JP2017218431A - Immune response-activating cytokine production promoter and th17 cell differentiation promoter - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、エルゴチオネインを有効成分とする、免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤、免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物、Ｔｈ１７細胞分化促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物、ならびに、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法およびＴｈ１７細胞の分化を促進する方法に関する。 The present invention relates to an immune response activated cytokine production promoter, a food composition for promoting immune response activated cytokine production, a Th17 cell differentiation promoting agent, a food composition for promoting Th17 cell differentiation, and an immunity comprising ergothioneine as an active ingredient. The present invention relates to a method for promoting the production of response-activated cytokines and a method for promoting the differentiation of Th17 cells.
エルゴチオネインは硫黄原子を含むアミノ酸の一種であり、肝臓や血液細胞などの生体内に広く存在している。また、タモギタケなどのキノコ類にも多く含まれている。エルゴチオネインは、従来、抗酸化機能を有することが知られており、この機能を期待して化粧品や健康食品として利用されている。エルゴチオネインの機能としては、その他に、特許文献１には、β−ディフェンシンの産生を促進することが（［０００７］、［図７］および［図１７］など）、特許文献２には、パネト細胞において抗菌物質の産生を促進することが（特許請求の範囲など）、それぞれ開示されている。 Ergothioneine is a kind of amino acid containing a sulfur atom, and is widely present in living bodies such as liver and blood cells. It is also abundant in mushrooms such as tamamotake. Ergothioneine is conventionally known to have an antioxidant function and is used as a cosmetic or health food in anticipation of this function. As other functions of ergothionein, Patent Document 1 discloses that β-defensin production is promoted ([0007], [FIG. 7] and [FIG. 17], etc.), and Patent Document 2 includes a panel cell. Have been disclosed to promote the production of antibacterial substances (eg, claims).
しかしながら、エルゴチオネインの生理作用については未だ十分に解明されておらず、生理作用の解明およびこれに基づくエルゴチオネインの新規な用途の開発が望まれていた。本発明は、係る課題を解決するためになされたものであって、エルゴチオネインの生理作用に関する新たな知見に基づき、新規な用途として、免疫応答活性化サイトカイン産生促進作用およびＴｈ１７細胞分化促進作用を奏する発明を提供することを目的とする。 However, the physiological action of ergothioneine has not been sufficiently elucidated, and it has been desired to elucidate the physiological action and develop a new use of ergothioneine based on this. The present invention has been made in order to solve such problems, and based on the new knowledge about the physiological action of ergothioneine, as a new use, has an action of promoting immune response activation cytokine production and an action of promoting Th17 cell differentiation. It is an object of the present invention to provide an invention.
本発明者らは、鋭意研究の結果、エルゴチオネインが、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を刺激することによって誘導される免疫応答活性化サイトカインの産生を促進すること、ならびに抗原ペプチドによって誘導されるＴｈ１７細胞の分化を促進することを見出した。そこで、これらの知見に基づいて、下記の各発明を完成した。 As a result of intensive studies, the present inventors have shown that ergothioneine promotes the production of immune response-activating cytokines induced by stimulating Toll-like receptors (TLRs), as well as Th17 cells induced by antigenic peptides. It was found to promote differentiation. Accordingly, the following inventions have been completed based on these findings.
（１）本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤は、エルゴチオネインを有効成分とする。 (1) The immune response activation cytokine production promoter according to the present invention contains ergothioneine as an active ingredient.
（２）本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤は、さらにＴｏｌｌ様受容体リガンドを含むことが好ましい。 (2) It is preferable that the immune response activation cytokine production promoter according to the present invention further includes a Toll-like receptor ligand.
（３）本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤は、Ｔｈ１７細胞による免疫応答を促進するための剤であってもよい。 (3) The immune response-activating cytokine production promoter according to the present invention may be an agent for promoting an immune response by Th17 cells.
（４）本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤において、エルゴチオネインはタモギタケから抽出したエルゴチオネインであってもよい。 (4) In the immune response activating cytokine production promoter according to the present invention, the ergothioneine may be ergothioneine extracted from Tamogitake.
（５）本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物は、エルゴチオネインを有効成分とする。 (5) The food composition for promoting immune response-activated cytokine production according to the present invention contains ergothioneine as an active ingredient.
（６）本発明に係る免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を有する；
（ａ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインを摂取させる工程、
（ｂ）前記ヒトまたは動物において、Ｔｏｌｌ様受容体の刺激により免疫応答活性化サイトカインを産生させる工程、
（ｃ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインにより免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する工程。
(6) The method for promoting production of immune response activating cytokine according to the present invention includes the following steps (a) to (c);
(A) ingesting ergothioneine into a human or animal;
(B) producing an immune response-activating cytokine by stimulation of a Toll-like receptor in the human or animal,
(C) A step of promoting the production of immune response-activating cytokine by ingested ergothioneine in the human or animal.
（７）本発明に係るＴｈ１７細胞分化促進剤は、エルゴチオネインを有効成分とする。 (7) The Th17 cell differentiation promoting agent according to the present invention contains ergothioneine as an active ingredient.
（８）本発明に係るＴｈ１７細胞分化促進剤は、さらに抗原ペプチドを含むことが好ましい。 (8) The Th17 cell differentiation promoting agent according to the present invention preferably further contains an antigen peptide.
（９）本発明に係るＴｈ１７細胞分化促進剤において、エルゴチオネインはタモギタケから抽出したエルゴチオネインであってもよい。 (9) In the Th17 cell differentiation promoting agent according to the present invention, the ergothioneine may be ergothioneine extracted from Tamogitake.
（１０）本発明に係るＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物は、エルゴチオネインを有効成分とする。 (10) The food composition for promoting Th17 cell differentiation according to the present invention contains ergothioneine as an active ingredient.
（１１）本発明に係るＴｈ１７細胞の分化を促進する方法は、下記（ｄ）〜（ｆ）の工程を有する；
（ｄ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインを摂取させる工程、
（ｅ）前記ヒトまたは動物において、抗原ペプチドの刺激によりＴｈ１７細胞を分化させる工程および
（ｆ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインによりＴｈ１７細胞の分化を促進する工程。
(11) The method for promoting Th17 cell differentiation according to the present invention includes the following steps (d) to (f);
(D) ingesting ergothioneine into a human or animal;
(E) a step of differentiating Th17 cells by stimulation with an antigen peptide in the human or animal; and (f) a step of promoting differentiation of Th17 cells by ingested ergothioneine in the human or animal.
本発明の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤等によれば、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進することができるため、生体の免疫応答を活性化して、健康増進、各種疾病の改善や治癒、予防に寄与することができる。
また、本発明のＴｈ１７細胞分化促進剤等によれば、Ｔｈ１７細胞の分化を促進することができるため、生体のＴＨ１７細胞による免疫応答を活性化して、健康増進、各種疾病の改善や治癒、予防に寄与することができる。
また、エルゴチオネインは、食用キノコに多く含有されることから、安全性の高い物質であるといえる。したがって、本発明によれば、免疫応答活性化サイトカインの産生やＴｈ１７細胞の分化を効果的に促進することができ、かつ、安全性も高く、日常的に簡便に摂取することができる様々な食品や医薬品等を得ることができる。
According to the immune response activated cytokine production promoter of the present invention and the like, since production of immune response activated cytokines can be promoted, the immune response of the living body is activated to improve health, improve or cure various diseases, Can contribute to prevention.
Further, according to the Th17 cell differentiation promoting agent of the present invention and the like, differentiation of Th17 cells can be promoted. Therefore, the immune response by TH17 cells in the living body is activated to promote health, improve, cure, or prevent various diseases. Can contribute.
In addition, ergothioneine is a highly safe substance because it is abundant in edible mushrooms. Therefore, according to the present invention, various foods that can effectively promote production of immune response-activating cytokines and differentiation of Th17 cells, are highly safe, and can be easily ingested on a daily basis. And pharmaceuticals.
以下、本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤、免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物、Ｔｈ１７細胞分化促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物、ならびに、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法およびＴｈ１７細胞の分化を促進する方法について詳細に説明する。 Hereinafter, an immune response activation cytokine production promoter, a food composition for promoting immune response activation cytokine production, a Th17 cell differentiation promoting agent, a food composition for promoting Th17 cell differentiation, and an immune response activation cytokine according to the present invention A method for promoting production and a method for promoting differentiation of Th17 cells will be described in detail.
本発明において、「免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤」とは、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する剤をいう。また、「免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物」とは、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する食品組成物をいう。 In the present invention, the “immune response activation cytokine production promoter” refers to an agent that promotes the production of immune response activation cytokines. The “food composition for promoting immune response-activating cytokine production” refers to a food composition that promotes production of immune response-activating cytokine.
本発明の「Ｔｈ１７細胞分化促進剤」とは、Ｔｈ１７細胞の分化を促進する剤をいう。また、「Ｔｈ１７細胞分化促進用食品組成物」とは、Ｔｈ１７細胞の分化を促進する食品組成物をいう。 The “Th17 cell differentiation promoting agent” of the present invention refers to an agent that promotes differentiation of Th17 cells. The “food composition for promoting Th17 cell differentiation” refers to a food composition that promotes differentiation of Th17 cells.
ここで、「サイトカイン」とは、免疫システムの細胞が産生して分泌するタンパク質であって、細胞間情報伝達を担う一群の液性因子をいう。サイトカインは、細胞表面の膜上に存在する受容体に結合して、特有の細胞内シグナル伝達経路の引き金を引き、結果的に細胞に生化学的あるいは形態的な変化をもたらす。サイトカインには、多くの種類が存在し、そのような種類としては、例えば、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）や顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）などの造血因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）や繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）などの細胞増殖因子、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）やリンフォトキシンα（ＬＴ−α）、ＬＴ−βなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、レプチンやＴＮＦ−αなどのアディポカイン、神経成長因子（ＮＧＦ）などの神経栄養因子、インターロイキン（ＩＬ）、リンフォカイン、モノカイン、ケモカイン、インターフェロン（ＩＦＮ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）などを挙げることができる。 Here, “cytokine” refers to a group of humoral factors that are produced and secreted by cells of the immune system and are responsible for intercellular communication. Cytokines bind to receptors present on cell surface membranes and trigger specific intracellular signaling pathways, resulting in biochemical or morphological changes in the cells. There are many types of cytokines. Examples of such types include hematopoietic factors such as colony stimulating factor (CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), erythropoietin (EPO), and epidermal growth factor. (EGF), fibroblast growth factor (FGF), platelet-derived growth factor (PDGF), hepatocyte growth factor (HGF) and other cell growth factors, tumor necrosis factor α (TNF-α) and lymphotoxin α (LT -Α), tumor necrosis factor (TNF) such as LT-β, adipokines such as leptin and TNF-α, neurotrophic factors such as nerve growth factor (NGF), interleukins (IL), lymphokines, monokines, chemokines, interferons (IFN), transforming growth factor (TGF), and the like.
本発明の「免疫応答活性化サイトカイン」とは、これらのうち、特に、ヒトや動物における免疫応答を活性化させる働きを有するサイトカインをいう。免疫応答活性化サイトカインとして、具体的には、例えば、インターロイキン６（ＩＬ−６）やインターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ＴＮＦ−α、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン８（ＩＬ−８）などの炎症性サイトカイン（炎症症状を引き起こすサイトカイン）や、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン２３（ＩＬ−２３）などを挙げることができる。 The “immune response activating cytokine” of the present invention refers to a cytokine having a function of activating an immune response in humans and animals. Specific examples of immune response activating cytokines include interleukin 6 (IL-6), interleukin 1β (IL-1β), TNF-α, interferon γ (IFN-γ), and interleukin 8 (IL- Inflammatory cytokines (cytokines that cause inflammatory symptoms) such as 8), interleukin 12 (IL-12), and interleukin 23 (IL-23).
一方、免疫応答を抑制するサイトカインとしては、インターロイキン４（ＩＬ−４）やインターロイキン１０（ＩＬ−１０）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）などを挙げることができ、これらは、「抗炎症性サイトカイン」あるいは「抑制性サイトカイン」と総称される。 On the other hand, examples of cytokines that suppress the immune response include interleukin 4 (IL-4), interleukin 10 (IL-10), and transforming growth factor β (TGF-β). Collectively referred to as “anti-inflammatory cytokine” or “inhibitory cytokine”.
本発明に係る免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤および免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物は、後述する実施例１、２および４で示すように、免疫応答活性化サイトカインの産生を促進し、抑制性サイトカインの産生を抑制することができる。特に、免疫応答活性化サイトカインのうち、Ｔｈ１７細胞の分化誘導に寄与することが知られているＩＬ−６、および、Ｔｈ１７細胞の生存や機能維持に寄与することが知られているＩＬ−２３の産生を促進することから、本発明は、Ｔｈ１７細胞による免疫応答を促進するために用いることができる。 The immune response activated cytokine production promoter and the food composition for promoting immune response activated cytokine production according to the present invention promote production of immune response activated cytokines as shown in Examples 1, 2 and 4 described later. , Production of inhibitory cytokines can be suppressed. In particular, among immune response activating cytokines, IL-6, which is known to contribute to the induction of Th17 cell differentiation, and IL-23, which is known to contribute to the survival and function maintenance of Th17 cells. Because it promotes production, the present invention can be used to promote an immune response by Th17 cells.
ここで、「Ｔｈ１７細胞」は、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）を産生するヘルパーＴ細胞をいい、ナイーブＴ細胞から分化する。ＩＬ−１７産生細胞は、細胞内寄生菌（マイコバクテリウム）感染症への防御に寄与することが確認されている（Elena Zenaro et. al., Journal of Leukocyte Biology, Vol. 86, Dec. 2009, 1393-1401; 第１４００頁第６段落など）。また、ＩＬ−１７は、ヒトおよびマウスにおいて、真菌感染症への防御に寄与することが確認されている（Eva Bar et. al., Immunity 40, 117-127, Jan. 16, 2014; Summaryなど）。 Here, “Th17 cell” refers to a helper T cell that produces interleukin 17 (IL-17), and is differentiated from a naive T cell. IL-17-producing cells have been confirmed to contribute to protection against intracellular parasite (mycobacterial) infection (Elena Zenaro et. Al., Journal of Leukocyte Biology, Vol. 86, Dec. 2009). , 1393-1401; page 1400, sixth paragraph, etc.). In addition, IL-17 has been confirmed to contribute to protection against fungal infections in humans and mice (Eva Bar et. Al., Immunity 40, 117-127, Jan. 16, 2014; Summary, etc.) ).
従って、本発明のＴｈ１７細胞分化促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物は、Ｔｈ１７細胞の分化を促進することにより、細菌や真菌の感染症の予防や治療に用いることができる。同様に、本発明の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤および免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物もまた、Ｔｈ１７細胞による免疫応答を促進することにより、細菌や真菌の感染症の予防や治療に用いることができる。 Therefore, the Th17 cell differentiation promoting agent and Th17 cell differentiation promoting food composition of the present invention can be used for prevention and treatment of bacterial and fungal infections by promoting Th17 cell differentiation. Similarly, the immune response activated cytokine production promoter and the food composition for promoting immune response activated cytokine production of the present invention also promote the immune response by Th17 cells to prevent or treat bacterial or fungal infections. Can be used.
本発明の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤、免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物、Ｔｈ１７細胞分化促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物はいずれも、エルゴチオネインを有効成分とする。 The immune response activated cytokine production promoter, the immune response activated cytokine production promoting food composition, the Th17 cell differentiation promoting agent and the Th17 cell differentiation promoting food composition of the present invention all contain ergothioneine as an active ingredient.
本発明において、「エルゴチオネイン」は、試薬や健康食品などとして市販されているものを用いてもよく、キノコなどの天然物質から抽出・精製等したものを用いてもよい。エルゴチオネインはキノコの中でもタモギタケに多く含有されるため、本発明のエルゴチオネインを天然物質から得る場合、タモギタケから抽出することが好ましい。 In the present invention, “ergothioneine” may be one commercially available as a reagent or health food, or one extracted or purified from a natural substance such as mushroom. Since ergothioneine is abundantly contained in mushrooms among the mushrooms, when the ergothioneine of the present invention is obtained from a natural substance, it is preferably extracted from the mushrooms.
エルゴチオネインをタモギタケから抽出する方法としては、下記の方法を挙げることができる。まず、 生のタモギタケ１５０ｋｇ〜２００ｋｇを水２００Ｌに入れて加熱し、沸騰させた状態で５分間煮出した後、濾過して１５０Ｌの濾液を得る。この濾液について、５０００ｒｐｍ、１０℃の条件下で３０分間遠心分離を行って１３５Ｌの上清を回収する。５×３０ｃｍのカラムに充填したイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ１２０Ｂ Ｈ型；オルガノ社）に、回収した上清のうちの７．５Ｌを入れ、一晩自然落下させる。続いて、イオン交換樹脂を回収し、蒸留水２．５Ｌを用いて洗浄して糖質成分を除去した後、０．２８％（ｗ／ｗ）アンモニア水１０Ｌを用いて溶出し、イオン交換樹脂に吸着していた陽イオン性化合物を含む溶出液１０ｍＬを得る。ロータリーエバポレーターを用いてこの溶出液を濃縮した後、下記の条件により定法に従って高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行い、流出開始３〜４分に検出されるピークの画分を分取する。分取した画分を合わせた後、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥することにより、粉末状のタモギタケ由来エルゴチオネイン１．７ｇ（７．４ｍｍｏｌ）を得ることができる。 Examples of methods for extracting ergothioneine from Tamogitake include the following methods. First, 150 kg to 200 kg of raw bamboo shoots are put in 200 L of water, heated, boiled for 5 minutes in a boiled state, and then filtered to obtain a 150 L filtrate. The filtrate is centrifuged at 5000 rpm and 10 ° C. for 30 minutes to collect 135 L of the supernatant. 7.5 L of the collected supernatant is put into an ion exchange resin (Amberlite IR120B H type; Organo) packed in a 5 × 30 cm column and allowed to fall naturally overnight. Subsequently, the ion exchange resin is recovered, washed with 2.5 L of distilled water to remove saccharide components, and then eluted with 10 L of 0.28% (w / w) ammonia water. 10 mL of an eluate containing the cationic compound adsorbed on is obtained. After concentrating the eluate using a rotary evaporator, high-performance liquid chromatography (HPLC) is performed according to a conventional method under the following conditions, and a fraction of a peak detected at 3 to 4 minutes from the start of outflow is collected. The combined fractions are combined and then freeze-dried using a freeze dryer to obtain 1.7 g (7.4 mmol) of ergothioneine derived from powdered bamboo.
ＨＰＬＣの条件
ＨＰＬＣシステム；日立高速液体クロマトグラフＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ
溶離溶媒；０〜１％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液
カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−ＳＰ（ジーエルサイエンス社）
検出器；ＵＶ検出器
検出条件；２５０ｎｍ
HPLC Condition HPLC system; Hitachi High Performance Liquid Chromatograph LaChrom Elite
Elution solvent: 0 to 1% (v / v) acetonitrile aqueous solution column; Inertsil ODS-SP (GL Sciences Inc.)
Detector; UV detector detection condition; 250 nm
また、本発明の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物は、エルゴチオネインの他に、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド（Toll-like receptor ligand；ＴＬＲリガンド）を含むことが好ましい。 In addition, the immune response-activating cytokine production promoter of the present invention contains a Toll-like receptor ligand (TLR ligand) in addition to ergothionein. preferable.
「Ｔｏｌｌ様受容体リガンド（ＴＬＲリガンド）」とは、Ｔｏｌｌ様受容体（Toll-like receptor；ＴＬＲ）」のリガンドであり、「ＴＬＲアゴニスト」ともいう。ここで、ＴＬＲは、一般に、ヒトまたは動物の細胞表面またはエンドソームに存在する受容体タンパク質であり、種々の病原体をリガンドとして結合して、シグナル伝達系を活性化し、サイトカイン産生などの免疫反応を作動させる機能を有する。ＴＬＲには複数の種類が存在し、例えば、ヒトでは１０種類が知られていて、ＴＬＲ１〜１０と呼ばれる。 The “Toll-like receptor ligand (TLR ligand)” is a ligand of Toll-like receptor (TLR) and is also referred to as a “TLR agonist”. Here, TLR is a receptor protein generally present on the cell surface or endosome of humans or animals, binds various pathogens as ligands, activates signal transduction system, and activates immune reactions such as cytokine production. It has a function to make it. There are a plurality of types of TLRs. For example, 10 types are known in humans and are referred to as TLRs 1 to 10.
本発明の「ＴＬＲリガンド」は、ＴＬＲに結合して免疫応答活性化サイトカインを産生させる物質であればよい。ここで、ある物質が、「ＴＬＲに結合して免疫応答活性化サイトカインを産生させるか否か」は、定法に従って確認することができる。すなわち、後述する実施例１（３）および（４）に示すように、マクロファージなどのＴＬＲを発現している培養細胞の培地に、被検物質を添加して所定の時間培養する。また、比較対照として、被検物質を添加しないで同様に培養する。その後、培養上清中の免疫応答活性化サイトカインの濃度を、エライザまたはフローサイトメーターを用いたビーズアレイ法（Cytometric Bead Array；ＣＢＡ）により測定する。被検物質を添加した場合の方が、添加しない場合と比較して当該濃度が大きければ、被検物質は「ＴＬＲに結合して免疫応答活性化サイトカインを産生させる」と判断することができる。 The “TLR ligand” of the present invention may be any substance that binds to TLR and produces an immune response-activating cytokine. Here, whether or not a substance binds to TLR to produce an immune response-activating cytokine can be confirmed according to a standard method. That is, as shown in Examples 1 (3) and (4) described later, a test substance is added to a culture medium of a cultured cell expressing TLR such as macrophages and cultured for a predetermined time. As a comparative control, the same culture is performed without adding a test substance. Thereafter, the concentration of the immune response-activating cytokine in the culture supernatant is measured by a bead array method (Cytometric Bead Array; CBA) using an ELISA or a flow cytometer. If the concentration is higher in the case where the test substance is added than in the case where the test substance is not added, it can be determined that the test substance “binds TLR to produce an immune response-activating cytokine”.
本発明の「ＴＬＲリガンド」として、具体的には、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）などのＴＬＲ１／４リガンド、合成ジアシル化リポタンパク質などのＴＬＲ２／６リガンド、合成トリアシル化リポタンパク質などのＴＬＲ１／２リガンド、加熱処理細菌（Heat-Killed Bacteria）やリポグリカン、リポテイコ酸、ペプチドグリカン、合成リポタンパク質、ザイモサンなどのＴＬＲ２リガンド、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）やウイルス二本鎖ＤＮＡなどのＴＬＲ３リガンド、リピドＡ（Monophosphoryl Lipid A）などのＴＬＲ４リガンド、フラジェリンなどのＴＬＲ５リガンド、イミダノキノリン化合物（ガーディキモド、イミキモドなど）やグアノシンアナログなどのＴＬＲ７リガンド、一本鎖ＲＮＡや大腸菌ＲＮＡなどのＴＬＲ８リガンド、チアゾロキノリン化合物やイミダゾキノリン化合物、ウイルス一本鎖ＲＮＡなどのＴＬＲ７／８リガンド、ＣｐＧモチーフをもつＤＮＡなどのＴＬＲ９リガンドを挙げることができる。本発明において、ＴＬＲリガンドは、例えば、試薬として市販されているものを用いることができる他、定法に従って化学合成してもよく、細菌やウイルスから定法に従って抽出・精製等したものを用いてもよい。 Specific examples of the “TLR ligand” of the present invention include TLR1 / 4 ligands such as lipopolysaccharide (LPS), TLR2 / 6 ligands such as synthetic diacylated lipoproteins, and TLR1 / 2 such as synthetic triacylated lipoproteins. Ligand, heat-treated bacterium (Heat-Killed Bacteria), lipoglycan, lipoteichoic acid, peptidoglycan, synthetic lipoprotein, TLR2 ligands such as zymosan, TLR3 ligands such as Poly (I: C) and viral double-stranded DNA, lipid A (Monophosphoryl) TLR4 ligands such as Lipid A), TLR5 ligands such as flagellin, TLR7 ligands such as imidanoquinoline compounds (Gardyquimod, imiquimod, etc.) and guanosine analogs, TLR8 ligands such as single-stranded RNA and E. coli RNA, and thiazoquinoline compounds And imidazoquinoline compounds, TLR7 / 8 ligands such as single-stranded RNA viruses, can be mentioned TLR9 ligands, such as DNA with CpG motifs. In the present invention, as the TLR ligand, for example, a commercially available reagent can be used, or it can be chemically synthesized according to a conventional method, or can be extracted or purified from bacteria or viruses according to a conventional method. .
本発明において「免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する」とは、免疫応答活性化サイトカインの産生量を増大させることをいう。被検物質が「免疫応答活性化サイトカインの産生を促進するか否か」は、定法に従って確認することができる。すなわち、後述する実施例１（１）〜（４）に示すように、まず、マクロファージなどの免疫応答活性化サイトカインを産生する能力を有する培養細胞の培地に被検物質を添加して所定の時間培養する。また、比較対照として、被検物質を添加しないで同様に培養する。続いて、ＴＬＲリガンドを添加して所定の時間培養する。その後、培養上清中の免疫応答活性化サイトカインの濃度を、エライザまたはＣＢＡにより測定する。被検物質を添加した場合の方が、添加しない場合と比較して当該濃度が大きければ、被検物質は「免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する」と判断することができる。 In the present invention, “promoting the production of immune response activating cytokine” means increasing the production amount of the immune response activating cytokine. Whether or not the test substance promotes production of immune response-activating cytokine can be confirmed according to a standard method. That is, as shown in Examples 1 (1) to (4), which will be described later, first, a test substance is added to a culture medium of cultured cells having the ability to produce immune response-activating cytokines such as macrophages, and a predetermined period of time. Incubate. As a comparative control, the same culture is performed without adding a test substance. Subsequently, a TLR ligand is added and cultured for a predetermined time. Thereafter, the concentration of the immune response activating cytokine in the culture supernatant is measured by an ELISA or CBA. If the concentration is higher in the case where the test substance is added than in the case where the test substance is not added, the test substance can be determined to “promote production of immune response-activating cytokines”.
本発明において、被検物質が「Ｔｈ１７細胞の分化を促進するか否か」は、ＩＬ−１７の産生量を測定することにより確認することができる。すなわち、後述する実施例３（１）〜（４）に示すように、まず、Ｆ４／８０陽性細胞などの抗原提示細胞の培地に被検物質を添加して所定の時間培養する。また、比較対照として、被検物質を添加しないで同様に培養する。続いて、当該抗原提示細胞とナイーブＴ細胞とを、抗原ペプチドの存在下で所定の時間共培養する。その後、培養上清中のＩＬ−１７の濃度を、エライザまたはＣＢＡにより測定する。被検物質を添加した場合の方が、添加しない場合と比較してＩＬ−１７の濃度が大きければ、被検物質は「Ｔｈ１７細胞の分化を促進する」と判断することができる。 In the present invention, whether or not a test substance promotes differentiation of Th17 cells can be confirmed by measuring the production amount of IL-17. That is, as shown in Examples 3 (1) to (4) described later, first, a test substance is added to a medium of antigen-presenting cells such as F4 / 80 positive cells and cultured for a predetermined time. As a comparative control, the same culture is performed without adding a test substance. Subsequently, the antigen-presenting cells and naive T cells are co-cultured for a predetermined time in the presence of the antigen peptide. Thereafter, the concentration of IL-17 in the culture supernatant is measured by an ELISA or CBA. If the concentration of IL-17 is greater in the case where the test substance is added than in the case where the test substance is not added, the test substance can be determined to “promote Th17 cell differentiation”.
ここで、「抗原ペプチド」とは、一般に、生体にとって異物として認識される抗原タンパク質のアミノ酸配列に由来するペプチドであって、抗原提示細胞の細胞表面に抗原提示されるペプチドをいう。 Here, the “antigen peptide” generally refers to a peptide derived from the amino acid sequence of an antigen protein that is recognized as a foreign substance by a living body and presented as an antigen on the cell surface of an antigen-presenting cell.
本発明のＴｈ１７細胞分化促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物は、エルゴチオネインの他に、抗原ペプチドを含むことが好ましい。 The Th17 cell differentiation promoting agent and Th17 cell differentiation promoting food composition of the present invention preferably contains an antigenic peptide in addition to ergothioneine.
本発明の抗原ペプチドは、抗原提示細胞の細胞表面に抗原提示されうる限り、そのアミノ酸配列および配列長は特に限定されない。抗原ペプチドとして、具体的には、例えば、細菌やウイルス、原虫などの抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドの他、トリ卵白アルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）の３２３〜３３９番目のアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。ここで、抗原タンパク質として、具体的には、例えば、サルモネラ菌やネズミチフス菌のフラジェリンタンパク質、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質、マラリア原虫のＳＥＲＡ（Serine Repeat Antigen）タンパク質、Ｂ群連鎖球菌のＧＢＳ８０タンパク質、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）のｐｇ４０エンベロープタンパク質、ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０またはｇｐ１６０エンベロープタンパク質、ヒトパピローマウイルスのＥ６、Ｅ７、またはＬ２タンパク質、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶのＥ２・ＮＳ１エンベロープ糖タンパク質、フラビウイルス属のＮＳ１非構造タンパク質またはＤＩ・ＩＩ・ＩＩＩタンパク質、アミロイドベータ（Ａβ）タンパク質、ペスチウイルス属のｇｐ５３タンパク質、豚コレラウイルスのｇｐ５５エンベロープタンパク質、パルポウイルスのＶＰ２カプシドタンパク質、ホワイトスポット症候群ウイルスのＶＰ２８エンベロープタンパク質などを挙げることができる。 The antigen peptide of the present invention is not particularly limited in its amino acid sequence and sequence length as long as the antigen can be presented on the cell surface of the antigen-presenting cell. Specific examples of antigenic peptides include peptides consisting of the 323-339th amino acid sequences of avian ovalbumin (OVA) in addition to antigenic peptides derived from antigenic proteins such as bacteria, viruses and protozoa. Can do. Specific examples of the antigen protein include flagellin protein of Salmonella and Salmonella typhimurium, M2 protein of influenza virus, SERA (Serine Repeat Antigen) protein of malaria parasite, GBS80 protein of group B streptococcus, porphyromonas Pg40 envelope protein of Porphyromonas gingivalis, gp120 or gp160 envelope protein of HIV virus, E6, E7, or L2 protein of human papilloma virus, E2 / NS1 envelope glycoprotein of hepatitis C virus HCV, NS1 non-flavor virus genus NS1 Structural protein or DI / II / III protein, amyloid beta (Aβ) protein, gp53 protein of pestivirus, porcine correlauil gp55 envelope protein of, VP2 capsid protein of Pal Po virus, and the like can be given VP28 envelope proteins of white spot syndrome virus.
本発明の抗原ペプチドは、試薬として市販されているものを用いてもよく、上述の抗原タンパク質の公知のアミノ酸配列情報に基づいて、その一部に相当するアミノ酸配列からなる抗原ペプチドを、化学合成または遺伝子工学的に合成して用いてもよい。化学合成する場合は、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法により合成することができる他、各種の市販のペプチド合成機を利用して合成することもできる。また、遺伝子工学的に合成する場合は、例えば、抗原ペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、適当なベクターに挿入して組換えベクターを得た後、その組換えベクターを大腸菌等の適当な宿主に導入して形質転換体を得る。そして、得られた形質転換体を培養して当該ＤＮＡを発現させることにより、抗原ペプチドを得ることができる。 The antigen peptide of the present invention may be one that is commercially available as a reagent. Based on the known amino acid sequence information of the above-mentioned antigen protein, an antigen peptide consisting of an amino acid sequence corresponding to a part thereof is chemically synthesized. Alternatively, it may be synthesized by genetic engineering. In the case of chemical synthesis, for example, it can be synthesized by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), and various commercially available peptide synthesizers. Can also be synthesized. In the case of synthesis by genetic engineering, for example, after a DNA encoding the amino acid sequence of an antigen peptide is inserted into an appropriate vector to obtain a recombinant vector, the recombinant vector is then transferred to an appropriate host such as Escherichia coli. To obtain a transformant. An antigenic peptide can be obtained by culturing the obtained transformant and expressing the DNA.
本発明に係る免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を有する；
（ａ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインを摂取させる工程、
（ｂ）前記ヒトまたは動物において、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の刺激により免疫応答活性化サイトカインを産生させる工程、
（ｃ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインにより免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する工程。
なお、本方法において、上述した「免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤」および「免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物」と同じまたは相当する構成については、再度の説明は省略する。
The method for promoting production of immune response activating cytokine according to the present invention includes the following steps (a) to (c);
(A) ingesting ergothioneine into a human or animal;
(B) producing an immune response activating cytokine by stimulation of a Toll-like receptor (TLR) in the human or animal,
(C) A step of promoting the production of immune response-activating cytokine by ingested ergothioneine in the human or animal.
In addition, in this method, about the structure which is the same as that of the "immune response activation cytokine production promoter" mentioned above and "the food composition for immune response activation cytokine production promotion", or description corresponding to it is abbreviate | omitted.
本発明において、「ヒトまたは動物」には、ヒトまたは動物に由来する培養細胞も含まれる。 In the present invention, “human or animal” includes cultured cells derived from humans or animals.
（ａ）の工程は、生体（ｉｎ ｖｉｖｏ）のヒトまたは動物に対しては、エルゴチオネインをそのまま、あるいは飲食物や飼料、医薬品などの形態で、経口摂取させることにより行うことができる。また、エルゴチオネインを含有する液体状、ゲル状ないしクリーム状の組成物を塗布、貼付あるいは噴霧するなどして経皮吸収させてもよく、座薬や注射により摂取させてもよい。また、ヒトまたは動物に由来する培養細胞に対しては、エルゴチオネインを培地に添加することにより摂取させることができる。 The step (a) can be carried out by ingesting ergothioneine as it is or in the form of food, drink, feed, medicine, etc. for a living human or animal. In addition, a liquid, gel or cream composition containing ergothioneine may be applied, affixed or sprayed for percutaneous absorption, or may be taken by suppository or injection. Further, cultured cells derived from humans or animals can be ingested by adding ergothioneine to the medium.
（ｂ）の工程は、エルゴチオネインを摂取させたヒトまたは動物において、ＴＬＲの刺激により免疫応答活性化サイトカインを産生させる工程である。すなわち、当該ヒトまたは動物において、ＴＬＲが刺激された結果、免疫応答活性化サイトカインが産生された状態となればよい。 The step (b) is a step of producing an immune response-activating cytokine by stimulation of TLR in a human or animal ingested with ergothioneine. That is, it suffices that the immune response-activating cytokine is produced as a result of stimulation of TLR in the human or animal.
なお、本発明において「ＴＬＲが刺激される」とは、ＴＬＲを発現しているヒト、動物ないし培養細胞においてＴＬＲにＴＬＲリガンドが結合することをいう。すなわち、「ＴＬＲを刺激する」とは、ＴＬＲにＴＬＲリガンドを結合させることをいう。 In the present invention, “TLR is stimulated” means that a TLR ligand binds to TLR in human, animal or cultured cells expressing TLR. That is, “stimulate TLR” means that a TLR ligand is bound to TLR.
ＴＬＲの刺激は、例えば、当該ヒトまたは動物に、ＴＬＲリガンドを摂取させることにより行うことができる。ＴＬＲリガンドを摂取させる方法は、上述した（ａ）の工程におけるエルゴチオネインを摂取させる方法と同様の方法を挙げることができる。 TLR stimulation can be performed, for example, by ingesting the human or animal with a TLR ligand. Examples of the method of ingesting the TLR ligand include the same method as the method of ingesting ergothioneine in the step (a) described above.
（ｃ）の工程において、摂取させたエルゴチオネインにより免疫応答活性化サイトカインの産生が促進されたか否かは、定法に従って確認することができる。すなわち、培養細胞に対しては、上述の「被検物質が免疫応答活性化サイトカインの産生を促進するか否かを確認する方法」で確認することができる。一方、生体（ｉｎ ｖｉｖｏ）のヒトまたは動物に対しては、後述する実施例４に示すように、血清を採取して、当該血清に含まれる免疫応答活性化サイトカインの濃度を、エライザまたはＣＢＡにより測定する。エルゴチオネインを摂取した場合の方が、摂取しない場合と比較して当該濃度が大きければ、「摂取させたエルゴチオネインにより免疫応答活性化サイトカインの産生が促進された」と判断することができる。 In the step (c), it can be confirmed according to a conventional method whether or not production of immune response activating cytokines is promoted by the ingested ergothioneine. That is, the cultured cells can be confirmed by the above-described “method for confirming whether the test substance promotes production of immune response-activating cytokine”. On the other hand, for in vivo humans or animals, as shown in Example 4 to be described later, serum is collected, and the concentration of immune response activating cytokine contained in the serum is determined by ELISA or CBA. taking measurement. If the concentration when ergothioneine is ingested is higher than that when it is not ingested, it can be determined that "the production of immune response-activating cytokines is promoted by the ingested ergothioneine".
本発明に係るＴｈ１７細胞の分化を促進する方法は、下記（ｄ）〜（ｆ）の工程を有する；
（ｄ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインを摂取させる工程、
（ｅ）前記ヒトまたは動物において、抗原ペプチドの刺激によりＴｈ１７細胞を分化させる工程および
（ｆ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインによりＴｈ１７細胞の分化を促進する工程。
なお、本方法において、上述した「免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤」、「免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物」、「免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法」、「Ｔｈ１７細胞分化促進剤」および「Ｔｈ１７細胞分化促進用食品組成物」と同じまたは相当する構成については、再度の説明は省略する。
The method for promoting Th17 cell differentiation according to the present invention includes the following steps (d) to (f);
(D) ingesting ergothioneine into a human or animal;
(E) a step of differentiating Th17 cells by stimulation with an antigen peptide in the human or animal; and (f) a step of promoting differentiation of Th17 cells by ingested ergothioneine in the human or animal.
In this method, the above-mentioned “immune response activation cytokine production promoter”, “food composition for promoting immune response activation cytokine production”, “method for promoting production of immune response activation cytokine”, “Th17 cells” The description of the same or corresponding components as the “differentiation promoter” and “Th17 cell differentiation promoting food composition” will not be repeated.
（ｄ）の工程は、上述した「免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法」の（ａ）の工程と同様に行うことができる。 The step (d) can be performed in the same manner as the step (a) in the above-mentioned “method for promoting production of immune response-activating cytokine”.
（ｅ）の工程は、エルゴチオネインを摂取させたヒトまたは動物において、抗原ペプチドの刺激によりＴｈ１７細胞を分化させる工程である。すなわち、当該ヒトまたは動物が抗原ペプチドの刺激を受けた結果、Ｔｈ１７細胞が分化した状態となればよい。ここで、「抗原ペプチドの刺激を受ける」とは、当該ヒトまたは動物における抗原提示細胞が抗原ペプチドに接触することをいう。 The step (e) is a step in which Th17 cells are differentiated by stimulation with an antigen peptide in a human or animal ingested with ergothioneine. That is, the Th17 cell may be in a differentiated state as a result of the human or animal being stimulated with the antigen peptide. Here, “being stimulated by an antigen peptide” means that an antigen-presenting cell in the human or animal comes into contact with the antigen peptide.
（ｅ）の工程は、簡便には、当該ヒトまたは動物に、抗原ペプチドを摂取させることにより行うことができる。抗原ペプチドを摂取させる方法は、上述した「免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する方法」の（ａ）の工程におけるエルゴチオネインを摂取させる方法と同様の方法を挙げることができる。 The step (e) can be conveniently performed by ingesting the human or animal with the antigenic peptide. Examples of the method for ingesting the antigenic peptide include the same method as the method for ingesting ergothioneine in the step (a) of the above-mentioned “Method for Promoting Production of Immune Response-Activating Cytokine”.
「抗原ペプチドの刺激を受けた結果、Ｔｈ１７細胞が分化したか否か」は、ＩＬ−１７の産生量を測定することにより確認することができる。すなわち、培養細胞については培養上清中の、生体（ｉｎ ｖｉｖｏ）のヒトまたは動物については血清中のＩＬ−１７の濃度を、エライザまたはＣＢＡにより測定する。抗原ペプチドの刺激を受けた場合の方が、抗原ペプチドの刺激を受けない場合と比較してＩＬ−１７の濃度が大きければ、「抗原ペプチドの刺激を受けた結果、Ｔｈ１７細胞が分化した」と判断することができる。 “Whether Th17 cells have differentiated as a result of stimulation with antigenic peptides” can be confirmed by measuring the amount of IL-17 produced. That is, the concentration of IL-17 in the culture supernatant for cultured cells, or in serum for in vivo humans or animals, is measured by an ELISA or CBA. If the IL-17 concentration is greater in the case of being stimulated with the antigen peptide than in the case of not being stimulated with the antigen peptide, “Th17 cells differentiated as a result of stimulation with the antigen peptide”. Judgment can be made.
（ｆ）の工程において、摂取させたエルゴチオネインによりＴｈ１７細胞の分化が促進されたか否かは、定法に従って確認することができる。すなわち、培養細胞に対しては、上述の「被検物質がＴｈ１７細胞の分化を促進するか否かを確認する方法」で確認することができる。一方、生体（ｉｎ ｖｉｖｏ）のヒトまたは動物に対しては、血清を採取して、当該血清に含まれるＩＬ−１７の濃度を、エライザまたはＣＢＡにより測定する。エルゴチオネインを摂取した場合の方が、摂取しない場合と比較して当該濃度が大きければ、「摂取させたエルゴチオネインによりＴｈ１７細胞の分化が促進された」と判断することができる。 In the step (f), whether or not differentiation of Th17 cells is promoted by the ingested ergothioneine can be confirmed according to a conventional method. That is, the cultured cells can be confirmed by the above-described “method for confirming whether the test substance promotes differentiation of Th17 cells”. On the other hand, for living humans or animals, serum is collected, and the concentration of IL-17 contained in the serum is measured by an ELISA or CBA. If the concentration when ergothioneine is ingested is higher than when it is not ingested, it can be determined that “the differentiation of Th17 cells is promoted by the ingested ergothioneine”.
本発明の免疫応答活性化サイトカイン産生促進剤およびＴｈ１７細胞分化促進剤（以下、まとめて「本発明の剤」という場合がある。）の具体的な態様としては、例えば、医薬品や医薬部外品、食品添加物、サプリメントなどの健康食品などを挙げることができる。本発明の剤の製剤化には、当業者に公知の方法を用いることができる。 Specific embodiments of the immune response-activating cytokine production promoter and Th17 cell differentiation promoter of the present invention (hereinafter sometimes collectively referred to as “the agent of the present invention”) include, for example, pharmaceuticals and quasi drugs. And health foods such as food additives and supplements. Methods known to those skilled in the art can be used to formulate the agent of the present invention.
本発明の剤を医薬品や医薬部外品、サプリメントとして用いる場合の剤型としては、例えば、液剤、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、コーティング剤、懸濁剤、ジェル剤、吸入剤、注射剤、点滴剤、糖衣剤、ドライシロップ剤、シロップ剤、ドロップ剤、ドリンク剤座薬、塗布剤、噴霧剤、貼付剤、軟膏、クリームなどを挙げることができる。
本発明の剤の摂取量は、摂取させる対象の年齢や体重、症状、摂取方法などによって適宜設定することができる。
Examples of dosage forms when the agent of the present invention is used as pharmaceuticals, quasi drugs, and supplements include, for example, liquids, granules, powders, tablets, capsules, coating agents, suspensions, gels, inhalants, and injections. Agents, drops, dragees, dry syrups, syrups, drops, drink suppositories, coatings, sprays, patches, ointments, creams and the like.
The intake of the agent of the present invention can be appropriately set depending on the age, weight, symptoms, intake method, etc. of the subject to be taken.
本発明の免疫応答活性化サイトカイン産生促進用食品組成物およびＴｈ１７細胞分化促進用食品組成物（以下、まとめて「本発明の食品組成物」という場合がある。）の具体的な態様としては、例えば、食用に供するペースト、水煮、レトルト食品、ベビーフード、発酵食品、保存食、乳製品、水産加工品、食肉加工品、穀物加工品などの加工食品や飲料、食品添加物、サプリメントなどの健康食品、動物飼料などを挙げることができる。
本発明の食品組成物は、各種の飲食品や動物飼料、食品添加物の通常の製造過程において、その有効成分を添加して製造することができる。
Specific embodiments of the food composition for promoting immune response-activating cytokine production and the food composition for promoting Th17 cell differentiation of the present invention (hereinafter sometimes collectively referred to as “the food composition of the present invention”) include: For example, processed foods and beverages such as pastes, boiled, retort foods, baby foods, fermented foods, preserved foods, dairy products, processed fishery products, processed meat products, processed grain products, etc., food additives, supplements, etc. Health foods, animal feeds and the like can be mentioned.
The food composition of the present invention can be produced by adding its active ingredients in the normal production process of various foods and drinks, animal feeds and food additives.
次に、本発明の各実施例について説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。 Next, each example of the present invention will be described. Note that the technical scope of the present invention is not limited to the features shown by these examples.
以下の実施例において、エルゴチオネインは、試薬のＬ−エルゴチオネイン（TETRAHEDRON社）を用いた。また、特に記載の無い場合、細胞の培養は３７℃、５（ｖ／ｖ）％ＣＯ２条件下で行った。 In the following examples, the reagent L-ergothioneine (TETRAHEDRON) was used as ergothioneine. Further, unless otherwise specified, the cells were cultured under the conditions of 37 ° C. and 5 (v / v)% CO 2 .
＜実施例１＞サイトカイン産生に対する効果の検討
（１）骨髄由来マクロファージの調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６〜１０週齢；日本クレア社）由来の骨髄細胞を６日間培養し、これを骨髄由来マクロファージ（bone marrow-derived macrophages；ＢＭＤＭ）とした。培地は、１０（ｖ／ｖ）％（fetal bovine serum；ＦＢＳ）、１００ｍＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび３０（ｖ／ｖ）％のＬ９２９細胞ならし培地（conditioned medium）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。培地は３日毎に新しいものに交換した。
<Example 1> Examination of effects on cytokine production (1) Preparation of bone marrow-derived macrophages C57BL / 6 mice (female, 6-10 weeks old; Claire Japan) were cultured for 6 days, and this was derived from bone marrow Macrophages (bone marrow-derived macrophages; BMDM) were used. The medium is RPMI 1640 containing 10 (v / v)% (fetal bovine serum; FBS), 100 mU / mL penicillin, 100 μg / mL streptomycin and 30 (v / v)% L929 cell conditioned medium. Medium was used. The medium was replaced with a new one every 3 days.
（２）エルゴチオネインの事前投与
本実施例１（１）のＢＭＤＭの培地に１ｍＭまたは１０ｍＭとなるようＬ−エルゴチオネイン（TETRAHEDRON社）を添加して、３〜２４時間培養した。また、比較対照として、エルゴチオネインに代えて同量のリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline；ＰＢＳ）を添加し、同様に培養した。
(2) Pre-administration of ergothioneine L-ergothioneine (TETRAHEDRON) was added to the BMDM medium of Example 1 (1) to 1 mM or 10 mM, and cultured for 3 to 24 hours. As a comparative control, the same amount of phosphate buffered saline (PBS) was added instead of ergothioneine, and the cells were cultured in the same manner.
（３）Ｔｏｌｌ様受容体の刺激
Ｔｏｌｌ様受容体リガンド（ＴＬＲリガンド）により、ＢＭＤＭのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を刺激した。具体的には、本実施例１（２）のＢＭＤＭの培地に、ガーディキモド（インビトロジェン社）を１μｇ／ｍＬとなるよう添加して２４時間培養し、これをＴＬＲリガンド有り」の試料とした。また、ＴＬＲを刺激しない比較対照として、ガーディキモドに代えて同量のＰＢＳを培地に添加して同様に培養し、これを「ＴＬＲリガンド無し」の試料とした。
(3) Stimulation of Toll-like receptor Toll-like receptor (TLR) of BMDM was stimulated by Toll-like receptor ligand (TLR ligand). Specifically, Gardiquimod (Invitrogen) was added to the BMDM medium of Example 1 (2) so as to be 1 μg / mL and cultured for 24 hours, and this was used as a sample with “TLR ligand”. In addition, as a comparative control that does not stimulate TLR, the same amount of PBS was added to the medium instead of gardiquimod and cultured in the same manner, and this was used as a sample having no TLR ligand.
（４）サイトカイン濃度の測定
本実施例１（３）のＢＭＤＭの培養上清に含まれるＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０の濃度を測定した。ＩＬ−６およびＩＬ−１０の濃度は、BD Cytometric Bead Array (CBA) Mouse IL-6 Flex SetおよびMouse IL-10 Flex Set（BD Bioscience社）を用いて、フローサイトメーターを用いたビーズアレイ法（ＣＢＡ）を使用書に従って行うことにより測定した。また、ＩＬ−１２ｐ４０の濃度は、Mouse IL-12/23 p40 ELISA MAX Deluxe（Biolegend社）を用いて、エライザを使用書に従って行うことにより測定した。測定値について、各条件における３試料の平均値および標準偏差を求めた。その結果を図１に示す。
(4) Measurement of cytokine concentration The concentrations of IL-6, IL-12p40 and IL-10 contained in the culture supernatant of BMDM of Example 1 (3) were measured. The concentrations of IL-6 and IL-10 were measured using a BD Cytometric Bead Array (CBA) Mouse IL-6 Flex Set and Mouse IL-10 Flex Set (BD Bioscience) using a bead array method using a flow cytometer ( CBA) was measured according to the instructions for use. Moreover, the concentration of IL-12p40 was measured by performing an ELISA according to the instruction manual using Mouse IL-12 / 23 p40 ELISA MAX Deluxe (Biolegend). About the measured value, the average value and standard deviation of 3 samples in each condition were calculated | required. The result is shown in FIG.
図１に示すように、ＴＬＲリガンド無しの場合は、培地におけるエルゴチオネインの濃度が０、１および１０ｍＭのいずれの試料でも、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０が検出されなかった。すなわち、ＴＬＲを刺激しなかった場合は、エルゴチオネインの有無に関わらず、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０が検出されなかった。 As shown in FIG. 1, in the case of no TLR ligand, IL-6, IL-12p40, and IL-10 were not detected in any samples having ergothioneine concentrations of 0, 1, and 10 mM in the medium. That is, when TLR was not stimulated, IL-6, IL-12p40 and IL-10 were not detected regardless of the presence or absence of ergothioneine.
その一方で、ＴＬＲリガンド有りの場合は、培地におけるエルゴチオネインの濃度が０、１および１０ｍＭのいずれの試料でも、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０のいずれも検出された。そして、エルゴチオネインの濃度が大きいほど、あるいは事前投与の培養時間が長いほど、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０の濃度が大きく、ＩＬ−１０の濃度が小さかった。特に、エルゴチオネインの事前投与の培養時間が１２時間以上または濃度が１０ｍＭ以上において、ＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０の濃度が顕著に大きかった。 On the other hand, when TLR ligand was present, any of IL-6, IL-12p40 and IL-10 was detected in any sample having ergothioneine concentrations of 0, 1, and 10 mM in the medium. And the concentration of IL-6 and IL-12p40 was large and the concentration of IL-10 was small, so that the density | concentration of ergothionein was large or the culture | cultivation time of prior administration was long. In particular, the concentrations of IL-6 and IL-12p40 were remarkably high when the culture time for pre-administration of ergothionein was 12 hours or more or the concentration was 10 mM or more.
すなわち、エルゴチオネインは、ＴＬＲの刺激により誘導されるＩＬ−６およびＩＬ−１２の産生を促進し、ＩＬ−１０の産生を抑制することが示された。また、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の産生促進効果は、エルゴチオネインの事前投与の培養時間が２４時間以上または濃度が１０ｍＭ以上である場合に、顕著に大きくなることが示された。これらの結果から、エルゴチオネインはＴＬＲの刺激により誘導される免疫応答活性化サイトカインの産生を促進することが明らかになった。 That is, it was shown that ergothioneine promotes IL-6 and IL-12 production induced by TLR stimulation and suppresses IL-10 production. Moreover, it was shown that the production promotion effect of IL-6 and IL-12 becomes remarkably large when the culture time of the pre-administration of ergothionein is 24 hours or more or the concentration is 10 mM or more. These results revealed that ergothioneine promotes the production of immune response-activating cytokines induced by TLR stimulation.
＜実施例２＞サイトカイン産生促進効果におけるＴＬＲリガンドの検討
（１）サイトカイン濃度の測定
実施例１（１）〜（４）に記載の方法により、ＢＭＤＭにエルゴチオネインを投与した後ＴＬＲを刺激し、培養上清のサイトカイン濃度を測定した。ただし、エルゴチオネインの濃度は０または１０ｍＭとした。また、ＴＬＲリガンドは、合成ジアシル化リポタンパク質（Ｐａｍ２ＣＳＫ４；CS Bio社）（５０ｎＭ）、合成トリアシル化リポタンパク質（Ｐａｍ３ＣＳＫ４；；Boehringer Mannheim社）（１００ｎｇ／ｍＬ）、リポ多糖（ＬＰＳ；シグマ社））（１００ｎｇ／ｍＬ）およびイミダゾキノリン化合物（ガーディキモド；インビトロジェン社）（１μｇ／ｍＬ）を、括弧内の濃度となるよう培地に添加して用いた。また、サイトカインは、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０の濃度を測定した。ＩＬ−１βの濃度は、CBA Mouse IL-1β Flex set（BD Bioscience社）を用いてＣＢＡを使用書に従って行うことにより測定した。その結果を図２に示す。
<Example 2> Examination of TLR ligand in cytokine production promoting effect (1) Measurement of cytokine concentration After ergothioneine was administered to BMDM by the method described in Examples 1 (1) to (4), TLR was stimulated and cultured. The cytokine concentration in the supernatant was measured. However, the concentration of ergothioneine was 0 or 10 mM. TLR ligands include synthetic diacylated lipoprotein (Pam2CSK4; CS Bio) (50 nM), synthetic triacylated lipoprotein (Pam3CSK4; Boehringer Mannheim) (100 ng / mL), lipopolysaccharide (LPS; Sigma)) (100 ng / mL) and imidazoquinoline compound (Gardyquimod; Invitrogen) (1 μg / mL) were added to the medium so that the concentration in the parenthesis was obtained. Moreover, as for cytokine, the density | concentration of IL-6, IL-12p40, IL-1 (beta), and IL-10 was measured. The concentration of IL-1β was measured by performing CBA according to the instruction manual using CBA Mouse IL-1β Flex set (BD Bioscience). The result is shown in FIG.
図２に示すように、ＴＬＲリガンド無しの場合は、エルゴチオネインの濃度が０および１０ｍＭのいずれの試料でも、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０が検出されなかった。すなわち、ＴＬＲを刺激しなかった場合は、エルゴチオネインの有無に関わらず、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０が検出されなかった。 As shown in FIG. 2, in the case of no TLR ligand, IL-6, IL-12p40, IL-1β, and IL-10 were not detected in any samples having ergothioneine concentrations of 0 and 10 mM. That is, when TLR was not stimulated, IL-6, IL-12p40, IL-1β and IL-10 were not detected regardless of the presence or absence of ergothioneine.
その一方で、ＴＬＲリガンド有りの場合は、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０のいずれも検出された。そして、ＴＬＲリガンドとしてＰａｍ２ＣＳＫ４、Ｐａｍ３ＣＳＫ４およびガーディキモドを用いた場合は、エルゴチオネインの濃度が１０ｍＭの方が０ｍＭと比較してＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１βの濃度が大きく、ＩＬ−１０の濃度が小さかった。ＴＬＲリガンドとしてＬＰＳを用いた場合は、エルゴチオネインの濃度が１０ｍＭの方が０ｍＭと比較してＩＬ−６およびＩＬ−１２ｐ４０の濃度が大きく、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０の濃度が小さかった。 On the other hand, when there was a TLR ligand, all of IL-6, IL-12p40, IL-1β, and IL-10 were detected. When Pam2CSK4, Pam3CSK4 and Gardiquimod are used as the TLR ligand, the concentration of IL-6, IL-12p40 and IL-1β is higher when the concentration of ergothionein is 10 mM than when 0 mM, and the concentration of IL-10 Was small. When LPS was used as the TLR ligand, the concentration of IL-6 and IL-12p40 was higher when the concentration of ergothionein was 10 mM than that of 0 mM, and the concentrations of IL-1β and IL-10 were lower.
すなわち、エルゴチオネインは、各種のＴＬＲリガンドによるＴＬＲの刺激で誘導されるＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１βの産生を促進し、ＩＬ−１０の産生を抑制することが示された。これらの結果から、エルゴチオネインは、幅広いＴＬＲリガンドによるＴＬＲの刺激で誘導される免疫応答活性化サイトカインの産生を促進することが明らかになった。 That is, it was shown that ergothioneine promotes the production of IL-6, IL-12 and IL-1β induced by the stimulation of TLR with various TLR ligands and suppresses the production of IL-10. These results revealed that ergothioneine promotes the production of immune response-activating cytokines induced by stimulation of TLRs with a wide range of TLR ligands.
（２）サイトカイン遺伝子の発現量の測定
本実施例２（１）のＢＭＤＭについて、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ３５およびＩＬ−２３ｐ１９の遺伝子発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。具体的には、まず、RNeasy Mini prep Kit（キアゲン社）を用いて、ＢＭＤＭから全ＲＮＡを抽出した。続いて、この全ＲＮＡを鋳型として、High-capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems社)およびランダムヘキサマーを用いてｃＤＮＡを作製した。次に、このｃＤＮＡを鋳型として、各サイトカイン遺伝子に特異的なプライマー（配列は以下に示す）、ＰＣＲ試薬「SYBR GREEN PCR Master Mix」（Applied Biosystems社）およびＰＣＲ装置「StepOne Real-Time PCR system」（Applied Biosystems社）を用いて定量ＰＣＲを行った。定量結果はマウスＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で補正し、「エルゴチオネインの濃度が０ｍＭかつＴＬＲリガンド無し」の場合の遺伝子発現量を１として、それに対する増加量（倍数）で表した。その結果を図３に示す。
(2) Measurement of expression level of cytokine gene For BMDM of Example 2 (1), gene expression levels of IL-6, IL-12p40, IL-1β, IL-10, IL-12p35 and IL-23p19 were quantified. Measured by RT-PCR method. Specifically, first, total RNA was extracted from BMDM using RNeasy Mini prep Kit (Qiagen). Subsequently, using this total RNA as a template, cDNA was prepared using High-capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) and random hexamer. Next, using this cDNA as a template, primers specific to each cytokine gene (sequences are shown below), PCR reagent “SYBR GREEN PCR Master Mix” (Applied Biosystems) and PCR device “StepOne Real-Time PCR system” Quantitative PCR was performed using (Applied Biosystems). The quantification result was corrected by the expression level of the mouse GAPDH gene, and the gene expression level when the “ergothionein concentration was 0 mM and no TLR ligand” was 1, and expressed as an increase (multiplier). The result is shown in FIG.
《遺伝子特異的なプライマーの配列》
マウスＧＡＰＤＨ フォワード；5’-GCCTGGAGAAACCTGCCA-3’（配列番号１）
マウスＧＡＰＤＨ リバース；5’-CCCTCAGATGCCTGCTTCA-3’（配列番号２）
マウスＩＬ−１２ｐ３５フォワード；5’-ATGTGTCTCCCAAGGTCAGC-3’（配列番号３）
マウスＩＬ−１２ｐ３５リバース；5’-ATGACCCTGGCCAAACTGAG-3’（配列番号４）
マウスＩＬ−１２ｐ４０フォワード；5’-AATGTCTGCGTGCAAGCTCA-3’（配列番号５）
マウスＩＬ−１２ｐ４０リバース；5’-ATGCCCACTTGCTGCATGA-3’（配列番号６）
マウスＩＬ−２３ｐ１９フォワード；5’-TCTGCATGCTAGCCTGGAAC-3’（配列番号７）
マウスＩＬ−２３ｐ１９リバース；5’-TGGCTGTTGTCCTTGAGTCC-3’（配列番号８）
マウスＩＬ−６ フォワード；5’-GTTCTCTGGGAAATCGTGGA-3’（配列番号９）
マウスＩＬ−６ リバース；5’-TCCAGTTTGGTAGCATCCATC-3’（配列番号１０）
マウスＩＬ−１０ フォワード；5’-GGCGCTGTCATCGATTTCTC-3’（配列番号１１）
マウスＩＬ−１０ リバース；5’-TGCTCCACTGCCTTGCTCTTA-3’（配列番号１２）
マウスＩＬ−１β フォワード；5’-TGACGGACCCCAAAAGATGA-3’（配列番号１３）
マウスＩＬ−１β リバース；5’-TGCTGCTGCGAGATTTGAAG-3’（配列番号１４）
《Gene-specific primer sequence》
Mouse GAPDH forward; 5'-GCCTGGAGAAACCTGCCA-3 '(SEQ ID NO: 1)
Mouse GAPDH reverse; 5'-CCCTCAGATGCCTGCTTCA-3 '(SEQ ID NO: 2)
Mouse IL-12p35 forward; 5'-ATGTGTCTCCCAAGGTCAGC-3 '(SEQ ID NO: 3)
Mouse IL-12p35 reverse; 5'-ATGACCCTGGCCAAACTGAG-3 '(SEQ ID NO: 4)
Mouse IL-12p40 forward; 5'-AATGTCTGCGTGCAAGCTCA-3 '(SEQ ID NO: 5)
Mouse IL-12p40 reverse; 5'-ATGCCCACTTGCTGCATGA-3 '(SEQ ID NO: 6)
Mouse IL-23p19 forward; 5'-TCTGCATGCTAGCCTGGAAC-3 '(SEQ ID NO: 7)
Mouse IL-23p19 reverse; 5'-TGGCTGTTGTCCTTGAGTCC-3 '(SEQ ID NO: 8)
Mouse IL-6 forward; 5'-GTTCTCTGGGAAATCGTGGA-3 '(SEQ ID NO: 9)
Mouse IL-6 reverse; 5'-TCCAGTTTGGTAGCATCCATC-3 '(SEQ ID NO: 10)
Mouse IL-10 forward; 5'-GGCGCTGTCATCGATTTCTC-3 '(SEQ ID NO: 11)
Mouse IL-10 reverse; 5'-TGCTCCACTGCCTTGCTCTTA-3 '(SEQ ID NO: 12)
Mouse IL-1β forward; 5′-TGACGGACCCCAAAAGATGA-3 ′ (SEQ ID NO: 13)
Mouse IL-1β reverse; 5′-TGCTGCTGCGAGATTTGAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 14)
図３に示すように、ＴＬＲリガンド無しの場合は、エルゴチオネインの濃度が１０ｍＭにおいて、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０の遺伝子発現量の増加は認められなかった。すなわち、ＴＬＲを刺激しなかった場合は、エルゴチオネインを添加しても、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１０の遺伝子発現量は増加しなかった。 As shown in FIG. 3, in the case of no TLR ligand, no increase in gene expression levels of IL-6, IL-12p40, IL-1β and IL-10 was observed at an ergothioneine concentration of 10 mM. That is, when TLR was not stimulated, the gene expression levels of IL-6, IL-12p40, IL-1β and IL-10 did not increase even when ergothioneine was added.
その一方で、ＴＬＲリガンド無しの場合でも、エルゴチオネインの濃度が１０ｍＭにおいて、ＩＬ−１２ｐ３５およびＩＬ−２３ｐ１９の遺伝子発現量の増加が認められた。この結果から、エルゴチオネインは、単独で、マクロファージからのＩＬ−１２およびＩＬ−２３の遺伝子発現を促進することが明らかになった。 On the other hand, even in the absence of the TLR ligand, increases in the gene expression levels of IL-12p35 and IL-23p19 were observed at an ergothioneine concentration of 10 mM. From these results, it was revealed that ergothioneine alone promotes gene expression of IL-12 and IL-23 from macrophages.
また、ＴＬＲリガンドとしてＰａｍ２ＣＳＫ４、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ＬＰＳおよびガーディキモドを用いた場合は、エルゴチオネインの濃度が０および１０ｍＭのいずれにおいても、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ３５およびＩＬ−２３ｐ１９の遺伝子発現量の増加が認められた。そして、この場合は、エルゴチオネインの濃度が１０ｍＭの方が０ｍＭと比較してＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ３５およびＩＬ−２３ｐ１９の遺伝子発現の増加量が大きく、ＩＬ−１０の遺伝子発現の増加量が小さかった。 In addition, when Pam2CSK4, Pam3CSK4, LPS, and gardiquimod were used as TLR ligands, IL-6, IL-12p40, IL-1β, IL-10, IL-12p35 and An increase in the gene expression level of IL-23p19 was observed. In this case, the increase in gene expression of IL-6, IL-12p40, IL-1β, IL-12p35, and IL-23p19 is larger when the concentration of ergothionein is 10 mM than when 0 mM. The amount of increase in gene expression was small.
すなわち、エルゴチオネインは、各種のＴＬＲリガンドによるＴＬＲの刺激で誘導されるＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１βおよびＩＬ−２３の遺伝子発現を促進し、ＩＬ−１０の遺伝子発現を抑制することが示された。これらの結果から、エルゴチオネインは幅広いＴＬＲリガンドによるＴＬＲの刺激で誘導される免疫応答活性化サイトカインの産生を促進することが明らかになった。 That is, ergothioneine promotes IL-6, IL-12, IL-1β and IL-23 gene expression induced by TLR stimulation with various TLR ligands, and suppresses IL-10 gene expression. Indicated. From these results, it was revealed that ergothioneine promotes the production of immune response-activating cytokines induced by stimulation of TLRs with a wide range of TLR ligands.
＜実施例３＞Ｔｈ１７細胞分化に対する効果の検討
（１）Ｆ４／８０陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の調製
抗原提示細胞として、Ｆ４／８０陽性細胞を調製した。Ｆ４／８０陽性細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６〜１０週齢；日本クレア社）由来の脾臓細胞をビオチン結合Ｆ４／８０抗体（Biolegend社）で標識し、ストレプトアビジンマイクロビーズ（MiltenyBiotec社）を用いて単離することにより調製した。
<Example 3> Examination of effects on Th17 cell differentiation (1) Preparation of F4 / 80 positive cells and CD4 positive cells F4 / 80 positive cells were prepared as antigen-presenting cells. F4 / 80 positive cells were prepared by labeling spleen cells derived from C57BL / 6 mice (female, 6-10 weeks old; Claire Japan) with biotin-conjugated F4 / 80 antibody (Biolegend) and streptavidin microbeads (MiltenyBiotec). ) Was used for isolation.
また、ナイーブＴ細胞として、ＣＤ４陽性細胞を調製した。ＣＤ４陽性細胞は、トリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）に対するＴ細胞受容体を発現するＯＴ−ＩＩトランスジェニックマウス（北里大学の岩淵博士より供与）の脾臓から、ＣＤ４抗体結合マイクロビーズ（MiltenyBiotec社）を用いて単離した。 Moreover, CD4 positive cells were prepared as naive T cells. CD4 positive cells were obtained from the spleen of an OT-II transgenic mouse (provided by Dr. Iwatsuki, Kitasato University) expressing a T cell receptor for avian ovalbumin (OVA) using CD4 antibody-coupled microbeads (MiltenyBiotec). Isolated.
（２）抗酸化物質の事前投与
本実施例３（１）のＦ４／８０陽性細胞の培地に、エルゴチオネインまたはＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ；シグマ社）を添加して２４時間培養した。エルゴチオネインは３０ｍＭ、ＮＡＣは１０ｍＭとなるよう添加した。なお、ＮＡＣは抗酸化物質として知られているグルタチオンの前駆物質である。また、抗酸化物質を投与しない比較対照の試料として、エルゴチオネインおよびＮＡＣに代えて同量のＰＢＳを添加して同様に培養した。培地は、１０（ｖ／ｖ）％ＦＢＳ、１ｍＭの4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid（ＨＥＰＥＳ）、５５μＭの２−メルカプトエタノール、１００ｍＵ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
(2) Pre-administration of antioxidant substance Ergothioneine or N-acetyl-L-cysteine (NAC; Sigma) was added to the medium of F4 / 80 positive cells of Example 3 (1) and cultured for 24 hours. Ergothionein was added to 30 mM and NAC to 10 mM. NAC is a precursor of glutathione known as an antioxidant. In addition, as a comparative control sample to which no antioxidant was administered, the same amount of PBS was added instead of ergothionein and NAC, and the cells were cultured in the same manner. The medium contains 10 (v / v)% FBS, 1 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 55 μM 2-mercaptoethanol, 100 mU / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin. RPMI 1640 medium was used.
（３）ＣＤ４陽性細胞との共培養
文献（Yabu Mら、IL-23-dependent and -independent enhancement pathways of IL-17A production by lactic acid. Int Immunol. 2011;23: 29-41. doi:10.1093/intimm/dxq455）に記載の方法に従って、Ｆ４／８０陽性細胞とＣＤ４陽性細胞との共培養を行った。すなわち、本実施例３（２）のＦ４／８０陽性細胞と本実施例３（１）のＣＤ４陽性細胞とを同数（１×１０５個ずつ）混合し、抗原ペプチドおよびＴＬＲリガンドの存在下または非存在下で３．５日間共培養した。なお、「抗原ペプチドの存在下」とする場合は、トリ卵白アルブミンの３２３〜３３９番目のアミノ酸配列（ISQAVHAAHAEINEAGR；配列番号１５）からなるペプチド（ＯＶＡ３２３−３３９ペプチド；ＭＢＬライフサイエンス社）を、０．１μｇ／ｍＬとなるよう培地に添加した。「抗原ペプチドの非存在下」とする場合は、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに代えて同量のＰＢＳを添加した。また、「ＴＬＲリガンドの存在下」とする場合は、Ｐａｍ２ＣＳＫ４（CS Bio社）を５０ｎＭとなるよう培地に添加した。「ＴＬＲリガンドの非存在下」とする場合は、Ｐａｍ２ＣＳＫ４に代えて同量のＰＢＳを添加した。
(3) Co-culture with CD4-positive cells (Yabu M et al., IL-23-dependent and -independent enhancement pathways of IL-17A production by lactic acid. Int Immunol. 2011; 23: 29-41. Doi: 10.1093 / F4 / 80 positive cells and CD4 positive cells were co-cultured according to the method described in intimm / dxq455). That is, the same number (1 × 10 5 ) of the F4 / 80 positive cells of Example 3 (2) and the CD4 positive cells of Example 3 (1) were mixed, and in the presence of the antigen peptide and TLR ligand or Co-cultured for 3.5 days in the absence. In the case of “in the presence of an antigenic peptide”, a peptide (OVA 323-339 peptide; MBL Life Sciences) consisting of the amino acid sequence (ISQAVHAAHAEINEAGR; SEQ ID NO: 15) of avian ovalbumin is defined as 0 .1 μg / mL was added to the medium. In the case of “in the absence of the antigen peptide”, the same amount of PBS was added instead of the OVA 323-339 peptide. In addition, in the case of “in the presence of TLR ligand”, Pam2CSK4 (CS Bio) was added to the medium so as to be 50 nM. In the case of “in the absence of TLR ligand”, the same amount of PBS was added instead of Pam2CSK4.
（４）サイトカイン濃度の測定
本実施例３（３）の培養上清中のＩＬ−１７Ａの濃度を、CBA Mouse IL-17A Flex set（BD Bioscience社）を用いてＣＢＡを使用書に従って行うことにより測定した。その結果を図４に示す。
(4) Measurement of cytokine concentration By performing CBA using the CBA Mouse IL-17A Flex set (BD Bioscience) according to the instructions for use, the concentration of IL-17A in the culture supernatant of Example 3 (3) was determined. It was measured. The result is shown in FIG.
図４に示すように、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを添加しない場合は、培地におけるエルゴチオネインまたはＮＡＣの濃度が０、１０ｍＭまたは３０ｍＭのいずれの試料でも、ＩＬ−１７Ａが検出されなかった。すなわち、抗原ペプチドの非存在下では、エルゴチオネインまたはＮＡＣの有無に関わらず、ＩＬ−１７Ａが検出されなかった。 As shown in FIG. 4, when the OVA 323-339 peptide was not added, IL-17A was not detected in any sample in which the concentration of ergothioneine or NAC in the medium was 0, 10 mM, or 30 mM. That is, in the absence of the antigen peptide, IL-17A was not detected regardless of the presence or absence of ergothioneine or NAC.
その一方で、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを添加した場合は、培地におけるエルゴチオネインまたはＮＡＣの濃度が０ｍＭならびにエルゴチオネインの濃度が３０ｍＭの試料でＩＬ−１７Ａが検出され、ＮＡＣの濃度が１０ｍＭの試料ではＩＬ−１７Ａがほとんど検出されなかった。そして、エルゴチオネインを添加したものと添加しないものとを比較すると、エルゴチオネインを添加した方が、ＩＬ−１７Ａの濃度が大きかった。これに対して、ＮＡＣを添加したものと添加しないものとを比較すると、ＮＡＣを添加した方がＩＬ−１７Ａの濃度が小さかった。また、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを添加し、かつエルゴチオネインを事前投与した場合において、Ｐａｍ２ＣＳＫ４を添加したものと添加しないものとを比較すると、Ｐａｍ２ＣＳＫ４を添加した方がＩＬ−１７Ａの濃度が大きかった。 On the other hand, when the OVA 323-339 peptide was added, IL-17A was detected in a sample with an ergothioneine or NAC concentration of 0 mM and an ergothionein concentration of 30 mM in the medium, and IL-A was detected with a sample with a NAC concentration of 10 mM. Almost no 17A was detected. When comparing ergothioneine with and without ergothioneine, the concentration of IL-17A was greater when ergothioneine was added. In contrast, when NAC was added and not added, the concentration of IL-17A was lower when NAC was added. In addition, when OVA 323-339 peptide was added and ergothioneine was pre-administered, the concentration of IL-17A was higher when Pam2CSK4 was added than when Pam2CSK4 was added.
すなわち、ＮＡＣはＯＶＡ３２３−３３９ペプチドにより誘導されるＴｈ１７細胞の分化を抑制するのに対して、エルゴチオネインはＯＶＡ３２３−３３９ペプチドにより誘導されるＴｈ１７細胞の分化を促進することが示された。また、エルゴチオネインによるＴｈ１７細胞の分化促進効果は、ＴＬＲリガンドが存在する場合に、より大きくなることが示された。これらの結果から、エルゴチオネインは抗原ペプチドにより誘導されるＴｈ１７細胞の分化を促進することが明らかになった。 That is, NAC suppressed Th17 cell differentiation induced by OVA 323-339 peptide, whereas ergothionein promoted Th17 cell differentiation induced by OVA 323-339 peptide. In addition, it was shown that the effect of promoting differentiation of Th17 cells by ergothioneine is greater when a TLR ligand is present. These results revealed that ergothioneine promotes Th17 cell differentiation induced by antigenic peptides.
＜実施例４＞生体（ｉｎ ｖｉｖｏ）における検討
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６〜１０週齢；日本クレア社）に、１５ｍｇのエルゴチオネインまたは同量のＰＢＳを、カニュラを用いて経口摂取させた。２４時間後、１０ｎｍｏｌのＰａｍ２ＣＳＫ４（CS Bio社）を腹腔内注射することによりＴＬＲを刺激した。続いて、０、１、３、５、７、９および２４時間後に尾静脈より血液を採取して、血清を回収した。血清の回収方法は、まず、血液を３７℃で６０分間インキュベートして凝固させた後、４℃で６０分間静置した。次に、２４００×ｇで３分間遠心分離を行って上清を回収し、これをさらに６２００×ｇで３分間遠心分離に供して上清を回収し、これを血清とした。血清に含まれるＩＬ−６の濃度を、実施例１（４）に記載の方法により測定した。測定値について、各条件における３個体の平均値および標準偏差を求めた。その結果を図５に示す。
<Example 4> Examination in vivo (in vivo) C57BL / 6 mice (female, 6 to 10 weeks old; Claire Japan) were orally ingested with 15 mg of ergothioneine or the same amount of PBS using a cannula. 24 hours later, TLR was stimulated by intraperitoneal injection of 10 nmol of Pam2CSK4 (CS Bio). Subsequently, blood was collected from the tail vein after 0, 1, 3, 5, 7, 9, and 24 hours, and serum was collected. The serum was collected by first incubating the blood at 37 ° C. for 60 minutes to clot, and then allowing the blood to stand at 4 ° C. for 60 minutes. Next, centrifugation was performed at 2400 × g for 3 minutes to recover the supernatant, and this was further centrifuged at 6200 × g for 3 minutes to recover the supernatant, which was used as serum. The concentration of IL-6 contained in the serum was measured by the method described in Example 1 (4). About the measured value, the average value and standard deviation of three individuals in each condition were calculated. The result is shown in FIG.
図５に示すように、エルゴチオネインを摂取させたものとＰＢＳを摂取させたものとを比較すると、エルゴチオネインを摂取させたものの方が、３時間後、５時間後および７時間後のＩＬ−６濃度が大きかった。すなわち、エルゴチオネインは、ＴＬＲの刺激により誘導されるＩＬ−６の産生を促進することが示された。この結果から、エルゴチオネインはＴＬＲの刺激により誘導される免疫応答活性化サイトカインの産生を促進することが明らかになった。 As shown in FIG. 5, when ergothioneine was ingested with PBS, ergothioneine was ingested after 3 hours, 5 hours, and 7 hours. Was big. That is, it was shown that ergothioneine promotes IL-6 production induced by TLR stimulation. From this result, it was revealed that ergothioneine promotes the production of immune response activation cytokine induced by stimulation of TLR.
Claims (11)
（ａ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインを摂取させる工程、
（ｂ）前記ヒトまたは動物において、Ｔｏｌｌ様受容体の刺激により免疫応答活性化サイトカインを産生させる工程、
（ｃ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインにより免疫応答活性化サイトカインの産生を促進する工程。 A method (excluding medical practice) that promotes production of immune response-activating cytokine, comprising the following steps (a) to (c);
(A) ingesting ergothioneine into a human or animal;
(B) producing an immune response-activating cytokine by stimulation of a Toll-like receptor in the human or animal,
(C) A step of promoting the production of immune response-activating cytokine by ingested ergothioneine in the human or animal.
（ｄ）ヒトまたは動物にエルゴチオネインを摂取させる工程、
（ｅ）前記ヒトまたは動物において、抗原ペプチドの刺激によりＴｈ１７細胞を分化させる工程および
（ｆ）前記ヒトまたは動物において、摂取させたエルゴチオネインによりＴｈ１７細胞の分化を促進する工程。 A method for promoting Th17 cell differentiation (excluding medical practice), comprising the following steps (d) to (f):
(D) ingesting ergothioneine into a human or animal;
(E) a step of differentiating Th17 cells by stimulation with an antigen peptide in the human or animal; and (f) a step of promoting differentiation of Th17 cells by ingested ergothioneine in the human or animal.
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