral administration, subcutaneous injection, intramuscular injection, intradermal injection, intravenous injection, infusion, transdermal administration, transmucosal administration, and transanal administration.
医薬組成物におけるＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の含有量は、投与された対象の体内でオートファジーを促進することのできる有効量が投与される含有量であればよい。投与された対象の体内でオートファジーを促進することのできる有効量としては、望まれるオートファジーの促進の程度、投与部位、投与経路等に応じて適宜決定することができるが、例えば、成人に投与する場合は１日あたり通常０．１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜１０００ｍｇであり得る。 The content of L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog in the pharmaceutical composition may be such that an effective amount capable of promoting autophagy is administered in the body of the administered subject. The effective amount capable of promoting autophagy in the body of the administered subject can be appropriately determined according to the desired degree of promotion of autophagy, administration site, administration route, etc., and for example, for adults. When administered, it can be usually 0.1 mg to 5000 mg, preferably 5 mg to 1000 mg per day.
医薬組成物は、１日１回〜数回投与されてもよいし、毎日或いは数日に一度の間隔で投与されてもよい。 The pharmaceutical composition may be administered once to several times a day, or may be administered daily or at intervals of several days.
オートファジー促進用組成物が飲食品組成物である場合、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体に加えて、飲食品として許容される他の成分、例えば水、賦形剤、担体等を更に含んでいてよい。 When the composition for promoting autophagy is a food or drink composition, in addition to L-ergothioneine or an analog of L-ergothioneine, it further contains other components permitted as food and drink, such as water, excipients, carriers and the like. You can go out.
飲食品組成物は一般食品のほか、健康食品、特定保健食品、栄養機能食品、機能性表示食品等を包含する。飲食品組成物はサプリメントとして提供されてもよい。 Food and drink compositions include general foods, health foods, specified health foods, nutritionally functional foods, foods with functional claims, and the like. The food and drink composition may be provided as a supplement.
飲食品組成物の形態は特に限定されないが、例えば、既存の飲食品組成物にＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を添加したものであってもよいし、錠剤、粉末、顆粒、トローチ、キャンディー、飲料、調味料等の形態であってもよい。 The form of the food or drink composition is not particularly limited, but for example, an existing food or drink composition may be added with L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog, or tablets, powders, granules, troches, and candies. , Beverages, seasonings and the like.
飲食品組成物におけるＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の含有量は、摂取したヒトの体内でオートファジーを促進することのできる有効量となる含有量であればよい。摂取したヒトの体内でオートファジーを促進することのできる有効量としては、望まれるオートファジーの促進の程度等に応じて適宜決定することができるが、例えば、成人が経口摂取する場合は１日あたり通常０．１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜１０００ｍｇであり得る。 The content of L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog in the food or drink composition may be an effective amount capable of promoting autophagy in the ingested human body. The effective amount capable of promoting autophagy in the ingested human body can be appropriately determined according to the desired degree of promotion of autophagy, etc., but for example, in the case of oral ingestion by an adult, one day. It can be usually 0.1 mg to 5000 mg, preferably 5 mg to 1000 mg per.
飲食品組成物は、１日１回〜数回摂取されてもよいし、毎日或いは数日に一度の間隔で摂取されてもよい。 The food and drink composition may be ingested once to several times a day, or may be ingested daily or at intervals of several days.
オートファジー促進用組成物が肥料組成物又は植物生長調節用組成物である場合、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体に加えて、植物への施用が許容される他の成分、例えば水、賦形剤、担体等を更に含んでいてよい。 When the autophagy-promoting composition is a fertilizer composition or a plant growth-regulating composition, in addition to L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog, other components that can be applied to the plant, such as water, are added. It may further contain a shaping agent, a carrier and the like.
オートファジー促進用組成物が飼料組成物である場合、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体に加えて、非ヒト動物への施用が許容される他の成分、例えば水、賦形剤、担体等を更に含んでいてよい。 When the composition for promoting autophagy is a feed composition, in addition to L-ergothioneine or an analog of L-ergothioneine, other components that can be applied to non-human animals, such as water, excipients, carriers, etc. May further be included.
オートファジー促進用組成物が細胞培養用の培地である場合、培地は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の他に、培地として使用される成分、例えば基礎培地の成分や、増殖を促進する成分、例えば、ＦＢＳ等の血清成分、血清代替物、増殖因子等を含むことができる。 When the composition for promoting autophagy is a medium for cell culture, the medium may be a component used as a medium, for example, a component of a basal medium, or a growth promoting, in addition to L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog. Ingredients such as serum components such as FBS, serum substitutes, growth factors and the like can be included.
培地中のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の含有量は特に限定されないが、例えば０．０００１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．０５〜２．０ｍＭ、より好ましくは０．１〜０．５ｍＭが例示できる。 The content of L-ergothioneine or L-ergothioneine analog in the medium is not particularly limited, and examples thereof include 0.0001 mM to 10 mM, preferably 0.05 to 2.0 mM, and more preferably 0.1 to 0.5 mM. it can.
培地は液体、半固形、固体等のいずれの形態であってもよく、特に限定されない。培地はまた、水等の媒体によって希釈することにより所望の成分濃度となる濃縮液又は粉末等の形態であってもよい。 The medium may be in any form such as liquid, semi-solid, and solid, and is not particularly limited. The medium may also be in the form of a concentrate or powder that has a desired component concentration by diluting with a medium such as water.
オートファジー促進用組成物が細胞培養用の培地に添加するための培地添加用組成物である場合、培地添加用組成物は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の他に、培地に添加される他の成分、例えば、増殖を促進する成分、例えば、ＦＢＳ等の血清成分、血清代替物、増殖因子等を更に含んでもよい。 When the composition for promoting autophagy is a composition for adding a medium for adding to a medium for cell culture, the composition for adding a medium is added to the medium in addition to L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog. Other components, such as components that promote growth, such as serum components such as FBS, serum substitutes, growth factors, and the like may be further contained.
培地添加用組成物は、培地の調製時に添加されるものであってもよいし、調製済み培地に添加されるものであってもよいし、培養途中の培地に添加されるものであってもよい。 The composition for adding a medium may be added at the time of preparing the medium, may be added to the prepared medium, or may be added to the medium in the middle of culturing. Good.
培地添加用組成物中のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の含有量は特に限定されないが、培地へ添加された場合に所望のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の濃度となるような量であればよい。培地中の所望の濃度は上記の通りである。 The content of the L-ergothioneine or L-ergothioneine analog in the composition for adding the medium is not particularly limited, but the amount so as to obtain the desired concentration of the L-ergothioneine or the L-ergothioneine analog when added to the medium. It should be. The desired concentration in the medium is as described above.
培地添加用組成物の形態はいずれの形態であってもよく、粉末、顆粒、タブレット等の固体、ペースト等の半固体、或いは濃縮液等の液体であってもよい。 The composition for adding the medium may be in any form, and may be a solid such as powder, granules or tablets, a semi-solid such as a paste, or a liquid such as a concentrated solution.
オートファジーを促進する方法
本発明はまた、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含む培地中で細胞を培養することを含む、細胞においてオートファジーを促進する方法に関する。
Methods of Promoting Autophagy The present invention also relates to methods of promoting autophagy in cells, comprising culturing cells in a medium containing L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog.
本発明の方法が対象とする細胞は、オートファジーの機能を有する細胞であればよく特に限定されないが、例えば、ヒトに由来する細胞、非ヒト動物（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ等）に由来する細胞、植物に由来する細胞、酵母細胞、その他の真核生物細胞等が例示できる。 The cell targeted by the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell having an autophagy function, and is, for example, a cell derived from humans or a non-human animal (for example, dog, cat, horse, cow, etc.). Examples thereof include derived cells, plant-derived cells, yeast cells, and other eukaryotic cells.
本発明の方法で用いる培地は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の他に、培地として使用される成分、例えば基礎培地の成分や、増殖を促進する成分、例えば、ＦＢＳ等の血清成分、血清代替物、増殖因子等を含むことができる。培地中のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の含有量は特に限定されないが、例えば、０．０００１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．０５〜２．０ｍＭ、より好ましくは０．１〜０．５ｍＭが例示できる。 The medium used in the method of the present invention includes, in addition to L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog, a component used as a medium, for example, a component of a basal medium, a component that promotes growth, for example, a serum component such as FBS. Serum substitutes, growth factors, etc. can be included. The content of L-ergothioneine or L-ergothioneine analog in the medium is not particularly limited, but is, for example, 0.0001 mM to 10 mM, preferably 0.05 to 2.0 mM, more preferably 0.1 to 0.5 mM. It can be exemplified.
細胞培養のための培養温度、培養時間、培養中の撹拌の有無、継代の有無等の培養条件は、培養しようとする細胞の種類や培養スケールに応じて適宜決定することができる。 Culture conditions such as culture temperature for cell culture, culture time, presence / absence of stirring during culture, presence / absence of passage, etc. can be appropriately determined according to the type of cells to be cultured and the culture scale.
細胞への細菌の感染を抑制するための組成物
本発明はまた、動物又は植物の生体内に存在する細胞への細菌による感染を抑制するための組成物であって、
Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含有すること、及び、
前記細胞の周囲に、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体が送達されるように、動物又は植物に投与されること
を特徴とする組成物に関する。
Composition for Suppressing Bacterial Infection of Cells The present invention is also a composition for suppressing bacterial infection of cells existing in the living body of an animal or plant.
Containing L-ergothioneine or L-ergothioneine analogs, and
It relates to a composition comprising being administered to an animal or plant such that L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog having a concentration of 0.05 mM to 2.0 mM is delivered around the cell.
本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物は、動物又は植物の生体内の、細菌の感染を抑制しようとする細胞においてオートファジーを促進することを通じて細菌の感染を抑制することができる。特許文献１では、５ｍＭ及び５０ｍＭのＥＧＴが大腸菌の増殖を直接抑制することが記載されているが、特許文献１に記載されている結果からは、より低濃度２．０ｍＭ以下の低濃度のＥＧＴでは大腸菌の増殖を直接抑制することはできない蓋然性が高い。本実施形態は、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭという低濃度のＥＧＴが細胞のオートファジーを促進することを通じて細菌の感染を抑制することを利用するものであり、従来公知の、ＥＧＴによる細菌感染の抑制とは機構及び動物又は植物への投与量が異なる。 The composition for suppressing bacterial infection according to the present embodiment can suppress bacterial infection by promoting autophagy in cells for suppressing bacterial infection in the living body of an animal or plant. Patent Document 1 describes that 5 mM and 50 mM EGT directly suppress the growth of Escherichia coli, but from the results described in Patent Document 1, a lower concentration of EGT of 2.0 mM or less is obtained. It is highly probable that the growth of E. coli cannot be directly suppressed. The present embodiment utilizes the fact that a low concentration of EGT of 0.05 mM to 2.0 mM suppresses bacterial infection by promoting autophagy of cells, and is conventionally known for bacterial infection by EGT. Suppression differs in mechanism and dose to animals or plants.
前記濃度は好ましくは０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭであり、更に好ましくは０．１ｍＭ〜１．０ｍＭであり、最も好ましくは０．１ｍＭ〜０．５ｍＭである。 The concentration is preferably 0.05 mM to 1.0 mM, more preferably 0.1 mM to 1.0 mM, and most preferably 0.1 mM to 0.5 mM.
本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物は、動物又は植物の生体における細菌による感染を抑制しようとする細胞の周囲に、前記濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体が送達されるように、動物又は植物に投与されるものであればよい。本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物に含まれるＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体の含有量は、対象となる動物又は植物の種類、体の大きさ、投与経路、投与部位等に応じて適宜調節することができる。例えば、本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物は、成人に投与する場合は、１日の投与量あたり通常０．１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜１０００ｍｇのＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含有するものであることができる。 The composition for suppressing bacterial infection according to the present embodiment is such that the above-mentioned concentration of L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog is delivered around cells that are intended to suppress bacterial infection in a living body of an animal or plant. , Anything that is administered to animals or plants. The content of L-ergothioneine or L-ergothioneine analog contained in the composition for suppressing bacterial infection according to the present embodiment depends on the type of target animal or plant, body size, administration route, administration site, and the like. Can be adjusted as appropriate. For example, when administered to an adult, the composition for suppressing bacterial infection according to the present embodiment is usually 0.1 mg to 5000 mg, preferably 5 mg to 1000 mg of L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog per daily dose. Can be contained.
本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物が投与される動物又は植物の種類は特に限定されない。動物はヒトであってもよいし、非ヒト動物であってもよい。植物は単子葉植物であってもよいし双子葉植物であってもよい。
本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物は、Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を少なくとも含有し、他の成分を更に含んでいても良い。
The type of animal or plant to which the composition for suppressing bacterial infection according to the present embodiment is administered is not particularly limited. The animal may be human or non-human. The plant may be a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.
The composition for suppressing bacterial infection according to the present embodiment contains at least L-ergothioneine or an analog of L-ergothioneine, and may further contain other components.
本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物は、医薬組成物、飲食品組成物、肥料組成物、植物生長調節用組成物、飼料組成物等の形態であることができる。これらの組成物の好ましい形態は、オートファジー促進用組成物について詳述した形態と同様の範囲から選択できる。 The composition for suppressing bacterial infection according to the present embodiment can be in the form of a pharmaceutical composition, a food or drink composition, a fertilizer composition, a plant growth regulating composition, a feed composition or the like. Preferred forms of these compositions can be selected from the same range as the forms detailed for autophagy-promoting compositions.
本実施形態に係る細菌感染抑制用組成物は、動物又は植物が細菌と接触する前に予め動物又は植物に投与されるものであることが好ましい。 The composition for suppressing bacterial infection according to the present embodiment is preferably administered to the animal or plant in advance before the animal or plant comes into contact with the bacterium.
細胞への細菌の感染を抑制する方法
本発明はまた、ヒト生体内に存在する細胞以外の細胞への細菌の感染を抑制する方法であって、前記細胞を、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体と接触させることを含む方法に関する。
Method for Suppressing Bacterial Infection of Cells The present invention is also a method for suppressing bacterial infection of cells other than cells existing in the human body, wherein the cells are 0.05 mM to 2.0 mM. It relates to a method comprising contacting with a concentration of L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog.
本実施形態に係る細菌感染抑制方法によれば、生体内又は生体外に存在する細胞への細菌の感染を抑制することができる。前記濃度は好ましくは０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭであり、更に好ましくは０．１ｍＭ〜１．０ｍＭであり、最も好ましくは０．１ｍＭ〜０．５ｍＭである。 According to the method for suppressing bacterial infection according to the present embodiment, it is possible to suppress bacterial infection of cells existing in or out of the living body. The concentration is preferably 0.05 mM to 1.0 mM, more preferably 0.1 mM to 1.0 mM, and most preferably 0.1 mM to 0.5 mM.
本実施形態に係る細菌感染抑制方法の対象となる細胞は、ヒト生体内に存在する細胞以外の細胞であればよく、例えば、生体外に存在するヒトに由来する細胞、生体内又は生体外に存在する非ヒト動物（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ等）に由来する細胞、生体内又は生体外に存在する植物に由来する細胞、酵母細胞、その他の真核生物細胞等が例示できる。 The cell to be the target of the method for suppressing bacterial infection according to the present embodiment may be a cell other than a cell existing in a human living body, for example, a human-derived cell existing in an in vitro, an in vivo or in vitro. Examples thereof include cells derived from existing non-human animals (for example, dogs, cats, horses, cows, etc.), cells derived from plants existing in vivo or in vitro, yeast cells, other eukaryotic cells, and the like.
前記濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を細胞に接触させる方法としては、前記濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含有する培地中で細胞を培養することや、前記濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含有する溶液（緩衝液であってよい）を、細菌感染を抑制しようとする細胞を含む生体内の部位に投与することが例示できる。 As a method for contacting the cells with the L-ergothioneine or the L-ergothioneine analog having the concentration, the cells are cultured in a medium containing the L-ergothioneine or the L-ergothioneine analog at the concentration, or the L-ergothioneine at the concentration is L. For example, a solution containing -ergothioneine or an L-ergothioneine analog (which may be a buffer solution) is administered to a site in the living body containing cells for suppressing bacterial infection.
前記濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を細胞に接触させる際の時間は特に限定されないが、好ましくは３〜１６８時間であり、より好ましくは１２〜９６時間である。 The time for contacting the L-ergothioneine or the L-ergothioneine analog at the above concentration with the cells is not particularly limited, but is preferably 3 to 168 hours, more preferably 12 to 96 hours.
本実施形態に係る細菌感染抑制方法は、好ましくは、細胞が細菌と接触するよりも前に行われる。 The method for suppressing bacterial infection according to the present embodiment is preferably performed before the cells come into contact with the bacteria.
実験１
６ウェルプレートの各ウェルに、エルゴチオネイン処理を行わないネガティブコントロール（ＮＴ）試験では１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）を、エルゴチオネイン処理（ＥＧＴ）試験ではエルゴチオネイン（テトラヘドロン社製）を１ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を、それぞれ１ｍＬ／ウェルずつ添加した。そこに１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて３０ｘ１０４個／ｍＬの細胞密度に調製したＡＲＰＥ−１９細胞を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で４８時間培養した後に、ＮＴ試験では新しい２ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換し、ＥＧＴ試験では、新しい２ｍＬの、エルゴチオネインを０．５ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換した。２４時間後、各試験の細胞をアール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ社製）２ｍＬで洗浄した後、ＥＢＳＳを２ｍＬずつウェルに添加した。炭酸ガスインキュベーター内で１時間又は３時間培養した後に、細胞を、氷冷したＰＢＳ（−）でリンスし、ＲＩＰＡライシスバッファー（ミリポア社製）を３００μＬ添加し細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液のサンプルにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（東京化成工業社製）を加え、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。電気泳動後のポリアクリルアミドゲルをＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にブロッティング後、ＰＶＤＦ膜をブロックエース（ケーエーシー社製）溶液に１時間浸漬した。得られたＰＶＤＦ膜を、一次抗体として抗ＬＣ３Ｂ抗体（アブカム社製）又は抗βアクチン抗体（アブカム社製）で処理し、更に、二次抗体として、西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（ロックランドイムノケミカルズ社製）で処理した。検出試薬はＥＣＬプライム（アマシャム社製）を用い、測定はＬＡＳ２０００（フジフィルム社製）を用いて行った。
Experiment 1
Each well of the 6-well plate was subjected to DMEM / F12 medium (manufactured by GIBCO) containing 10% FBS (manufactured by GIBCO) in the negative control (NT) test without ergothioneine treatment, and ergothioneine (tetra) in the ergothioneine treatment (EGT) test. DMEM / F12 medium containing 1 mM of Hedron) containing 10% FBS was added at 1 mL / well each. ARPE-19 cells prepared to a cell density of 30x10 4 cells / mL using DMEM / F12 medium containing 10% FBS were added 1 mL / well at a time. After culturing in a carbon dioxide incubator for 48 hours, the medium was replaced with new 2 mL of DMEM / F12 medium containing 10% FBS in the NT test, and in the EGT test, 2 mL of new DMEM containing 0.5 mM ergothioneine was contained. The medium was replaced with / F12 medium. After 24 hours, the cells of each test were washed with 2 mL of Earl Equilibrium Salt Solution (EBSS, manufactured by GIBCO), and then 2 mL of EBSS was added to the wells. After culturing in a carbon dioxide incubator for 1 hour or 3 hours, the cells were rinsed with ice-cooled PBS (−), and 300 μL of RIPA Lysis buffer (manufactured by Millipore) was added to prepare a cell lysate. A sample buffer for SDS-PAGE (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was added to the obtained cell lysate sample, and the mixture was subjected to sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. After blotting the electrophoresed polyacrylamide gel on a PVDF membrane (manufactured by Millipore), the PVDF membrane was immersed in a block ace (manufactured by KAC) solution for 1 hour. The obtained PVDF membrane was treated with an anti-LC3B antibody (manufactured by Abcam) or an anti-β-actin antibody (manufactured by Abcam) as a primary antibody, and further, as a secondary antibody, a horseradish peroxidase-labeled secondary antibody (Rockland Immuno). Treated with (Chemicals). The detection reagent was ECL Prime (manufactured by Amersham), and the measurement was performed using LAS2000 (manufactured by Fujifilm).
図１は、ＥＧＴ試験及びＮＴ試験での１時間培養及び３時間培養後のＡＲＰＥ−１９細胞の溶解液をサンプルとした、ウェスタンブロッティングにおけるＰＶＤＦ膜上のＬＣ３Ｂ−Ｉ、ＬＣ３Ｂ−ＩＩ、βアクチンの染色像を示す。 FIG. 1 shows LC3B-I, LC3B-II, and β-actin on a PVDF membrane in Western blotting, using lysates of ARPE-19 cells after 1-hour culture and 3-hour culture in the EGT test and NT test as samples. The stained image is shown.
図２Ａは、ＥＧＴ試験及びＮＴ試験での１時間培養後のＡＲＰＥ−１９細胞の溶解液のウェスタンブロッティングでのＬＣ３Ｂ−ＩＩの染色強度を、ＮＴ試験での染色強度を１００％としたときの相対値として示したグラフである。 FIG. 2A shows the relative staining intensity of LC3B-II in Western blotting of the lysate of ARPE-19 cells after 1-hour culture in the EGT test and the NT test, when the staining intensity in the NT test was 100%. It is a graph shown as a value.
図２Ｂは、ＥＧＴ試験及びＮＴ試験での３時間培養後のＡＲＰＥ−１９細胞の溶解液のウェスタンブロッティングでのＬＣ３Ｂ−ＩＩの染色強度を、ＮＴ試験での染色強度を１００％としたときの相対値として示したグラフである。 FIG. 2B shows the relative staining intensity of LC3B-II in Western blotting of the lysate of ARPE-19 cells after culturing for 3 hours in the EGT test and the NT test, when the staining intensity in the NT test was 100%. It is a graph shown as a value.
エルゴチオネインの処理により、ＡＲＰＥ−１９細胞中のＬＣ３Ｂ−ＩＩ量が増大した。ＬＣ３Ｂ−ＩＩの量の増大は、オートファゴソームの形成が促進されていることを示すことから、本実験の結果は、エルゴチオネインの処理により、ＡＲＰＥ−１９細胞のオートファゴソームの形成が促進されていることを裏付ける。 Treatment with ergothioneine increased the amount of LC3B-II in ARPE-19 cells. Since the increase in the amount of LC3B-II indicates that the formation of autophagosomes is promoted, the result of this experiment is that the treatment of ergothioneine promotes the formation of autophagosomes in ARPE-19 cells. To support.
実験２
２４ウェルプレートの各ウェルに、エルゴチオネイン処理を行わないネガティブコントロール（ＮＴ）試験では１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）を、エルゴチオネイン処理（ＥＧＴ）試験ではエルゴチオネイン（テトラヘドロン社製）を１．０ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を、それぞれ０．２ｍＬ／ウェルずつ添加した。そこに１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて３０ｘ１０４個／ｍＬの細胞密度に調製したＡＲＰＥ−１９細胞を０．２ｍＬ／ウェルずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で４８時間培養した後に、ＮＴ試験では新しい０．４ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換し、ＥＧＴ試験では、新しい０．４ｍＬの、エルゴチオネインを０．５ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換した。２４時間後、培地を除去し、１μＭのオートライソソーム染色試薬ＤＡＬＧｒｅｅｎ（同仁化学研究所製）を含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（０．２ｍＬ）を添加した。３０分間培養しＤＡＬＧｒｅｅｎを細胞内に取り込ませた。その後、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１ｍＬで２回洗浄した後、透析処理したＦＢＳ（ＧＢＣＯ社製）を１％含有したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を０．２ｍＬずつウェルに添加した。炭酸ガスインキュベーター内で１時間培養した後に細胞を蛍光顕微鏡（エクリプスＴｓ２ ニコン社製）でランダムに５か所撮影し、オートライソソーム染色像を得た。撮影したオートライソソーム染色像をフォトショップ（アドビー社製）で解析し蛍光強度を数値化した。
Experiment 2
Each well of the 24-well plate was subjected to DMEM / F12 medium (manufactured by GIBCO) containing 10% FBS (manufactured by GIBCO) in the negative control (NT) test without ergothioneine treatment, and ergothioneine (tetra) in the ergothioneine treatment (EGT) test. DMEM / F12 medium containing 1.0 mM of Hedron) containing 10% FBS was added at 0.2 mL / well each. ARPE-19 cells prepared to a cell density of 30 × 10 4 cells / mL using DMEM / F12 medium containing 10% FBS were added thereto in an amount of 0.2 mL / well. After culturing in a carbon dioxide incubator for 48 hours, the medium was changed to DMEM / F12 medium containing 0.4 mL of new 10% FBS in the NT test, and 0.4 mL of new 0.4 mL of ergothioneine was contained in 0.5 mM in the EGT test. The medium was replaced with DMEM / F12 medium containing% FBS. After 24 hours, the medium was removed and DMEM / F12 medium (0.2 mL) containing 10% FBS containing 1 μM of autolysosome staining reagent DALGreen (manufactured by Dojin Chemical Laboratory) was added. The cells were cultured for 30 minutes and DALGreen was incorporated into the cells. Then, the cells were washed twice with 1 mL of DMEM / F12 medium, and then 0.2 mL each of DMEM / F12 medium containing 1% of dialyzed FBS (manufactured by GBCO) was added to the wells. After culturing in a carbon dioxide incubator for 1 hour, the cells were randomly photographed at 5 locations with a fluorescence microscope (Eclipse Ts2 manufactured by Nikon Corporation) to obtain autolithosome stained images. The photographed autolysosome stained image was analyzed in Photoshop (manufactured by Adobe) and the fluorescence intensity was quantified.
図３は、ＮＴ試験及びＥＧＴ試験で培養したＡＲＰＥ−１９細胞のＤＡＬＧｒｅｅｎによる蛍光染色像である。 FIG. 3 is a fluorescence-stained image of ARPE-19 cells cultured in the NT test and the EGT test by DALGreen.
図４は、ＮＴ試験及びＥＧＴ試験で培養したＡＲＰＥ−１９細胞のＤＡＬＧｒｅｅｎによる蛍光染色像での蛍光強度を数値化し、ＮＴ試験での蛍光強度を１００％としたときの相対値として示したグラフである。 FIG. 4 is a graph showing the fluorescence intensity of ARPE-19 cells cultured in the NT test and the EGT test in the fluorescence-stained image by DALGreen as a relative value when the fluorescence intensity in the NT test is 100%. is there.
エルゴチオネインの処理により、ＡＲＰＥ−１９細胞のＤＡＬＧｒｅｅｎによる蛍光強度が増大した。ＤＡＬＧｒｅｅｎによる蛍光強度の増大は、オートライソソームの形成が促進されていることを示すことから、本実験の結果は、エルゴチオネインの処理により、ＡＲＰＥ−１９細胞のオートライソソームの形成が促進されていることを裏付ける。また、実験１の結果との組み合わせから、エルゴチオネインは細胞のオートファジーを促進することが示された。 Treatment with ergothioneine increased the fluorescence intensity of ARPE-19 cells by DALGreen. Since the increase in fluorescence intensity by DALGreen indicates that the formation of autolysosomes is promoted, the results of this experiment show that the treatment with ergothioneine promotes the formation of autolysosomes in ARPE-19 cells. support. In addition, the combination with the results of Experiment 1 showed that ergothioneine promotes cell autophagy.
実験３
６ウェルプレートに、エルゴチオネインを含まない１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）、あるいは、エルゴチオネイン（テトラヘドロン社製）を０．２ｍＭもしくは１ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。そこに１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて３０ｘ１０４個／ｍＬの細胞密度に調製したＡＲＰＥ−１９細胞を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で４８時間培養した後に新しい２ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、あるいは、エルゴチオネインを０．１ｍＭもしくは０．５ｍＭ含有した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に交換した。２４時間後、細胞をアール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ、ＧＩＢＣＯ社製）２ｍＬで洗浄した後、ＥＢＳＳを２ｍＬずつウェルに添加した。炭酸ガスインキュベーター内では１時間培養した後に細胞を氷冷したＰＢＳ（−）でリンスし、ＲＩＰＡライシスバッファー（ミリポア社製）を３００μＬ添加し細胞溶解液を調製した。得られたサンプルにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（東京化成工業社製）を加え、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にサンプルをかけた。電気泳動して得られたポリアクリルアミドゲルをＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にブロッティング後、ＰＶＤＦ膜をブロックエース（ケーエーシー社製）溶液に１時間浸漬した。得られたＰＶＤＦ膜を、一次抗体として抗ＬＣ３Ｂ抗体（アブカム社製）又は抗βアクチン抗体（アブカム社製）で処理し、更に、二次抗体として、西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（ロックランドイムノケミカルズ社製）で処理した。検出試薬はＥＣＬプライム（アマシャム社製）を用い、測定はＬＡＳ２０００（フジフィルム社製）を用いて行った。
Experiment 3
DMEM / F12 medium (manufactured by GIBCO) containing 10% FBS (manufactured by GIBCO) containing no ergothioneine, or DMEM containing 0.2 mM or 1 mM of ergothioneine (manufactured by Tetrahedron) in a 6-well plate. / F12 medium was added in 1 mL / well increments. ARPE-19 cells prepared to a cell density of 30x10 4 cells / mL using DMEM / F12 medium containing 10% FBS were added 1 mL / well at a time. After culturing in a carbon dioxide incubator for 48 hours, the medium was replaced with new 2 mL of DMEM / F12 medium containing 10% FBS or DMEM / F12 medium containing 10% FBS containing 0.1 mM or 0.5 mM of ergothioneine. After 24 hours, the cells were washed with 2 mL of Earl Equilibrium Salt Solution (EBSS, manufactured by GIBCO), and then 2 mL of EBSS was added to the wells. After culturing for 1 hour in a carbon dioxide incubator, the cells were rinsed with ice-cooled PBS (−), and 300 μL of RIPA Lysis buffer (manufactured by Millipore) was added to prepare a cell lysate. A sample buffer for SDS-PAGE (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was added to the obtained sample, and the sample was subjected to sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. After blotting the polyacrylamide gel obtained by electrophoresis on a PVDF membrane (manufactured by Millipore), the PVDF membrane was immersed in a block ace (manufactured by KAC) solution for 1 hour. The obtained PVDF membrane was treated with an anti-LC3B antibody (manufactured by Abcam) or an anti-β-actin antibody (manufactured by Abcam) as a primary antibody, and further, as a secondary antibody, a horseradish peroxidase-labeled secondary antibody (Rockland Immuno). Treated with (Chemicals). The detection reagent was ECL Prime (manufactured by Amersham), and the measurement was performed using LAS2000 (manufactured by Fujifilm).
図５は、上記の、エルゴチオネイン（ＥＧＴ）濃度が０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭの培地中で培養したＡＲＰＥ−１９細胞の溶解液サンプルのウェスタンブロッティングでのＬＣ３Ｂ−ＩＩの染色強度を、ＥＧＴ濃度が０ｍＭの培地中で培養したＡＲＰＥ−１９細胞の溶解液サンプルでの染色強度を１００％としたときの相対値として示したグラフである。 FIG. 5 shows the staining intensity of LC3B-II by Western blotting of the above-mentioned lysate sample of ARPE-19 cells cultured in a medium having ergothioneine (EGT) concentrations of 0 mM, 0.1 mM, and 0.5 mM. It is a graph shown as a relative value when the staining intensity in the lysate sample of ARPE-19 cells cultured in a medium having a concentration of 0 mM was set to 100%.
０．１ｍＭという低濃度のエルゴチオネインの処理により、ＡＲＰＥ−１９細胞のオートファゴソームの形成が促進されたことが示された。 It was shown that treatment with a low concentration of ergothioneine of 0.1 mM promoted the formation of autophagosomes in ARPE-19 cells.
Claims (4)
Ｌ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体を含有すること、及び、
前記細胞の周囲に、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体が送達されるように、動物又は植物に投与されること
を特徴とする組成物。 A composition for suppressing bacterial infection of cells existing in the living body of an animal or plant.
Containing L-ergothioneine or L-ergothioneine analogs, and
A composition characterized in that it is administered to an animal or plant such that L-ergothioneine or an L-ergothioneine analog having a concentration of 0.05 mM to 2.0 mM is delivered around the cells.
前記細胞を、０．０５ｍＭ〜２．０ｍＭの濃度のＬ−エルゴチオネイン又はＬ−エルゴチオネイン類縁体と接触させること
を含む方法。
It is a method of suppressing bacterial infection of cells other than cells existing in the human body.
A method comprising contacting the cells with an L-ergothioneine or L-ergothioneine analog at a concentration of 0.05 mM to 2.0 mM.
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