JP2020529193A - ドナー特異的セルフリーdnaを用いる移植対象における状態の評価 - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
本願は、2017年6月20日に出願された米国仮出願番号62/522,547、2017年6月20日に出願された米国仮出願番号62/522,556、2017年6月20日に出願された米国仮出願番号62/522,560、2017年8月8日に出願された米国仮出願番号62/542,787、2017年8月8日に出願された米国仮出願番号62/542,790、2017年8月17日に出願された米国仮出願番号62/546,798、2017年8月17日に出願された米国仮出願番号62/546,848、2017年8月17日に出願された米国仮出願番号62/546,872、2017年10月12日に出願された米国仮出願番号62/571,709、2017年10月12日に出願された米国仮出願番号62/571,715、2017年10月24日に出願された米国仮出願番号62/576,641、2018年2月20日に出願された米国仮出願番号62/632,960、および2018年4月5日に出願された米国仮出願番号62/653,261に対する、35U.S.C.§119下における優先権の利益を主張し、これらの各々の全内容は、本明細書において参照として組み込まれる。
本発明は、移植対象からの試料中のドナー特異的核酸の量を評価するための方法および組成物に関する。かかる量は、移植の後の対象の特定の状態、例えば、移植された臓器の状態または疾患に関連するリスク、例えば、心臓同種移植片脈管障害もしくは心停止、細胞性拒絶グレードもしくは細胞性拒絶グレードに関連するリスク、抗体媒介性拒絶もしくは抗体媒介性拒絶に関連するリスク、または細胞の傷害などの移植臓器傷害、もしくは細胞の傷害などの移植臓器傷害に関連するリスクを評価するために用いることができる。本発明は、さらに、前述のものなどの多様な状態の評価のために、多重最適化ミスマッチ増幅(multiplexed optimized mismatch amplification:MOMA)および/または配列決定技術を用いて、ドナー特異的セルフリーデオキシリボ核酸の量を評価するための方法および組成物に関する。
本開示は、少なくとも部分的に、臓器移植の後の対象における特定の状態、例えば、心臓同種移植片脈管障害、心停止、細胞性拒絶、細胞の傷害、および/または抗体媒介性拒絶のリスクを、対象のドナー特異的セルフリーDNAレベルを用いて予測または評価することができるという驚くべき発見に基づく。試料中のドナー特異的セルフリーDNAを定量するための多様な手段のいずれか1つを用いて、心臓同種移植片脈管障害、心停止、細胞性拒絶、抗体媒介性拒絶、移植臓器傷害に関連するリスク、および/またはこれらに関連するリスクを、経時的に、決定すること、ならびにこれらをモニタリングすることができる。
提供される方法のいずれか1つの一態様において、方法は、対象から試料を得ることをさらに含む。
一側面において、本明細書において提供される量の1つ以上を含む、レポートまたはデータベースが提供される。
一側面において、本明細書において提供される方法のいずれか1つは、心臓移植対象などの移植対象を処置する方法であってよい。
ドナー特異的cf−DNA(DS cf−DNA)またはドナー画分(DF)cf−DNAが、特定の状態、例えば、心臓同種移植片脈管障害、心停止、細胞性拒絶、移植臓器傷害(例えば細胞の傷害)、および抗体媒介性拒絶と相関し、これらの各々は、組み合わせて、または別々に、結果として、対象を評価および/またはモニタリングするために用いることができることを見出した。したがって、本開示の側面は、少なくとも部分的に、細胞性拒絶、抗体媒介性拒絶、移植臓器傷害(例えば細胞の傷害)、心臓同種移植片脈管障害および/または心停止、またはこれらに関連するリスクのグレードを評価または決定するために、試料中のDS cf−DNAを定量する方法に関する。
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、状態の悪化または改善について、かかる知見を確認するか、またはかかる対象をモニタリングするために用いることができる。
他のかかる治療は、当業者に公知である。
DS cf−DNAの量はまた、MOMAアッセイにより決定することができる。一態様において、DS cf−DNAを決定するための方法のいずれか1つは、PCT公開番号WO2016/176662A1の方法のいずれか1つであってよく、かかる方法は、その全体において本明細書において参考として援用される。
PCR反応溶液の温度は、変性状態、アニーリング状態、および伸長状態の間で、予め決定されたサイクルの数にわたり、連続的に周回され得る。実際の時間および温度は、酵素、プライマー、および標的に依存的であり得る。任意の所与の反応について、変性状態、ある態様においては、約70℃〜約100℃の範囲であり得る。加えて、アニーリングの温度および時間は、プライマーが標的核酸中の特定の遺伝子座に結合する特異度および効率に影響を及ぼし得、特定のPCR反応について重要であり得る。任意の所与の反応について、アニーリング状態は、ある態様においては、約20℃〜約75℃の範囲であり得る。いくつかの態様において、アニーリング状態は、約46℃〜64°Cであり得る。ある態様において、アニーリング状態は、室温(例えば、約20℃〜約25℃)において行うことができる。
PCRアッセイからのアレルの量の定量は、本明細書において提供されるように行うことができるか、別段に当業者には明らかであろう。一例として、一貫性および強力な定量のために、増幅のトレースを分析する。サイクルの閾値をインプット核酸(例えばDNA)の量に換算するために、内部標準を用いてもよい。アレルの量は、性能(performant)アッセイの平均として計算することができ、遺伝子型について補正することができる。
別の側面において、本明細書において提供されるような1つ以上のプライマーペアを含む組成物およびキットが提供される。PCRアッセイなどのアッセイを行うための他の試薬もまた、組成物またはキット中に含まれていてもよい。
また、本発明の態様は、そのうちの一例が提供されている1つ以上の方法として実行してもよい。方法の一部として行われる行為は、任意の好適な方法において指令することができる。したがって、説明されたものとは異なる順序において行為が行われる態様が構築されてもよく、これは、いくつかの行為を、それが説明的態様においては連続的な行為として示されるものであっても、同時に行うことを含んでもよい。
本明細書において用いられる語法および用語法は、記載を目的とするものであり、限定するものとしてみなされるべきではない。「含むこと(including)」、「含むこと(comprising)」、「有すること(having)」、「含むこと(containing)」、「含むこと(involving)」、およびこれらのバリエーションの使用は、その後に列記される項目およびさらなる項目を包含することを意図される。
例1−レシピエントおよびドナーの遺伝子型情報を用いるMOMAアッセイ
SNV標的選択
本開示に従って多重化するための標的の同定は、以下のステップの1つ以上を含んでもよい。初めに、いくつかの人種対照集団において、高度にヘテロ接合型のSNPをスクリーニングし(ハーディ・ワインベルグp>0.25)、既知の困難な領域を除外した。困難な領域として、患者において異常である可能性が高い症候性の領域、ならびに染色体のセントロメアおよびテロメアを含む低複雑度領域が挙げられる。所望される長さの標的フラグメントを、次いでコンピューターシミュレーションにより設計した。具体的には、各々のSNPの70bpのウィンドウにわたる2つの20〜26bpのプライマーを設計した。全ての候補プライマーを、次いで、BLASTを用いてGCRh3に対して問い合わせた。十分に特異的であることが見出されたプライマーを保持し、オフターゲットヒットについて(特にフラグメントの3’末端において)モニタリングした。オフターゲット候補ヒットを、サイズ選択を通るであろうペアワイズフラグメント作製について分析した。選択されたプライマーを、次いで、コンピューターシミュレーションによる多重化評価に供した。計算されたプライマーの融解温度およびグアニン−シトシンパーセンテージ(GC%)を用いて、中程度の範囲の配列についてフィルタリングした。反復遺伝子アルゴリズムおよびシミュレーションされたアニーリングを用いて、400の標的について適合可能な候補プライマーを選択し、最終的に800のプライマーの選択肢がもたらされた。800のプライマーを作製し、共通の融解温度において共通の溶液中で、多重化能力について物理的に試験した。具体的には、プライマーを、多重スクリーンにおける一様な増幅および中程度の読み取り深度(read depth)ウィンドウに基づいてフィルタリングした。最上の性能の多重化SNPを用いるMOMAのために、48のアッセイを設計した。各々のSNPは、WT/MUTにおいて4つのミスマッチの選択において設計されたプローブを有した;1アッセイあたり8つのプローブが存在した。70bpの濃縮されたフラグメント中に新たなネステッドプライマーを設計した。最後に、既知のヘテロ接合型個体により、プライマーを実験的に増幅し、増幅効率を評価した(TAQMAN(商標)を用いて、8プローブ×48アッセイを3部)。
各々のアッセイされたSNPにおいて既知のレシピエントおよびドナー遺伝子型を用いて、インフォーマティブなアッセイのサブセットを選択した。ドナーが任意の他の遺伝子型であるレシピエントホモ接合型部位を用いることができることに留意する。加えて、ドナー遺伝子型が不明である場合、それは、例えば血漿データの矛盾を用いることにより、推測することができる。遺伝子型はまた、配列決定、SNPマイクロアレイ、または既知の0%(クリーンな(clean)レシピエント)の試料に対するMOMAアッセイの適用を通して、学習することができる。
患者特異的MOMAプローブの偏りを、実験コホートの間で推定した。選択を、反復的に精密化して、最終的なドナーのパーセントのコールを行った。さらに、自動外れ値検出が、患者特異的な異常ゲノム領域を提供した。
再構築実験
既知の混合比により再構築された血漿試料を用いて、アッセイの感度および正確性を評価した。具体的には、1:10、1:20、1:100、1:200および1:1000の比を評価した。
再構築実験の結果を、図2において示す。ホモ接合型レシピエントに対するホモ接合型ドナーが存在する1つの標的は、完全にインフォーマティブである(網掛けされたデータポイント)。ホモ接合型レシピエントに対するヘテロ接合型ドナーが存在する他の標的は、半インフォーマティブである(オープンなデータポイント)。
ドナー遺伝子型情報なしで研究するために、インフォーマティブなアッセイを推測して、血漿試料中のドナー特異的セルフリーDNAの定量を可能にするために、以下の手順を行うことができる。全アッセイを、完全な情報のシナリオにおいて性能について評価した。この手順は、したがって、各々のアッセイにおけるクリーンなAA/AB/BB遺伝子型および各々の定量の不偏挙動を推測した。レシピエントの遺伝子型により、レシピエントにおいてホモ接合型であると知られるアッセイを選択した。任意の混入物が、ドナー核酸に起因し得、アッセイの集合は、非インフォーマティブ、半インフォーマティブおよび完全インフォーマティブなアッセイに対応する3つのアッセイのクラスターによる三峰性分布を作成した。十分な数のレシピエントホモ接合型アッセイにより、ドナーの完全にインフォーマティブなアッセイの存在を推測することができる。
これらの再構築を、翌日再び実行した(Recon3)。
MOMA cf−DNAアッセイの原理および手順
この例示的なアッセイは、移植レシピエントの血液試料中に存在するDS cf−DNAのパーセンテージを決定するために設計される。この態様において、レシピエントの血液試料は、EDTA管中に収集し、遠心分離して、血漿およびバフィーコートを分離する。血漿およびバフィーコートは、2つの別々の15mL円錐管中に等分して凍結することができる。血漿試料は、定量的遺伝子型判定(qGT)のために用いることができ、一方、バフィーコートは、基本的なレシピエントの遺伝子型判定(bGT)のために用いることができる。移植レシピエントの血液試料に加えて、ドナーからの廃棄された組織または血液試料の小片を、基本的な遺伝子型判定のために用いることができる。
いくつかの態様において、上記の診断技術は、対象について試料を(例えば経時的に)分析し、試料中の核酸(セルフリーDNAなど)を測定し、試料中の核酸(セルフリーDNAなど)を測定し、および試料のうちの1つ以上に基づいて結果(診断結果など)をもたらすために、1つ以上のソフトウェア設備を実行する1つ以上のコンピューター処理デバイスを介して、実装することができる。図6は、いくつかの態様が作動することができるコンピューターシステムの例を説明するが、態様は、図6において説明される型の系により作動することに限定されないことが、理解されるべきである。
MOMAアッセイを用いて、移植レシピエントのドナー特異的cf−DNAを定量し、かかるアッセイについての例示的なステップは、本明細書において提供される。図67および68は、既知の遺伝子型によるMOMA(図67)および不明なドナー遺伝子型によるMOMA(図68)についてのデータ分布を示す。例示的な図7〜31および57〜66において示されるとおり、細胞性拒絶のグレードおよび/またはそれに付随するリスクを予測することができるように、閾値(「カットポイント」)値を、実験により決定した。また、いくつかの結果を、表にして、以下の表1〜24において示す。
表1.既知のドナー遺伝子型を用いる方法および不明なドナー遺伝子型を用いる方法を用いた統計学的試験
(「健常ではない」試料を含む)
CR1/2/3群において、用いた試料は、第1の拒絶からのものであった;CR0群において、それは、採取された第1の試料であった。
(「健常ではない」試料を含む)
CR1/2/3群において、用いた試料は、第1の拒絶からのものであった;CR0群において、それは、採取された第1の試料であった。
拒絶間でのWB+血漿:
CR0対CR2:p=0.04(CR2がCR0より高い);CR1対CR2:p=0.01(CR2がCR1より高い);CR0対CR1:p=0.39;
拒絶間での全血:
CR0対CR2:p=0.16;CR1対CR2:p=0.04(CR2がCR1より高い);CR0対CR1 p=0.11
拒絶間での血漿:CR0対CR1:p<0.0001(CR1がCR0より高い)
拒絶間でのWB+血漿:
CR0対CR2:p=0.05;CR1対CR2:p=0.08;
CR0対CR1:p=0.83;
拒絶間での全血:
CR0対CR2:p=0.20;CR1対CR2:p=0.14(CR2がCR1より高い);CR0対CR1:p=0.62
拒絶間での血漿:CR0対CR1:p<0.0001(CR1がCR0より高い)
目的
心臓移植レシピエントのサーベイランスのための現在の至適基準は、心内膜心筋生検(EMB)であり、これは、小児を一定の傷害のリスクに曝し、妥当なスクリーニングの頻度を限定し、雑駁なプロセスとして拒絶が起こることから感度が本質的に限定される。侵襲性サーベイランス生検の必要性に取って代わるために、循環中のドナー特異的セルフリーDNA(DS cfDNA)の正確な定量に基づく、小児および成人の心臓移植レシピエントのための非侵襲性の診断スクリーニングツールを開発した。
ウィスコンシン州小児病院(Children’s Hospital of Wisconsin:CHW)において追跡された全ての心臓移植レシピエントを、この盲検研究において参加するように招待した。3〜10ミリリットル(ml)の抗凝固剤処置された血液を採取して、以下の臨床シナリオにおいてcf−DNAの循環レベルを評価した:移植後の第1、4、7および28日、任意のEMBの前24時間以内、拒絶のための処置の開始後の第1、4、7および28日。試料は、すぐにコード化し、匿名化し、MyTAI(心臓)検査(TAI diagnostics, Milwaukee, WI)を用いる処理のために研究室に送達された。臨床、研究室、心臓生検、脈管障害、カテーテル処置、および心エコーデータを、全て、試料採取の時点で記録した。全生検レポートのうちの病理学レポートを見直し、2004 International Society for Heart and Lung Transplantation(ISHLT)グレードを記録した。感染のための処置、拒絶のための処置、心停止、心臓再移植、機械的循環サポートの開始、および死亡を含む全ての重要なイベントの日付および時間を記録した。ターゲティングされたアプローチを用いてドナー特異的(ds)セルフリーDNA(cf−DNA)を定量し、ドナー遺伝子型を用いる(方法1)、およびドナー遺伝子型を用いない(方法2)2つの別々の方法を用いて、関連する生検および脈管障害の結果と比較した。
成人および小児の両方の87人のユニークな移植レシピエント対象からの合計で158の試料が、QC基準を通り、分析のために利用可能であった。1個体は、最初の移植の後および再移植の後の両方の研究に参加し、2つのユニークなドナー/レシピエントが一致しないDNAを考慮して、2人のユニークな対象として分析した。移植時の患者の平均年齢は、7.9+/−7.5歳(0.03〜24.2歳の範囲)であった。採血時の平均年齢は、12.7+/−8.1歳(0.08〜30.2歳の範囲)であった。59.6%(51/87)の対象は男性であり、65.5%(57/87)は白人であった。移植から採血までの平均時間は、4.8+/−4.2年であった。134の生検はグレードCR0であり、21の生検はグレードCR1であり、3つの生検は、グレードCR2であった。平均のドナー特異的cf−DNA画分は、グレードCR0生検に関連する試料においては0.11%(IQR:0.06〜0.21%)、グレードCR1に関連する試料においては0.37%(IQR:0.15〜0.72%)、グレードCR2に関連する試料においては0.97%(IQR:0.88〜1.06%)であった(p=0.027)。関連するROC曲線に基づいてグレードCR2の拒絶を除外するための経験的最適カットポイントは、0.87%[95%CI:0.78〜0.97%(p=0.009)]であった。曲線下面積は、0.97であった。感度は100%であり、特異度は93%であった。
ドナー特異的cf−DNAの定量のためのターゲティングされたハイスループットアッセイが、心臓移植レシピエントにおける急性細胞性拒絶サーベイランスについて、優れた感度を有することを見出した。驚くべきことに、CR0、CR1およびCR2に関連する生検の間で、ドナー特異的cf−DNAの段階的増加が観察され、このことは、拒絶グレードの増大に伴う漸進的な同種移植片傷害を示唆している。
MOMAを用いて移植レシピエント(n=273)のドナー特異的cf−DNAを定量した。図39において示されるとおり、心臓同種移植片脈管障害(移植片脈管障害)についての閾値(「カットポイント」)値を、2つの異なる方法を用いて、既知のドナー遺伝子型により(方法1)、および不明なドナー遺伝子型により(方法2)、実験により決定した。加えて、全セルフリーDNAを試験し、閾値を実験により決定した。さらに、以下の表25は、さらなる統計学を示す。
表25.移植片脈管障害の統計学
同様に、MOMAを用いて移植レシピエント(n=71〜77)のドナー特異的cf−DNAを定量した。図40において示されるとおり、心停止についての閾値(「カットポイント」)値を、2つの異なる方法を用いて実験により決定した。さらに、以下の表26は、さらなる統計学を示す。
表26.心停止の統計学
表27.心停止の統計学−不明なドナー遺伝子型を用いるMOMA
表28.心停止の統計学−不明なドナー遺伝子型による、かつ上界なしのMOMA
目的
心臓移植レシピエントのサーベイランスのための現在の至適基準は、心内膜心筋生検(EMB)であり、これは、小児を、一定の傷害のリスクに曝し、妥当なスクリーニングの頻度を限定し、雑駁なプロセスとして拒絶が起こることから感度が本質的に限定される。侵襲性サーベイランス生検の必要性に取って代わるために、循環中のドナー特異的セルフリーDNA(DS cfDNA)の正確な定量に基づく、小児および成人の心臓移植レシピエントのための非侵襲性の診断スクリーニングツールを開発した。
ウィスコンシン州小児病院(Children’s Hospital of Wisconsin:CHW)において追跡された全ての心臓移植レシピエントを、この盲検研究において参加するように招待した。3〜10ミリリットル(ml)の抗凝固剤処置された血液を採取して、以下の臨床シナリオにおいてcf−DNAの循環レベルを評価した:移植後の第1、4、7および28日、任意のEMBの前24時間以内、拒絶のための処置の開始後の第1、4、7および28日。試料は、すぐにコード化し、匿名化し、MyTAI(心臓)検査(TAI diagnostics, Milwaukee, WI)を用いる処理のために研究室に送達された。臨床、研究室、心臓生検、脈管障害、カテーテル処置、および心エコーデータを、全て、試料採取の時点で記録した。全生検レポートのうちの病理学レポートを見直し、2004 International Society for Heart and Lung Transplantation(ISHLT)グレードを記録した。感染のための処置、拒絶のための処置、心停止、心臓再移植、機械的循環サポートの開始、および死亡を含む全ての重要なイベントの日付および時間を記録した。ターゲティングされたアプローチを用いてドナー特異的(ds)セルフリーDNA(cf−DNA)を定量し、ドナー遺伝子型を用いる(方法1)、およびドナー遺伝子型を用いない(方法2)2つの別々の方法を用いて、関連する生検および脈管障害の結果と比較した。
心臓同種移植片脈管障害
QC基準を通った成人および小児の両方の87人のユニークな移植レシピエント対象からの合計で158の試料が、分析のために利用可能であった。1個体は、最初の移植の後および再移植の後の両方の研究に参加し、2つのユニークなドナー/レシピエントが一致しないDNAを考慮して、2人のユニークな対象として分析した。移植時の患者の平均年齢は、7.9+/−7.5歳(0.03〜24.2歳の範囲)であった。採血時の平均年齢は、12.7+/−8.1歳(0.08〜30.2歳の範囲)であった。59.6%(51/87)の対象は男性であり、65.5%(57/87)は白人であった。移植から採血までの平均時間は、4.8+/−4.2年であった。
ドナー遺伝子型なしでは、平均ドナー画分は、CAVと関連しない試料については0.27%(IQR 0.16〜0.54%)、CAVに関連する試料については0.55%(IQR 0.38〜1.22%)であった(p=0.057)。CAVを除外するための経験的最適カットポイントは、0.37%であった[95%CI:0.24〜0.57%(p<0.001)]。
表29.ドナー画分および冠動脈移植片脈管障害
別の分析において、心内膜心筋生検(EMB)の前の88の対象からの血液試料を得た。ドナー画分(DF)を、循環中の全レシピエントcfDNAのうちのパーセンテージとして報告した。採血時の平均年齢は、12.7±8.1歳であった(0.1〜30.2歳の範囲)。基本的な心臓診断は、42.0%において心筋症、56.8%において先天性心疾患であった。対象のうちの合計59.0%は、男性であり、69.3%(88中61)はコーカサス人種であった。158の生検関連試料(そのうち148は、無症候性のサーベイランス生検であった)のうち、134は、細胞性拒絶グレード0(CR0)に、21は細胞性拒絶グレード1(CR1)、3は細胞性拒絶グレード2(CR2)に、0は、細胞性拒絶グレード3(CR3)に関連していた。
特定されたDFカットポイントにおける急性細胞性拒絶および心臓同種移植片脈管障害の関連を分析した(表30)。全140の試料を、方法1(既知のドナー遺伝子型によるもの)により、0.2%のDFカットポイントにおいて分析し、CR0をCR1およびCR2と比較した(p=0.0022)。全158の試料を、方法2(不明なドナー遺伝子型によるもの)により、0.2%のDFカットポイントにおいて分析し、CR0を、CR1およびCR2と比較した(p=0.0141)。0.2%のDFカットポイントにおいて脈管障害に関連する102の試料を、方法1(既知のドナー遺伝子型によるもの)を用いて分析した;7つの試料は、CAVについて真に陽性であり、1つの試料は、偽陰性であり、70は真に陰性であり、24は偽陽性であった(p<0.001)。方法2(不明なドナー遺伝子型によるもの)を用いて、116の試料を、0.2%のDFカットポイントにおいて分析した、11の試料は、CAVについて真に陽性であり、0は偽陰性であり、38は真に陰性であり、67は偽陽性であった(p=0.015)。
ドナー特異的cf−DNAの定量のためのターゲティングされたハイスループットアッセイの使用は、心臓移植レシピエントにおけるサーベイランスのために、および心臓移植レシピエントにおける急性細胞性拒絶の存在を除外するために、精巧な感度を有することを見出した。DFは、CR0に関連する生検からCR1〜CR2に関連する生検へと増大し、このことは、ドナーの臓器に対する進行性の傷害を検出するその能力を示唆している。加えて、ドナー特異的画分の著しい増加は、冠動脈移植片脈管障害の形態における急性特発性拒絶および慢性拒絶を含む顕著な同種移植片傷害に相関する。これらの知見は、診療においてDFの正確な定量が可能であること、および両方のアッセイ方法の間での結果において観察される類似(既知のドナー遺伝子型によるもの、または不明なドナー遺伝子型によるもの)は、遺伝子型判定のために利用可能でない場合においてすら、定量における正確性が保存されることを示すことを示唆する。
MOMAを用いて、移植レシピエント(n=142)のドナー特異的cf−DNAを定量した。図32において示されるとおり、抗体媒介性拒絶グレード0ならびにグレード1および2についての閾値(「カットポイント」)値を、実験により決定した。
閾値(カットポイント)の決定のさらなる例を、図33〜38において示す。図33および36は、214の試料を用いた、既知のドナー遺伝子型(図33)および不明なドナー遺伝子型(図36)による、閾値の決定を示す。機械的サポートを用いる集団を除外して、同じ試料を分析し、結果を、図34および37において示す。各々の対象からの最後の試料(n=79)のみを検査することにより、ドナー遺伝子型が既知の場合は0.25(図35)、ドナー遺伝子型が不明の場合、0.16(図38)のカットポイントを得た。
表31.ドナー画分および抗体媒介性拒絶
21人の無症候性の患者から、対にした血液試料を採血したプレおよびポストサーベイランス生検(bx)。myTAI-HEART(商標)検査(TAI Diagnostics(Wauwatosa, WI)製の定量的遺伝子型判定アッセイの商標)を用いて定量的DF cfDNAを決定した。既知の移植片脈管障害、がん、機械的循環サポート、またはグレード>1を有する任意の細胞性拒絶を有する患者を除外して、17の試料のペアが利用可能であった。生検鉗子サイズおよび採取されたbx試料の数を記録し、分析した。
Claims (89)
- 移植対象からの試料を評価する方法であって、
(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)の量を決定すること、ここで、対象は、細胞性拒絶グレード(例えばCR1、CR2もしくはそれより低い、CR1以上、またはCR2もしくはそれより高い)を有するか、またはこれを有することが疑われる;ならびに
(b)DS cf−DNAの量を報告および/または記録すること
を含む、前記方法。 - (c)DS cf−DNAの量を、閾値DS cf−DNAまたは少なくとも1つの前のDS−cf−DNA値と比較すること
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - (d)閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較した、決定されたDS cf−DNAの量に基づいて、対象についての細胞性拒絶グレードを当てはめるか、またはリスクが増大しているものとして当てはめること
をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。 - 移植対象を評価する方法であって、
(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)の量を得ること、ここで、対象は、細胞性拒絶グレード(例えばCR1、CR2もしくはそれより低い、CR1以上、またはCR2もしくはそれより高い)を有するか、またはこれを有することが疑われる;
(b)DS cf−DNAの量を、閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較すること;ならびに
(c)閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較した、決定されたDS cf−DNAの量に基づいて、対象のための処置またはモニタリングのレジメンを決定すること
を含む、前記方法。 - 閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較した、決定されたDS cf−DNAの量に基づいて、細胞性拒絶グレードを対象に当てはめることをさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 対象が、細胞性拒絶グレード(例えばCR0もしくはCR1の、または例えばCR2もしくはCR3)有するか、またはこれを有することが疑われる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が、細胞性拒絶グレード(例えばCR1、CR2もしくはそれより低い、CR1以上、またはCR2もしくはそれより高い)を有することが決定されている、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が、細胞性拒絶グレード(例えばCR0もしくはCR1の、または例えばCR2もしくはCR3)を有することが決定されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 対象における移植拒絶を評価するために前に適用された1つ以上のさらなる検査により、対象が細胞性拒絶グレードを有することが決定されたか、または、対象における移植拒絶を評価するために1つ以上のさらなる検査を行うことをさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 閾値が、0.2である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 閾値が、0.3である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 閾値が、0.8である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- DS cf−DNAの量が、0.14、0.15または0.2未満である場合に、CR0の細胞性拒絶グレードを対象に当てはめる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- DS cf−DNAの量が、0.14、0.15または0.2より高いか、0.14〜0.8、0.15〜0.8または0.2〜0.8である場合に、CR1の細胞性拒絶グレードを対象に当てはめる、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- DS cf−DNAの量が、それぞれ0.8以上である場合に、CR2以上の細胞性拒絶グレードを対象に当てはめる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- DS cf−DNAの量が、0.14〜0.5、0.15〜0.5、0.2〜0.5または0.3〜0.5である場合に、1つ以上のさらなる検査が示される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 移植対象からの試料を評価する方法であって、
(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)の量を決定すること、ここで、対象が、移植された臓器の状態または疾患を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを有するリスクがある;ならびに
(b)DS cf−DNAの量を報告および/または記録すること
を含む、前記方法。 - (c)DS cf−DNAの量を閾値DS cf−DNAの値または少なくとも1つの前のDS cf−DNA値と比較すること
をさらに含む、請求項17に記載の方法。 - 閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較した、決定されたDS cf−DNAの量に基づいて、状態または疾患が示されるか、または対象が増大したリスクを有する、請求項17または18に記載の方法。
- 移植対象を評価する方法であって、
(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)の量を得ること、ここで、対象が、移植された臓器の状態または疾患を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを有するリスクがある;
(b)DS cf−DNAの量を、閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較すること;ならびに
(c)閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較した、決定されたDS cf−DNAの量に基づいて、対象のための処置またはモニタリングのレジメンを決定すること
を含む、前記方法。 - 閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較した、決定されたDS cf−DNAの量に基づいて、状態または疾患が示されるか、または対象が増大したリスクを有する、請求項20に記載の方法。
- 対象が、心臓同種移植片脈管障害を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを有するリスクがある、請求項17〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が、心停止を既に有しているか、これを有するリスクがある、請求項17〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が、心臓同種移植片脈管障害を有することが決定されているか、または心停止を既に有している、請求項17〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 対象を評価するために前に適用された1つ以上のさらなる検査により、対象が心臓同種移植片脈管障害を有することが決定されたか、または、対象を評価するために1つ以上のさらなる検査を行うことをさらに含む、請求項17〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 閾値が、0.2または0.3である、請求項17〜25のいずれか一項に記載の方法。
- DS cf−DNAの量が0.2または0.3と等しいかまたはこれより高い場合、心臓移植片脈管障害または心停止のリスクが示される、請求項17〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 移植対象からの試料を評価する方法であって、
(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)の量を決定すること、ここで、対象は、抗体媒介性拒絶を有するか、またはこれを有することが疑われる;ならびに
(b)DS cf−DNAの量を報告および/または記録すること
を含む、前記方法。 - (c)DS cf−DNAの量を閾値DS cf−DNAの値または少なくとも1つの前のDS cf−DNA値と比較すること
をさらに含む、請求項28に記載の方法。 - (d)閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較した、決定されたDS cf−DNAの量に基づいて、対象を、抗体媒介性拒絶を有する、またはリスクが増大しているものとして分類すること
をさらに含む、請求項28または29に記載の方法。 - 移植対象を評価する方法であって、
(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)の量を得ること、ここで、対象は、抗体媒介性拒絶を有するか、またはこれを有することが疑われる;
(b)DS cf−DNAの量を、閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較すること;ならびに
(c)閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較した、決定されたDS cf−DNAの量に基づいて、対象のための処置またはモニタリングのレジメンを決定すること
を含む、前記方法。 - 閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較した、決定されたDS cf−DNAの量に基づいて、対象を、抗体媒介性拒絶を有するか、またはリスクが増大しているものとして分類することをさらに含む、請求項31に記載の方法。
- 対象が、抗体媒介性拒絶を有することが決定されている、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 対象における移植拒絶を評価するために前に適用された1つ以上のさらなる検査により、対象が抗体媒介性拒絶を有することが決定されたか、対象を評価するために1つ以上のさらなる検査を行うことをさらに含む、請求項28〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 閾値が、0.2である、請求項28〜34のいずれか一項に記載の方法。
- DS cf−DNAの量が0.2よりも高い場合に、対象が抗体媒介性拒絶を有する、請求項28〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 移植対象からの試料を評価する方法であって、
(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)の量を決定すること、ここで、対象は、移植臓器傷害を有するか、またはこれを有することが疑われる、ならびに
(b)DS cf−DNAの量を報告および/または記録すること
を含む、前記方法。 - (c)DS cf−DNAの量を閾値DS cf−DNAの値または少なくとも1つの前のDS cf−DNA値と比較すること
をさらに含む、請求項37に記載の方法。 - (d)閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較した、決定されたDS cf−DNAの量に基づいて、対象が移植臓器傷害を有するか否かを決定するか、またはリスクが増大しているものとして決定すること
をさらに含む、請求項37または38に記載の方法。 - 対象が24歳未満である、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が16歳未満である、請求項40に記載の方法。
- 対象が体重30kg未満である、請求項37〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が体重20kg未満である、請求項42に記載の方法。
- 移植対象を評価する方法であって、
(a)対象からの試料中のドナー特異的セルフリーDNA(DS cf−DNA)の量を得ること、ここで、対象は、移植臓器傷害を有するか、またはこれを有することが疑われる;
(b)DS cf−DNAの量を、閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較すること;ならびに
(c)閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較した、決定されたDS cf−DNAの量に基づいて、対象のための処置またはモニタリングのレジメンを決定すること
を含む、前記方法。 - 閾値DS cf−DNAの値および/または少なくとも1つの前のDS cf−DNA量と比較した、決定されたDS cf−DNAの量に基づいて、対象が移植臓器傷害を有するか否かを決定するか、またはリスクが増大しているものとして決定することをさらに含む、請求項44に記載の方法。
- 対象が24歳未満である、請求項44または45に記載の方法。
- 対象が16歳未満である、請求項46に記載の方法。
- 対象が体重30kg未満である、請求項44〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が体重20kg未満である、請求項48に記載の方法。
- 少なくとも1つの量が、移植臓器に対する傷害の1、5、10または15分後に対象から採取された試料において決定される、請求項37〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上のさらなる検査が、生検を含む、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 生検が、心内膜心筋生検(EMB)である、請求項51に記載の方法。
- 量が、レポートにおいて提供される、請求項1〜52のいずれか一項に記載の方法。
- レポートにおいて量が提供され、レポートがまた、対象からの試料中のものであったDS−cfDNAの少なくとも1つの前の量を含む、請求項53に記載の方法。
- 量が、データベースにおいて記録される、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。
- データベースがまた、対象からの試料中のものであったDS cf−DNAの少なくとも1つの前の量を含む、請求項55に記載の方法。
- DS cf−DNAの量が、
(a)複数の単一ヌクレオチドバリアント(SNV)標的に対して、試料またはその一部に対して、少なくとも2組のプライマーペアにより、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)定量アッセイなどの増幅ベースの定量アッセイを行うこと、ここで、各々のプライマーペアは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、少なくとも2組のプライマーペアの一方は、SNV標的の一方のアレルと比較して、プライマー中に3’の最後から2番目にミスマッチを含むが、SNV標的の他方のアレルと比較して3’の二重のミスマッチは含まず、SNV標的の一方のアレルを特異的に増幅し、少なくとも2組のプライマーペアの他方は、SNV標的の他方のアレルを特異的に増幅する、ならびに
(b)結果に基づいてDS cf−DNAの量を評価すること
により決定されるかまたは得られる、請求項1〜56のいずれか一項に記載の方法。 - ドナーの遺伝子型が既知である、請求項57に記載の方法。
- ドナーの遺伝子型が不明である、請求項57に記載の方法。
- DS cf−DNAの量が、
(a)複数の遺伝子座の各々のアレルを決定すること;
(b)アレルの決定に基づいて、複数の遺伝子座から少なくとも1つのインフォーマティブな遺伝子座を選択すること;
(c)複数の遺伝子座、対象の第1の核酸および対象にとってネイティブではない第2の核酸を含む核酸を同定すること;
(d)統計学的分布を用いて、少なくとも1つのインフォーマティブな遺伝子座における第1のアレルの推定アレル頻度を計算すること;ならびに
(e)推定アレル頻度に基づいて、DS cf−DNAの量を決定すること
により決定されるかまたは得られる、請求項1〜56のいずれか一項に記載の方法。 - ドナーの遺伝子型が既知である、請求項60に記載の方法。
- ドナーの遺伝子型が不明である、請求項60に記載の方法。
- 少なくとも1つの量が、臓器移植の4、5、6、7または8日後に対象から採取される試料において決定される、請求項1〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 閾値より高いか、および/またはより早い時点からの量と比較して増大したDS cf−DNAの量が、増大したかまたは増大中のリスクを表す、請求項1〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 閾値より低いか、および/またはより早い時点からの量と比較して低下したDS cf−DNAの量が、低下したかまたは低下中のリスクを表す、請求項1〜64のいずれか一項に記載の方法。
- モニタリングレジメンを決定することが、対象において経時的にもしくはその後の時点においてDS cf−DNAの量を決定すること、またはかかるモニタリングを対象に提案することを含む、請求項1〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 対象が、毎日または1週間ごとに評価される、請求項66に記載の方法。
- 対象が、1ヵ月ごとまたは2ヵ月ごとに評価される、請求項66に記載の方法。
- 対象が、6ヵ月まで、8ヵ月まで、10ヵ月まで、または1年までにわたり評価される、請求項1〜68のいずれか一項に記載の方法。
- DS cf−DNAの量が、閾値またはより早い時点からの量と比較して高い場合、試料採取の間の時間が短縮される、請求項1〜69のいずれか一項に記載の方法。
- DS cf−DNAのさらなる量が、記録または報告される、請求項1〜70のいずれか一項に記載の方法。
- さらなる量が、レポートにおいて提供される、請求項71に記載の方法。
- さらなる量が、データベースにおいて記録される、請求項71または72に記載の方法。
- モニタリングレジメンを決定することが、対象における移植拒絶を評価するための1つ以上のさらなる検査を用いること、またはこの使用を提案することを含む、請求項1〜73のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上のさらなる検査が、生検を含む、請求項74に記載の方法。
- 生検が、心内膜心筋生検(EMB)である、請求項75に記載の方法。
- DS cf−DNAの量が、本明細書において提供される閾値のいずれか1つと等しいかまたはこれより高い場合、1つ以上のさらなる検査が示される、請求項1〜76のいずれか一項に記載の方法。
- 処置レジメンを決定することが、対象のための処置を選択または示唆することを含む、請求項1〜77のいずれか一項に記載の方法。
- 処置レジメンを決定することが、対象を処置することを含む、請求項1〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 処置が、抗拒絶療法を含む、請求項1〜79のいずれか一項に記載の方法。
- 処置が、心臓同種移植片脈管障害のための処置、例えば再移植、経皮的冠動脈形成術(PCI)、冠動脈バイパス移植術(CABG)、経心筋レーザー血行再建術またはヘパリン誘導型/媒介型体外LDLプラスマフェレーシス(HELP)を含む、請求項1〜80のいずれか一項に記載の方法。
- 心臓同種移植片脈管障害が示される場合、処置が、スタチン、降圧剤または抗サイトメガロウイルス(抗CMV)剤による処置を含む、請求項1〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 降圧剤が、カルシウムチャネル遮断薬である、請求項82に記載の方法。
- 心停止のリスクの増大が示される場合、処置が、経皮的冠動脈形成術(冠動脈形成術)、冠動脈バイパス移植術、または植込み型除細動器(ICD)の付加などの心停止のための処置を含む、請求項1〜83のいずれか一項に記載の方法。
- 心停止のリスクの増大が示される場合、処置が、抗不整脈剤、不随意神経系遮断薬、または血圧の医薬を含む、請求項1〜84のいずれか一項に記載の方法。
- 処置レジメンを決定することが、処置についての情報を対象に提供することを含む、請求項1〜85のいずれか一項に記載の方法。
- 試料が、血液、血漿または血性試料である、請求項1〜86のいずれか一項に記載の方法。
- 血液試料が血漿試料である、請求項87に記載の方法。
- 移植対象が心臓移植対象である、請求項1〜88のいずれか一項に記載の方法。
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