KR102011719B1

KR102011719B1 - Uses of water-soluble astragalin galactosides as a dendritic cell activation-inducing adjuvant

Info

Publication number: KR102011719B1
Application number: KR1020170181158A
Authority: KR
Inventors: 김태성; 김도만; 전재형
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2017-11-07
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2019-08-19
Also published as: KR20190051743A

Abstract

본 발명은 수용성 아스트라갈린 배당체에 의한 수지상 세포의 활성화 작용 및 면역 보강제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체는, 기존의 아스트라갈린에서 거의 관찰되지 않았던, 수지상 세포 활성화 유도 효과를 나타내었을 뿐만 아니라, 상기 활성화된 수지상 세포는 CD4⁺ T 세포 특이적인 면역 반응을 유의적으로 향상시킬 수 있었는바, 상기 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체 또는 상기 배당체에 의해 활성화된 수지상 세포는 면역 증강제 또는 면역 조절제의 유효 성분으로 폭넓게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. The present invention relates to the activation action of dendritic cells by water-soluble astragalin glycosides and their use as immunoadjuvant. Not only did the astragalin galactoside glycosides according to the present invention show a dendritic cell activation inducing effect, which was hardly observed in conventional astragalin, but the activated dendritic cells had a significant CD4 ⁺ T cell specific immune response. As can be improved, the astragalin galactoside glycosides or dendritic cells activated by the glycosides are expected to be widely used as active ingredients of immune enhancers or immunomodulators.

Description

Use of water-soluble astragalin galactosides as a dendritic cell activation-inducing adjuvant}

본 발명은 수용성 아스트라갈린 배당체에 의한 수지상 세포의 활성화 작용 및 면역 보강제로서의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to the activation action of dendritic cells by water-soluble astragalin glycosides and their use as immunoadjuvant.

체내에서는, 박테리아, 바이러스, 독소, 암세포, 다른 사람 혹은 동물의 혈액, 및 조직과 같은 외부 물질인 항원으로부터 신체를 보호하기 위하여 면역반응이 일어난다. 이러한 면역계는 크게 면역을 억제, 조절하는 메카니즘인 면역 관용(tolerance)과 면역을 증진하는 면역 반응 (immunity)으로 구성되며, 면역계는 이러한 두 가지 면역 작용이 적절한 균형을 이룸으로써, 면역 항상성을 유지하고 있다. 이렇게 유지되는 면역학적 균형은 다양한 원인에 의해 불균형이 초래될 수 있으며, 이러한 불균형은 결국 다양한 질병을 발생시키는 결과를 초래한다. 면역 관용의 기능이 면역 반응에 비해 상대적으로 강하거나, 이와 반대로 면역반응 기능이 면역관용 기능에 비해 강해질 경우, 면역학적 불균형이 초래될 수 있다. 예를 들어, 면역 반응에 비해 면역 관용 기작이 강해질 경우, 인체 면역계는 암의 발생이나 외부 바이러스 병원성 균 등의 침입이 용이하게 되어 암 또는 바이러스 및 세균성 질환을 발생시키게 되며, 이와 반대로 면역 반응성이 면역 관용 기능보다 강해질 경우는 자가 면역질환, 강력한 이식 거부 반응, 및 알러지성 질환과 같은 염증성 질환을 초래하게 된다. 따라서, 면역학적 관점에서 바라본 질병은 면역 시스템 항상성의 불균형에 의해 나타나는 결과물이며, 이러한 불균형의 조절을 통해 질병의 치료가 가능하다고 할 수 있다. In the body, an immune response occurs to protect the body from antigens that are foreign substances such as bacteria, viruses, toxins, cancer cells, blood of other people or animals, and tissues. The immune system consists of immune tolerance, which is a mechanism for suppressing and regulating immunity, and an immune response that promotes immunity. The immune system maintains immune homeostasis by properly balancing these two immune actions. have. This maintained immunological balance can lead to imbalances for a variety of causes, which in turn result in a variety of diseases. If the function of immune tolerance is relatively strong relative to the immune response, or vice versa, the immunological imbalance can result. For example, when the immune tolerance mechanism is stronger than the immune response, the human immune system may easily develop cancer or invade external viral pathogens, thereby causing cancer or viral and bacterial diseases, and vice versa. Being stronger than tolerating results in inflammatory diseases such as autoimmune diseases, potent transplant rejection, and allergic diseases. Therefore, the disease seen from the immunological point of view is a result of the imbalance of the immune system homeostasis, it can be said that the treatment of the disease through the regulation of this imbalance.

한편, 수지상 세포 (Dendritic Cell, DC)는 기원, 형태, 표현형, 기능, 성숙화 과정 등에 따라 다양한 특성을 지니게 되며, 특히, 상황에 따라 T 세포 반응을 촉진 또는 억제할 수 있는바, 체내 면역의 항상성을 조절하는 중요한 역할을 한다. 즉, 수지상 세포는 항원에 노출된 적이 없는 원시 T 세포 (naive T cell)를 자극시킬 수 있는 일차 면역 반응 (primary immune response)의 유도 능력을 지니며, 또한 면역 기억을 유도할 수 있는 특성을 갖는 유일한 면역세포이다. 수지상 세포가 강력한 면역반응 활성화 기능을 할 수 있는 것은 항원제시세포 (APC, Antigen Presenting Cell)로서 세포 표면에 MHC 분자 (I/II) 뿐만 아니라, 예컨대 CD80, CD86과 같은 보조자극 분자 (co-stimulatory molecules)와, 예컨대 ICAM-1 등과 같은 부착 분자 (adhesion molecule)를 고농도로 발현하고 있으며, 여러 가지의 사이토카인 (IFN-alpha, IL-12, IL-18 등)을 분비하기 때문인 것으로 알려져 있다. On the other hand, dendritic cells (Dendritic Cell, DC) has a variety of characteristics depending on the origin, form, phenotype, function, maturation process, etc., in particular, can promote or inhibit the T cell response depending on the situation, the homeostasis of the immune system Plays an important role in regulating That is, dendritic cells have the ability to induce a primary immune response capable of stimulating naïve T cells that have never been exposed to antigen, and also have the property of inducing immune memory. It is the only immune cell. Dendritic cells are capable of activating a potent immune response. Antigen Presenting Cells (APCs) are not only MHC molecules (I / II) on the cell surface, but also co-stimulatory molecules such as CD80 and CD86. molecules, and adhesion molecules such as ICAM-1, etc., are expressed at high concentrations and are known to secrete various cytokines (IFN-alpha, IL-12, IL-18, etc.).

수지상 세포 분화 또는 활성화는 말초 혈액 유래 단핵구 (monocytes) 또는 말초 혈액, 제대혈, 골수의 조혈모세포로부터 사이토카인을 활용하여 체외 세포 배양 (ex vivo culture)으로 이루어지고 있으며, 크게 두 단계로 구분된다. 1 단계는 단핵구, 조혈모세포와 같은 전구세포로부터 형질적, 기능적으로 미성숙 단계의 수지상 세포로의 분화를 유도한 것이며, 2 단계는 이들 미성숙 수지상 세포를 용도에 맞도록 형질적, 기능적으로 성숙시키는 분화물질을 이용한 성숙 수지상 세포로의 분화이다. 특히, 2단계에서 분화되는 수지상 세포의 형질과 기능은 분화물질 조절을 통해 면역강화 혹은 면역 억제의 명확히 구별되는 양상이 나타난다. 따라서 수지상 세포의 분화를 적절히 체외에서 조절하여 각종 면역질환 증상에 맞는 최적의 조건을 갖추는 것이 필요하며 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.Dendritic cell differentiation or activation consists of ex vivo culture using cytokines from peripheral blood-derived monocytes or hematopoietic stem cells from peripheral blood, umbilical cord blood, bone marrow, and is divided into two stages. The first stage induces the differentiation of progenitor cells such as monocytes and hematopoietic stem cells into the characteristically and immature stages of dendritic cells. The second stage is the differentiation of these immature dendritic cells to be functionally and maturated to suit the purpose. Differentiation into mature dendritic cells using the substance. In particular, the traits and functions of the dendritic cells differentiated in the second stage are clearly distinguished aspects of immune intensification or immunosuppression through differentiation regulation. Therefore, it is necessary to appropriately control the differentiation of dendritic cells in vitro and to prepare the optimal conditions for various immune disease symptoms.

현재까지 다양한 분화유도 인자들을 이용한, 세포면역 기능성 강화를 위한 수지상 세포의 제조방법이 제시되어 왔다. 각종 사이토카인의 조합인 사이토카인 칵테일 (cytokine cocktail), 감염성 인자들이 공통적으로 보유하는 분자 패턴 (pathogen-associated molecular pattern, PAMP) 또는 이들에 대한 수용체의 리간드 (toll like receptor ligands), 독성이 제거된 멸균된 세균, 괴사를 유도한 암세포 등이 분화 유도 물질로 많이 활용되고 있다. 특히, 인위적으로 체외에서 제조한 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도하기 위해 LPS, 폴리(I:C)(poly(I:C)), LTA, CpG, flagellin 등 세균이나 바이러스 유래의 성분 또는 그에 상응하는 합성 분자들을 단독, 혹은 다양한 조합으로 사용하기도 한다. 대부분의 면역 질환은 Th1과 Th2 면역세포간의 균형이 중요하며, 암이나 천식, 아토피와 같이 Th2 면역세포가 활성화되어 있는 상황에서는 Th1 면역세포를 가동하기 위해 수지상 세포로부터 IL-12의 분비가 필요조건이다.To date, a method of preparing dendritic cells for enhancing cellular immune function using various differentiation-inducing factors has been proposed. Cytokine cocktails, combinations of various cytokines, pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) common to infectious agents, or receptor-like ligands for them, toxins are removed Sterilized bacteria, cancer cells that induce necrosis have been widely used as induction of differentiation. In particular, bacteria or virus-derived components such as LPS, poly (I: C), LTA, CpG, flagellin, or the like to induce maturation of immature dendritic cells prepared in vitro. Synthetic molecules may be used alone or in various combinations. In most immune disorders, the balance between Th1 and Th2 immune cells is important, and in situations where Th2 immune cells are active, such as cancer, asthma and atopy, the release of IL-12 from dendritic cells is required to activate Th1 immune cells. to be.

이러한 내용들을 토대로, 다양한 방법들이 수지상 세포를 성숙화시키기 위해 사용되어 왔다 (한국 등록특허 10-1749165). 그러나, 이들은 체외 분석에서 면역학적 활성 기능 증진 효과를 나타내었으나, 인체를 대상으로 한 임상연구에서는 결과가 미흡한 것으로 나타났다. 이는 체외 제조한 수지상 세포들이 세포성 면역의 유도에 필수적인 IL-12의 생산이 매우 낮고, 체내 투여되었을 때 생존율과 이동성이 낮으며, 전신성 면역 억제 환경에 의한 수지상 세포의 기능 상실 등이 그 이유인 것으로 보고되고 있다. 따라서, 수지상 세포의 분화 또는 활성화 기술을 통해 보다 효과적으로 체내에서 Th1 면역활성을 증가시킬 수 있는 기술의 개발이 요구되고 있다.Based on these findings, various methods have been used to mature dendritic cells (Korean Patent 10-1749165). However, they showed immunologically active function enhancement in vitro, but the results were insufficient in clinical studies in humans. The reason for this is that the in vitro manufactured dendritic cells have a very low production of IL-12 which is essential for the induction of cellular immunity, low survival rate and mobility when administered in vivo, and loss of dendritic cells due to systemic immune suppression environment. It is reported. Therefore, there is a need for the development of a technique that can more effectively increase Th1 immune activity in the body through differentiation or activation of dendritic cells.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은, 수지상 세포의 활성화에 의한 체내 면역 반응을 증진시키기 위하여 예의 노력한 결과, 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체의 처리에 따른 수지상 세포 및 CD4⁺ T 세포의 활성화를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.The present invention has been made to solve the above problems, the present inventors have made diligent efforts to enhance the body's immune response by activation of dendritic cells, dendritic cells and CD4 according to the treatment of astragalin galactoside glycosides Activation of ⁺ T cells was confirmed and based on this, the present invention was completed.

따라서, 본 발명의 목적은 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체를 유효성분으로 포함하는, 수지상 세포의 활성화 유도용 조성물 및 이의 용도를 제공하는데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a composition for inducing activation of dendritic cells and the use thereof, comprising astragaline galactoside glycoside as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은, 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체를 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 조성물 및 이의 용도를 제공하는데 있다.Still another object of the present invention is to provide a composition for enhancing immunity and use thereof, comprising astragall galactoside glycoside as an active ingredient.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다. However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problem, another task that is not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체를 유효성분으로 포함하는, 수지상 세포의 활성화 유도용 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention provides a composition for inducing activation of dendritic cells comprising astragaline galactoside glycoside represented by the formula (1) as an active ingredient.

[화학식 1][Formula 1]

(상기 화학식 1에서, n은 1 내지 5의 정수이다.) (In Formula 1, n is an integer of 1 to 5.)

본 발명의 일 구현예로서, 상기 수지상 세포는 CD80, CD86, 및 MHC 클래스 Ⅱ 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 표면 항원에 양성의 면역학적 특성을 나타내는 것일 수 있고, IL-6, IL-1β, TNF-α, IL-12p40로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인의 분비가 증가된 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the dendritic cells may exhibit positive immunological properties to any one or more surface antigens selected from the group consisting of CD80, CD86, and MHC class II molecules, IL-6, IL- The secretion of any one or more cytokines selected from the group consisting of 1β, TNF-α, IL-12p40 may be increased.

또한, 본 발명은 체외로 분리된 수지상 세포에 상기 수지상 세포의 활성화 유도용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 수지상 세포의 활성화 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for activating dendritic cells, comprising the step of treating the dendritic cells in vitro isolated dendritic cells with a composition for inducing activation of the dendritic cells.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체 또는 상기 배당체의 처리에 의해 활성화된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 조성물을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a composition for immuno-enhancing comprising astragalin galactoside glycoside represented by the formula (1) or dendritic cells activated by the treatment of the glycoside as an active ingredient.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 CD4⁺ T 세포 매개 면역을 활성화시킬 수 있다. In one embodiment of the present invention, the composition may activate CD4 ⁺ T cell mediated immunity.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체 또는 상기 배당체의 처리에 의해 활성화된 수지상 세포를 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 면역 증진방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for enhancing immunity comprising the step of treating astragalin galactoside glycoside represented by Formula 1 or dendritic cells activated by treatment of the glycoside to an individual.

본 발명에 따른 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체는, 기존의 아스트라갈린에서 거의 관찰되지 않았던, 수지상 세포 활성화 유도 효과를 나타내었을 뿐만 아니라, 상기 활성화된 수지상 세포는 CD4⁺ T 세포 특이적인 면역 반응을 유의적으로 향상시킬 수 있었는바, 상기 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체 또는 상기 배당체에 의해 활성화된 수지상 세포는 면역 증강제 또는 면역 조절제의 유효 성분으로 폭넓게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. Not only did the astragalin galactoside glycosides according to the present invention show a dendritic cell activation inducing effect, which was hardly observed in conventional astragalin, but the activated dendritic cells had a significant CD4 ⁺ T cell specific immune response. As can be improved, the astragalin galactoside glycosides or dendritic cells activated by the glycosides are expected to be widely used as active ingredients of immune enhancers or immunomodulators.

도 1은, 본 발명에 따른 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체에 의한 수지상 세포 표면 상 활성화 표지 분자의 발현의 증가를 확인한 결과이다.
도 2는, 본 발명에 따른 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체에 의한 수지상 세포의 면역 증가성 사이토카인의 분비 증가를 확인한 결과이다.
도 3은, 시험관 내에서, 본 발명에 따른 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체가 처리된 수지상 세포에 의한 CD4⁺ T 세포의 INF-γ 분비 증가를 확인한 결과이다.
도 4는, 생체 내에서, 본 발명에 따른 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체가 처리된 수지상 세포의 주입에 의한 림프절 CD4⁺ T 세포의 INF-γ 분비 증가를 확인한 결과이다.1 is a result confirming the increase in the expression of the activating label molecules on the dendritic cell surface by the astragalin galactoside glycosides according to the present invention.
2 is a result confirming the increased secretion of immune-increasing cytokines of dendritic cells by the astragalin galactoside glycosides according to the present invention.
Figure 3 shows in vitro, the increase in the secretion of INF-γ secretion of CD4 ⁺ T cells by dendritic cells treated with astragalin galactoside glycosides according to the present invention.
4 is a result confirming the increase of INF-γ secretion of lymph node CD4 ⁺ T cells by injection of dendritic cells treated with the astragalin galactoside glycoside according to the present invention in vivo.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체를 유효성분으로 포함하는, 수지상 세포의 활성화 유도용 조성물; 수지상 세포의 활성화를 유도하기 위한 상기 배당체의 의약적 용도; 및 상기 배당체를 개체에 처리하는 단계를 포함하는 수지상 세포의 활성화 방법을 제공한다. The present invention comprises an astragalin galactoside glycoside represented by Formula 1 as an active ingredient, a composition for inducing activation of dendritic cells; Medical use of said glycoside to induce activation of dendritic cells; And it provides a method for activating dendritic cells comprising the step of treating the glycosides to the subject.

[화학식 1][Formula 1]

본 명세서에서 사용되는 용어, "수지상 세포 (dendritic cell)"는 항원을 세포 내부로 흡수하고 이를 처리하여 항원 또는 항원으로부터 유래된 펩타이드를 MHC (major histocompatibility complex) 클래스 I 복합체 또는 MHC 클래스 Ⅱ 복합체와 함께 제시하는 전문적 항원 제시 세포 (professional antigen presenting cell)를 의미한다. As used herein, the term "dendritic cell" refers to the absorption of an antigen into a cell and processing the antigen to combine the antigen or peptide derived from the antigen with a major histocompatibility complex (MHC) class I complex or MHC class II complex. Refers to a professional antigen presenting cell.

본 명세서에서 사용되는 용어, "수지상 세포의 활성화"는 성숙 수지상 세포 (mature dendritic cells; "mDC")의 표현형의 일부 특성을 갖는 수지상 세포를 생성하는 것으로서, 부분적으로(partially) 또는 불완전하게(incompletely) 성숙된 형태 및 표현형적 특성을 나타내는 수지상 세포를 생성하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 활성화된 수지상 세포는 CD80, CD86, 및 MHC 클래스 Ⅱ 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 표면 항원에 양성의 면역학적 특성을 나타내고, IL-6, IL-1β, TNF-α, IL-12p40로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 사이토카인의 분비가 증가된 수지상 세포로 정의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. As used herein, the term "activation of dendritic cells" refers to the generation of dendritic cells having some characteristics of the phenotype of mature dendritic cells ("mDC"), which are partially or incompletely. ) To produce dendritic cells exhibiting mature morphology and phenotypic properties. Activated dendritic cells according to the present invention exhibit positive immunological properties to any one or more surface antigens selected from the group consisting of CD80, CD86, and MHC class II molecules, IL-6, IL-1β, TNF-α, One or more cytokines selected from the group consisting of IL-12p40 may be defined as an increased dendritic cells, but is not limited thereto.

본 명세서에서 사용되는 용어, "개체"는 수지상 세포의 활성화를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.As used herein, the term "individual" refers to a subject in need of activation of dendritic cells, more specifically human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, Mean mammals such as horses and cattle.

본 발명에 따른 아스트라갈린 (astragalin, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside)은 세 개의 페놀 고리 구조를 포함하는 플라보노이드 중 하나인 캠페롤 (kaempferol)에 글루코오스가 베타결합을 하고 있는 물질로서, 식물의 잎과 꽃에 분포되어 있으며 천연물 한방 소재 성분으로 알려져 있다. 아스트라갈린은 비교적 작은 분자량 (448.39g/mol)을 갖으며, 항산화능력 등의 효능을 가지는 것으로 알려져 있다. 그러나, 아스트라갈린은 수용성이 낮고 장내 흡수가 잘되지 않아 그 자체로는 식품이나 약제 등에 적용함에는 어려움이 있었다. 이러한 문제를 해결 위하여, 상기 화학식 1의 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체를 합성하였으며, 이의 생리적 활성을 평가하던 중, 예기치 않게 기존의 아스트라갈린에서는 관찰되지 않았던, 수지상 세포의 활성화 유도 효과를 새롭게 규명하였다는 점에서, 본 발명의 기술적 의의가 있다. Astragalin (astragalin, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside) according to the present invention is a substance in which glucose is beta-linked to kaempferol, which is one of flavonoids containing three phenol ring structures, It is distributed in the leaves and flowers of plants and is known as a natural herbal ingredient. Astragaline has a relatively small molecular weight (448.39 g / mol) and is known to have efficacy such as antioxidant activity. However, astragalin has low water solubility and poor intestinal absorption, which makes it difficult to apply to foods or drugs. In order to solve this problem, the astragalin galactoside glycoside of Formula 1 was synthesized, and while evaluating its physiological activity, unexpectedly not found in the conventional astragalin, a new induction of activation of dendritic cells was identified. In this respect, there is a technical significance of the present invention.

상기 아스트라갈린 배당체는 예컨데, 하기 화학식 2의 kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside일 수 있으나, 당업계의 기술 수준에 비추어 볼 때, 당업자는 상기 갈락토사이드 단위체의 수를 적의 변경하여 실시할 수 있는 것으로 이해할 수 있다. The astragalin glycoside may be, for example, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl- (1 → 6) -O-β-D-galactopyranosyl- (1 → 4) -β-D-galactopyranoside of Formula 2 below. However, in view of the state of the art, one skilled in the art can understand that can be carried out by appropriately changing the number of the galactoside units.

[화학식 2] [Formula 2]

한편, 본 발명의 수지상 세포의 활성화 유도용 조성물은 배지 조성물 또는 약학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다. Meanwhile, the composition for inducing activation of dendritic cells of the present invention may be provided in the form of a medium composition or a pharmaceutical composition.

상기 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체는 수지상 세포의 성숙, 활성화, 또는 분화 과정에서 사용될 수 있는 배지에 포함될 수 있다. The astragalin galactoside glycoside may be included in a medium that can be used in the process of maturation, activation, or differentiation of dendritic cells.

상기 배지로는 예를 들어, 혈청 (우태아 혈청, 말 혈청 또는 인간 혈청)이 함유된 배지, RPMI 시리즈 (예컨대, RPMI 1640), Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle), α-MEM, Iscove's MEM, 199 배지, CMRL 1066, F12, F10, DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium), DMEM과 F12의 혼합물, Way-mouth's MB752/1, McCoy's 5A 및 MCDB 시리즈를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 배지에는 다른 성분, 예를 들어, 항산화제 (예컨대, β-머캅토에탄올) 또는 항생제 (예컨대, 페니실린/스트렙토마이신) 등이 추가로 포함될 수 있다.The medium may be, for example, a medium containing serum (fetal calf serum, horse serum or human serum), RPMI series (e.g. RPMI 1640), Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle), α-MEM, Iscove's MEM, 199 medium, CMRL 1066, F12, F10, Dulbecco's modification of Eagle's medium (DMEM), mixtures of DMEM and F12, Way-mouth's MB752 / 1, McCoy's 5A and MCDB series. In addition, the medium may further include other components such as antioxidants (eg β-mercaptoethanol) or antibiotics (eg penicillin / streptomycin) and the like.

상기 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체는 수지상 세포의 활성화를 위한 약학적 조성물에 포함될 수 있다. The astragalin galactoside glycoside may be included in a pharmaceutical composition for activation of dendritic cells.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. The composition of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions. It may also be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like in the form of conventional formulations, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose , Microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. In formulating the composition, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level means the type, severity, and activity of the patient's disease. , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of the drug, and other factors well known in the medical arts. The pharmaceutical compositions according to the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

구체적으로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 1일 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 30 mg/kg의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 또는 수 회 나누어 투여할 수도 있다.Specifically, the effective amount of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on the age, sex, condition, weight of the patient, the absorption of the active ingredient in the body, the inactivation rate and excretion rate, the type of disease, the drug used in general It may be administered in an amount of 0.1 mg / kg to 100 mg / kg, preferably in an amount of 1 to 30 mg / kg per day, it may be administered once or several times a day.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by subcutaneous, intravenous, intramuscular or intrauterine dural or cerebrovascular injections. The pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug which is the active ingredient, along with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient and the severity of the disease.

또한, 본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 체외로 분리된 수지상 세포에 상기 수지상 세포 활성화 유도용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 수지상 세포의 활성화 방법을 제공한다. In addition, as an aspect of the present invention, the present invention provides a method for activating dendritic cells comprising the step of treating the dendritic cell activation inducing composition to the dendritic cells separated in vitro.

본 발명에 따른 수지상 세포의 활성화 방법은, 전술한 수지상 세포의 활성화 조성물에서 기술한 바 있는 기술적 구성을 이용하기 때문에 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.Since the method for activating dendritic cells according to the present invention utilizes the technical configuration described in the above-described activating composition of dendritic cells, the common contents between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification. .

또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체를 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 조성물; 체내 면역 증진을 위한 상기 배당체의 의약적 용도; 및 상기 배당체를 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 면역 증진 방법을 제공한다. In addition, as another embodiment of the present invention, the present invention comprises an astragalin galactoside glycoside represented by Formula 1 as an active ingredient, an immune enhancing composition; Medical use of said glycoside for enhancing immune system; And treating the glycoside with the subject.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 화학식 1로 표시되는 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체가 처리된 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는, 면역 증강용 조성물; 체내 면역 증진을 위한 상기 수지상 세포의 의약적 용도; 및 상기 수지상 세포를 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 면역 증진 방법을 제공한다. In addition, as another embodiment of the present invention, comprising a dendritic cell treated with the astragalin galactoside glycoside represented by Formula 1 as an active ingredient, an immune enhancing composition; Medicinal use of said dendritic cell for enhancing immunity in the body; And treating the dendritic cells with the subject.

본 발명에 따른 면역 증강용 조성물 등은, 전술한 수지상 세포의 활성화 조성물에서 기술한 바 있는 기술적 구성을 이용하기 때문에 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.Since the composition for enhancing immune system and the like according to the present invention use the technical configuration described in the above-described activating composition of dendritic cells, the common contents between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification. .

본 명세에서 사용되는 용어, "면역 증강" 또는 "면역 증진"은 초기 면역 반응을 유도하거나 항원에 대한 기존의 면역 반응을 측정 가능할 정도로 증가시키는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상, 상기 면역 증강 또는 증진은 CD4⁺ T 세포 매개 면역을 활성화시키는 것을 나타낼 수 있다. 본 발명에서는, 상기 화학식 1의 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체, 또는 상기 배당체가 처리된 수지상 세포는 CD4⁺ T 세포의 INF-γ 분비를 증가시키고, 이에 따라, Th1 세포 분화 유도만을 특이적으로 증진시킴을 새롭게 규명하였는바, 이러한 점에서 본 발명은 기술적 의의가 있다. As used herein, the term "immune boost" or "immune boost" means to induce an initial immune response or to increase measurably an existing immune response to an antigen, and for the purposes of the present invention, the immune boosting or Enhancement may indicate activating CD4 ⁺ T cell mediated immunity. In the present invention, the astragalin galactoside glycoside of Formula 1, or dendritic cells treated with the glycosides increases INF-γ secretion of CD4 ⁺ T cells, thereby specifically promoting only Th1 cell differentiation induction. As has been newly identified, in this respect the present invention has a technical significance.

한편, 본 발명의 면역 증강용 조성물은 약학적 조성물의 형태로 제공될 수 있으며, 보다 구체적으로, 면역 보강제 또는 백신의 형태로 제조될 수 있다. 이와 관련된 첨가물, 제형 등은 전술한 수지상 세포의 활성화 유도용 조성물에 기술한 바와 같다. On the other hand, the immune enhancing composition of the present invention may be provided in the form of a pharmaceutical composition, more specifically, may be prepared in the form of an adjuvant or vaccine. Additives, formulations, etc. related thereto are as described in the above composition for inducing activation of dendritic cells.

또한, 본 발명의 면역 증강용 조성물은 건강기능식품의 형태로 제공될 수 있다. 상기 건강기능식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드 (pharmafood), 건강보조식품, 뉴트라슈티칼 (nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다.In addition, the immune enhancing composition of the present invention may be provided in the form of health functional food. The health functional food is not particularly limited thereto, but may be all types of foods such as health functional foods, nutritional supplements, nutritional supplements, pharmafood, health supplements, nutraceutical, designer foods, and food additives. Preferably, meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products, including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes And so on.

본 발명의 건강기능식품은 식품제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어, 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.The dietary supplement of the present invention includes ingredients that are commonly added in food production, and include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents. Examples of the above carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like and xylitol, sorbitol, erythritol. As the flavoring agent, natural flavoring agents [tautin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used. In addition to the above, the food of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), dietary ingredients, flavoring agents such as synthetic and natural flavoring agents, coloring and neutralizing agents (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof. , Alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.

본 발명의 면역 증강용 조성물은 면역 증강을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.The immune enhancing composition of the present invention may be added to food or beverage for the purpose of immune boosting. At this time, the amount of the extract in the food or beverage is generally the health food composition of the present invention can be added to 0.01 to 15% by weight of the total food weight, the health beverage composition is 0.02 to 10 g, preferably based on 100 ml It can be added at a ratio of 0.3 to 1 g.

본 발명의 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적 (예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 추출물은, 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량부에 대하여 0.1 내지 70 중량부, 바람직하게는 2 내지 50 중량부 첨가될 수 있다. 상기 추출물의 유효 용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 기타 영양제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.The food composition of the present invention may be added as it is or used with other food or food compositions, and may be suitably used according to a conventional method. The mixed amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention, improvement or therapeutic treatment). Generally, the extract of the present invention may be added in an amount of 0.1 to 70 parts by weight, preferably 2 to 50 parts by weight, based on 100 parts by weight of the raw material of the food or beverage in the manufacture of the food or beverage. The effective dose of the extract may be used in accordance with the effective dose of the pharmaceutical composition, but may be less than the above range in the case of long-term intake for health and hygiene purposes or health control purposes, the active ingredient is safe It can be used in an amount above the above range because there is no problem in terms. There is no particular limitation on the kind of food. The food composition may be used in the form of oral preparations, such as tablets, hard or soft capsules, solutions, suspensions, etc., these preparations are acceptable carriers, for example, in the case of oral preparations, excipients, Examples of binders, disintegrants, glidants, solubilizers, and foods to which the extract can be added include dairy products including meat, sausages, breads, chocolates, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums and ice creams. Products, various soups, beverages, teas, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, and other nutritional agents, but are not limited to these types of food.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 배당체를 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.In addition to containing the glycoside as an essential ingredient in the indicated ratio, the health beverage composition of the present invention is not particularly limited in the liquid component, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks. Examples of the above-mentioned natural carbohydrates are conventional monosaccharides such as disaccharides such as glucose and fructose, such as maltose, sucrose and the like, and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like. Sugars and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. As flavoring agents other than those mentioned above, natural flavoring agents (tauumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. The proportion of said natural carbohydrates is generally about 1-20 g, preferably about 5-12 g per 100 ml of the composition of the present invention.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.In addition to the above, the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and its Salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like. The compositions of the present invention may also contain pulp for the production of natural fruit juices and fruit juice beverages and vegetable beverages. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical but is generally selected in the range of 0.1 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.

이하의 실시예에서는, 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체를 생쥐 골수에서 분리한 수지상 세포에 처리하여, 수지상 세포 활성화 유발, 및 이의 활성화에 기여하는 세포 내 신호전달 체계를 개시한다. 수지상 세포 활성화는 전술한 바와 같이, 세포 표면 활성화 표지 인자들의 발현 증가, 및/또는 면역 증가성 사이토카인 증가로 정의되며, T 세포 분화 활성화는 T 세포에서 분비하는 사이토카인의 증가로 정의된다. 또한, 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체가 처리된 수지상 세포가 투여된 생쥐의 면역 기관에서, T 세포 분화의 활성화를 실험적으로 증명하였다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.In the following examples, astragalin galactoside glycosides are treated to dendritic cells isolated from mouse bone marrow to disclose intracellular signaling systems that induce dendritic cell activation and contribute to its activation. Dendritic cell activation is defined as an increase in expression of cell surface activation markers, and / or an increase in immunogenic cytokines, as described above, and T cell differentiation activation is defined as an increase in cytokines secreted by T cells. In addition, activation of T cell differentiation was experimentally demonstrated in the immune organs of mice to which dendritic cells treated with astragalin galactoside glycosides were administered. However, the following examples are merely provided to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

[[ 실험예Experimental Example ]]

실험예Experimental Example 1. 실험재료 및 실험 방법 1. Experimental Materials and Experimental Methods

1-1.1-1. 아스트라갈린 Astragaline 갈락토사이드Galactoside 배당체의 제조 Preparation of Glycosides

아스트라갈린 4.45g, 유당 27.38g, 및 바실러스 서큘런스 (Bacillus circulans)에서 유래한 락타아제 600 단위 (효소활성 단위)가 포함된 인산칼륨 버퍼 (pH 6.0, 용액 중 농도 20mM) 효소혼합 수용액 200ml를 제조하였다. 상기 효소혼합 수용액을 60℃에서 16시간 동안 중탕으로 반응시켜서 배당체, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(16)-O-β-D-glactopyranoside을 수득하였다 (상기 화학식 2 참조, 이하에서는 상기 배당체를 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체 또는 수용성 아스트라갈린 배당체로 명명함.).200 ml of potassium phosphate buffer (pH 6.0, 20 mM concentration in solution) containing 4.45 g of astragaline, 27.38 g of lactose, and 600 units of lactase derived from Bacillus circulans (enzyme-active unit) were prepared. . The aqueous solution of enzyme mixture was reacted in a bath at 60 ° C. for 16 hours to obtain a glycoside, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl- (16) -O-β-D-glactopyranoside (see Formula 2, below). In the above, the glycosides are referred to as astragalin galactoside glycosides or water-soluble astragaline glycosides.).

1-2. 시험관 내 수지상 세포 활성화 표지 인자 측정1-2. In Vitro Dendritic Cell Activation Marker Determination

분리된 수지상 세포는 10 내지 100μM의 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체가 첨가된 48-웰 플레이트에서 5 × 10⁵cells/well로 배양되었다. 음성 대조군으로 배지만 첨가된 군, 양성 대조군으로 리포폴리사카라이드 (LPS, lipopolysaccharide) 처리군을 사용하였고, 비교군으로는 100uM의 아스트라갈린을 사용하였다. 상기의 배양을 18시간 진행한 후, MHCII, CD80, CD86 발현 정도를 유세포분석법으로 확인하였다.Isolated dendritic cells were incubated at 5 × 10 ⁵ cells / well in 48-well plates to which 10-100 μM of astragalin galactoside glycosides were added. Lipopolysaccharide (LPS, lipopolysaccharide) treated group was used as a negative control group, and a positive control group, and 100 μM of astragalin was used as a comparative group. After 18 hours of incubation, MHCII, CD80, and CD86 expression levels were confirmed by flow cytometry.

1-3. 시험관 내 또는 생체 내 T 세포 분화 표지 인자 측정1-3. Determination of T cell differentiation marker factors in vitro or in vivo

분리된 수지상 세포는 24-웰 플레이트에서 5 × 10⁴ cells/ well로 배양되었고, 공생 배양을 위하여 ovabulin (OVA)으로 2시간 동안 pulse하였다. 이와 함께 상기 수지상 세포에 50-200uM의 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체를 6시간 동안 처리하였다. 음성 대조군으로 배지만 첨가된 군, 양성 대조군으로 리포폴리사카라이드 (LPS, lipopolysaccharide) 처리군을 사용하였다. 시험관 내 실험의 경우, 분리된 OT-II T 세포와 72시간 동안 공생 배양을 실시하였다. 생체 내 실험의 경우에는, OT-II 생쥐의 발바닥에 피하 주사로 상기 배양된 각각의 수지상 세포를 주사한 뒤, 이로부터 1주일 후, 발바닥 근처 림프절을 채취하여 72시간 동안 OVA와 함께 배양을 하였다. 림프절 세포 중 CD4 발현 T 세포를 형광 항체로 표지하고, IFN-γ, IL-4 그리고 IL-17 발현 정도를 유세포 분석법으로 확인하였다.The isolated dendritic cells were incubated at 5 × 10 ⁴ cells / well in 24-well plates and pulsed with ovabulin (OVA) for 2 hours for symbiotic culture. In addition, the dendritic cells were treated with 50-200 uM of astragalin galactoside glycoside for 6 hours. As a negative control, only the medium added, and as a positive control lipopolysaccharide (LPS, lipopolysaccharide) treated group was used. For in vitro experiments, commensal culture was performed for 72 hours with isolated OT-II T cells. In the case of in vivo experiments, each dendritic cell was cultured by subcutaneous injection into the sole of the OT-II mouse, and one week thereafter, lymph nodes near the sole of the foot were collected and incubated with OVA for 72 hours. . CD4 expressing T cells in lymph node cells were labeled with fluorescent antibodies, and IFN-γ, IL-4 and IL-17 expression levels were confirmed by flow cytometry.

1-4. 1-4. 역전사Reverse transcription 중합효소연쇄반응Polymerase Chain Reaction

분리된 수지상 세포는 24-웰 플레이트에서 1.5 × 10⁶ cells/well로 6시간 배양되었고, 여기에, 10-100uM의 아스트라갈린 갈락토사이드 배당체가 처리되었다. 음성 대조군으로 배지만 첨가된 군, 양성 대조군으로 리포폴리사카라이드 (LPS, lipopolysaccharide) 처리군을 사용하였다. 상기 배양된 수지상 세포로부터 RNA를 분리하여 역전사 반응으로 cDNA가 획득되었다. 사이토카인들의 발현 정도를 측정하기 위해 획득된 cDNA를 주형 (template)으로 사용하고, 각각 IL-6 프라이머(sense, 5`-TGAACAACGATGATGCACTT; anti-sense, 5`- ACATTCGAGGCTCCAGTGAA-3`), IL-1β 프라이머(sense, 5`-CTAAAGTATGGGCTGGACTG-3`; anti-sense, 5`-GGCAGGTCTACTTTGGAGTC), TNF-α 프라이머(sense, 5`-GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTG-3`; anti-sense, 5`-ACATTCGAGGCTCCAGTGAA-3`), IL-12p40 프라이머(sense, 5`-TTATGC AAATTGTGAGCTTG-3`; anti-sense, 5`-AGCTTCTTCATGTCTCCAAA-3`), GAPDH 프라이머(sense, 5`-ACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3`; anti-sense, 5`-ATTCAAGAGAGTAGGGAGGG-3`)를 이용해 중합효소연쇄반응으로 사이토카인들의 mRNA 발현을 비교하였다.The isolated dendritic cells were incubated for 6 hours at 1.5 x 10 ⁶ cells / well in 24-well plates, and treated with 10-100 uM of astragalin galactoside glycosides. As a negative control, only the medium added, and as a positive control lipopolysaccharide (LPS, lipopolysaccharide) treated group was used. RNA was isolated from the cultured dendritic cells to obtain cDNA by reverse transcription. The obtained cDNA was used as a template to measure the expression level of cytokines, and IL-6 primers (sense, 5`-TGAACAACGATGATGCACTT; anti-sense, 5`- ACATTCGAGGCTCCAGTGAA-3`) and IL-1β, respectively. Primer (sense, 5`-CTAAAGTATGGGCTGGACTG-3`; anti-sense, 5`-GGCAGGTCTACTTTGGAGTC), TNF-α primer (sense, 5`-GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTG-3`; anti-sense, 5`-ACATTCGAGGCTCCAGTGAA-3`), IL-12p40 primer (sense, 5`-TTATGC AAATTGTGAGCTTG-3`; anti-sense, 5`-AGCTTCTTCATGTCTCCAAA-3`), GAPDH primer (sense, 5`-ACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3`; anti-sense, 5`-ATTCAAGAGAGTAGGGAGGG -3`) mRNA expression of cytokines was compared by polymerase chain reaction.

1-5. 효소면역측정법1-5. Enzyme immunoassay

분리된 세포의 상층액을 샌드위치 엘라이자 (ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay)기법으로 cytokine의 정량을 수행하였다. 플레이트 표면에 코팅 항체를 붙인 후 blocking buffer를 통해 비특이적 결합을 막았다. 세포의 상층액과 control로 쓰일 standard 재조합 단백질을 넣은 후 biotin 항체를 붙여 진행을 하였다. 이어서, HRP와 OPD 과정을 거친 뒤, 여기에 황산을 첨가하여 이에 따른 발색을 비교하였다.Supernatants of the isolated cells were quantified by cytokine using a sandwich ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) technique. After attaching the coating antibody to the surface of the plate to prevent non-specific binding through the blocking buffer. After adding the standard recombinant protein to be used as a supernatant of the cell and the control, the biotin antibody was attached. Subsequently, after HRP and OPD, sulfuric acid was added thereto to compare the color development.

1-6. 1-6. 유세포Flow cell 분석 analysis

세포 표면 분자의 경우, FACS 완충액에 단일세포 혼탁액을 준비하고 형광 항체를 1/500 비율로 첨가해 상온에서 15분 동안 염색하였다. 세포 내부 염색이 필요한 경우, 세포 표면 분자 염색 후 세포 고정 및 세포막 투과화 (permeabilization)를 Cytofic/Cytoperm과 Perm/Wash solution (BD Bioscience, San Diego, CA)을 이용해 진행하였다. 이어서, 형광 항체를 1/500 비율로 첨가해 4℃에서 1시간 동안 염색하였다. 유세포 분석은 FACSaccuri (BD Biosceince)를 이용하여 수행되었다.For cell surface molecules, single cell suspensions were prepared in FACS buffer and fluorescent antibodies were added at a 1/500 ratio and stained at room temperature for 15 minutes. When intracellular staining was required, cell fixation and cell membrane permeabilization were performed using Cytofic / Cytoperm and Perm / Wash solution (BD Bioscience, San Diego, CA). Subsequently, fluorescent antibodies were added at a 1/500 ratio and stained at 4 ° C. for 1 hour. Flow cytometry was performed using FACSaccuri (BD Biosceince).

1-7. 통계적 분석1-7. Statistical analysis

대조군과 실험군의 차이는 paired Students`s t-test에 의해서 평가되었으며, P-values < 0.05 인 경우, 그 결과가 유의한 것으로 판단하였다.The difference between the control group and the experimental group was evaluated by paired students`s t- test, and the result was considered to be significant when P-values <0.05.

[[ 실시예Example ]]

실시예Example 1. 수지상 세포 1. Dendritic Cells 표면 상의On the surface 활성화 표지 분자의 발현 증가 Increased expression of activating marker molecules

본 실시예에서는, 수지상 세포에 대한 수용성 아스트라갈린 배당체의 작용을 확인하기 위하여, 생쥐의 골수에서 수지상 세포를 분리하고, 100ng/ml LPS, 100uM의 아스트라갈린 (A0)과 100uM의 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)을 처리하였다 (도 1). 구체적으로, 상기 수지상 세포를 총 7일간 배양을 하였으며, 3 일째와 5 일째에 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 첨가하였고 7 일째에 아스트라갈린과 수용성 아스트라갈린 배당체를 각각 100uM 농도로 처리하였다. 100uM의 아스트라갈린과 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)를 처리하고 18 시간 후, 수지상 세포 표면의 CD11c^hi MHCII, CD80, CD86 발현을 유세포 분석으로 확인한 결과 (도 1의 A, B), 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)에 의해 수지상 세포 활성화 표지 분자인 MHCII, CD80, CD86이 유의적으로 증가함을 알 수 있었다 (3회 반복실험 결과, ^* P<0.01, 미처리군에 대하여). 또한, 수지상 세포에 10, 50, 100μM 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)를 처리하고 18 시간 후에 활성화된 CD11c^hi MHCII, CD80, CD86 수지상 세포 비율을 확인한 결과 (도 1의 C, D), 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)에 의해 농도 의존적으로 활성화된 수지상 세포의 비율이 증가함을 확인할 수 있었다 (3회 반복실험 결과, ^* P<0.01, 미처리군에 대하여). 특히, 수지상 세포 활성화를 유발하는 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)의 효과는, 아스트라갈린 (A0)에서 전혀 관찰되지 않았는바, 수용성 아스트라갈린 배당체로 변형이 되었을 때만 관찰되는 상기 배당체 고유의 효과임을 확인할 수 있었다.In this example, in order to confirm the action of water-soluble astragalin glycosides on dendritic cells, dendritic cells were isolated from bone marrow of mice, 100ng / ml LPS, 100uM of astragalin (A0) and 100uM of water-soluble astragalin glycosides ( A2) was treated (FIG. 1). Specifically, the dendritic cells were cultured for 7 days, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) was added on day 3 and day 5 and treated with astragalin and water-soluble astragalin glycoside at 100 uM concentration on day 7 respectively. It was. 18 hours after treatment with 100 uM of astragalin and water-soluble astragalin glycoside (A2), CD11c ^hi on the dendritic cell surface MHCII, CD80, CD86 expression was confirmed by flow cytometry (A, B in Fig. 1), the water-soluble astragallin glycosides (A2) showed a significant increase in dendritic cell activation marker molecules MHCII, CD80, CD86 It was (3 times repeated experiments, ^* P <0.01, relative to the untreated group). In addition, CD11c ^hi activated after 18 hours of treatment with 10, 50, and 100 μM water soluble astragalin glycosides (A2) in dendritic cells. As a result of confirming the ratio of MHCII, CD80, and CD86 dendritic cells (C, D of FIG. 1), it was confirmed that the proportion of dendritic cells activated in concentration-dependent manner by the water-soluble astragalin glycoside (A2) was increased (3 replicates). Results, ^* P <0.01, for untreated group). In particular, the effect of water-soluble astragalin glycosides (A2) that induces dendritic cell activation was not observed at all in the astragalin (A0), it can be confirmed that the effect is unique to the glycosides observed only when transformed into water-soluble astragalin glycosides there was.

실시예Example 2. 수지상 세포의 면역 2. Immunity of Dendritic Cells 증가성Incremental 사이토카인의 분비 증가 Increased secretion of cytokines

수지상 세포의 활성화가 진행되면, 상기 수지상 세포는 면역 반응과 관련된 면역 증가성 사이토카인들을 분비하는 것으로 알려져 있다. 상기 실시예 1에서는 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)가 수지상 세포를 활성화를 유도할 수 있음을 확인하였는바, 본 실시예에서는 상기 수지상 세포가 분비하는 면역 증가성 사이토카인의 양을 비교 분석하였다. 수지상 세포를 100ng/ml LPS, 10, 50, 100uM의 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)로 각각 처리하였다. 6시간 배양 후, 사이토카인의 발현을 역전사 중합효소연쇄반응으로 측정한 결과 (도 2의 A, B), 수용성 아스트라갈린 배당체 처리군 (A2)에서 면역 증가성 사이토카인인 IL-6, IL-1β, TNF-α, IL-12p40의 mRNA 발현이 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다 (3회 반복실험 결과, ^* P<0.01, 미처리군에 대하여). 또한, 효소면역측정법으로 IL-12p40과 IL-12p70의 단백질 정량이 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)의 농도 의존적으로 이들의 양이 증가함을 확인할 수 있었다 (3회 반복실험 결과, ^* P<0.01, 미처리군에 대하여).As activation of dendritic cells progresses, the dendritic cells are known to secrete immune potent cytokines associated with immune responses. In Example 1, it was confirmed that the water-soluble astragalin glycoside (A2) can induce activation of dendritic cells. In this example, the amount of immune-increasing cytokines secreted by the dendritic cells was compared and analyzed. Dendritic cells were treated with 100 ng / ml LPS, 10, 50, and 100 uM of water soluble astragalin glycosides (A2), respectively. After 6 hours of incubation, the expression of cytokines was measured by reverse transcriptase polymerase chain reaction (A and B in Fig. 2). As a result, the immune-increasing cytokines IL-6 and IL- were treated in the water-soluble astragaline glycoside treatment group (A2). It was confirmed that mRNA expression of 1β, TNF-α, IL-12p40 increased in a concentration-dependent manner (three replicates, ^* P <0.01, for the untreated group). In addition, the enzyme immunoassay showed that the protein quantification of IL-12p40 and IL-12p70 increased their amount depending on the concentration of water-soluble astragalin glycoside (A2) (3 repeats, ^* P <0.01, For the untreated group).

실시예Example 3. 수용성 아스트라갈린 배당체가 처리된 수지상 세포에 의한 CD4 3. CD4 by Dendritic Cells Treated with Water Soluble Astragaline Glycosides ^{+ +} T 세포의 T cell INFINF -γ 분비 증가 (in vitro)increased γ secretion (in vitro)

본 실시예에서, 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)가 수지상 세포 활성화를 유도하는 경우, T 세포의 분화 역시 촉진되는지 확인하고자 하였다. 이를 위하여, OVA를 pulse하고, 50, 100, 200uM 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2) 또는 100 ng/ml LPS가 처리된 수지상 세포를 OT-II 생쥐에서 분리한 CD4 양성 T 세포와 공생 배양하였다. 72 시간 배양 후, T 세포의 분화 정도를 유세포 분석와 효소면역측정법으로 측정한 결과 (도 3), 수용성 아스트라갈린 배당체 처리군 (A2)에서 농도 의존적으로 INF-γ가 유도되는 것을 확인할 수 있었다 (3회 반복실험 결과, ^* P<0.01, ^** P<0.05, ^*** P<0.001 미처리군에 대하여). 반면, IL-4와 IL-17는 변화가 없었다. 즉, 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)로 활성화된 수지상 세포는 Th1 세포를 특이적으로 유도함을 확인할 수 있었다.In this example, when the water-soluble astragalin glycoside (A2) induces dendritic cell activation, it was intended to determine whether the differentiation of T cells is also promoted. To this end, OVA was pulsed and dendritic cells treated with 50, 100, 200 uM water-soluble astragalin glycoside (A2) or 100 ng / ml LPS were co-cultured with CD4 positive T cells isolated from OT-II mice. After 72 hours of cultivation, the degree of differentiation of T cells was measured by flow cytometry and enzyme immunoassay (FIG. 3). As a result, it was confirmed that INF-γ was induced in a concentration-dependent manner in the water-soluble astragalin glycoside treatment group (A2) (3 Repeated results, ^* P <0.01, ^** P <0.05, ^{*** for} P <0.001 untreated group). In contrast, IL-4 and IL-17 did not change. That is, it was confirmed that the dendritic cells activated with the water-soluble astragalin glycoside (A2) specifically induced Th1 cells.

실시예Example 4. 수용성 아스트라갈린 배당체가 처리된 수지상 세포 주입에 의한 림프절 CD4 4. Lymph Node CD4 by Dendritic Cell Injection Treated with Water-soluble Astragalin Glycosides ⁺⁺ T 세포의 T cell INFINF -γ 분비 증가 (in increased γ secretion (in vivovivo ))

본 실시예에서는, 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)에 의해 활성화된 수지상 세포가 생체 내에서도 T 세포 분화 유도 효과를 갖는지 확인하고자 하였다.In this example, it was intended to confirm whether dendritic cells activated by the water-soluble astragalin glycoside (A2) have a T cell differentiation induction effect in vivo.

이를 위하여, OVA를 pulse하고 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)가 처리된 수지상 세포를 OT-II 생쥐의 발바닥에 피하 주사하고 림프절에서 T 세포 분화 반응을 확인하였다. 수지상 세포 주입 1주 후 림프절을 분리하여 72시간 배양하여 CD4 양성 T 세포의 분화 정도를 유세포 분석과 효소면역측정법으로 측정하였다. 그 결과 (도 4), INF-γ 생성이 증가함을 확인할 수 있었지만 IL-4와 IL-17은 변화가 없음을 알 수 있었다 (3회 반복실험 결과, ^* P<0.01, 미처리군에 대하여). 즉, 생체 내 실험에서도 역시, 수용성 아스트라갈린 배당체 (A2)에 의해 활성화된 수지상 세포는 Th1 세포 분화 유도만 증진시킴을 확인하였다.To this end, dendritic cells treated with OVA pulsed and soluble astragalin glycosides (A2) were injected subcutaneously into the soles of OT-II mice, and T cell differentiation was confirmed in lymph nodes. One week after injection of dendritic cells, lymph nodes were isolated and cultured for 72 hours. Differentiation of CD4 positive T cells was measured by flow cytometry and enzyme immunoassay. As a result (FIG. 4), it was confirmed that INF-γ production was increased, but IL-4 and IL-17 were found to be unchanged (3 times of repeated experiments, ^* P <0.01, for the untreated group) . In other words, in vivo experiments, it was also confirmed that dendritic cells activated by the water-soluble astragalin glycoside (A2) only enhanced the induction of Th1 cell differentiation.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The foregoing description of the present invention is intended for illustration, and it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be easily modified in other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are exemplary in all respects and not restrictive.

Claims

delete

A method for activating dendritic cells, comprising: treating a dendritic cell isolated in vitro with an astragalin galactoside glycoside represented by Formula 2 below.
[Formula 2]

Comprising an astragalin galactoside glycoside represented by the formula (2) as an active ingredient, an immune enhancing composition.
[Formula 2]

delete

The composition of claim 6, wherein the composition activates CD4 ⁺ T cell mediated immunity.

An immune enhancing composition comprising the activated dendritic cells according to claim 5.

The composition of claim 9, wherein the composition activates CD4 ⁺ T cell mediated immunity.