JP2006124383A - Dendritic cell activator - Google Patents
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Description
本出願は、メシマコブ抽出物を含む樹状細胞活性化剤、特に樹状細胞成熟化促進剤に関する。さらに本発明は、当該樹状細胞活性化剤を含む経口摂取用組成物、医薬組成物、食品組成物等に関する。 The present application relates to a dendritic cell activator comprising a Meshimakobu extract, particularly a dendritic cell maturation promoter. Furthermore, this invention relates to the composition for oral intake, the pharmaceutical composition, the food composition, etc. containing the said dendritic cell activator.
樹状細胞は樹枝状の突起を持つという形態的な特徴を有する免疫細胞の一種であり、様々な組織（例えば、皮膚や粘膜など）に分布し、免疫監視細胞としての役割を果たしている。特に、樹状細胞は、体内に進入した抗原をリンパ組織に運び、Ｔ細胞を刺激して免疫反応を惹起させる機能を有し、リンパ球とともに免疫反応の中心的役割を担う細胞である。 Dendritic cells are a type of immune cell having a morphological characteristic of having dendritic processes, and are distributed in various tissues (for example, skin and mucous membranes) and play a role as immune surveillance cells. In particular, dendritic cells are cells that have the function of carrying antigens that have entered the body to lymphoid tissues and stimulating T cells to elicit immune responses, and play a central role in immune responses together with lymphocytes.
様々な生体内組織に分布する樹状細胞のうち、末梢組織に存在する樹状細胞はＴ細胞活性化能が低いことから、未成熟樹状細胞と呼ばれる。これに対して、リンパ器官に存在する樹状細胞は強力なＴ細胞活性化能を有することから成熟樹状細胞と呼ばれる。このような機能の差は、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）分子に加えて、細胞接着分子および共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０およびＣＤ８６など）の発現量の増加ならびにサイトカインやケモカインなどの生産能の変化に起因する。また、成熟に伴って、樹状細胞は、細胞骨格の再構成により固着性の強い構造から運動性の高い構造となり、リンパ節への移動を開始する。所属リンパ器官のＴ領域において、樹状細胞はケモカインの産生などによりＴ細胞の活性化を促進する（非特許文献１：細胞工学、第１９巻、第９号、２０００年、第１３１１−１３１７頁）。 Among dendritic cells distributed in various in vivo tissues, dendritic cells present in peripheral tissues are called immature dendritic cells because of their low ability to activate T cells. In contrast, dendritic cells present in lymphoid organs are called mature dendritic cells because they have a strong ability to activate T cells. Such functional differences are due to increased expression levels of cell adhesion and costimulatory molecules (eg, CD40, CD54, CD58, CD80, and CD86) and cytokines in addition to MHC (major histocompatibility complex) molecules. This is due to changes in the production capacity of chemokines and chemokines. In addition, with maturation, dendritic cells change from a strongly adherent structure to a highly motile structure due to reorganization of the cytoskeleton, and begin to migrate to lymph nodes. In the T region of the regional lymphoid organ, dendritic cells promote the activation of T cells by producing chemokines (Non-patent Document 1: Cell Engineering, Vol. 19, No. 9, 2000, 1311-1317). ).
生体内において、樹状細胞の成熟は、感染細菌やウイルス由来のＬＰＳ（リポ多糖）、ＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡ、あるいは炎症応答の誘導によって組織細胞から産生されるＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）およびＩＬ−１（インターロイキン−１）、さらに活性化血小板、好塩基球、肥満細胞などに発現されるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）により誘導されることが知られている（非特許文献２：Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９２巻、１９９８年、第２４５−２５２頁）。 In vivo, dendritic cell maturation is caused by LPS (lipopolysaccharide), DNA, double-stranded RNA, or TNFα (tumor necrosis factor α) produced from tissue cells by induction of an inflammatory response and It is known to be induced by IL-1 (interleukin-1) and CD40 ligand (CD40L) expressed in activated platelets, basophils, mast cells and the like (Non-patent Document 2: Banchereau J. et al. Et al., Nature, 392, 1998, 245-252).
また、インビトロ系の実験において、樹状細胞活性化作用を有する物質を探索する試みも行われている。例えば、カワラタケ菌糸体抽出物に由来するクレスチン（以下、「ＰＳＫ」とも称す）およびＡ群溶血性連鎖球菌の弱毒性自然変異株（Ｓｕ株）をペニシリンで処理した製剤であるＯＫ−４３２が樹状細胞の成熟を促進する効果を有すること、および椎茸由来のβ−グルカンを活性成分として含み抗癌剤として市販されているレンチナンが樹状細胞に対して何らの効果も有さないことが報告されている（非特許文献３：Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、第１５巻、第３号、２００１年、第３８５−３８８頁；非特許文献４：Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、第５２巻、２００３年、第２０７−２１４頁）。また、ある種のグラム陽性菌の細胞壁骨格により樹状細胞の成熟化が促進されることが報告されている（特許文献１：国際特許公報０１／０４８１５４パンフレット）。さらに、化学合成により得られる特定の低分子化合物が樹状細胞活性化作用を有することについても報告されている（特許文献２：特開２００４−２１０７６８号公報）。 Attempts have also been made to search for substances having a dendritic cell activation effect in in vitro experiments. For example, OK-432, which is a preparation obtained by treating Krestin (hereinafter also referred to as “PSK”) derived from Kawaratake mycelium extract and a weakly toxic natural mutant (Group Su) of group A hemolytic streptococci with penicillin. Have been reported to have an effect of promoting maturation of dendritic cells, and that lentinan marketed as an anticancer agent containing β-glucan derived from shiitake mushroom as an active ingredient has no effect on dendritic cells. (Non-Patent Document 3: Biotherapy, Vol. 15, No. 3, 2001, 385-388; Non-Patent Document 4: Cancer Immunology and Immunotherapy, Vol. 52, 2003, 207-214). Moreover, it has been reported that the maturation of dendritic cells is promoted by the cell wall skeleton of certain gram-positive bacteria (Patent Document 1: International Patent Publication No. 01/048154 pamphlet). Furthermore, it has also been reported that specific low molecular weight compounds obtained by chemical synthesis have a dendritic cell activation action (Patent Document 2: JP-A-2004-210768).
メシマコブは桑などの広葉樹の古木の幹に寄生するタバコウロコタケ科キコブタケ属のコブ状のキノコである。中国では古くから「桑黄」と呼ばれる煎じ薬の漢方薬として利用されている。近年の研究によりメシマコブに含まれる成分の種々の生理活性についての報告がなされている（例えば、非特許文献７：日本農芸化学会大会講演要旨集、ＶＯＬ２００４、２００４年、第１９７頁；非特許文献８：日本農芸化学会大会講演要旨集、ＶＯＬ２００４、２００４年、第２８１頁；非特許文献９：Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、第３０９巻、第２号、２００３年、第３９９頁−４０７頁など）。しかし、メシマコブの樹状細胞に対しての効果については、これまでに何らの報告もされていなかった。 Meshimakobu is a mushroom-like mushroom belonging to the genus Mushroom of the Tobacco family that grows on the trunks of old broad-leaved trees such as mulberry. In China, it has long been used as a traditional Chinese decoction called “Kuwa Huang”. In recent years, various physiological activities of components contained in Meshimakobu have been reported (for example, Non-Patent Document 7: Annual Meeting of the Agricultural Chemical Society of Japan, VOL 2004, 2004, p. 197; Non-patent Document) 8: Abstracts of Annual Meeting of the Japanese Society for Agricultural Chemistry, VOL 2004, 2004, 281; Non-Patent Document 9: Biochem Biophys Res Commun, Vol. 309, No. 2, 2003, pp. 399-407, etc.). However, there has been no report on the effect of mesimacob on dendritic cells.
また、樹状細胞の有する強力な抗原提示能を臨床に応用することを目的として、樹状細胞を用いた抗癌療法および抗感染症療法についての研究が進められている（非特許文献５：日経サイエンス、２００３年２月号、第８４−９１頁；非特許文献６：現代医療、２００３年８月号、第８６−９２頁）。このような療法においては、何らかの手段により樹状細胞を活性化することが必要であり、特に、安全で効率のよい樹状細胞活性化剤が求められている。 In addition, research on anti-cancer therapy and anti-infection therapy using dendritic cells has been promoted for the purpose of applying the powerful antigen-presenting ability of dendritic cells to the clinic (Non-patent Document 5: Nikkei Science, February 2003, pp. 84-91; Non-Patent Document 6: Contemporary Medicine, August 2003, pp. 86-92). In such therapy, it is necessary to activate dendritic cells by some means, and in particular, a safe and efficient dendritic cell activator is required.
本発明者は、上記の課題解決のために鋭意研究を進めたところ、メシマコブに樹状細胞活性化作用を有することを発見して本発明を完成させた。
本発明の目的は、メシマコブを含む樹状細胞活性化剤、免疫賦活剤、経口摂取用組成物、医薬組成物、食品組成物、食品および飲料を提供することである。
The present inventor has conducted extensive research to solve the above problems, and has found that mesimacob has a dendritic cell activation action, thereby completing the present invention.
An object of the present invention is to provide a dendritic cell activator, an immunostimulant, a composition for oral intake, a pharmaceutical composition, a food composition, a food and a beverage containing mesimacob.
すなわち本発明の一つの側面によれば、メシマコブを含む樹状細胞活性化剤が提供される。ここで、「樹状細胞の活性化」という用語は、樹状細胞が有する何らかの機能が強化され、または樹状細胞において発現するタンパク質などの分子の量が増幅されることを意味し、当該用語の意図するところには、例えば、樹状細胞の成熟化促進、抗原取り込み能増強、抗原提示能増強、Ｔリンパ球刺激能増強などが含まれる。当該活性化に伴って樹状細胞に観察される現象としては、接着分子／共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６など）の発現量の増加、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１２、インターフェロンγおよびインターロイキン−１など）の生産能の増強、ＭＨＣ分子の発現量の増加などが挙げられる。 That is, according to one aspect of the present invention, a dendritic cell activator containing mesimacob is provided. Here, the term “activation of dendritic cells” means that some function of dendritic cells is enhanced or the amount of a molecule such as a protein expressed in dendritic cells is amplified. Examples of the intention include, for example, promotion of maturation of dendritic cells, enhancement of antigen uptake ability, enhancement of antigen presentation ability, enhancement of T lymphocyte stimulation ability, and the like. The phenomenon observed in the dendritic cells with the activation includes an increase in the expression level of an adhesion molecule / costimulatory molecule (for example, CD40, CD54, CD58, CD80, CD86, etc.), cytokine (for example, interleukin- 12, interferon γ, interleukin-1, etc.), and the like.
本発明の別の側面によれば、上記の樹状細胞活性化剤を含む医薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、特に限定はされないが、例えば、免疫賦活化、癌もしくは悪性腫瘍の治療もしくは予防、または感染症の治療または予防のために用いられうる。ここで、癌および悪性腫瘍としては、特に限定はされないが、例えば、大腸癌および胃癌などの消化器癌、骨髄腫、肝臓癌、白血病、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肺癌、口腔癌、脳腫瘍などが挙げられる。また、特に限定はされないが、感染症にはウイルス感染症などが含まれ、例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルスによる慢性肝炎、ＨＩＶ、インフルエンザなどが挙げられる。 According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising the above dendritic cell activator. The pharmaceutical composition is not particularly limited, and can be used, for example, for immunostimulation, treatment or prevention of cancer or malignant tumor, or treatment or prevention of infectious diseases. Here, the cancer and malignant tumor are not particularly limited. For example, digestive organ cancer such as colon cancer and gastric cancer, myeloma, liver cancer, leukemia, melanoma, prostate cancer, breast cancer, uterine cancer, lung cancer, oral cancer And brain tumors. In addition, although not particularly limited, infectious diseases include viral infectious diseases, and examples thereof include chronic hepatitis due to hepatitis B and hepatitis C viruses, HIV, influenza, and the like.
本発明に用いられるメシマコブ（Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ Ｌｉｎｔｅｕｓ Ａｏｓｈｉｍａ）は、子実体、菌糸体またはそれらの混合物であってよい。メシマコブは粉体として使用することもできるが、好ましくは抽出物として使用され、特に好ましくは、子実体の抽出物が使用される。メシマコブは培養により生産されたものであっても天然より採取されたものであってもよい。本発明においては、例えば、メシマコブ菌を固体培地で培養して得られる菌糸体を用いることができる。 Meshimakobu (Phellinus Linteus Aoshima) used in the present invention may be a fruiting body, a mycelium, or a mixture thereof. Although Meshimakobu can be used as a powder, it is preferably used as an extract, and particularly preferably an extract of fruiting bodies is used. Meshimakobu may be produced by culture or collected from nature. In the present invention, for example, a mycelium obtained by culturing Meshimakobu fungus in a solid medium can be used.
本発明において用いられるメシマコブは、粉体などに加工して使用してもよい。また本発明においては、当該技術分野において公知の方法により得られるメシマコブの抽出物を用いてもよい。メシマコブの抽出物の調製に用いられる溶媒としては、例えば、水、エタノール、メタノール、ブタノール、イソプロパノールなど、好ましくは水を使用することができる。抽出は溶媒の加熱下（例えば、８５〜１０５℃程度）で行うこともできるが、より低温（例えば、２５〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃）で超音波を照射することにより行うこともできる。 Meshimakobu used in the present invention may be processed into a powder or the like. In the present invention, an extract of Meshimakobu obtained by a method known in the art may be used. As the solvent used for the preparation of the extract of Meshimakobu, for example, water, ethanol, methanol, butanol, isopropanol, etc., preferably water can be used. Extraction can be performed under heating of a solvent (for example, about 85 to 105 ° C.), but can also be performed by irradiating ultrasonic waves at a lower temperature (for example, 25 to 50 ° C., preferably 30 to 45 ° C.). it can.
本発明においてメシマコブ抽出物を用いる場合、当該抽出物は、抽出物から得られる分画物であってもよい。分画方法は本発明の属する技術分野において通常用いられる方法であってよく、分画方法の例には、任意の溶媒を用いての抽出による分画、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムを用いた分画、およびシリカゲルカラムクロマトグラフィーなどが含まれる。分画方法は１種類の方法であってもよく、または複数の手段の組み合わせであってもよい。上記の分画方法で用いる溶媒としては、特に限定はされないが、例えば、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、酢酸、アセトン、およびそれらの混合物を用いることができる。 In the present invention, when the Messimacob extract is used, the extract may be a fraction obtained from the extract. The fractionation method may be a method usually used in the technical field to which the present invention belongs, and examples of the fractionation method include fractionation by extraction using an arbitrary solvent, gel filtration column chromatography, and ion exchange column. Fractions used, silica gel column chromatography and the like are included. The fractionation method may be one type of method or a combination of a plurality of means. Although it does not specifically limit as a solvent used by said fractionation method, For example, water, methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, acetic acid, acetone, and mixtures thereof can be used.
本発明の用いる抽出物および分画物は、必要に応じて濃縮および／または凍結乾燥などを行うことにより得られる濃縮液、粘稠物質または固体を可溶性画分として使用することができる。 As the extract and fraction used in the present invention, a concentrated solution, a viscous substance or a solid obtained by concentration and / or lyophilization, etc. can be used as a soluble fraction, if necessary.
本発明の１つの態様において、メシマコブ子実体抽出物は水抽出物であり、当該抽出は例えば２５〜１０５℃、好ましくは２５〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃にて行うことができる。当該抽出は、超音波照射下で行ってもよく、抽出時間は特に限定はされないが、例えば０．１〜２時間、より好ましくは０．５〜１時間である。 In one embodiment of the present invention, the fruit body extract is a water extract, and the extraction can be performed at 25 to 105 ° C, preferably 25 to 50 ° C, more preferably 30 to 45 ° C, for example. The extraction may be performed under ultrasonic irradiation, and the extraction time is not particularly limited, but is, for example, 0.1 to 2 hours, and more preferably 0.5 to 1 hour.
本発明の別の態様において、メシマコブ子実体抽出物は、以下の工程：
１）メシマコブ子実体から水抽出物を得る工程；および
２）当該水抽出物から、さらにＣ１−３アルカノール水溶液を用いて抽出物を得る工程
を含む製造方法により調製することができる。ここで、Ｃ１−３アルカノールには、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールが含まれ、好ましいＣ１−３アルカノールはエタノールである。Ｃ１−３アルカノール水溶液におけるＣ１−３アルカノールの濃度は、例えば５０〜９０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは７０〜８５％（ｖ／ｖ）である。
In another embodiment of the present invention, the fruit body extract is the following steps:
1) A step of obtaining a water extract from the fruit body of Mesima Kobu; and 2) A preparation method comprising a step of obtaining an extract from the water extract using an aqueous C 1-3 alkanol solution. Here, the C 1-3 alkanol includes methanol, ethanol, n-propanol, and isopropanol, and the preferred C 1-3 alkanol is ethanol. The concentration of C 1-3 alkanol in the C 1-3 alkanol aqueous solution is, for example, 50 to 90% (v / v), more preferably 70 to 85% (v / v).
工程１）の水抽出は、例えば２５〜１０５℃、２５〜５０℃、より好ましくは３０〜４５℃で行うことができる。また工程２）におけるＣ１−３アルカノールによる抽出は、例えば４〜５０℃、好ましくは１５〜２５℃で行うことができる。 The water extraction in step 1) can be performed at, for example, 25 to 105 ° C, 25 to 50 ° C, more preferably 30 to 45 ° C. The extraction with C 1-3 alkanol in step 2) can be performed at, for example, 4 to 50 ° C., preferably 15 to 25 ° C.
本明細書で用いられる用語「樹状細胞活性化剤」とは、一般的には、樹状細胞に作用することにより、樹状細胞が有する機能を強化する、または樹状細胞上または細胞内に発現する物質の量を増幅する作用を有する薬剤を意味し、樹状細胞活性化剤により、例えば、樹状細胞の成熟化促進作用、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１２、インターフェロンγまたはインターロイキン−１など）の産生能が高められるなどの効果を得ることができる。 As used herein, the term “dendritic cell activator” generally enhances the function of a dendritic cell by acting on the dendritic cell or on or inside the dendritic cell. Means a drug having an action of amplifying the amount of a substance expressed in a dendritic cell activator, for example, a maturation promoting action of a dendritic cell, cytokine (eg, interleukin-12, interferon γ or interleukin) -1 etc.) can be produced.
本発明の樹状細胞活性化剤は、医薬組成物の有効成分として使用することができる。当該医薬組成物は、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができ、非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤とすることができるが、これらには限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。 The dendritic cell activator of the present invention can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition can be used in various dosage forms such as tablets, capsules, powders, granules, pills, solutions, emulsions, suspensions, solutions, spirits, syrups, for oral administration. Extracts and elixirs can be used, and parenterals include, for example, injections such as subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, and intraperitoneal injections. Is not limited. These preparations can be produced by known methods usually used in the preparation process.
当該医薬組成物は、一般に用いられる各種成分を含みうるものであり、例えば、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤等を含みうる。また本発明の医薬組成物は、持続性または徐放性剤形であってもよい。 The pharmaceutical composition may contain various commonly used components, such as one or more pharmaceutically acceptable excipients, disintegrants, diluents, lubricants, flavoring agents, Coloring agents, sweetening agents, flavoring agents, suspending agents, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, adjuvants, preservatives, buffering agents, binders, stabilizers, coating agents and the like can be included. The pharmaceutical composition of the present invention may be in a sustained or sustained release dosage form.
本発明の医薬組成物の投与量は、投与経路、患者の体型、年齢、体調、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができ、本発明の医薬組成物は、治療有効量および／または予防有効量の樹状細胞活性化剤を含むことができる。メシマコブは元来漢方薬として使用されてきたものであり、比較的安全な物質であるので、必要に応じて高濃度で投与することも可能である。本発明においてメシマコブは、一般に１００〜５０００ｍｇ／日／成人、好ましくは３００〜１０００ｍｇ／日／成人の用量で使用されうる。当該医薬組成物の投与は、単回投与または複数回投与であってもよく、例えば他の樹状細胞活性化剤、免疫賦活剤、抗癌剤、抗腫瘍剤、好感染症剤などの他の薬剤と組み合わせて使用することもできる。 The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately selected depending on the administration route, the patient's body shape, age, physical condition, degree of disease, elapsed time after onset, etc. An effective amount and / or a prophylactically effective amount of a dendritic cell activator can be included. Meshimakobu has been used as a traditional Chinese medicine and is a relatively safe substance, so that it can be administered at a high concentration as required. In the present invention, mesimacob may be used at a dose of generally 100 to 5000 mg / day / adult, preferably 300 to 1000 mg / day / adult. The pharmaceutical composition may be administered in a single dose or multiple doses. For example, other drugs such as other dendritic cell activators, immunostimulators, anticancer agents, antitumor agents, anti-infective agents, etc. Can also be used in combination.
本発明のさらに別の側面によれば、上記の樹状細胞活性化剤により、未成熟樹状細胞を処理することにより成熟樹状細胞を誘導する方法が提供される。ここで、未成熟樹状細胞は、特に限定はされないが、例えば単球細胞をサイトカイン（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（以下、「ＧＭ−ＣＦＳ」とも称す）およびインターロイキン−４（以下、「ＩＬ−４」とも称す））を含む培地で培養することにより調製することができる。ここで、単球細胞は特に限定はされないが、例えば血中単球細胞を使用することができ、好ましくはヒト血中単球細胞である。 According to still another aspect of the present invention, a method for inducing mature dendritic cells by treating immature dendritic cells with the above dendritic cell activator is provided. Here, immature dendritic cells are not particularly limited. For example, monocyte cells can be cytokines (for example, granulocyte / macrophage colony-stimulating factor (hereinafter also referred to as “GM-CFS”) and interleukin-4 (hereinafter, referred to as “monocyte”). , Also referred to as “IL-4”))). Here, the monocyte cell is not particularly limited. For example, a blood monocyte cell can be used, and a human blood monocyte cell is preferable.
未成熟樹状細胞の成熟樹状細胞への変化は、当該技術分野において当業者に知られた方法により確認することができるが、例えば、樹状細胞に共通の共刺激因子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）の発現量の増加や、成熟樹状細胞に特異的なタンパク質（例えば、ＣＤ８３など）の発現量の増加を観測することにより判断されうる。これらのタンパク質の発現量は、例えばフローメトリー法などにより観測することができる。 The change of immature dendritic cells into mature dendritic cells can be confirmed by methods known to those skilled in the art, for example, costimulatory factors common to dendritic cells (eg, CD40, This can be determined by observing an increase in the expression level of CD80, CD86) or an increase in the expression level of a protein specific to mature dendritic cells (eg, CD83). The expression levels of these proteins can be observed by, for example, a flowmetry method.
樹状細胞を活性化させる際に使用する本発明の樹状細胞活性化剤は、例えば、１日に１０〜１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００〜５００μｇ／ｍＬの量で培養液中に添加することができる。また、例えば１〜５日、好ましくは２〜３日の期間培養することにより樹状細胞の活性化を誘導することができる。 The dendritic cell activator of the present invention used for activating dendritic cells is added to the culture solution in an amount of, for example, 10 to 1000 μg / mL, preferably 100 to 500 μg / mL per day. Can do. Further, for example, the activation of dendritic cells can be induced by culturing for a period of 1 to 5 days, preferably 2 to 3 days.
本発明の方法は、得られる成熟樹状細胞に特定の抗原を提示させるために、樹状細胞と抗原性物質を混合する工程をさらに含んでいてもよい。ここで、抗原性物質は特には限定されないが、腫瘍由来ペプチドまたはウイルス由来ペプチドなどを使用することができ、例えば、ＣＥＡ由来ペプチド、ＭＡＧＥ由来ペプチドなどを使用することができる。樹状細胞と抗原性物質との混合は、樹状細胞の活性化の前後、または樹状細胞の活性化と同時であってもよいが、好ましくは樹状細胞の活性化と同時に行われる。 The method of the present invention may further comprise a step of mixing the dendritic cell and the antigenic substance in order to present the specific antigen to the resulting mature dendritic cell. Here, the antigenic substance is not particularly limited, and a tumor-derived peptide or a virus-derived peptide can be used. For example, a CEA-derived peptide, a MAGE-derived peptide, or the like can be used. The mixing of the dendritic cell and the antigenic substance may be performed before or after the activation of the dendritic cell, or simultaneously with the activation of the dendritic cell, but is preferably performed simultaneously with the activation of the dendritic cell.
本発明のさらに別の側面によれば、樹状細胞活性化剤により未成熟樹状細胞を処理することにより得られる成熟樹状細胞、および当該成熟樹状細胞を含む医薬組成物が提供される。ここで、当該医薬組成物は、特に限定はされないが、癌、悪性腫瘍または感染症を予防または治療するために使用することができ、例えば、大腸癌および胃癌などの消化器癌、骨髄腫、肝臓癌、白血病、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肺癌、口腔癌、脳腫瘍などの癌もしくは悪性腫瘍；またはＢ型またはＣ型肝炎ウイルスによる慢性肝炎、ＨＩＶ、インフルエンザなどの感染症に適用することができる。 According to still another aspect of the present invention, there are provided mature dendritic cells obtained by treating immature dendritic cells with a dendritic cell activator, and pharmaceutical compositions containing the mature dendritic cells. . Here, the pharmaceutical composition is not particularly limited, but can be used to prevent or treat cancer, malignant tumor or infection, for example, digestive organ cancer such as colon cancer and gastric cancer, myeloma, Applicable to liver cancer, leukemia, melanoma, prostate cancer, breast cancer, uterine cancer, lung cancer, oral cancer, brain cancer and other malignant tumors; or chronic hepatitis due to hepatitis B or C virus, HIV, influenza, etc. be able to.
本発明のさらなる側面によれば、上記の樹状細胞活性化剤を含む、免疫療法において使用する補助活性化物質が提供される。ここで、補助活性化物質とは、免疫療法の際に樹状細胞の活性化を誘導するために樹状細胞とともに生体内に投与する物質であり、医薬組成物の１成分として含まれていてもよい。ここで、免疫療法が対象とする疾患は特に限定はされないが、例えば、大腸癌および胃癌などの消化器癌、骨髄腫、肝臓癌、白血病、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肺癌、口腔癌、脳腫瘍などの癌もしくは悪性腫瘍；またはＢ型またはＣ型肝炎ウイルスによる慢性肝炎、ＨＩＶ、インフルエンザなどの感染症に適用することができる。 According to a further aspect of the present invention, there is provided an auxiliary activator for use in immunotherapy comprising the above dendritic cell activator. Here, the auxiliary activator is a substance that is administered in vivo together with dendritic cells to induce dendritic cell activation during immunotherapy, and is included as one component of the pharmaceutical composition. Also good. Here, the disease targeted by immunotherapy is not particularly limited, but for example, digestive organ cancer such as colon cancer and stomach cancer, myeloma, liver cancer, leukemia, melanoma, prostate cancer, breast cancer, uterine cancer, lung cancer, oral cavity It can be applied to cancers or malignant tumors such as cancer and brain tumor; or chronic hepatitis due to hepatitis B or C virus, HIV, influenza, and other infections.
本発明のさらに別の側面によれば、上記の樹状細胞活性化剤を含む食品組成物が提供される。本発明の食品組成物は、機能性飲料などの液体飲料を含む。当該食品組成物は、機能性食品として使用できるほか、医薬部外品、飲食物などの成分、食品添加物などとして使用することができる。また本明細書における食品組成物は、そのまま機能性食品として使用できるほか、飲食物、医薬品、医薬部外品、飲食物等の成分、食品添加物などとして使用することができる。当該使用により、樹状細胞活性化効果および免疫賦活化効果を有する飲食物、食品組成物または経口摂取用組成物の日常的および継続的な摂取が可能となり、効果的な樹状細胞活性化効果および免疫賦活化効果による体質改善、癌、悪性腫瘍および感染症などの疾患の治療および発症の予防が可能となる。本発明の樹状細胞活性化剤または免疫賦活化剤を含む食品組成物、食品または飲料の例としては、樹状細胞活性化効果もしくは免疫賦活化効果を有する機能性食品、健康食品、一般食品（ジュース、菓子、加工食品等）、栄養補助食品（栄養ドリンク等）などが含まれる。本明細書における食品または飲料は、限定はされないが、鉄およびカルシウムなどの無機成分、種々のビタミン類、オリゴ糖およびキトサンなどの食物繊維、大豆抽出物などのタンパク質、レシチンなどの脂質、ショ糖および乳糖などの糖類、椎茸などの植物抽出物などを含むことができる。 According to still another aspect of the present invention, a food composition comprising the above dendritic cell activator is provided. The food composition of the present invention includes a liquid beverage such as a functional beverage. In addition to being used as a functional food, the food composition can be used as a quasi-drug, a component such as food and drink, a food additive, and the like. In addition, the food composition in the present specification can be used as a functional food as it is, and can also be used as a component of food and drink, pharmaceuticals, quasi drugs, food and drink, food additives, and the like. The use enables daily and continuous ingestion of food and drink, food composition or composition for oral intake having dendritic cell activation effect and immunostimulatory effect, and effective dendritic cell activation effect It is possible to improve the constitution by immunostimulatory effect, treat diseases such as cancer, malignant tumors and infectious diseases and prevent their onset. Examples of food compositions, foods or beverages containing the dendritic cell activator or immunostimulatory agent of the present invention include functional foods, health foods, general foods having dendritic cell activation effect or immunostimulatory effect (Juices, confectionery, processed foods, etc.), nutritional supplements (nutrient drinks, etc.) are included. The food or beverage in the present specification includes, but is not limited to, inorganic components such as iron and calcium, various vitamins, dietary fibers such as oligosaccharides and chitosan, proteins such as soybean extract, lipids such as lecithin, sucrose And saccharides such as lactose, plant extracts such as shiitake mushrooms, and the like.
以下の実施例で示すように、本発明の樹状細胞活性化剤は、未成熟樹状細胞の成熟化を促進する作用および当該作用に起因する免疫賦活化作用を有する。したがって本発明により、免疫賦活化による癌、悪性腫瘍および感染症などを治療および／または予防するための有効な手段が提供される。 As shown in the following examples, the dendritic cell activator of the present invention has an action of promoting maturation of immature dendritic cells and an immunostimulatory action resulting from the action. Therefore, the present invention provides an effective means for treating and / or preventing cancer, malignant tumor and infection caused by immunostimulation.
さらに本発明により、未成熟樹状細胞を処理することにより成熟樹状細胞を誘導する方法が提供される。本発明の方法により活性化された樹状細胞は、高いＩＬ−１２生産能を有するので、ＩＬ−１２産生を介してのＴｈ１細胞の活性化を強く促進し、疾患に対して高い治療効果または予防効果を発揮すると考えられる。 Furthermore, the present invention provides a method for inducing mature dendritic cells by treating immature dendritic cells. Since the dendritic cells activated by the method of the present invention have a high IL-12 production ability, they strongly promote the activation of Th1 cells through IL-12 production, and have a high therapeutic effect on diseases or It is thought to exert a preventive effect.
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although the preferable Example of this invention is described in detail, this invention is not limited to these Examples.
［実施例１］メシマコブ抽出物の調製
メシマコブ抽出物は以下の手順により調製した。メシマコブ子実体を微粉化することにより調製した１００μｍ以下の粒径のメシマコブ子実体粉末２５ｇを５００ｍＬ用量の蒸留水に懸濁させ、３５℃で３０分間、超音波破砕処理を行った。この処理液を高速遠心して沈殿を除去し、得られた濾液を凍結乾燥して、メシマコブ抽出物を得た。得られたメシマコブ抽出物はもとの子実体粉末の５〜２０％であった。
[Example 1] Preparation of Meshimakobu extract Meshimakobu extract was prepared by the following procedure. 25 g of Meshimakobu fruit body powder having a particle size of 100 μm or less prepared by pulverizing Meshimakobu fruit body was suspended in 500 mL of distilled water and subjected to ultrasonic crushing treatment at 35 ° C. for 30 minutes. The treated solution was centrifuged at a high speed to remove the precipitate, and the obtained filtrate was lyophilized to obtain a Meshimakobu extract. The obtained Mishima Kobu extract was 5 to 20% of the original fruit body powder.
［実施例２］メシマコブ抽出物のヒト樹状細胞活性化効果の測定
（２−１）ヒト末梢血からの未熟樹状細胞の誘導
健常人末梢血をヘパリン採血し、RosetteSep Humon monocyte Enrichment cocktail キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ社）を用い、キット付属のプロトコル通りに単球を調製し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ｓｉｇｍａ、１０％ＦＢＳ含有）に５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液を２４穴プレートに５００μＬずつ分注し、さらにＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテック）、ＩＬ−４（ペプロテック）各４０ｎｇ／ｍＬになるように添加した。これを３７℃、５％ＣＯ２条件で３日間培養した。３日後に培養上清３００μＬを、細胞を吸わないように注意深く吸い取り、新しいＲＰＭＩ１６４０培地（ｓｉｇｍａ、１０％ＦＢＳ含有）３００μＬを加えた。さらにＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテック）、ＩＬ−４（ペプロテック）各４０ｎｇ／ｍＬになるように添加し、さらに３日間培養（合計６日間）し、未熟樹状細胞を誘導した。未熟樹状細胞の誘導は、細胞表面の単球マーカーであるＣＤ１４タンパクが発現低下、共刺激因子であるＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６タンパクが発現していることを、それぞれのタンパク特異的な抗体である、抗ＣＤ１４抗体ＦＩＴＣ標識、抗ＣＤ４０抗体ＦＩＴＣ標識、抗ＣＤ８０抗体ＰＥ標識、抗ＣＤ８６抗体ＰＣ５標識（ペプロテック）を用いて、フローサイトメーター（ベックマンコールターＥｐｉｃｓ ＸＬ）で測定し確認した。
[Example 2] Measurement of human dendritic cell activation effect of Meshimakobu extract (2-1) Induction of immature dendritic cells from human peripheral blood Heparin blood was collected from healthy human peripheral blood, and RoseetteSep Humon monocyte Enrichment cocktail kit ( Monocytes were prepared using a Stemcell) according to the protocol attached to the kit, and a cell suspension was prepared in RPMI1640 medium (containing Sigma, 10% FBS) at 5 × 10 5 cells / mL. 500 μL of the prepared cell suspension was dispensed into a 24-well plate, and further added so that each of GM-CSF (Peprotech) and IL-4 (Peprotech) was 40 ng / mL. This was cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 3 days. After 3 days, 300 μL of the culture supernatant was carefully aspirated without sucking the cells, and 300 μL of fresh RPMI 1640 medium (containing sigma, 10% FBS) was added. Further, GM-CSF (peprotech) and IL-4 (peprotech) were added so as to be 40 ng / mL, respectively, and further cultured for 3 days (6 days in total) to induce immature dendritic cells. Induction of immature dendritic cells is a protein-specific antibody that expresses decreased expression of CD14 protein, a monocyte marker on the cell surface, and expression of CD40, CD80, CD86 proteins, costimulatory factors. Using an anti-CD14 antibody FITC label, an anti-CD40 antibody FITC label, an anti-CD80 antibody PE label, and an anti-CD86 antibody PC5 label (Peprotech), measurement was performed with a flow cytometer (Beckman Coulter Epis XL).
（２−２）成熟樹状細胞の誘導
上記のように調製した未熟樹状細胞に、メシマコブ抽出物及びＰＳＫを最終濃度が２００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件で２日間培養した。また、コントロールとして何も添加せずに３７℃、５％ＣＯ２条件で２日間培養した。２日後、各条件で培養した細胞の細胞表面の共刺激因子ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６タンパク及び成熟樹状細胞特異的マーカーであるＣＤ８３タンパクの発現量を抗ＣＤ４０抗体ＦＩＴＣ標識、抗ＣＤ８０抗体ＰＥ標識、抗ＣＤ８６抗体ＰＣ５標識（ペプロテック）及び抗ＣＤ８３抗体ＦＩＴＣ標識（ペプロテック）を用いて、フローサイトメーター（ベックマンコールターＥｐｉｃｓ ＸＬ）で測定した。結果を図１に示す。
(2-2) Induction of mature dendritic cells To immature dendritic cells prepared as described above, Meshima Cob extract and PSK were added to a final concentration of 200 μg / mL, and the conditions were 37 ° C. and 5% CO 2. For 2 days. Further, as a control, the cells were cultured for 2 days at 37 ° C. and 5% CO 2 without adding anything. Two days later, the expression levels of the costimulatory factors CD40, CD80, CD86 protein and the mature dendritic cell-specific marker CD83 protein on the cell surface of cells cultured under each condition were expressed as anti-CD40 antibody FITC label, anti-CD80 antibody PE label, Measurement was performed with a flow cytometer (Beckman Coulter Epis XL) using an anti-CD86 antibody PC5 label (Peprotech) and an anti-CD83 antibody FITC label (Peprotech). The results are shown in FIG.
測定の結果、メシマコブ抽出物およびＰＳＫのいずれを添加した場合も、コントロールと比較してすべてのマーカーについて発現量の増加が認められ、メシマコブ抽出物およびＰＳＫの添加により樹状細胞が活性化され、成熟化が促進されたことが確認された。また、すべてのマーカーに関して、メシマコブ抽出物を添加した系の発現量はＰＳＫの系の発現量を上回り、特に、成熟樹状細胞特異的マーカーであるＣＤ８３のメシマコブ抽出物を添加した系における発現量は、ＰＳＫを添加した系と比して２倍以上であることが確認された。このことから、本発明の樹状細胞活性化剤は、従来知られていた樹状細胞活性化剤と比べて、高い活性化効果を有することが示唆された。 As a result of the measurement, an increase in the expression level was observed for all markers as compared to the control when either the Mishima Kobu extract or PSK was added, and dendritic cells were activated by the addition of Messima Kobu extract and PSK, It was confirmed that maturation was promoted. In addition, for all markers, the expression level of the system to which the extract of Meshimakobu was added exceeded the expression level of the system of PSK. Was confirmed to be at least twice that of the system to which PSK was added. From this, it was suggested that the dendritic cell activator of the present invention has a higher activation effect than the conventionally known dendritic cell activators.
［実施例３］メシマコブ抽出物により活性化されたヒト樹状細胞のＩＬ−１２産生能の測定
実施例２と同じ方法で、ヒト末梢血から未熟樹状細胞を誘導した。調製した未熟樹状細胞に、メシマコブ抽出物及びＰＳＫを最終濃度が２００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した。また、コントロールとして何も添加せずに３７℃、５％ＣＯ２条件で２４時間培養した。２４時間後、各培養上清を回収し、培養上清中のＩＬ−１２量をＥＬＩＳＡキット（バイオソース）で、キットのプロトコルに従って測定した。結果を図２に示す。
[Example 3] Measurement of IL-12 production ability of human dendritic cells activated by Meshimakobu extract Immature dendritic cells were induced from human peripheral blood by the same method as in Example 2. To the prepared immature dendritic cells, Messimacob extract and PSK were added to a final concentration of 200 μg / mL, and the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours. Moreover, nothing 37 ° C. without the addition as a control, were cultured for 24 hours in 5% CO 2 condition. After 24 hours, each culture supernatant was collected, and the amount of IL-12 in the culture supernatant was measured with an ELISA kit (Biosource) according to the protocol of the kit. The results are shown in FIG.
ＰＳＫを添加した系においては、コントロールに比べてほとんどＩＬ−１２産生の増加は認められなかった。一方、メシマコブ抽出物の系ではＩＬ−１２産生の大幅の増加が確認された。このことから、メシマコブ抽出物により活性化された樹状細胞は、高いＩＬ−１２生産能を有することが確認された。 In the system to which PSK was added, IL-12 production was hardly increased as compared with the control. On the other hand, a significant increase in IL-12 production was confirmed in the Meshimakobu extract system. From this, it was confirmed that the dendritic cells activated by the Meshimakobu extract have high IL-12 production ability.
［実施例４］メシマコブ抽出物分画物ＥＳの調製
実施例１に記載の方法で調製したメシマコブ抽出物を８０％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）中に懸濁し、２４時間室温で静置した。懸濁液を遠心分離し、上清を適度に濃縮後、凍結乾燥を行い、メシマコブ抽出物分画物ＥＳを褐色粉末として得た。メシマコブ抽出物からの収率は代表例として約５０％であった。得られたメシマコブ抽出物分画物ＥＳは、糖含量が２０〜４０％で残りの大部分は糖・蛋白・脂質以外の低分子成分であった。
[Example 4] Preparation of Meshimakobu extract fraction ES Meshimakobu extract prepared by the method described in Example 1 was suspended in an 80% aqueous ethanol solution (v / v) and allowed to stand at room temperature for 24 hours. The suspension was centrifuged, and the supernatant was moderately concentrated and then lyophilized to obtain Meshimakobu extract fraction ES as a brown powder. The yield from Meshimakobu extract was typically about 50%. The obtained Meshimakobu extract fraction ES had a sugar content of 20 to 40%, and most of the remainder was low molecular components other than sugar, protein and lipid.
［実施例５］メシマコブ抽出物分画物ＥＳのマウス樹状細胞活性化効果の測定
マウスの骨髄細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（ｓｉｇｍａ、１０％ＦＢＳ含有）に１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液を２４穴プレートに５００μＬずつ分注し、さらにＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテック）を５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−４（ペプロテック）を４０ｎｇ／ｍＬになるように添加した。これを３７℃、５％ＣＯ２条件で３日間培養した。３日後に培養上清３００μＬを、細胞を吸わないように注意深く吸い取り、新しいＲＰＭＩ１６４０培地（ｓｉｇｍａ、１０％ＦＢＳ含有）３００μＬを加えた。ＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテック）を５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−４（ペプロテック）を４０ｎｇ／ｍＬになるように添加し、さらに３日間培養（合計６日間）し、未熟樹状細胞を誘導した。調製した未熟樹状細胞に、ＰＳＫ、メシマコブ抽出物及びメシマコブ抽出物分画物ＥＳを最終濃度が各１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件で２日間培養した。コントロールは何も添加しない系を用いた。２日後、各条件で培養した細胞の細胞表面の樹状細胞活性化マーカーであるＣＤ８６タンパクの発現量を測定した。発現量は抗ＣＤ８６抗体ＦＩＴＣ標識（ベックマンコールター）を用いて細胞表面上のＣＤ８６タンパクをＦＩＴＣ蛍光標識し、フローサイトメーター（ベックマンコールターＥｐｉｃｓ ＸＬ）でレーザー強度５００ｖｏｌｔ、蛍光検出力１．０ｇａｉｎと設定して、ＦＩＴＣ蛍光を検出することで測定した。また、各薬剤の効果は各薬剤を添加したときの発現量から、何も添加しなかったコントロールの発現量を差し引いた、発現増加量で評価した。結果を図３に示す。
[Example 5] Measurement of mouse dendritic cell activation effect of Messimacob extract fraction ES Mouse bone marrow cells were suspended in RPMI1640 medium (containing sigma and 10% FBS) at 1 × 10 6 cells / mL. A liquid was prepared. 500 μL of the prepared cell suspension was dispensed into a 24-well plate, and GM-CSF (Peprotech) was added at 50 ng / mL and IL-4 (Peprotech) was added at 40 ng / mL. This was cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 3 days. After 3 days, 300 μL of the culture supernatant was carefully aspirated without sucking the cells, and 300 μL of fresh RPMI 1640 medium (containing sigma, 10% FBS) was added. GM-CSF (peprotech) was added to 50 ng / mL and IL-4 (peprotech) was added to 40 ng / mL, and further cultured for 3 days (6 days in total) to induce immature dendritic cells. To the prepared immature dendritic cells, PSK, Meshimakobu extract, and Meshimakobu extract fraction ES were added so as to have a final concentration of 100 μg / mL, respectively, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 days. As a control, a system in which nothing was added was used. Two days later, the expression level of CD86 protein, which is a dendritic cell activation marker on the cell surface of cells cultured under each condition, was measured. The expression level is set to FITC fluorescent labeling of CD86 protein on the cell surface using anti-CD86 antibody FITC labeling (Beckman Coulter), laser intensity 500 volt, and fluorescence detection power 1.0 gain with a flow cytometer (Beckman Coulter Epis XL). Then, it was measured by detecting FITC fluorescence. In addition, the effect of each drug was evaluated by the amount of expression increase obtained by subtracting the expression level of the control to which nothing was added from the expression level when each drug was added. The results are shown in FIG.
測定の結果、いずれを添加した場合も、樹状細胞活性化マーカーであるＣＤ８６タンパクの発現量が増加した。また、メシマコブ抽出物を添加した系における発現増加量は従来より知られている樹状細胞活性化剤ＰＳＫ添加の系の３倍以上、さらにメシマコブ抽出物分画物ＥＳは１３倍以上の発現量増加が認められた。このことから、本発明の樹状細胞活性化剤は、従来知られていた樹状細胞活性化剤と比べて、高い活性化効果を有することが示唆された。 As a result of the measurement, the expression level of CD86 protein, which is a dendritic cell activation marker, increased when any of them was added. In addition, the expression increase amount in the system to which Meshimakobu extract was added was more than 3 times that of the conventionally added system of dendritic cell activator PSK, and the expression amount of Meshimakobu extract fraction ES was 13 times or more. An increase was observed. From this, it was suggested that the dendritic cell activator of the present invention has a higher activation effect than the conventionally known dendritic cell activators.
Claims (16)
１）メシマコブ子実体から２５〜１０５℃で水抽出物を得る工程；および
２）当該水抽出物から、さらに５０〜９０％（ｖ／ｖ）のＣ１−３アルカノール水溶液を用いて４〜５０℃で抽出物を得る工程
を含む製造方法により調製することができる、請求項２に記載の樹状細胞活性化剤。 Said extract comprises the following steps:
1) a step of obtaining a water extract at 25 to 105 ° C. from the fruit body of Meshimakobu; and 2) 4 to 50 from the water extract using a 50 to 90% (v / v) aqueous C 1-3 alkanol solution. The dendritic cell activator according to claim 2, which can be prepared by a production method including a step of obtaining an extract at 0 ° C.
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