JP2020535807A - デジタルヌクレアーゼ検出組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年9月29日に出願された米国仮出願第62/565,674号に基づく優先権を主張する。上記で引用した出願の全内容は、本明細書によって参考として本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた連邦政府助成金番号R01 AI106738の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明にある一定の権利を保有する。
蛍光を消光させる化学部分は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)プロセスおよび基底状態消光を含む多様な機構を通して作動する。FRETは、蛍光消光の最も一般的な機構の1つであり、蛍光ドナーの発出スペクトルがクエンチャーの吸収スペクトルとオーバーラップする場合、ならびにドナーおよびクエンチャーがフェルスター距離として公知の十分な距離内にある場合に起こり得る。クエンチャーによって吸収されたエネルギーは、次にクエンチャーの化学的性質に応じて多様な機構を通して放出され得る。捕獲されたエネルギーは、蛍光を通して、もしくは電荷移動および衝突機構を含む非蛍光機構を通して、またはそのような機構の組合せを通して放出され得る。クエンチャーが、非蛍光機構を通して、捕獲されたエネルギーを放出する場合、FRETは、蛍光ドナーの蛍光発出の低減として単純に観察される。
ある特定の実施形態では、本発明は、検量線を使用することなく、ヌクレアーゼ濃度を定量する手段を提供する。この方法の利点としては、単一のヌクレアーゼ分子の感度;連続的ではないバイナリ出力;より高濃度の消化された基質;シグナルの拡散を防止するビーズ;および検量線を生成する必要がないことが挙げられる。
現在、標的分子の正確な定量を可能にする超高感度の分子検出技術が必要である。例として、生物学的液体中の微生物病原体の分子標的の検出および定量を使用して、患者が特定の微生物による感染症を有するか否かを決定することができる。定量は、存在する病原体レベルを決定するために必要であり、これはバックグラウンドを臨床的に有意なレベルと識別することができる重要なデータピースである。食品中の病原体の検出(例えば、SalmonellaおよびE.coliの検出)およびバイオテロリズムに関して類似の応用が存在する。超高感度検出法は、本質的に非線形である酵素的増幅ステップに主に依存し、したがって的確な解釈のためには連続希釈した標準物質の同時並行評価(検量線)を必要とする。この追加の負担は、検量線がなくとも標的DNA配列を正確に定量することができるデジタル液滴またはエマルジョンPCRに基づく方法によって回避される。本発明は、デジタルPCRの正確な検量線非依存性を利用するが、標的分子の代替のカテゴリーであるヌクレアーゼを検出することが可能である。ヌクレアーゼは、DNA配列より実質的に豊富に存在することから、本発明は、現在最も感度のよいプラットフォーム技術であるPCRより標的微生物病原体に関してより大きい感度を生じる。さらに、本発明は、複雑な反応混合物および繊細な温度サイクリング機器を必要とするデジタルPCRほど実質的に複雑ではなく、これらはいずれもヌクレアーゼ検出にとって必要ではない。全体的に見て、デジタルヌクレアーゼ検出アプローチは、多様な貴重な応用の優れた代替となる潜在能力を有する。
「プローブ」または「基質」オリゴヌクレオチド
/5ビオチンTEG//iCy3/ACTACGTAGTCACAACTACGTAGT/ZEN//3IAbRQSp/
5’−/56−FAM//CTACGTAG//ZEN/3IAbRQSp/−3’
フルオロフォア
蛍光クエンチャー基
リンカー
基質合成
検出方法
キット
ヌクレアーゼ活性を評価するためのin vitroアッセイ
検出組成物
区画化、および反応構成
より小さい反応体積は、より早期の時点でのヌクレアーゼ検出を生じると予想される
別個のヌクレアーゼを識別するための反応速度論の使用可能性
反応区画化アプローチ
ピコリットルおよびフェムトリットルスケールの酵素反応の検出方法
追加のフルオロフォア、クエンチャー、およびリンカー
検出方法
S.aureusのマイクロコッカスヌクレアーゼを検出するために消光した蛍光オリゴヌクレオチドプローブを使用したこれまで公表されていない実験から、このヌクレアーゼの約330個もの少ない分子を、約50マイクロリットルの反応において検出できることが示された。これらは、Burghardt, E. L. et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One 11, e0157234, doi:10.1371/journal.pone.0157234 (2016)に記載される方法に基づいた。この超高感度によって、本研究者らは、そのようなプローブが、単一のヌクレアーゼ分子の検出を可能にするか否かを検討した。反応体積を(例えば、ピコリットルスケールに)縮小する方法が、マイクロリットルスケールの反応で観察された感度を超える検出感度の実質的な増加を可能にし得ることは理にかなっていた。消光した蛍光オリゴヌクレオチドプローブフォーマットによるプローブのヌクレアーゼ消化は、非消光フルオロフォアが結果として反応に放出されることにより検出される。これらのフルオロフォアは、拡散のためにより大きい体積の反応では希釈され、そのためにそれらを検出する能力が低減する。より小さい反応体積では、その拡散が小さい反応体積によって制限されることから、活性化プローブは濃縮されたままである。さらに、プローブをビーズに固定することは、消化されたフルオロフォアを濃縮状態に維持する簡便な方法を提供し、このように、プローブ活性化の検出を容易にする。
全体で19,995個(0.99976×20,000)の液滴の場合、反応中のMN分子の数は:
材料および方法
オリゴヌクレオチドプローブ
プローブカップリング磁気ビーズの調製
マイクロコッカスヌクレアーゼ保存液の調製
エマルジョン油の調製
反応の調製および実行
エマルジョンからのビーズの回収
反応したビーズの撮像
反応したビーズのフローサイトメトリー
(実施例2)
Claims (66)
- 試料中に存在する少なくとも1つの個々のヌクレアーゼ分子を検出する方法であって、
(a)水性反応混合物を形成するために、少なくとも1つのヌクレアーゼ分子を含有することが疑われる水性試料に、少なくとも1つの検出組成物を接触させるステップであって、前記検出組成物が、水溶液と、磁気マイクロビーズに作動可能に連結した基質プローブとを含むピコ液滴を含み、前記基質プローブが、
(i)2〜75ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、
(ii)前記オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したフルオロフォア、および
(iii)前記オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したクエンチャー
を含む、ステップと、
(b)エマルジョン中でピコリットルスケールの液滴を形成するために、前記水性混合物を油中で乳化させるステップと、
(c)前記ヌクレアーゼが存在すれば前記マイクロビーズに連結した前記基質プローブを消化するように、前記エマルジョン中で前記ピコリットルスケールの液滴をインキュベートするステップと、
(d)前記マイクロビーズを回収するステップと、
(e)前記マイクロビーズから発する蛍光を検出するステップと
を含む方法。 - (f)前記マイクロビーズの蛍光をフローサイトメトリーによって定量するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- (f)前記マイクロビーズの蛍光を顕微鏡によって定量するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試料が、血液、血清、血漿、便、皮膚抽出物、汗、尿、滑液、腹水、脳脊髄液、硝子体液、肺洗浄液、鼻抽出物、またはこれらのいずれかに由来する材料(例えば、それらから精製された1つもしくは複数のヌクレアーゼ分子)である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料を十分に希釈して、ヌクレアーゼを有する一部のピコ液滴と、ヌクレアーゼを有しない一部の液滴とを生じる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記油が、鉱物油、ABIL WE09、およびTegasoft DECの混合物である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インキュベートするステップが、30秒〜10時間である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インキュベートするステップが、4〜5時間である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)において、前記水性試料に、2つの検出組成物を接触させ、各々の検出組成物が異なる蛍光標識を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応混合物の体積がナノリットルより小さい、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、4〜15ヌクレオチド長である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、4〜11ヌクレオチド長である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、1つまたは複数の修飾ピリミジンを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、TTTTTTTTTTT(配列番号1)である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドの1つまたは複数が、化学修飾されている、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ピリミジンの1つまたは複数が、化学修飾されている、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ピリミジンの1つまたは複数が、2’−O−メチル修飾されている、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ピリミジンの1つまたは複数が、2’−フルオロ修飾されている、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- プリンの1つまたは複数が、存在する場合、化学修飾されている、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プリンの1つまたは複数が、2’−O−メチル修飾されている、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プリンの1つまたは複数が、2’−フルオロ修飾されている、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フルオロフォアが、表1に記載のフルオロフォアからなる群から選択される、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フルオロフォアが、近赤外線範囲で発出を有する、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クエンチャーが、表2に記載のクエンチャーからなる群から選択される、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、RNAおよびDNAの両方を含む、請求項1から13または15から25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドがDNAを含む、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マイクロビーズが、直径約0.5〜20μmである、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マイクロビーズが、直径約2〜10μmである、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マイクロビーズが連結部分を含む、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記連結部分が、ストレプトアビジン分子、クリックケミストリーリンカー、アミノリンカー、またはチオールリンカーである、請求項30に記載の方法。
- 前記基質プローブが、ビオチン部分を含み、前記基質プローブが、ビオチン−ストレプトアビジン結合を通して前記磁気マイクロビーズに連結される、請求項31に記載の方法。
- 前記溶液が、0.1〜20mMのMgCl2および0.1〜20mMのCaCl2を含む緩衝剤、0.1〜20mMのMgCl2、もしくはCaCl2、または他の二価カチオンを含む緩衝剤、あるいは二価カチオンを有しないおよび/または二価カチオンのキレート剤(EDTA)を有する緩衝剤である、請求項1から32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ピコ液滴が、0.014〜2.6ピコリットルである、請求項1から33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マイクロビーズが、ピコ液滴あたり平均で1個未満のマイクロビーズを生じる濃度で存在する、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
- (a)マグネシウムを欠如する、および/または二価カチオンキレート剤を含む水溶液と、
(b)(i)2〜75ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、
(ii)前記オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したフルオロフォア、および
(iii)前記オリゴヌクレオチドに作動可能に連結したクエンチャー
を含む基質プローブと
を含むピコ液滴を含む検出組成物。 - 前記水溶液が、亜鉛、マンガン、および/またはカルシウムを含む、請求項36に記載の検出組成物。
- 前記亜鉛、マンガン、および/またはカルシウムが、独立して100μM〜20mMの濃度で存在する、請求項37に記載の検出組成物。
- 前記二価カチオンキレート剤がEDTAである、請求項36に記載の検出組成物。
- 前記EDTAが、20〜50mMの濃度で存在する、請求項39に記載の検出組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、4〜15ヌクレオチド長である、請求項36から40のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、4〜11ヌクレオチド長である、請求項36から41のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、1つまたは複数の修飾ピリミジンを含む、請求項36から42のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、TTTTTTTTTTT(配列番号1)である、請求項36から41のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記ヌクレオチドの1つまたは複数が、化学修飾されている、請求項36から44のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記ピリミジンの1つまたは複数が、化学修飾されている、請求項36から45のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記ピリミジンの1つまたは複数が、2’−O−メチル修飾されている、請求項46に記載の検出組成物。
- 前記ピリミジンの1つまたは複数が、2’−フルオロ修飾されている、請求項46に記載の検出組成物。
- プリンの1つまたは複数が、存在する場合、化学修飾されている、請求項36から48のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記プリンの1つまたは複数が、2’−O−メチル修飾されている、請求項49に記載の検出組成物。
- 前記プリンの1つまたは複数が、2’−フルオロ修飾されている、請求項50に記載の検出組成物。
- 前記フルオロフォアが、表1に記載のフルオロフォアからなる群から選択される、請求項36から51のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記フルオロフォアが、近赤外線範囲で発出を有する、請求項52に記載の検出組成物。
- 前記クエンチャーが、表2に記載のクエンチャーからなる群から選択される、請求項36から53のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項36から54のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、RNAおよびDNAの両方を含む、請求項36から43または45から55のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記基質プローブが、磁気マイクロビーズに作動可能に連結している、請求項36から56のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記マイクロビーズが、直径約0.5〜20μmである、請求項57に記載の検出組成物。
- 前記マイクロビーズが、直径約2〜10μmである、請求項57に記載の検出組成物。
- 前記マイクロビーズが、連結部分を含む、請求項57から59のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記連結部分が、ストレプトアビジン分子、クリックケミストリーリンカー、アミノリンカー、またはチオールリンカーである、請求項60に記載の検出組成物。
- 前記基質プローブが、ビオチン部分を含み、前記基質プローブが、ビオチン−ストレプトアビジン結合を通して前記磁気マイクロビーズに連結される、請求項61に記載の検出組成物。
- 前記溶液が、0.1〜20mMのMgCl2および0.1〜20mMのCaCl2を含む緩衝剤、0.1〜20mMのMgCl2、もしくはCaCl2、または他の二価カチオンを含む緩衝剤である、請求項36から62のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記ピコ液滴が、0.014〜2.6ピコリットルである、請求項36から63のいずれか一項に記載の検出組成物。
- 前記マイクロビーズが、ピコ液滴あたり平均で1個未満のマイクロビーズを生じる濃度で存在する、請求項57から64のいずれか一項に記載の検出組成物。
- pHが、8.5〜10.5を含むその間である、請求項36から65のいずれか一項に記載の検出組成物。
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