JP2020525766A - パルスフィールド多重化キャピラリ電気泳動システム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体の内容が引用することにより本明細書の一部をなす、2015年12月30日に出願された米国特許出願第14/984,039号の一部継続出願である。
本明細書において、用語「印加波形(applied waveforms)」は、「印加電界(applied electric fields)」と等価である。少なくとも2つのキャピラリにわたって変動するパルスフィールド波形を印加することは、少なくとも2つのキャピラリにわたってパルス電界を印加することと同一である。
この実施例のために、パルスフィールドキャピラリ電気泳動ゲル「930ゲル」(Advanced Analytical Technology社から入手可能)を使用した。「930ゲル」ふるい分けマトリクスを、本明細書で述べるキャピラリ電気泳動システムを使用して、22cmの有効長及び40cmの全体長(50μmI.D.)を有する、複数の12本のキャピラリ内に圧送した。10.06kB、17.7kB、21.2kB、23.45kB、41.77kB、50.31kB、及び165.65kBのサイズを有するDNAフラグメントから構成される7GT DNAサイジングラダー(Wako Chemical Company社から入手可能)(図16A)を、キャピラリ電気泳動システムに関する分離効率を評価するために使用した。1X TEバッファ内の7GTラダーの150pg/μLのサンプルを、分析のためのサンプルとして調製した。サンプルの注入前に、1秒間、2.0kVを印加することによって、ゲル充填キャピラリを電気泳動前処理によって処理した。7GTラダーサンプルを、5秒間の5kVの動電学的注入を使用してキャピラリ電気泳動システム(本発明)に注入した。この直後に、3600秒間の7.2kVの一定印加電圧を使用した電気泳動処理を行った。結果として得られるエレクトロフェログラムが図16Bに示される。これは、従来技術の一定フィールドキャピラリ電気泳動システムについての最良事例の分離を示す。次に、本発明のキャピラリ電気泳動システムを使用するが、5Hz矩形波を有する+1.8kV/−7.2kVのパルスフィールド印加電圧によって、同じサンプル(同じ注入、同じ濃度)を再分析した。12本のキャピラリシステムについての結果として得られるエレクトロフェログラムのセットは図16Cに示される。全ての分析(一定フィールド及びパルスフィールドの両方)についての周囲温度は約23℃であった。パルスフィールドによる分離(図16C)は、遥かに良好なベースライン分解されたエレクトロフェログラムを示し、ラダー要素の7つ全てが、単一の融合したピークを示す、従来技術の一定フィールドを使用する分離(図15)に比べて明瞭に見ることができる。
この実施例のために、パルスフィールドキャピラリ電気泳動ゲル「FP5001 Large DNA Separationゲル」(Advanced Analytical Technology社から入手可能)を使用した。「FP5001 Large DNA Separationゲル」ふるい分けマトリクスを、本明細書で述べるキャピラリ電気泳動システムを使用して、22cmの有効長及び40cmの全体長(50μmI.D.)を有する、複数の12のキャピラリ内に圧送した。10.06kB、17.7kB、21.2kB、23.45kB、41.77kB、50.31kB、及び165.65kBのサイズを有するDNAフラグメントから構成される7GT DNAサイジングラダー(Wako Chemical Company社から入手可能)(図16A)を、キャピラリ電気泳動システムに関する分離効率を評価するために使用した。1X TEバッファ内の7GTラダーの150pg/μLのサンプルを、0.25X Tris−EDTAバッファによる分析のためのサンプルとして調製した。サンプルの注入前に、1秒間、2.0kVを印加することによって、ゲル充填キャピラリを電気泳動前処理によって処理した。7GTラダーサンプルを、5秒間の−5kVの動電学的注入を使用してキャピラリ電気泳動システム(本発明)に注入した。この直後に、2つの異なる条件を使用した電気泳動処理を行った。図17A(上部トレース1704)は、30秒の期間にわたって線形的に変動した、2Hz〜7Hzの周波数を有する三角波(+2.0kV〜−7.2kV)と、それに続く、30秒の期間にわたって線形的に変動した、2Hz〜7Hzの周波数を有する矩形波(+2.0kV〜−7.2kV)とで構成される印加電圧を使用して取得された。三角波(30秒)と、それに続く矩形波(30秒)とを、100分の総処理時間の間、100回反復した。図17A(下部トレース1705)は、30秒の期間にわたって線形的に変動した、2Hz〜7Hzの周波数を有する矩形波(+2.0kV〜−7.2kV)で構成される印加電圧を使用して取得された。矩形波(30秒)を、100分の総処理時間の間、200回反復した。7GTラダートレースの場合、フラグメント分離は、上部トレース及び下部トレースの両方について同様であった。これは、反復した三角/矩形波の印加(図17A上部トレース)が、反復なしの純粋な矩形波方法(図17A下部トレース)と比較して7GTフラグメントの分離に実質的に影響を及ぼさなかったことを示している。
Claims (15)
- 少なくとも2本のキャピラリにわたって電界を印加する方法であって、
第1の期間の間、前記キャピラリにわたって第1の周波数で第1のパルスフィールド波を印加することと、
第2の期間の間、前記キャピラリにわたって第2の周波数で少なくとも異なる形状の第2のパルスフィールド波を印加することと、その後、前記第1のパルスフィールド波及び少なくとも前記第2のパルスフィールド波を少なくとも2回繰り返すことと、
を含む、方法。 - 前記第1の周波数は前記第1の期間内で時間とともに変動し、前記第2の周波数は前記第2の期間内で時間とともに変動する、請求項1に記載の方法。
- 前記第1のパルスフィールド波及び前記第2のパルスフィールド波は、矩形波、三角波、正弦波、及び鋸歯状波の群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の期間及び前記第2の期間は各々10分未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の期間及び前記第2の期間は各々5分未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の期間及び前記第2の期間は各々1分未満である、請求項1に記載の方法。
- 蛍光又は吸光検出によって前記キャピラリの窓内のサンプルを検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 2本のキャピラリにわたって電界を印加する方法であって、
第1の期間の間、前記キャピラリにわたって第1の周波数で第1のパルスフィールド波を印加することと、
第2の期間の間、前記キャピラリにわたって第2の周波数で異なる形状の第2のパルスフィールド波を印加することと、
第3の期間の間、第3の周波数で少なくとも異なる形状の第3のパルスフィールド波を印加することと、その後、前記第1のパルスフィールド波、前記第2のパルスフィールド波、及び少なくとも前記第3のパルスフィールド波の印加を繰り返すことと、
を含む、方法。 - 前記第1の周波数は前記第1の期間内で時間とともに変動し、前記第2の周波数は前記第2の期間内で時間とともに変動し、前記第3の周波数は前記第3の期間内で時間とともに変動する、請求項8に記載の方法。
- 前記第1のパルスフィールド波及び前記第2のパルスフィールド波は、矩形波、三角波、正弦波、及び鋸歯状波の群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記第1の期間及び前記第2の期間は各々10分未満である、請求項8に記載の方法。
- 前記第1の期間及び前記第2の期間は各々5分未満である、請求項8に記載の方法。
- 前記第1の期間及び前記第2の期間は各々1分未満である、請求項8に記載の方法。
- 前記第1の周波数、前記第2の周波数、及び前記第3の周波数は、2Hz〜15Hzの範囲内で変動する、請求項8に記載の方法。
- 蛍光又は吸光検出によって前記キャピラリの窓内のサンプルを検出することを含む、請求項8に記載の方法。
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