JP2020532530A - バチルス・コアグランスを含有する汚染防止組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その詳細が参照により本明細書に組み込まれる、2017年8月31日に出願されたインド仮特許出願第201741030867号に基づく優先権を主張する、PCT出願である。
本発明は、プロバイオティクス組成物に関する。より具体的には、本発明は、汚染物質防止および皮膚再生/洗浄剤としての使用のための、プロバイオティクス微生物バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans) MTCC 5856を含む組成物に関係する。
WHOからの近年の報告では、汚染レベルの増大によってほぼ全員が影響を受けており、世界で300万を超える人々がそれが原因で死亡していることが示されている。汚染の主要な発生源としては、微小粒子状物質、多環芳香族炭化水素(PAH)、揮発性有機化合物(VOC)、窒素および硫黄酸化物、一酸化炭素、オゾン、および重金属が挙げられる(Baudouin, C., et al., Environmental pollutants and skin cancer.Cell Biol Toxicol, 2002.18(5): p. 341-8)。有毒ガス(CO2、CO、SO2、NO、NO2)、低分子量炭化水素、残留性有機汚染物質(例えば、ダイオキシン)、重金属(例えば、鉛、水銀)および微小粒子状物質(PM)は、発生源から形成される、一次汚染物質を形成する。オゾン(O3)、NO2、ペルオキシアセチルナイトレート、過酸化水素およびアルデヒドが含まれる二次汚染物質は、一次汚染物質が関与する化学および光化学反応を介して、大気中で形成される(Kampa, M. and E. Castanas, Human health effects of air pollution.Environ Pollut, 2008.151(2): p. 362-7)。
以下の先行技術文献には、様々な疾患の病因であるROS/RNSの役割が詳細に記載されている。
非制御ROSの増大を阻止する細胞防御系は、非酵素的分子(グルタチオン、ビタミンA、C、およびE、ならびに食物中に存在する数種の抗酸化物質)ならびにROSの酵素スカベンジャーを含み、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、カタラーゼ(CAT)およびグルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)は、最もよく知られている機構である。
しかし、プロバイオティクスの生物学的活性が株特異的であるという共通理解に起因して、プロバイオティクス微生物の治療的な目的での使用には、技術的な問題が存在する。生物学的活性における属−種−株特異的差異は、特定の健康への効果に対してプロバイオティクスを関連付け、Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food London, Ontario, Canada, April 30 and May 1, 2002-See Section 3.1に示されているような正確な監視および疫学的試験を可能とするために、評価されることとなる。したがって、良好な汚染防止効果を呈し、皮膚を再生させることのできる優れたプロバイオティクスが、なお保証されている。本発明は、有効な汚染防止剤および良好な抗酸化物質としてのプロバイオティクス微生物バチルス・コアグランス MTCC 5856の開示により、前述の技術的な問題を克服するものである。
バチルス・コアグランス MTCC 5856の抗酸化特性を開示することが、本発明の別の目的である。
本発明は、前述の目的を実現し、さらなる関連する利点を提供する。
本出願中で言及される、受託番号MTCC 5856を有する生物学的材料バチルス・コアグランスの寄託は、2013年9月19日に、Microbial Type Culture Collection & Gene Bank (MTCC)、CSIR−Institute of Microbial Technology、Sector 39−A、Chandigarh−160036、インドで行われている。
本発明の他の特徴および利点は、例示として本発明の原理を説明する添付の図面と合わせ、以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。
なお別の好ましい実施形態では、本発明は、抗酸化物質としての使用のための、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する組成物を開示する。関連する一実施形態では、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する組成物は、哺乳類の細胞の酸化ストレスの治療的な管理において使用される。関連する一実施形態では、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスは、芽胞または生存桿菌の形態で存在する。関連する一実施形態では、バチルス・コアグランス株は、好ましくはバチルス・コアグランス MTCC 5856である。なお別の関連する実施形態では、組成物は、薬学的/薬用化粧品的に許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、バイオアベイラビリティ向上剤、および防腐剤とともに製剤化され、ならびに/または、皮膚ケア成分を含有する製剤中に組み込まれ、機能性食品、薬用化粧品およびニュートリコスメティクスの用途に適した、錠剤、カプセル剤、粉末、エマルション、溶液、クリーム、ゲル、ローション、粉末、血清、油、懸濁液、軟膏、石けん、スクラブ、エマルションおよびコンパクトの形態で、経口または局所投与される。
最も好ましい実施形態を言明する特定の例示的な例は、本明細書の以下に挙げられている。
1.細胞中のROS蓄積を、ROSにより酸化され、蛍光化合物を生成する、前蛍光プローブ(Rosenkranz, A.R., et al., A microplate assay for the detection of oxidative products using 2',7'-dichlorofluorescin-diacetate.J Immunol Methods, 1992.156(1): p. 39-45)を使用して測定した。
2.汚染防止処置の効果は、皮膚の抗酸化能および抗酸化物質が有害物質を中和する能力に反映される。
3.汚染防止処置の効果は、細胞の抗酸化酵素の増大および炎症の低減としても反映される。
バチルス・コアグランス MTCC 5856の汚染防止効果
方法
ROSアッセイ:細胞透過性の非蛍光性色素である2’,7’−ジクロロフルオレセインジアセテート(DCFH−DA)を細胞に進入させ、DCFH−DA上のアセテート基を細胞のエステラーゼにより切断し、非蛍光性DCFHを細胞中に取り込ませた。細胞中で硫酸第一鉄により生成された活性酸素種による、その後の酸化により、485/520 Ex:Em波長で検出することができる蛍光DCFを得る。試料の除去活性は、抗酸化物質を用いない対照と比較した蛍光の低減により示される。
ROSによる酸化
DCFH−DA(非蛍光色素)→DCF(蛍光色素)
60分間の15ジュール/m2のUVA強度、洗浄し、6時間インキュベートした。
30分間の4.6ジュール/m2のUV−B強度、洗浄し、6時間インキュベートした。
多環芳香族炭化水素(ベンゾ[a]ピレン(BaP)を、0.5mMで使用した。
重金属(各々0.25mmの、塩化コバルト(Cobalt chlorie)および硝酸鉛(II))
37℃および5% CO2でのインキュベーションの6時間後、細胞中ROSを決定した。
UV−A
マウス線維芽細胞を、様々な細胞数のバチルス・コアグランス MTCC 5856で1時間前処理し、15ジュール/m2の強度でUVAに30分間曝露させ、活性酸素除去を記録した。結果は、バチルス・コアグランス MTCC 5856が、細胞500個/ウェルの濃度で効果的に、UV−A放射線に対して保護を与えたことを示している(図1aおよび1b)。
UV−B
ヒト角化細胞を、4.5ジュール/m2の強度でUVB照射に10分間曝露させ、活性酸素除去を記録した。細胞500個/ウェルの濃度のバチルス・コアグランス MTCC 5856は、産生されたROSを18%除去することにより最大の保護を与えた(図2aおよび2b)。
マウス線維芽細胞を、異なる細胞数のバチルス・コアグランス MTCC 5856で1時間前処理し、300μMのラウリル硫酸ナトリウム(SLS)に60分間曝露させ、活性酸素除去を記録した。バチルス・コアグランス MTCC 5856は、用量依存様式で、洗剤により誘導されたROSの除去により、汚染防止効果を呈した(図3a)。最大ROS除去(30.6%)は、細胞103個/ウェルの細胞数で観察された(図3b)。
重金属
ヒト角化細胞を、異なる細胞数のバチルス・コアグランス MTCC 5856の存在下で、重金属(各々0.25mmの、塩化コバルトおよび硝酸鉛)に曝露させた。バチルス・コアグランス MTCC 5856は、重金属により誘導されたROSの除去により、汚染防止効果を呈した(図4a)。18%の最大ROS除去は、細胞102個/ウェルの細胞密度で観察された(図4b)。
多環芳香族炭化水素(PAH)は、変異原性および腫瘍原性の環境汚染物群である。PAHは、天然材料の不完全燃焼およびタバコ煙から生成され、環境中に拡散する(Connell, D. W.; Hawker, D. W.; Warne, M. J.; Vowles, P. P.:Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs).In Introduction into Environmental Chemistry (McCombs, K., and Starkweather, A. W., eds), 1997, pp. 205-217, CRC Press LLC, Boca Raton, FL.2.Shaw, G. R.; Connell, D. W.:Prediction and monitoring of the carcinogenicity of polycyclic aromaticcompounds (PACs).Rev. Environ.Contam.Toxic., 1994, 135, 1-62.)。PAH自体は、生物学的に不活性であり、遺伝毒性を呈するために代謝活性化を要する。PAHは、UVA領域の光を吸収し、酸素または他の分子と反応して、反応中間体を生成する(Yu H, Xia Q, Yan J, et al.Photoirradiation of polycyclic aromatic hydrocarbons with UVA light - a pathway leading to the generation of reactive oxygen species, lipid peroxidation, and dna damage.Int J Environ Res Public Health.2006;3:348-354)。したがって、PAHは、光照射により「活性化」し、光誘導性の細胞毒性を引き起こすことがある。したがって、UVA照射によるPAHの光照射は、細胞毒性およびDNA傷害を引き起こす汚染源に相当する。
ヒトHaCaT角化細胞/マウス線維芽細胞を、細胞1×104個/ウェルの密度で、96ウェルプレートに播種した。24時間、細胞を接着させ、単層を形成させた。細胞を、異なる細胞密度のバチルス・コアグランス MTCC 5856で60分間前処理し、0.5mMのベンツピレンa PAHの存在下で、15ジュール/m2の強度でUVAに30分間曝露させ、滅菌緩衝液で洗浄し、新鮮な培養培地(5%のFBS)を、それぞれの濃度のプロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス MTCC 5856とともに加え、続いて、37℃で、CO2インキュベーター中で6時間インキュベートした。ニュートラルレッド(50pg/mL)(3−アミノ−7−ジメチルアミノ−2−メチルフェナジン塩酸塩)を、3時間、細胞に加えた。細胞によるNRの取込みを、細胞を溶解し、分光光度計で540nmでの吸収を読み取ることにより決定した(Guidelines, O., Genetic Toxicology:Bacterial Reverse Mutation Assay # 471.1997)。
バチルス・コアグランス MTCC 5856は、用量依存様式で、UVA照射によるPAHの光照射により誘導された細胞の細胞毒性から角化細胞を保護することにより、汚染防止効果を呈した(図5a)。最大ROS除去(30.6%)は、細胞103個/ウェルの細胞数で観察された(図5b)。
細胞の抗酸化物質に対するバチルス・コアグランス MTCC 5856の効果
方法
細胞の抗酸化物質は、汚染物質により枯渇する。細胞中でこれらの抗酸化酵素を増大させるバチルス・コアグランス MTCC 5856の能力を、インビトロで試験した。細胞グルタチオン(GSH)およびスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)レベルを、ヒト角化細胞において推定した(Peskin AV, Winterbourn CC.Assay of superoxide dismutase activity in a plate assay using WST-1.Free Radic Biol Med.2017;103:188-191.)。
グルタチオン(GSH)の含有量:還元型グルタチオンを、Moron、Depierreの方法に基づき決定した。GSHを、DTNBと反応させ、412nmで最大吸収する黄色の複合体を得ることにより測定する。100μlの検査試料(CELL LYSATE)を10μlの50% TCAと混合し、2000rpmで10分間、遠心分離にかけた。30μlの上清を50μlの0.2M リン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)および200μlの新しく調製した0.6mM DTNBと混合し、黄色形成の強度を412nmで測定した。標準グラフを、異なる濃度(1000〜62.5μM)のGSHを用いて作成した。試料中のGSHの含有量を、標準グラフから計算し、μmol/mgタンパク質として表した。
結果は、バチルス・コアグランス MTCC 5856が、用量依存様式で、グルタチオンの含有量を増大させたことを明らかにしている(図6aおよび6b)。SODの活性は、用量依存様式で、バチルス・コアグランス MTCC 5856で処理した細胞中でも増大し(図7aおよび7b)、バチルス・コアグランス MTCC 5856が、有効な抗酸化物質であるだけでなく、細胞中の抗酸化物質の含有量を増大させることにより皮膚を再生させることも示している。
結論
全体として、バチルス・コアグランス MTCC 5856は、UVおよび他の汚染物質に対し、これらの汚染物質への曝露の結果として産生されたROSを除去することにより保護を与えることにより、汚染防止効果を呈したことが観察された。バチルス・コアグランス MTCC 5856は、有効な抗酸化物質としても作用し、細胞中の抗酸化物質の含有量も増大させる。本発明は、バチルス・コアグランス MTCC 5856は、様々な病原性状況の管理のための抗酸化物質としてだけでなく、汚染物質に対する保護を与え、抗酸化物質の含有量を増大させることにより、有効な皮膚再生および洗浄剤としても使用することができ、皮膚ケア/化粧品産業の用途の可能性を有することができることを報告する。
皮膚ケアのための、バチルス・コアグランスを含有する製剤
バチルス・コアグランス MTCC 5856を含有する組成物は、薬学的/薬用化粧品的に許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、バイオアベイラビリティ向上剤、抗酸化物質および防腐剤とともに製剤化されてもよく、ならびに/または、抗老化成分を含有する製剤中に組み込まれ、クリーム、ゲル、ローション、粉末、血清、油、懸濁液、軟膏、石けん、スクラブ、エマルションおよびコンパクトの形態で局所投与されてもよい。
表1〜4は、バチルス・コアグランス MTCC 5856(LACTOSPOREとして市販されている)を含有する皮膚ケア製剤の例示的な例を提供する。
健康全般のための、バチルス・コアグランスを含有する製剤
表5および6は、抗酸化物質として、かつ細胞の酸化還元平衡を維持するための使用のための、バチルス・コアグランスを含有する製剤の例示的な例を提供する。
Claims (17)
- UV放射線および環境汚染物質の有害な作用に対して哺乳類の皮膚を保護するための、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する組成物。
- プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスが、芽胞または生存桿菌の形態で存在する、請求項1に記載の組成物。
- 環境汚染物質が、限定されないが、微小粒子状物質、多環芳香族炭化水素(PAH)、揮発性有機化合物(VOC)、洗剤、窒素および硫黄酸化物、一酸化炭素、オゾンならびに重金属からなるリストから選択される、請求項1に記載の組成物。
- プロバイオティクス細菌が、抗酸化物質のレベルを増大させ、ROSレベルを低減させることにより、皮膚保護を与える、請求項1に記載の組成物。
- バチルス・コアグランス株が、好ましくはバチルス・コアグランス MTCC 5856である、請求項1に記載の組成物。
- 組成物が、薬学的/薬用化粧品的に許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、バイオアベイラビリティ向上剤、および防腐剤とともに製剤化され、ならびに/または、皮膚ケア成分を含有する製剤中に組み込まれ、クリーム、ゲル、ローション、粉末、血清、油、懸濁液、軟膏、石けん、スクラブ、エマルションおよびコンパクトの形態で局所投与される、請求項1に記載の組成物。
- 環境汚染物質およびUV放射線に曝露した哺乳類の皮膚を洗浄し再生させる方法であって、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する有効用量の組成物を、このような効果を必要とする哺乳類に投与するステップを含む、方法。
- プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスが、芽胞または生存桿菌の形態で存在する、請求項7に記載の方法。
- 環境汚染物質が、限定されないが、微小粒子状物質、多環芳香族炭化水素(PAH)、揮発性有機化合物(VOC)、洗剤、窒素および硫黄酸化物、一酸化炭素、オゾンならびに重金属からなるリストから選択される、請求項7に記載の方法。
- プロバイオティクス細菌が、抗酸化物質のレベルを増大させ、ROSレベルを低減させることにより、皮膚を再生させる、請求項7に記載の方法。
- バチルス・コアグランス株が、好ましくはバチルス・コアグランス MTCC 5856である、請求項7に記載の方法。
- 組成物が、薬学的/薬用化粧品的に許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、バイオアベイラビリティ向上剤、および防腐剤とともに製剤化され、ならびに/または、皮膚ケア成分を含有する製剤中に組み込まれ、クリーム、ゲル、ローション、粉末、血清、油、懸濁液、軟膏、石けん、スクラブ、エマルションおよびコンパクトの形態で局所投与される、請求項7に記載の方法。
- 抗酸化物質としての使用のための、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する組成物。
- プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する組成物が、哺乳類の細胞の酸化ストレスの治療的な管理において使用される、請求項13に記載の組成物。
- プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスが、芽胞または生存桿菌の形態で存在する、請求項13に記載の組成物。
- バチルス・コアグランス株が、好ましくはバチルス・コアグランス MTCC 5856である、請求項13に記載の組成物。
- 薬学的/薬用化粧品的に許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、バイオアベイラビリティ向上剤、および防腐剤とともに製剤化され、ならびに/または、皮膚ケア成分を含有する製剤中に組み込まれ、機能性食品、薬用化粧品およびニュートリコスメティクスの用途に適した、錠剤、カプセル剤、粉末、エマルション、溶液、クリーム、ゲル、ローション、粉末、血清、油、懸濁液、軟膏、石けん、スクラブ、エマルションおよびコンパクトの形態で、経口または局所投与される、請求項13に記載の組成物。
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