JP2021007764A - 中枢神経損傷の修復に用いられる３次元多孔質ポリウレタン足場の調製における使用 - Google Patents

Abstract

【課題】損傷した中枢神経系を修復することができる、良好な動物実験効果を有し、実施難度が低い、中枢神経系を修復するための組織工学足場の提供。【解決手段】圧縮弾性率が０．００１〜１０．０メガパスカルであり、孔径が１０〜２００マイクロメートルであり、生体内の中枢神経損傷によって生じる中枢神経損傷修復足場を単独で構成することを特徴とする固体の３次元多孔質ポリウレタンの、前記中枢神経損傷修復足場の調製における使用。【選択図】図１

Description

本発明は、中枢神経損傷の修復の分野に関し、特に中枢神経損傷の修復に用いられる３次元多孔質ポリウレタン足場の調製における使用に関する。

一般的には、成人神経系の再生能力が限られているため、神経損傷を被った人は、感覚又は運動機能がある程度喪失し、神経因性疼痛を患う。

神経移植は、現在、神経損傷を治療するための「黄金律」である。しかし、ドナー不足及び手術のリスクが生じているため、この治療手段の拡大は非常に困難であり、さらに、期待するほどの治療効果が得られないのはネックとなっている。

組織工学技術の使用、特に損傷神経の修復を促進するための人工神経組織工学足場の使用は、近年注目を浴び、一連の顕著な結果を得ている。

しかし、現在の研究では主に、難度が比較的低い末梢神経の修復に焦点を当てており、難度が高い中枢神経の修復にはほとんど関与していない。これは、中枢神経系の再生能力が末梢神経系の再生能力よりもかなり弱いからである（Ｊ．Ｗ． Ｆａｗｃｅｔｔ， Ｒ．Ａ． Ａｓｈｅｒ， Ｔｈｅ ｇｌｉａｌ ｓｃａｒ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｒｅｐａｉｒ， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｂｕｌｌ． ４９ （１９９９） ３７７-３９１）。また、現在、中枢神経線維は、損傷後再生不能と認識されている（Ｓａｂｒｉｎａ Ｍｏｒｅｌｌｉ， Ａｎｔｏｎｅｌｌａ Ｐｉｓｃｉｏｎｅｒｉ， Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ （２０１２））。従って、末梢神経系に適用されている現在の修復方法のほとんどは、中枢神経系の修復に適用されない。これにより、既存の組織工学技術を利用して損傷した中枢神経を修復する研究は、長年にわたり大きな進歩を遂げておらず、これに対し、組織工学足場を利用して末梢神経系の修復において顕著な効果を得ている。

人工神経組織工学足場を用いて末梢神経系を修復する研究において、神経の修復は、ステント構造、化学的又は生物学的に誘発される刺激等の要因に依存する可能性があると見出され、そしてこの発見に基づいて分解性天然高分子材料（例えば、コラーゲン、キトサン、アルギン酸塩等）又は人工合成分解性材料（例えば、ポリラクチドーポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリピロール等）を用いて、中空管や電界紡糸繊維膜等のステントを製造し、ある程度の末梢神経修復効果を得た。これに基づいて、機能細胞（例えば、シュワン細胞、嗅神経鞘細胞、神経幹細胞等）又は成長因子（例えば、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子等）を植え込むことにより、より良好な末梢神経修復効果が実現される。

しかし、中枢神経系の修復については、これまで適切で且つ顕著な効果を有する人工神経組織工学足場は未だ見いだされていない。既存の報告では、研究者らは通常、ゲルのみを中枢神経系修復のステントとして使用し、さらに、植え込まれた細胞と携帯された因子との共同作用のみにおいて一定の効果を達成することができる。ゲルステントは、生体内での維持時間が非常に短いため、長期的な修復作用を提供することができないことは認識されたい。現在知っている限り、既存の研究成果のいずれも被験動物の元の神経機能を回復させることができないのは、さらに重要である。即ち、現在の研究成果は主に、生体外実験のレベルに留まっており、中枢神経系を修復するための実用的価値を有するステントを見出す方法は、依然としてこの研究分野における大きな課題である。

研究者らは、ゲルの維持時間が短いという欠点を克服するために、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）３次元ナノファイバーをステントとして使用して中枢神経系を修復することを試みた。得られた成果は、ステントの維持時間が短いという問題をある程度解決したが、その修復効果の発生が植え込まれた神経幹細胞（ＮＳＣ）に依存する。さらに重要なのは、それがまだ生体外実験のレベルに留まっており、実用的な見通しが明らかに示されていないことである。

医療分野において、ある技術の実用的な見通しを判断する際に、生体内実験の結果が有効か否か、及び、再現性が良好か否かが基本指標となる。細胞を含むステントについては、細胞の機能が環境によって大きく影響されるため、ステントの植込中及びステントの植込後の治療効果を発揮する過程において、植込処理ステップ、植込部位の周囲環境及びその生理環境が修復効果の優劣に影響を与える。従って、既存の中枢神経の修復方法は、期待される優れた動物実験結果をまだ果たしておらず、実施に至っても、その難度が非常に大きい。

上記の内容に鑑み、損傷した中枢神経系を修復することができる、良好な動物実験効果
を有し、実施難度が低い中枢神経系を修復するための組織工学足場を見出すことが、当技術分野において急務である。

従来技術の欠点に対して、本発明は、中枢神経損傷によって生じる中枢神経損傷の修復足場を単独で構成する固体の３次元多孔質ポリウレタンの、中枢神経損傷修復足場の調製における使用を提供することが１つの目的である。３次元多孔質ポリウレタンは、神経細胞の接着、移動、成長及びシナプスのリモデリングを促進することができる。さらに重要なのは、脳損傷によって生じた中枢神経損傷を被った被験動物の元の神経機能の一部を回復させることができ、従来技術における、ステントを使用するだけで損傷した中枢神経の機能が回復できないという重大な技術的問題を解決することである。

好ましくは、３次元多孔質ポリウレタンは、生体内における内因性修復に用いられる中枢神経損傷修復に用いられる。

好ましくは、３次元多孔質ポリウレタンは、生体内における内因性脳組織修復を高める。

当該ステントは、圧縮弾性率が０．００１〜１０．０メガパスカルであり、孔径が１０〜２００マイクロメートルである３次元多孔質ポリウレタンを含む。

末梢神経修復のために使用されている組織工学足場を用いて中枢神経を修復することは、数年もの実験検証により、満足のいく結果を得ることが困難である。これは、中枢神経系が損傷後、その周囲の神経再生を阻害する環境が生成されることにより、損傷した中枢神経系の修復を阻害するからである。現在、中枢神経に対する修復効果を有する生体外実験は主に、関連細胞及び因子を含むキトサンゲル足場の研究に焦点を当てており、良好な生体内修復効果（主に元の神経機能に対する修復効果）を有する研究がほとんど報道されていない。

ポリウレタンは、良好な生体適合性を有するため、薬物送達、組織工学足場等に応用されていれば、損傷した末梢神経系修復の研究においても広く使用されている。中枢神経系修復の分野において、２０１５年８月１７日に、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓというこの分野における有名な雑誌には、神経幹細胞を有する感熱性ポリウレタンゲルを用いて、ゼブラフィッシュの損傷した中枢神経系の修復に関する研究が発表され、良好な効果が得られたが、ゼブラフィッシュは、低レベルの生物に過ぎず、そのゲインラインが哺乳動物と大きな差を有する。また、当該研究において、ステントとして使用されるＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＬＧＡ（乳酸−グリコール酸共重合体）又はＰＣＬ（ポリカプロラクトン）等の材料が有する弾性が低く又は加工しにくいという欠点、及び、使用される天然高分子が有する機械的強度が低いという欠点のみが解決された。これらのほか、この分野ではこれ以上の画期的な貢献がなく、損傷した中枢神経系を修復するのに、依然として神経幹細胞に強く依存しなければならない。

本発明の発明者は、鋭意研究を重ねた結果、圧縮弾性率が０．００１〜１０．０メガパスカルであり、孔径が１０〜２００マイクロメートルである３次元多孔質ポリウレタンを含むステントのみを利用することで損傷した中枢神経を効果的に修復することができることを見出した。さらに、これにより、中枢神経が損傷した後の被験動物の元の神経機能（特に運動機能）の一部が直接回復されることについては、言及すべきである。本発明により、ゲルの生体内での維持時間が短く、細胞の植込作業が複雑で且つ環境の影響を受けやすいという欠点が解決されるだけでなく、中枢神経系に対する修復効果が著しく改善され、被験動物の一部の運動機能が回復される。現在、本発明に係る損傷した中枢神経系を修復するメカニズムは、完全に解明されておらず、まだ研究されている最中にある。

明らかに、本発明のこの分野に対する貢献は、以下の通りである。本発明は、維持時間が短く、操作難度が高く、環境の影響を受けやすいという従来技術の欠点を克服し、損傷した中枢神経系を修復する顕著な効果を有する組織工学足場を提供する。

好ましくは、前記３次元多孔質ポリウレタンの圧縮弾性率が０．０１〜７．０メガパスカルであり、さらに好ましくは、前記３次元多孔質ポリウレタンの圧縮弾性率が０．１〜３．０メガパスカルである。

好ましくは、前記３次元多孔質ポリウレタンの孔径が２０〜１５０マイクロメートルである。

前記３次元多孔質ポリウレタンのポロシティは、３０％〜９５％であり、好ましくは７０％〜９０％である。

神経系を修復するためには、ステントの機械的特性、孔径及びポロシティが重要な役割を果たしている。

理論的に言えば、ステントは、圧縮弾性率が低すぎると、細胞成長を支持する作用を発揮することができず、圧縮弾性率が高すぎると、周囲の組織に損傷を与えるおそれがある。また、ステントの孔径が小さすぎると、細胞が入りにくいが、孔径が大きすぎると、細胞接着のための部位が少なくなり、細胞の成長に寄与しない。また、ステントのポロシティが小さすぎると、細胞間の栄養伝達及び細胞間の成長シグナルがブロックされ、細胞成長に寄与しない。一方、ステントは、ポロシティが大きすぎると、材料の機械的特性があまりにも劣り、細胞成長を支持する役割を果たすことができない。

末梢神経系の修復についても中枢神経系の修復についても、上記の知見は当該分野において常識となっている。しかしながら、この分野の研究者らは、長年に亘った研究にも関わらず、依然としてステントの圧縮弾性率、孔径及びポロシティのみを調整することによって、損傷した中枢神経系の修復を実現することができない。３次元多孔質ポリウレタンの圧縮弾性率、孔径及びポロシティが上記の各好ましい範囲内にある場合において、本発明に係るステントの損傷した中枢神経に対する修復効果がより良好であるが、そのメカニズムについては、さらなる調査が必要である。

前記３次元多孔質ポリウレタンの構造は、ポリウレタン電界紡糸繊維多孔質足場、ポリウレタン凍結乾燥多孔質足場、ポリウレタン３Ｄ印刷多孔質足場、ポリウレタン粒子浸出多孔質足場、及びガス発泡ポリウレタン多孔質足場のうちの１つを含む。

好ましくは、前記３次元多孔質ポリウレタン足場は、機能性サイトカイン及び／又は機能細胞をさらに備えている。前記機能性サイトカインは、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、及びグリア由来神経栄養因子の少なくとも１つを含む。

機能性サイトカイン及び／又は機能細胞の植込により、中枢神経系の修復効果がさらに向上する。ここで、本発明のステントにおける３次元多孔質ポリウレタンは、本発明の優れた効果の鍵であり、機能性サイトカイン及び／又は機能細胞の添加は、既に得られた優れた結果に基づいて修復効果をさらに高める役割にすぎず、機能性サイトカイン及び／又は機能細胞の添加は、本発明の技術的効果を得るために不可欠ではないことは理解されたい。

前記中枢神経損傷は、脳損傷、脊髄損傷及び網膜損傷のうちの１つを含む。

３次元多孔質ポリウレタンの、中枢神経損傷修復足場の調製における使用は、少なくともポリウレタンを含み、、凍結乾燥法、エレクトロスピニング法、３Ｄ印刷法、粒子浸出法、ガス発泡法のうちの１つを含む。前記ポリウレタンは、生分解性熱可塑性ポリウレタン又は架橋生分解性ポリウレタンを含む生分解性ポリウレタンを含む。

前記凍結乾燥法のプロセスは、ポリウレタンエマルジョンを４℃で４時間保存し、エマルジョン内のガスを除去し、次に、−２０℃で一晩放置してから２日間凍結乾燥を行い、その後乾かして得ることである。

前記エレクトロスピニング法のプロセスは、ポリウレタンを、テトラヒドロフランとジメチルアセトアミドとの混合溶媒又はヘキサフルオロイソプロパノール内に溶解し、錫箔を受容体として電界紡糸でポリウレタン電界紡糸繊維多孔質足場を得ることである。

前記３Ｄ印刷法のプロセスは、ポリウレタンエマルジョン内にゼラチンを加え、３Ｄ印刷を行ってポリウレタン３Ｄ印刷多孔質足場を得ることである。

前記粒子浸出法のプロセスは、ポリウレタンエマルジョン内に塩化ナトリウムを加えた後、溶液を平滑な表面に広げて自然揮発させた後乾燥させ、次に、塩化ナトリウム粒子を水で洗浄してポリウレタン粒子浸出多孔質足場を得ることである。

前記ガス発泡法のプロセスは、ポリウレタン溶液を乾燥させて膜を得た後、得られた膜を超臨界二酸化炭素内に飽和状態になるまで浸漬し、最後に、常圧状態まで減圧してガス発泡ポリウレタン多孔質足場を得ることである。

好ましくは、前記原料は、機能性サイトカイン及び／又は機能細胞をさらに備えている。前記機能性サイトカインは、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、及びグリア由来神経栄養因子の少なくとも１つを含む。

もう１つの目的として、本発明は、中枢神経損傷の修復における前記３次元多孔質ポリウレタンの使用を提供する。

本発明に係る３次元多孔質ポリウレタンは、機能細胞又は機能性サイトカインを追加して植え込むことなく効果的な中枢神経修復機能を有するため、被験動物の元の神経機能の一部を回復させることができる。本発明に係る３次元多孔質ポリウレタンの、中枢神経損傷修復足場の調製における使用は簡単であり、幅広い使用見通しを有する。

本発明に係る３次元多孔質ポリウレタン足場のＳＥＭでの形態学的特徴付けの結果である。ここで、Ａは、凍結乾燥された３次元多孔質架橋生分解性ポリウレタン足場の断面形態である。Ｂは、凍結乾燥された３次元多孔質架橋生分解性ポリウレタン足場の表面形態である。 本発明で使用されたモデルにおける術後のラットの神経機能の採点結果である。 本発明で使用されたモデルにおいて、本発明に係る多孔質ポリウレタン足場を植え込む前及び植え込んだ後の形態学的特徴付けである。ここで、Ａは、凍結乾燥された３次元多孔質架橋生分解性ポリウレタン足場をラットに植え込む手術中の状況であり、破線の枠内がステントを植え込む箇所である。Ｂは、比較例において生理食塩水をラットに投入する手術中の状況である。Ｃは、凍結乾燥された３次元多孔質架橋生分解性ポリウレタン足場をラットに植え込んで８週間後の脳の形態であり、破線の枠内がステントを植え込んだ箇所である。Ｄは、比較例において生理食塩水をラットに投入して８週間後の脳の形態であり、破線の枠内が生理食塩水を投入した箇所である。 本発明の実施例１で使用されたモデルにおいて、ステントの植込から４週間後の脳組織の凍結切片のＨＥ染色の結果図である。図Ａは、１００倍の拡大画像であり、Ｂは、２００倍の拡大画像である。 本発明の実施例１で使用されたモデルにおいて、ステントの植込から８週間後の脳組織のパラフィン切片ＨＥ染色の結果図である。図Ａは、ステントの再生部の縁部状況を示す４００倍の拡大画像であり、矢印箇所が分解されたステントである。Ｂは、ステントの再生部の中心状況を示す４００倍の拡大画像であり、矢印箇所が分解されたステントである。 本発明で使用されたモデルにおいて、軸索再生効果を示す共焦点レーザースキャン結果図である。ここで、Ａは、実施例１における脳組織の細胞核である。Ｂは、実施例１におけるＧＡＰ４３の術後４週間の発現状況である。Ｃは、実施例１における細胞核とＧＡＰ４３との合成図である。Ｄは、比較例における脳組織の細胞核である。Ｅは、比較例におけるＧＡＰ４３の術後４週間の発現状況である。Ｆは、比較例における細胞核とＧＡＰ４３との合成図である。 本発明で使用されたモデルにおいて、シナプスの再構築効果を示す共焦点レーザースキャン結果図である。ここで、Ａは、実施例１における脳組織の細胞核である。Ｂは、実施例１におけるシナプトフィジンの術後８週間の発現状況である。Ｃは、実施例１における細胞核とシナプトフィジンとの合成図である。Ｄは、比較例における脳組織の細胞核である。Ｅは、比較例におけるシナプトフィジンの術後８週間の発現状況である。Ｆは、比較例における細胞核とシナプトフィジンとの合成図である。 ＧＡＰ４３とシナプトフィジンとのウェスタンブロッティング実験の結果図である。

以下、実施例を挙げつつ本発明について詳細に説明する。以下の実施例は、本発明についてのさらなる説明に用いられるだけであり、本発明の保護範囲を限定するものではないことは理解されたい。当業者が上記の発明内容に基づいて成した非本質的な変更及び調整は、本発明の保護範囲内に属す。

＜実施例１＞
架橋した生分解性ポリウレタン水性エマルジョンを４℃で４時間保存し、エマルジョン内のガスを除去し、次に、−２０℃で一晩放置してから２４時間凍結乾燥を行い、その後、４０℃で乾かして凍結乾燥した３次元多孔質ポリウレタン足場を得た。図１に示された構造のように、その平均気孔径は８０μｍ、ポロシティは９０％、圧縮弾性率は１．０ＭＰａであった。この凍結乾燥された３次元多孔質架橋生分解性ポリウレタン足場を用いて、ラットの脳軸索及びシナプス再生機能を修復した。

＜実施例２＞
生分解性熱可塑性ポリウレタンをジメチルスルホキシドに溶解して、質量濃度が３０％の溶液として調製し、４℃で４時間保存し、溶液内のガスを除去し、次に、−２０℃で一晩放置してから２４時間凍結乾燥を行って、凍結乾燥した３次元多孔質ポリウレタン足場を得た。その平均気孔径は１５０μｍであり、ポロシティは７０％であり、圧縮弾性率は３．０ＭＰａであった。この凍結乾燥した３次元多孔質生分解性熱可塑性ポリウレタン足場を用いて、ラットの脳軸索及びシナプス再生機能を修復した。

＜実施例３＞
架橋した生分解性ポリウレタンエマルジョン内に質量比が４０％の塩化ナトリウムを加えた後、エマルジョンを平滑な表面に広げて、４日間自然揮発させた後乾燥させ、次に、塩化ナトリウム粒子を水で洗浄して、粒子浸出した３次元多孔質架橋生分解性ポリウレタン足場を得た。その平均気孔径は２００μｍであり、ポロシティは３０％であり、圧縮弾性率は７．０ＭＰａであった。この粒子浸出した３次元多孔質架橋生分解性ポリウレタン足場を用いて、ラットの脳軸索及びシナプス再生機能を修復した。

＜実施例４＞
生分解性熱可塑性ポリウレタンをテトラヒドロフランとジメチルアセトアミドとの混合溶媒に溶解し、錫箔を受容体として、電界紡糸の電圧を２０ｋｖ、捕集距離を１５ｃｍ、流速を１ｍｌ／ｈと設定して、電界紡糸法で電界紡糸繊維の生分解性熱可塑性ポリウレタン足場を得た。その平均気孔径は１００μｍであり、ポロシティは８５％であり、圧縮弾性率は０．００１ＭＰａであった。この電界紡糸繊維生分解性熱可塑性ポリウレタン足場を用いて、ラットの脳軸索及びシナプス再生機能を修復した。

＜実施例５＞
生分解性熱可塑性ポリウレタン溶液を乾燥させて膜を得た後、得られた膜を超臨界二酸化炭素内に飽和状態になるまで浸漬し、最後に、常圧状態まで減圧してガス発泡３次元多孔質生分解性熱可塑性ポリウレタン足場を得た。その平均気孔径は２０μｍであり、ポロシティは４０％であり、圧縮弾性率は１０．０ＭＰａであった。このガス発泡３次元多孔質生分解性熱可塑性ポリウレタン足場を用いて、ラットの脳軸索及びシナプス再生機能を修復した。

＜実施例６＞
生分解性熱可塑性ポリウレタンをテトラヒドロフランとジメチルアセトアミドとの混合溶媒に溶解し、錫箔を受容体として、電界紡糸の電圧を１５ｋｖ、捕集距離を１０ｃｍ、流速を０．５ｍｌ／ｈと設定して、電界紡糸法で電界紡糸繊維の生分解性熱可塑性ポリウレタン足場を得た。その平均気孔径は１０μｍであり、ポロシティは８５％であり、圧縮弾性率は０．０１ＭＰａであった。この電界紡糸繊維生分解性熱可塑性ポリウレタン足場を用いて、ラットの脳軸索及びシナプス再生機能を修復した。

＜実施例７＞
架橋した生分解性ポリウレタン水性エマルジョンに神経成長因子を加えて、４℃で４時間保存し、エマルジョン内のガスを除去し、次に、−２０℃で一晩放置してから２４時間凍結乾燥を行い、その後、乾燥箱を使用して４０℃で乾かして、成長因子を含む凍結乾燥した３次元多孔質ポリウレタン足場を得た。その平均気孔径は８０μｍであり、ポロシティは８５％であり、圧縮弾性率は１．０ＭＰａであった。この神経成長因子を加えた足場を用いて、ラットの脳軸索及びシナプス再生機能を修復した。

＜実験例＞
実施例１〜７で得られた３次元多孔質ポリウレタン足場について関連する実験を行った。具体的な実験内容は、以下の通りである。

二、動物実験
（一）動物モデルの確立
成体ＳＤラットに対して１０％の抱水クロラール（０．５ｍｌ／１００ｇ）で麻酔し、麻酔終了後、頭部の毛を剃毛し、ラットの頭部で正中切開して大泉門を見つけた後、大泉門の前方から大きさ５×４ｍｍの骨窓を開けて硬膜を除去し、次に、大きさ４ｍｍ×４ｍｍ×３ｍｍのＭ１ゾーンを取り除いた。完全に止血した後、実施例１〜７で得られた３次元多孔質生分解性ポリウレタン足場をそれぞれ移植し、骨窓を封じる必要がなく止血後皮膚を縫合した。術後、感染を防ぐためにセファチアミジン（Ｃｅｆａｔｈｉａｍｉｄｉｎｅ）（０．０５ｇ／日）を３日間連続的に注射した。ラットのＭ１ゾーンを切除して３次元多孔質ポリウレタン足場を植え込んで２、４、８週間後に、ラットの前肢運動機能の回復状況を観察且つ採点した後、ラットを処分した。

比較例：ラットの頭蓋脳損傷モデルの製造方法は、実施例における動物モデルと同様であった。モデルの製造後にポリウレタン足場の代わりに生理食塩水を使用して脳組織に充填する以外に、ほかの手術プロセス及び飼育環境が同じであり、同様に、実施例におけるステントを植え込んで２、４、８週間後、比較グループにおけるラットの前肢運動機能の回復状況を観察且つ採点した後、ラットを処分した。

（ニ）機能評価
この実験において、主な機能が前肢運動であるラットのＭ１ゾーンを切除したため、ベダーソン（Ｂｅｄｅｒｓｏｎ）スコア基準を用いて実験結果を評価した。スコア基準については、表１を参照されたい。具体的には、以下の通りである。ラットの尾部を１メートルの高さまで持ち上げて両側の上肢を観察した。両上肢が地面を指している場合は、麻痺がないと判断して０点を記録し、手術の対側に連続痙縮が起こる場合は１点を記録する。１点と記録されたラットを、その手が地面を確実に掴むように、摩擦力を十分に有する地面に放置し、その尾を穏やかに持ち上げて、前肢が一定の距離移動するまで各方向から側力を与えた。患側の側力に対する抵抗が低下した場合、２点を記録する。２点と記録されたラットを自由に動かせ、ラットが円形運動を行うようになった場合は、３点を記録する。

ベダーソンスコア方法を採用して、ラットのＭ１ゾーンを切除して実施例１〜７で得られた３次元多孔質ポリウレタン足場を植え込んで２、４、８週間後のラットの前肢運動機能

図２に示すように、本発明の各実施例における神経機能に対するスコア平均値は、比較例より著しく低下している。結果として、平均孔径が８０μｍ、ポロシティが９０％、圧縮弾性率が１．０ＭＰａである、実施例１における凍結乾燥された３次元多孔質架橋生分解性ポリウレタン足場をラットに植え込んで８週間後、ベダーソンスコアの平均値は比較例より１．５点低い。平均孔径が１５０μｍ、ポロシティが７０％、圧縮弾性率が３．０ＭＰａである、実施例２における凍結乾燥された３次元多孔質生分解性熱可塑性ポリウレタン足場をラットに植え込んで８週間後、ベダーソンスコアの平均値は比較例より１．０点低い。平均孔径が２００μｍ、ポロシティが３０％、圧縮弾性率が７．０ＭＰａである、実施例３における粒子浸出した３次元多孔質架橋生分解性ポリウレタン足場をラットに植え込んで８週間後、ベダーソンスコアの平均値は比較例より１．１点低い。平均孔径が１００μｍ、ポロシティが８５％、圧縮弾性率が０．００１ＭＰａである、実施例４における電界紡糸繊維生分解性熱可塑性ポリウレタン足場をラットに植え込んで８週間後、ベダーソンスコアの平均値は比較例より１．３点低い。平均孔径が２０μｍ、ポロシティが４０％、圧縮弾性率が１０．０ＭＰａである、実施例５におけるガス発泡３次元多孔質生分解性熱可塑性ポリウレタン足場をラットに植え込んで８週間後、ベダーソンスコアの平均値は比較例より１．１点低い。平均孔径が１０μｍ、ポロシティが８５％、圧縮弾性率が０．０１ＭＰａである、実施例６における電界紡糸繊維生分解性熱可塑性ポリウレタン足場をラットに植え込んで８週間後、ベダーソンスコアの平均値は比較例より０．９点低い。平均孔径が８０μｍ、ポロシティが８５％、圧縮弾性率が１．０ＭＰａである、実施例７で神経成長因子を加えた場合の凍結乾燥された３次元多孔質架橋生分解性ポリウレタン足場をラットに植え込んで８週間後、ベダーソンスコアの平均値は比較例より１．７点低い。

上記の結果により、本発明のすべての実施例における３次元多孔質ポリウレタン足場は、ラットの前肢運動機能の一部を効果的に回復させることができ、神経成長因子を添加したステントの補修効果がより良好であることが証明された。

図３は、３次元多孔質ポリウレタン足場をラットに移植する際の手術方法図及び比較例における手術図であり、また、３次元多孔質ポリウレタン足場を移植して８週間後の生体内状況及び比較例における生体内状況を示している。結果により、比較例に対して、本発明に係る３次元多孔質ポリウレタン足場は、手術中において、細胞浸潤、軸索再生及びシナプスの再構築を支持するために、ステントの完全性を維持するのに十分な強度を有することが示された。

（三）組織学的評価
記録評価後にラットを処分し、ＰＢＳを利用して脳組織に灌流した後、脳組織を取り出し、充填材料部分をＯＣＴゲルにおいて−８０℃で凍結させ、５μｍの切片にスライスした後、４％のパラホルムアルデヒドで１時間固定し、次に、ＰＢＳで切片を２回洗浄した。０．３％のＴｒｉｔｉｏｎ Ｘ−１００を利用して１５分間穴打抜きし、ＰＢＳで１回洗浄した後、室温において抗原ブロッキング溶液で１時間ブロッキングした。 ＰＢＳで２回洗浄した後、一次抗体を添加して４℃で一晩放置した。ＰＢＳを使用して２回洗浄した後、二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩを添加して１５分間染色した。抗蛍光消光剤を使用して封入し、翌日共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。

注：この実験における一次抗体として、抗ＧＡＰ４３抗体及び抗シナプトフィジン抗体を使用した。ＧＡＰ４３は、極め付きの神経再生の印であり、軸索再生及びシナプスが形成する際に高発現となる。シナプトフィジンは、シナプスを代表する、信頼性のある印であると認識されている。

図４及び図５に示すように、ＨＥ染色結果は、神経線維が本発明に係るステントの縁部からステントの中間部まで急速に成長し、血管もステントに入ったが、炎症又は不利な組織反応が発生していないことを示した。

図６及び図７に示すように、本発明に係る３次元多孔質ポリウレタンをステントとした手術の４週間後、ＧＡＰ４３の発現量が多かった。また、手術の８週間後のシナプトフィジンも大量に発現した。これにより、軸索及びシナプスが修復されて再構築されたことがわかる。

（四）ウェスタンブロッティング
灌流後のラットの脳組織を採取し、充填材料部分を選択して液体窒素内で粉砕し、組織粉末をＲＩＰＡ＋ＰＭＳＦ（５μＬ／ｍＬ）で３０分間消化した。４℃で５分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。タンパク質含有量を測定した後、ローディングバッファーを添加して、１００℃で１０分間沸騰させた。ガラス板を洗浄した後、４％の濃縮ゲルを調製し、ＴＥＭＥＤを加えた後直ちにゲルを灌注した。濃縮ゲルが凝固した後、電気泳動槽内にゲルを入れ、電気泳動液を十分に加えてローディングした。電圧を１２０Ｖに設定し、１時間の電気泳動を行った。７．０〜８．３ｃｍのろ紙６枚及び７．３〜８．６ｃｍのニトロセルロース膜１枚を用意し、クランプをブロッティングタンク内に入れ、６０Ｖで２時間、又は、４０Ｖで３時間ブロッティングし、必要に備えるために膜を乾燥させた。膜をＴＢＳで下部から上部へ湿らせた後、ブロッキング溶液（５％のスキムミルク）を含むシャーレに移し、室温においてシェーカー上で２時間シェイクしてブロッキング処理を行い、一次抗体を適切な濃度まで希釈し、膜及び抗体を４セルシウス度で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴを用いて室温においてシェーカー上で３回洗浄し、毎回１０ｍｉｎであった。二次抗体を適切な濃度まで希釈して膜と接触させ、室温下で１〜２ｈインキュベートし、ＴＢＳＴを用いて室温においてシェーカー上で３回洗浄し、毎回１０ｍｉｎであった。ＥＣＬのＡ試薬とＢ試薬とを混合し、膜タンパク質表面が位置する面と１〜２ｍｉｎ十分に接触させた後、残液を完全に除去して、きちんと包んでからＸ線フィルムカセッテ内に入れた。暗室において１×現像液及び定着液をそれぞれプラスチックトレイに注いだ。赤色光の下でＸ線フィルムを取り除き、ペーパーカッターで適切なサイズに切断し、Ｘ線フィルムカセッテを開き、Ｘ線フィルムを膜に置いて、Ｘ線フィルムカセッテを閉じてタイムカウントを開始した。信号の強度に応じて露光時間（通常は、１ｍｉｎ又は５ｍｉｎ）を適切に調整した。露光終了後、Ｘ線フィルムカセッテを開き、Ｘ線フィルムを取り出し、速やかに現像液内に浸して現像を行い、明白なバンドが現れたら、直ちに現像を終了した。現像時間は通常１〜２ｍｉｎ（２０〜２５℃）であり、温度が低すぎる場合（１６℃未満）は現像時間を適切に延長する必要がある。現像終了後、直ちにＸ線フィルムを定着液に浸漬し、通常、フィルムが透明になるまでの定着時間が５〜１０ｍｉｎである。残留定着液を水道水ですすぎ、室温で乾燥させた。フィルムをスキャン又は写真撮影し、ゲル画像処理システムを用いて標的バンドの分子量及び純光学密度を分析した。

注：この実験における一次抗体として、抗ＧＡＰ４３抗体及び抗シナプトフィジン抗体を使用した。ＧＡＰ４３は、極め付きの神経再生の印であり、軸索再生及びシナプスが形成する際に高発現となる。シナプトフィジンは、シナプスを代表する、信頼のある印であると認識されている。

ウェスタンブロッティングの実験結果は、本発明に係るステントが移植された後のシナプトフィジン及びＧＡＰ４３の発現結果を検証することができる。図８に示すように、比較例と比較して、実施例における神経軸索再生は顕著な回復を得た。

Claims (14)

1. 圧縮弾性率が０．００１〜１０．０メガパスカルであり、孔径が１０〜２００マイクロメートルであり、生体内の中枢神経損傷によって生じる中枢神経損傷修復足場を単独で構成することを特徴とする固体の３次元多孔質ポリウレタンの、前記中枢神経損傷修復足場の調製における使用。
2. 前記３次元多孔質ポリウレタンは、生体内における内因性修復に用いられる中枢神経損傷修復足場を単独で構成することを特徴とする請求項１に記載の使用。
3. 前記３次元多孔質ポリウレタンは、生体内における内因性脳組織修復を高めることを特徴とする請求項２に記載の使用。
4. 前記３次元多孔質ポリウレタンの圧縮弾性率が０．０１〜７．０メガパスカルであり、前記３次元多孔質ポリウレタンの孔径が２０〜１５０マイクロメートルであることを特徴とする請求項１〜３に記載の使用。
5. 前記３次元多孔質ポリウレタンの圧縮弾性率が０．１〜３．０メガパスカルであることを特徴とする請求項１〜４に記載の使用。
6. 前記３次元多孔質ポリウレタンのポロシティが３０〜９５％であることを特徴とする請求項１〜３に記載の使用。
7. 前記３次元多孔質ポリウレタンのポロシティが３０〜９５％であることを特徴とする請求項５に記載の使用。
8. 前記３次元多孔質ポリウレタンのポロシティが７０〜９０％であることを特徴とする請求項６又は７に記載の使用。
9. 前記ポリウレタンは、生分解性熱可塑性ポリウレタン又は架橋生分解性ポリウレタンを含む生分解性ポリウレタンを備えていることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
10. 前記足場は、機能性サイトカイン及び機能細胞の少なくとも一方をさらに備え、前記機能性サイトカインは、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、及びグリア由来神経栄養因子の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
11. 前記中枢神経損傷修復足場は、ポリウレタン電界紡糸繊維多孔質足場、ポリウレタン凍結乾燥多孔質足場、ポリウレタン３Ｄ印刷多孔質足場、ポリウレタン粒子浸出多孔質足場、及び、ガス発泡ポリウレタン多孔質足場の１つを備えていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
12. 前記中枢神経損傷は、脳損傷、脊髄神経損傷及び視神経損傷の１つを含むことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
13. 前記中枢神経損傷修復足場の調製における使用は、凍結乾燥法、エレクトロスピニング法、３Ｄ印刷法、粒子浸出法、ガス発泡法の１つを含み、前記ポリウレタンは、生分解性熱可塑性ポリウレタン又は架橋生分解性ポリウレタンを含む生分解性ポリウレタンを含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
14. 前記凍結乾燥法のプロセスは、ポリウレタンエマルジョンを４℃で保存し、エマルジョン内のガスを除去した後、−２０℃で一晩放置してから凍結乾燥を行い、その後乾かして得ることであり、
    前記エレクトロスピニング法のプロセスは、ポリウレタンを、テトラヒドロフランとジメチルアセトアミドとの混合溶媒又はヘキサフルオロイソプロパノール内に溶解し、錫箔を受容体として電界紡糸を行ってポリウレタン電界紡糸繊維多孔質足場を得ることであり、
    前記３Ｄ印刷法のプロセスは、ポリウレタンエマルジョン内にゼラチンを加え、３Ｄ印刷を行ってポリウレタン３Ｄ印刷多孔質足場を得ることであり、
    前記粒子浸出法のプロセスは、ポリウレタンエマルジョン内に塩化ナトリウムを加えた後、溶液を平滑な表面に広げて自然揮発させた後乾燥させ、次に、塩化ナトリウム粒子を水で洗浄してポリウレタン粒子浸出多孔質足場を得ることであり、
    前記ガス発泡法のプロセスは、ポリウレタン溶液を乾燥させて膜を得た後、得られた膜を超臨界二酸化炭素内に飽和状態になるまで浸漬し、最後に、常圧状態まで減圧してガス発泡ポリウレタン多孔質足場を得ることであることを特徴とする請求項１３に記載の使用。