JP2006141346A - Dendritic cell activator - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、椎茸菌糸体抽出物またはその分画物を含む樹状細胞活性化剤、特に樹状細胞成熟化促進剤に関する。さらに本発明は、当該樹状細胞活性化剤を含む経口摂取用組成物、医薬組成物、食品組成物等に関する。 The present application relates to a dendritic cell activator comprising a shiitake mycelium extract or a fraction thereof, particularly a dendritic cell maturation promoter. Furthermore, this invention relates to the composition for oral intake, the pharmaceutical composition, the food composition, etc. containing the said dendritic cell activator.
樹状細胞は樹枝状の突起を持つという形態的な特徴を有する免疫細胞の一種であり、様々な組織（例えば、皮膚や粘膜など）に分布し、免疫監視細胞としての役割を果たしている。特に、樹状細胞は、体内に進入した抗原をリンパ組織に運び、Ｔ細胞を刺激して免疫反応を惹起させる機能を有し、リンパ球とともに免疫反応の中心的役割を担う細胞である。 Dendritic cells are a type of immune cell having a morphological characteristic of having dendritic processes, and are distributed in various tissues (for example, skin and mucous membranes) and play a role as immune surveillance cells. In particular, dendritic cells are cells that have the function of carrying antigens that have entered the body to lymphoid tissues and stimulating T cells to elicit immune responses, and play a central role in immune responses together with lymphocytes.
様々な生体内組織に分布する樹状細胞のうち、末梢組織に存在する樹状細胞はＴ細胞活性化能が低いことから、未成熟樹状細胞と呼ばれる。これに対して、リンパ器官に存在する樹状細胞は強力なＴ細胞活性化能を有することから成熟樹状細胞と呼ばれる。このような機能の差は、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）分子に加えて細胞接着分子および共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０およびＣＤ８６など）の発現量の増加ならびにサイトカインやケモカインなどの生産能の変化に起因する。また、成熟に伴って、樹状細胞は、細胞骨格の再構成により固着性の強い構造から運動性の高い構造となり、リンパ節への移動を開始する。所属リンパ器官のＴ領域において、樹状細胞はケモカインの産生などによりＴ細胞の活性化を促進する（非特許文献１：細胞工学、第１９巻、第９号、２０００年、第１３１１−１３１７頁）。 Among dendritic cells distributed in various in vivo tissues, dendritic cells present in peripheral tissues are called immature dendritic cells because of their low ability to activate T cells. In contrast, dendritic cells present in lymphoid organs are called mature dendritic cells because they have a strong ability to activate T cells. Such functional differences are caused by increased expression levels of cell adhesion molecules and costimulatory molecules (for example, CD40, CD54, CD58, CD80 and CD86) in addition to MHC (major histocompatibility complex) molecules, cytokines, Due to changes in production capacity such as chemokines. In addition, with maturation, dendritic cells change from a strongly adherent structure to a highly motile structure due to reorganization of the cytoskeleton, and begin to migrate to lymph nodes. In the T region of the regional lymphoid organ, dendritic cells promote the activation of T cells by producing chemokines (Non-patent Document 1: Cell Engineering, Vol. 19, No. 9, 2000, 1311-1317). ).
生体内において、樹状細胞の成熟は、感染細菌やウイルス由来のＬＰＳ（リポ多糖）、ＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡ、あるいは炎症応答の誘導によって組織細胞から産生されるＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）およびＩＬ−１（インターロイキン−１）、さらに活性化血小板、好塩基球、肥満細胞などにおいて発現するＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）により誘導されることが知られている（非特許文献２：Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９２巻、１９９８年、第２４５−２５２頁）。 In vivo, dendritic cell maturation is caused by LPS (lipopolysaccharide), DNA, double-stranded RNA, or TNFα (tumor necrosis factor α) produced from tissue cells by induction of an inflammatory response and It is known to be induced by IL-1 (interleukin-1), CD40 ligand (CD40L) expressed in activated platelets, basophils, mast cells and the like (Non-patent Document 2: Banchereau J. et al. Nature, 392, 1998, 245-252).
また、インビトロ系の実験において、樹状細胞活性化作用を有する物質を探索する試みも行われている。例えば、カワラタケ菌糸体抽出物に由来するクレスチン（以下、「ＰＳＫ」とも称す）およびＡ群溶血性連鎖球菌の弱毒性自然変異株（Ｓｕ株）をペニシリンで処理した製剤であるＯＫ−４３２が樹状細胞の成熟を促進する効果を有することが報告されている（非特許文献３：Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、第１５巻、第３号、２００１年、第３８５−３８８頁；非特許文献４：Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、第５２巻、２００３年、第２０７−２１４頁）。また、ある種のグラム陽性菌の細胞壁骨格により樹状細胞の成熟化が促進されることが報告されている（特許文献１：国際特許公報０１／０４８１５４パンフレット）。さらに、化学合成により得られる特定の低分子化合物が樹状細胞活性化作用を有することについても報告されている（特許文献２：特開２００４−２１０７６８号公報）
一方、日本および中国の代表的な食用キノコで、日本では３００年前から人工栽培が行われている椎茸は、永年にわたって食品として摂取され続けられており、椎茸由来の生理活性物質は、ヒトに投与した場合の安全性、特に長期間経口的に投与した場合の安全性に優れていると考えられる。椎茸の薬理作用についていくつかの報告がされている（例えば、特許文献３：特開昭６２−２７０５３２号公報；特許文献４：特開平２−２３７９３４号公報；特許文献５：特開平２−１３４３２５号公報；特許文献６：特開２００３−１２
５３８号公報、など）。特に、椎茸由来のβ−グルカンを活性成分として含むレンチナンは抗癌剤として市販されており、マクロファージ、キラーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞などを誘導、活性化すると考えられているが、樹状細胞にほとんど影響を及ぼさないことが報告されている（非特許文献３：Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、第１５巻、第３号、２００１年、第３８５−３８８頁）。したがって、樹状細胞に対して何らかの効果を有する椎茸抽出物については、これまでに何らの報告もされていなかった。
Attempts have also been made to search for substances having a dendritic cell activation effect in in vitro experiments. For example, OK-432, which is a preparation obtained by treating Krestin (hereinafter also referred to as “PSK”) derived from Kawaratake mycelium extract and an attenuated natural mutant (Group Su) of group A hemolytic streptococci with penicillin. It has been reported to have an effect of promoting maturation of dendritic cells (Non-patent Document 3: Biotherapy, Vol. 15, No. 3, 2001, pages 385-388; Non-patent Document 4: Cancer Immunology and Immunotherapy. 52, 2003, 207-214). Moreover, it has been reported that the maturation of dendritic cells is promoted by the cell wall skeleton of certain gram-positive bacteria (Patent Document 1: International Patent Publication No. 01/048154 pamphlet). Furthermore, it has also been reported that a specific low molecular weight compound obtained by chemical synthesis has a dendritic cell activation action (Patent Document 2: Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-210768).
On the other hand, shiitake mushrooms, which are representative edible mushrooms in Japan and China, have been ingested as food for many years in Japan and have been artificially cultivated for 300 years. It is considered excellent in safety when administered, particularly when administered orally for a long period of time. Several reports have been made on the pharmacological action of shiitake mushrooms (for example, Patent Document 3: JP-A-62-270532; Patent Document 4: JP-A-2-237934; Patent Document 5: JP-A-2-134325). Patent Publication: Patent Document 6: Japanese Patent Laid-Open No. 2003-12
538, etc.). In particular, lentinan containing β-glucan derived from shiitake mushroom as an active ingredient is commercially available as an anticancer agent, and is thought to induce and activate macrophages, killer T cells, natural killer cells, etc., but has almost no effect on dendritic cells. (Non-patent Document 3: Biotherapy, Vol. 15, No. 3, 2001, pages 385-388). Therefore, there has been no report on shiitake extract that has any effect on dendritic cells.
また、樹状細胞の有する強力な抗原提示能を臨床に応用することを目的として、樹状細胞を用いた抗癌療法および抗感染症療法についての研究が進められている（非特許文献５：日経サイエンス、２００３年２月号、第８４−９１頁；非特許文献６：現代医療、２００３年８月号、第８６−９２頁）。このような療法においては、何らかの手段により樹状細胞を活性化することが必要であり、特に、安全で効率のよい樹状細胞活性化剤が求められている。
本発明者は、上記の課題を達成するために鋭意研究を進めたところ、椎茸菌糸体の抽出物が樹状細胞活性化作用を有することを発見して本発明を完成させた。
本発明の目的は、樹状細胞活性化作用を有する椎茸菌糸体由来の抽出物、および当該抽出物を含む樹状細胞活性化剤、免疫賦活剤、経口摂取用組成物、医薬組成物、食品組成物、食品および飲料を提供することである。
The present inventor conducted extensive research to achieve the above-mentioned problems. As a result, the inventors discovered that an extract of shiitake mycelium has a dendritic cell activation action and completed the present invention.
An object of the present invention is to provide an extract derived from shiitake mycelium having a dendritic cell activation action, and a dendritic cell activator, immunostimulant, composition for oral intake, pharmaceutical composition, and food containing the extract It is to provide compositions, foods and beverages.
すなわち本発明の一つの側面によれば、椎茸菌糸体抽出物を含む樹状細胞活性化剤が提供される。ここで、「樹状細胞の活性化」という用語は、樹状細胞が有する何らかの機能が強化され、または樹状細胞において発現するタンパク質などの分子の量が増幅されることを意味し、当該用語の意図するところには、例えば、樹状細胞の成熟化促進、抗原取り込み能増強、抗原提示能増強、Ｔリンパ球刺激能増強などが含まれる。当該活性化に伴って樹状細胞に観察される現象としては、接着分子／共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６など）の発現量の増加、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１２、インターフェロンγおよびインターロイキン−１など）の生産能の増強、ＭＨＣ分子の発現量の増加などが挙げられる。 That is, according to one aspect of the present invention, a dendritic cell activator comprising a shiitake mycelium extract is provided. Here, the term “activation of dendritic cells” means that some function of dendritic cells is enhanced or the amount of a molecule such as a protein expressed in dendritic cells is amplified. Examples of the intention include, for example, promotion of maturation of dendritic cells, enhancement of antigen uptake ability, enhancement of antigen presentation ability, enhancement of T lymphocyte stimulation ability, and the like. The phenomenon observed in the dendritic cells with the activation includes an increase in the expression level of an adhesion molecule / costimulatory molecule (for example, CD40, CD54, CD58, CD80, CD86, etc.), cytokine (for example, interleukin- 12, interferon γ, interleukin-1, etc.), and the like.
本発明の別の側面によれば、上記の樹状細胞活性化剤を含む医薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、特に限定はされないが、例えば、免疫賦活化、癌もしくは悪性腫瘍の
治療もしくは予防、または感染症の治療または予防のために用いられうる。ここで、癌および悪性腫瘍としては、特に限定はされないが、例えば、大腸癌および胃癌などの消化器癌、骨髄腫、肝臓癌、白血病、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肺癌、口腔癌、脳腫瘍などが挙げられる。また、特に限定はされないが、感染症にはウイルス感染症などが含まれ、例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎ウイルスによる慢性肝炎、ＨＩＶ、インフルエンザなどが挙げられる。
According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising the above dendritic cell activator. The pharmaceutical composition is not particularly limited, and can be used, for example, for immunostimulation, treatment or prevention of cancer or malignant tumor, or treatment or prevention of infectious diseases. Here, the cancer and malignant tumor are not particularly limited. For example, digestive organ cancer such as colon cancer and stomach cancer, myeloma, liver cancer, leukemia, melanoma, prostate cancer, breast cancer, uterine cancer, lung cancer, oral cancer And brain tumors. In addition, although not particularly limited, infectious diseases include viral infectious diseases, and examples thereof include chronic hepatitis due to hepatitis B and hepatitis C viruses, HIV, influenza, and the like.
本発明における椎茸菌糸体は、特に限定はされないが、例えば、食用にされる子実体の前段階の菌糸の状態のものを使用することができる。当該菌糸体は、培養により生産されたものであっても天然より採取されたものであってもよい。本発明には、例えば、椎茸菌を固体培地で培養して得られる菌糸体を用いることができる。本発明において用いられる椎茸菌糸体抽出物は、当該技術分野において公知の方法により調製することができるが、菌糸体を粉砕後に熱水抽出して得られる抽出物を用いることができる。さらに、例えば、菌糸体を含む固体培地を水および酵素の存在下に粉砕、分解して得られる抽出物を用いることができる。抽出物の調製に用いられる溶媒としては、例えば、水、エタノール、メタノール、ブタノール、イソプロパノールなど、好ましくは水を使用することができる。抽出は溶媒の加熱下（例えば、８５〜１０５℃程度）で行うこともできるが、より低温（例えば、２５〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃）で超音波を照射することにより行うこともできる。 Although the shiitake mycelium in the present invention is not particularly limited, for example, a mycelium in a state before the fruit body to be edible can be used. The mycelium may be produced by culture or collected from nature. In the present invention, for example, a mycelium obtained by culturing shiitake mushrooms in a solid medium can be used. The shiitake mycelium extract used in the present invention can be prepared by a method known in the art, but an extract obtained by hot water extraction after grinding the mycelium can be used. Furthermore, for example, an extract obtained by pulverizing and decomposing a solid medium containing mycelium in the presence of water and an enzyme can be used. As a solvent used for the preparation of the extract, for example, water, ethanol, methanol, butanol, isopropanol and the like, preferably water can be used. Extraction can be performed under heating of a solvent (for example, about 85 to 105 ° C.), but can also be performed by irradiating ultrasonic waves at a lower temperature (for example, 25 to 50 ° C., preferably 30 to 45 ° C.). it can.
当該椎茸菌糸体抽出物は、限定はされないが、例えば以下の方法により得られたものを使用することができる。すなわち、バガス（サトウキビのしぼりかす）と脱脂米糠を基材とする固体培地上に椎茸菌を接種し、次いで菌糸体を増殖して得られる菌糸体を含む固体培地を１２メッシュ通過分が３０重量％以下となるよう解束し、この解束された固体培地に水およびセルラーゼ、プロテアーゼまたはグルコシダーゼから選ばれる酵素の１種またはそれ以上を、前記固体培地を３０〜５５℃の温度に保ちながら添加するとともに、前記固体培地を前記酵素の存在下に粉砕、すりつぶしてバガス繊維の少なくとも７０重量％以上が１２メッシュ通過分であるようにし、次いで９０℃までの温度に加熱することにより酵素を失活させるとともに滅菌し、得られた懸濁状液をろ過することによって椎茸菌糸体抽出液を得る。当該抽出液を椎茸菌糸体抽出物として用いてもよいが、これを濃縮、凍結乾燥して粉末として保存し、使用時に種々の形態で使用するのが便宜的である。凍結乾燥して得られる粉末は褐色粉末で、吸湿性があり、特異な味と臭いをもつ。このようにして得られる椎茸菌糸体抽出物はフェノール−硫酸法による糖質分析により糖質を１５〜５０％、好ましくは２０〜４０％（ｗ／ｗ）、Ｌｏｗｒｙ法によるタンパク質分析によりタンパク質を１０〜４０％、好ましくは１３〜３０％（ｗ／ｗ）、没食子酸を標準とするＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法によりポリフェノール類を１〜５％、好ましくは２．５〜３．５％（ｗ／ｗ）含む。椎茸菌糸体抽出物にはそのほかに脂質約０．１％、繊維約０．４％、灰分約２０％を含むが、これに限定されない。 Although the said shiitake mycelium extract is not limited, For example, what was obtained by the following methods can be used. That is, a solid medium containing mycelia obtained by inoculating shiitake mushrooms on a solid medium based on bagasse (sugar cane scum) and defatted rice bran and then growing the mycelium has a 30-mesh weight of 12 mesh. %, And one or more of water and one or more enzymes selected from cellulase, protease, or glucosidase are added to the unbound solid medium while maintaining the solid medium at a temperature of 30 to 55 ° C. In addition, the solid medium is pulverized and ground in the presence of the enzyme so that at least 70% by weight or more of the bagasse fiber is passed through 12 mesh, and then the enzyme is deactivated by heating to a temperature up to 90 ° C. And sterilizing, and the resulting suspension is filtered to obtain a shiitake mycelium extract. The extract may be used as a shiitake mycelium extract, but it is convenient to store it as a powder by concentrating, lyophilizing, and using it in various forms at the time of use. The powder obtained by freeze-drying is a brown powder, is hygroscopic and has a unique taste and smell. The resulting mushroom mycelium extract thus obtained has a sugar content of 15 to 50%, preferably 20 to 40% (w / w) by carbohydrate analysis by the phenol-sulfuric acid method, and 10 protein by protein analysis by the Lowry method. -40%, preferably 13-30% (w / w), 1-5% polyphenols by the Folin-Denis method with gallic acid as standard, preferably 2.5-3.5% (w / w) Including. Shiitake mycelium extract includes, but is not limited to, about 0.1% lipid, about 0.4% fiber, and about 20% ash.
また、椎茸菌糸体抽出物の構成糖組成（％）の一例は以下の通りであったが、この組成は培養条件などによって変動しうる：キシロース：１５．２；アラビノース：８．２；マンノース：８．４；グルコース：３９．４；ガラクトース：５．４；アミノ糖：１２．０；ウロン酸：１１．３。 An example of the constituent sugar composition (%) of the shiitake mycelium extract was as follows, but this composition may vary depending on the culture conditions: xylose: 15.2; arabinose: 8.2; mannose: 8.4; glucose: 39.4; galactose: 5.4; amino sugar: 12.0; uronic acid: 11.3.
本発明における椎茸菌糸体抽出物は、椎茸菌糸体抽出物から得られる分画物であってもよい。当該分画物は、本発明の属する技術分野において通常用いられる分画方法により得られ、分画方法の例には、任意の溶媒を用いての抽出による分画、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムを用いた分画、およびシリカゲルカラムクロマトグラフィーなどが含まれる。分画方法は１種類の方法であってもよく、または複数の手段の組み合わせであってもよい。上記の分画方法で用いる溶媒としては、特に限定はされないが、
例えば、水、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、酢酸、アセトン、およびそれらの混合物を用いることができる。当該分画物は、必要に応じて濃縮および／または凍結乾燥などを行うことにより得られる濃縮液、粘稠物質または固体を可溶性画分として使用することができる。
The shiitake mycelium extract in the present invention may be a fraction obtained from a shiitake mycelium extract. The fraction is obtained by a fractionation method usually used in the technical field to which the present invention belongs, and examples of the fractionation method include fractionation by extraction using an arbitrary solvent, gel filtration column chromatography, ion Examples include fractionation using an exchange column and silica gel column chromatography. The fractionation method may be one type of method or a combination of a plurality of means. The solvent used in the fractionation method is not particularly limited,
For example, water, methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, acetic acid, acetone, and mixtures thereof can be used. As the fraction, a concentrated solution, a viscous substance, or a solid obtained by performing concentration and / or lyophilization as necessary can be used as a soluble fraction.
本明細書で用いられる用語「樹状細胞活性化剤」とは、一般的には、樹状細胞に作用することにより、樹状細胞が有する機能を強化する、または樹状細胞上または細胞内に発現する物質の量を増幅する作用を有する薬剤を意味し、樹状細胞活性化剤により、例えば、樹状細胞の成熟化促進作用、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１２など）産生能が高められるなどの効果を得ることができる。 As used herein, the term “dendritic cell activator” generally enhances the function of a dendritic cell by acting on the dendritic cell or on or inside the dendritic cell. Means a drug having an action of amplifying the amount of a substance expressed in the dendritic cell, and the dendritic cell activator enhances, for example, the action of promoting the maturation of dendritic cells and the ability to produce cytokines (eg, interleukin-12). Effects can be obtained.
本発明の樹状細胞活性化剤は、医薬組成物の有効成分として使用することができる。当該医薬組成物は、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができ、非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤とすることができるが、これらには限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。 The dendritic cell activator of the present invention can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition can be used in various dosage forms such as tablets, capsules, powders, granules, pills, solutions, emulsions, suspensions, solutions, spirits, syrups, for oral administration. Extracts and elixirs can be used, and parenterals include, for example, injections such as subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections. Is not limited. These preparations can be produced by known methods usually used in the preparation process.
当該医薬組成物は、一般に用いられる各種成分を含みうるものであり、例えば、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤等を含みうる。また本発明の医薬組成物は、持続性または徐放性剤形であってもよい。 The pharmaceutical composition may contain various commonly used components, such as one or more pharmaceutically acceptable excipients, disintegrants, diluents, lubricants, flavoring agents, Coloring agents, sweetening agents, flavoring agents, suspending agents, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, adjuvants, preservatives, buffering agents, binders, stabilizers, coating agents and the like can be included. The pharmaceutical composition of the present invention may be in a sustained or sustained release dosage form.
本発明の医薬組成物の投与量は、投与経路、患者の体型、年齢、体調、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができ、本発明の医薬組成物は、治療有効量および／または予防有効量の樹状細胞活性化剤を含むことができる。椎茸菌糸体抽出物は元来食品として使用されてきたものであり過剰症に対する懸念の少ない比較的安全な物質であるので、必要に応じて高濃度で投与することも可能である。本発明において椎茸菌糸体抽出物は、一般に１００〜５０００ｍｇ／日／成人、好ましくは３００〜３０００ｍｇ／日／成人の用量で使用されうる。当該医薬組成物の投与は、単回投与または複数回投与であってもよく、例えば他の樹状細胞活性化剤、免疫賦活剤、抗癌剤、抗腫瘍剤、好感染症剤などの他の薬剤と組み合わせて使用することもできる。 The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately selected depending on the administration route, the patient's body shape, age, physical condition, degree of disease, elapsed time after onset, etc. An effective amount and / or a prophylactically effective amount of a dendritic cell activator can be included. Shiitake mycelium extract was originally used as a food and is a relatively safe substance with little concern about hyperplasia, so it can be administered at a high concentration as necessary. In the present invention, the shiitake mycelium extract may be used at a dose of generally 100 to 5000 mg / day / adult, preferably 300 to 3000 mg / day / adult. The pharmaceutical composition may be administered in a single dose or multiple doses. For example, other drugs such as other dendritic cell activators, immunostimulators, anticancer agents, antitumor agents, anti-infective agents, etc. Can also be used in combination.
本発明のさらに別の側面によれば、上記の樹状細胞活性化剤により、未成熟樹状細胞を処理することにより成熟樹状細胞を誘導する方法が提供される。ここで、未成熟樹状細胞は、特に限定はされないが、例えば単球細胞をサイトカイン（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（以下、「ＧＭ−ＣＦＳ」とも称す）およびインターロイキン−４（以下、「ＩＬ−４」とも称す））を含む培地で培養することにより調製することができる。ここで、単球細胞は特に限定はされないが、例えば血中単球細胞を使用することができ、好ましくはヒト血中単球細胞である。 According to still another aspect of the present invention, there is provided a method for inducing mature dendritic cells by treating immature dendritic cells with the above dendritic cell activator. Here, immature dendritic cells are not particularly limited. For example, monocyte cells can be cytokines (for example, granulocyte / macrophage colony-stimulating factor (hereinafter also referred to as “GM-CFS”) and interleukin-4 (hereinafter, referred to as “monocyte”). , Also referred to as “IL-4”))). Here, the monocyte cell is not particularly limited. For example, a blood monocyte cell can be used, and a human blood monocyte cell is preferable.
未成熟樹状細胞の成熟樹状細胞への変化は、当該技術分野において当業者に知られた方法により確認することができるが、例えば、樹状細胞に共通の共刺激因子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）の発現量の増加や、成熟樹状細胞に特異的なタンパク質（例えば、ＣＤ８３など）の発現量の増加を観測することにより判断されうる。これらのタンパク質の発現量は、例えばフローメトリー法などにより観測することができる。 The change of immature dendritic cells into mature dendritic cells can be confirmed by methods known to those skilled in the art, for example, costimulatory factors common to dendritic cells (eg, CD40, This can be determined by observing an increase in the expression level of CD80, CD86) or an increase in the expression level of a protein specific to mature dendritic cells (eg, CD83). The expression levels of these proteins can be observed by, for example, a flowmetry method.
生体外で樹状細胞を活性化させる際に使用する本発明の樹状細胞活性化剤は、例えば、
１日に１０〜１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００〜５００μｇ／ｍＬの量で培養液中に添加することができる。また、例えば１〜５日、好ましくは２〜３日の期間培養することにより樹状細胞の活性化を誘導することができる。
The dendritic cell activator of the present invention used when activating dendritic cells in vitro is, for example,
It can be added to the culture medium in an amount of 10 to 1000 μg / mL, preferably 100 to 500 μg / mL per day. Further, for example, the activation of dendritic cells can be induced by culturing for a period of 1 to 5 days, preferably 2 to 3 days.
本発明の方法は、得られる成熟樹状細胞に特定の抗原を提示させるために、樹状細胞と抗原性物質を混合する工程をさらに含んでいてもよい。ここで、抗原性物質は特には限定されないが、腫瘍由来ペプチドまたはウイルス由来ペプチドなどを使用することができ、例えば、ＣＥＡ由来ペプチド、ＭＡＧＥ由来ペプチドなどを使用することができる。樹状細胞と抗原性物質との混合は、樹状細胞の活性化の前後、または樹状細胞の活性化と同時であってもよいが、好ましくは樹状細胞の活性化と同時に行われる。 The method of the present invention may further comprise a step of mixing the dendritic cell and the antigenic substance in order to present the specific antigen to the resulting mature dendritic cell. Here, the antigenic substance is not particularly limited, and a tumor-derived peptide or a virus-derived peptide can be used. For example, a CEA-derived peptide, a MAGE-derived peptide, or the like can be used. The mixing of the dendritic cell and the antigenic substance may be performed before or after the activation of the dendritic cell, or simultaneously with the activation of the dendritic cell, but is preferably performed simultaneously with the activation of the dendritic cell.
本発明のさらに別の側面によれば、樹状細胞活性化剤により未成熟樹状細胞を処理することにより得られる成熟樹状細胞、および当該成熟樹状細胞を含む医薬組成物が提供される。ここで、当該医薬組成物は、特に限定はされないが、癌、悪性腫瘍または感染症を予防または治療するために使用することができ、例えば、大腸癌および胃癌などの消化器癌、骨髄腫、肝臓癌、白血病、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肺癌、口腔癌、脳腫瘍などの癌もしくは悪性腫瘍；またはＢ型またはＣ型肝炎ウイルスによる慢性肝炎、ＨＩＶ、インフルエンザなどの感染症に適用することができる。 According to still another aspect of the present invention, there are provided mature dendritic cells obtained by treating immature dendritic cells with a dendritic cell activator, and pharmaceutical compositions containing the mature dendritic cells. . Here, the pharmaceutical composition is not particularly limited, but can be used to prevent or treat cancer, malignant tumor or infection, for example, digestive organ cancer such as colon cancer and gastric cancer, myeloma, Applicable to cancers or malignant tumors such as liver cancer, leukemia, melanoma, prostate cancer, breast cancer, uterine cancer, lung cancer, oral cancer, brain tumor; or chronic hepatitis due to hepatitis B or C virus, HIV, influenza, etc. be able to.
本発明のさらなる側面によれば、上記の樹状細胞活性化剤を含む、免疫療法において使用する補助活性化剤が提供される。ここで、補助活性化剤とは、免疫療法の際に樹状細胞の活性化を誘導するために樹状細胞とともに生体内に投与する物質（アジュバント）であり、医薬組成物の１成分として含まれていてもよい。ここで、免疫療法が対象とする疾患は特に限定はされないが、例えば、大腸癌および胃癌などの消化器癌、骨髄腫、肝臓癌、白血病、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、子宮癌、肺癌、口腔癌、脳腫瘍などの癌もしくは悪性腫瘍；またはＢ型またはＣ型肝炎ウイルスによる慢性肝炎、ＨＩＶ、インフルエンザなどの感染症などが挙げられる。本発明の補助活性化剤は、一般に用いられる各種成分を含みうるものであり、またその投与量は、投与経路、患者の体型、年齢、体調、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができる。例えば、本発明の補助活性化剤は上述の本発明の医薬組成物と同様の実施態様により実施することができる。 According to a further aspect of the present invention there is provided an auxiliary activator for use in immunotherapy comprising the above dendritic cell activator. Here, the auxiliary activator is a substance (adjuvant) administered in vivo together with dendritic cells in order to induce the activation of dendritic cells during immunotherapy, and is included as one component of the pharmaceutical composition It may be. Here, the disease targeted by immunotherapy is not particularly limited, but for example, digestive organ cancer such as colon cancer and stomach cancer, myeloma, liver cancer, leukemia, melanoma, prostate cancer, breast cancer, uterine cancer, lung cancer, oral cavity Cancer, malignant tumors such as cancer and brain tumor; or chronic hepatitis due to hepatitis B or C virus, HIV, infection such as influenza, and the like. The auxiliary activator of the present invention can contain various commonly used components, and its dosage depends on the route of administration, the patient's body shape, age, physical condition, degree of disease, elapsed time after onset, etc. It can be selected appropriately. For example, the co-activator of the present invention can be implemented by the same embodiment as the above-described pharmaceutical composition of the present invention.
本発明のさらに別の側面によれば、上記の樹状細胞活性化剤を含む食品組成物が提供される。本発明の食品組成物は、機能性飲料などの液体飲料を含む。当該食品組成物は、機能性食品として使用できるほか、医薬部外品、飲食物などの成分、食品添加物などとして使用することができる。また本明細書における食品組成物は、そのまま機能性食品として使用できるほか、飲食物、医薬品、医薬部外品、飲食物等の成分、食品添加物などとして使用することができる。当該使用により、樹状細胞活性化効果および免疫賦活化効果を有する飲食物、食品組成物または経口摂取用組成物の日常的および継続的な摂取が可能となり、効果的な樹状細胞活性化効果および免疫賦活化効果による体質改善、癌、悪性腫瘍および感染症などの疾患の治療および発症の予防が可能となる。本発明の樹状細胞活性化剤または免疫賦活化剤を含む食品組成物、食品または飲料の例としては、樹状細胞活性化効果もしくは免疫賦活化効果を有する機能性食品、健康食品、一般食品（ジュース、菓子、加工食品等）、栄養補助食品（栄養ドリンク等）などが含まれる。本明細書における食品または飲料は、限定はされないが、鉄およびカルシウムなどの無機成分、種々のビタミン類、オリゴ糖およびキトサンなどの食物繊維、大豆抽出物などのタンパク質、レシチンなどの脂質、ショ糖および乳糖などの糖類、椎茸などの植物抽出物などを含むことができる。 According to still another aspect of the present invention, a food composition comprising the above dendritic cell activator is provided. The food composition of the present invention includes a liquid beverage such as a functional beverage. In addition to being used as a functional food, the food composition can be used as a quasi-drug, a component such as food and drink, a food additive, and the like. In addition, the food composition in the present specification can be used as a functional food as it is, and can also be used as a component of food and drink, pharmaceuticals, quasi drugs, food and drink, food additives, and the like. The use enables daily and continuous ingestion of food and drink, food composition or composition for oral intake having dendritic cell activation effect and immunostimulatory effect, and effective dendritic cell activation effect It is possible to improve the constitution by immunostimulatory effect, to treat and prevent the onset of diseases such as cancer, malignant tumor and infectious disease. Examples of food compositions, foods or beverages containing the dendritic cell activator or immunostimulatory agent of the present invention include functional foods, health foods, general foods having dendritic cell activation effect or immunostimulatory effect (Juices, confectionery, processed foods, etc.), nutritional supplements (nutrient drinks, etc.) are included. The food or beverage in the present specification includes, but is not limited to, inorganic components such as iron and calcium, various vitamins, dietary fiber such as oligosaccharide and chitosan, protein such as soybean extract, lipid such as lecithin, sucrose And saccharides such as lactose, plant extracts such as shiitake mushrooms, and the like.
以下の実施例で示すように、本発明の樹状細胞活性化剤は、未成熟樹状細胞の成熟化を
促進する作用および当該作用に起因する免疫賦活化作用を有する。したがって本発明により、免疫賦活化による癌、悪性腫瘍および感染症などを治療および／または予防するための有効な手段が提供される。
As shown in the following examples, the dendritic cell activator of the present invention has an action of promoting maturation of immature dendritic cells and an immunostimulatory action resulting from the action. Therefore, the present invention provides an effective means for treating and / or preventing cancer, malignant tumor and infection caused by immunostimulation.
さらに本発明により、未成熟樹状細胞を処理することにより成熟樹状細胞を誘導する方法が提供される。椎茸菌糸体抽出物は抗酸化作用も併せ持つので、本発明の方法により酸化ストレスの少ない環境下で効率よく樹状細胞を活性化することができる。 Furthermore, the present invention provides a method for inducing mature dendritic cells by treating immature dendritic cells. Since the shiitake mycelium extract also has an antioxidant effect, dendritic cells can be efficiently activated in an environment with little oxidative stress by the method of the present invention.
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］椎茸菌糸体抽出物の調製
バガス９０重量部、米糠１０重量部からなる固体培地に純水を適度に含ませた後に、椎茸菌糸を接種し、温度および湿度を調節した培養室内に放置し、菌糸体を増殖させた。菌糸体が固体培地に蔓延した後、バガス基材の繊維素を解束し、１２メッシュ通過分が２４重量％以下となるようにした。この解束された培地１．０ｋｇに、純水３．５Ｌを加え、４０℃に保ちながら精製セルラーゼ２．０ｇを加え培地含有混合物とした。次いで培地含有混合物を変速付ギヤーポンプにより循環させながら、固体培地にギヤー部分における粉砕およびすりつぶし作用を２００分間程度加え、バガス繊維の約８０重量％が１２メッシュ通過分となるようにした。培地含有混合物の粉砕およびすりつぶしは、該混合物の温度を徐々に上昇させながら行った。その後、培地含有混合物をさらに加熱して９０℃として３０分間放置し、酵素を失活せしめ、かつ殺菌を施した。得られた培地含有混合物を６０メッシュろ布を用いてろ過して、濃縮した後、凍結乾燥粉末を椎茸菌糸体抽出物（Ｌ．Ｅ．Ｍ．）として得た。
［実施例２］椎茸菌糸体抽出物のヒト樹状細胞活性化効果の測定
（２−１）ヒト末梢血からの未熟樹状細胞の誘導
健常人末梢血をヘパリン採血し、RosetteSep Humon monocyte Enrichment cocktail キット（Stemcell社）を用い、キット付属のプロトコル通りに単球を調整し、RPMI1640培地（sigma、10%FBS含有）に5x105 cells/mlになるように細胞懸濁液を調製した。調製した
細胞懸濁液を24穴プレートに500μLずつ分注し、さらにGM-CSF(ペプロテック)、IL-4（ペプロテック）各40ng/mlになるように添加した。これを37℃、5% CO2 条件で３日間培養した。３日後に培養上清300μLを、細胞をすわないように注意深く吸い取り、新しいRPMI1640培地（sigma、10%FBS含有）300μLを加えた。さらにGM-CSF(ペプロテック)、IL-4（ペ
プロテック）各40ng/mlになるように添加し、さらに３日間培養（合計６日間）し、未熟
樹状細胞を誘導した。未熟樹状細胞の誘導は、細胞表面の単球マーカーであるCD14タンパクが発現低下、共刺激因子であるCD40、CD80、CD86タンパクが発現していることを、それぞれのタンパク特異的な抗体である、抗CD14抗体FITC標識、抗CD40抗体FITC標識、抗CD80抗体PE標識、抗CD86抗体PC5標識（ペプロテック）を用いて、フローサイトメーター（ベ
ックマンコールター Epics XL）で測定し確認した。
EXAMPLES Hereinafter, although the preferable Example of this invention is described in detail, this invention is not limited to these Examples.
[Example 1] Preparation of Shiitake Mycelium Extract A culture chamber in which pure water was appropriately contained in a solid medium consisting of 90 parts by weight of bagasse and 10 parts by weight of rice bran, inoculated with shiitake mycelia, and temperature and humidity were adjusted. And allowed to grow mycelium. After the mycelium spread on the solid medium, the bagasse-based fibrin was bunched so that the 12-mesh passage was 24% by weight or less. To 1.0 kg of the unbundled medium, 3.5 L of pure water was added, and 2.0 g of purified cellulase was added while maintaining the temperature at 40 ° C. to obtain a medium-containing mixture. Next, the medium-containing mixture was circulated by a gear pump with a speed change, and the grinding and grinding action in the gear portion was added to the solid medium for about 200 minutes, so that about 80% by weight of bagasse fibers became 12 meshes. The medium-containing mixture was pulverized and ground while gradually raising the temperature of the mixture. Thereafter, the medium-containing mixture was further heated to 90 ° C. for 30 minutes to inactivate the enzyme and sterilized. The obtained medium-containing mixture was filtered using a 60 mesh filter cloth and concentrated, and then a freeze-dried powder was obtained as a shiitake mycelium extract (LEM).
[Example 2] Measurement of human dendritic cell activation effect of shiitake mycelium extract (2-1) Induction of immature dendritic cells from human peripheral blood Heparin blood was collected from healthy human peripheral blood, and RosetteSep Humon monocyte Enrichment cocktail Using a kit (Stemcell), monocytes were prepared according to the protocol attached to the kit, and a cell suspension was prepared in RPMI1640 medium (sigma, containing 10% FBS) so as to be 5 × 10 5 cells / ml. 500 μL of the prepared cell suspension was dispensed into a 24-well plate, and further added to each of GM-CSF (Peprotech) and IL-4 (Peprotech) at 40 ng / ml. This was cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 3 days. After 3 days, 300 μL of the culture supernatant was carefully aspirated so as not to smear cells, and 300 μL of fresh RPMI1640 medium (sigma, containing 10% FBS) was added. Further, GM-CSF (peprotech) and IL-4 (peprotech) were added at 40 ng / ml, respectively, and further cultured for 3 days (6 days in total) to induce immature dendritic cells. Induction of immature dendritic cells is a protein-specific antibody that the expression of CD14 protein, a monocyte marker on the cell surface, is decreased, and the CD40, CD80, CD86 proteins, which are costimulatory factors, are expressed. Using an anti-CD14 antibody FITC label, an anti-CD40 antibody FITC label, an anti-CD80 antibody PE label, and an anti-CD86 antibody PC5 label (Peprotech), measurement was carried out using a flow cytometer (Beckman Coulter Epics XL).
（２−２）成熟樹状細胞の誘導
上記のように調製した未熟樹状細胞に、椎茸菌糸体抽出物及びPSKを最終濃度が200μg/mlになるように添加し、37℃、5% CO2条件で２日間培養した。また、コントロールとして何も添加せずに37℃、5% CO2条件で２日間培養した。２日後、各条件で培養した細胞の細胞表面の共刺激因子CD40、CD80、CD86タンパク及び成熟樹状細胞特異的マーカーであるCD83タンパクの発現量を抗CD40抗体FITC標識、抗CD80抗体PE標識、抗CD86抗体PC5標識（ペ
プロテック）及び抗CD83抗体FITC標識（ペプロテック）を用いて、フローサイトメーター（ベックマンコールター Epics XL）で測定した。その結果、コントロールに対して、椎
茸菌糸体抽出物、PSK共に高いCD40、CD80、CD83、CD86の発現量の増加が認められた。結
果を図１に示す。
(2-2) Induction of mature dendritic cells To immature dendritic cells prepared as described above, shiitake mycelium extract and PSK were added to a final concentration of 200 μg / ml, and the mixture was incubated at 37 ° C., 5% CO 2. It was cultured for 2 days under 2 conditions. Further, as a control, the cells were cultured for 2 days at 37 ° C. and 5% CO 2 without adding anything. Two days later, the expression levels of the CD40, CD80, CD86 protein and CD83 protein, a mature dendritic cell-specific marker, on the cell surface of cells cultured under each condition were expressed as anti-CD40 antibody FITC label, anti-CD80 antibody PE label, Measurement was performed with a flow cytometer (Beckman Coulter Epics XL) using an anti-CD86 antibody PC5 label (Peprotech) and an anti-CD83 antibody FITC label (Peprotech). As a result, an increase in the expression level of CD40, CD80, CD83, and CD86, both of which were high in shiitake mycelium extract and PSK, was observed relative to the control. The results are shown in FIG.
測定の結果、椎茸菌糸体抽出物およびＰＳＫのいずれを添加した場合も、コントロールと比較してすべてのマーカーについて発現量の増加が認められ、椎茸菌糸体抽出物およびＰＳＫの添加により樹状細胞が活性化され、成熟化が促進されたことが確認された。また、すべてのマーカーについて椎茸菌糸体を添加した系の発現量はＰＳＫの系の発現量を上回り、特に、成熟樹状細胞特異的マーカーであるCD83の椎茸菌糸体抽出物を添加した系における発現量は、PSKを添加した系と比して２倍以上であることが確認された。このこと
から、本発明の樹状細胞活性化剤は、従来知られていた樹状細胞活性化剤と比べて、高い活性化効果を有することが示唆された。
As a result of the measurement, when either shiitake mycelium extract or PSK was added, an increase in the expression level was observed for all markers as compared to the control, and the addition of shiitake mycelium extract and PSK resulted in dendritic cells being added. It was confirmed that activation and maturation were promoted. Moreover, the expression level of the system in which shiitake mycelium was added for all the markers exceeded the expression level of the PSK system, and in particular, the expression in the system to which the mature dendritic cell-specific marker CD83 shiitake mycelium extract was added. The amount was confirmed to be at least twice that of the system to which PSK was added. From this, it was suggested that the dendritic cell activator of the present invention has a higher activation effect than the conventionally known dendritic cell activators.
また上記手順により得られた成熟樹状細胞を顕微鏡により観察した（ｘ４００倍）。その結果を図２に示す。
椎茸菌糸体により誘導された成熟樹状細胞はＰＳＫにより誘導された成熟樹状細胞に比べ、細胞が大きく伸張した細胞が含まれていることが確認された。このことから、本発明の樹状細胞活性化剤は、従来知られていた樹状細胞活性化剤と比べて、高いＴ細胞相互作用活性を有することが示唆された。
Moreover, the mature dendritic cell obtained by the said procedure was observed with the microscope (x400 times). The result is shown in FIG.
It was confirmed that the mature dendritic cells induced by shiitake mycelium contained cells with greatly expanded cells as compared to mature dendritic cells induced by PSK. From this, it was suggested that the dendritic cell activator of the present invention has higher T cell interaction activity than the conventionally known dendritic cell activators.
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