JP2020534855A - 持続型単鎖インスリンアナログ及びその結合体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、持続型単鎖インスリンアナログ、その結合体及びこれらの利用に関する。また、本発明は、持続型単鎖インスリンアナログ及びその結合体の製造方法に関する。
Description
本発明は、持続型単鎖インスリンアナログ、その結合体及びこれらの利用に関する。また、本発明は、持続型単鎖インスリンアナログ及びその結合体の製造方法に関する。
インスリンは、膵臓のベータ細胞から分泌される51個のアミノ酸からなるポリペプチドホルモンであり、動物において血糖値の調節に関与する。インスリンは、ジスルフィド結合で連結されている、A鎖とB鎖で構成されているが、生体内では、プロインスリンでC-ペプチドがタンパク質分解酵素に除去(加水分解)され、プロインスリンからインスリンが生成される。
インスリン製剤は、先天的にインスリンの生成に異常があるI型(TypeI)糖尿病患者;インスリン耐性、インスリン分泌不足などにより2次的に血糖値が上昇するII型(TypeII)糖尿病でありながら、経口糖尿病薬で調節がうまくできないか、経口糖尿病薬が禁忌である患者; または妊娠性糖尿病患者に投与する血糖調節剤である。
初期には牛や豚のインスリンを精製して使用する方法を用いたが、遺伝子工学及びDNA操作技術の発達により、細菌、酵母などを利用してヒトインスリンの大量生産が可能になり(欧州公開特許EP 0055945(特許文献1))、ヒトインスリンを変形させて作用時間などを改善したインスリンアナログなどを生産することができるようになった。
しかし、インスリンは、他のタンパク質及びペプチドホルモンと同様に、体内の半減期が極めて短く、治療学的効果を継続的に奏しにくく、効果を奏するためには、継続的に反復投与しなければならないという欠点がある。また、タンパク質及びペプチド薬物はほとんど注射剤の形態で患者に投与され、生理活性ペプチドの血中濃度を維持するために頻繁に注射するようになるが、これは患者に多大な苦痛を引き起こすようになる。したがって、タンパク質の生体内半減期を増加させて投与回数を減らすことにより、治療学的効果を高め、患者の生活の質を高めるために、種々のタンパク質剤形化の研究と化学変形が研究されてきた。
インスリン製剤の持続型及び低血糖の問題を解決するための方法として、単鎖インスリンアナログを使用することができる。単鎖インスリンは、既存のA鎖とB鎖がジスルフィド結合(di-sulfide bond)で連結された形態ではなく、単鎖で製造して使用することにより、半減期及び効果を調節することができる。単鎖インスリンアナログは、B鎖とA鎖の順に連結したり、A鎖とB鎖の順に連結することができ、各鎖の連結時にペプチドをリンカーとして挿入することができる。
過去数十年間、多くの種類の単鎖インスリン(single-chain insulin)類似体が作られた。これら類似体は、B鎖のC末端とA鎖のN末端を多様な長さのペプチドまたは化合物で構成されたリンカー(linker)で連結させた。しかし、B鎖のC末端領域に位置するLysB29とA鎖のN末端のGlyA1を直接連結させた単鎖インスリン類似体の場合、生物学的に不活性を示した(Derewenda, U. et al, J. Mol. Biol., 1991, 220: 425-433(非特許文献1))。
インスリン製剤の持続性を向上させるための他の方法は、インスリンの前駆物質であるプロインスリンの利用である。プロインスリンそのものは弱いインスリンアゴニストであり、インスリンに比べて活性は低いが、インスリンに比べて長い半減期を有する。
プロインスリンは、インスリンとは異なり、B鎖とA鎖がインスリンの安定性の維持に重要な役割をするCペプチドにより連結されており、血中半減期がインスリンに比べて長い。したがって、多くの研究者により、プロインスリンを持続型インスリンに開発しようとするいくつかの試みがあった。しかし、活性に重要な役割をするA鎖のアミノ末端グリシン残基がCペプチドに遮られており、インスリンに比べて活性が低いという短所があり(William F et al., The Journal of biological chemistry, 1992, 267: 419-425(非特許文献2))、まだ薬物として開発されていない。
遺伝子組換え技術を利用して生産されるほとんどのタンパク質は、タンパク質のアミノ末端にメチオニンが結合している形態で生産される。必要としないアミノ酸であるメチオニンを除去するために、既存のインスリン製造方式の一つとして、セリンタンパク質分解酵素であるトリプシンを使用する方法があるが(欧州公開特許EP 1926749(特許文献2))、プロインスリンの内部にトリプシン認識配列が存在するため、上記方式は、単鎖インスリンアナログの製造には適していない。代替方法としては、伝統的に広く使用されてきた臭化シアン(Cyanogen bromide、CNBr)を使用し、タンパク質のアミノ末端メチオニンを除去する方法があるが、CNBrの激しい有毒性と製造工程の複雑度の増加、低い生産収率などが問題として提起されてきた。そこで、持続性の増加及び活性が維持されるインスリン製剤の必要性が台頭している。
Derewenda, U. et al, J. Mol. Biol., 1991, 220: 425-433
William F et al., The Journal of biological chemistry, 1992, 267: 419-425
Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Uhlman及びPeyman, Chemical Reviews, 90: 543-584, 1990
H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979
本発明の一つの目的は、単鎖インスリンアナログを提供することにある。
本発明の他の一つの目的は、単鎖インスリンアナログ及びその生体内半減期を増加させる物質が連結された、単鎖インスリンアナログ結合体を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、上記単鎖インスリンアナログ及びその生体内半減期を増加させる物質を連結する段階を含む、単鎖インスリンアナログ結合体を製造する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、上記単鎖インスリンアナログ及び/または単鎖インスリンアナログ結合体を含む、生体内持続性及び安定性が増加した単鎖インスリン持続性製剤を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、上記単鎖インスリンアナログ及び/または単鎖インスリンアナログ結合体を含む、糖尿病の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、上記薬学的組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、糖尿病の予防または治療方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、糖尿病の予防または治療用薬剤の製造のための上記単鎖インスリンアナログ結合体または上記単鎖インスリンアナログの用途を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、糖尿病の予防または治療のための上記単鎖インスリンアナログ結合体または上記単鎖インスリンアナログの用途を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、上記単鎖インスリンアナログをコードする分離された核酸、上記核酸を含む組換え発現ベクター及び上記組換え発現ベクターを含む形質転換体を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、上記形質転換体を利用して単鎖インスリンアナログを製造する方法を提供することにある。
本発明の一つの態様は、下記化学式1を有する単鎖インスリンアナログ結合体を提供する:
[化学式1]
X−Y−Z−La−F
ここで、
Xは、天然型インスリンA鎖、B鎖またはこれらのアナログであり、
Yは、C−ペプチドまたはそのアナログであり、
Zは、天然型インスリンB鎖、A鎖またはこれらのアナログであり、
Lは、リンカーであり、
aは、0または自然数であり、ただし、aが2以上であるとき、それぞれのLは互いに独立しており、
Fは、インスリンアナログの生体内半減期を増加させる物質であり、
ただし、X、Y及びZがそれぞれ天然型インスリンのB鎖、C−ペプチド及びA鎖であるか、天然型インスリンのA鎖、C−ペプチド及びB鎖である場合は除外され、
X−Y−Zは、単鎖インスリンアナログを形成する。
X−Y−Z−La−F
ここで、
Xは、天然型インスリンA鎖、B鎖またはこれらのアナログであり、
Yは、C−ペプチドまたはそのアナログであり、
Zは、天然型インスリンB鎖、A鎖またはこれらのアナログであり、
Lは、リンカーであり、
aは、0または自然数であり、ただし、aが2以上であるとき、それぞれのLは互いに独立しており、
Fは、インスリンアナログの生体内半減期を増加させる物質であり、
ただし、X、Y及びZがそれぞれ天然型インスリンのB鎖、C−ペプチド及びA鎖であるか、天然型インスリンのA鎖、C−ペプチド及びB鎖である場合は除外され、
X−Y−Zは、単鎖インスリンアナログを形成する。
本発明の一つの具体的な態様として、上記単鎖インスリンアナログは、天然型プロインスリンに比べて少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換(Substitution)、追加(Addition)、除去(Deletion)、修飾(Modification)及び配列順(インスリンB鎖、C-ペプチド及びA鎖の順など)の変換の中から選択されるいずれか一つ以上の方法で変異されたアナログ、変異体、またはそれらの断片である単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、上記単鎖インスリンアナログは、上記X、Y及びZがそれぞれリンカーで連結された単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、上記C−ペプチドのアナログは、天然型インスリンC−ペプチドの1番アミノ酸、2番アミノ酸、34番アミノ酸及び35番アミノ酸からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換または欠失したものである、単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な様態として、インスリンアナログの生体内半減期を増加させる物質は、ポリエチレングリコール、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びその断片、アルブミン結合物質、特定のアミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、FcRn結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン(Transferrin)、サッカリド(saccharide)及び高分子重合体からなる群から選択されたものである、単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な様態として、Lは、ペプチド、ポリエチレングリコール、脂肪酸、サッカリド、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、X−Y−ZとFは、共有化学結合、非共有化学結合、またはこれらの組み合わせであり、Lにより互いに結合されるものである、単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な様態として、高分子重合体は、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカリド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、上記FcRn結合物質は、免疫グロブリンFc領域である、単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、免疫グロブリンFc領域が非糖鎖化されることを特徴とする、単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、免疫グロブリンFc領域がCH1、CH2、CH3、及びCH4ドメインからなる群から1個〜4個の選択されたドメインからなる、単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、免疫グロブリンFc領域がIgG、IgA、IgD、IgE、またはIgMに由来のFc領域である、単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、免疫グロブリンFc領域のそれぞれのドメインがIgG、IgA、IgD、IgE、及びIgMからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、免疫グロブリンFc領域は、同じ起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体または多量体である、単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、免疫グロブリンFc領域がIgG4 Fc領域である、単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、免疫グロブリンFc領域は、ヒト非糖鎖化IgG4 Fc領域である、単鎖インスリンアナログ結合体を提供する。
本発明の他の一つの態様は、下記化学式2を有する単鎖インスリンアナログを提供する:
[化学式2]
X−Y−Z
ここで、
Xは、天然型インスリンA鎖、B鎖またはこれらのアナログであり、
Yは、C−ペプチドまたはそのアナログであり、
Zは、天然型インスリンB鎖、A鎖またはこれらのアナログであり、
ただし、X、Y及びZがそれぞれ天然型インスリンのB鎖、C−ペプチド及びA鎖であるか、天然型インスリンのA鎖、C−ペプチド及びB鎖である場合は除く。
X−Y−Z
ここで、
Xは、天然型インスリンA鎖、B鎖またはこれらのアナログであり、
Yは、C−ペプチドまたはそのアナログであり、
Zは、天然型インスリンB鎖、A鎖またはこれらのアナログであり、
ただし、X、Y及びZがそれぞれ天然型インスリンのB鎖、C−ペプチド及びA鎖であるか、天然型インスリンのA鎖、C−ペプチド及びB鎖である場合は除く。
本発明のもう一つの具体的な態様として、上記C-ペプチドのアナログは、天然型インスリンC-ペプチドの1番アミノ酸、2番アミノ酸、34番アミノ酸及び35番アミノ酸からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換または欠失したものである、単鎖インスリンアナログを提供する。
本発明のもう一つの態様は、上記単鎖インスリンアナログ及びその生体内半減期を増加させる物質を連結する段階を含む、上記単鎖インスリンアナログ結合体を製造する方法を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、上記単鎖インスリンアナログ及びその生体内半減期を増加させる物質をリンカーを通じて連結するものである、上記単鎖インスリンアナログ結合体を製造する方法を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、上記リンカーは、アルデヒドグループ、プロピオンアルデヒドグループ、ブチルアルデヒドグループ、マレイミドグループ及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される反応基を有する非ペプチド性リンカーである、上記単鎖インスリンアナログ結合体を製造する方法を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、上記スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルプロピオネート、メチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルバレラート、スクシンイミジルカルボキシメチル、N−ヒドロキシスクシンイミジルまたはスクシンイミジルカルボネートである、上記単鎖インスリンアナログ結合体を製造する方法を提供する。
本発明のもう一つの具体的な態様として、上記単鎖インスリンアナログは、下記(a)及び(b)を含む方法で得られるものである、上記単鎖インスリンアナログ結合体を製造する方法を提供する:
(a)タンパク質分解酵素の切断部位を含む5〜20個のアミノ酸で構成されたペプチドが上記単鎖インスリンアナログのアミノ末端に融合した形態で単鎖インスリンアナログを発現する段階; 及び
(b)単鎖インスリンアナログの融合したペプチドを除去する段階。
(b)単鎖インスリンアナログの融合したペプチドを除去する段階。
本発明のもう一つの態様は、上記単鎖インスリンアナログ結合体;及び/または上記単鎖インスリンアナログを含む、生体内持続性及び安定性が増加した単鎖インスリン持続性製剤を提供する。
本発明のもう一つの態様は、上記単鎖インスリンアナログ結合体;及び/または上記単鎖インスリンアナログを含む、糖尿病の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明の他の一つの態様は、上記薬学的組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、糖尿病の予防または治療方法を提供する。
本発明の他の一つの態様は、糖尿病の予防または治療用薬剤の製造のための上記単鎖インスリンアナログ結合体または上記単鎖インスリンアナログの用途を提供する。
本発明の他の一つの態様は、糖尿病の予防または治療のための上記単鎖インスリンアナログ結合体または上記単鎖インスリンアナログの用途を提供する。
本発明の他の一つの態様は、上記単鎖インスリンアナログをコードする分離された核酸、上記核酸を含む組換え発現ベクター及び上記組換え発現ベクターを含む形質転換体を提供する。
本発明の他の一つの態様は、上記形質転換体を利用して単鎖インスリンアナログを製造する方法を提供する。
本発明のもう一つの具体的な様態として、下記段階を含む上記単鎖インスリンアナログを製造する方法を提供する:
a)上記単鎖インスリンアナログをコードする核酸を含む形質転換体を培養して単鎖インスリンアナログを発現させる段階;及び
b)発現された単鎖インスリンアナログを分離及び精製する段階。
b)発現された単鎖インスリンアナログを分離及び精製する段階。
本発明に係る単鎖インスリンアナログ及びその結合体は、生体内で安定した血糖降下効果を維持し、血中半減期が著しく増加し、インスリンの投与便宜性及び副作用を改善し、製造過程が簡素化される効果がある。
本発明を実施するための具体的な内容を説明すると、次の通りである。一方、本願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。即ち、本願で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明の範囲に属する。また、以下に記述される具体的な叙述により、本発明の範疇が限定されるとは言えない。
本発明の一つの態様は、天然型インスリンに比べてインスリン受容体結合力が減少した、単鎖インスリンアナログを提供する。
本発明で使用される用語「単鎖インスリンアナログ」とは、生体内血糖降下特性を保有し、インスリンのA鎖とB鎖が一つの鎖で連結されたインスリンアナログをいう。本発明の目的上、上記単鎖インスリンアナログは、天然型インスリンに比べてインスリン受容体の結合力及びin vitro活性が減少した物質であることが望ましい。
天然型インスリンは、膵臓から分泌されるホルモンであり、一般に、細胞内のグルコースの吸収を促進し、脂肪の分解を抑制し、体内の血糖値を調節する役割をする。インスリンは、血糖調節機能がないプロインスリン(proinsulin)の形態でプロセシングを経て、血糖調節機能を有するインスリンになる。生体内インスリンは、B鎖-Cペプチド-A鎖のプロインスリンの形態で発現した後、酵素的処理を経て、2個のポリペプチド鎖、即ち、それぞれ21個及び30個のアミノ酸残基を含むA鎖及びB鎖が2個のジスルフィド架橋で連結されたインスリンの形態で存在する。天然型プロインスリンのA鎖、B鎖及びC-ペプチドは、それぞれ配列番号1〜3で示されるアミノ酸配列を含むことができるが、これに限定されない。
A鎖:
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(配列番号 1)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(配列番号 1)
B鎖:
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(配列番号 2)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(配列番号 2)
C-ペプチド:
Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg(配列番号 3)
Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg(配列番号 3)
また、本発明の単鎖インスリンアナログは、プロインスリンアナログであってもよいが、これに限定されない。上記プロインスリンアナログは、B鎖、C−ペプチド、A鎖の順に配列された、野生型または天然型プロインスリンとA鎖、B鎖及びC−ペプチド配列が一つ以上異なるペプチドを意味する。具体的には、プロインスリンアナログは、A鎖、C−ペプチド及びB鎖の配列を有することができるが、これに限定されない。
本発明において、単鎖インスリンアナログは、プロインスリンアナログと混用することができる。
本発明のプロインスリンアナログのA鎖、B鎖、C−ペプチドそれぞれのアミノ酸配列は、野生型配列、または野生型配列に天然型または非天然型である一つ以上のアミノ酸が追加、置換または削除された配列がすべて可能であるが、これに制限されない。
本発明のプロインスリンアナログは、天然型プロインスリンのA鎖、B鎖、C-ペプチドとそれぞれ少なくとも80%以上、具体的に90%以上、より具体的には91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%以上の相同性を示し、アミノ酸の一残基の一部のグループが、化学的に置換(例えば、alpha-methylation、alpha-hydroxylation)、除去(例;deamination)、または修飾(例;N-methylation)された形態であってもよく、体内で血糖値を調節する機能を有するペプチドを全て含むが、これに限定されない。
上記「相同性(homology)」とは、野生型(wild type)タンパク質のアミノ酸配列またはそれをコードする塩基配列との類似度を示すためのものであり、本発明のアミノ酸配列または塩基配列と上記のようなパーセント以上の同一配列を有する配列も本発明に含まれる。このような相同性は、両配列を肉眼で比較して決定することもできるが、比較対象となる配列を並べて配列して相同性の程度を分析する生物情報アルゴリズム(bioinformatic algorithm)を使用して決定することができる。上記二つのアミノ酸配列間の相同性はパーセントで表示することができる。有用な自動化したアルゴリズムは、Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group、Madison、W、USA)のGAP、BESTFIT、FASTAとTFASTAコンピュータソフトウェアモジュールで利用可能である。上記モジュールで自動化した配列アルゴリズムは、Needleman & WunschとPearson & LipmanとSmith & Waterman配列アルゴリズムを含む。他の有用な配列に対するアルゴリズムと相同性の決定は、FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLASTとCLUSTAL Wを含むソフトウェアで自動化されている。
本発明の単鎖インスリンアナログは、生体内の血糖調節機能を有するペプチドであり、このようなペプチドは、プロインスリンアゴニスト(agonist)、誘導体(derivatives)、断片(fragments)、変異体(variants)などを含むが、これに限定されない。
本発明のプロインスリンアゴニストは、プロインスリンの構造に関係なく、インスリンの生体内受容体に結合してインスリンと同じ生物学的活性を示す物質を意味する。
本発明のプロインスリン断片は、プロインスリン1つまたはそれ以上のアミノ酸が追加または削除された形態を意味し、追加されたアミノ酸は、天然に存在しないアミノ酸(例えば、D型アミノ酸)も可能であり、このようなプロインスリン断片は体内で血糖調節機能を有している。
本発明のプロインスリン変異体は、プロインスリンとアミノ酸配列が一つ以上異なるペプチドであり、体内で血糖調節機能を有するペプチドを意味する。
本発明のプロインスリンアゴニスト、誘導体、断片及び変異体で、それぞれ使用された製造方法は、独立して使用することができ、組み合わせも可能である。例えば、アミノ酸配列が一つ以上異なり、アミノ末端のアミノ酸残基に脱アミノ化(deamination)された体内で血糖調節機能を有するペプチドも含まれる。
一つの具体的な実施形態において単鎖インスリンアナログは、組換え方法を通じて生産することができ、Solid phase合成法を通じて合成する方法でも生産可能である。
一つの具体的な実施形態において本発明の単鎖インスリンアナログは、天然型インスリンA鎖またはそのアナログ;天然型インスリンC−ペプチドまたはそのアナログ;及びB鎖またはそのアナログが、多様な順序で、直接またはリンカーで連結することができる。
一つの具体的な実施形態において本発明の単鎖インスリンアナログは、天然型プロインスリンに比べて少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換(Substitution)、追加(Addition)、除去(Deletion)、修飾(Modification)及び配列順(B鎖、C-ペプチド及びA鎖の順など)の変換の中から選択されるいずれか一つ以上の方法で変異されたアナログ、変異体、またはこれらの断片であってもよい。
一つの具体的な実施形態において本発明の単鎖インスリンアナログは、天然型インスリンA鎖またはそのアナログ;天然型インスリンC−ペプチドまたはそのアナログ;及び天然型インスリンB鎖またはそのアナログが上記の順序で連結されたものであってもよいが、これに限定されない。
一つの具体的な実施形態において本発明の単鎖インスリンアナログは、C-ペプチドまたはそのアナログを含むことができる。C-ペプチド(connecting peptide)は、プロインスリンでB鎖とA鎖を連結する、35個のアミノ酸で構成されたペプチドであり、インスリンの生合成の際に除去されるが、除去されずにインスリンに存在する時、インスリンのin vitro活性を天然型に比べて下げる。本発明において単鎖インスリンアナログに含まれたC-ペプチドは、天然型C-ペプチドでアミノ酸が削除、置換、及び/または挿入されたアナログであってもよい。
一つの具体的な実施形態において上記C-ペプチドのアナログは、天然型インスリンC-ペプチドの1番アミノ酸、2番アミノ酸、34番アミノ酸及び35番アミノ酸からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換または欠失したものであってもよいが、これに限定されない。より具体的には、上記C-ペプチドのアナログは、天然型インスリンC-ペプチドの1番、2番アルギニンと34番リジン残基と35番アルギニン残基が除去され、単鎖インスリンアナログの生産時に生産収率を向上させるアナログであってもよいが、これに限定されない。
一つの具体的な実施形態において本発明の単鎖インスリンアナログは、天然型インスリンA鎖;上記C−ペプチドのアナログ;及び天然型インスリンB鎖が上記順序で連結されたものであり得、具体的には、配列番号19のアミノ酸配列を有してもよいが、これに限定されない。
一つの具体的な実施形態において本発明の単鎖インスリンアナログは、単鎖インスリンアナログのアミノ末端にペプチドが融合した融合体であってもよい。上記単鎖インスリンアミノ末端に融合したペプチドは、単鎖インスリンアナログの発現収率の増大に寄与し、タンパク質分解酵素(例えば、トリプシン)の切断部位を有しており、単鎖インスリンアナログの生産時に効率的に除去される。上記単鎖インスリンアナログのアミノ末端に追加されるペプチドは、単鎖インスリンアナログの発現収率の増大に寄与し、タンパク質分解酵素の切断部位を有している限り限定されないが、具体的には、5〜20個のアミノ酸で構成されてもよく、より具体的には、7〜18個、または9〜16個のアミノ酸で構成されてもよく、さらに具体的には、MATTSTATTR(配列番号20)のアミノ酸配列を含むことができる。
一つの具体的な実施形態において欠失したペプチドが融合した単鎖インスリンアナログは、天然型インスリンA鎖;上記C−ペプチドのアナログ;及び天然型インスリンB鎖が上記順で連結された単鎖インスリンアナログのアミノ末端にペプチドが融合したものであってもよく、具体的には、配列番号19のアミノ酸配列を有してもよいが、これに限定されない。
本発明に係る単鎖インスリンアナログは、天然型プロインスリンのA鎖、B鎖及びC-ペプチドのアミノ酸配列でアミノ酸の置換、付加、欠失、または翻訳後の変形(例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化、分子内共有結合)が導入され、天然型インスリンに比べて減少したインスリン受容体結合力を有する任意のペプチドを包括する。上記アミノ酸の置換または付加の際には、ヒトタンパク質で通常観察される20個のアミノ酸だけでなく、非定型または非自然的発生アミノ酸を使用することができる。非定型アミノ酸の商業源にはSigma-Aldrich、ChemPep及びGenzymepharmaceuticalsが含まれてもよい。このようなアミノ酸が含まれたペプチドと典型的なペプチド配列は、商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のAmerican peptide company、Bachemや韓国のAnygenを通じて合成及び購入が可能である。
より具体的には、本発明の単鎖インスリンアナログは、下記化学式2を有してもよい。
[化学式2]
X−Y−Z
ここで、
Xは、天然型インスリンA鎖、B鎖またはこれらのアナログであり、
Yは、天然型インスリンC−ペプチドまたはそのアナログであり、
Zは、天然型インスリンB鎖、A鎖またはこれらのアナログであり、
ただし、X、Y及びZがそれぞれ天然型インスリンのB鎖、C−ペプチド及びA鎖であるか、天然型インスリンのA鎖、C−ペプチド及びB鎖の場合は除く。
X−Y−Z
ここで、
Xは、天然型インスリンA鎖、B鎖またはこれらのアナログであり、
Yは、天然型インスリンC−ペプチドまたはそのアナログであり、
Zは、天然型インスリンB鎖、A鎖またはこれらのアナログであり、
ただし、X、Y及びZがそれぞれ天然型インスリンのB鎖、C−ペプチド及びA鎖であるか、天然型インスリンのA鎖、C−ペプチド及びB鎖の場合は除く。
上記インスリンA鎖、B鎖、C−ペプチド、これらのアナログは、前述した通りである。
上記の「−」は、X、Y、Zの間のそれぞれの結合を意味するもので、X、Y、Zの直接結合またはリンカーを示す。上記リンカーは、ペプチド性リンカーまたは非ペプチド性リンカーであってもよい。
また、上記「−」は、非共有結合もしくは共有結合など、任意の化学的結合であってもよく、具体的には共有結合であってもよいが、これに限定されない。
本発明のもう一つの態様は、上記単鎖インスリンアナログをコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び上記発現ベクターを含む形質転換体を提供する。
上記単鎖インスリンアナログについては、先に説明した通りである。
上記ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形態で存在するデオキシリボヌクレオチド(DNA)またはリボヌクレオチド(RNA)であり、ゲノムDNA、cDNA、及びこれから転写されたRNAを含む意味を有し、基本的な構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形した類似体(analogue)も含む(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Uhlman及びPeyman, Chemical Reviews, 90: 543-584, 1990(非特許文献3))。本発明のポリヌクレオチドは、標準分子生物学技術を用いて分離または製造することができる。例えば、適切なプライマー配列を用いて天然型プロインスリン遺伝子配列(NM_000207.2、NCBI)からPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を通じて増幅することができ、自動化したDNA合成器を用いる標準合成技術を用いて製造することができる。上記ポリヌクレオチドは、本発明で核酸と混用して使用することができる。
上記単鎖インスリンアナログをコードするポリヌクレオチドは、上述したA鎖、B鎖及びC−ペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
本発明に係る組換えベクターは、典型的にはクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築することができ、原核細胞または真核細胞を宿主細胞として使用するためのベクターとして構築することができる。
本発明で使用される「ベクター」とは、適切な宿主細胞で目的タンパク質を発現する組換えベクターであり、核酸挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須の調節要素を含む核酸構造物(construct)を意味する。本発明は、インスリンアナログをコードする核酸を含む組換えベクターを製造することができるが、上記組換えベクターを宿主細胞に形質転換(transformation)または形質感染(transfection)させることにより、本発明の単鎖インスリンアナログを得ることができる。
本発明において単鎖インスリンアナログをコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。本発明における用語、「作動可能に連結された(operatively linked)」とは、核酸発現調節配列(例えば、プロモーター、シグナル配列、リボソーム結合部位、転写終結配列など)と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより上記調節配列は、上記他の核酸配列の転写及び/または解読を調節するようになる。
本発明における用語、「プロモーター」とは、ポリメラーゼに対する結合部位を含み、プロモーター下位遺伝子のmRNAへの転写開始活性を有する、コード領域の上位(upstream)の非解読の核酸配列、即ち、ポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始するようにするDNA領域をいい、mRNA転写開始部位の5’部位に位置する。
例えば、本発明のベクターが組換えベクターであり、原核細胞を宿主とする場合に、転写を進行させる強力なプロモーター(例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、lacUV5プロモーター、lppプロモーター、pLλプロモーター、pRλプロモーター、rac5プロモーター、ampプロモーター、recAプロモーター、SP6プロモーター、trpプロモーター及びT7プロモーターなど)、解読の開始のためのリボソーム結合部位及び転写/解読終結配列を含むことが一般的である。
また、本発明に使用することができるベクターは、当業界でよく使用されるプラスミド(例えば、pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14 、pGEXシリーズ、pETシリーズ、pPICZαシリーズ、pUC19など)、ファージ(例えば、λgt4・λB、λ-Charon、λΔz1及びM13など)またはウイルス(例えば、SV40など)を操作して製作することができる。
一方、本発明のベクターが組換えベクターであり、真核細胞を宿主とする場合に、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター、SV40プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター及びHSVのtkプロモーター)を使用することができ、転写終結配列としてポリアデニル化配列(例えば、ウシ成長ホルモンターミネーター及びSV40に由来するポリアデニル化配列)を一般に有する。
また、本発明の組換えベクターは、選択マーカーとして当業界において通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を使用することができる。
本発明の組換えベクターは、回収される目的タンパク質、即ち、インスリンアナログの精製を容易にするために、必要に応じて他の配列をさらに含むことができる。上記さらに含むことができる配列は、タンパク質精製用タグ配列であってもよく、例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(Pharmacia、USA)、マルトース結合タンパク質(NEB、USA)、FLAG(IBI、USA)及び6個のヒスチジン(hexahistidine)などがあるが、上記例により目的タンパク質の精製のために必要な配列の種類が制限されるものではない。
上記のようなタグ配列を含む組換えベクターにより発現された融合タンパク質は、アフィニティー・クロマトグラフィーにより精製することができる。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼが融合された場合には、この酵素の基質であるグルタチオンを利用することができ、6個のヒスチジンタグが使用された場合には、Ni−NTAカラムを用いて所望の目的のタンパク質を容易に回収することができる。
上記単鎖インスリンアナログをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを用いて上記ベクターが形質転換された形質転換体を構築することができる。
本発明で使用される「形質転換(transformation)」とは、DNAを宿主細胞内に導入してDNAが染色体の因子として、または染色体統合完成により複製可能になることであり、外部のDNAを細胞内に導入して人為的に遺伝的な変化を起こす現象を意味する。
本発明の形質転換方法は、任意の形質転換方法を使用することができ、当業界の常法により容易に行うことができる。一般に、形質転換の方法には、CaCl2 沈殿法、CaCl2 沈殿法にDMSO(dimethyl sulfoxide)という還元物質を使用することにより、効率を高めたHanahan方法、電気穿孔法(electroporation)、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を用いた攪拌法、アグロバクテリウム媒介形質転換法、PEGを用いた形質転換法、デキストラン硫酸、リポフェクタミン及び乾燥/抑制媒介された形質転換法などがある。
本発明に係る単鎖インスリンアナログをコードする核酸を含む組換えベクターを形質転換させるための方法は、上記例に限定されず、当業界において通常使用される形質転換または形質感染方法を制限なく使用することができる。
目的核酸である単鎖インスリンアナログをコードする核酸を含む組換えベクターを宿主細胞内に導入することにより、本発明の形質転換体を取得することができる。
本発明に適した宿主は、本発明の核酸を発現させる限り、特に制限されない。本発明に使用することができる宿主の特定の例としては、大腸菌(E. coli)のようなエシェリキア(Escherichia)属細菌; バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)のようなバチルス(Bacillus)属細菌; シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)のようなシュードモナス(Pseudomonas)属細菌; ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)のような酵母; スポドプテラ・フルギペルダ(SF9)のような昆虫細胞; 及びCHO、COS、BSCなどのような動物細胞があるが、これに限定されない。具体的には、宿主細胞として大腸菌を使用する。
本発明に適した宿主は、本発明の核酸を発現させる限り、特に制限されない。本発明に使用することができる宿主の特定の例としては、大腸菌(E. coli)のようなエシェリキア(Escherichia)属細菌; バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)のようなバチルス(Bacillus)属細菌; シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)のようなシュードモナス(Pseudomonas)属細菌; ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)のような酵母; スポドプテラ・フルギペルダ(SF9)のような昆虫細胞; 及びCHO、COS、BSCなどのような動物細胞があるが、これに限定されない。具体的には、宿主細胞として大腸菌を使用する。
本発明を具現するための他の態様は、上記形質転換体を利用して単鎖インスリンアナログを製造する方法を提供する。
具体的には、下記段階を含む上記単鎖インスリンアナログを製造する方法を提供する:
a)上記単鎖インスリンアナログをコードする核酸を含む形質転換体を培養して単鎖インスリンアナログを発現させる段階;及び
b)発現された単鎖インスリンアナログを分離及び精製する段階。
b)発現された単鎖インスリンアナログを分離及び精製する段階。
上記単鎖インスリンアナログ、核酸、形質転換体は、先に説明した通りである。
本発明において形質転換体の培養に使用される培地は、適切な方法で宿主細胞培養の要件を満たさなければならない。宿主細胞の生長のために培地中に含めることができる炭素源は、製造された形質転換体の種類に応じて当業者の判断により適宜選択することができ、培養時期及び量を調節するために適した培養条件を採用することができる。
使用することができる糖源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油のようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これら物質は、個別に、または混合物として使用することができる。
使用することができる窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別にまたは混合物として使用することができる。
使用することができるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩が含まれる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができる。
最後に、上記の物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質を使用することができる。また、培養培地に適切な前駆体を使用することができる。上記原料は、培養途中に培養物に適切な方式により回分式または連続式で添加することができる。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような塩基性化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方法で使用して培養物のpHを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡の生成を抑制することができる。好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素含有気体(例えば、空気)を注入する。
本発明に係る形質転換体の培養は、通常、20℃〜45℃、具体的には、25℃〜40℃の温度で行われる。また、培養は、所望の単鎖インスリンアナログの生成量が最大に得られるまで継続されるが、このような目的で、培養は、通常、10〜160時間持続することができる。
前述したように、宿主細胞に応じて適切な培養条件を造成すれば、本発明に係る形質転換体は、単鎖インスリンアナログを生産するようになり、ベクターの構成及び宿主細胞の特徴に基づいて生産された単鎖インスリンアナログは、宿主細胞の細胞質内、ペリプラスム間隙(periplasmic space)または細胞外に分泌されてもよい。
宿主細胞内または外で発現されたタンパク質は、通常の方法で精製することができる。精製方法の例としては、塩析(例えば、硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など)、溶媒沈殿(例えば、アセトン、エタノールなどを利用したタンパク質画分沈殿など)、透析、ゲルろ過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー及び限外ろ過などの技法を単独または組み合わせて適用することができる。
本発明の具体例としては、単鎖インスリンアナログを製造する方法は、
(a)タンパク質分解酵素の切断部位を含む5〜20個のアミノ酸で構成されたペプチドが上記単鎖インスリンアナログのアミノ末端に融合した形態で単鎖インスリンアナログを発現させる段階; 及び
(b)発現された単鎖インスリンアナログに融合したペプチドを除去する段階を含むことができる。
(a)タンパク質分解酵素の切断部位を含む5〜20個のアミノ酸で構成されたペプチドが上記単鎖インスリンアナログのアミノ末端に融合した形態で単鎖インスリンアナログを発現させる段階; 及び
(b)発現された単鎖インスリンアナログに融合したペプチドを除去する段階を含むことができる。
上記単鎖インスリンアミノ末端に融合したペプチドは、単鎖インスリンアナログの発現収率の増大に寄与し、タンパク質分解酵素(例えば、トリプシン)の切断部位を有しており、単鎖インスリンアナログの生産時に効率的に除去される。上記単鎖インスリンアミノ末端に追加されるペプチドは、単鎖インスリンアナログの発現収率の増大に寄与し、タンパク質分解酵素の切断部位を有している限り限定されないが、具体的には、5〜20個のアミノ酸で構成することができ、より具体的には、7〜18個、または9〜16個のアミノ酸で構成することができ、さらに具体的には、MATTSTATTR(配列番号20)のアミノ酸配列を含むことができる。上記ペプチドが融合した単鎖インスリンアナログは、配列番号24のアミノ酸配列を有してもよいが、これに限定されない。
一つの具体的な実施形態においてペプチドが融合した単鎖インスリンアナログは、天然型インスリンA鎖;上記C−ペプチドのアナログ;及び天然型インスリンB鎖が上記の順序で連結された単鎖インスリンアナログのアミノ末端にペプチドが融合したものであってもよく、具体的には、配列番号19のアミノ酸配列を有してもよいが、これに限定されない。
本発明の具体例では、形質転換体から封入体の形態で発現された単鎖インスリンアナログを分離及び精製するために下記段階をさらに含むことができる:
b-1)上記a)段階の培養液から形質転換体を収穫して破砕する段階;
b-2)破砕された細胞溶解物から発現された単鎖インスリンアナログを回収してリフォールディングする段階;
b-3)リフォールディングされた単鎖インスリンアナログを、カチオン交換クロマトグラフィーで精製する段階;
b-4)精製された単鎖インスリンアナログを、タンパク質分解酵素(例えば、トリプシンまたはカルボペプチダーゼB)で処理する段階; 及び/または
b-5)処理された単鎖インスリンアナログをカチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせで精製する段階。
b-2)破砕された細胞溶解物から発現された単鎖インスリンアナログを回収してリフォールディングする段階;
b-3)リフォールディングされた単鎖インスリンアナログを、カチオン交換クロマトグラフィーで精製する段階;
b-4)精製された単鎖インスリンアナログを、タンパク質分解酵素(例えば、トリプシンまたはカルボペプチダーゼB)で処理する段階; 及び/または
b-5)処理された単鎖インスリンアナログをカチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせで精製する段階。
また、上記分離及び精製する段階は、タンパク質分解酵素の切断部位を含むペプチドが融合した形態で単鎖インスリンアナログを発現させた場合、単鎖インスリンアナログに融合したペプチドを除去する段階をさらに含むことができる。
本発明のもう一つの態様は、単鎖インスリンアナログの半減期及び生体利用率を増加させたり、活性を持続的に維持させる製剤を提供する。具体的には、上記製剤は、単鎖インスリンアナログに直接共有結合するキャリアを含む製剤や、または直接共有結合はなくても単鎖インスリンアナログの生体内活性の維持を高める成分を含む製剤をいう。
また、本発明のもう一つの他の態様は、単鎖インスリンアナログ及びその生体内半減期を増加させる物質を結合させた、単鎖インスリンアナログ結合体を持続型インスリンとして提供する。また、本発明の単鎖インスリンアナログは、天然型インスリンに比べて低い活性を有し、既存の天然型インスリンの最大の問題である低血糖のリスクを下げることができ、その持続型剤形は、低活性を持続的に維持して低血糖のリスクなしに長い間血糖調節に有利である。
一つの具体的な実施形態において、本発明の単鎖インスリンアナログ結合体は、下記化学式1の構造を有する。
[化学式1]
X−Y−Z−La−F
ここで、
Xは、天然型インスリンA鎖、B鎖またはこれらのアナログであり、
Yは、C−ペプチドまたはそのアナログであり、
Zは、天然型インスリンB鎖、A鎖またはこれらのアナログであり、
Lは、リンカーであり、
aは、0または自然数であり、ただし、aが2以上であるとき、それぞれのLは互いに独立しており、
Fは、インスリンアナログの生体内半減期を増加させる物質であり、
ただし、X、Y及びZがそれぞれ天然型インスリンのB鎖、C−ペプチド及びA鎖であるか、天然型インスリンのA鎖、C−ペプチド及びB鎖である場合は除外され、
X−Y−Zは、単鎖インスリンアナログを形成する。
X−Y−Z−La−F
ここで、
Xは、天然型インスリンA鎖、B鎖またはこれらのアナログであり、
Yは、C−ペプチドまたはそのアナログであり、
Zは、天然型インスリンB鎖、A鎖またはこれらのアナログであり、
Lは、リンカーであり、
aは、0または自然数であり、ただし、aが2以上であるとき、それぞれのLは互いに独立しており、
Fは、インスリンアナログの生体内半減期を増加させる物質であり、
ただし、X、Y及びZがそれぞれ天然型インスリンのB鎖、C−ペプチド及びA鎖であるか、天然型インスリンのA鎖、C−ペプチド及びB鎖である場合は除外され、
X−Y−Zは、単鎖インスリンアナログを形成する。
上記の「−」は、それぞれの結合を意味するもので、直接的な結合またはリンカーを示す。上記リンカーは、ペプチド性リンカーまたは非ペプチド性リンカーであってもよい。
また、上記「−」は、非共有結合もしくは共有結合など、任意の化学的結合であってもよく、具体的には共有結合であってもよいが、これに限定されない。
上記Lは、ペプチド性重合体または非ペプチド性重合体であってもよい。
上記Lがペプチド性重合体であるとき、1個以上のアミノ酸を含むことができ、例えば、1個〜1000個のアミノ酸を含むことができるが、特に、これに限定されるものではない。本発明において、FとZを連結するために公知の様々なペプチドリンカーが、本発明に使用することができ、その例として[GS] xリンカー、[GGGS] xリンカー及び[GGGGS] xリンカーなどを含み、ここで、xは1以上の自然数であってもよい。しかし、上記例に制限されるものではない。
上記Lが非ペプチド性重合体であるとき、上記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカリド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、及びこれらの組み合わせからなる群から選択することができ、より具体的には、ポリエチレングリコールであってもよいが、これに限定されるものではない。
上記X−Y−ZとFは、共有化学結合または非共有化学結合で互いに結合することができ、共有化学結合、非共有化学結合、またはこれらの組み合わせでLを介してX−Y−ZとFが互いに結合することができる。
本発明で使用される用語「持続型インスリン」とは、単鎖インスリンアナログに半減期を延長させる生体適合性物質が結合された物質をいう。上記持続型インスリンは、天然型インスリンに比べて半減期が増大した効果を有する。
上記単鎖インスリンアナログについては、先に説明した通りである。
本発明において、「生体適合性物質または生体内半減期を増加させる物質」とは、単鎖インスリンアナログに結合され、その半減期を延長させる物質を意味する。上記「生体適合性物質」または「生体内半減期を増加させる物質」は、本発明において「キャリア」と混用される。
上記生体適合性物質またはキャリアは、単鎖インスリンアナログに結合されてその半減期を延長させる物質であれば、すべて含まれ、その例として、ポリエチレングリコール、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びその断片、アルブミン結合物質、特定のアミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、FcRn結合物質、生体内の結合組織、あるいはその誘導体、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン(Transferrin)、糖類(saccharide)及び高分子重合体からなる群から選択することができるが、これに限定されない。
上記生体適合性物質またはキャリアは、共有または非共有結合で単鎖インスリンアナログに結合することができる。また、単鎖インスリンアナログと上記生体適合性物質またはキャリアとの連結は、遺伝子組換え方法と高分子または低分子の化学物質を用いたin vitro結合などを含み、どの結合方式にも限定されない。
本発明においてポリエチレングリコールをキャリアとして使用するとき、位置特異的にポリエチレングリコールを付着することができるAmbrx社のRecode技術が含まれてもよく、糖鎖部位に特異的に付着することができるNeose社の糖PEG化(glycopegylation)技術が含まれてもよい。また、生体内でポリエチレングリコールが徐々に除去されるreleasable PEG技術がこれに含まれてもよいが、これに限定されず、PEGを用いて生体内の利用率を高めた技術が含まれてもよい。
また、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸のような高分子重合体も、上記技術によりインスリンアナログに結合することができる。
本発明においてアルブミンをキャリアとして使用する場合、アルブミンあるいはアルブミン断片を直接インスリンアナログに直接共有結合して生体内安定性を向上させる技術が含まれてもよく、アルブミンを直接結合しなくても、アルブミンに結合する物質、例えば、アルブミン特異的結合抗体もしくは抗体断片をインスリンアナログに結合させてアルブミンに結合させる技術及びアルブミンに結合力を有する特定のペプチド/タンパク質(例えば、Affibody社のalbumod技術を利用して生産されたアルブミン結合ペプチド)をインスリンアナログに結合する技術が含まれてもよく、アルブミンに結合力を有する脂肪酸などを結合させる技術が、これに含まれてもよいが、これに限定されず、アルブミンを用いた生体内安定性を向上させる如何なる技術、結合方式などがこれに含まれてもよい。
生体内半減期を増加させるために、抗体もしくは抗体断片をキャリアとして使用してインスリンアナログに結合させる技術も本発明に含まれることができる。FcRn結合部位を有する抗体もしくは抗体断片であってもよく、FabなどFcRn結合部位を含まない任意の抗体断片であってもよい。Catalytic抗体を利用するCovX社のCovX−body技術がこれに含まれてもよく、免疫グロブリンFc領域を利用して生体内半減期を増加させる技術も本発明に含まれてもよい。
上記FcRn結合物質は、免疫グロブリンFc領域であってもよい。
本発明で使用される用語「免疫グロブリンFc領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域1(CH1)と軽鎖不変領域(CL)を除いた残りの部分を意味し、免疫グロブリンFc領域は、重鎖不変領域にヒンジ(hinge)領域をさらに含むこともある。特に、免疫グロブリンFc領域全体及びその一部を含む断片であってもよく、本発明では、免疫グロブリンFc領域は、免疫グロブリン断片、または免疫グロブリン不変領域と混用することができる。
天然型Fcは、重鎖不変領域1においてAsn297部位に糖鎖が存在するが、大腸菌由来の組換えFcは糖鎖がない形態で発現される。Fcから糖鎖が除去されると、重鎖不変領域1に結合するFcガンマ受容体1、2、3と補体(c1q)の結合力が低下して抗体依存性細胞傷害または補体依存性細胞傷害が減少または除去される。
本発明において、「免疫グロブリン不変領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域1(CH1)と軽鎖不変領域(CL)を除いた、重鎖不変領域2(CH2)及び重鎖不変領域3(CH3)(または重鎖不変領域4(CH4)を含む)の部分を含むFc断片を意味することができ、重鎖不変領域にヒンジ(hinge)部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリン不変領域は、天然型と実質的に同等または向上した効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除き、一部または全体の重鎖不変領域1(CH1)及び/または軽鎖不変領域(CL)を含む拡張された免疫グロブリン不変領域であってもよい。また、CH2及び/またはCH3に該当する非常に長い、一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。即ち、本発明の免疫グロブリン不変領域は、(1)CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメイン、(2)CH1ドメイン及びCH2ドメイン、(3)CH1ドメイン及びCH3ドメイン、(4)CH2ドメイン及びCH3ドメイン、(5)1個または2個以上の不変領域ドメインと免疫グロブリンヒンジ領域(またはヒンジ領域の一部)との組み合わせは、(6)重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。免疫グロブリンFc断片をはじめとする不変領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるため、薬物のキャリアとして使用するのに安全である。また、免疫グロブリンFc断片は、免疫グロブリン全体分子に比べて相対的に分子量が少ないため、結合体の製造、精製、及び収率の面で有利であるのみならず、アミノ酸配列が抗体ごとに異なり、高い非均質性を示すFab部分が除去されるので、物質の同質性が大幅に増加し、血中抗原性の誘発可能性も低くなる効果も期待することができる。
一方、免疫グロブリン不変領域は、ヒトまたはウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物由来であってもよく、具体的には、ヒト起源である。また、免疫グロブリン不変領域は、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM由来またはこれらの組み合わせ(combination)またはこれらの混成(hybrid)による不変領域からなる群から選択することができる。具体的には、ヒトの血液に最も豊富なIgGまたはIgM由来であり、最も具体的には、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させると公知になったIgG由来であってもよい。本発明において、免疫グロブリンFc領域は、同じ起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体または多量体であってもよい。
本発明において「組み合わせ(combination)」とは、二量体または多量体を形成するとき、同じ起源の単鎖免疫グロブリン不変領域(具体的には、Fc領域)を暗号化するポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。即ち、IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc及びIgEのFc断片からなるグループから選択された2個以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
本発明において「ハイブリッド(hybrid)」とは、単鎖の免疫グロブリン不変領域(具体的には、Fc領域)内に2個以上の異なる起源の免疫グロブリン不変領域に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、様々な形態のハイブリッドが可能である。即ち、IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc及びIgD FcのCH1、CH2、CH3、及びCH4からなるグループから選択された1個〜4個のドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジ領域をさらに含むことができる。
IgGもIgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4のサブクラスに分けることができ、本発明では、これらの組み合わせ、またはこれらの混成化した形態も可能である。具体的には、IgG2及びIgG4サブクラスであり、より具体的には、補体依存障害(CDC、Complementdependent cytotoxicity)のようなエフェクター機能(effector function)がほとんどないIgG4のFc領域であってもよい。
また、免疫グロブリン不変領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリン不変領域糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を利用した遺伝子工学的方法のような通常の方法を用いることができる。ここで、免疫グロブリン不変領域から糖鎖が除去された免疫グロブリン不変領域は、補体(c1q)の結合力が顕著に低下し、抗体依存性細胞傷害または補体依存性細胞傷害が減少または除去されるため、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点で、薬物のキャリアとしての本来の目的に、より合致する形態は、糖鎖が除去されたり非糖鎖化された免疫グロブリン不変領域と言える。したがって、さらに具体的には、ヒトIgG4由来の非糖鎖化されたFc領域、即ち、ヒト非糖鎖化IgG4 Fc領域を使用することができる。ヒト由来のFc領域は、ヒト生体で抗原として作用し、これに対する新たな抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を引き起こし得る非ヒト由来のFc領域に比べて好ましいことがある。
また、本発明の免疫グロブリン不変領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体(mutant)を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせにより異なる配列を有することを意味する。例えば、IgG Fcの場合、結合に重要であると知られている214〜238、297〜299、318〜322または327〜331番アミノ酸残基が変形のために、適当な部位として利用されてもよい。また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去されるか、天然型FcからN末端のいくつかのアミノ酸が除去され、又は天然型FcのN末端にメチオニン残基が付加されるなど、様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えば、C1q結合部位が除去されてもよく、ADCC部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリン不変領域の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開第97/34631号(特許文献3)、国際特許公開第96/32478号(特許文献4)などに開示されている。
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野において公知となっている(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979(非特許文献4))。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly間の交換である。場合によっては、リン酸化(phosphorylation)、硫酸化(sulfation)、アクリル化(acrylation)、グリコシル化(glycosylation)、メチル化(methylation)、ファルネシル化(farnesylation)、アセチル化(acetylation)、アミド化(amidation)などで修飾(modification)されてもよい。
上述した免疫グロブリン不変領域誘導体は、本発明の免疫グロブリン不変領域と同じ生物学的活性を示すが、免疫グロブリン不変領域の熱、pHなどに対する構造的安定性を増大させた誘導体であってもよい。また、このような免疫グロブリン不変領域は、ヒト及びウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内で分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組換え型またはその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は、全免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理する場合には、Fab及びFcに切断され、ペプシンを処理する場合には、pFc及びF(ab)2に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー(size-exclusion Chromatography)などを利用してFcまたはpFcを分離することができる。
具体的には、ヒト由来の免疫グロブリン不変領域を微生物から収得した組換え型免疫グロブリン不変領域であってもよい。
一つの具体的な実施形態において本発明の結合体は、単鎖インスリンアナログ及びその生体内半減期を増加させる物質がリンカーを通じて連結されてもよい。
本発明において、上記リンカーは、単鎖インスリンアナログまたはその生体内半減期を増加させる物質のそれぞれのN末端、C末端、リジン、ヒスチジン、またはシステインに結合された形態であってもよい。
上記リンカーは、ペプチド性リンカーまたは非ペプチド性リンカーであってもよい。
上記非ペプチド性リンカーとしてタンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体を使用して、単鎖インスリンアナログの生体内半減期を増加させる物質と同様に単鎖インスリンアナログの血中半減期を維持することができる。したがって、本発明で使用することができる非ペプチド性リンカーは、上記のような役割、即ち、生体内タンパク質分解酵素に抵抗性のある非ペプチド性重合体であれば、制限なく使用することができる。
本発明において、「非ペプチド性重合体」とは、繰り返し単位が2つ以上の結合された生体適合性重合体を含み、「非ペプチド性リンカー」と混用される。上記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合を通じて互いに連結される。本発明において、非ペプチド性重合体は、末端に反応基を含み、結合体を構成する他の構成要素と反応を通じて結合体を形成することができる。
本発明において、「非ペプチド性重合体の連結部(linkage moiety)」とは、両末端に反応基を有する非ペプチド性重合体が、各反応基を通じて免疫グロブリンFc領域及び単鎖インスリンアナログと結合して形成した結合体の一構成要素を意味する。
一つの具体的な実施形態において、上記単鎖インスリンアナログ結合体は、両末端に免疫グロブリンFc領域及び単鎖インスリンアナログと結合することができる反応基を含む非ペプチド性重合体を通じて、免疫グロブリンFc領域及び単鎖インスリンアナログが互いに共有結合的に連結されたものであってもよい。
具体的には、特にこれに限定されないが、上記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカリド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、PLA(polylactic acid)及びPLGA(polylactic-glycolic acid)のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの組み合わせで構成された群から選択することができる。より具体的な実施形態において、上記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコールであってもよいが、これに限定されない。また、当該分野において既に知られているこれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造することができる誘導体も、本発明の範囲に含まれる。
上記リンカーによる結合は、非共有化学結合あるいは共有化学結合など、如何なる化学的結合であってもよく、その制限はない。
より具体的には、本発明において非ペプチド性重合体は、繰り返し単位が2つ以上の結合された生体適合性重合体を含み、上記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合を通じて互いに連結される。このような非ペプチド性重合体は、両末端または三末端を有することができる。
本発明で使用することができる非ペプチド性重合体は、生体内のタンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であれば、制限なく使用することができるが、具体的には、非ペプチド性重合体の分子量は、0を超え200kDaの範囲、具体的には1〜100kDaの範囲、より具体的には1〜50kDaの範囲、より具体的には1〜20kDaの範囲、より具体的には3.4kDa〜10kDaの範囲、より具体的には約3.4kDaであってもよいが、これに限定されない。
また、上記キャリア、特に免疫グロブリンFc領域と結合される本発明の非ペプチド性重合体は、一種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが使用されてもよい。
一つの具体的な実施形態において、上記非ペプチド性重合体の両末端は、それぞれ免疫グロブリンFc領域または単鎖インスリンアナログのアミン基、チオール基、ヒドロキシル基に結合することができる。
具体的には、上記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれ免疫グロブリンFc及び単鎖インスリンアナログと結合することができる反応基、具体的には、単鎖インスリンアナログまたは免疫グロブリンFc領域のN末端、リジン、及び/またはヒスチジンに位置するアミン基、C末端に位置するヒドロキシル基及び/またはシステインのチオール基と結合することができる反応基を含むことができるが、これに限定されない。
より具体的には、上記非ペプチド性重合体の反応基は、アルデヒドグループ、プロピオンアルデヒドグループ、ブチルアルデヒドグループ、マレイミドグループ及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される一つ以上であってもよいが、これに限定されない。
上記において、アルデヒド基としてプロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基を例として挙げられるが、これに限定されない。
上記において、スクシンイミド誘導体としては、上記スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレラート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、N−ヒドロキシスクシンイミド、またはスクシンイミジルカルボネートが使用されてもよいが、これに限定されない。
上記非ペプチド性重合体は、上記のような反応基を通じて免疫グロブリンFc及び単鎖インスリンアナログで連結され、非ペプチド性重合体の連結部に転換することができる。
また、アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終的な産物は、アミド結合で連結されたものより遥かに安定している。アルデヒド反応基は、低pHでN末端に選択的に反応し、高いpH、例えば、pH9.0の条件では、リジン残基と共有結合を形成することができる。
本発明の非ペプチド性重合体の末端反応基は、互いに同一または異なってもよい。上記非ペプチド性重合体は、末端にアルデヒドグループの反応基を有するものであってもよく、また、上記非ペプチド性重合体は、末端にそれぞれアルデヒドグループ及びマレイミド反応基を有するか、または末端にそれぞれアルデヒドグループ及びスクシンイミド反応基を有してもよいが、これに限定されない。
例えば、一方の末端にはマレイミドグループを、他方の末端には、アルデヒドグループ、プロピオンアルデヒドグループまたはブチルアルデヒドグループを有してもよい。もう一つの例として、一方の末端にはスクシンイミジルグループを、他方の末端には、プロピオンアルデヒドグループまたはブチルアルデヒドグループを有してもよい。
プロピオン側の末端にヒドロキシ反応基を有するポリ(エチレングリコール)を非ペプチド性重合体として用いる場合には、公知の化学反応により、上記ヒドロキシ基を上記様々な反応基で活性化したり、商業的に入手可能な変形された反応基を有するポリ(エチレングリコール)を用いて本発明の結合体を製造することができる。
一つの具体的な実施形態において、上記非ペプチド性重合体の反応基が単鎖インスリンアナログのシステイン残基、より具体的にはシステインの−SH基に連結されるものであってもよいが、これに限定されない。
もし、マレイミド-PEG-アルデヒドを使用する場合は、マレイミド基は単鎖インスリンアナログの-SH基とチオエーテル(thioether)結合で連結し、アルデヒド基は、免疫グロブリンFcの-NH2基と還元的アルキル化反応を通じて連結することができるが、これに限定されず、これは一つの例に該当する。
このような還元的アルキル化を通じてPEGの一方の末端に位置する酸素原子に免疫グロブリンFc領域のN末端アミノ基が-CH2CH2CH2-の構造を有するリンカー作用基を通じて互いに連結され、-PEG-O -CH2CH2CH2NH-免疫グロブリンFcのような構造を形成してもよく、チオエーテル結合を通じてPEGの一方の末端が単鎖インスリンアナログのシステインに位置する硫黄原子に連結された構造を形成することができる。上述したチオエーテル結合は、
の構造を含むことができる。
の構造を含むことができる。
しかし、上述した例に特に制限されるものではなく、これは一つの例に該当する。
また、上記結合体において、非ペプチド性重合体の反応基が免疫グロブリンFc領域のN末端に位置する−NH2と連結されたものであってもよいが、これは一つの例に該当する。具体的には、本発明の単鎖インスリンアナログは、反応基を有する非ペプチド性重合体とC末端を通じて連結することができる。
本発明において、「C末端」は、ペプチドのカルボキシ末端を意味することであり、本発明の目的上、非ペプチド性重合体と結合する位置をいう。その例として、これに限定されないが、C末端の最末端のアミノ酸残基だけでなく、C末端の周囲のアミノ酸残基をすべて含むことができ、具体的には、最末端から最初〜20番目のアミノ酸残基を含むことができる。
一つの具体的な実施形態において、単鎖インスリンアナログと生体内半減期を延長する物質の連結は、遺伝子組換えの方法であってもよい。
本発明のもう一つの態様は、上記単鎖インスリンアナログ及びその生体内半減期を増加させる物質を連結する段階を含む、単鎖インスリンアナログ結合体を製造する方法を提供する。
上記単鎖インスリンアナログ、その生体内半減期を増加させる物質及び単鎖インスリンアナログ結合体は、先に説明した通りである。
具体的には、上記方法は、
(a)2以上の末端反応基を有する非ペプチド性重合体と単鎖インスリンアナログまたはキャリア中の一つを反応させ、単鎖インスリンアナログまたはキャリアが一方の末端に取り付けられ、他方の末端に反応基(reactive end group)を有する、連結体を製造する段階;及び
(b)上記(a)段階で製造された連結体と、キャリアまたは単鎖インスリンアナログ中、連結体に付着されていない他の一つを反応させ、単鎖インスリンアナログとキャリアが非ペプチド性重合体を通じて連結された、結合体を製造する段階を含むことができる。
(a)2以上の末端反応基を有する非ペプチド性重合体と単鎖インスリンアナログまたはキャリア中の一つを反応させ、単鎖インスリンアナログまたはキャリアが一方の末端に取り付けられ、他方の末端に反応基(reactive end group)を有する、連結体を製造する段階;及び
(b)上記(a)段階で製造された連結体と、キャリアまたは単鎖インスリンアナログ中、連結体に付着されていない他の一つを反応させ、単鎖インスリンアナログとキャリアが非ペプチド性重合体を通じて連結された、結合体を製造する段階を含むことができる。
上記非ペプチド性重合体、キャリア、単鎖インスリンアナログと、これらの連結の構成については、先に記述した説明がすべて適用される。
本発明において、用語「連結体」とは、非ペプチド性重合体と単鎖インスリンアナログまたはキャリア中の一つのみが共有結合で連結された中間体であって、上記連結体において単鎖インスリンアナログまたはキャリアが連結されていない非ペプチド性重合体の末端に、連結体に付着されていない単鎖インスリンアナログまたはキャリアが結合されてもよい。
上記単鎖インスリンアナログは、先に説明した単鎖インスリンアナログを製造する方法により得ることができ、商業的に依頼して製造することができる。
本発明のもう一つの態様は、上記単鎖インスリンアナログまたは単鎖インスリンアナログ結合体を含む、生体内持続性及び安定性が増加した単鎖インスリン持続性製剤を提供する。
一方、生体利用率を増加、あるいは継続的な活性を維持することができる製剤としては、PLGA、ヒアルロン酸、キトサンなどを利用したマイクロパーティクル、ナノパーティクルなどによる徐放性(sustained release)剤形がこれに含まれてもよい。
また、生体利用率の増加、あるいは継続的な活性を維持することができる他の態様の 製剤としては、インプラント(implant)、吸入剤(inhalation)、ネイザル(nasal)製剤、パッチ(patch)のような形態の製剤であってもよい。
このような本発明の単鎖インスリンアナログまたは単鎖インスリンアナログ結合体は、エネルギー代謝及び糖代謝のような従来のインスリンの生体内活性が維持されるだけでなく、インスリンアナログの血中半減期及びこれによる上記ペプチドの生体内の効力持続効果が画期的に増加するようになるため、糖尿病(Diabetes)の治療に有用である。
本発明のもう一つの態様は、上記単鎖インスリンアナログまたは単鎖インスリンアナログ結合体を含む、糖尿病の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
上記単鎖インスリンアナログ及び単鎖インスリンアナログ結合体は、先に説明した通りである。
本発明で使用される用語「予防」とは、上記薬学的組成物の投与により糖尿病疾患の発症を抑制または遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、上記薬学的組成物の投与により糖尿病疾患の症状が好転したり、有効になるすべての行為を意味する。
本発明で使用される用語「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、上記薬学的組成物の投与経路は特に限定されないが、上記組成物が、生体内標的に到達することができる任意の一般的な経路を通じて投与することができ、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、または直腸内投与などであってもよい。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。このような薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤は、非自然に発生したものであってもよい。上記担体は、特にこれに限定されないが、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。
本発明で使用される用語「薬学的に許容可能な」とは、治療効果を示すことができる程度の十分な量と副作用を起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合または同時使用される薬物など、医学分野でよく知られている要素に応じて、当業者により容易に決定することができる。
本発明の組成物の剤形は、上述したような薬学的に許容可能な担体と混合して多様に製造することができる。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウエハーなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤などに剤形化することができる。
一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギン酸、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが使用されてもよい。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含むことができる。
また、本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有することができる。
また、上記組成物は、薬学的分野において通常の方法により、患者の身体内投与に適した単位投与型の製剤、具体的には、タンパク質医薬品の投与に有用な製剤形態に剤形化させ、当業界において通常使用される投与方法を用いて経口、または皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髓膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内または直腸の経路を含む非経口投与経路により投与することができるが、これに限定されるものではない。
また、上記結合体は、生理食塩水または有機溶媒のように薬剤として許容された種々の伝達体(carrier)と混合して使用することができ、安定性や吸水性を増加させるためにグルコース、スクロースまたはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸(ascorbic acid)またはグルタチオンのような抗酸化剤(antioxidants)、キレート剤、低分子タンパク質または他の安定化剤(stabilizers)などが薬剤として使用されてもよい。
本発明の薬学的組成物の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び疾患の重症度などの種々の関連因子とともに、活性成分である薬物の種類に応じて決定される。
本発明の組成物の総有効量は、単一投与量(single dose)で患者に投与されてもよく、多重投与量(multiple dose)で長期間投与される分割治療方法(fractionated treatment protocol)により投与されてもよい。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含量を異にすることができる。具体的には、本発明の結合体の望ましい全体容量は一日に患者の体重1 kg当たり約0.0001 mg〜500 mgであってもよい。しかし、上記結合体の容量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食物及び排泄率など、多様な要因を考慮し、患者に対する有効投与量が決定されるため、このような点を考慮すると、当分野の通常の知識を有する者であれば、上記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定することができる。本発明に係る薬学的組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。
本発明のもう一つの態様は、上記単鎖インスリンアナログまたは単鎖インスリンアナログ結合体を含む薬学的組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、糖尿病疾患の予防または治療方法を提供する。
上記単鎖インスリンアナログ、単鎖インスリンアナログ結合体、予防及び治療は、先に説明した通りである。
本発明で使用される用語「個体」とは、糖尿病疾患が疑われる個体であって、上記糖尿病疾患が疑われる個体は、当該疾患が発症又は、発症し得るヒトを含むマウス、家畜などを含む哺乳動物を意味するが、本発明の単鎖インスリンアナログ、単鎖インスリンアナログ結合体もしくはそれを含む組成物で治療可能な個体は、制限なく含まれる。
本発明の方法は、上記薬学的組成物を薬学的有効量で投与することができる。適切な総1日使用量は、正しい医学的判断の範囲内で処置医により決定されてもよく、1回または数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって異なる製剤が使用されるかどうかをはじめとした具体的組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物とともに使用されたり、同時に使用される薬剤をはじめとする多様な因子と医薬分野によく知られている類似因子に応じて異なって適用することが望ましい。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、ひたすら本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものではない。
実施例1:単鎖インスリンアナログ発現ベクターの作製
1.プロインスリンアナログ(A鎖-Cペプチド-B鎖)の製作
インスリンアナログ、プロインスリンアナログを大腸菌で発現させるようにする塩基配列を有する発現ベクターを作製した。上記発現ベクターは、インスリンA鎖のアミノ末端を自由にするために、天然型プロインスリン(B鎖-Cペプチド-A鎖;配列番号4及び5)と、他のプロインスリンアナログ(A鎖-Cペプチド-B鎖、配列番号6及び7)を発現させる塩基配列を含み、次のように製造された。
1.プロインスリンアナログ(A鎖-Cペプチド-B鎖)の製作
インスリンアナログ、プロインスリンアナログを大腸菌で発現させるようにする塩基配列を有する発現ベクターを作製した。上記発現ベクターは、インスリンA鎖のアミノ末端を自由にするために、天然型プロインスリン(B鎖-Cペプチド-A鎖;配列番号4及び5)と、他のプロインスリンアナログ(A鎖-Cペプチド-B鎖、配列番号6及び7)を発現させる塩基配列を含み、次のように製造された。
86個のアミノ酸を暗号化するプロインスリンアナログの発現ベクターを作製するために、報告されたプロインスリン遺伝子配列(NM_000207.2、NCBI)に基づいて、以下のような6個のプライマーを合成した。また、プロインスリンcDNA(Origene)を鋳型とし、A鎖、Cペプチド及びB鎖をPCR方法でそれぞれ増幅した後、3個のPCR増幅産物と上記プライマーをともに混ぜてPCRを行い、プロインスリンアナログの遺伝子を合成した。
具体的には、プロインスリンアナログの遺伝子のA鎖の合成のために、フォワードプライマー(配列番号8)は、開始ATGコドン及びNdeI制限酵素部位を含むように合成し、リバースプライマー(配列番号9)は、A鎖の3'末端部位配列とCペプチドの5'部位配列を含むように合成した。Cペプチドを暗号化する遺伝子を合成するために、フォワードプライマー(配列番号10)は、A鎖のアミノ末端配列及びCペプチドの配列を、そしてリバースプライマー(配列番号11)は、Cペプチドの3'末端配列及びB鎖の5'末端配列を含むように合成した。B鎖を暗号化する遺伝子を合成するために、フォワードプライマー(配列番号12)は、Cペプチドの3'末端配列及びB鎖の配列を、そしてリバースプライマー(配列番号13)は、B鎖の5'末端配列及び制限酵素BamH I配列を含むように合成した。上記プライマーの配列は下記の通りである。
5’GGAATTCCATATGGGCATTGTGGAACAATGCTGT 3'(配列番号8)
5’CTGCCTCCCGGCGGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTG 3'(配列番号9)
5’GAACTACTGCAACCGCCGGGAGGCAGAGGACCTG 3'(配列番号10)
5’GTTGGTTCACAAAACGCTTCTGCAGGGACCCCTC 3'(配列番号11)
5’CCTGCAGAAGCGTTTTGTGAACCAACACCTGTGC 3'(配列番号12)
5’CGCGGATCCCTAGGTCTTGGGTGTGTAGAAGAAG 3'(配列番号13)
5’CTGCCTCCCGGCGGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTG 3'(配列番号9)
5’GAACTACTGCAACCGCCGGGAGGCAGAGGACCTG 3'(配列番号10)
5’GTTGGTTCACAAAACGCTTCTGCAGGGACCCCTC 3'(配列番号11)
5’CCTGCAGAAGCGTTTTGTGAACCAACACCTGTGC 3'(配列番号12)
5’CGCGGATCCCTAGGTCTTGGGTGTGTAGAAGAAG 3'(配列番号13)
上記のプライマーを用いて、それぞれの遺伝子を増幅した後、それぞれのPCR増幅産物と配列番号8で記載されるオリゴヌクレオチド及び配列番号13で記載されるプライマーをともに混ぜて、最終のA鎖−Cペプチド−B鎖の配列を有するプロインスリンアナログを合成した(図1)。上記のプロインスリンアナログの増幅のためにアニーリングを60℃で20秒に、延長を68℃で20秒にしてPCRを行った。
上記で得られたプロインスリンアナログの断片をpET22bベクター(Novagen)にクローニングした。プロインスリンアナログを、細胞内の封入体の形態で発現させるために、pET22bベクターを制限酵素Nde I及びBamH Iで処理して信号配列を除去し、プロインスリンアナログPCR産物を、同じ制限酵素Nde IとBamH Iで処理して分離されたそれぞれのDNAをT4 DNAリガーゼを用いてpET22bクローニングベクターに挿入した。上記結果として得られた発現ベクターをpET22b-InvPIと命名した。
2.単鎖インスリンアナログ(InvPIΔRRKR)の製作
上記で得られたプロインスリンアナログの塩基配列(配列番号7)でCペプチドの1番目、2番目のアミノ酸であるアルギニン(配列番号3で1番、2番)とCペプチドの最後の2個のアミノ酸(配列番号3において34番リジン、35番アルギニン)を下記配列番号14〜17番プライマーを用いて除去した。
上記で得られたプロインスリンアナログの塩基配列(配列番号7)でCペプチドの1番目、2番目のアミノ酸であるアルギニン(配列番号3で1番、2番)とCペプチドの最後の2個のアミノ酸(配列番号3において34番リジン、35番アルギニン)を下記配列番号14〜17番プライマーを用いて除去した。
5’GCTGGAGAACTACTGCAACGAGGCAGAGGACCTGCAGG 3'(フォワード、配列番号14)
5’CCTGCAGGTCCTCTGCCTCGTTGCAGTAGTTCTCCAGC 3'(リバース、配列番号15)
5’GGGGTCCCTGCAGTTTGTGAACCAACACCTGTGC 3'(フォワード、配列番号16)
5’GTTGGTTCACAAACTGCAGGGACCCCTCCAGGGC 3'(リバース、配列番号17)
5’CCTGCAGGTCCTCTGCCTCGTTGCAGTAGTTCTCCAGC 3'(リバース、配列番号15)
5’GGGGTCCCTGCAGTTTGTGAACCAACACCTGTGC 3'(フォワード、配列番号16)
5’GTTGGTTCACAAACTGCAGGGACCCCTCCAGGGC 3'(リバース、配列番号17)
上記で得られたプロインスリンアナログの発現ベクターをpET22b-InvPIΔRRKRと命名し、単鎖インスリンアナログをInvPIΔRRKR(配列番号18及び19)と命名した。
3.結合タンパク質配列が挿入された単鎖インスリンアナログ(FInvPI ΔRRKR)及びその発現ベクターの作製
上記実施例で製作されたpET22b-InvPIΔRRKRにおいてタンパク質の発現を助け、アミノ末端メチオニンの削除を容易にするための目的で、上記InvPIΔRRKRの塩基配列の5’部分に10個のアミノ酸配列(MATTSTATTR:配列番号20)をエンコードする塩基配列を追加するために、下記プライマーを合成した。
上記実施例で製作されたpET22b-InvPIΔRRKRにおいてタンパク質の発現を助け、アミノ末端メチオニンの削除を容易にするための目的で、上記InvPIΔRRKRの塩基配列の5’部分に10個のアミノ酸配列(MATTSTATTR:配列番号20)をエンコードする塩基配列を追加するために、下記プライマーを合成した。
具体的には、配列番号20に記載される10個のアミノ酸配列の挿入のために、フォワードプライマー(配列番号21)は、開始ATGコドン及びNdeI制限酵素部位と10個のアミノ酸配列を含むように合成し、リバースプライマー(配列番号22 )は、制限酵素BamH I配列を含むように合成した。上記プライマーの配列は下記の通りである。
5' TTTAAGAAGGAGATATACATCATATGGCAACAACATCAACAGCAACT
ACGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTG 3 '(配列番号21)
5' CAGCATTGTTCCACAATGCCACGCGTAGTTGCTGTTGATGTTGTTGC
CATATGATGTATATCTCCTTCTTAAA 3 '(配列番号22)
ACGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTG 3 '(配列番号21)
5' CAGCATTGTTCCACAATGCCACGCGTAGTTGCTGTTGATGTTGTTGC
CATATGATGTATATCTCCTTCTTAAA 3 '(配列番号22)
上記のプライマーを用いて、結合タンパク質が挿入された単鎖インスリンアナログの増幅のためにアニーリングを60℃で30秒に、伸長を68℃で30秒にしてPCRを行った。
上記で得られた結合タンパク質が挿入された単鎖インスリンアナログの断片をpET22bベクター(Novagen)にクローニングした。単鎖インスリンアナログを細胞内の封入体の形態で発現させるために、pET22bベクターを制限酵素Nde I及びBamH Iで処理して信号配列を除去し、結合タンパク質が挿入された単鎖インスリンアナログPCR産物を同じ制限酵素Nde IとBamH Iで処理し、分離された各DNAをT4 DNAリガーゼを用いて、pET22bクローニングベクターに挿入した。上記結果として得られた発現ベクターをpET22b-FInvPIΔRRKRと命名し、結合タンパク質が挿入された単鎖インスリンアナログをFInvPIΔRRKR(Fusion-A-C-B RRKR;配列番号23及び24)と命名した。
上記pET22b-FInvPIΔRRKR発現ベクターは、T7プロモーターの調節下に配列番号24のアミノ酸配列を暗号化し、宿主細胞内でプロインスリンアナログのタンパク質を封入体の形態で発現させた。
実施例2:単鎖インスリンアナログの発現
上記実施例1で製造した発現ベクターを用いて、T7プロモーター調節の下の組換え単鎖インスリンアナログを発現させた。それぞれの組換え単鎖インスリンアナログ発現ベクターでE. coli BL21DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)galλ(DE3);Novagen)を形質転換した。形質転換の方法は、Novagen社で推薦する方法を用いた。各組換え発現ベクターが形質転換されたそれぞれの単一コロニーを取り、アンピシリン(50μg/ml)を含む2Xルリアブロス(Luria Broth)培地に接種し、37℃で15時間培養した。組換え菌株の培養液と30%のグリセロールが含まれた2X LB培地を1:1(v/v)の割合で混合し、各1mlずつcryoチューブに分注し、-140℃で保管した。これを組換え融合タンパク質の生産のための細胞ストック(cell stock)として使用した。
上記実施例1で製造した発現ベクターを用いて、T7プロモーター調節の下の組換え単鎖インスリンアナログを発現させた。それぞれの組換え単鎖インスリンアナログ発現ベクターでE. coli BL21DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)galλ(DE3);Novagen)を形質転換した。形質転換の方法は、Novagen社で推薦する方法を用いた。各組換え発現ベクターが形質転換されたそれぞれの単一コロニーを取り、アンピシリン(50μg/ml)を含む2Xルリアブロス(Luria Broth)培地に接種し、37℃で15時間培養した。組換え菌株の培養液と30%のグリセロールが含まれた2X LB培地を1:1(v/v)の割合で混合し、各1mlずつcryoチューブに分注し、-140℃で保管した。これを組換え融合タンパク質の生産のための細胞ストック(cell stock)として使用した。
組換え単鎖インスリンアナログの発現のために、各細胞ストック1バイアル(vial)を溶かして500mlの2X LBに接種し、37℃で14〜16時間振とう培養した。OD.600nmの値が4.0以上を示すと培養を終了し、これを種培養液として使用した。5Lの発酵器(Bioflo-320、NBS、アメリカ)を用いて、種培養液を1.6Lの発酵培地に接種し、初期発酵を開始した。培養条件は、温度37℃、空気量2.0 L/min(1vvm)、攪拌速度650rpm及び30%のアンモニア水を使用し、pH 6.70に維持した。発酵の進行は、培養液内の栄養素が制限されたとき、追加の培地(feeding solution)を添加して流加培養を行った。菌株の成長は、OD値によりモニタリングし、OD値70以上で、最終濃度500μMのIPTGを導入した。培養はIPTG導入後、約23〜25時間までさらに行い、培養終了後、遠心分離器を使用して組換え菌株を収穫し、使用時まで-80℃で保管した。
実施例3:組換え単鎖インスリンアナログの抽出及びリフォールディング(refolding)
上記実施例で得られた単鎖インスリンアナログの発現の大腸菌から単鎖インスリンアナログを可溶性の形態に変えるために細胞を破砕し、リフォールディングした。培養液1 L分量に相当する細胞ペレットを1 Lの破砕緩衝溶液(20 mM Tris-HCl pH9.0、1 mM EDTA pH8.0、0.2 M NaCl、0.5%Triton X-100)に浮遊させた後、微細溶液化(Microfludizer)を利用して15,000 psiで組換え大腸菌を破砕した。12,000 gで30分間遠心分離して上澄み液を捨て、1 Lの洗浄緩衝液(50 mM Tris-HCl pH9.0、1 mM EDTA pH9.0、0.2 M NaCl、0.5%Triton X-100)でペレットを洗浄した。上記と同様な条件で遠心分離して上澄み液を捨て、蒸留水でペレットを再浮遊した後、同様な条件で遠心分離して洗浄された大腸菌封入体(inclusion body)ペレットを得た。洗浄された封入体ペレットを1 Lの可溶化緩衝液(6 M Urea、15 mM Glycine pH10.6)に再浮遊して常温で3時間攪拌した。可溶化された単鎖インスリンアナログの還元化のために、最終濃度15 mMのL-Cysteine-HClを導入した後、常温で1.5時間攪拌した。還元された単鎖インスリンアナログを3 Lの95 mM Glycine pH10.5溶液と4℃で混合して40〜70時間撹拌することにより、リフォールディング過程を行った。リフォールディング反応終了のために溶液体積の7%に相当する反応止め溶液(1 M Na-Cit pH2.0:acetic acid = 1:1.67(v/v))を添加した。12,000 gで30分間遠心分離して浮遊物を除去した後、0.45μmのフィルタを通過させて追加の浮遊物を除去した。
上記実施例で得られた単鎖インスリンアナログの発現の大腸菌から単鎖インスリンアナログを可溶性の形態に変えるために細胞を破砕し、リフォールディングした。培養液1 L分量に相当する細胞ペレットを1 Lの破砕緩衝溶液(20 mM Tris-HCl pH9.0、1 mM EDTA pH8.0、0.2 M NaCl、0.5%Triton X-100)に浮遊させた後、微細溶液化(Microfludizer)を利用して15,000 psiで組換え大腸菌を破砕した。12,000 gで30分間遠心分離して上澄み液を捨て、1 Lの洗浄緩衝液(50 mM Tris-HCl pH9.0、1 mM EDTA pH9.0、0.2 M NaCl、0.5%Triton X-100)でペレットを洗浄した。上記と同様な条件で遠心分離して上澄み液を捨て、蒸留水でペレットを再浮遊した後、同様な条件で遠心分離して洗浄された大腸菌封入体(inclusion body)ペレットを得た。洗浄された封入体ペレットを1 Lの可溶化緩衝液(6 M Urea、15 mM Glycine pH10.6)に再浮遊して常温で3時間攪拌した。可溶化された単鎖インスリンアナログの還元化のために、最終濃度15 mMのL-Cysteine-HClを導入した後、常温で1.5時間攪拌した。還元された単鎖インスリンアナログを3 Lの95 mM Glycine pH10.5溶液と4℃で混合して40〜70時間撹拌することにより、リフォールディング過程を行った。リフォールディング反応終了のために溶液体積の7%に相当する反応止め溶液(1 M Na-Cit pH2.0:acetic acid = 1:1.67(v/v))を添加した。12,000 gで30分間遠心分離して浮遊物を除去した後、0.45μmのフィルタを通過させて追加の浮遊物を除去した。
実施例4:1次カチオンカラムクロマトグラフィー
上記実施例3で得られた単鎖インスリンアナログリフォールディング溶液をカチオン性質のSP FF(GE healthcare)カラムに適用して精製した。カラムは、リフォールディング溶液導入前の結合緩衝液(20 mM Na-Citrate pH3.0、45%ethanol)で平衡化し、溶出緩衝液(20 mM Na-Citrate pH3.0、0.5 M KCl、45%ethanol)を0〜100%の勾配で4カラムボリューム流して溶出した。
上記実施例3で得られた単鎖インスリンアナログリフォールディング溶液をカチオン性質のSP FF(GE healthcare)カラムに適用して精製した。カラムは、リフォールディング溶液導入前の結合緩衝液(20 mM Na-Citrate pH3.0、45%ethanol)で平衡化し、溶出緩衝液(20 mM Na-Citrate pH3.0、0.5 M KCl、45%ethanol)を0〜100%の勾配で4カラムボリューム流して溶出した。
実施例5:タンパク質分解酵素を利用した結合タンパク質の除去
タンパク質の発現を容易にするために、単鎖インスリンアナログのアミノ末端には結合タンパク質(fusion protein)が存在する。この結合タンパク質を除去するために、タンパク質分解酵素であるトリプシン(trypsin、Roche)を用いた。カチオンカラムクロマトグラフィーで得られた溶出液を酵素反応のための緩衝溶液(50 mM Tris-HCl pH8.0)で交換するために、Sephadex G-25(GE healthcare)カラムを用いた。カラムから溶出されたタンパク質1g当たり163.28 unitsのトリプシンを処理した後、15℃で15時間反応を行った。15時間後に除去反応を停止させるために、20 mM Na-phosphate pH2.0緩衝溶液でカラムを利用してバッファの交換を行った。
タンパク質の発現を容易にするために、単鎖インスリンアナログのアミノ末端には結合タンパク質(fusion protein)が存在する。この結合タンパク質を除去するために、タンパク質分解酵素であるトリプシン(trypsin、Roche)を用いた。カチオンカラムクロマトグラフィーで得られた溶出液を酵素反応のための緩衝溶液(50 mM Tris-HCl pH8.0)で交換するために、Sephadex G-25(GE healthcare)カラムを用いた。カラムから溶出されたタンパク質1g当たり163.28 unitsのトリプシンを処理した後、15℃で15時間反応を行った。15時間後に除去反応を停止させるために、20 mM Na-phosphate pH2.0緩衝溶液でカラムを利用してバッファの交換を行った。
実施例6:2次カチオンカラムクロマトグラフィー
結合タンパク質が除去された単鎖インスリンアナログの精製のために、SP HP(GE healthcare)カラムを用いた。カラムは、結合緩衝液(20 mM Na-Citrate pH3.0、45%ethanol)で平衡化し、溶出緩衝液(20 mM Na-Citrate pH3.0、0.5 M KCl、45%ethanol)を0-56%の勾配で8カラムボリューム流して溶出した。
結合タンパク質が除去された単鎖インスリンアナログの精製のために、SP HP(GE healthcare)カラムを用いた。カラムは、結合緩衝液(20 mM Na-Citrate pH3.0、45%ethanol)で平衡化し、溶出緩衝液(20 mM Na-Citrate pH3.0、0.5 M KCl、45%ethanol)を0-56%の勾配で8カラムボリューム流して溶出した。
実施例7:逆相カラムクロマトグラフィー
上記実施例6のカチオンカラムクロマトグラフィーで溶出されたタンパク質を逆相カラムで追加精製するために、Source 30RPC(GE healthcare)を用いた。精製過程で使用する緩衝溶液の製造のために基本緩衝溶液である0.05 M Na-phosphate、0.1 M Na-percholate pH2.3を製造し、0.22μmのフィルタ(Sartorious)で濾過して準備した。結合緩衝液は、基本緩衝溶液90%と10%のイソプロピルアルコールを混合(w/v)して製造し、溶出緩衝液は、基本緩衝溶液55%と45%のイソプロピルアルコールを混合して製造した。溶出緩衝液を0〜100%の勾配で12.5カラムボリューム流して溶出した。溶出された試料は、RP-HPLC(C18、C4)とSE-HPLC分析を通じて純度を測定した。純度の測定結果を図2に示した。
上記実施例6のカチオンカラムクロマトグラフィーで溶出されたタンパク質を逆相カラムで追加精製するために、Source 30RPC(GE healthcare)を用いた。精製過程で使用する緩衝溶液の製造のために基本緩衝溶液である0.05 M Na-phosphate、0.1 M Na-percholate pH2.3を製造し、0.22μmのフィルタ(Sartorious)で濾過して準備した。結合緩衝液は、基本緩衝溶液90%と10%のイソプロピルアルコールを混合(w/v)して製造し、溶出緩衝液は、基本緩衝溶液55%と45%のイソプロピルアルコールを混合して製造した。溶出緩衝液を0〜100%の勾配で12.5カラムボリューム流して溶出した。溶出された試料は、RP-HPLC(C18、C4)とSE-HPLC分析を通じて純度を測定した。純度の測定結果を図2に示した。
実施例8:単鎖インスリンアナログペグ化(Pegylation)
上記実施例7の工程で高純度に精製された単鎖インスリンアナログを100mMのリン酸カリウム(pH 6.0)にバッファ交換した後、5 mg/mLと濃度を合わせ、3.4 kDa PropionylALD2 PEGを単鎖インスリンアナログのアミノ末端にペグ化させるために、単鎖インスリンアナログとPEGのモル比1:10になるようにPEGを添加した後、完全に溶かした。その後、還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)を20 mMになるように入れた後、常温で70分間反応させた。その後、30%のエタノールが含まれた20 mMのクエン酸ナトリウムpH 2.0のバッファで10倍に希釈した後、Source Sカラム(15 mm/15.5 cm、GE Healtcare社)に注入した。Source Sカラムは、30%のエタノールが含まれた20 mMのクエン酸ナトリウム、pH 2.0 qバッファで平衡がとれたカラムであり、流速は2.5 mL/minとした。一つのペグ化単鎖インスリンアナログを精製するために、30%のエタノールが含まれた20 mMのクエン酸ナトリウム、pH 2.0、0.25 M KClのバッファを0から100%になるように10カラム体積を流して一つのペグ化された単鎖インスリンアナログを精製した。
上記実施例7の工程で高純度に精製された単鎖インスリンアナログを100mMのリン酸カリウム(pH 6.0)にバッファ交換した後、5 mg/mLと濃度を合わせ、3.4 kDa PropionylALD2 PEGを単鎖インスリンアナログのアミノ末端にペグ化させるために、単鎖インスリンアナログとPEGのモル比1:10になるようにPEGを添加した後、完全に溶かした。その後、還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)を20 mMになるように入れた後、常温で70分間反応させた。その後、30%のエタノールが含まれた20 mMのクエン酸ナトリウムpH 2.0のバッファで10倍に希釈した後、Source Sカラム(15 mm/15.5 cm、GE Healtcare社)に注入した。Source Sカラムは、30%のエタノールが含まれた20 mMのクエン酸ナトリウム、pH 2.0 qバッファで平衡がとれたカラムであり、流速は2.5 mL/minとした。一つのペグ化単鎖インスリンアナログを精製するために、30%のエタノールが含まれた20 mMのクエン酸ナトリウム、pH 2.0、0.25 M KClのバッファを0から100%になるように10カラム体積を流して一つのペグ化された単鎖インスリンアナログを精製した。
実施例9:単鎖インスリンアナログ結合体の製造
上記実施例8の方法を用いて得られたペグ化された単鎖インスリンアナログを免疫グロブリンFcとカップリングさせた。単鎖インスリンアナログと免疫グロブリンFcモル比を1:4にし、全タンパク質濃度を30 mg/mLとし、4℃で18時間反応させた。この時、還元剤として20 mMになるようにシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)を入れた。その後、Sephadex G25カラムを用いて20 mM Tris、pH 7.5バッファでバッファ交換を行った後、Source Qカラム(25 mm/17.6 cm、GE Healthcare社)に注入した。Source Qカラムは20mM Tris、pH 7.5バッファで平衡がとれたカラムであり、流速は7 mL/minとした。カップリングタンパク質を溶出するために、20 mM Tris、pH 7.5、0.5M NaClバッファを0%から30%まで線形的に10カラム体積を流して溶出した。Source Qカラムで未反応の免疫グロブリンFcを除去することができた。上記Source Qで溶出されたカップリングタンパク質溶液に1.5 Mの硫酸アンモニウムを添加してSource isoカラム(25 mm/12.3 cm、GE Healthcare社)に注入した。Source isoカラムは、20 mM Tris-HCl、pH 7.5、1.5 Mの硫酸アンモニウムバッファで平衡がとれたカラムであり、流速は7.5 mL/minとした。単鎖インスリンアナログ-PEG-免疫グロブリンFcを精製するために、20 mM Tris-HCl、pH 7.5のバッファを0%から100%まで線形的に37カラム体積を流した。
上記実施例8の方法を用いて得られたペグ化された単鎖インスリンアナログを免疫グロブリンFcとカップリングさせた。単鎖インスリンアナログと免疫グロブリンFcモル比を1:4にし、全タンパク質濃度を30 mg/mLとし、4℃で18時間反応させた。この時、還元剤として20 mMになるようにシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)を入れた。その後、Sephadex G25カラムを用いて20 mM Tris、pH 7.5バッファでバッファ交換を行った後、Source Qカラム(25 mm/17.6 cm、GE Healthcare社)に注入した。Source Qカラムは20mM Tris、pH 7.5バッファで平衡がとれたカラムであり、流速は7 mL/minとした。カップリングタンパク質を溶出するために、20 mM Tris、pH 7.5、0.5M NaClバッファを0%から30%まで線形的に10カラム体積を流して溶出した。Source Qカラムで未反応の免疫グロブリンFcを除去することができた。上記Source Qで溶出されたカップリングタンパク質溶液に1.5 Mの硫酸アンモニウムを添加してSource isoカラム(25 mm/12.3 cm、GE Healthcare社)に注入した。Source isoカラムは、20 mM Tris-HCl、pH 7.5、1.5 Mの硫酸アンモニウムバッファで平衡がとれたカラムであり、流速は7.5 mL/minとした。単鎖インスリンアナログ-PEG-免疫グロブリンFcを精製するために、20 mM Tris-HCl、pH 7.5のバッファを0%から100%まで線形的に37カラム体積を流した。
上記Source isoカラムで最終精製された単鎖インスリンアナログ結合体(単鎖インスリンアナログ-PEG-免疫グロブリンFc)をSE-HPLCは、IE-HPLCで分析し、図3に示した。
実施例10:単鎖インスリンアナログ及び単鎖インスリンアナログ結合体のインスリン受容体結合力の確認
単鎖インスリンアナログのインスリン受容体結合力を測定するために、Scintillation proximity assay(SPA)の方法を用いて分析した。96 well pico-plateにインスリン受容体が発現されたCHO細胞株の細胞膜とPVT SPA beadをともに入れた。インスリン受容体に対する結合力を確認するために、10個以上の濃度に希釈したヒトインスリン及びそれぞれのインスリンアナログ、そして競争相手として、放射性同位元素である125ヨウ素が付着したインスリンをともに入れた後、常温で4時間の間競争反応させた。4時間後、ベータカウンターを用いて、インスリン受容体の結合力を測定した。各物質の結合力は、GraphPad Prism 6ソフトウェアを使用IC50として出力し、天然インスリンのインスリン受容体結合力に対する相対的な単鎖インスリンアナログのインスリン受容体結合力に数値化した。
単鎖インスリンアナログのインスリン受容体結合力を測定するために、Scintillation proximity assay(SPA)の方法を用いて分析した。96 well pico-plateにインスリン受容体が発現されたCHO細胞株の細胞膜とPVT SPA beadをともに入れた。インスリン受容体に対する結合力を確認するために、10個以上の濃度に希釈したヒトインスリン及びそれぞれのインスリンアナログ、そして競争相手として、放射性同位元素である125ヨウ素が付着したインスリンをともに入れた後、常温で4時間の間競争反応させた。4時間後、ベータカウンターを用いて、インスリン受容体の結合力を測定した。各物質の結合力は、GraphPad Prism 6ソフトウェアを使用IC50として出力し、天然インスリンのインスリン受容体結合力に対する相対的な単鎖インスリンアナログのインスリン受容体結合力に数値化した。
その結果、天然インスリンと比べて単鎖インスリンアナログは69%、単鎖インスリンアナログ結合体は、1.9%の受容体結合力がそれぞれ確認された(表4)。このように、本発明の単鎖インスリンアナログは、天然のインスリンに比べてインスリン受容体結合力が減少した。
実施例11:単鎖インスリンアナログ結合体のin vitro効力の確認
単鎖インスリンアナログ結合体のin vitro効力を測定するためには、脂肪細胞に分化させたマウス由来の3T3-L1細胞株を用いたグルコース吸収能(glucose uptake、または脂質合成能)試験を行った。3T3-L1細胞を10%NBCS(新生仔牛血清)を含むDMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium、Gibco、Cat.No、12430)培地を用いて週2〜3回継代培養して維持した。3T3-L1細胞を分化用培地(10%FBSを含むDMEM)を用いて懸濁した後、48ウェルプレートに1ウェル当り5×104個になるように接種して48時間培養した。脂肪細胞への分化のために分化用培地に1μg/mLのヒトインスリン(Sigma、Cat. No. I9278)、0.5μM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine, Sigma, Cat. No.I5879)、 1 μM Dexamethasone(Sigma, Cat. No. D4902)を混合し、既存の培地を除去した後、1ウェル当り250μlずつ入れた。48時間後、分化用培地に1μg/mLのヒトインスリンのみを添加した培地で再度交換した。その後、48時間ごとに1μg/mLのヒトインスリンを添加した分化用培地に交換しながら12日間脂肪細胞への分化が誘導されることを確認した。グルコース吸収能の試験のために、分化が終わった細胞を無血清DMEM培地で1回水洗した後、250μlずつ入れ、4時間の間血清の枯渇を誘導した。ヒトインスリンは、10μMから0.001 nMまで、単鎖インスリン-免疫グロブリンFc結合体は、20μMから0.002 nMまで無血清DMEM培地で10倍ずつ順次希釈して準備した。準備された試料を細胞にそれぞれ250μlずつ添加した後、24時間、37℃、5%CO2培養器で培養した。培養が終わった培地のグルコース残量を測定するために、200μlの培地を取り、D-PBSでそれぞれ5倍に希釈してGOPOD(GOPOD Assay Kit、Megazyme、Cat. No. K-GLUC)分析を行った。グルコース標準溶液の吸光度を基準に培地の残余グルコース濃度を換算し、グルコース吸収能に対するEC50をそれぞれ算出した。
単鎖インスリンアナログ結合体のin vitro効力を測定するためには、脂肪細胞に分化させたマウス由来の3T3-L1細胞株を用いたグルコース吸収能(glucose uptake、または脂質合成能)試験を行った。3T3-L1細胞を10%NBCS(新生仔牛血清)を含むDMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium、Gibco、Cat.No、12430)培地を用いて週2〜3回継代培養して維持した。3T3-L1細胞を分化用培地(10%FBSを含むDMEM)を用いて懸濁した後、48ウェルプレートに1ウェル当り5×104個になるように接種して48時間培養した。脂肪細胞への分化のために分化用培地に1μg/mLのヒトインスリン(Sigma、Cat. No. I9278)、0.5μM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine, Sigma, Cat. No.I5879)、 1 μM Dexamethasone(Sigma, Cat. No. D4902)を混合し、既存の培地を除去した後、1ウェル当り250μlずつ入れた。48時間後、分化用培地に1μg/mLのヒトインスリンのみを添加した培地で再度交換した。その後、48時間ごとに1μg/mLのヒトインスリンを添加した分化用培地に交換しながら12日間脂肪細胞への分化が誘導されることを確認した。グルコース吸収能の試験のために、分化が終わった細胞を無血清DMEM培地で1回水洗した後、250μlずつ入れ、4時間の間血清の枯渇を誘導した。ヒトインスリンは、10μMから0.001 nMまで、単鎖インスリン-免疫グロブリンFc結合体は、20μMから0.002 nMまで無血清DMEM培地で10倍ずつ順次希釈して準備した。準備された試料を細胞にそれぞれ250μlずつ添加した後、24時間、37℃、5%CO2培養器で培養した。培養が終わった培地のグルコース残量を測定するために、200μlの培地を取り、D-PBSでそれぞれ5倍に希釈してGOPOD(GOPOD Assay Kit、Megazyme、Cat. No. K-GLUC)分析を行った。グルコース標準溶液の吸光度を基準に培地の残余グルコース濃度を換算し、グルコース吸収能に対するEC50をそれぞれ算出した。
その結果、ヒトインスリンと比べて単鎖インスリンアナログ結合体(単鎖インスリンアナログ−PEG−免疫グロブリンFc)は、8.1%のグルコース吸収能が確認された(表5、図4)。
実施例12.単鎖インスリンアナログ結合体の薬物動態学(Pharmacokinetics)の確認
単鎖インスリンアナログ結合体の薬物動態を確認するために、正常のラット(SD rat、雄性、6週齢)で経時による血中濃度の比較試験を行った。単鎖インスリンアナログ結合体を65.1 nmol/kg、そして260.4 nmol/kgをそれぞれ皮下投与した後、0、1、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、及び216時間で採血した。各時間における単鎖インスリンアナログ結合体の血中内の残余濃度は、酵素結合免疫吸着分析法(ELISA、enzyme linked immunosorbent assay)を用いて測定し、使用されたキットは、Insulin ELISA(ALPCO、米国)を使用した。ただし、測定抗体(detection antibody)としてはmouse anti-human IgG4 HRP conjugate(Alpha Diagnostic Intl、Inc., 米国)を使用した。
単鎖インスリンアナログ結合体の薬物動態を確認するために、正常のラット(SD rat、雄性、6週齢)で経時による血中濃度の比較試験を行った。単鎖インスリンアナログ結合体を65.1 nmol/kg、そして260.4 nmol/kgをそれぞれ皮下投与した後、0、1、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、及び216時間で採血した。各時間における単鎖インスリンアナログ結合体の血中内の残余濃度は、酵素結合免疫吸着分析法(ELISA、enzyme linked immunosorbent assay)を用いて測定し、使用されたキットは、Insulin ELISA(ALPCO、米国)を使用した。ただし、測定抗体(detection antibody)としてはmouse anti-human IgG4 HRP conjugate(Alpha Diagnostic Intl、Inc., 米国)を使用した。
単鎖インスリンアナログ結合体の薬物動態を調べた結果、単鎖インスリンアナログ結合体の半減期は31〜32時間であり、これは、現在市販されている持続型インスリンアナログであるインスリングラルギンの報告されたラットにおける半減期(4.3時間)に比べて約7倍以上に増加した結果であることが分かった(図5)。
このような結果は、インスリン受容体結合力が減少するように変形された本発明の単鎖インスリンアナログが免疫グロブリンFc領域と結合された結合体を形成した場合、実際に生体内で血中半減期が大幅に増加して安定したインスリン製剤として提供することができ、糖尿病治療薬として効果的に使用されうることを示唆するものである。併せて、本発明に係る単鎖インスリンアナログ自体もインスリン受容体との結合力の減少及び力価が減少し、多様なキャリアなどと結合しても、やはり同じ効果を示すことを示唆するものである。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。本発明の範囲は、上記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
Claims (30)
- 下記化学式1を有する短鎖単鎖インスリンアナログ結合体:
[化学式1]
X−Y−Z−La−F
式中、
Xは、天然型インスリンA鎖、B鎖またはこれらのアナログであり、
Yは、天然型インスリンC−ペプチドまたはそのアナログであり、
Zは、天然型インスリンB鎖、A鎖またはこれらのアナログであり、
Lは、リンカーであり、
aは、0または自然数であり、ただし、aが2以上であるとき、それぞれのLは互いに独立しており、
Fは、インスリンアナログの生体内半減期を増加させる物質であり、
ただし、X、Y及びZがそれぞれ天然型インスリンのB鎖、C−ペプチド及びA鎖であるか、天然型インスリンのA鎖、C−ペプチド及びB鎖である場合は除外され、
X−Y−Zは、単鎖インスリンアナログを形成する。 - 上記単鎖インスリンアナログは、天然型プロインスリンに比べて少なくとも一つ以上のアミノ酸が置換(Substitution); 追加(Addition); 除去(Deletion); 修飾(Modification); 及びインスリンA鎖、C-ペプチド及びB鎖の配列順の変換の中から選択されるいずれか一つ以上の方法で変異されたアナログ、変異体、またはそれらの断片である、請求項1に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- 上記単鎖インスリンアナログは、X、Y及びZがそれぞれリンカーで連結された、請求項1又は請求項2に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- 上記C−ペプチドのアナログは、天然型インスリンC−ペプチドの1番アミノ酸、2番アミノ酸、34番アミノ酸及び35番アミノ酸からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換または欠失したものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- インスリンアナログの生体内半減期を増加させる物質は、ポリエチレングリコール、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びその断片、アルブミン結合物質、特定のアミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、FcRn結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン(Transferrin)、サッカリド(saccharide)及び高分子重合体からなる群から選択されたものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- Lは、ペプチド、ポリエチレングリコール、脂肪酸、サッカリド、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- X−Y−ZとFは、共有化学結合、非共有化学結合、またはこれらの組み合わせであり、Lにより互いに結合されるものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- 高分子重合体は、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカリド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項6に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- 上記FcRn結合物質は、免疫グロブリンFc領域である、請求項5に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- 免疫グロブリンFc領域が非糖鎖化されることを特徴とする、請求項9に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- 免疫グロブリンFc領域が、CH1、CH2、CH3、及びCH4ドメインからなる群から1個〜4個の選択されたドメインからなる、請求項9又は請求項10に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- 免疫グロブリンFc領域が、IgG、IgA、IgD、IgE、またはIgMに由来のFc領域である、請求項9〜11のいずれか一項に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- 免疫グロブリンFc領域のそれぞれのドメインがIgG、IgA、IgD、IgE、及びIgMからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、請求項12に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- 免疫グロブリンFc領域は、同じ起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体または多量体である、請求項9〜12のいずれか一項に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- 免疫グロブリンFc領域がヒンジ領域をさらに含む、請求項9〜14のいずれか一項に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- 免疫グロブリンFc領域がIgG4 Fc領域である、請求項9に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- 免疫グロブリンFc領域は、ヒト非糖鎖化IgG4 Fc領域である、請求項9に記載の単鎖インスリンアナログ結合体。
- 下記化学式2を有する単鎖インスリンアナログ:
[化学式2]
X−Y−Z
式中、
Xは、天然型インスリンA鎖、B鎖またはこれらのアナログであり、
Yは、天然型インスリンC−ペプチドまたはそのアナログであり、
Zは、天然型インスリンB鎖、A鎖またはこれらのアナログであり、
ただし、X、Y及びZがそれぞれ天然型インスリンのB鎖、C−ペプチド及びA鎖であるか、天然型インスリンのA鎖、C−ペプチド及びB鎖である場合は除く。 - 上記C−ペプチドのアナログは、天然型インスリンC−ペプチドの1番アミノ酸、2番アミノ酸、34番アミノ酸及び35番アミノ酸からなる群から選択された一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換または欠失したものである、請求項18に記載の単鎖インスリンアナログ。
- 請求項1〜17のいずれか一項に記載の単鎖インスリンアナログ結合体;または請求項18又は請求項19に記載の単鎖インスリンアナログを含む、生体内持続性及び安定性が増加した単鎖インスリン持続性製剤。
- 請求項1〜17のいずれか一項に記載の単鎖インスリンアナログ結合体;または請求項18又は請求項19に記載の単鎖インスリンアナログを含む、糖尿病の予防または治療用薬学的組成物。
- 請求項18又は請求項19に記載の単鎖インスリンアナログ及びその生体内半減期を増加させる物質を連結する段階を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の単鎖インスリンアナログ結合体の製造方法。
- 上記単鎖インスリンアナログ及びその生体内半減期を増加させる物質を、リンカーを通じて連結するものである、請求項22に記載の製造方法。
- 上記リンカーは、アルデヒドグループ、マレイミドグループ及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される反応基を有する非ペプチド性リンカーである、請求項23に記載の製造方法。
- 上記スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレラート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、N−ヒドロキシスクシンイミド、またはスクシンイミジルカルボネートである、請求項24に記載の製造方法。
- 上記単鎖インスリンアナログは、下記(a)及び(b)を含む方法で得るものである、請求項22〜25のいずれか一項に記載の製造方法:
(a)タンパク質分解酵素の切断部位を含む5〜20個のアミノ酸で構成されたペプチドが上記単鎖インスリンアナログのアミノ末端に融合した形態で単鎖インスリンアナログを発現する段階;及び
(b)単鎖インスリンアナログに融合したペプチドを除去する段階。 - 請求項18又は請求項19に記載の単鎖インスリンアナログをコードする分離された核酸。
- 請求項27に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
- 請求項28に記載の組換え発現ベクターを含む、形質転換体。
- 下記段階を含む請求項18又は請求項19の単鎖インスリンアナログの製造方法:
a)請求項18又は請求項19に記載の単鎖インスリンアナログをコードする核酸を含む形質転換体を培養して単鎖インスリンアナログを発現させる段階;及び
b)発現された単鎖インスリンアナログを分離及び精製する段階。
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