JP2021020933A - 心血管病を予防及び治療するための新しい方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】心血管病、特に糖尿病によって引き起こされる心血管病を治療及び/または解消する方法の提供。【解決手段】プラスミノゲンまたはプラスミンを投与する。プラスミノゲンは単独で投与することができ、抗心血管薬、抗糖尿病薬、抗血栓薬、抗感染薬、抗不整脈薬、高脂血症治療薬などの、他の薬物と組み合わせて使用することもできる。【選択図】なし
Description
本発明は心血管病、特に糖尿病によって引き起こされる心血管病の治療及び/解消におけるプラスミノゲンの作用に係り、さらには心血管病を治療し、特に糖尿病によって引き起こされる心血管病及びその関連疾患の治療に対して全く新しい治療ステラテジーを提供するものである。
「心血管病」とは心血管系に組織学及び機能変化が生じる病変であり、よく大血管及び微小血管の病変によって引き起こされる心臓の変化をその主な表れとする。臨床的には心電図の異常、心臓の拡張、不整脈、狭心症、無痛性心筋梗塞、心不全が見られる。現在、糖尿病は心血管病が発生する高リスク要因及び予測指標であり、且つ糖尿病合併心血管病の患者の短期または長期的予後はいずれも糖尿病のない患者とは違いを見せている。
「糖尿病」は複数の遺伝及び環境要因が共同作用することで起こるインスリンの分泌減少またはインスリンの作用欠陥によって起きる体内の糖質、タンパク質、脂肪、水及び電解質の代謝の乱れによる内分泌、代謝症候群である。それは慢性血糖上昇を特徴とし、病気が長引くと複数の臓器系に慢性合併症を引き起こし、そのうち心血管病は糖尿病の主な合併症である。
「糖尿病性心血管病」とは糖尿病によって引き起こされる心血管系に組織学及び機能変化が起きる病変であり、最もよく見られる糖尿病合併症の一つである。糖尿病性心血管病という糖尿病合併症は危害が大きく、よく大血管及び微小血管病変によって引き起こされる心臓の変化を主な表れとする。臨床的には心電図異常、心臓の拡張、不整脈、狭心症、無痛性心筋梗塞、心不全が見られる。統計によれば、約70−80%の糖尿病患者は最終的に心血管合併症で死亡することになる。糖尿病患者においてアテローム性動脈硬化、高血圧、急性心筋梗塞、慢性心不全及び突然死の発生率が明らかに増加している。現在において、糖尿病は心血管病が発生する高リスク要因及び予測指標であり、且つ糖尿病合併心血管病の患者の短期また長期的予後はいずれも糖尿病のない患者とは違いを見せる。
プラスミンはプラスミノゲン活性化系(PA系)の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外マトリックス(ECM)の幾つかの成分を加水分解することができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む(非特許文献1)。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテアーゼ(pro−MMP)を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である(非特許文献2,3)。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のPA:組織型プラスミノゲン活性化剤(tPA)またはウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤(uPA)をタンパク質加水分解することで形成されるものである。プラスミノゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはPA系の調節は主にPAの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。PA系成分の合成は異なる要素によって厳格な調節を受け、例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、この他に、プラスミンとPAの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα2−抗プラスミン(α2−antiplasmin)である。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるuPA特異性細胞表面受容体(uPAR)(非特許文献4、5)がある。
プラスミノゲン(plasminogen,plg)は単一鎖の糖タンパクであり、7
91個のアミノ酸からなり、分子量は約92kDaである(非特許文献6、7)。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約2μMである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的なソースである(引用文献8、9参照)。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する:グルタミン酸−プラスミノゲン(Glu−plasminogen)及びリジン−プラスミノゲン(Lys−plasminogen)である。天然的に分泌され及び分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端(N−末端)グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸−プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸−プラスミノゲンはLys76−Lys77においてリジン−プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸−プラスミノゲンと比較して、リジン−プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でPAによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのArg560−Val561ペプチド結合はuPAまたはtPAによって切断され、これによりジスルフィド結合によって接続された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす(非特許文献10)。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの同源トリクル環を含み、即ちいわゆるkringleであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のKringleはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α2−APの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたのは38kDaのフィブリンプラスミノゲンフラグメントであり、kringlel−4を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントは血管阻害剤と命名され、幾つかのプロテアーゼ加水分解プラスミノゲンから生成される。
91個のアミノ酸からなり、分子量は約92kDaである(非特許文献6、7)。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約2μMである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的なソースである(引用文献8、9参照)。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する:グルタミン酸−プラスミノゲン(Glu−plasminogen)及びリジン−プラスミノゲン(Lys−plasminogen)である。天然的に分泌され及び分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端(N−末端)グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸−プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸−プラスミノゲンはLys76−Lys77においてリジン−プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸−プラスミノゲンと比較して、リジン−プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でPAによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのArg560−Val561ペプチド結合はuPAまたはtPAによって切断され、これによりジスルフィド結合によって接続された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす(非特許文献10)。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの同源トリクル環を含み、即ちいわゆるkringleであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のKringleはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α2−APの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたのは38kDaのフィブリンプラスミノゲンフラグメントであり、kringlel−4を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントは血管阻害剤と命名され、幾つかのプロテアーゼ加水分解プラスミノゲンから生成される。
プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理性血栓の形成を予防するキーポイントである(非特許文献11)。プラスミンはさらにECMの幾つかの成分に対する基質特異性を有し、これらはラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含み、これはプラスミンがECM再建において重要な作用を有することを示している(非特許文献7、12、13)。間接的に、プラスミンはさらにいくつかのプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりECMのその他の成分を分解し、MMP−1、MMP−2、MMP−3及びMMP−9を含む。そのため、以下のように提唱する人がいる。プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子である(非特許文献14)。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する(非特許文献15−17)。体外において、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。
現在、糖尿病心血管合併症を治療する方法は主に血糖の制御、血中脂質の低下、血圧制御等を含む。
我々の研究は意外にも以下について見出した。プラスミノゲンは糖尿病による心臓、血管壁の損傷に対して明らかな修復作用を有し、さらに微小血栓の溶解を促進でき、糖尿病によってもたらされる内臓器官、例えば腎臓、肝臓、網膜の損傷の修復、損傷神経の感知機能の回復をさせることができ、糖尿病合併症、例えば糖尿病性心血管病に対して全く新しい治療ステラテジーを提供する。
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一方で、本発明は被験者の血管病変、特に糖尿病性血管病変を予防及び/または治療する方法に係り、被験者に有効量のプラスミノゲンまたはプラスミンを投与することを含む。一方において、本発明はプラスミノゲンまたはプラスミンの被験者血管病変、特に糖尿病性血管病変の予防及び/または治療における用途に係り、被験者に対して有効量のプラスミノゲンまたはプラスミンを投与することを含む。
一つの実施形態において、前記血管病変は糖尿病性血管病変であり、特に糖尿病性大血管病変、小血管病変及び/または糖尿病性微小血管病変である。一つの実施形態において、前記血管病変はアテローム性動脈硬化を含み、主動脈及び内臓臓器のアテローム性動脈硬化を含み、特に糖尿病によってもたらされるアテローム性動脈硬化であり、主動脈及び内臓臓器のアテローム性動脈硬化を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性微小血管病変は微小循環の機能の改変、血管壁の損傷、微小血栓形成及び/または微小血管閉塞を含む。本発明はさらに被験者の心血管病、特に糖尿病性心血管病を予防及び/または治療する方法に係り、被験者に有効量のプラスミノゲンまたはプラスミンを投与することを含む。一つの実施形態において、前記心血管病は糖尿病性心血管病、心臓肥大、心機能不全、不整脈、狭心症、無痛性心筋梗塞、心不全を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性心血管病は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管病変によってもたらされるものである。
前記実施形態において、前記被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンが低下している。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び/または局所的なものである。
一つの実施形態において、本発明の心血管病は以下を含むが、これらは限られない。即ち、糖尿病性心血管病、高脂血症、アテローム性動脈硬化、高血圧、冠状動脈症、狭心症、心筋梗塞、冠状動脈血液供給不足、胸部圧迫感、動悸、息切れ、不整脈、心不全などである。
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列2、6、8、10または12は少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一
性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列2、6、8、10または12に基づいて、1−100、1−90、1−80、1−70、1−60、1−50、1−45、1−40、1−35、1−30、1−25、1−20、1−15、1−10、1−5、1−4、1−3、1−2、1個のアミノ酸を追加、削除及び/または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはGlu−プラスミノゲン、Lys−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的(conservative)な置換バリアントである:Glu−プラスミノゲン、Lys−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列2が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列2、6、8、10または12に示される通りである。
性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列2、6、8、10または12に基づいて、1−100、1−90、1−80、1−70、1−60、1−50、1−45、1−40、1−35、1−30、1−25、1−20、1−15、1−10、1−5、1−4、1−3、1−2、1個のアミノ酸を追加、削除及び/または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはGlu−プラスミノゲン、Lys−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的(conservative)な置換バリアントである:Glu−プラスミノゲン、Lys−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列2が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列2、6、8、10または12に示される通りである。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは全身または局所投与によって治療が行われ、好ましくは以下の経路により投与される:静脈内、筋肉内、皮下、吸入によりプラスミンを投与する。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日0.0001−2000mg/kg、0.001−800mg/kg、0.01−600mg/kg、0.1−400mg/kg、1−200mg/kg、1−100mg/kg、10−100mg/kg(体重一キロあたりで計算)または0.0001−2000mg/cm2、0.001−800mg/cm2、0.01−600mg/cm2、0.1−400mg/cm2、1−200mg/cm2、1−100mg/cm2、10−100mg/cm2(体表面積平方センチメートルあたりで計算)の用量で投与され、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
前記プラスミノゲンは単独で投与することができ、他の薬物と組み合わせて使用することもできる。前記他の薬物は以下を含むがこれらに限られない。即ち:抗心血管薬、抗糖尿病薬、抗血栓薬、抗感染薬、抗不整脈薬、高脂血症治療薬などである。
もう一方において、本発明はプラスミノゲンまたはプラスミンの被験者の血管病変、特に糖尿病性血管病変を予防及び/または治療する薬物の製造における用途に係る。一方において、本発明はさらに製薬方法に係り、プラスミノゲンまたはプラスミンを薬学的に許容できる担体と共に被験者の血管病変、特に糖尿病性血管病変を予防及び/または治療する薬物に製造することに係る。
一つの実施形態において、前記血管病変は糖尿病性血管病変であり、特に糖尿病性大血管病変、小血管病変及び/または糖尿病性微小血管病変である。一つの実施形態において、前記血管病変はアテローム性動脈硬化を含み、特に糖尿病によってもたらされるアテローム性動脈硬化であり、主動脈及び内臓臓器のアテローム性動脈硬化を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性微小血管病変は微小循環機能改変、血管壁の損傷、微小血栓形成及び/または微小血管閉塞を含む。
本発明はプラスミノゲンまたはプラスミンの被験者心血管病、特に糖尿病性心血管病を予防及び/または治療する心血管病の薬物における用途に係る。一つの実施形態において、前記心血管病は糖尿病性心血管病、心臓肥大、心機能不全、不整脈、狭心症、無痛性心筋梗塞、心不全を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性心血管病は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管病変がもたらすものである。
前記技術構成において、前記被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンは低下している。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び/または局所的なものである。
一つの実施形態において、本発明の心血管病は以下を含むが、これらは限られない。即ち、糖尿病性心血管病、高脂血症、アテローム性動脈硬化、高血圧、冠状動脈症、狭心症、心筋梗塞、冠状動脈の血液供給不足、胸部圧迫感、動悸、息切れ、不整脈、心不全などである。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは全身または局所投与によって投与され、好ましくは以下の経路により投与される:静脈内、筋肉内、皮下、吸入によりプラスミンを投与することで治療を行う。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは全身または局所投与によって治療が行われ、好ましくは以下の経路により投与される:プラスミノゲンを静脈内、筋肉内、皮下、吸入により投与される。
前記プラスミノゲンは単独で使用することができ、他の薬物と組み合わせて使用することもでき、前記他の薬物は以下を含むがこれらに限られない:抗心血管病薬、抗糖尿病薬、抗血栓薬、抗感染薬、抗不整脈薬、高脂血症治療薬などである。
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンが低下している。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び/または局所的なものである。
もう一方において、本発明は被験者の血管病変、特に糖尿病性血管病変を予防及び/または治療するプラスミノゲンまたはプラスミンに係り、及び被験者の血管病変、特に糖尿病性血管病変を予防及び/または治療する、プラスミノゲンまたプラスミンを含有する薬物組成物に係る。一つの実施形態において、前記血管病変、特に糖尿病性血管病変は糖尿病性大血管病変、小血管病変及び/または糖尿病性微小血管病変である。一つの実施形態において、前記血管病変はアテローム性動脈硬化を含み、特に糖尿病性アテローム性動脈硬化であり、主動脈及び内臓臓器のアテローム性動脈硬化を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性微小血管病変は微小循環の機能改変、血管壁の損傷、微小血栓形成及び/または微小血管閉塞を含む。本発明はさらに被験者の心血管病、特に糖尿病性心血管病のプラスミノゲンまたはプラスミンに係り、及び被験者の心血管病、特に糖尿病性心血管病を予防及び/または治療するための、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物に係る。一つの実施形態において、前記心血管病は糖尿病性心臓病を含み、心臓肥大、心機能不全、不整脈、狭心症、無痛性心筋梗塞、心不全を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性心血管病は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によってもたらされるものである。
一つの実施形態において、前記心血管病、特に糖尿病によって引き起こされる心血管病は以下を含むが、これらに限られない:高脂血症、アテローム性動脈硬化、高血圧、冠状動脈症、狭心症、心筋梗塞、冠状動脈の血液供給不足、胸部圧迫感、動悸、息切れ、不整脈、心不全などである。
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列2、6、8、10または12は少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列2、6、8、10または12に基づいて、1−100、1−90、1−80、1−70、1−60、1−50、1−45、1−40、1−35、1−30、1−25、1−20、1−15、1−10、1−5、1−4、1−3、1−2、1個のアミノ酸を追加、削除及び/または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはGlu−プラスミノゲン、Lys−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである:Glu−プラスミノゲン、Lys−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列2が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列2、6、8、10または12に示される通りである。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは全身または局所投与によって投与され、好ましくは以下の経路により投与されることで治療が行われる:静脈内、筋肉内、皮下、吸入によりプラスミンを投与する。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日0.0001−2000mg/kg、0.001−800mg/kg、0.01−600mg/kg、0.1−400mg/kg、1−200mg/kg、1−100mg/kg、10−100mg/kg(体重一キロあたりで計算)または0.0001−2000mg/cm2、0.001−800mg/cm2、0.01−600mg/cm2、0.1−400mg/cm2、1−200mg/cm2、1−100mg/cm2、10−100mg/cm2(体表面積平方センチメートルあたりで計算)の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンは低下している。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び/または局所的なものである。
もう一方において、本発明は被験者の血管病変、特に糖尿病性血管病変を予防及び/または治療するための、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する製品または薬品キットである。一つの実施形態において、前記血管病変、特に糖尿病性血管病変は糖尿病性大血管病変、小血管病変及び/または糖尿病性微小血管病変である。一つの実施形態において、前記血管病変はアテローム性動脈硬化、特に糖尿病によってもたらされるアテローム性動脈硬化であり、主動脈及び内臓器官のアテローム性動脈硬化を含む。一つの実施形態において、前記糖尿病性微小血管病変は微小循環機能の改変、血管壁の損傷、微小血栓形成及び/または微小血管閉塞を含む。本発明はさらに被験者の心血管病、特に糖尿病性心血管病を予防及び/治療するための、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する製品または薬物キットに係る。一つの実施形態において、前記心血管病は糖尿病性心血管病、心臓肥大、心機能不全、不整脈、狭心症、無痛性心筋梗塞、心不全を含む。一つの実施形態に
おいて、前記糖尿病性心血管病は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管病変によってもたらされる。一つの実施形態において、前記製品または製品キットは有効量のプラスミノゲン/プラスミンを含有する容器を含む。好ましくは、該製品または薬物キットは一種類または複数種類の他の薬物の容器を含む。該製品または薬物キットはさらにプロトコルを含むことができ、前記プラスミノゲンは前記血管病変、特に糖尿病性血管病変または糖尿病性心血管病の治療に用いることができると説明するものであり、さらには以下のように説明を行うことができる:前記プラスミノゲンは他の薬物を投与する前、投与と同時、及び/または後に投与できる。一つの実施形態において、前記他の薬物は以下を含むがこれらに限られない:抗心血管薬、抗糖尿病薬、抗血栓薬、抗感染薬、抗不整脈薬、高脂血症治療薬等である。一つの実施形態において、前記心血管病は以下を含むがこれらに限られない:糖尿病性心血管病、高脂血症、アテローム性動脈硬化、高血圧、冠状動脈症、狭心症、心筋梗塞、冠状動脈の血液供給不足、胸部圧迫感、動悸、息切れ、不整脈、心不全などである。
おいて、前記糖尿病性心血管病は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管病変によってもたらされる。一つの実施形態において、前記製品または製品キットは有効量のプラスミノゲン/プラスミンを含有する容器を含む。好ましくは、該製品または薬物キットは一種類または複数種類の他の薬物の容器を含む。該製品または薬物キットはさらにプロトコルを含むことができ、前記プラスミノゲンは前記血管病変、特に糖尿病性血管病変または糖尿病性心血管病の治療に用いることができると説明するものであり、さらには以下のように説明を行うことができる:前記プラスミノゲンは他の薬物を投与する前、投与と同時、及び/または後に投与できる。一つの実施形態において、前記他の薬物は以下を含むがこれらに限られない:抗心血管薬、抗糖尿病薬、抗血栓薬、抗感染薬、抗不整脈薬、高脂血症治療薬等である。一つの実施形態において、前記心血管病は以下を含むがこれらに限られない:糖尿病性心血管病、高脂血症、アテローム性動脈硬化、高血圧、冠状動脈症、狭心症、心筋梗塞、冠状動脈の血液供給不足、胸部圧迫感、動悸、息切れ、不整脈、心不全などである。
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列2、6、8、10または12は少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列2、6、8、10または12に基づいて、1−100、1−90、1−80、1−70、1−60、1−50、1−45、1−40、1−35、1−30、1−25、1−20、1−15、1−10、1−5、1−4、1−3、1−2、1個のアミノ酸を追加、削除及び/または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはGlu−プラスミノゲン、Lys−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである:Glu−プラスミノゲン、Lys−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列2が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列2、6、8、10または12に示される通りである。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは全身または局所投与によって投与され、好ましくは以下のルートにより投与される:静脈内、筋肉内、皮下、吸入によりプラスミンを投与することで治療を行う。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日0.0001−2000mg/kg、0.001−800mg/kg、0.01−600mg/kg、0.1−400mg/kg、1−200mg/kg、1−100mg/kg、10−100mg/kg(体重一キロあたりで計算)または0.0001−2000mg/cm2、0.001−800mg/cm2、0.01−600mg/cm2、0.1−400mg/cm2、1−200mg/cm2、1−100mg/cm2、10−100mg/cm2(体表面積平方センチメートルあたりで計算)の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンは低下してい
る。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び/または局所的なものである。
る。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び/または局所的なものである。
一方において、本発明はプラスミノゲンまたはプラスミンの、被験者の血管病変、特に血管病変によってもたらされる生体組織及び内臓臓器の損傷(ダメージ)を予防及び/または治療するための薬物、製品、薬物キットの製造における用途に係るものである。一つの実施形態において、前記組織及び内臓臓器の損傷(ダメージ)は大脳、心臓、肝臓、肺臓、腎臓、神経、網膜、皮膚、胃腸管の損傷(ダメージ)を含む。一方において、本発明はプラスミノゲンまたはプラスミンの被験者の糖尿病合併症を予防及び/または治療するための薬物、製品、薬物キットにおける用途に係る。一つの実施形態において、前記糖尿病合併症は糖尿病によって引き起こされる糖尿病性大脳病変、糖尿病性心臓病変、糖尿病性肝臓病変、糖尿病性腎臓病変、糖尿病性肺臓病変、糖尿病性神経病変、糖尿病性血管病変、糖尿病網膜症、糖尿病性皮膚病変である。
一方において、本発明は製薬方法に係り、プラスミノゲンまたはプラスミンと薬学的に許容し得る担体から、被験者の糖尿病性血管病変によってもたらされる生体組織及び内臓臓器の損傷(ダメージ)を予防及び/または治療するための薬物、製品、薬物キットに製造することを含む。一つの実施形態において、前記組織及び内臓臓器の損傷(ダメージ)は大脳、心臓、肝臓、肺臓、腎臓、神経、網膜、皮膚、胃腸管の損傷(ダメージ)を含む。一方において、本発明は製薬方法に係り、プラスミノゲンまたはプラスミンの薬学的に許容し得る担体を、被験者の糖尿病合併症を予防及び/または治療するための薬物、製品、薬物キットに製造することを含む。一つの実施形態において、前記糖尿病合併症は糖尿病によって引き起こされる糖尿病性大脳病変、糖尿病性心臓病変、糖尿病性肝臓病変、糖尿病性腎臓病変、糖尿病性肺臓病変、糖尿病性神経病変、糖尿病性血管病変、糖尿病網膜症、糖尿病性皮膚病変である。
一方において、本発明は被験者の血管病変、特に被験者の糖尿病性血管病変によってもたらされる生体組織及び内臓臓器の損傷(ダメージ)を予防及び/または治療するためのプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する組成物、製品、薬物キットに係る。一つの実施形態において、前記組織及び内臓臓器の損傷(ダメージ)は大脳、心臓、肝臓、腎臓、肺臓、神経、網膜、胃腸管、皮膚の損傷(ダメージ)を含む。一方において、本発明は被験者の糖尿病合併症を予防及び/または治療するプラスミノゲン、プラスミノゲンを含有する薬物組成物、製品または薬物キットに係る。一つの実施形態において、前記糖尿病合併症は糖尿病によって引き起こされる糖尿病性大脳病変、糖尿病性心臓病変、糖尿病性肝臓病変、糖尿病性肺臓病変、糖尿病性腎臓病変、糖尿病性神経病変、糖尿病性血管病変、糖尿病網膜症、糖尿病性皮膚病変である。
一方において、本発明は被験者の血管病変、特に血管病変によってもたらされる生体組織及び内臓臓器損傷(ダメージ)を予防及び/または治療する方法に係り、被験者にプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物、製品、薬物キットを投与することを含む。本発明はさらにプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物、製品、薬物キットの被験者の血管病変、特に被験者の糖尿病性血管病変によってもたらされる生体組織及び内臓臓器損傷(ダメージ)を予防及び/または治療する用途に係るものである。一つの実施形態において、前記組織及び内臓臓器の損傷(ダメージ)は大脳、心臓、肝臓、肺臓、腎臓、神経、網膜、胃腸管、皮膚に対する損傷(ダメージ)を含む。一方において、本発明は被験者の糖尿病合併症を予防及び/または治療する方法に係り、被験者にプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物、製品または薬物キットを投与することを含む。本発明はさらにプラスミノゲンまたはプラスミン、プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物、製品または薬物キットの、被験者の糖尿病合併症を予防及び/治療することにおける用途を含む。一つの実施形態において、前
記糖尿病合併症は糖尿病によって引き起こされた糖尿病性大脳病変、糖尿病性心臓病変、糖尿病性肝臓病変、糖尿病性肺臓病変、糖尿病性腎臓病変、糖尿病性神経病変、糖尿病性血管病変、糖尿病性網膜病変、糖尿病性皮膚病変である。
記糖尿病合併症は糖尿病によって引き起こされた糖尿病性大脳病変、糖尿病性心臓病変、糖尿病性肝臓病変、糖尿病性肺臓病変、糖尿病性腎臓病変、糖尿病性神経病変、糖尿病性血管病変、糖尿病性網膜病変、糖尿病性皮膚病変である。
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンは低下する。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び/または局所的なものである。
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列2、6、8、10または12は少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列2、6、8、10または12に基づいて、1−100、1−90、1−80、1−70、1−60、1−50、1−45、1−40、1−35、1−30、1−25、1−20、1−15、1−10、1−5、1−4、1−3、1−2、1個のアミノ酸を追加、削除及び/または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはGlu−プラスミノゲン、Lys−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである:Glu−プラスミノゲン、Lys−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲンである。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列2が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。最も好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列2、6、8、10または12に示される通りである。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは全身または局所にて投与され、体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与により投与される。一つの実施形態において、前記局所投与は血栓領域においてプラスミノゲンを含有するドレッシング材及び/またはガイドチューブを用いることによって行われる。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日0.0001−2000mg/kg、0.001−800mg/kg、0.01−600mg/kg、0.1−400mg/kg、1−200mg/kg、1−100mg/kg、10−100mg/kg(体重一キロあたりで計算)または0.0001−2000mg/cm2、0.001−800mg/cm2、0.01−600mg/cm2、0.1−400mg/cm2、1−200mg/cm2、1−100mg/cm2、10−100mg/cm2(体表面積平方センチメートルあたりで計算)の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
前記プラスミノゲンは単独で投与でき、他の薬物と組み合わせても使用でき、前記他の薬物は例えば、心血管病治療薬、不整脈治療薬、糖尿病治療薬等であり、これにより病理性の血栓に伴って発生するその他の疾患を治療する。
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンは低下している。具体的には、前記低下は先天的、継発的、及び/または局所的なものである。
本発明は本発明の実施形態どうしの技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、且つこれらの組み合わせ後の技術構成は本出願で明確に開示され、前記技術構成が単独且つ明確に開示されているのと一緒である。また、本発明はさらに各実施形態及び要素のすべてのサブの組み合わせをカバーし、さらに本明細書中において開示され、それぞれのサブの組み合わせが単独且つ明確に本明細書中において開示されているのと一緒である。
「心血管病」とは心血管系に組織学及び機能変化が生じる病変であり、大血管及び微小血管が引き起こす心臓の変化が主な表れである。臨床的には心電図異常、心臓の拡張、不
整脈、無痛性心筋梗塞、心不全が見られる。
整脈、無痛性心筋梗塞、心不全が見られる。
「糖尿病」は遺伝的要素、免疫機能の乱れ、微生物感染及びその毒素、フリーラジカル毒素、精神要因などの各種病気誘発因子が生体に作用することによる、インスリン減退、インスリン抵抗などに起因する糖、タンパク質、脂肪、水及び電解質等の一連の代謝混乱症候群であり、臨床的には高血糖を主な特徴とする。
「糖尿病合併症」は糖尿病プロセスにおける血糖の制御不良によって引き起こされる身体のその他の臓器または組織のダメージまたは機能障害であり、肝臓、腎臓、心臓、網膜、神経系のダメージまたは機能障害等を含む。世界保健機関(WHO)の統計によれば、糖尿病合併症は100種類以上あり、現在における合併症が最も多い疾患である。これらの糖尿病の合併症は主に患者の各臓器の大血管、小血管、微小血管が損傷を受けることによって起こる。
「糖尿病性血管病変」は主に糖尿病が引き起こす主動脈及び内臓器官の動脈、大脳、肺臓、心臓、肝臓、脾臓、腎臓の大、小動脈のアテローム性動脈硬化、及びそれらによって引き起こされる臓器、組織病変を含む。その発病メカニズムは以下の面を含む:1)持続性の高血糖は血液の粘度及び凝固性を向上させ、これにより動脈の血管弾性の弱まり及び喪失をもたらす;2)脂質類代謝異常、それはコレステロール及びコレステロールエステルの細胞内における堆積を促進し、これによりアテローム性動脈硬化の発生および発展をもたらす;3)動脈壁の内皮細胞損傷、血流動力学の変化により血液が機械的に長期的に血管内皮に衝突し、内皮の損傷を引き起こし、これにより血小板、フィブリンが損傷部位において凝集して血栓を形成し、さらには炎症を引き起こす;4)凝血メカニズムに関与する糖タンパク質因子が多くなり、血小板及びフィブリンが損傷した内皮下層に附着することで溶解能力が低下することを促進し、これにより血栓を形成する。そのため、本発明の請求項において「糖尿病性血管病変」という用語に言及した場合、糖尿病によって引き起こされるアテローム性動脈硬化及び血栓、及びそれにより引き起こされる臓器、組織病変をカバーする。
「糖尿病性微小血管病変」とは糖尿病患者の生体の各臓器または組織の微小循環において異なる程度の異常がもたらす微小血管障害である。微小血管障害が形成するプロセスは概ね以下である:微小循環の機能改変、内皮損傷、基膜の厚み増大、血液粘度の上昇、赤血球の凝集、血小板の粘着及び凝集、最終的には微小血栓形成及び/または微小血管閉塞をもたらす。
前記「糖尿病性微小血管病変」は組織または臓器の局所血管損傷、血流不順、細胞の酸素欠乏、血液凝塊の形成、血栓及び炎症をもたらし、さらには周辺の組織及び臓器の機能に影響し、これにより「糖尿病合併症」をもたらす。
「糖尿病性心血管病」とは糖尿病によって引き起こされる心血管系の組織学及び機能変化が生じる病変であり、最もよく見られる糖尿病合併症の一つであり、主に糖尿病によって引き起こす大血管、小血管、微小血管病変によってもたらされる。そのうち、患者は臨床的に心電図異常、心臓の拡張、不整脈、狭心症、無痛性心筋梗塞、心不全として現れる。統計によれば、概ね70%−80%の糖尿病患者は最終的に心血管合併症で死亡する。糖尿病患者中のアテローム性動脈硬化、高血圧、急性心筋梗塞、慢性心不全及び突然死の発生率が明らかに上昇する。現在において、糖尿病は心臓血管病変が発生する高リスク要因及び予測指標であり、且つ糖尿病合併心血管病の患者の短期または長期的な予後は明らかに糖尿病のない患者と異なるものである。
「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブ
リン分解生成物及びD−二量体に加水分解することができる。
リン分解生成物及びD−二量体に加水分解することができる。
「プラスミノゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、swiss prot中の配列に基づいて、シグナルペプチドを含む天然ヒト由来プラスミノゲンのアミノ酸配列(配列4)は計算によれば810個のアミノ酸からなり、分子量は約92kDであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするcDNA配列は配列3に示される通りである。フルサイズのプラスミノゲンは七つのドメインを含む:C末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、N末端に位置するPan Apple(PAp)ドメイン及び5つのKringleドメイン(Kringle1−5)を含む。swiss prot中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Met1−Gly19を含み、Papは残基Glu20−Val98を含み、Kringle1は残基Cys103−Cys181を含み、Kringle2は残基Glu184−Cys262を含み、Kringle3は残基Cys275−Cys352を含み、Kringle4は残基Cys377−Cys454を含み、Kringle5は残基Cys481−Cys560を含む。NCBIデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Val581−Arg804を含む。
Glu−プラスミノゲンは天然のフルサイズのプラスミノゲンであり、791個のアミノ酸からなる(19個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない)、該配列をコードするcDNA配列は配列1に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列2に示される通りである。体内において、さらにGlu−プラスミノゲンの第76−77位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたLys−プラスミノゲンが存在し、配列6に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするcDNA配列は配列5が示す通りである。δ−プラスミノゲン(δ−plasminogen)はフルサイズのプラスミノゲンにKringle2−Kringle5構造の欠損が生じているフラグメントであり、Kringle1及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず(非特許文献18、19参照)、δ−プラスミノゲンのアミノ酸配列(配列8)を報告している文献があり(非特許文献19)、該アミノ酸配列をコードするcDNA配列は例えば配列7である。ミニプラスミノゲン(Mini−plasminogen)はKringle5及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Val443−Asn791(シグナルペプチドGlu−プラスミノゲン配列を含まないGlu残基を開始アミノ酸とする)について文献が報告しており(非特許文献20参照)、そのアミノ酸配列は配列10に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするcDNA配列は配列9が示す通りである。しかしマイクロプラスミノゲン(Micro−plasminogen)はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ala543−Asn791(シグナルペプチドを含まないGlu−プラスミノゲン配列のGlu残基は開始アミノ酸である)と文献が報告し(非特許文献21)、特許文献CN102154253Aはそれが残基Lys531−Asn791を含むと開示し(シグナルペプチドを含まないGlu−プラスミノゲン配列のGlu残基を開始アミノ酸とする)、本特許の配列は特許文献CN102154253Aを参照でき、そのアミノ酸配列は配列12に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするcDNA配列は配列11に示される通りである。
「血栓」は凝血プロセスにおいて形成される産物である。凝血プロセスは生体が密閉高圧循環系の完全性を保持する防御メカニズムである。正常な場合において、該プロセスは非活性化状態を維持すべきであり、しかし組織が損傷を受ける場合、速やかに該メカニズムを起動させて血液の外部への浸透を減らすべきである。血管が損傷を受けた場合、凝血酵素の作用下において血漿中に溶解するフィブリノーゲン(fibrinogen)は最終的に水に溶けないフィブリン(fibrin)多重合体であり、さらに互いに網となり、血液細胞を中に囲み、血液凝塊を形成することで、凝血プロセスを完成させる。該プロセスにおいて、血液凝塊と傷口の大きさの比が極めて重要である。そのため血液凝塊の形
成を開始させる分子(フィブリン、トロンビン)及び血液凝塊を溶解させる分子(プラスミン、プラスミノゲン活性化剤など)の間には平衡が存在する。しかし病理的なプロセスにおいて、該平衡の破壊は過剰の血液凝塊形成分子をもたらし、これにより血栓(thrombus)を形成させ、該血栓は「病理性血栓」である。
成を開始させる分子(フィブリン、トロンビン)及び血液凝塊を溶解させる分子(プラスミン、プラスミノゲン活性化剤など)の間には平衡が存在する。しかし病理的なプロセスにおいて、該平衡の破壊は過剰の血液凝塊形成分子をもたらし、これにより血栓(thrombus)を形成させ、該血栓は「病理性血栓」である。
人体において、血栓は血流のある如何なる位置で発生でき、現在は主に二種類に分けられる:静脈血栓及び動脈血栓である。静脈血栓は静脈中において生じる血液凝塊によってもたらされる。最もよく見られる静脈血栓のタイプは以下である:深部静脈血栓症(DVT)、それは体の静脈例えば大腿静脈(femoral vein)に影響し、これにより影響を受ける部位の痛みと腫れをもたらす;門静脈血栓、それは肝臓門静脈に影響し、これにより膵臓炎、肝硬変、憩室炎または胆管がんをもたらす;腎臓静脈血栓、腎臓の栓塞をもたらす;頸内静脈血栓、それは全身性の敗血症、肺塞栓などの複数種類の合併症を引き起こす;脳静脈血栓、それは患者の頭痛、視覚異常、卒中などの症状をもたらす。動脈血栓は体内のほとんどの臓器の梗塞をもたらす可能性があり、それが引き起こす疾患は以下を含むがこれらに限られない:脳梗塞、心筋梗塞、血栓性卒中、アテローム性動脈硬化、不安定性狭心症、難治性狭心症、一過性脳虚血発作、肺栓塞などである。
糖尿病の場合において、動脈壁の内皮細胞が損傷を受け、血流動力学が変化して血液が機械的に長期的に血管内皮に衝撃を与えることにより、内皮損傷を引き起こし、さらには血小板、フィブリンなどの損傷部位に凝集することで血栓を形成する。本発明の実験は以下について見出した。プラスミノゲンは糖尿病マウス血清中のD−二量体を明らかに上昇させ、心臓、肝臓、腎臓、神経組織局所のフィブリンは対照グループより明らかに減少し、これはプラスミノゲンが糖尿病マウスの微小血栓の溶解を促進できることを示している。本発明はプラスミノゲンの糖尿病微小血栓に対する治療をカバーするものである。
本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノゲン」と「フィブリンプラスミノゲン」、「繊維タンパクプラスミノゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用され、そのため、本発明が記載する技術構成はプラスミノゲン及びプラスミンをカバーする。
本発明の記載する血栓は新鮮血栓及び陳旧性血栓を含む。本発明の「新鮮血栓」及び「急性血栓」は互いに置き換えて使用できる。「陳旧性血栓」及び「慢性血栓」は互いに置き換えて使用できる。
循環過程において、プラスミノゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノゲン活性化剤(plasminogen activator,PA)の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン質加水分解生成物及びD−二量体に加水分解して、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノゲンのPapドメインはプラスミノゲンを非活性閉鎖コンフォメーションにする重要な決定クラスターであり、しかしKRドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、以下を含む:組織プラスミノゲン活性化剤(tPA)、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤(uPA)、カリクレイン及び凝結因子XII(ハーゲマン因子)などである。
「プラスミノゲン活性フラグメント」とはプラスミノゲンのタンパク質において、基質
中のターゲット配列と結合してタンパク質加水分解機能を発揮できる活性フラグメントである。本発明はプラスミノゲンの技術構成に係り、プラスミノゲン活性フラグメントでプラスミノゲンの替わりとする技術構成を含む。本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメントはプラスミノゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むタンパク質であり、好ましくは、本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメントは配列14、配列14と少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含むものである。そのため、本発明に記載のプラスミノゲンは該プラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然該プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。
中のターゲット配列と結合してタンパク質加水分解機能を発揮できる活性フラグメントである。本発明はプラスミノゲンの技術構成に係り、プラスミノゲン活性フラグメントでプラスミノゲンの替わりとする技術構成を含む。本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメントはプラスミノゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むタンパク質であり、好ましくは、本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメントは配列14、配列14と少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含むものである。そのため、本発明に記載のプラスミノゲンは該プラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然該プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。
現在、血液中のプラスミノゲン及びその活性測定方法は以下を含む:組織フィブリンプラスミノゲン活性化剤の活性に対する測定(t−PAA)、血漿組織プラスミノゲン活性化剤抗原に対する測定(t−PAAg)、血漿組織プラスミノゲン活性に対する測定(plgA)、血漿組織プラスミノゲン抗原に対する測定(plgAg)、血漿組織プラスミノゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン−抗プラスミン複合物に対する測定(PAP)。最もよく見られる測定方法は発色基質法である:測定対象の血漿中にストレプトキナーゼ(SK)と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のプラスミノゲンはSKの作用下においてPLMとなり、後者は発光基質に作用し、その後に分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノゲンの活性と正比例関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のフィブリンプラスミノゲン活性に対して測定を行う。
「オルソロジー(orthology)」とは異なる種どうしのオルソログ(ortholog)であり、タンパク質の相同物もDNAの相同物も含む。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノゲン活性を有するプラスミノゲン直系同源物または直系同系物である。
「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性(例えば酸性、アルカリ性、疎水性など)のアミノ酸でペアレントタンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、MEGALIGNアルゴリズムに基づいて70%〜99%の類似性(同一性)を有する。「保存的置換変異体」はさらにBLASTまたはFASTAアルゴリズムに基づいて60%以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素であり、75%以上に達すればさらによく、最も好ましくは85%以上に達し、さらには90%以上に達するのが最も好ましく、さらに天然またはペアレントタンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
「分離された」プラスミノゲンとは天然環境から分離及び/または回収されたプラスミノゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノゲンは(1)90%を超える、95%を超える、または98%を超える純度(重量で計算した場合)になるまで精製し、例えばLowry法によって決まるもので、例えば99%(重量で計算した場合)を超えるまで精製する、(2)少なくともスピニングカップ配列分析装置によりN末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15個の残基が得られる程度になる精製する
、または(3)同質性になるまで、該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって決まるものである。分離されたプラスミノゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造することができ、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノゲンを含む。
、または(3)同質性になるまで、該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって決まるものである。分離されたプラスミノゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造することができ、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノゲンを含む。
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体をも指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列(N端メチオニン残基を有するか有しない)を含む融合物;などである。
参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ(%)」の定義は、必要な時にギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウエアによって実現できる。当業者は引用配列の適切なパラメータを決めることができ、比較対象の配列のフルサイズを比較することで最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアALIGN−2により得られるものである。
ALIGN−2を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、アミノ酸配列Aと所定のアミノ酸配列Bのアミノ酸配列同一性%(または所定のアミノ酸配列Bのあるアミノ酸配列と同一性を有する所定のアミノ酸配列Aの占める%)は以下のように計算される:
分数X/Y×100
分数X/Y×100
そのうちXは配列比較プログラムALIGN−2において該プログラムのA及びBの比較において同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちYはBにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである:アミノ酸配列Aの長さとアミノ酸配列Bの長さが等しくない場合、AのBに対するアミノ酸配列の同一性%は、BのAに対するアミノ酸配列同一性%とは異なる。明確に説明した場合を除き、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値%は前記の段落に記載の通りであり、ALIGN−2コンピュータプログラムによって得られるものである。
本文において使用されているように、用語の「治療」及び「処理」は期待される薬理及び/または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状を完全または一部予防すること、及び/または疾患及び/またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む:(a)疾病が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況である;(b)疾患を抑制し、その形成を阻害する;及び(c)疾患及び/またはその症状を減軽し、即ち疾患及び/またはその症状を解消させる。
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ(ラット、マウス)、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネ
コ、有蹄動物(例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ)などを含むがこれらに限られない。
コ、有蹄動物(例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ)などを含むがこれらに限られない。
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与した場合、疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び/または治療を実現するのに足りるプラスミノゲンの量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノゲン、治療しようとする被験者の疾患及び/または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
本発明のプラスミノゲンの製造
プラスミノゲンは自然界から分離及び精製されてさらに治療の用途に用いられるものであり、さらには標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することができる。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成(SPPS)(配列のC末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する)はプラスミノゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のSPPS、例えばFmoc及びBocは、プラスミノゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている:Barany及びSolid−Phase Peptide Synthesis;3−284ページ、The
Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第二巻:Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield,tら J.Am.Chem.Soc.,85:2149−2156(1963);Stewartら,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984);及びGanesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3−10及びCamarero JAら 2005Protein Pept Lett.12:723−8。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築された機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング/脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離N末端アミンと単一のN保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護させ、他のアミノ酸と連結する新しいN末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
プラスミノゲンは自然界から分離及び精製されてさらに治療の用途に用いられるものであり、さらには標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することができる。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成(SPPS)(配列のC末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する)はプラスミノゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のSPPS、例えばFmoc及びBocは、プラスミノゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている:Barany及びSolid−Phase Peptide Synthesis;3−284ページ、The
Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第二巻:Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield,tら J.Am.Chem.Soc.,85:2149−2156(1963);Stewartら,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984);及びGanesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3−10及びCamarero JAら 2005Protein Pept Lett.12:723−8。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築された機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング/脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離N末端アミンと単一のN保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護させ、他のアミノ酸と連結する新しいN末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノゲンを生産することができる。例えば、プラスミノゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に接続させる。発現制御配列はプロモーター(例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター)、シグナル配列、エンハンサー素子及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーター系とすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞(例えばCOSまたはCHO細胞)を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノゲンの収集及び精製の条件下において宿主を維持できる。
適切な発現ベクターは通常宿主生体内において附加体または宿主染色体DNAの整合部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー(例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性)を含み、外部由来に期待のDNA配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
大腸菌(Escherichia coli)はクローンするターゲット抗体をコードするポリヌクレオチドの原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿
菌を含み、例えばバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)及びその他の腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、例えばサルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia)、及び各種シュードモナス属(Pseudomonas)種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と許容する発現制御配列(例えば複製開始点)を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系である。プロモーターは通常発現を制御し、遺伝子配列を操縦する場合、さらにリボソームの結合位置配列を有し、転写及び翻訳を起動させてもよい。
菌を含み、例えばバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)及びその他の腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、例えばサルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia)、及び各種シュードモナス属(Pseudomonas)種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と許容する発現制御配列(例えば複製開始点)を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系である。プロモーターは通常発現を制御し、遺伝子配列を操縦する場合、さらにリボソームの結合位置配列を有し、転写及び翻訳を起動させてもよい。
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母(例えば出芽酵母(S.cerevisiae))及びピキア(Pichia)が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列(例えばプロモーター)、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは3−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母はエタノール脱水素酵素、イソ細胞色素C、及び麦芽糖とガラクトースの利用のための酵素のプロモーターによって起動される。
微生物以外に、哺乳動物細胞(例えば体外細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞)も本発明のプラスミノゲンの発現に用いることができる(例えばターゲット抗−Tau抗体をコードするポリヌクレオチド)。例えばWinnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)参照。適した哺乳動物宿主細胞はCHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたB細胞またはハイブリドーマである。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー(Queenら,Immunol.Rev.89:49(1986))、及び必要とされる加工情報位置、例えばリボソームの結合位置、RNAの切断位置、ポリアデノシン酸化位置、及び転写終止子配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなどの派生のプロモーターである。Coら、J.Immunol.148:1149(1992)を参照すること。
一旦合成(化学または組み換え方式)されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー(HPLC)、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノゲンを精製することができる。該プラスミノゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約80%から85%の純度で、少なくとも約85%〜90%の純度で、少なくとも約90%〜95%の純度で、または98%〜99%の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、ターゲット抗体以外の大分子などである。
薬物配合剤
必要とする純度のプラスミノゲンと選択可能な薬用担体、賦形剤、または安定剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.ed.(1980))を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む;防腐剤(例えばベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリド水和物;塩化ヘキサメチレンジアミン;塩化ベンザルコニウム(benzalkonium chloride)、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブタノールまたはベンジルエタノール;アルキルパラヒドロキシ安息香
酸エステル、例えばメチルまたはプロピルのパラヒドロキシ安息香酸エステル;ピロカテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンチルエタノール;m−クレゾール);低分子量ポリペプチド(少なくとも10個の残基を有するもの);タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性重合体、例えばポリゼニールピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンである;単糖、二糖及びその他の炭水化物はブドウ糖、マンノース、またはデキストリンを含む;キレート剤は例えばEDTAである;糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである;塩形成イオン、例えばナトリウム;金属複合体(例えば亜鉛−タンパク複合体);及び/または非イオン界面活性剤、例えばTWEENTM、PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(PEG)である。好ましくは凍結乾燥された抗−VEGF抗体配合剤であり、WO 97/04801に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。
必要とする純度のプラスミノゲンと選択可能な薬用担体、賦形剤、または安定剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.ed.(1980))を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む;防腐剤(例えばベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリド水和物;塩化ヘキサメチレンジアミン;塩化ベンザルコニウム(benzalkonium chloride)、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブタノールまたはベンジルエタノール;アルキルパラヒドロキシ安息香
酸エステル、例えばメチルまたはプロピルのパラヒドロキシ安息香酸エステル;ピロカテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンチルエタノール;m−クレゾール);低分子量ポリペプチド(少なくとも10個の残基を有するもの);タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性重合体、例えばポリゼニールピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンである;単糖、二糖及びその他の炭水化物はブドウ糖、マンノース、またはデキストリンを含む;キレート剤は例えばEDTAである;糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである;塩形成イオン、例えばナトリウム;金属複合体(例えば亜鉛−タンパク複合体);及び/または非イオン界面活性剤、例えばTWEENTM、PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(PEG)である。好ましくは凍結乾燥された抗−VEGF抗体配合剤であり、WO 97/04801に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、血圧降下薬、抗不整脈薬、糖尿病治療薬等である。
本発明のプラスミノゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に包まれることができ、例えば、膠質薬物輸送系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル)中に入れるかまたはエマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―(メタアクリル酸メチル)マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術は以下に開示されている。Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌ろ過膜でろ過することで容易に実現できる。
本発明のプラスミノゲンは緩衝製剤を調製できる。緩衝製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過基質を含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。緩衝基質の実例はポリエステル、水性ゲル(例えばポリ(2−ヒドロキシエチル−メタアクリル酸エステル)(Langerら,J.Biomed.Mater.Res.,15:167−277(1981);Langer,Chem.Tech.,12:98−105(1982))またはポリ(ビニールエタノール)、ポリラクチド(米国特許3773919,EP 58,481)、L−グルタミン酸とγメチル−L−グルタミン酸の共重合体(Sidman,ら,Biopolymers 22:547(1983)),分解できないエチレン−ビニルアセテート(ethylene−vinyl acetate)(Langer,ら,出所は前記と同じ)、または分解可能な乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばLupron DepotTM(乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン(leuprolide)酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体)、及びポリD−(−)−3−ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン−酢酸エチル及び乳酸−ヒドロキシ酢酸は、持続的に100日間以上分子を放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間S−S結合を形成するであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現する。
投与及び用量
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内(例えば頸動脈)、筋肉内、鼻内、体表または皮内投与または脊髄または脳内輸送により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。エアロゾル製剤例えば鼻噴霧製剤は活性剤を含有する精製した水性またはその他の溶液及び防腐剤と等張剤を含有する。このような製剤を鼻粘膜と許容し得るpH及び等張状態に調整する。
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内(例えば頸動脈)、筋肉内、鼻内、体表または皮内投与または脊髄または脳内輸送により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。エアロゾル製剤例えば鼻噴霧製剤は活性剤を含有する精製した水性またはその他の溶液及び防腐剤と等張剤を含有する。このような製剤を鼻粘膜と許容し得るpH及び等張状態に調整する。
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性/水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが存在してもよい。
医療関係者は各種臨床的要素により用量の案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約0.0001〜2000mg/kgであり、または約0.001〜500mg/kg(例えば0.02mg/kg,0.25mg/kg,0.5mg/kg,0.75mg/kg,10mg/kg,50mg/kgなど)である。例えば、用量は1mg/kg体重または50mg/kg体重または1−50mg/kgの範囲とすることができ、または少なくとも1mg/kgである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量の日程表は連続数日1−10mg/kg投与することである。本発明の薬物の投与過程において糖尿病性心血管病及びその関連疾患の治療効果及び安全性はリアルタイムに評価、定期的に評価すべきである。
治療効力及び治療安全性
本発明の一つの実施形態はプラスミノゲンを用いて被験者を治療した後、治療効力及び治療安全性に対して判断を行うことに係る。そのうちの前記治療効力に対する判断方法は被験者の血圧、心電図、一般血液検査、一般尿検査、血中脂質、血糖、血流動力学に対して測定を行うことを含むがこれらに限られない。具体的に、被験者に対して下記検査を行うことを含む:1)心血管超音波;心臓の各房室の大小、室壁運動、血流速度及び心臓機能面に対して全面的に診断する;2)心筋マーカー測定;例えばC−反応性タンパク(CRP)、筋肉ヘモグロビン(Mb)、クレアチンキナーゼアイソザイム(CK−MB)、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)等の濃度に対して測定を行い、これらのマーカーは急性心筋梗塞の重要な診断マーカーであり、被験者は本発明のプラスミノゲン治療を受けた後に前記測定において正常値範囲内にまで回復しまたは改善されることが期待され、例えばMbは男性被験者では19〜92μg/Lに、女性は12〜76μg/Lにまで回復する;3)携帯型心電図モニタリング。これ以外に、本発明はさらにプラスミノゲンを使用して被験者に対して治療を行う過程中及び治療後における、前記治療案の安全性に対する判断、各種有害事象のモニタリングに係る。
本発明の一つの実施形態はプラスミノゲンを用いて被験者を治療した後、治療効力及び治療安全性に対して判断を行うことに係る。そのうちの前記治療効力に対する判断方法は被験者の血圧、心電図、一般血液検査、一般尿検査、血中脂質、血糖、血流動力学に対して測定を行うことを含むがこれらに限られない。具体的に、被験者に対して下記検査を行うことを含む:1)心血管超音波;心臓の各房室の大小、室壁運動、血流速度及び心臓機能面に対して全面的に診断する;2)心筋マーカー測定;例えばC−反応性タンパク(CRP)、筋肉ヘモグロビン(Mb)、クレアチンキナーゼアイソザイム(CK−MB)、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)等の濃度に対して測定を行い、これらのマーカーは急性心筋梗塞の重要な診断マーカーであり、被験者は本発明のプラスミノゲン治療を受けた後に前記測定において正常値範囲内にまで回復しまたは改善されることが期待され、例えばMbは男性被験者では19〜92μg/Lに、女性は12〜76μg/Lにまで回復する;3)携帯型心電図モニタリング。これ以外に、本発明はさらにプラスミノゲンを使用して被験者に対して治療を行う過程中及び治療後における、前記治療案の安全性に対する判断、各種有害事象のモニタリングに係る。
製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、心血管病、特に糖尿病によって引き起こされる心血管病及びその関連疾患の治療に用いられる本発明のプラスミノゲン/プラスミンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはパンフレットを含む。適切な容器はボトル、小瓶、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する(例えば前記容器は静脈輸液用パックまたは小瓶であり、皮下注射針によって貫通可能な栓を含む)。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノゲン/プラスミンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の前記心血管病、特に糖尿病によって引き起こされる心血管病及びその関連疾患の治療に用いられるものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びブドウ糖溶液である。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するパンフレットを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノゲン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、心血管病、特に糖尿病によって引き起こされる心血管病及びその関連疾患の治療に用いられる本発明のプラスミノゲン/プラスミンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはパンフレットを含む。適切な容器はボトル、小瓶、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する(例えば前記容器は静脈輸液用パックまたは小瓶であり、皮下注射針によって貫通可能な栓を含む)。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノゲン/プラスミンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の前記心血管病、特に糖尿病によって引き起こされる心血管病及びその関連疾患の治療に用いられるものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びブドウ糖溶液である。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するパンフレットを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノゲン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
<実施例>
実施例1はプラスミノゲンのマウス体重に対する影響に関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス20匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループ各10匹ずつである。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に31日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。0、4、7、11、16、21、26、31日目にそれぞれ体重を測定する。
結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループと溶媒PBS投与対照グループは0、4、7、11、16、21、26、31日目において体重に顕著な差異がない(図1)。これは、プラスミノゲンは動物体重に対して影響が大きくなく、投与処理は動物体重に対して顕著な影響がないことを示している。
実施例2はプラスミノゲンのマウス心筋に対する損傷修復作用に関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス10匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループ各5匹ずつである。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に31日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。32日目にマウスを殺処分してから心臓を取り、10%中性ホルマリン固定液にて24時間固定する。固定後の心臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは5μmで、切片を脱パラフィンさせて再水和した後にヘマトキシリン及びエオジンで染色させ(HE染色)、1%塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水
させて封入する。切片を顕微鏡下において400倍下にて観察する。
させて封入する。切片を顕微鏡下において400倍下にて観察する。
結果は以下を示している。溶媒PBS投与対照グループは心筋細胞が肥大し、ごく一部では細長い紡錘形の肥大した細胞核が見られ、軽度な脂肪変性を起こし、空胞状を呈し、血管の縁または筋肉細胞の隙間に軽度炎症性細胞浸潤が見られ、筋肉繊維の隙間が広くなっている(図2A)。プラスミノゲン投与グループの心筋細胞は円形または紡錘形であり、肥大した細胞は対照グループより少なく、筋肉繊維の隙間は対照グループより緻密で、炎症性細胞浸潤及び脂肪変性は溶媒PBS投与対照グループに比較していずれも明らかに減軽されている(図2B)。これはプラスミノゲンを注射することでマウスの心筋損傷が顕著に修復されたことを示している。
実施例3はプラスミノゲンのマウス心筋フィブリン加水分解の促進に関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス10匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループ各5匹ずつである。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に31日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。32日目にマウスを殺処分してから心臓を取り、10%中性ホルマリン固定液にて24時間固定する。固定後の心臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは5μmで、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して1回水洗いして、3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、2回水洗いして、毎回5分間である。10%の正常ヒツジ血清液(Vector
laboratories,Inc.,USA)で1時間封止する;ヒツジ血清液を破棄して、PAPマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブリン(フィブリノーゲン)抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で顕色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒再染色して、流水で5分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止を行い、顕微鏡下で400倍下にて切片を観察する。
laboratories,Inc.,USA)で1時間封止する;ヒツジ血清液を破棄して、PAPマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブリン(フィブリノーゲン)抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で顕色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒再染色して、流水で5分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止を行い、顕微鏡下で400倍下にて切片を観察する。
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、有機体の損傷に対する刺激応答反応として、フィブリノーゲンは加水分解してフィブリンとなる(非特許文献22〜24)。そのためフィブリノーゲンレベルを損傷の程度の一つの指標とすることができる。フィブリンは組織損傷後に血栓を形成する主な成分であり、そのため、フィブリンレベルを血栓形成の一つの指標とすることができる。
研究により以下が示されている。溶媒PBS投与対照グループ(図3A)と比較して、プラスミノゲン投与グループ(図3B)のマウス心臓組織のフィブリンの陽性着色が比較的浅く、これはプラスミノゲン投与グループの心臓組織沈着のフィブリンが減少していることを示し、プラスミノゲンが心臓組織の損傷修復を促進していることを反映し、プラスミノゲンは心臓組織血栓の溶解を促進できることを示している。
実施例4はプラスミノゲンのマウス動脈壁損傷に対する修復作用に関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス10匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループ各5匹ずつである。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に31日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。32日目にマウスを殺処分してさらに大動脈弓を取り10%中性ホルマリン固定液中において24時間固定する。固定後の心臓をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは5μmで、切片を脱パラフィンさせて再水和した後にヘマトキシリン及びエオジンで染色させ(HE染色)、1%塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水させて封入する。切片を顕微鏡下において400倍下にて観察する。
結果は以下のように示している。溶媒PBS投与対照グループの血管管壁には泡沫細胞の沈着があり、中層弾性膜の配列が乱れ、血管壁の厚さが増大し、管壁の凹凸が不均一である(図4A);プラスミノゲン投与グループの中層弾性膜の構造は規則的で、波状を呈し、血管壁の厚みは均一である(図4B)。これは、プラスミノゲンは主動脈管壁損傷に対して修復作用を有することを示している。
実施例5はプラスミノゲンの心筋損傷を顕著に減軽させることに関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス28匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ12匹で、プラスミノゲン投与グループ16匹である。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に31日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。32日目に眼球を摘出して採血を行い、3500r/minにて15−20分間遠心を行い、さらに上澄み液を取って血清中心筋トロポニンIの濃度測定を行う。
心筋トロポニンI(cardiac troponin,CTNI)は心筋損傷の重要なマーカーであり、その血清濃度は心筋損傷の程度を反映できる(非特許文献25)。結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループの心筋トロポニンIの濃度は明らかに溶媒PBS対照グループより低く、且つ極めて顕著な統計学差異を有する(図5)。これはプラスミノゲンが顕著に心筋損傷を減軽できることを示している。
実施例6はプラスミノゲンの微小血栓の溶解促進に関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス10匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループ各5匹ずつである。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に15日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。最後の投与から24時間後に眼球を摘出して採血を行い、全血を静置した後に血清を用いて血液中のD−二量体の含有量(D−dimer)を測定する。
結果は以下を示している。プラスミノゲン投与15日後に、血清中のD−二量体の含有
量が顕著に上昇し(図6)、これはプラスミノゲンが微小血栓の溶解を顕著に促進させていることを示している。
量が顕著に上昇し(図6)、これはプラスミノゲンが微小血栓の溶解を顕著に促進させていることを示している。
実施例7はプラスミノゲンのマウス網膜毛細血管の損傷修復を促進することに関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス20匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループ各10匹ずつである。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に31日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。32日目にマウスを殺処分して左側眼球を取り、パラホルムアルデヒド固定液において24時間固定を行う。固定後の眼球から網膜を剥離した後、1mL 3%パンクレアチン(Solarbio)のEPチューブ中に入れ、振動テーブルにおいて37℃で2〜3h振動消化させる。網膜に軟化、脱落の現象が現れてからていねいに網膜を蒸留水の入ったEPチューブ中に移し、振動テーブルにおいて37℃で2〜3h振動させ、網膜上の余分な組織を脱落させる。優しく網膜を処理し、血管層のみが残るようにしてからスライド上にサンプルを広げて載せ、自然乾燥させる。網膜をSchiff氏液で染色させ(PAS染色)、1%塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水させてキシレンで透明にしてから封入を行い、顕微鏡下で400倍下にて観察を行う。
実験結果から分かるように、プラスミノゲン投与グループ(図7B)と比較して、溶媒PBS投与対照グループ(図7A)のdb/dbマウス網膜毛細血管の管径の太さが不均一で、血管の管壁が厚くなり深く染色され、血管内皮細胞(Δ)が増殖し、周細胞(↓)が明らかに減少している;定量分析により、プラスミノゲン投与グループと溶媒PBS投与対照グループを比較した場合、無細胞血管の長さ(図7C)が顕著に低下し、且つ統計学的分析結果から顕著な差異があることが示されている。これはプラスミノゲンがマウス網膜毛細血管損傷の修復を顕著に促進でき、これにより網膜損傷の修復を促進できることを示している。
実施例8はプラスミノゲンによるマウス腎臓フィブリン沈着の減少に関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス20匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループ各10匹ずつである。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に31日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。32日目にマウスを殺処分してから腎臓を取り、10%中性ホルマリン固定液にて24時間固定する。固定後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して1回水洗いする。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、2回水洗いし、毎回5分間である。10%の正常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間封止する;時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、PAPマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブ
リン(フィブリノーゲン)抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で顕色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒再染色して、流水で5分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止を行い、顕微鏡下で200倍下にて切片を観察する。
リン(フィブリノーゲン)抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で顕色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒再染色して、流水で5分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止を行い、顕微鏡下で200倍下にて切片を観察する。
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、有機体の損傷に対する刺激応答反応として、フィブリノーゲンは加水分解してフィブリンとなる(非特許文献22〜24)。そのためフィブリノーゲンレベルを損傷の程度の一つの指標とすることができる。フィブリンは組織損傷後に血栓を形成する主な成分であり、そのため、フィブリンレベルを血栓の一つの指標とすることができる。
研究により以下が示されている。溶媒PBS投与対照グループ(図8A)と比較して、プラスミノゲン投与グループ(図8B)のフィブリンの陽性着色が浅い。これはプラスミノゲンを注射することで顕著にマウス腎臓フィブリンの沈着を低減させ、プラスミノゲンはマウスの腎臓損傷に対して顕著な修復効果を有することが示され、さらにプラスミノゲンは腎臓組織血栓の溶解を促進できることを示している。
実施例9はプラスミノゲンのマウス腎臓アポトーシス阻害タンパクBcl−2の発現促進に関するものである。
24−25週齢db/dbオスマウスを20匹準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミン投与グループであり、各グループ10匹ずつである。実験開始当日を0日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与して1日目と記録する。連続的に31日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じてプラスミノゲンを尾部静脈から注射を行い、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。32日目にマウスを殺処分し、腎臓を取り10%中性ホルマリン固定液中において24時間固定させる。固定後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明化処理した後にパラフィンで包埋処理を行う。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して1回水洗いする。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、2回水洗いし、毎回5分間である。10%の正常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間封止する;時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、PAPマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスBcl−2抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で顕色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒再染色して、流水で5分間流す。透明になるよう段階的に脱水させてから封止を行い、顕微鏡下で200倍下にて切片を観察する。
Bcl−2は細胞アポトーシス阻害タンパクであり、アポトーシス刺激因子の作用下において発現が減少するように制御される(非特許文献26、27)。Bcl−2免疫染色の結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループ(図9B)の腎細管上皮細胞の陽性発現着色は明らかに溶媒PBS投与対照グループ(図9A)より深く、且つ前者の着色範囲がより広い。定量分析結果は観察結果と一致し、且つ顕著な差異を有する(図9C)。これは、プラスミノゲンは糖尿病マウス腎臓アポトーシス阻害分子Bcl−2的の発現を促進させ、これにより糖尿病マウス腎臓組織細胞のアポトーシスを阻害することを示
している。
している。
実施例10はプラスミノゲンが肝臓組織フィブリンレベルを減少させることに関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス10匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループ各5匹ずつである。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に31日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。32日目にマウスを殺処分してから肝臓を取り、10%中性ホルマリン固定液にて24時間固定する。固定後の腎臓組織をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して1回水洗いする。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、2回水洗いし、毎回5分間である。10%の正常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間封止する;時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、PAPマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブリン(フィブリノーゲン)抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で顕色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒再染色して、流水で5分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止を行い、顕微鏡下で200倍下にて切片を観察する。
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、有機体の損傷に対する刺激応答反応として、フィブリノーゲンは加水分解してフィブリンとなる(非特許文献22〜24)。そのためフィブリンを損傷の程度の一つの指標とすることができる。フィブリンは組織損傷後に血栓を形成する主な成分であり、そのため、フィブリンレベルを血栓の一つの指標とすることができる。
研究により以下が示されている。溶媒PBS投与対照グループ(図10A)と比較して、プラスミノゲン投与グループ(図10B)のマウス肝臓組織のフィブリンの陽性着色が浅く、これはプラスミノゲンを注射することで顕著にマウス肝臓フィブリンの沈着を低減させ、プラスミノゲンはマウスの肝臓損傷に対して顕著な修復効果を有することを反映し、プラスミノゲンが肝臓組織血栓の溶解を促進できることを示している。
実施例11はプラスミノゲンの肝臓組織の炎症修復の促進に関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス10匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループ各5匹ずつである。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に31日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。プラスミノゲンを31日間プラスミノゲン投与した後に、マウスを殺処分してから肝臓組織を取り、10%中性ホルマリン固定液中にて24時間固定する。固定後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで
包埋させる。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して1回水洗いする。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、2回水洗いし、毎回5分間である。10%の健常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間封止する;時間になった後に、血清を遠心により廃棄し、PAPマーカーで組織を囲む。F4/80のウサギポリグローナル抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗う。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で顕色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒再染色して、流水で5分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、切片を顕微鏡下で200倍にて観察する。
包埋させる。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して1回水洗いする。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、2回水洗いし、毎回5分間である。10%の健常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間封止する;時間になった後に、血清を遠心により廃棄し、PAPマーカーで組織を囲む。F4/80のウサギポリグローナル抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗う。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で顕色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒再染色して、流水で5分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、切片を顕微鏡下で200倍にて観察する。
F4/80はマクロファージマーカーである。マクロファージは炎症段階の主なマクロファージ細胞であり、生体の損傷箇所の組織及び細胞の壊死砕片及び病原体等を除去する作用を果たすものである。プラスミノゲン投与グループ(図11B)と溶媒PBS投与対照グループ(図11A)を比較した場合、プラスミノゲン投与グループのネズミのF4/80陽性レベルは明らかに低下し、これはプラスミノゲンを投与した後の肝臓組織の炎症の程度が減軽されていることを示している。図11CはF4/80免疫組織陽性発現数の定量分析の結果であり、プラスミノゲン投与グループのF4/80の発現量が顕著に減少され、且つ統計学的差異を有し、プラスミノゲンはマウスの肝臓炎症の修復を顕著に促進できることを示している。
実施例12はプラスミノゲンの神経損傷マウスの機械的触刺激による痛みに対する感知能力の修復促進に関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス10匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループ各5匹ずつである。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、さらに生理実験を始め、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に15日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し,溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。プラスミノゲン投与後の0、4、7、11、16日目にVon−Freyファイバー(Stoelting,USA)を用いて動物の機械性損傷に関する感受度を測定する。2.0gの力を開始力として、まずその左足を測定する。5回の刺激中に2回の足を引っ込める反応があれば陽性で、陽性であれば、1ランク小さい力でその右足に対して刺激を行う;陰性であれば、1ランク大きい力でその右足を刺激し、このように左右足を交互に刺激し、刺激の間隔は5分間であり、全部で6回刺激し、それからS.R.Chaplan et al.(1994)(非特許文献28)で紹介した方法によりその50%足の引っ込めが生じる閾値を計算する。
研究により、溶媒PBS投与対照グループと比較して、プラスミノゲン投与グループのマウスの機械的誘発疼痛に対する反応の均一性が増加し、且つ16日目測定した際に溶媒PBS投与対照グループに比較して極めて顕著な差異が見られている(図12)。これはプラスミノゲンが神経損傷糖尿病マウスの機械的触刺激による痛み(mechanical allodynia)に対する応答能力を修復できることを示している。
実施例13はプラスミノゲンの神経損傷マウスの冷刺激に対する感知の修復に関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス10匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ5匹ずつである。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に15日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。投与後の0、4、7、11、16日目に針注射器で一滴のアセトン液滴を押し出してさらにdb/dbマウスの足裏に接触させ、それが足裏全体を覆うようにする。左足から始め、3分間間隔で交互にその左右足を刺激し、全部で10回刺激し、その足を引っ込める反応の回数をカウントする。反応パーセンテージ=足を引っ込めた回数/刺激回数×100のパーセンテージである。
実験結果は以下を示している。0及び4日目に、プラスミノゲン投与グループ及び溶媒PBS投与対照グループはアセトン刺激に対して顕著な差異がなく、7日目から顕著な差異が観察され、16日目に極めて顕著な差異が観察され、P値<0.0001である(図7)。これは投与から15日後に、糖尿病マウスは冷刺激に対する反応がほとんど完全に回復され、これは、プラスミノゲンは極めて顕著に糖尿病末期マウスの冷刺激に対する刺激損傷を修復していることを示している。
実施例14はプラスミノゲンが神経損傷マウスの神経組織フィブリンレベルを減少させることに関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス10匹を準備し、ランダムで二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミン投与グループであり、各グループ5匹ずつである。実験開始当日を0日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与して1日目と記録する。連続的に15日間投与する。プラスミノゲン投与グループに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じてプラスミノゲンを尾部から静脈注射を行い、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。16日目にマウスを殺処分してから坐骨神経を取り、10%中性ホルマリン固定液にて24時間固定する。固定後の坐骨神経をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和して1回水洗いして、PAPマーカーで組織を囲む。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、3回水洗いする。10%の正常ヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間封止する;余分の血清を吸い取る。ウサギ抗マウスフィブリン(フィブリノーゲン)抗体(Abcam)室温で1時間インキュベーションしまたは4℃で終夜インキュベーションし、TBSで3回洗う。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで3回洗う。DABキット(Vector
laboratories,Inc.,USA)で顕色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒再染色して、流水で5分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止を行い、顕微鏡下で400倍下にて切片を観察する。
laboratories,Inc.,USA)で顕色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒再染色して、流水で5分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止を行い、顕微鏡下で400倍下にて切片を観察する。
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、有機体の損傷に対する刺激応答反応として、フィブリノーゲンは加水分解してフィブリンとなる(非特許文献22〜24)。そのためフィブリノーゲンレベルを損傷の程度の一つの指標とすることができる。フィブリンは組織損傷後に血栓を形成する主な成分であり、そのため、フィブリンレベルを血栓の一つの指標とすることができる。
研究により以下が示されている。溶媒PBS投与対照グループ(図14A)と比較して、プラスミノゲン投与グループ(図14B)のマウス坐骨神経のフィブリンのレベルが低下し、これはプラスミノゲンがフィブリンレベルを分解させる機能を有し、損傷がある程度修復されていることを示し、さらにはプラスミノゲンが神経組織周囲血栓の溶解を促進できることを示している。
実施例15はプラスミノゲンのマウス腎臓の損傷減軽に関するものである。
24−25週齢のdb/dbオスマウス8匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、毎組各4匹である。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に31日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。32日目に生理的指標を測定してから、マウスを殺処分して腎臓組織を取り10%中性ホルマリン固定液中において24時間固定させる。固定した後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは5μmで、切片を脱パラフィンさせて再水和した後にさらに1回水洗いする。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、2回水洗いし、毎回5分間である。ヤギ抗マウスIgM(HRP)抗体(Abcam)室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間である。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で顕色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒再染色して、流水で5分間洗い流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、顕微鏡下で400倍下にて切片を観察する。
IgM抗体はアポトーシス及び壊死した細胞を除去する過程において重要な役割を果たしている。細胞アポトーシス及び壊死細胞が多ければ多いほど、局所IgM抗体レベルは高いものとなる(非特許文献29〜31)。そのため、局所IgM抗体レベルは組織器官の損傷状況を反映することができる。
結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループ(図15B)のマウス腎糸球体IgMの陽性着色は溶媒PBS投与対照グループより浅く(図15A)、且つ範囲も対照グループより小さく、統計分析の結果と観察結果は一致している(図15C)。これはプラスミノゲンを注射した後の腎糸球体の損傷が明らかに改善され、プラスミノゲンは糖尿病マウスの生体損傷に対して顕著な修復機能を有することを反映している。
実施例16はプラスミノゲンのマウス肝臓損傷の修復促進に関するものである。
25−28週齢のdb/dbオスマウス9匹を取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒PBS投与対照グループ3匹、プラスミノゲン投与グループ6匹である。実験開始当日を0日目として体重計測してグループ分けを行い、実験2日目からプラスミノゲンまたはPBSを投与し始め、且つ1日目と記録する。連続的に31日間投与する。プラスミノゲン投与グループマウスに対して2mg/0.2mL/匹/日に応じて尾部静脈からプラスミノゲンを注射し,溶媒PBS投与対照グループに対して同じ体積のPBSを投与する。31日間プラスミノゲンを投与した後に、眼球を摘出して全血を採取し、血清が析出してから4℃、3500r/minにて10分間遠心させ、上澄み液を取って測定を行う。本実験はグルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素測定薬物キット(南京建成生物工程研究所、品番C009−2)を使用して、ライトマン−フランケル法(Reitman−
Frankel)を用いて血清中のグルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素(ALT)の含有量を測定する。
Frankel)を用いて血清中のグルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素(ALT)の含有量を測定する。
グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素は肝臓の健康状態を示す重要な指標であり(非特許文献32、33)、グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素の正常参考値の範囲は9〜50U/Lである。測定結果は以下を示している。溶媒PBS投与対照グループの血清中のALTの含有量は明らかに正常な生理的数値より高く、プラスミノゲン投与グループは既に体内の正常レベルに戻り、且つプラスミノゲン投与グループのALT含有量は溶媒PBS投与対照グループより顕著に低く、且つ統計学的差異を有する(図16)。これはモデルマウスにおいて、プラスミノゲンを注射することでより効果的に肝損傷を修復できることを示している。
Claims (12)
- プラスミノゲンを含む、被験者における心筋損傷を修復するための医薬組成物。
- 心臓のフィブリンの加水分解を促進するためのものである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 動脈壁損傷の修復を促進するためのものである、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 微小血栓の溶解を促進するためのものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- プラスミノゲンを含む、被験者における心血管病を予防及び/または治療するための医薬組成物。
- 前記プラスミノゲンは配列2と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記プラスミノゲンは一種類または複数種類の他の薬物と組み合わせて投与することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記他の薬物は、抗狭心症薬、高脂血症治療薬、血圧降下薬、抗炎症薬、抗感染薬、アルドステロン拮抗薬、血糖調整薬、インスリン、抗血栓薬を含むことを特徴とする、請求項7に記載の医薬組成物。
- 有効用量のプラスミノゲンを含有する容器、及び心筋損傷の修復におけるプラスミノゲンの投与を指導するプロトコルを含むことを特徴とする、被験者における心筋損傷を修復するための製品。
- さらに一種類または複数種類の他の薬物を含有する容器を含む、請求項9に記載の製品。
- 前記他の薬物は抗心血管病薬、抗糖尿病薬、抗血栓薬、抗感染薬、抗不整脈薬、高脂血症治療薬であることを特徴とする、請求項10に記載の製品。
- 前記プロトコルはさらに前記プラスミノゲンは前記他の薬物を投与する前、投与と同時、及び/または後に投与することを説明するものであることを特徴とする、請求項10または11に記載の製品。
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