CN111094593A - 使用供体特异性无细胞dna来评估移植对象中的病症 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于评估无细胞DNA(例如来自对象)的供体特异性分数的量的方法和组合物。本文中提供的方法和组合物可用于确定移植对象中病症(例如移植器官损伤(例如，细胞损伤)、细胞排斥等级、抗体介导的排斥、心脏同种异体移植物血管病和/或心脏停搏)的风险。

Description

使用供体特异性无细胞DNA来评估移植对象中的病症

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119要求以下申请的优先权权益：2017年6月20日提交的美国临时申请No.62/522,547，2017年6月20日提交的美国临时申请No.62/522,556，2017年6月20日提交的美国临时申请No.62/522,560，2017年8月8日提交的美国临时申请No.62/542,787，2017年8月8日提交的美国临时申请No.62/542,790，2017年8月17日提交的美国临时申请No.62/546,798，2017年8月17日提交的美国临时申请No.62/546,848，2017年8月17日提交的美国临时申请No.62/546,872，2017年10月12日提交的美国临时申请No.62/571,709，2017年10月12日提交的美国临时申请No.62/571,715，2017年10月24日提交的美国临时申请No.62/576,641，2018年2月20日提交的美国临时申请No.62/632,960，以及2018年4月5日提交的美国临时申请No.62/653,261，其各自的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于评估来自移植对象的样品中供体特异性核酸的量的方法和组合物。这样的量可用于评估在移植之后对象的某些病症，例如与所移植器官的病症或疾病(例如心脏同种异体移植物血管病(cardiac allograft vasculopathy)或心脏停搏(cardiacarrest))相关的风险，细胞排斥等级或与细胞排斥等级相关的风险，抗体介导的排斥或与抗体介导的排斥相关的风险，或者移植器官损伤(例如细胞损伤)或与移植器官损伤(例如细胞损伤)相关的风险。本发明还涉及使用多路复用优化的错配扩增(multiplexedoptimized mismatch amplification，MOMA)和/或测序技术来评估供体特异性无细胞脱氧核糖核酸的量的方法和组合物，以用于评估例如前述的多种病症。

发明概述

本公开内容至少部分基于以下出乎意料的发现：可使用对象的供体特异性无细胞DNA水平来预测或评估器官移植之后对象中的某些病症(例如心脏同种异体移植物血管病、心脏停搏、细胞排斥、细胞损伤和/或抗体介导的排斥)的风险。使用多种方法中的任一种来量化样品中的供体特异性无细胞DNA，可以确定以及随着时间监测与心脏同种异体移植物血管病、心脏停搏、细胞排斥、抗体介导的排斥、移植器官损伤相关的风险和/或其相关风险。

本文中提供了与这样的确定相关的方法、组合物和试剂盒(kit)。所述方法、组合物或试剂盒可分别是本文中提供的方法、组合物或试剂盒中的任一种，包括实施方案和附图的那些中的任一种。

在所提供的任一种方法的一个实施方案中，所述方法还包括从对象获得样品。

在一个实施方案中，本文中提供的方法的任一个实施方案可以是所提供的任一种组合物、试剂盒或报告的实施方案。在一个实施方案中，本文中提供的组合物、试剂盒或报告的任一个实施方案可以是本文中提供的任一种方法的一个实施方案。

在一个方面，提供了包含本文中提供的一个或更多个量的报告或数据库。

在一个方面，提供了用于确定细胞排斥等级(cellular rejection grade)或其风险(例如CR1或更高的细胞排斥等级)的方法。在一些实施方案中，所述方法是本文中提供的任一种方法。在一个方面，提供了用于确定CR0、CR1、CR2或CR3的细胞排斥等级或其风险的方法。在另一个方面，提供了用于评估移植对象的方法，例如确定对象是否患有或有风险患心脏同种异体移植物血管病或心脏停搏。在另一个方面，提供了用于确定抗体介导的排斥或其风险的方法。在另一个实施方案中，提供了用于评估移植器官损伤(例如，细胞损伤)或其风险的方法。在一些实施方案中，所述方法是本文中提供的任一种方法。

在一个方面，提供了本文中提供的任一种方法。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，指示本文中提供的任一种病症或其风险的量是本文中描述的任一个临界点(cutpoint)或其范围。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，获得样品的时间是本文中描述的任一个时间。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，所述对象是本文中描述的任一个对象。

在一个方面，提供了基于供体特异性无细胞DNA的量或本文中提供的任一种分析方法来对对象进行治疗、确定用于对象的治疗方案或向对象提供关于治疗的信息的方法。在任一种这样的方法的一个实施方案中，所述方法包括对对象进行治疗或向对象提供关于治疗的信息的步骤。在任一种治疗方法的一个实施方案中，治疗可以是本文中提供的任一种治疗。在任一种治疗方法的一个实施方案中，治疗用于本文中提供的任一种病症；其实例在本文中提供或者是本领域普通技术人员已知的。

在一个方面，本文中提供的任一种方法可以是治疗移植对象(例如心脏移植对象)的方法。

附图简述

附图并非旨在按比例绘制。所述附图仅是举例说明性的，并且不是使得能够实现本公开内容所需要的。

图1提供了MOMA引物的示例性的非限制性图。在聚合酶链式反应(PCR)测定中，预期发生包含SNV A的序列的延伸，导致检出SNV A，其可随后被量化。然而，由于双错配而预期不发生SNV B的延伸。

图2示出了重建实验的结果。

图3展示了使用最大期望值法(expectation-maximization)来预测供体基因型。虚线＝第一次迭代(iteration)，实线＝第二次迭代，最终调用(final call)＝10％。

图4展示了使用最大期望值法来预测供体基因型。最终调用＝5％。示出了重建实验的结果。

图5提供了重建实验的数据，其展示了预测供体基因型的能力。已用一组95种SNV靶标生成数据。

图6示出了可用其操作一些实施方案的计算机系统的一个实例。

图7包括示出了不同方法确定细胞2级(或更高)排斥临界点的阈值(临界点)的灵敏度和特异性的图。示出了使用来自移植患者的供体特异性无细胞DNA(cf-DNA)的方法1和方法2(上排)。

图8示出了使用供体特异性cf-DNA和两种不同方法对CR0和CR1(上排)以及CR0和CR2(下排)的阈值(“临界点”)的实验确定。

图9示出了使用MOMA(具有供体基因型信息)对CR0阈值的实验确定。

图10示出了使用MOMA(不具有供体基因型信息)对CR0阈值的实验确定。

图11示出了不同MOMA方法(具有和不具有供体基因型信息)的结果比较。

图12示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(具有供体基因型信息)对2级细胞排斥(CR2)的阈值点的实验确定。

图13示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(具有供体基因型信息)对2级细胞排斥(CR2)的阈值点的实验确定。从每位对象获得的最后样品用于分析。

图14示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有供体基因型信息)对2级细胞排斥(CR2)的阈值点的实验确定。

图15示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有供体基因型信息)对2级细胞排斥(CR2)的阈值点的实验确定。从每位对象获得的最后样品用于分析。

图16示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(具有供体基因型信息)对2级细胞排斥(CR2)的阈值点的实验确定。从分析中排除了来自受机械支持(mechanical support)的对象的样品。

图17示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有供体基因型信息)对2级细胞排斥(CR2)的阈值点的实验确定。从分析中排除了来自受机械支持的对象的样品。

图18示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有供体基因型信息)对2级细胞排斥(CR2)的阈值点的实验确定。

图19示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有供体基因型信息)对2级细胞排斥(CR2)的阈值点的实验确定。从分析中排除了来自受机械支持的对象的样品。

图20示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(具有供体基因型信息)对1级细胞排斥(CR1)的阈值点的实验确定。

图21示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(具有供体基因型信息)对1级细胞排斥(CR1)的阈值点的实验确定。排除了来自受机械支持的对象的样品。

图22示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(具有供体基因型信息)对1级细胞排斥(CR1)的阈值点的实验确定。从每位对象获得的最后样品用于分析。

图23示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有供体基因型信息)对1级细胞排斥(CR1)的阈值点的实验确定。

图24示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有供体基因型信息)对1级细胞排斥(CR1)的阈值点的实验确定。排除了来自受机械支持的对象的样品。

图25示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有供体基因型信息)对1级细胞排斥(CR1)的阈值点的实验确定。从每位对象获得的最后样品用于分析

图26示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(具有供体基因型信息)对0级细胞排斥(CR0)的阈值点的实验确定。

图27示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(具有供体基因型信息)对0级细胞排斥(CR0)的阈值点的实验确定。排除了来自受机械支持的对象的样品。

图28示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(具有供体基因型信息)对0级细胞排斥(CR0)的阈值点的实验确定。从每位对象获得的最后样品用于分析。

图29示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有供体基因型信息)对0级细胞排斥(CR0)的阈值点的实验确定。

图30示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有供体基因型信息)对0级细胞排斥(CR0)的阈值点的实验确定。排除了来自受机械支持的对象的样品。

图31示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有供体基因型信息)对0级细胞排斥(CR0)的阈值点的实验确定。从每位对象获得的最后样品用于分析

图32示出了描绘抗体介导的排斥的实验确定的阈值(临界点)的两个图(0级vs.1或2级)。

图33是示出了使用MOMA(供体基因型已知)对抗体介导的排斥的临界点(阈值)的实验确定的图。

图34是示出了使用MOMA(供体基因型已知)且排除来自受机械支持的对象的样品，对抗体介导的排斥的临界点(阈值)的实验确定的图。

图35是示出使用MOMA(供体基因型已知)和来自每位对象的最后样品对抗体介导的排斥的临界点(阈值)的实验确定的图。

图36是示出了使用MOMA(供体基因型未知)对抗体介导的排斥的临界点(阈值)的实验确定的图。

图37是示出了使用MOMA(供体基因型未知)且排除来自受机械支持的对象的样品，对抗体介导的排斥的临界点(阈值)的实验确定的图。

图38是示出使用MOMA(供体基因型未知)和来自每位对象的最后样品对抗体介导的排斥的临界点(阈值)的实验确定的图。

图39示出了使用供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)利用两种不同方法(上排)对心脏同种异体移植物血管病临界点(阈值)的实验确定。

图40示出了使用供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)利用两种不同方法(上排)对心脏停搏临界点(阈值)的实验确定。

图41示出了使用214个样品使用MOMA(具有供体基因型信息)对移植物血管病阈值的实验确定。

图42示出了排除来自受机械支持的对象的样品，使用MOMA(具有供体基因型信息)对移植物血管病阈值的实验确定。

图43示出了使用214个样品使用MOMA(不具有供体基因型信息)对移植物血管病阈值的实验确定。

图44示出了排除来自受机械支持的对象的样品，使用MOMA(不具有供体基因型信息)对移植物血管病阈值的实验确定。

图45示出了使用从每位对象(N＝79)获得的最后样品，使用MOMA(不具有供体基因型信息)对移植物血管病阈值的实验确定。

图46示出了使用MOMA(不具有供体基因型信息)对移植物血管病阈值的实验确定。

图47示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(具有供体基因型)对心脏停搏阈值的实验确定。

图48示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(具有供体基因型)对心脏停搏阈值的实验确定。从分析中排除了来自受机械支持的对象的样品。

图49示出了使用从每位对象获得的最后样品，使用供体特异性cf-DNA和MOMA(具有供体基因型)对心脏停搏阈值的实验确定。

图50示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有已知供体基因型)对心脏停搏阈值的实验确定。

图51示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有已知供体基因型)对心脏停搏阈值的实验确定。从分析中排除了来自受机械支持的对象的样品。

图52示出了使用从每位对象获得的最后样品，使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有已知供体基因型)对心脏停搏阈值的实验确定。

图53示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有已知供体基因型)对心脏停搏阈值的实验确定。

图54示出了使用供体特异性cf-DNA和MOMA(不具有已知供体基因型)对心脏停搏阈值的实验确定。从分析中排除了来自受机械支持的对象的样品。

图55示出了活检前和活检后的供体特异性分数(donor-specific fraction，DF)无细胞DNA(cf-DNA)百分比的升高。

图56示出了活检前和活检后每mL血浆中供体基因组当量(genome equivalent，GE)的升高。

图57示出了在所有样品中使用MOMA(具有已知供体基因型)对CR1/2/3和CR0的实验区分。

图58示出了使用MOMA(具有已知供体基因型)对CR1/2/3和CR0的实验区分。健康样品(具有CR0的那些)是不具有以下的那些：死亡、心脏停搏、MCS、对感染的治疗、AMR 1和2、移植物血管病和癌症。

图59示出了使用每位对象一个样品使用MOMA(具有已知供体基因型)对CR1/2/3和CR0的实验区分。使用CR1/2/3组的第一个排斥作为样品，并且使用来自“健康”组的每个成员的第一个样品。

图60示出了使用血浆样品使用MOMA(具有已知供体基因型)对CR1/2/3和CR0的实验区分。健康样品(具有CR0的那些)是不具有以下的那些：死亡、心脏停搏、MCS、对感染的治疗、AMR1和2、移植物血管病和癌症。

图61示出了使用来自健康对象(不具有以下的那些：死亡、心脏停搏、MCS、对感染的治疗、AMR 1和2、移植物血管病和癌症)的全血样品使用MOMA(具有已知供体基因型)对CR1/2/3和CR0的实验区分。

图62示出了在所有样品中使用MOMA(具有未知供体基因型)对CR1/2/3和CR0的实验区分。

图63示出了使用MOMA(具有未知供体基因型)对CR1/2/3和CR0的实验区分。健康样品(具有CR0的那些)是不具有以下的那些：死亡、心脏停搏、MCS、对感染的治疗、AMR 1和2、移植物血管病和癌症。

图64示出了使用每位对象一个样品使用MOMA(具有未知供体基因型)对CR1/2/3和CR0的实验区分。使用CR1/2/3组的第一个排斥作为样品，并且使用来自“健康”组的每个成员的第一个样品。

图65示出了使用血浆样品使用MOMA(具有未知供体基因型)对CR1/2/3和CR0的实验区分。健康样品(具有CR0的那些)是不具有以下的那些：死亡、心脏停搏、MCS、对感染的治疗、AMR 1和2、移植物血管病和癌症。

图66示出了使用全血样品使用MOMA(具有未知供体基因型)对CR1/2/3和CR0的实验区分。健康样品(具有CR0的那些)是不具有以下的那些：死亡、心脏停搏、MCS、对感染的治疗、AMR 1和2、移植物血管病和癌症。

图67是示出了经历MOMA(具有已知供体基因型)的样品的数据分布的示意图。有1133个样品数据可用于供体分数。

图68是示出了经历MOMA(具有未知供体基因型)的样品的数据分布的示意图。有1204个样品数据可用于供体分数。

图69包括两个图，示出了用接受者操作特征(receiver-operatingcharacteristic，ROC)曲线通过方法1(具有已知供体基因型；左图)和方法2(具有未知供体基因型；右图)将DF cfDNA与细胞排斥(CR)等级(CR0 vs.CR1或CR2)相关联。

发明详述

已发现供体特异性cf-DNA(DS cf-DNA)或供体分数(DF)cf-DNA与某些病症相关，例如心脏同种异体移植物血管病、心脏停搏、细胞排斥、移植器官损伤(例如，细胞损伤)和抗体介导的排斥，因此其各自可组合或分别用于评估和/或监测对象。因此，本公开的一些方面至少部分涉及量化样品中的DS cf-DNA以评估或确定细胞排斥的等级、抗体介导的排斥、移植器官损伤(例如，细胞损伤)、心脏同种异体移植物血管病和/或心脏停搏或与其相关的风险的方法。

本文中使用的“供体特异性核酸”是指可在移植接受者中发现的来自移植供体的核酸。这样的核酸优选是无细胞DNA。“无细胞DNA”(或cf-DNA)是存在于细胞外部(例如，在对象的血液、血浆、血清、尿等中)的DNA。如本文中所用，本文中提供的组合物和方法可用于确定可在移植接受者中发现的对供体来说特异性的无细胞DNA或供体特异性无细胞DNA(DScf-DNA)的量。本文中使用的“移植”是指将器官或组织从供体移动至接受者，目的是替换接受者的受损的或缺乏的器官或组织。本文中提供的任一种方法或组合物可用于来自已经历器官或组织移植的对象的样品。在一些实施方案中，移植是心脏移植。

对象可以是任何年龄；然而，在一些实施方案中，对象小于24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1岁。在另一个实施方案中，对象为24岁或更年长，例如26、28、30、32、34、36、38、40、45、50、55、60、65、70、75或80或更年长。对象可以为任何体重；然而，在一些实施方案中，对象小于30kg，例如28、26、24、22、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、或10kg或更少。在一个实施方案中，对象小于16岁。在另一些他实施方案中，对象为30kg或更多，例如31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100kg或更多。在一实施方案中，对象的体重小于20kg。

重要的是，DS cf-DNA的量可用于评估或确定移植排斥的等级，包括甚至低细胞排斥等级。本文中提供的任一种方法都可用于评估具有或被怀疑具有CR2或更低的细胞排斥等级的对象。同样地，本文中提供的任一种方法都可用于评估具有或被怀疑具有CR2或更高的细胞排斥等级的对象。DS cf-DNA的量也可用于评估或确定心脏同种异体移植物血管病和/或心脏停搏或其风险。本文中提供的任一种方法都可用于评估患有、被怀疑患有、已经患有或有风险患心脏同种异体移植物血管病和/或心脏停搏的对象。此外，DS cf-DNA的量可用于评估或确定抗体介导的排斥。本文中提供的任一种方法可用于评估患有或被怀疑患有抗体介导的排斥的对象。DS cf-DNA的量也可用于评估或确定移植器官损伤，例如细胞损伤，例如在活检之后。本文中提供的任一种方法都可用于评估患有或被怀疑患有移植器官损伤的对象。本文中使用的“被怀疑患有”是指这样的对象，临床医生认为存在着该对象患有特定病症，例如特定细胞排斥等级、心脏同种异体移植物血管病、抗体介导的排斥、移植器官损伤(例如，细胞损伤)的可能性。

在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，对象可以是患有本文中提供的任一种等级的细胞排斥或者临床医生认为存在患有本文中提供的任一种等级的排斥的可能性的对象。可基于细胞排斥等级的症状(和/或其缺乏)怀疑这样的对象患有某等级的细胞排斥。然而，在一些实施方案中，对象是已经通过一种或更多种其他测试(例如利用活检)被确定患有某等级的排斥的对象。

在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，对象可以是患有或已经患有心脏同种异体移植物血管病和/或心脏停搏的对象，或者临床医生认为存在患有心脏同种异体移植物血管病和/或心脏停搏的可能性的对象。可基于心脏同种异体移植物血管病和/或心脏停搏的症状(和/或其缺乏)怀疑这样的对象患有或可具有该可能性。然而，在一些实施方案中，前述内容可基于一种或更多种其他测试，例如利用活检。

在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，对象可以是患有抗体介导的排斥或临床医生认为存在患有抗体介导的排斥的可能性的对象。可基于抗体介导的排斥的症状(和/或其缺乏)怀疑这样的对象患有抗体介导的排斥。然而，在一些实施方案中，对象是已经通过一种或更多种其他测试(例如利用活检)被确定患有抗体介导的排斥的对象。

在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，对象可以是患有本文中提供的移植器官损伤的对象，或者是临床医生认为存在患有本文中提供的移植器官损伤的可能性的对象。可基于损伤的症状(和/或其缺乏)怀疑这样的对象患有移植器官损伤。然而，在一些实施方案中，对象是已经通过一种或更多种其他测试(例如利用活检或利用另外的活检)被确定患有移植器官损伤的对象。

在一些实施方案中，本文中提供的方法可用于确认这样的发现或监测这样的对象的病症恶化或改善。

例如根据国际心肺移植协会(International Society for Heart and LungTransplantation，ISHLT)分级方案，可以将细胞排斥按等分数为CR0、CR1、CR2或CR3。下面提供了示例性的分级方案。

ISHLT-2004急性细胞排斥分级方案

来自Stewart et al JHLT，2005

可通过确定或获得一个或更多个DS cf-DNA量来对对象进行评估。DS cf-DNA量可用实验技术(例如本文其他地方提供的那些)确定。本文中使用的“获得”是指可以获取相应信息或材料的任何方法。因此，可通过实验方法来获取相应信息。在一些实施方案中，可使用多种实验或实验室方法来产生、设计相应材料。相应信息或材料也可通过给予或提供信息(例如在报告或材料中)来获得。在一些实施方案中，可通过商业手段(即通过购买)来给予或提供材料。

由于能够确定供体特异性核酸(例如DS cf-DNA)的量以及与细胞排斥等级、心脏同种异体移植物血管病、心脏停搏、抗体介导的排斥和移植器官损伤(例如，细胞损伤)的相关性，本文中提供的方法和组合物可用于对本文中提供的对象进行评估。因此，可在这样的对象中确定排斥病症改善或恶化的风险。如本文中提供的“风险”是指对象中任何不希望的病症的存在或不存在或进展，或者这样的病症的存在或不存在或进展的升高的可能性。本文中提供的“升高的风险”是指对象中任何不希望的病症的存在或进展，或者这样的病症的存在或进展的升高的可能性。本文中提供的“降低的风险”是指在对象中不存在任何不希望的病症或进展，或者这样的病症的存在或进展的降低的可能性(或者不存在或无进展的升高的可能性)。

如本文所提供的，诸如细胞排斥、心脏同种异体移植物血管病、心脏停搏、抗体介导的排斥和/或移植器官损伤(例如，细胞排斥)的病症的早期检测或监测可有助于治疗并改善临床结局。如上所述，可以对本文中提供的对象进行所提供的任一种方法。这样的方法可用于在治疗或不治疗的情况下随着时间监测对象。此外，这样的方法可有助于选择、施用和/或监测治疗或疗法。因此，本文中提供的方法可用于确定治疗或监测方案。

本文中使用的“确定治疗方案”是指确定用于正在经历临床上可执行的排斥的对象的行动过程。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，确定治疗方案包括确定合适的治疗或提供关于合适治疗的信息以提供给对象。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，确定包括向对象提供合适的治疗或关于合适治疗的信息。如本文中所使用的，关于治疗或疗法或监测的信息可以以书面形式或电子形式提供。在一些实施方案中，信息可以作为计算机可读指令提供。在一些实施方案中，信息可口头提供。

所述治疗可例如用于治疗细胞排斥，例如抗排斥治疗。抗排斥治疗包括例如免疫抑制剂。免疫抑制剂包括但不限于皮质类固醇(例如，泼尼松龙或氢化可的松)、糖皮质激素、细胞抑制剂、烷化剂(例如，氮芥类(环磷酰胺)、亚硝基脲类、铂化合物、环磷酰胺(Cytoxan))、抗代谢物类(例如叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)、嘌呤类似物(例如硫唑嘌呤和巯嘌呤)、嘧啶类似物和蛋白质合成抑制剂)、细胞毒性抗生素(例如，放线菌素D、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素、光辉霉素(mithramycin))、抗体(例如，抗CD20、抗IL-1、抗IL-2Rα、抗T细胞或抗CD-3单克隆抗体和多克隆抗体，例如Atgam和即复宁(Thymoglobuline)、作用于免疫嗜素(immunophilin)的药物、环孢素、他克莫司、西罗莫司、干扰素、阿片样物质(opiod)、TNF-结合蛋白、霉酚酸酯、芬洛莫德和多里菌素(myriocin)。在一些实施方案中，抗排斥治疗包括血液转移或骨髓移植。治疗还可包括静脉内输液(intravenous fluid)、抗生素、外科引流、早期目标定向治疗(early goal directed therapy，EGDT)、血管加压剂、类固醇、活化蛋白C、屈曲可净α(drotrecogin alfa)(活化的)、氧气和器官功能障碍的适当支持。这可包括肾衰竭的血液透析、肺功能障碍的机械通气、血液制品的输注以及循环衰竭的药物和流体治疗。也可包括确保足够的营养(优选通过肠内营养，但如果有必要，通过肠外营养)，特别是在长期疾病期间。其他相关治疗可包括胰岛素和药物以预防深静脉血栓形成和胃溃疡。其他这样的治疗是本领域普通技术人员已知的。

所述治疗可例如用于治疗抗体介导的排斥。抗体介导的排斥的治疗包括例如免疫抑制剂、血浆去除术(plasmapheresis)/血浆交换(plasma exchange)、静脉内免疫球蛋白、皮质类固醇、抗淋巴细胞抗体和脾切除术。

心脏同种异体移植物血管病的治疗包括例如再移植、经皮冠脉介入术(percutaneous coronary intervention，PCI)、冠状动脉旁路移植术(coronary arterybypass grafting，CABG)、激光心肌血运重建术(transmyocardial laserrevascularization)和/或肝素诱导/介导的体外LDL血浆去除术(heparin-induced/mediated extracorporeal LDL plasmapheresis，HELP)，以及施用他汀类、抗高血压剂和/或抗巨细胞病毒(anti-cytomegalovirus，抗CMV)剂。

当指示心脏停搏时，治疗包括但不限于经皮冠脉介入术(冠脉血管成形术(coronary angioplasty))、冠状动脉旁路移植术或添加植入型心律转复除颤器(implantable cardioverter defibrillator，ICD)。其他治疗包括但不限于抗心律失常剂、不随意神经系统阻断剂(involuntary nervoussystem blocker)或血压药物。此外，可以用冠脉导管插入术(coronary catheterization)对对象进行治疗和/或可以植入心律转复除颤器。

所述治疗可例如用于治疗器官损伤，并且可单独使用或和与移植并发症相关的其他治疗(例如抗排斥治疗)组合使用。抗排斥治疗包括例如免疫抑制剂(如上所述)。

其他这样的治疗是本领域普通技术人员已知的。

可通过本领域中已知的任何方法完成治疗或疗法的施用(参见例如Harrison’sPrinciple of Internal Medicine，McGraw Hill Inc.)。优选地，治疗或疗法的施用以治疗有效量发生。施用可以是局部的或全身性的。施用可以是肠胃外的(例如，静脉内、皮下或皮内)或经口的。用于不同施用途径的组合物是本领域中已知的(参见例如E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences)。

治疗和临床过程可由对象的细胞排斥等级和/或相关预期结局决定。例如，如果DScf-DNA的量等于0.8或更大，则可指示CR2或更高的细胞排斥等级，并且可用抗排斥治疗(例如上文中描述的那些)对对象进行治疗或提供与其相关的信息。作为另一个实例，如果DScf-DNA的量为0.2或0.3或更大，则可指示心脏同种异体移植物血管病和/或心脏停搏，并且可用疗法(例如上文中描述的那些)对对象进行治疗或提供与其相关的信息。在一些实施方案中，如果DS cf-DNA的量为0.2或更大，则可指示抗体介导的排斥，并且可用抗排斥治疗(例如上文中描述的那些)对对象进行治疗或提供与其相关的信息。

本文中使用的“确定监测方案”是指确定随时间监测对象中的病症的行动过程。在本文中提供的任一种方法的一个实施方案中，确定监测方案包括确定适当的行动过程，以用于确定对象中随时间或在随后的时间点DS cf-DNA的量，或者向对象建议这样的监测。这可允许测量临床状态的变化和/或允许计算正常值或基线水平(以及与其比较)。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，确定监测方案包括确定从对象获得样品的时间和/或频率和/或确定或获得DS cf-DNA的量。

在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，可在移植手术之后早至4天检测DS cf-DNA。在另一些实施方案中，可在移植之后5、6、7或8天或更长时间对DS cf-DNA进行量化。为了监测对象的DS cf-DNA水平，可以每月、每两个月或以更频繁的间隔采样，持续长至6个月、长至8个月、长至10个月、长至12个月或更长时间。

在移植器官损伤的情况下，在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，可在损伤之后早至一分钟检测DS cf-DNA水平。在另一些实施方案中，可在损伤之后5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟对DS cf-DNA进行量化。在另一个实施方案中，可在损伤之后1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时对DS cf-DNA进行量化。为了监测对象的DS cf-DNA水平，可以每月、每两个月或更频繁的间隔采样，持续长至6个月、长至8个月、长至10个月、长至12个月或更长时间。

由于已发现升高的DS cf-DNA的水平与升高的风险相关，所以如果发现在两个时间点之间对象的DS cf-DNA升高，则临床医生可确定该对象应进行更频繁的采样。如果发现对象在两个时间点之间的DS cf-DNA水平降低，则临床医生可确定较低频率的采样就足够了。也可通过与一个或更多个阈值的比较来确定监测的时间和/或频率。例如，如果DS cf-DNA的量等于或大于0.1、0.2或0.3(或本文中提供的任一阈值)和/或升高，则可需要更频繁的采样，而如果DS cf-DNA的量小于0.1、0.2或0.3(或本文中提供的任一阈值)和/或没有升高，则可需要较低的采样频率。通常来说，具有更高或升高的DS cf-DN量的对象需要更密切的监测和更频繁的采样。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，可在报告或数据库中记录每个量和时间点。

在一个方面，还提供了具有本文中提供的任一个或更多个值的报告。报告可以是口头、书面(或硬拷贝)或电子形式，例如可被可视化或显示的形式。优选地，报告提供样品中供体特异性核酸的量。在一些实施方案中，该报告提供了随时间来自对象的样品中供体特异性核酸的量。

在一些实施方案中，量在数据库中或进入数据库。在一个方面，提供了具有这样的值的数据库。根据该量，临床医生可评估对对象进行治疗或监测的需要。因此，在本文中提供的任一种方法中，该方法可包括在多于一个时间点评估对象中核酸的量。这样的评估可用本文中提供的任一种方法或组合物进行。

本文中使用的“量”是指用于核酸测量的任何定量值，并且可以以绝对量或相对量给出。此外，量可以是总量、频率、比例、百分比等。本文中使用的术语“水平”可用于代替“量”，但是旨在指相同类型的值。通常来说，除非另外提供，否则本文中提供的量代表样品中的DS cf-DNA相对于总量的比例或百分比。

在一些实施方案中，本文中提供的任一种方法可包括将供体特异性核酸的量与阈值或与一个或更多个先前的量进行比较，以鉴定处于升高或降低的风险的对象。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，与阈值相比或与一个或更多个先前的量相比，供体特异性核酸的量升高的对象被鉴定为处于升高的风险中。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，与阈值相比或与一个或更多个先前的量相比，供体特异性核酸的量降低或类似的对象被鉴定为处于降低的或未升高的风险。

本文中使用的“阈值”或“阈值值”或“临界点”是指指示病症的存在或不存在或者风险的存在或不存在的任何预定水平或水平范围。阈值可采用多种形式。其可以是单个截止值，例如中位值或均值。其可基于比较组来建立，例如在一个确定组中的风险是另一个确定组中的风险的两倍的情况下。其可以是范围，例如在以下情况下：将测试群体平等地(或不平等地)分组，例如低风险组、中等风险组和高风险组；或者分为四个象限，最低象限是风险最低的对象，最高象限是风险最高的对象。阈值可取决于所选的特定群体。例如，表面上健康的群体将具有不同的“正常”范围。作为另一个实例，可由在病症或风险存在之前或者在治疗过程之后的基线值确定阈值。这样的基线可指示对象中与所测试风险或病症不相关的正常或其他状态。在一些实施方案中，阈值可以是所测试对象的基线值。因此，所选择的预定值可将对象所属的类别纳入考虑之中。本领域普通技术人员仅用常规实验即可选择合适的范围和类别。本文中提供的任一种方法的阈值可以是本文中(例如在实施例或附图)中提供的任一阈值。

本文中提供的阈值可用于确定或分配对象的细胞排斥等级。因此，如果测得的DScf-DNA的量小于0.2，则可为对象分配CR0的细胞排斥等级。如果测得的DS cf-DNA的量小于0.15，则可为对象分配CR0的细胞排斥等级。如果量在0.15至0.8之间，则可为对象分配CR1的细胞排斥等级。如果量在0.15但小于0.8之间，则可为对象分配CR1的细胞排斥等级。如果量在0.2至0.8之间，则可为对象分配CR1的细胞排斥等级。如果量在0.2但小于0.8之间，则可为对象分配CR1的细胞排斥等级。如果量在0.25或0.3但小于0.75或0.8之间，则可为对象分配CR1的细胞排斥等级。如果量等于或大于0.8或0.9，则可为对象分配CR2或更高的细胞排斥等级。可基于在本文中提供的任一种比较在有或没有这样的等级的其他指标的情况下进行排斥等级的分配。

本文中提供的阈值还可用于确定对象中的心脏同种异体移植物血管病和/或心脏停搏。因此，如果测得的DS cf-DNA的量等于或大于0.2、0.3、0.4或0.5，则可指示心脏同种异体移植物血管病和/或心脏停搏。可基于在本文中提供的任一种比较在有或没有心脏同种异体移植物血管病和/或心脏停搏的其他指标的情况下进行评估或确定。

本文中提供的阈值还可用于确定对象中抗体介导的排斥或与其相关的风险的存在或不存在。因此，如果测得的DS cf-DNA的量小于0.2，则对象可能没有抗体介导的排斥。如果量等于或大于0.2，则对象可能具有抗体介导的排斥。抗体介导的排斥的存在或不存在的确定可基于在本文中提供的任一种比较在有或没有这样的病症的其他指标的情况下进行。

本文中提供的阈值可用于确定对象是否患有移植器官损伤。因此，如果测得的DScf-DNA的量小于阈值，则对象可能没有移植器官损伤。如果量大于阈值，则对象可能患有移植器官损伤。另外，在一些实施方案中，可通过检查对象中DS cf-DNA的升高倍数(例如相对于基线)来测量损伤。为了进行该分析，第一样品可在损伤之前的时间点采集，并且第二样品可在损伤之后的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分钟或更长时间之内采集。然后可以确定两个样品之间的升高倍数。如果升高倍数超过阈值，则可指示对象患有或有风险患移植器官损伤；如果升高倍数低于阈值，则可指示对象没有移植器官损伤或没有移植器官损伤的风险。

阈值也可用于比较以做出治疗和/或监测决定。例如，如果DS cf-DNA的量等于或大于0.1、0.2或0.3和/或随时间升高，则可指示进一步的监测。作为另一个实例，如果量等于或大于0.8，则可指示对对象的治疗。例如，如果量为0.3-0.5、0.3-0.6或0.3-0.7，则可指示对对象的另外的测试，例如利用活检。如果量等于或大于本文中提供的任一阈值，则可指示对对象的另外的测试，例如利用活检。

因此，本文中提供的任一种方法还可包括用于评估对象的另外的测试，或向对象建议这样的进一步测试(或提供关于这样的进一步测试的信息)的步骤。另外的测试可以是本文中提供的任一种方法。另外的测试可以是本文中提供的或本领域中以其他方式适当已知的任一种其他方法。

用于对象的示例性的另外测试包括但不限于超声心动图、冠脉造影、血管内超声(intravescular ultrasound，IVUS)、活检(例如，心内膜心肌活检)、负荷超声心动图(stress echocardiography)、CT冠脉造影、冠状动脉血流储备评估(coronary flowreserve assessment)(对比增强超声心动图(contrast-enhanced echocardiography))、负荷心肌灌注闪烁显像(stress myocardial perfusion scintigraphy)、正电子发射断层显像(positron emission tomography，PET)扫描、以及血清生物标志物(例如BNP和/或肌钙蛋白)的测量。另外的测试的类型将取决于对象病症的严重性和/或完全在技术人员确定的范围内。

示例性的另外测试包括但不限于供体特异性抗体(HLA抗体)的存在、活检(例如，肾活检、心内膜心肌活检)的阳性C4d染色以及抗体介导的损伤的组织病理学证据(例如，肾小球炎、小管周围毛细血管炎(peritubular capillaries)、动脉炎)。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，其他测试是确定移植接受者中BNP和/或肌钙蛋白的水平。在本文中提供的任一种方法的另一些实施方案中，除BNP和/或肌钙蛋白水平之外或代替BNP和/或肌钙蛋白水平的其他测试是超声心动图。另外的测试的类型将取决于病症、怀疑的病症和/或其严重性和/或完全在技术人员的确定范围内。

DS cf-DNA的量可通过多种方法确定。在一些实施方案中，这样的方法是基于测序的方法。例如，可通过分析样品的DNA以鉴定多个基因座来测量DS cf-DNA，可确定每个基因座的等位基因，并且可基于所确定的等位基因来选择信息性基因座。本文中使用的“基因座”是指核酸中的核苷酸位置，例如染色体或基因中的核苷酸位置。本文中使用的“信息性基因座”是指这样的基因座，其中对象的基因型对于主要等位基因是纯合的，而供体的基因型对于次要等位基因是纯合的或杂合的。本文中使用的“次要等位基因”是指在基因座的核酸群体中频率较低的等位基因。在一些实施方案中，次要等位基因是供体核酸中基因座处的核苷酸身份(nucleotide identity)。另一个方面，“主要等位基因”是指群体中频率较高的等位基因。在一些实施方案中，主要等位基因是对象的核酸中的基因座处的核苷酸身份。

在一些实施方案中，可基于对象的核酸和供体的核酸的先前基因型分型来确定信息性基因座和等位基因。例如，可以比较接受者和供体的基因型，并且可以将信息性基因座鉴定为其中接受者对于核苷酸身份是纯合的并且供体对于不同核苷酸身份是杂合的或纯合的那些基因座。基因型分型的方法是本领域中公知的，并在本文中进一步描述。在该实例中，次要等位基因和主要等位基因可通过确定信息性基因座处每种等位基因的相对量来鉴定，和/或可以鉴定为供体DNA(次要等位基因)和接受者DNA(主要等位基因)中信息性基因座处的核苷酸身份。因此，所提供的方法还可包括对接受者和供体进行基因型分型、或者获得或提供这样的基因型的步骤。

然后可以以合适的方式计算在信息位性基因座处的估计的等位基因频率，例如估计的次要等位基因频率。在一些实施方案中，可基于使用统计分布对信息性基因座处的等位基因(例如次要等位基因)的计数数目进行建模来计算估计的等位基因频率。例如，可通过使用二项式分布对等位基因读取计数进行建模来计算估计的等位基因频率。在一些实施方案中，确定这样的分布的峰并且其指示供体特异性cf-DNA的百分比。信息性基因座处的次要等位基因的频率也可使用最大似然法(maximum likelihood method)来计算。在一些实施方案中，可利用来自对象血浆DNA的基因型来计算次要等位基因频率(minor allelefrequency，MAF)，并且可使用最大期望值法来推断信息性基因座处的供体基因型。在一些实施方案中，可以在估计等位基因频率之前校正主要和/或次要等位基因的读取计数。

可使用任何合适的下一代或高通量测序和/或基因型分型技术来分析DNA。下一代和高通量测序和/或基因型分型技术的实例包括但不限于大规模并行签名测序(massivelyparallel signature sequencing)、聚合酶克隆测序(polony sequencing)、454焦磷酸测序(454pyrosequencing)、Illumina(Solexa)测序、SOLID测序、离子半导体测序(ionsemiconductor sequencing)、DNA纳米球测序(DNA nanoball sequencing)、Heliscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序、

和选定区域的数字分析(DANSR^TM)(参见例如Stein RA(1September 2008).″Next-Generation Sequencing Update″.Genetic Engineering&Biotechnology News 28(15)；Quail，Michael；Smith，Miriam E；Coupland，Paul；Otto，Thomas D；Harris，Simon R；Connor，Thomas R；Bertoni，Anna；Swerdlow，Harold P；Gu，Yong(1January 2012).″A tale of three next generationsequencing platforms：comparison of Ion torrent，pacific biosciences andillumina MiSeq sequencers″.BMC Genomics 13(1)：341；Liu，Lin；Li，Yinhu；Li，Siliang；Hu，Ni；He，Yimin；Pong，Ray；Lin，Danni；Lu，Lihua；Law，Maggie(1January2012).″Comparison of Next-Generation Sequencing Systems″.Journal ofBiomedicine and Biotechnology 2012：1-11；Qualitative and quantitativegenotyping using single base primer extension coupled with matrix-assistedlaser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(

).Methods Mol Biol.2009；578：307-43；Chu T，Bunce K，Hogge WA，Peters DG.A novelapproach toward the challenge of accurately quantifying fetal DNA in maternalplasma.Prenat Diagn 2010；30：1226-9；以及Suzuki N，Kamataki A，Yamaki J，HommaY.Characterization of circulating DNA in healthy human plasma.Clinica chimicaacta；International Journal of Clinical Chemistry2008；387：55-8)。

在一个实施方案中，用于确定DS cf-DNA的任一种方法可以是美国公开No.2015-0086477-A1的任一种方法，并且这样的方法通过引用整体并入本文。

还可通过MOMA测定来确定DS cf-DNA的量。在一个实施方案中，用于确定DS cf-DNA的任一种方法可以是PCT公开No.WO 2016/176662A1的任一种方法，并且这样的方法通过引用整体并入本文。

可使用对象和供体基因型之间的序列身份差异来确定DS cf-DNA。这样的差异可以是单核苷酸变体(single nucleotide variant，SNV)；然而，无论本文中在何处提及SNV，接受者和供体特异性核酸之间的任何序列身份差异均旨在也适用。因此，本文中提供的任一种方法或组合物可应用于序列身份不同的接受者与供体特异性核酸。本文中使用的“单核苷酸变体”是指其中存在序列变异性的核酸序列，在一些实施方案中优选在单个核苷酸处。这些SNV包含对于DS cf-DNA特异性的或可识别DS cf-DNA的任何突变。可以如本文中提供的对任一种或更多种SNV制备引物。

其中存在序列身份变异性的核酸序列通常称为“靶标”。本文中使用的“SNV靶标”是指其中存在序列变异性(例如在单个核苷酸处)的核酸序列。SNV靶标具有多于一种等位基因，并且在一些优选的实施方案中，SNV靶标是双等位基因的。通过利用SNV靶标特异性的引物进行基于扩增的定量测定(例如定量PCR测定)可甚至在极低水平下量化供体特异性核酸。在一些实施方案中，通过尝试用多种SNV靶标的引物进行基于扩增的定量测定(例如定量PCR测定)来确定供体特异性核酸的量。“多种SNV靶标”是指多于一种SNV靶标，其中对于每种靶标存在至少两种等位基因。优选地，在一些实施方案中，预期每种SNV靶标是双等位基因的，并且对SNV靶标的每种等位基因具有特异性的引物对用于特异性地扩增每种等位基因的核酸，其中如果样品中存在特定等位基因的核酸，则发生扩增。如本文中使用的，一种等位基因可以是靶序列的供体特异性形式，而另一种等位基因是该序列的接受者特异性形式。

在本文中提供的任一种方法或组合物的一个实施方案中，基于SNV靶标将是信息性的知识(例如基因型的知识，例如供体的)，可预先选择SNV靶标的一种或更多种引物对。在这样的一些实施方案中，供体的基因型是已知的或可以是确定的。因此，本文中提供的任一种方法可包括对供体进行基因型分型或获得供体基因型的步骤。

在本文中提供的任一种方法的另一些实施方案中，供体的基因型是未知的。在这种情况的一个实施方案中，可用最大期望值法推断供体基因型。例如，使用已知的接受者基因型，可选择已知在接受者中是纯合的靶标。任何污染物都可归因于供体特异性核酸，并且所得的测定收集物将由三峰分布组成：非信息性、半信息性和完全信息性测定。利用足够数量的接受者纯合测定，可推断供体完全信息性测定的存在。

例如，如果接受者基因型是纯合的并且是已知的，则与接受者基因型无关的测量结果(为真正供体纯合的那些)将具有最高的簇(cluster)，并且等于猜测(完全信息性)，相比之下为供体杂合的那些(半信息性)仅为猜测的一半。然后，可绘制概率分布，并且可使用最大期望值法算法(EM)来推断供体基因型。EM算法可用于在本文中提供的任一种方法中推断供体基因型频率。因此，EM算法可用于在所有测定的SNV靶标处推断最可能的供体基因型。利用推断的供体基因型，可以如上文讨论的完全信息性情境中进行量化。EM可开始于假设在测定中存在的次要等位基因比例遵循三态分布(接受者(A)和供体(B)的每种组合之一，即AA、AB和BB)。由于所有供体基因型都未知，因此可从知识引导得到显示几乎为零次要等位基因的任何测定都是供体AA(即，接受者等位基因)，并且最高的是供体BB。然后可记录对所有供体基因型的初始猜测，并且可计算每个簇的均值。强制使BB测定的均值是供体AB的两倍限制了搜索。然后，该算法基于簇和内置假设重新分配猜测的供体基因型。该过程是迭代的，直到不再发生任何更改。最终结果是一组给出其与背景的测量差异的最可能的供体基因型。通常来说，每个靶标都落入模型中；如果在最大化之后在组之间，结果可被排除。

在本文中提供的任一种方法或组合物的另一个实施方案中，可根据至少一种(或更多种)处是信息性的可能性选择多种SNV靶标的引物对。在这样的一些实施方案中，在本文中提供的任一种方法中使用一组SNV靶标的引物对。在一些实施方案中，SNV靶标组是至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或更多种可能靶标的组。

本文中使用的“信息性SNV靶标”是这样的靶标：其中发生用本文所提供的引物进行的扩增，并且其结果是信息性的。本文中提供的“信息性结果”是可用于量化样品中供体特异性核酸的水平的结果。在一些实施方案中，信息性结果排除了被认为“无调用(nocall)”或错误调用结果的结果。由信息性结果，在所提供的任一种方法的一些实施方案中，可使用标准曲线来计算等位基因百分比。在所提供的任一种方法的一些实施方案中，供体特异性核酸的量分别代表供体特异性核酸的信息性结果的平均。

在一些实施方案中，供体特异性核酸的量可用主要和次要等位基因的量以及接受者的基因型来确定。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，可基于对象的先前基因型分型来确定等位基因。用于基因型分型的方法是本领域中公知的。这样的方法包括测序，例如下一代、杂交、微阵列、其他分离技术或PCR测定。本文中提供的任一种方法均可包括获得这样基因型的步骤。

可获得用于MOMA测定的引物，并且本文中提供的任一种方法均可包括获得用于进行基于扩增的定量测定(例如PCR测定)的一种或更多种引物对的步骤。一般来说，引物具有有利于其用于量化核酸的量的独特特性。例如，引物对的正向引物可在3’核苷酸(例如，倒数第二位3’核苷酸)处错配。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，这种错配位于3’核苷酸处但与SNV位置相邻。在所提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，引物相对于SNV位置的错配定位如图1中所示。一般来说，这样的正向引物即使具有3’错配也在扩增反应(例如PCR反应)中产生扩增产物(与合适的反向引物联合)，因此允许扩增并导致检测到具有相应SNV的核酸。如果不存在特定SNV并且存在相对于SNV靶标的另一种等位基因的双错配，则通常不会产生扩增产物。优选地，在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，对于每种SNV靶标，获得以下引物对，通过所述引物对，可发生每种等位基因的特异性扩增而不扩增其他等位基因。“特异性扩增”是指扩增靶标的特定等位基因，而基本上不扩增另外的核酸或不扩增超过背景或噪声的另外核酸序列。在一些实施方案中，特异性扩增仅导致扩增特定等位基因。

在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，对于双等位基因的每种SNV靶标，存在两种引物对，每种对两种等位基因之一具有特异性，并且因此具有相对于其将要扩增之等位基因的单个错配，并且具有相对于其不扩增之等位基因的双错配(如果这些等位基因的核酸存在的话)。在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，错配引物是正向引物。在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，用于每种SNV靶标的两种引物对中的反向引物是相同的。

这些概念可用于设计用于本文中提供的任一种方法或组合物的引物对。应理解，正向和反向引物被设计成结合相对链(例如，有义链和反义链)以扩增模板的特定基因座的片段。引物对的正向和反向引物可被设计成扩增任意合适大小的核酸片段以检测例如根据本公开内容之SNV靶标的等位基因是否存在。本文中提供的任一种方法均可包括用于获得如本文中所述的一种或更多种引物对的一个或更多个步骤。

应理解，本文中所述的引物对可用于多路复用基于扩增的定量测定(例如PCR测定)。因此，在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，引物对被设计成在PCR反应中与其他引物对相容。例如，引物对可被设计成在PCR反应中与至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种等其他引物对相容。如本文中使用的，如果引物对能够在同一PCR反应中扩增其靶标，则其在PCR反应中是“相容的”。在一些实施方案中，如果在同一PCR反应中多路复用进行时，引物对扩增其靶DNA被抑制不超过1％、不超过2％、不超过3％、不超过4％、不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过30％、不超过35％、不超过40％、不超过45％、不超过50％或不超过60％，则所述引物对是相容的。引物对可由于多种原因而不相容，所述原因包括但不限于引物二聚体的形成和与模板上的脱靶位点结合，这可干扰另外的引物对。因此，本公开内容的引物对可被设计成防治与其他引物对形成二聚体或限制脱靶结合位点的数目。用于设计用于多路复用PCR测定的引物的示例性方法是本领域中已知的或在本文中别处描述。

在一些实施方案中，本文中所述的引物对用于多路复用基于扩增的定量测定(例如PCR测定)以量化供体特异性核酸的量。因此，在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，引物对被设计成检测二倍体的基因组区域，排除被设计成检测可能是非二倍体的基因组区域的引物对。在本文中提供的任一种方法或组合物的一些实施方案中，根据本公开内容使用的引物对不检测重复掩蔽区、已知拷贝数可变区或可以是非二倍体的其他基因组区。

在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，基于扩增的定量测定是任何定量测定，例如由此扩增核酸并可以确定核酸的量。这样的测定包括用本文所述的MOMA引物扩增核酸并进行量化的那些。这样的测定包括简单的扩增和检测、杂交技术、分离技术(例如电泳)、下一代测序等。

在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，PCR是定量PCR，意味着可以确定核酸的量。定量PCR包括实时PCR、数字PCR、TAQMAN^TM等。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，PCR是“实时PCR”。这样的PCR是指其中可在扩增过程仍在进行的同时在液相中监测反应动力学的PCR反应。与常规PCR相比，实时PCR提供了在扩增反应中同时实时地检测或量化的能力。基于来自特定染料的荧光强度的提高，甚至可在扩增达到其平台期之前确定靶标的浓度。

使用多种探针可扩展单探针实时PCR的能力。多路复用实时PCR使用多个基于探针的测定，其中每个测定可具有用独特的荧光染料标记的特定探针，使得对于每个测定观察到不同的颜色。实时PCR仪器可区分由不同染料产生的荧光。不同的探针可用各自具有独特的发射谱的不同染料进行标记。谱信号用离散的光学装置收集，通过一系列滤光器组，并由检测器阵列收集。染料之间的谱重叠可通过使用纯染料谱通过矩阵代数对实验数据去卷积来进行校正。

探针可用于本公开内容的方法，特别地可用于包括量化步骤的那些方法。本文中提供的任一种方法可包括在进行PCR测定中使用探针，同时本文中提供的任一种组合物或试剂盒包含一种或更多种探针。重要的是，在本文中提供的任一种或更多种方法的一些实施方案中，一个或更多个或全部PCR定量测定中的探针与错配引物位于同一链上，而不在相对链上。已发现，将探针这样并入PCR反应中，可提供另外的等位基因特异性区分。

作为一个实例，TAQMAN^TM探针是在5’端具有FAM^TM或

染料标记并且在3’端具有小沟结合剂(minor groove binder，MGB)非荧光猝灭剂(non-fluorescent quencher，NFQ)的水解探针。TAQMAN^TM探针原理一般依赖于

聚合酶在与互补探针结合区杂交期间切割双重标记的TAQMAN^TM探针的5’-3’核酸外切酶活性和基于荧光团的检测。TAQMAN^TM探针可提高定量PCR反应的指数期期间定量测量中检测的特异性。

PCR系统通常依赖于荧光染料或报道子(其中信号与反应中PCR产物的量成正比地提高)的检测和量化。例如，在最简单和最经济的形式中，所述报道子可以是双链DNA特异性染料

Green(Molecular Probes)。

Green是与双链DNA小沟结合的染料。当

Green染料与双链DNA结合时，荧光强度提高。随着产生更多的双链扩增子，

Green染料信号将提高。

应理解，可对本文中提供的PCR条件进行改进或优化以根据本文中所述的任一种方法来工作。通常来说，PCR条件基于所使用的酶、靶模板和/或引物。在一些实施方案中，对PCR反应的一种或更多种组分进行改进或优化。可优化的PCR反应组分的一些非限制性实例包括模板DNA、引物(例如，正向引物和反向引物)、脱氧核苷酸(dNTP)、聚合酶、镁浓度、缓冲剂、探针(例如，当进行实时PCR时)、缓冲剂和反应体积。

在前述任一实施方案中，可使用任何DNA聚合酶(催化DNA核苷酸聚合成DNA链的酶)，包括热稳定性聚合酶。合适的聚合酶将是本领域技术人员已知的，并且包括大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T7 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、Klenow类聚合酶、Taq聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent聚合酶、噬菌体29、REDTaq^TM基因组DNA聚合酶或测序酶。示例性的聚合酶包括但不限于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)pol I、水生栖热菌(Thermus aquaticus，Taq)pol I、嗜热古细菌(Pyrccoccus furiosus，Pfu)、乌兹炽热球菌(Pyrococcus woesei，Pwo)、黄栖热菌(Thermus flavus，Tfl)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus，Tth)、里氏栖热菌(Thermuslitoris，Tli)和海栖热袍菌(Thermotoga maritime，Tma)。这些酶、这些酶的经修饰形式和酶组合可从供应商商购获得，所述供应商包括Roche、Invitrogen、Qiagen，Stratagene和Applied Biosystems。代表性的酶包括

(New England Biolabs，Ipswich，MA)、Hot MasterTaq^TM(Eppendorf)、

Mpx(Finnzymes)、

(Fermentas)、KOD(EMD Biosciences)、Z-Taq(TAKARA)和CS3AC/LA(KlenTaq，UniversityCity，MO)。

盐和缓冲剂包括本领域技术人员熟悉的那些，包括分别包含MgCl₂，以及Tris-HCl和KCl的那些。通常来说，1.5至2.0nM的镁对于Taq DNA聚合酶是最佳的，然而，最佳的镁浓度可取决于模板、缓冲剂、DNA和dNTP因为每一种都具有与镁形成螯合物的潜力。如果镁[Mg²⁺]的浓度太低，则不能形成PCR产物。如果镁[Mg²⁺]的浓度太高，则可见到不期望的PCR产物。在一些实施方案中，镁浓度可通过以0.1mM或0.5mM的增量补充镁浓度直至镁浓度为约5mM来优化。

根据本公开内容使用的缓冲剂可包含添加剂，例如表面活性剂、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、牛血清白蛋白(BSA)和聚乙二醇(PEG)，以及本领域技术人员熟悉的其他添加剂。核苷酸一般是三磷酸脱氧核糖核苷，例如脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，其也可以以足够的量添加至反应用于扩增靶核酸。在一些实施方案中，一种或更多种dNTP(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的浓度为约10μM至约500μM，这可取决于PCR反应中产生的PCR产物的长度和数量。

在一些实施方案中，可改进或优化PCR反应中使用的引物的浓度。在一些实施方案中，PCR反应中引物(例如，正向或反向引物)的浓度可以是例如约0.05μM至约1μM。在一些特别实施方案中，每种引物的浓度为约1nM至约1μM。应理解，根据本公开内容的引物可在PCR反应中以相同或不同的浓度使用。例如，引物对中的正向引物可以以0.5μM的浓度使用，而引物对中的反向引物可以以0.1μM使用。引物的浓度可基于包括但不限于以下的因素：引物长度、GC含量、纯度、与靶DNA的错配、或形成引物二聚体的可能性。

在一些实施方案中，对PCR反应的热分布(thermal profile)进行改进或优化。PCR热分布改进的一些非限制性实例包括变性温度和持续时间、退火温度和持续时间，以及延伸时间。

PCR反应溶液的温度可在变性状态、退火状态和延伸状态之间依次地进行预定数目的循环。实际的时间和温度可以是酶、引物和靶标依赖性的。对于任何给定的反应，变性状态在某些实施方案中可以是约70μ至约100℃。另外，退火温度和时间可影响引物与靶核酸内特定基因座结合的特异性和效率，并且对于特定的PCR反应可以是重要的。对于任何给定的反应，退火状态在某些实施方案中可以是约20℃至约75℃。在一些实施例中，退火状态可以是约46℃到64℃。在某些实施方案中，退火状态可在室温(例如，约20℃至约25℃)下进行。

延伸温度和时间还可影响等位基因产物产率。对于给定的酶，延伸状态在某些实施方案中可以是约60℃至约75℃。

由PCR测定来量化等位基因的量可如本文中提供的进行，或者如另外本领域普通技术人员显而易见地进行。作为一个实例，分析扩增迹线的一致性和稳健量化。可使用内标(internal standard)来将循环阈值转化为输入核酸(例如，DNA)的量。等位基因的量可作为性能测定的均值来计算，并且可针对基因型进行调整。

本文中提供的任一种方法可包括从获自对象的样品提取核酸(例如无细胞DNA(例如供体特异性无细胞DNA))。这样的提取可使用本领域中已知或本文中另外提供的任何方法(参见例如Current Protocols in Molecular Biology，最新版本，或QIAamp循环核酸试剂盒或其他合适的可商购试剂盒)来进行。描述了用于从血液分离无细胞DNA的示例性方法。从对象收集包含抗凝剂(例如EDTA或DTA)的血液。使包含cf-DNA的血浆与血液中存在的细胞分离(例如，通过离心或过滤)。可进行任选的第二分离以从血浆中除去任何剩余的细胞(例如，第二离心或过滤步骤)。然后，可使用本领域中已知的任何方法，例如使用商用试剂盒(例如由Qiagen生产的那些)来提取cf-DNA。用于提取cf-DNA的其他示例性方法也是本领域中已知的(参见例如Cell-Free Plasma DNA as a Predictor of Outcome in SevereSepsis and Septic Shock.Clin.Chem.2008，V.54，p.1000-1007；Prediction of MYCNAmplification in Neuroblastoma Using Serum DNA and Real-Time QuantitativePolymerase Chain Reaction.JCO2005，v.23，p.5205-5210；Circulating Nucleic Acidsin Blood of Healthy Male and Female Donors.Clin.Chem.2005，v.51，p.1317-1319；Use of Magnetic Beads for Plasma Cell-free DNA Extraction：Toward Automationof Plasma DNA Analysis for Molecular Diagnostics.Clin.Chem.2003，v.49，p.1953-1955；Chiu RWK，Poon LLM，Lau TK，Leung TN，Wong EMC，LoYMD.Effects of blood-processing protocols on tetal and total DNA quantification in maternalplasma.Clin Chem 2001；47：1607-1613；和Swinkels et al.Effects of Blood-Processing Protocols on Cell-free DNA Quantification in Plasma.ClinicalChemistry，2003，vol.49，no.3，525-526)。

在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，进行预扩增步骤。这样的扩增的示例性方法如下，并且这样的方法可包括在本文中提供的任一种方法中。对于约13种靶标使用Q5 DNA聚合酶在PCR中扩增约15ng的无细胞血浆DNA，其中合并的引物总共为4uM。样品进行约25个循环。反应总共为25ul。在扩增后，可使用数种方法清洗样品，包括AMPURE珠净化、珠纯化、或者简单的ExoSAP-IT^TM或Zymo。

如本文中使用的，来自对象的样品可以是生物样品。这样的生物样品的实例包括全血、血浆、血清、尿等。在本文中提供的任一种方法的一些实施方案中，可进行向样品添加另外的核酸，例如标准品。

在另一个方面，提供了包含本文中提供的一种或更多种引物对的组合物和试剂盒。组合物或试剂盒中还可包含用于进行测定(例如PCR测定)的其他试剂。

本发明的不同方面可单独地、组合或以前文中所述实施方案中未具体讨论的多种布置使用，并且因此其应用不限于在先描述中所述的或附图中举例说明的组分的细节和布置。例如，一个实施方案中描述的一些方面可以以任何方式与其他实施方案中描述的一些方面组合。

此外，本发明的一些实施方案可作为一种或更多种方法实施，其实例已提供。作为方法的一部分执行的动作可以以任何合适的方式排序。因此，可构建其中动作以不同于所举例说明的顺序执行的实施方案，其可包括同时进行一些动作，即使在一些举例说明性实施方案中被示为顺序动作。

在权利要求书中使用例如“第一”、“第二”、“第三”等的序数术语来修饰权利要求要素并非自身暗示一个权利要求要素相对于另一个具有任何优先权、优先性或顺序或者其中执行方法动作的时间顺序。这样的术语仅用作标记以区分具有某一名称的一个权利要求要素与具有相同名称(除序数术语的使用之外)的另一个要素。

本文中使用的用语和术语是出于描述的目的，并且不应被认为是限制性的。“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式的使用意味着涵盖其后列出的项目和另外的项目。

已经详细描述了本发明的数个实施方案，本领域技术人员将容易想到不同的修改和改进。这样的修改和改进旨在落入本发明的精神和范围内。因此，前面的描述仅是作为示例，而不是旨在是限制性的。以下描述提供了本文中提供的方法的一些实例。

实施例

实施例1-具有接受者和供体基因型信息的MOMA测定

SNV靶标选择

根据本公开内容的用于多路复用的靶标的鉴定可包括一个或更多个以下步骤。首先，在数个种族对照群体(Hardy-Weinberg p＞0.25)上(排除已知的困难区域)筛选高度杂合的SNP。困难区域包括患者中可能异常的综合征区和低复杂性的区域，包括染色体的着丝粒和端粒。然后在计算机中(in silico)设计期望长度的靶标片段。具体地，设计跨越每个SNP的70bp窗口的两个20至26bp引物。然后使用BLAST将所有候选引物针对GCRh37进行查询。保留那些被发现具有足够特异性的引物，并监测脱靶的命中，特别是在片段的3’末端。分析脱靶候选物命中之将在尺寸选择后还存在的成对片段生成。然后对所选择的引物进行计算机多路复用评价。引物的计算解链温度和鸟嘌呤-胞嘧啶百分比(GC％)用于过滤中等范围序列。迭代遗传算法和模拟退火用于选择与400种靶标相容的候选引物，最终导致选择800种引物。产生800种引物并在常见溶液中在共同的解链温度下物理地测试多路复用能力。具体地，基于多路复用筛选中的均匀扩增和中等读取深度窗口来过滤引物。使用表现最佳的多路复用SNP为MOMA设计了48种测定。每种SNP具有在四种错配选择处以WT/MUT中设计的探针；每次测定8种探针。在70bp富集的片段内设计新的巢式引物。最后，利用已知的杂合个体实验性地扩增引物以评价扩增效率(使用TAQMAN^TM，一式三份，8种探针×48个测定)。

每种测定的先验基因型分型信息

使用每种所测定的SNP处已知的接受者和供体基因型，选择信息性测定的子集。注意，可在供体是任何其他基因型的情况下使用接受者纯合位点。另外，如果供体基因型未知，则其可被推断，例如通过使用血浆数据差异。还可通过测序、SNP微阵列或在已知的0％(纯净接受者)样品上应用MOMA测定来了解基因型。

多路复用测定性能的后处理分析

在整个实验群组中评估患者特异性MOMA探针偏倚。细化迭代选择以进行最终的供体百分比调用。此外，自动离群值检测提供了患者特异性异常基因组区域。

重建实验

使用具有已知混合比例的重建血浆样品评价测定的灵敏度和精密度。具体地，评价1∶10、1∶20、1∶100、1∶200和1∶1000的比例。

重建实验的结果如图2所示。一个靶标是完全信息性的，其中针对纯合接受者存在纯合供体(阴影数据点)。另一个靶标是半信息性的，其中针对纯合接受者存在杂合供体(空心数据点)。

实施例2-具有接受者但不具有供体基因型信息的MOMA测定

为了在没有供体基因型信息的情况下工作，可进行以下操作以推断信息性测定并允许定量血浆样品中供体特异性无细胞DNA。在完整信息情境中评价所有测定的性能。因此，该操作假定每次测定时有干净的AA/AB/BB基因型和每种定量的无偏倚行为。对于接受者基因型，选择已知在接受者中纯合的测定。任何污染都归因于供体核酸，并且测定收集产生三模态分布，其中三簇测定对应于非信息性、半信息性和完全信息性测定。通过足够数目的接受者纯合测定，可推测存在供体完全信息性测定。

如果接受者基因型是纯合的并且是已知的，则如果观察到不是接受者基因型的测量，那么真正供体纯合的探针将具有最高的簇并且等于猜测，而供体杂合的那些探针将是猜测的一半。可绘制概率分布并且可使用最大期望值法算法(EM)来推断供体基因型。这可用于在本文中提供的任一种方法中推断供体基因型频率。因此，EM算法用于在所有所测定的SNV靶标处推断最可能的供体基因型。利用推断的供体基因型，可在完全信息情境中进行量化。EM可开始于假设在测定中存在的次要等位基因比例遵循三态分布，对于接受者和供体的每种组合一种，给定所有测定在接受者中是“AA”(或从“BB”翻转而大部分没有损失)。由于所有供体基因型都未知，因此可从知识引导得到(bootstrap)显示几乎为零次要等位基因的任何测定都是供体AA，并且最高的是供体BB。记录对所有供体基因型的初始猜测，并计算每个簇的均值。强制使BB测定的均值是供体AB的两倍限制了搜索。然后，该算法基于簇和内置假设重新分配猜测的供体基因型。该过程是迭代的，直到不再发生任何更改。最终结果是一组给出其与背景的测量差异最可能的供体基因型。通常来说，每个靶标都落入模型中；如果在最大化之后结果在组之间可被排除。

图3和4示出了以这种方式处理的血浆样品的示例性结果。对于任何存在接受者纯合子的测定，x轴是供体％。点行表示单独的PCR测定结果。圆圈最底部行表示供体基因型的初始猜测，一些AA、一些A/B和一些BB。然后绘制实体曲线，表示了以初始测定为中心的β分布，点为纯合(完全信息性)，且白色表示杂合(半信息性)，黑色曲线表示非信息性测定或背景噪声的分布。在第二行中对于测定重新分配了更新的猜测。第二行的曲线使用虚线。最上面的行是最终评估，因为没有发生变化。白色虚线曲线的双倍峰对应于最大似然法供体％调用，在约10％，或等于点曲线的均值。

以10％、5％、1％、0.5％和0.1％产生使用来自两个个体的DNA的重建实验(重建(Recon)1)。用靶标的多路复用文库扩增所有混合物，清洗，随后使用MOMA方法定量地进行基因型分型。通过对每个个体进行基因型分型进行了分析以便了解其真实的基因型。使用主要个体的基因型的先验知识(寻找纯合位点)确定信息性靶标并且其中第二个个体不同，并使用信息性靶标计算分数(百分比)。然后计算分数(以黑色表示以指示“具有基因型”信息)。

还以10％、5％、1％、0.5％和0.1％从两个个体(主要和次要)开始创建第二次重建实验(重建2)。用靶标的多路复用文库扩增所有混合物，清洁，并随后使用上述MOMA方法定量地进行基因型分型。通过对每个个体进行基因型分型进行了分析以便了解其真实的基因型。如上所述使用第二个体的基因型的先验知识确定信息性靶标。然后计算分数(以黑色表示以指示“具有基因型”信息)。

次日再次运行这些重建(重建3)。

然后仅使用可用于第一个体(主要DNA贡献者)的基因型分型信息再次分析相同的重建样品(重建1、2、3)。不使用来自第二个体(次要DNA贡献者)的基因型分型信息。约38至40种靶标用于计算没有进行基因型分型(没有供体模拟)的分数；其表示为阴影点(图5)。发现接受者纯合的每个靶标通常是可用的。圆圈示出了第一个评估，阈值；在右边的那些被认为是完全信息性的，而在左边那些并不是。顶部的三角形是相同的靶标，但对于最终的信息性决定，他们被重新着色。

实施例3-MOMA cf-DNA测定

MOMA cf-DNA测定的原理和程序

该示例性测定旨在确定移植接受者血液样品中存在的DS cf-DNA的百分比。在该实施方案中，将接受者的血液样品收集在EDTA管中并进行离心以分离血浆和血沉棕黄层(buffy coat)。血浆和血沉棕黄层可等分到两个单独的15mL锥形管中并冷冻。血浆样品可用于定量基因型分型(qGT)，而血沉棕黄层可用于接受者的基本基因型分型(bGT)。除了移植接受者的血液样品外，来自供体的丢弃组织的小块或血液样品也可用于基本基因型分型。

该过程的第一步可以是从血浆样品中提取无细胞DNA(用于qGT)，以及从血沉棕黄层、全血或组织样品中提取基因组DNA(gDNA)(用于bGT)。cfDNA的总量可通过qPCR确定，并且相对于靶标浓度进行归一化。此过程称为cfDNA定量。gDNA可使用UV分光光度法进行量化和归一化。15ng DNA通常提供准确且有效的结果。

归一化的患者DNA可用作包含例如96种引物对的高多路复用文库PCR扩增反应的输入，每种引物对扩增包含一个MOMA靶位点的区域。所得文库可用作bGT或qGT测定的输入，因为其由具有MOMA靶引物和探针位点的PCR扩增子组成。该步骤可通过在高度特异性qPCR扩增之前提高每个靶标的拷贝数来提高整体测定的灵敏度。对照和校准物/标准品可与患者样品一起使用多路复用文库进行扩增。文库扩增之后，可进行酶促清除以去除多余的引物和未引入的脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，以防止干扰下游扩增。

在并行工作流程中，可制备母液混合物(master mix)并将其转移至384孔PCR板。然后可用文库稀释缓冲液将扩增的样品、对照和校准品/标准品稀释至预定的体积和浓度。可将经稀释的样品和对照等分至6孔储存板，并使用声学液体处理器将其转移至384孔PCR板。然后可将板密封并移至实时PCR扩增和检测系统。

MOMA可通过靶向双等位基因SNP进行基本和定量基因型分型分析两者，所述双等位基因SNP可能在移植供体与接受者之间是差异的，使得它们是高度信息性的。基本基因型分型分析可用每个靶标处的三种可能的基因型(例如纯合REF、杂合REF和VAR、以及纯合VAR)标记接受者和供体。该信息可与标准曲线一起用于定量基因型分型分析，以量化已知为小种类比例的每个靶标的等位基因比例。所有信息性和质量控制通过的等位基因比例的中位数可用于确定DS cfDNA的％。

实施例4-计算机实现的一些实施方案的一些实施例

在一些实施方案中，上述诊断技术可通过执行一种或更多种软件设施的一种或更多种计算装置来实现以分析对象的样品(例如随时间)、测量样品中的核酸(例如无细胞DNA)并基于一个或更多个样品产生结果，例如诊断结果。图6示出了可用其操作一些实施方案的计算机系统的一个实例，但应理解，实施方案不限于用图6中所示类型的系统来操作。

图6的计算机系统包括对象802和可从对象806获得样品806的临床医生804。如从前述应理解的，样品806可以是用于对象802的任何合适的生物材料样品，其可用于测量对象802(包括血液样品)中核酸(例如无细胞DNA)的存在。可将样品806提供给分析装置808，普通技术人员将从前述内容中理解其将分析样品808以确定(包括评估)样品806和/或对象802中核酸(例如无细胞DNA)的量，包括DS核酸(例如DS无细胞DNA)的量。为了便于举例说明，将分析装置808描绘为单个装置，但应理解，分析装置808可采用任何合适的形式，并且在一些实施方案中，可作为多个装置实现。为了确定样品806和/或对象802中的核酸(例如无细胞DNA)的量，分析装置808可执行上述任何技术，并且不限于进行任何特定的分析。分析装置808可包含一个或更多个处理器以执行在软件中实现的分析设施，其可驱动处理器以操作其他硬件并接收由其他硬件执行的任务的结果以确定分析的总体结果(其可以是样品806和/或对象802中的核酸(例如无细胞DNA)的量)。分析设施可存储在装置808的一个或更多个计算机可读存储介质(例如存储器)中。在另一些实施方案中，本文中描述的用于分析样品的技术可部分地或完全地在一个或更多个专用计算机组件(例如专用集成电路(Application Specific Integrated Circuits，ASIC))中实现，或者通过可代替软件实施的任何其他合适形式的计算机组件来实现。

在一些实施方案中，临床医生804可直接将样品806提供给分析装置808，并且除了从对象802获得样品806之外还可操作装置808，而在另一些实施方案中，装置808可在地理上位于远离临床医生804的位置，并且对象802和样品806可需要被运送或以其他方式转移至分析装置808的位置。在一些实施方案中，样品806可(例如，经由任何合适的界面输入)与样品806和/或对象802、获得样品806的日期和/或时间、或者描述或识别样品806之其他信息的标识符一起提供给分析装置808。

在一些实施方案中，分析装置808可配置成将对样品806执行的分析的结果提供给计算装置810，所述计算装置810可包括可作为数据库或其他合适的数据存储的数据存储810A来实现。在一些实施方案中，计算装置810可作为一种或更多种服务器实现，包括作为例如云服务提供商的分布式计算平台的一种或更多种物理和/或虚拟机。在另一些实施方案中，装置810可作为台式或膝上型个人计算机、智能移动电话、平板计算机、专用硬件装置或其他计算装置实现。

在一些实施方案中，分析装置808可经由一种或更多种有线和/或无线、本地和/或广域计算机通信网络(包括因特网)将其分析结果传送至装置810。可使用任何合适的协议传达分析的结果，并且可与描述或识别样品806的信息，例如样品806和/或对象802的标识符或获得样品806的日期和/或时间一起传送。

计算装置810可包括一种或更多种处理器以执行在软件中实现的诊断设施，其可驱动处理器来执行本文中描述的诊断技术。诊断设施可存储在装置810的一种或更多种计算机可读存储介质(例如存储器)中。在另一些实施方案中，本文中描述的用于分析样品的技术可部分地或全部地在一种或更多种专用计算机组件(例如专用集成电路(ASIC))中，或通过可代替软件实现的任何其他合适形式的计算机组件来实现。

诊断设施可接收分析的结果以及描述或识别样品806的信息，并且可将该信息存储在数据存储810A中。该信息可与对于对象802的其他信息相关联地存储在数据存储810A中，例如在关于对象802的先前样品的信息先前由诊断设施接收和存储的情况下。关于多个样品的信息可使用通用标识符(common identifier)(例如对象802的标识符)来关联。在一些情况下，数据存储810A可包括用于多个不同对象的信息。

还可操作诊断设施以分析由用户输入识别的特定对象802的一个或更多个样品806的分析结果，以便确定对象802的诊断。诊断可以是对象802患有、可患有或可在将来发生特定病症的风险的结论。诊断设施可使用上述任何多种实例来确定诊断，包括通过将针对特定样品806确定的核酸(例如无细胞DNA)的量与一种或更多种阈值进行比较，或者通过比较对样品806确定的核酸(例如无细胞DNA)的量例如相对于一种或更多种阈值随时间的变化。例如，诊断设施可通过将一个或更多个样品806的核酸(例如无细胞DNA)的量与一个阈值进行比较并且将同一样品806的核酸(例如无细胞DNA)的量与另一个阈值进行比较来确定对象802的病症的风险。基于与阈值的比较，诊断设施可产生指示对象802的病症的风险的输出。

如从前述应理解的，在一些实施方案中，诊断设施可配置有不同的阈值，可将核酸(例如无细胞DNA)的量与其进行比较。例如，不同的阈值可对应于不同的人口统计组(年龄、性别、种族、经济类别、病史中特定操作/病症/其他的存在或不存在，或其他人口统计类别)、不同的病症和/或其他参数或参数组合。在这样的一些实施方案中，诊断设施可配置成选择与其比较核酸(例如无细胞DNA)的量的阈值，其中不同的阈值存储在计算装置810的存储器中。因此，在基于人口统计组阈值不同的一些实施方案中，可基于对象802的人口统计信息进行选择，并且在这些情况下，可将对象802的人口统计信息提供给诊断设施或使用对象802的标识符通过诊断设施检索(来自其他计算装置，或可以是与数据存储810A相同或不同的数据储存或来自任何其他合适的来源)。作为替代或补充，可基于待确定风险的病症来进行选择，并且诊断设施可在确定风险之前接收作为输入的病症并使用该条件来选择确定风险的基础的阈值。应理解，在支持多个阈值的一些实施方案中，诊断设施不限于以任何特定方式选择阈值。

在一些实施方案中，诊断设施可配置成输出以向用户呈现用户界面，该用户界面包括对象802的诊断的风险和/或诊断的基础。诊断的基础可包括例如对于对象802在一个或更多个样品806中检测的核酸(例如无细胞DNA)的量。在一些实施方案中，用户界面可包括上面讨论的结果、值、量、图等的任何实例。它们可包括随时间推移的结果、值、量等。例如，在一些实施方案中，用户界面可引入类似于本文中提供的任一个图中所示的图。在这种情况下，在一些情况下，可对图进行注释以向用户指示图的不同区域如何可对应于可以从图中显示的数据的分析产生的不同诊断。例如，可将图数据所针对的阈值进行比较以确定分析可施加在图上。

与可通过其他用户界面提供的相比，包含图(特别是具有线条和/或阴影)的用户界面可向用户提供更直观且更快速评阅的界面，以基于核酸(例如无细胞DNA)的量确定对象802的风险。然而，应理解，实施方案不限于用任何特定用户界面来实现。

在一些实施方案中，诊断设施可将诊断或用户界面输出至可由对象802和/或临床医生(可以是临床医生804或其他临床医生)操作的一种或更多种其他计算装置814(包括装置814A、814B)。诊断设施可经由网络812将诊断和/或用户界面传送至装置814。

根据本文中描述的原理操作的技术可以以任何合适的方式实现。上面讨论中包括一系列流程图，示出了基于核酸(例如无细胞DNA)的量的分析来确定病症风险之多种方法的步骤和动作。上面讨论的处理和决策块(decision block)表示可包括在执行这些多种过程的算法中的步骤和动作。从这些过程来源的算法可作为与一种或更多种单用途或多用途处理器的操作集成并指导其操作的软件来实现，可作为功能等效电路(例如数字信号处理(Digital Signal Processing，DSP)电路或专用集成电路(ASIC))来实现，或者可以以任何其他合适的方式实现。应理解，实施方案不限于任何特定电路或任何特定编程语言或编程语言类型的任何特定语法(syntax)或操作。相反，本领域技术人员可使用上面的描述来制造电路或实现计算机软件算法以执行实施本文中描述的技术类型的特定装置的处理。还应理解的是，除非本文中另有指示，否则上述步骤和/或动作的特定顺序仅是举例说明可被实现的算法，并且可在本文中描述的原理的实现和实施方案中变化。

因此，在一些实施方案中，本文中描述的技术可体现为作为软件(包括作为应用软件、系统软件、固件、中间件、嵌入代码或任何其他合适类型的计算机代码)的计算机可执行指令来实现。这样的计算机可执行指令可使用许多合适的编程语言和/或编程或脚本工具中的任一种来编写，并且还可被编译为在框架或虚拟机上执行的可执行机器语言代码或中间代码。

当本文中描述的技术体现为计算机可执行指令时，这些计算机可执行指令可以以任何合适的方式实现，包括作为多种功能设施，每种功能设施提供一种或更多种操作以完成根据这些技术操作的算法的执行。然而，实例化的“功能设施”是计算机系统的结构组件，当用一种或更多种计算机集成并由其执行时，使得一种或更多种计算机执行特定的操作角色。功能设施可以是软件元素的一部分或全部。例如，功能设施可根据过程、或作为离散过程，或作为任何其他合适的处理单元来实现。如果本文中描述的技术作为多种功能设施来实现，则每种功能设施可以以其自己的方式实现；所有这些都不需要以同样的方式实现。另外，这些功能设施可并行和/或串行地执行(如果适当的话)，并且可使用正在执行它们的计算机上的共享存储器，使用消息传递协议，或者以任何其他合适的方式在彼此之间传递信息。

一般来说，功能设施包括执行特定任务或实现特定抽象数据类型的例程、程序、对象、组件、数据结构等。通常来说，功能设施的功能可根据期望在它们运行的系统中组合或分布。在一些实现中，执行本文中技术的一个或更多个功能设施可一起形成完整的软件包。在一些作为替代的实施方案中，这些功能设施可适于与其他不相关的功能设施和/或过程交互以实现软件程序应用。

本文中已经描述了用于执行一个或更多个任务的一些示例性功能设施。然而，应理解，所描述的功能设施和任务划分仅是举例说明可实现本文中描述的示例性技术的功能设施的类型，并且实施方案不限于以任何特定数目、划分或功能设施的类型来实现。在一些实现中，所有功能可在单个功能设施中实现。还应理解，在一些实现中，本文中描述的一些功能设施可与其他功能设施一起实现或与其他功能设施分开实现(即，作为单个单元或分开的单元)，或者可以不实现这些功能设施中的一些。

在一些实施方案中，实现本文中描述的技术的计算机可执行指令(当作为一个或更多个功能设施或以任何其他方式实现时)可在一个或更多个计算机可读介质上编码以向介质提供功能。计算机可读介质包括磁介质例如硬盘驱动器，光学介质例如光盘(CompactDisk，CD)或数字通用盘(Digital Versatile Disk，DVD)，持久或非持久性固态存储器(例如，闪存、磁性RAM等)或任何其他合适的存储介质。这样的计算机可读介质可以以任何合适的方式实现，包括作为计算装置的一部分或作为独立的单独存储介质。如本文中使用的，“计算机可读介质”(也称为“计算机可读存储介质”)是指有形存储介质。有形存储介质为非暂时性的并且具有至少一个物理结构组件。在如本文中使用的“计算机可读介质”中，至少一个物理结构组件具有至少一个物理特性，该特性可在创建具有嵌入信息的介质的过程、在其上记录信息的过程、或用信息编码介质的任何其他过程期间以某种方式改变。例如，可在记录过程期间改变计算机可读介质的物理结构的一部分的磁化状态。

在其中技术可体现为计算机可执行指令的一些但非全部实现中，这些指令可在任何合适的计算机系统中操作的一个或更多个合适的计算装置上执行，包括图6的示例性计算机系统，或者可对一个或更多个计算装置(或一个或更多个计算装置的一个或更多个处理器)进行编程以执行计算机可执行指令。计算装置或处理器可被编程为当指令以可访问计算装置或处理器的方式，例如在数据存储器(例如，芯片上高速缓存(on-chip cache)或指令寄存器(instruction register)、通过总线访问的计算机可读存储介质等)中存储时，执行指令。包括这些计算机可执行指令的功能设施可与以下集成并指导其操作：单个多用途可编程数字计算装置、共享处理能力并且联合执行本文中描述的技术的两个或更多个多用途计算装置的协调系统、专用于执行本文中所述技术的单个计算装置或计算装置的协调系统(共址或地理上分布式)、用于执行本文中所述技术的一个或更多个现场可编程门阵列(Field-Programmable Gate Array，FPGA)或任何其他合适的系统。

已经描述了以电路和/或计算机可执行指令实现这些技术的实施方案。应理解，一些实施方案可以是其中已经提供了至少一个实例的方法的形式。作为方法的一部分执行的动作可以以任何合适的方式排序。因此，可构造一些实施方案，其中各动作以不同于所示的顺序执行，这可包括同时执行某些动作，即使所述动作在举例说明性实施方案中作为顺序动作示出。在另一些方面，本文中提供了前述任一个，包括前述装置、系统、实施方案、方法、技术、算法、介质、硬件、软件、接口、处理器、显示器、网络、输入、输出或其任何组合。

实施例5-供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)与细胞排斥等级的相关性

使用MOMA测定对移植接受者的供体特异性cf-DNA进行量化，本文中提供了用于这样的测定的示例性步骤。图67和68示出了具有已知基因型的MOMA(图67)和具有未知供体基因型的MOMA(图68)的数据分布。如示例性图7-31和57-66所示，通过实验确定阈值(“临界点”)，以便可以预测细胞排斥等级和/或与其相关的风险。还列出了一些结果，并在下表1-24中示出。

表1.使用具有已知供体基因型的方法和具有未知供体基因型的方法进行的统计检验

表2.使用实验确定的CR0临界点的交叉表格(具有已知供体基因型的MOMA)

表3.使用实验确定的CR0临界点的交叉表格(具有未知供体基因型的MOMA)

表4：使用实验确定的CR1临界点的交叉表格(具有未知供体基因型的MOMA)

表5：使用实验确定的CR2临界点的交叉表格(具有已知供体基因型的MOMA)

表6：使用实验确定的CR2临界点的交叉表格(具有未知供体基因型的MOMA)

表7.CR1/2/3vs.CR0(具有已知供体基因型的MOMA)

(包括“不健康”的样品)

表8.CR1/2/3vs.CR0(具有已知供体基因型的MOMA)-健康(无以下情况：死亡、心脏停搏、MCS、对感染的治疗、AMR 1和2、移植物血管病、癌症)

表9.CR1/2/3vs.CR0(具有已知供体基因型的MOMA-1个样品/对象)在CR1/2/3组中，使用的样品来自第一次排斥；在CR0组中，其为采集的第一个样品。

表10.CR1/2/3vs.CR0(使用血浆的具有已知供体基因型的MOMA)-健康(无以下情况：死亡、心脏停搏、MCS、对感染的治疗、AMR 1和2、移植物血管病、癌症)

表11.CR1/2/3vs.CR0(使用全血的具有已知供体基因型的MOMA)-健康(无以下情况：死亡、心脏停搏、MCS、对感染的治疗、AMR 1和2、移植物血管病、癌症)

表12.具有已知供体基因型的MOMA交叉表格(全血和血浆)

表13.具有已知供体基因型的MOMA的交叉表格(血浆)

表14.具有已知供体基因型的MOMA的交叉表格(全血)

表15.CR1/2/3vs.CR0(具有未知供体基因型的MOMA)

(包括“不健康”的样品)

表16.CR1/2/3vs.CR0(具有未知供体基因型的MOMA)-健康(无以下情况：死亡、心脏停搏、MCS、对感染的治疗、AMR 1和2、移植物血管病、癌症)

表17.CR1/2/3vs.CR0(具有未知供体基因型的MOMA-1个样品/对象)在CR1/2/3组中，使用的样品来自第一次排斥；在CR0组中，其为采集的第一个样品。

表18.CR1/2/3vs.CR0(使用血浆的具有未知供体基因型的MOMA)-健康(无以下情况：死亡、心脏停搏、MCS、对感染的治疗、AMR 1和2、移植物血管病、癌症)

表19.CR1/2/3vs.CR0(使用全血的具有未知供体基因型的MOMA)-健康(无以下情况：死亡、心脏停搏、MCS、对感染的治疗、AMR1和2、移植物血管病、癌症)

表20.具有未知供体基因型的MOMA交叉表格(全血和血浆)

表21.具有未知供体基因型的MOMA的交叉表格(血浆)

表22.具有未知供体基因型的MOMA的交叉表格(全血)

表23.排斥之间具有已知供体基因型的MOMA(移植之后7天，不包括排斥的治疗之后14天)

排斥之间WB+血浆：

CR0 vs CR2 p＝0.04(CR2高于CR0)；CR1 vs CR2 p＝0.01(CR2高于CR1)；CR0 vsCR1 p＝0.39；

排斥之间全血

CR0 vs CR2 p＝0.16；CR1 ｖs CR2 p＝0.04(CR2高于CR1)；CR0 vs CR1 p＝0.11

排斥之间血浆：CR0 vs CR1p＜0.0001(CR1高于CR0)

表24.排斥之间具有未知供体基因型的MOMA(移植之后7天，不包括排斥的治疗之后14天)

排斥之间WB+血浆：

CR0 vs CR2 p＝0.05；CR1 Vs CR2p＝0.08；

CR0 vs CR1 p＝0.83；

排斥之间全血：

CR0 vs CR2 p＝0.20；CR1 vs CR2 p＝0.14(CR2高于CR1)；CR0 vs CR1 p＝0.62

排斥之间血浆：CR0 vs CR1p＜0.0001(CR1高于CR0)

实施例6-供体特异性无细胞DNA作为心脏移植之后的非侵入性指标

目的

当前用于心脏移植接受者的监测的金标准是心内膜心肌活检(endomyocardialbiopsy，EMB)，这会使儿童处于受伤的特别风险中，限制了合理筛查的频率，并且由于排斥可能作为零散过程(patchy process)发生，所以灵敏度固有地受限。开发了基于循环供体特异性无细胞DNA(DS cfDNA)的精确量化的用于小儿和成人心脏移植接受者的非侵入性诊断筛选工具，以代替对侵入性监测活检的需求。

方法

在威斯康星州儿童医院(Children’s Hospital of Wisconsin，CHW)随访的所有心脏移植接受者均被邀请参加这项盲法研究(blinded study)。在以下临床情形下收集三至十毫升(ml)的抗凝血液以评估循环cf-DNA水平：移植之后第1、4、7和28天，任何EMB之前的24小时之内，开始对排斥的治疗之后第1、4、7和28天。将样品立即编码，去标识(de-identified)并且送到实验室用于使用MyTAI(心脏)测试(TAI diagnostics，Milwaukee，WI)进行处理。临床、实验室、心脏活检、血管造影术、导管插入术和超声心动图数据均在样品收集时记录。回顾了所有活检报告的病理学报告，并记录了2004年国际心肺移植协会(ISHLT)等级。记录所有关键事件的日期和时间，包括对感染的治疗、对排斥的治疗、心脏停搏、心脏再移植、机械循环支持开始、以及死亡。使用靶向方法对供体特异性(ds)无细胞DNA(cf-DNA)进行量化，并使用两种不同的方法将其与相关的活检和血管造影术结果进行比较：具有供体基因型(方法1)和不具有供体基因型(方法2)。

结果

来自成年和小儿的87位不同移植接受者对象的总共158个样品通过了QC标准，并且可用于分析。一个个体在初始移植之后和再移植之后均参加了该研究，并作为两个不同的对象进行分析，给出了两种不同的供体/接受者错配DNA。移植时患者的平均年龄为7.9+/-7.5岁(范围为0.03至24.2岁)。血液样品时的平均年龄为12.7+/-8.1岁(范围为0.08至30.2岁)。59.6％(51/87)的对象为男性，并且65.5％(57/87)为白人。从移植至血液样品的平均时间为4.8+/-4.2年。134个活检为CR0级，21个活检为CR1级，并且3个活检为CR2级。平均供体特异性cf-DNA分数为在与CR0级活检相关的样品中为0.11％(IQR 0.06-0.21％)，在与CR1级活检相关的样品中为0.37％(IQR 0.15-0.72％)，并且在与CR2级活检相关的样品中为0.97％(IQR 0.88-1.06％)(p＝0.027)。基于相关的ROC曲线排除CR2级排斥的经验最优临界点为0.87％[95％CI 0.78-0.97％(p＝0.009)]。曲线下的面积为0.97。灵敏度为100％，并且特异性为93％。

作为另一个实例，在没有供体基因型的情况下，平均供体cf-DNA分数为在与CR0级活检相关的样品中为0.25％(IQR 0.17-0.39％)，在与CR1级活检相关的样品中为0.89％(IQR 0.44-5.35％)，并且在与CR2级活检相关的样品中为1.22％(IQR 1.04-5.18％)(p＜0.001)。基于相关的ROC曲线排除CR2级排斥的经验最优临界点为0.89％[95％CI 0.46-1.70％(p＝0.725)]。曲线下的面积为0.95。灵敏度为100％，并且特异性为89％。

结论

发现使用靶向的高通量测定来进行供体特异性cf-DNA的量化对于心脏移植接受者中的急性细胞排斥监测具有极好的灵敏度。引人注目地，观察到CR0、CR1和CR2相关活检中供体特异性cf-DNA逐渐升高，表明排斥等级升高时的进展性同种异体移植物损伤。

实施例7-供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)与心脏同种异体移植物血管病的相关性

使用MOMA对移植接受者的供体特异性cf-DNA(n＝273)进行量化。如图39中所示，使用具有已知供体基因型(方法1)和具有未知供体基因型(方法2)的两种不同的方法(上排)通过实验确定了心脏同种异体移植物血管病(移植物血管病)的阈值(“临界点”)。另外，检查了总无细胞DNA，并通过实验确定了阈值(下排)。此外，下表25示出了另外的统计信息。

在图41-46中提供了另外的一些实例。使用整个样品群体(N＝214)，当供体基因型已知(图41)和未知(图43)时确定实验阈值。在从数据中排除受机械支持的对象之后，确定相同的阈值。结果示出在图42和图44中。图45示出了当仅使用来自每位对象的最后样品时(N＝79)(当供体基因型未知时)的结果。

表25.移植物血管病统计

实施例8-供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)与心脏停搏的相关性

同样地，使用MOMA对移植接受者的供体特异性cf-DNA(n＝71-77)进行量化。如图40中所示，使用两种不同的方法(上排)通过实验确定了心脏停搏的阈值(“临界点”)。此外，下面的表26示出了另外的统计信息。

表26.心脏停搏统计

*标志物每次加倍，心脏停搏的优势比(否/是)。

图47-52示出了使用不同方法对心脏停搏阈值(临界点)的实验确定。图47-49示出了在三个群体中使用MOMA(具有已知供体基因型)获得的阈值：全部样品群体(图47)，排除受机械支持的那些对象的全部样品群体(图48)以及从每位对象获得的最后样品(图49)。图50-52示出了在三个群体中使用MOMA(具有未知供体基因型)获得的阈值：全部样品群体(图50)，排除受机械支持的那些对象的全部样品群体(图51)以及从每位对象获得的最后样品(图52)。表27中显示了测试的统计信息。

表27.心脏停搏统计-具有未知供体基因型的MOMA

图53和54示出了另外的结果。在图53中，使用了全部样品群体(N＝214)。图54示出了当群体限于来自未受机械支持的对象的群体时的结果。研究的其他结果示于下表28中。

表28.心脏停搏统计-具有未知供体基因型且无上限的MOMA

实施例9-供体特异性无细胞DNA作为心脏移植之后的非侵入性指标

目的

当前用于心脏移植接受者的监测的金标准是心内膜心肌活检(EMB)，这会使儿童处于受伤的特别风险中，限制了合理筛查的频率，并且由于排斥可能作为零散过程发生，所以灵敏度固有地受限。开发了基于循环供体特异性无细胞DNA(DS cfDNA)精确定量的用于小儿和成人心脏移植接受者的非侵入性诊断筛选工具，以代替对侵入性监测活检的需求。

方法

在威斯康星州儿童医院(Children’s Hospital of Wisconsin，CHW)随访的所有心脏移植接受者均被邀请参加这项盲法研究。在以下临床情形下收集三至十毫升(ml)的抗凝血液以评估循环cf-DNA水平：移植之后第1、4、7和28天，任何EMB之前的24小时之内，开始对排斥的治疗之后第1、4、7和28天。将样品立即编码，去标识(de-identified)并且送到实验室用于使用MyTAI(心脏)测试(TAI diagnostics，Milwaukee，WI)进行处理。临床、实验室、心脏活检、血管造影术、导管插入术和超声心动图数据均在样品收集时记录。回顾了所有活检报告的病理学报告，并记录了2004年国际心肺移植协会(ISHLT)等级。记录所有关键事件的日期和时间，包括对感染的治疗、对排斥的治疗、心脏停搏、心脏再移植、机械循环支持开始、以及死亡。使用靶向方法对供体特异性(ds)无细胞DNA(cf-DNA)进行量化，并使用两种不同的方法将其与相关的活检和血管造影术结果进行比较：具有供体基因型(方法1)和不具有供体基因型(方法2)。

结果

心脏同种异体移植物血管病

来自成年和小儿的87位不同移植接受者对象的总共158个样品通过了QC标准，并且可用于分析。一个个体在初始移植之后和再移植之后均参加了该研究，并作为两个不同的对象进行分析，给出了两种不同的供体/接受者错配DNA。移植时患者的平均年龄为7.9+/-7.5岁(范围为0.03至24.2岁)。血液样品时的平均年龄为12.7+/-8.1岁(范围为0.08至30.2岁)。59.6％(51/87)的对象为男性，并且65.5％(57/87)为白人。从移植至血液样品的平均时间为4.8+/-4.2年。

在选择性冠脉造影之前24小时内收集了116个血液样品。其中有12个表现出如由2010ISHLT分级系统所定义的移植物血管病，而104个未表现出移植物血管病。总结了血管造影相关样品中供体特异性cf-DNA分数的比较。与CAV无关的样品的平均供体特异性分数为0.09％(IQR 0.06-0.20％)，并且与CAV相关的样品的平均供体特异性分数为0.52％(IQR0.33-0.88％)(p＝0.029)。排除CAV的经验最优临界点为0.19％[95％CI 0.09-0.38％(p＜0.001)]。

作为另一个实例，在选择性冠脉造影之前的24小时内收集了116个血液样品。其中有11个表现出如由2010ISHLT分级系统(Mehra et al.，J Heart Lung Transplant 29，717-727(2010))所定义的移植物血管病，而99个未表现出移植物血管病。表29中总结了血管造影相关样品之间供体特异性cf-DNA分数的比较。

使用MOMA，具有供体基因型，与CAV无关的样品的平均供体分数为0.09％(IQR0.06-0.20％)，并且与CAV相关的样品的平均供体分数为0.47％(IQR 0.27-0.71％)(p＝0.05)(Mehra，M.R.，et al.International Society for Heart and LungTransplantation working formulation of a standardized nomenclature forcardiac allograft vasculopathy-2010.J Heart Lung Transplant 29，717-727(2010)。排除CAV的经验最优临界点为0.19％[95％CI 0.09-0.38％(p＜0.001)]。

没有供体基因型，与CAV无关的样品的平均供体分数为0.27％(IQR 0.16-0.54％)，并且与CAV相关的样品的平均供体分数为0.55％(IQR 0.38-1.22％)(p＝0.057)。排除CAV的经验最优临界点为0.37％[95％CI 0.24-0.57％(p＜0.001)]。

在另一项分析中，在选择性冠脉造影之前的24小时内，从66位对象中采集了116个血液样品。11个样品表现出心脏同种异体移植物血管病(CAV)(7个1级，2个2级和3个3级)，而105个样品未表现出CAV。使用方法1(具有已知供体基因型)，与CAV无关的样品的DF为0.09％(IQR：0.06％至0.20％)，并且与CAV相关的样品的DF为0.47％(IQR：0.27％至0.71％)(p＝0.05)。使用方法2(具有未知供体基因型)，与CAV无关的样品的DF为0.27％(IQR：0.16％至0.52％)，并且与CAV相关的样品的DF为0.55％(IQR：0.38％至1.22％)(p＝0.057)。

表29.供体分数和冠状动脉移植物血管病

急性细胞排斥

在另一项分析中，获得了来自心内膜心肌活检(EMB)之前的88位对象的血液样品。供体分数(DF)报告为总循环接受者cfDNA的百分比。血液样品时的平均年龄为12.7±8.1岁(范围0.1至30.2岁)。基本心脏诊断为心肌病42.0％，且先天性心脏病56.8％。共有59.0％的对象为男性，并且69.3％(88位对象中的61位)为白种人(Caucasian)。在158个与活检相关的样品(其中148个为无症状监测活检)中，134个与细胞排斥等级0(CR0)相关，21个与细胞排斥等级1(CR1)相关，3个与细胞排斥等级2(CR2)相关，而0与细胞排斥等级3(CR3)相关。

使用方法1(具有已知供体基因型)，在排斥等级之间DF升高：在与CR0相关的样品中为0.11％(四分位距(interquartile range)[IQR]：0.06％至0.21％)，在与CR1相关的样品中为0.37％(IQR：0.15％至0.72％)，并且在与CR2相关的样品中为0.97％(IQR：0.88％至1.06％)。将CR0(0.11％；IQR：0.06％至0.21％)与CR1或CR2(0.48％；IQR：0.19％至0.89％)进行比较，p＝0.02。

使用方法2(具有未知供体基因型)，在排斥等级之间DF也升高：在与CR0相关的样品中为0.25％(IQR：0.17％至0.39％)，在与CR1相关的样品中为0.89％(IQR：0.44％至5.35％)，并且在与CR2相关的样品中为1.22％(IQR：1.04％至5.18％)。将CR0(0.25％；IQR：0.19％至0.39％)与CR1或CR2(1.05％；IQR：0.47％至5.26％)进行比较，p＜0.001。确定了具有最优临界点的接受者工作特性曲线，并在图69中示出。

特定临界点处急性细胞排斥与心脏同种异体移植物血管病的相关性

分析了在特定DF临界点处与急性细胞排斥和心脏同种异体移植物血管病的相关性(表30)。通过方法1(具有已知供体基因型)以DF临界点为0.2％对所有140个样品进行分析，并将CR0与CR1和CR2进行比较(p＝0.0022)。通过方法2(具有未知供体基因型)以DF临界点为0.2％对所有158个样品进行分析，并将CR0与CR1和CR2进行比较(p＝0.0141)。使用方法1(具有已知供体基因型)分析DF临界点为0.2％的与血管造影术相关的102个样品；7个样品对于CAV为真阳性，1个样品为假阴性，70个为真阴性，并且24个为假阳性(p＜0.001)。使用方法2(具有未知供体基因型)以DF临界点为0.2％对116个样品进行了分析，11个样品对于CAV为真阳性，0个为假阴性，38个为真阴性，并且67个为假阳性(p＝0.015)。

表30.在两个特定的临界点(0.2％和0.8％)处DF cfDNA与细胞排斥(CR)和心脏同种异体移植物血管病(CAV)的相关性

结论

发现使用靶向的高通量测定来进行供体特异性cf-DNA的量化对于心脏移植接受者中的监测和对于排除心脏移植接受者中急性细胞排斥的存在具有极高的灵敏度。从CR0到CR1到CR2相关活检，DF升高，表明其检测供体器官的进行性损伤的能力。另外，供体特异性分数的显著升高与显著的同种异体移植物损伤(包括冠状动脉移植物血管病形式的急性发作性排斥和慢性排斥)相关。这些发现表明，在临床实践中可精确量化DF，并且两种测定方法(具有已知或未知供体基因型)之间观察到的结果相似性表明，即使当供体DNA对于基因型分型不可用时，也可保持量化的准确性。

实施例10-供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)与抗体介导的排斥的相关性

使用MOMA对移植接受者的供体特异性cf-DNA(n＝142)进行量化。如图32所示，通过实验确定了0级以及1级和2级抗体介导的排斥的阈值(“临界点”)值。

在图33-38中示出了阈值(临界点)确定的另一些实例。图33和36示出了在供体基因型已知(图33)和未知(图36)的情况下使用214个样品确定阈值。在排除使用机械支持的群体的情况下分析了相同的样品，并且结果示出在图34和37中。仅检查来自每位对象的最后样品(n＝79)产生的临界点为：当供体基因型已知时为0.25(图35)，并且当供体基因型未知时为0.16(图38)。

在另一个实例中，当供体基因型已知时，与等级pAMR0相关的样品的平均供体特异性分数为0.12％(IQR 0.07-0.29％)，并且对于与等级pAMR1或2相关的样品为0.26％(IQR0.09-0.33％)(p＝0.905)。当供体基因型未知时，与等级pAMR0相关的样品的平均供体分数为0.29％(IQR 0.18-0.61％)，并且对于与等级pAMR1或2相关的样品为0.39(IQR 0.12-0.44％)(p＝0.969)。基于相关的ROC曲线，对于排除pAMR1或2的经验最优临界点为0.38％[95％CI0.19-0.74％(p＝0.005)]。

表31.供体分数和抗体介导的排斥

实施例11-心内膜心肌活检引起可量化的细胞损伤

在监测活检(bx)之前和之后抽取来自21名无症状患者的配对血液样品。使用myTAI-HEART^TM测试(来自TAI Diagnostics，Wauwatosa，WI的专有定量基因型分型测定)确定定量DF cfDNA。除具有已知移植物血管病、癌症、机械循环支持或任何等级＞1的细胞排斥的患者外，可获得17个样品对。记录和分析活检力大小(Bioptome size)和采集的bx样品的数量。

供体分数(DF)从bx之前0.02％到bx之后11.1％不等，中位数为0.43％。bx之后DF持续升高，中位数升高8.2×(范围1.5×-213×)。患者年龄为4至32岁(中位数12岁)。患者体重为17至90kg(中位数49kg)。年龄和体重两者与DF变化独立相关(p＜0.01)。16岁或以下的pts的平均DF升高24×，对比于24岁或高于24岁的pts的平均DF升高2.7×。年龄和体重是相关的，因此在抽血时体重产生类似的效果。DF的变化与活检力大小无关(p＝0.4)。bx与第二次抽血之间的时间为1至36分钟，并且与DF升高无关。在bx之后不久抽取的样品具有比更加延迟的样品更剧烈的DF升高，符合cfDNA的短半衰期；最快的5个(平均2分钟)的平均DF升高为19.8×，而最迟的5个(平均7.6分钟)的DF仅升高4.1×。初始DF指示bx之前的器官健康。活检之前具有升高的DF(＞0.9％)的患者在bx之后看到较少DF升高(p＜0.01)。数据在图55中示出。

在另一项分析中，将ds-cfDNA的量报告为供体基因组当量(GE)，并且为从活检之前的1.9(中位数，12)到活检之后的1200(中位数，136)。在图56中示出了配对样品。ds-cfDNA的GE在所有患者中在活检之后均升高(p＜0.02)，中位数升高8.2×(范围0.34×至345×)。患者年龄为4至32岁(中位数，12岁)。患者体重范围为17至90kg(中位数，49kg)。年龄和体重均与GE变化有关(p＜0.01)。小于17岁的患者的GE平均升高29×，相比之下大于23岁的患者的平均GE升高为1.1×。发现年龄和体重是相关的，因此在抽血时体重观察到类似的效果。GE变化与活检力大小无关(p＝4)。活检与第二次抽血之间的时间为1至36分钟，并且延长的时间与升高的总无细胞DNA相关(p＝0.037)。GE中最初的ds-cfDNA指示活检之前的器官健康。活检之前具有升高的GE(＞20，n＝4)的患者在活检之后看到更低的GE升高(p＜0.01)。

发现标准心内膜心肌活检对移植心脏造成显著且可测量的损伤，这受患者体型和ds-cfDNA的活检之前水平的强烈影响。活检与血液样品之间的较长时间与升高的总无细胞DNA相关。这证明了ds-cfDNA作为心脏损伤标志物的灵敏性。

Claims (89)

1.评估来自移植对象的样品的方法，所述方法包括：

(a)确定来自所述对象的样品中供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)的量，其中所述对象具有或被怀疑具有例如CR1、CR2或更低、CR1或更高、或者CR2或更高的细胞排斥等级；以及

(b)报告和/或记录DS cf-DNA的量。

2.权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括：

(c)将DS cf-DNA的量与阈值DS cf-DNA或至少一个先前的DS-cf-DNA值进行比较。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括：

(d)基于与所述阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量相比较的所确定的DS cf-DNA量，为所述对象分配细胞排斥等级，或分配为处于升高的风险中。

4.评估移植对象的方法，所述方法包括：

(a)获得来自所述对象的样品中供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)的量，其中所述对象具有或被怀疑具有例如CR1、CR2或更低、CR1或更高、或者CR2或更高的细胞排斥等级；

(b)将DS cf-DNA的量与阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量进行比较；以及

(c)基于与所述阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量相比较的所确定的DS cf-DNA量为所述对象确定治疗或监测方案。

5.权利要求4所述的方法，其中所述方法还包括基于与所述阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量相比较的所确定的DS cf-DNA量，为所述对象分配细胞排斥等级。

6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对象具有或被怀疑具有例如CR0或CR1或者例如CR2或CR3的细胞排斥等级。

7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对象已被确定为具有例如CR1、CR2或更低、CR1或更高、或者CR2或更高的细胞排斥等级。

8.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对象已被确定为具有例如CR0或CR1或者例如CR2或CR3的细胞排斥等级。

9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中在用于评估所述对象中的移植排斥之前已经利用一个或更多个另外的测试将所述对象确定为具有所述细胞排斥等级，或者所述方法还包括进行一个或更多个另外的测试以评估所述对象中的移植排斥。

10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阈值为0.2。

11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阈值为0.3。

12.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阈值为0.8。

13.前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果DS cf-DNA的量小于0.14、0.15或0.2，则为所述对象分配CR0的细胞排斥等级。

14.前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果DS cf-DNA的量大于0.14、0.15或0.2或者为0.14至0.8、0.15至0.8或0.2至0.8，则为所述对象分配CR1的细胞排斥等级。

15.前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果DS cf-DNA的量分别为0.8或更大，则分别为所述对象分配CR2或更高的细胞排斥等级。

16.前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果DS cf-DNA的量为0.14至0.5、0.15至0.5、0.2至0.5或者0.3至0.5，则指示进行一个或更多个另外的测试。

17.评估来自移植对象的样品的方法，所述方法包括：

(a)确定来自所述对象的样品中供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)的量，其中所述对象患有、被怀疑患有、已经患有、或有风险患所移植器官的病症或疾病；以及

(b)报告和/或记录DS cf-DNA的量。

18.权利要求17所述的方法，其中所述方法还包括：

(c)将DS cf-DNA的量与阈值DS cf-DNA值或至少一个先前的DS-cf-DNA值进行比较。

19.权利要求17或18所述的方法，其中基于与所述阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量相比较的所确定的DS cf-DNA量，指示所述病症或疾病，或者所述对象处于升高的风险中。

20.评估移植对象的方法，所述方法包括：

(a)获得来自所述对象的样品中供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)的量，其中所述对象患有、被怀疑患有、已经患有、或有风险患所移植器官的病症或疾病；

(b)将DS cf-DNA的量与阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量进行比较；以及

(c)基于与所述阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量相比较的所确定的DS cf-DNA量为所述对象确定治疗或监测方案。

21.权利要求20所述的方法，其中基于与所述阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量相比较的所确定的DS cf-DNA量，指示所述病症或疾病，或者所述对象处于升高的风险中。

22.权利要求17至21中任一项所述的方法，其中所述对象患有、被怀疑患有、已经患有、或有风险患心脏同种异体移植物血管病。

23.权利要求17至22中任一项所述的方法，其中所述对象已经患有或有风险患心脏停搏。

24.权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述对象已经被确定患有心脏同种异体移植物血管病或已经患有心脏停搏。

25.权利要求17至24中任一项所述的方法，其中在用于评估所述对象之前已经利用一个或更多个另外的测试将所述对象确定为患有心脏同种异体移植物血管病，或者所述方法还包括进行一个或更多个另外的测试以对所述对象进行评估。

26.权利要求17至25中任一项所述的方法，其中所述阈值为0.2或0.3。

27.权利要求17至26中任一项所述的方法，其中如果DS cf-DNA的量等于或大于0.2或0.3，则指示心脏移植物血管病或指示心脏停搏的风险。

28.评估来自移植对象的样品的方法，所述方法包括：

(a)确定来自所述对象的样品中供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)的量，其中所述对象患有或被怀疑患有抗体介导的排斥；以及

(b)报告和/或记录DS cf-DNA的量。

29.权利要求28所述的方法，其中所述方法还包括：

(c)将DS cf-DNA的量与阈值DS cf-DNA值或至少一个先前的DS-cf-DNA值进行比较。

30.权利要求28或29所述的方法，其中所述方法还包括：

(d)基于与所述阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量相比较的所确定的DS cf-DNA量，将所述对象分类为患有抗体介导的排斥，或者处于升高的风险中。

31.评估移植对象的方法，所述方法包括：

(a)获得来自所述对象的样品中供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)的量，其中所述对象患有或被怀疑患有抗体介导的排斥；

(b)将DS cf-DNA的量与阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量进行比较；以及

(c)基于与所述阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量相比较的所确定的DS cf-DNA量为所述对象确定治疗或监测方案。

32.权利要求31所述的方法，其中所述方法还包括基于与所述阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量相比较的所确定的DS cf-DNA量，将所述对象分类为患有抗体介导的排斥，或者处于升高的风险中。

33.权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述对象已被确定为患有抗体介导的排斥。

34.权利要求28至33中任一项所述的方法，其中在用于评估所述对象中的移植排斥之前已经利用一个或更多个另外的测试将所述对象确定为患有抗体介导的排斥，或者所述方法还包括进行一个或更多个另外的测试以对所述对象进行评估。

35.权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述阈值为0.2。

36.权利要求28至35中任一项所述的方法，其中如果DS cf-DNA的量大于0.2，则所述对象患有抗体介导的排斥。

37.评估来自移植对象的样品的方法，所述方法包括：

(a)确定来自所述对象的样品中供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)的量，其中所述对象患有或被怀疑患有移植器官损伤，以及

(b)报告和/或记录DS cf-DNA的量。

38.权利要求37所述的方法，其中所述方法还包括：

(c)将DS cf-DNA的量与阈值DS cf-DNA值或至少一个先前的DS-cf-DNA值进行比较。

39.权利要求37或38所述的方法，其中所述方法还包括：

(d)基于与所述阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量相比较的所确定的DS cf-DNA量，确定所述对象是否患有移植器官损伤，或者确定为处于升高的风险中。

40.权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述对象小于24岁。

41.权利要求40所述的方法，其中所述对象小于16岁。

42.权利要求37至41中任一项所述的方法，其中所述对象的体重小于30kg。

43.权利要求42所述的方法，其中所述对象的体重小于20kg。

44.评估移植对象的方法，所述方法包括：

(a)获得来自所述对象的样品中供体特异性无细胞DNA(DS cf-DNA)的量，其中所述对象患有或被怀疑患有移植器官损伤；

(b)将DS cf-DNA的量与阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量进行比较；以及

(c)基于与所述阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量相比较的所确定的DS cf-DNA量为所述对象确定治疗或监测方案。

45.权利要求44所述的方法，其中所述方法还包括基于与所述阈值DS cf-DNA值和/或至少一个先前的DS cf-DNA量相比较的所确定的DS cf-DNA量，确定所述对象是否患有移植器官损伤，或者确定为处于升高的风险中。

46.权利要求44或45所述的方法，其中所述对象小于24岁。

47.权利要求46所述的方法，其中所述对象小于16岁。

48.权利要求44至47中任一项所述的方法，其中所述对象的体重小于30kg。

49.权利要求48所述的方法，其中所述对象的体重小于20kg。

50.权利要求37至49中任一项所述的方法，其中在移植器官损伤之后1、5、10或15分钟从所述对象采集的样品中确定至少一个量。

51.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个另外的测试包含活检。

52.权利要求51所述的方法，其中所述活检是心内膜心肌活检(EMB)。

53.前述权利要求中任一项所述的方法，其中在报告中提供所述量。

54.权利要求53所述的方法，其中在报告中提供所述量，所述报告还包含来自所述对象的样品中的至少一个先前的DS-cfDNA量。

55.前述权利要求中任一项所述的方法，其中在数据库中记录所述量。

56.权利要求55所述的方法，其中所述数据库还包含来自所述对象的样品中的至少一个先前的DS cf-DNA量。

57.前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过以下确定或获得DS cf-DNA的量：

(a)对于多种单核苷酸变体(SNV)靶标，用至少两种引物对对所述样品或其一部分进行基于扩增的定量测定，例如聚合酶链式反应(PCR)定量测定，其中每种引物对包含正向引物和反向引物，其中所述至少两种引物对中的一种在引物中包含相对于所述SNV靶标的一种等位基因的3’倒数第二位错配，但是包含相对于所述SNV靶标的另一种等位基因的3’双错配，并且特异性扩增所述SNV靶标的所述一种等位基因，并且所述至少两种引物对中的另一种特异性扩增所述SNV靶标的另一种等位基因，以及(b)基于结果评估DS cf-DNA的量。

58.权利要求57所述的方法，其中所述供体的基因型是已知的。

59.权利要求57所述的方法，其中所述供体的基因型是未知的。

60.权利要求1至56中任一项的方法，其中通过以下确定或获得DS cf-DNA的量：

(a)确定多个基因座中每一个的等位基因；

(b)基于对所述等位基因的确定，从所述多个基因座中选择至少一个信息性基因座；

(c)鉴定多个基因座，该核酸包含所述对象的第一核酸和非所述对象天然的第二核酸；

(d)使用统计分布计算在所述至少一个信息性基因座处第一等位基因的估计的等位基因频率；以及

(e)基于所述估计的等位基因频率确定DS cf-DNA的量。

61.权利要求60所述的方法，其中所述供体的基因型是已知的。

62.权利要求60所述的方法，其中所述供体的基因型是未知的。

63.前述权利要求中任一项所述的方法，其中在器官移植之后第4、5、6、7或8天从所述对象采集的样品中确定至少一个量。

64.前述权利要求中任一项所述的方法，其中大于所述阈值和/或相对于来自较早时间点的量升高的DS cf-DNA的量代表升高的或正在升高的风险。

65.前述权利要求中任一项所述的方法，其中小于所述阈值和/或相对于来自较早时间点的量降低的DS cf-DNA的量代表降低的或正在降低的风险。

66.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述确定监测方案包括确定所述对象中随时间或在随后的时间点的DS cf-DNA的量，或向所述对象建议这样的监测。

67.权利要求66所述的方法，其中每天或每周对所述对象进行评估。

68.权利要求66所述的方法，其中每月或每两个月对所述对象进行评估。

69.前述权利要求中任一项所述的方法，其中评估所述对象长至6个月、长至8个月、长至10个月或长至一年。

70.前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果DS cf-DNA的量相对于所述阈值或来自较早时间点的量升高，则缩短样品之间的时间。

71.前述权利要求中任一项所述的方法，其中记录或报告DS cf-DNA的另外的量。

72.权利要求71所述的方法，其中在报告中提供所述另外的量。

73.权利要求71或72所述的方法，其中在数据库中记录所述另外的量。

74.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述确定监测方案包括使用或建议使用一个或更多个另外的测试以评估所述对象中的移植排斥。

75.权利要求74所述的方法，其中所述一个或更多个另外的测试包含活检。

76.权利要求75所述的方法，其中所述活检是心内膜心肌活检(EMB)。

77.前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果DS cf-DNA的量等于或大于本文中提供的任一阈值，则指示进行所述一个或更多个另外的测试。

78.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述确定治疗方案包括选择或建议用于所述对象的治疗。

79.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述确定治疗方案包括治疗所述对象。

80.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗包括抗排斥治疗。

81.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述治疗包括用于心脏同种异体移植物血管病的治疗，例如再移植、经皮冠脉介入术(PCI)、冠状动脉旁路移植术(CABG)、激光心肌血运重建术或肝素诱导/介导的体外LDL血浆去除术(HELP)。

82.前述权利要求中任一项所述的方法，其中当指示心脏同种异体移植物血管病时，所述治疗包括用他汀类、抗高血压剂或抗巨细胞病毒(抗CMV)剂进行治疗。

83.权利要求82所述的方法，所述抗高血压剂是钙通道阻滞剂。

84.前述权利要求中任一项所述的方法，其中当指示升高的心脏停搏风险时，所述治疗包括用于心脏停搏的治疗，例如经皮冠脉介入术(冠脉血管成形术)、冠状动脉旁路移植术或添加植入型心律转复除颤器(ICD)。

85.前述权利要求中任一项所述的方法，其中当指示升高的心脏停搏风险时，所述治疗包括抗心律失常剂、不随意神经系统阻断剂或血压药物。

86.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述确定治疗方案包括向所述对象提供关于治疗的信息。

87.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是血液、血浆或血清样品。

88.权利要求87所述的方法，其中所述血液样品是血浆样品。

89.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述移植对象是心脏移植对象。

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