JP2020524507A - 増殖細胞のための支持的ナノフィブリルセルロース足場 - Google Patents
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-
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-
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Abstract
Description
a.aNFCを提供すること、及び
b.前記aNFCを水と混合すること、を含む。
本発明の観点は、細胞培養組成物、3D細胞培養エンティティー(entities)、並びに細胞培養中でそれを製造及び使用する方法に関連する。特定しない限り、本明細書と特許請求の範囲の中で使用される用語は、細胞培養において一般的に使用される意味を有する。具体的に下記の用語は以下に示す意味を有する。
アニオン性ポリマーがニューロン細胞に支持的な効果を誘導するかもしれないことは、過去に報告された。本発明者らは、aNFCで作られたヒドロゲルは、増殖細胞の伸展と生育を支持するのにより適切であることを見出した。一例として、本発明者らは、ヒトニューロン細胞を培養してニューロンネットワークを形成した。aNFCヒドロゲルはニューロン細胞、特に単一細胞の神経突起の伸長を支持するのに良好であった。先行技術のヒドロゲルとの比較におけるこの改良は、2つのヒドロゲルの改良に基づいている:1)ナノフィブリルセルロースの表面上のアニオン性荷電は、ヒドロゲル中での細胞運動を誘導した(なぜならば細胞はフィブリル中の荷電基を感知し且つ伸長したフィブリルに沿って/向かって伸展する傾向があるからである)、及び2)アニオン性ヒドロゲルのゲル強度は、天然のグレードと比較してより高い(なぜならばフィブリル径とサイズが小さくなる程、同じ固体含有量におけるナノフィブリルの数はより多くなるからである)。よってより低いフィブリル濃度において細胞培養を行うことができる。フィブリルは運動を妨害しないので、固体含有量がより低いことは、ヒドロゲル中での細胞のより自由な運動を可能とする。aNFCの最適な固体含有量は0.5重量%未満、有利には0.4重量%未満である。
材料及び方法
ナノフィブリルセルロースに基づいたヒドロゲル内にカプセル封入されたヒトニューロン細胞を2週間培養した。実験に使用された細胞は、ヒト胚性幹細胞株Regea08/023から予め分化した(pre-differentiated)ヒトニューロンであった(Lappalainenら 2010;Yla-Outinenら 2014)。要するに、約3000個の細胞を含んでいるhESC塊を6ウェルの超低付着性プレート(ヌンク、サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ロチェスター、ニューヨーク州、USA)中に移し、1:1のDMEM培地(DMEMedium)/F12(ギブコ、インビトロゲン、フィンランド)及びニューロベーサル培地を含み、2mMのGlutaMax(商標)、1×B27、1×N2(ギブコ)、20ng/mlの線維芽細胞成長因子(bFGF、R&Dシステム、ミネアポリス、ミネソタ州、USA)及び25U/mlのペニシリン/ストレプトマイシン(キャンブレックス、ベルギー)を添加したニューロン分化培地中で、浮遊凝集体、ニューロスフェアとして細胞を培養することにより、hESCからニューロン細胞への分化を行った。培地を週に3回交換し、スフェアを週に1回機械的に分解した。ニューロスフェアを8週間培養し、純粋なニューロンの集団を得た。
フィブリル化のための工業用流動化装置を用いて、高圧ホモジナイゼーションにより、漂白されたセルロースパルプからaNFCを調製した。原材料をパルプミルから無菌的に収集し、滅菌した機械によりホモジナイゼーションを行う前に完全に精製した。よって全製造工程を通じて微生物上の純度は維持された。精製されたものをフィブリル化の前にアニオン性に改質した。アニオン性の改質は、セルロースパルプの酸化に基づいている。改質によって、セルロースパルプはセルロースナノフィブリルに容易に分解する。また不安定化反応(labilization reaction)はaNFC上にアルデヒドとカルボン酸の官能性をもたらし、それによって材料の疎水性が増加した。国際公開第09/084566号公報と日本特許出願20070340371号公報はそのような改質を開示している。化学的改質の後に酸化したセルロースパルプを完全に精製した。フィブリル化前に、精製したフィブリルを滅菌した超高品質水で希釈した。得られるヒドロゲルのNFC濃度は典型的には1〜2重量%である。NFCヒドロゲルを、フィブリル化の後に直接オートクレーブ処理(121℃/20分)した。
細胞培養実験の前に、浸透圧環境のバランスをとるために、ヒドロゲル材料を細胞培養培地の存在下で5時間、室温でインキュベートした。ヒドロゲルの500μl〜1mlの一定量を、丸い底を有する2mlのエッペンドルフチューブ中にピペット採取した。1mlの細胞培養培地を、ヒドロゲルの最上部にゆっくりと添加した。インキュベーションした後にチューブを遠心分離し(5分、1500rpm)、最上部の過剰な培地(〜1ml)を除去した。
予め分化したニューロスフェアをエッペンドルフチューブに採取し、細胞培養培地を除去した。Tryple Select(インビトロゲン、12563−011)を使用して細胞を酵素的に解離し、小さな細胞凝集体と単一細胞を有する懸濁液を形成した。懸濁液中の細胞の量と生存を、トリパンブルー(1:1)と共にCountess−cell counter(インビトロゲン)を使用して計算した。使用された細胞密度は、ヒドロゲル1ml当たり500万細胞であった。細胞懸濁液の計算量をエッペンドルフチューブにピペッティングし、遠心分離を行い(5分、1500rpm)、細胞培養培地を除去した。細胞ペレットを50μlの新鮮な細胞培養培地に再懸濁し、ヒドロゲル(750μl)の内部に小さな液滴としてピペッティングした。ゆっくりと上下にピペッティングすることにより細胞をヒトロゲルと混合するのみならず、混合液が均質に見えるまでピペットのチップで攪拌した。その後に混合液を96ウェルプレートに一定量を分注した(aliquoted to)。150μlの細胞培養液を培養物の最上部に添加した。
ヒトロゲル内にカプセル封入し細胞を2週間培養した。使用された培養培地は、DMEM/F12:ニューロベーサル培地を1:1で含み、2mMのGlutaMax(商標)、1×B27、1×N2、及び25U/mlのペニシリン/ストレプトマイシンを添加した、ニューロン分化培地(NMD)であった。100μlの細胞培養培地を週に3回交換した。培養液を位相差顕微鏡によりモニターした。細胞培養の間のヒドロゲルの安定性を目視により評価した。共焦点画像化のための培養を、No.1.5のガラスの底部、部品番号P96G−1.5−5−Fを有するMatTek96ウェルプレート内で行った。
免疫細胞化学的解析は、過去に公表された(Koivistoら 2017)通りに行った。使用された一次抗体は、抗微小管関連タンパク質2(MAP2)(AB5622、メルク ミリポア、ドイツ)とモノクローナル抗−β−チューブリンIII抗体(T8660、シグマ−アルドリッチ、フィンランド株式会社、フィンランド)であった。染色した後に、4倍の対物レンズを有するオリンパスDP30BWデジタルカメラ(オリンパス株式会社、日本)を有するオリンパスIX51倒立顕微鏡により、培養液を画像化した。グレイスケールの画像を、Adobe Photoshop CS4(バージョン11、アドビシステムズ株式会社、カリフォルニア州)を使用して加工した。
実験の総括
試料調製、ヒドロゲル希釈、細胞播種、及び細胞培養は、研究した両方のヒドロゲル(Grwodex及びaNFC)において成功した。試験された全てのヒドロゲルは2週間ニューロンの生存と成長を支持した。ある程度のゲルの損失は生じたが、画像化のための試料調製も成功した。研究した両方のヒドロゲルは蛍光画像において良好な視覚特性を有し、透明性のおかげでaNFCヒドロゲルは位相差画像化にも非常に適していた。
Growdexヒドロゲルの取り扱いは、我々の過去の実験(先にUPMに報告した)と非常に類似していた。Growdexの材料はヒペッティングして試料を均質に混合することにやや困難性がある。1mlのローリテンション・ピペットチップならば、取り扱いは容易となった。細胞懸濁液を液滴としてヒドロゲルの内側にピペットするという指示の提供も、試料の均質性に有利な影響を有した。
ニューロンネットワークの形成を、ニューロンマーカーに対する免疫細胞化学染色により、2週間の培養期間の後に評価した。低い倍率の対物レンズを有する広視野蛍光顕微鏡を使用して、試料を画像化した。目に見える神経突起(図1)の量に従って培養物を3つのカテゴリー:良好、中程度、及び貧弱な神経突起成長、に分類した。貧弱な神経突起の伸長のみが観察された場合においても、全ての試料中の細胞の生存は良好であった(視覚解析)。
1.aNFCの最も低い濃度(0.30%)は、ヒトニューロン細胞のための最良の組成であった。
2.ニューロンネットワークの形成は、より少ない試料容量(60μl)おいてより安定であった。
細胞間ネットワークをより詳細に可視化するために、共焦点画像化を使用した。研究された全ての材料は共焦点解析に適合しており、バックグラウンド又は自家蛍光の問題は生じなかった。少量の試料において抗体の洗浄は不完全であり、それはヒドロゲル中の明るい点として見ることができる。Growdexヒドロゲルは主として細胞凝集体からの伸長を支持したが、それに対してaNFCヒドロゲルは単一細胞の神経突起成長も支持した。
主として細胞凝集体から大量の神経突起伸長が見られた(図3、スタック1と2)。幾つかの凝集体において神経突起の量はより低かった(図3、スタック3)。
Growdex 1.50%とGrowdex 1.00%の間で結果は非常に類似していた。細胞凝集体からの神経突起伸長が見られた(図4、スタック1〜3)。神経突起伸長の量は凝集体により変化した。幾つかの試料において抗体の洗浄が不完全であり、明るい蛍光のドットを引き起こした(図4、スタック2)。
aNFC 0.65%ヒドロゲルは凝集体からの神経突起伸長(図5、スタック1と3)のみならず、単一細胞の神経突起成長(図5、スタック2)も支持した。
aNFC 0.45%ヒドロゲルは凝集体からの神経突起伸長(図6、スタック1と3)のみならず、単一細胞の神経突起成長(図6、スタック2と3)も支持した。
aNFC 0.30%ヒドロゲルは単一細胞の神経突起成長を大いに支持し(図7、スタック1)、細胞凝集体からの大量の神経突起伸長(図7、スタック2と3)を支持した。
1.aNFCヒドロゲルは単一細胞の神経突起伸長の支持においてより良好であった。
2.GrowdexとaNFCヒドロゲルの両方において、細胞凝集体からの実質的な神経突起伸長も検出された。
3.ヒドロゲルの容量(80μl又は60μl)は画像化の質に影響しなかった。
ナノフィブリルセルロース試料を水の中で、前記ナノフィブリルセルロースのゲル化点未満の濃度に希釈し、希釈した試料の濁度を測定した。0.1%の濃度において、ナノフィブリルセルロース試料の濁度を測定した。濁度の測定に、50mlの測定容器を有するHACH P2100濁度計を使用した。ナノフィブリルセルロース試料の乾燥物質を測定し、乾燥物質として計算された試料の0.5gを測定容器の中に搭載し、その容器を水道水で満たして500gとし、約30秒間振盪することにより激しく混合した。遅滞なく水性混合液を5つの測定容器に分け、それらを濁度計内に挿入した。各容器について3回の測定を実施した。得られた結果から平均値と標準偏差を計算し、最終的な結果はNTU単位として与えられた。新規なナノフィブリルセルロース産物は、上記で述べた測定条件で200未満、好ましくは150NTU未満の典型的な濁度を有していた。
フィブリル化の成功を検証するために、四つ刃の羽根の形状(four-bladed vane geometry)を備えた応力制御型回転レオメーター(ARG2、TAインスツルメント、英国)により、ナノフィブリルセルロースのヒドロゲルの形態での試料のレオロジー測定を実施した。試料を脱イオン水(200g)により希釈して0.5重量%の濃度とし、ハンドミキサーで混合した。その試料についてのレオメーター測定が実施された。シリンダー状の試料カップと羽根の直径は、それぞれ30mmと28mmであり、長さは42mであった。0.001〜100Paの範囲の剪断応力におけるストレススイープを、25℃で、0.1Hzの周波数で測定した。
ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)を、NFCヒドロゲルGrowDex又はアニオン性NFCヒドロゲルGrowDexTと混合した。細胞−ヒドロゲルを96ウェルのプレートに移し、ウェル当たり60μlの細胞−ヒドロゲル、及び100μlの細胞培養培地(血清を補足したDMEM)をヒドロゲルの最上部に添加した。5%CO2において37℃で7日間細胞を培養し、成長特性(増殖、形態、運動)を、自動化Cell−IQ顕微鏡(チップマンテクノロジー)を有する明視野生細胞イメージングにより解析した。その結果、GrowDex中に丸いHDFスフェロイドの形成が示された(図9A)。GrowDexT内ではHDF細胞は塊で成長し、突起を形成し、細胞は環境を感知することが示唆された(図9B)。
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Claims (24)
- 増殖細胞の培養のための組成物であって、前記組成物はで、0.05〜0.5重量%の植物由来のアニオン性ナノフィブリルセルロースをヒドロゲルの形態で含む組成物。
- 細胞が突出又は突起を成長させる、請求項1に記載の組成物。
- 細胞がニューロン細胞である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 0.05〜0.35重量%のナノフィブリルセルロースを含む、請求項1〜3の何れか1項に記載の組成物。
- 前記植物由来のアニオン性ナノフィブリルセルロースがセルロース原材料の重量に基づいて、0.5mmol/g超、好ましくは0.5〜1.6mmol/g、より好ましくは0.65〜1.4mmol/g、なおさらに好ましくは0.75〜1.2mmol/gのカルボキシレート含有量を有する酸化セルロース原材料から製造されたナノフィブリルセルロースを含む、請求項1〜4の何れか1項に記載の組成物。
- 前記植物由来のアニオン性ナノフィブリルセルロースが、0.1超、好ましくは0.1と0.3の間、より好ましくは0.12と0.2の間の置換度を有するカルボキシメチル化されたセルロース原材料から製造されたナノフィブリルセルロースを含む、請求項1〜5の何れか1項に記載の組成物。
- 前記植物由来のアニオン性ナノフィブリルセルロースが、少なくとも0.08、好ましくは0.08と0.3の間、より好ましくは0.1と0.25、又はなおさらに好ましくは0.12と0.2の間の置換度を有するアニオン化セルロース原材料から製造されたナノフィブリルセルロースを含む、請求項1〜6の何れか1項に記載の組成物。
- 前記植物由来のアニオン性ナノフィブリルセルロースがセルロースIのものである、請求項1〜7の何れか1項に記載の組成物。
- 前記植物由来のアニオン性ナノフィブリルセルロースがTEMPO酸化されたナノフィブリルセルロースを含む、請求項1〜8の何れか1項に記載の組成物。
- 前記植物由来のアニオン性ナノフィブリルセルロースが、カルボキシメチル化された又はスルホン化されたナノフィブリルセルロースを含む、請求項1〜9の何れか1項に記載の組成物。
- 前記植物由来のアニオン性ナノフィブリルセルロースが、水中に0.5重量%の濃度で分散されたときには、1と40Paの間、好ましくは3と30の間、より好ましくは5と20の間の貯蔵弾性率を有する、請求項1〜10の何れか1項に記載の組成物。
- 前記植物由来のアニオン性ナノフィブリルセルロースが、剪断応力が0.5Pa未満であるときには0.3未満、好ましくは0.25未満の損失正接を有する、請求項1〜11の何れか1項に記載の組成物。
- 前記植物由来のアニオン性ナノフィブリルセルロースが、水中に0.5重量%の濃度で分散されたときに、貯蔵弾性率の範囲が1〜20Paの間、好ましくは2〜10Paであるときには、1を超える損失正接を有する、請求項1〜12の何れか1項に記載の組成物。
- 前記植物由来のアニオン性ナノフィブリルセルロースが、セルロース原材料の重量に基づいて、0.75mmol/g超、好ましくは0.75〜1.6mmol/g、より好ましくは0.9〜1.2mmol/gのカルボキシレート含有量を有する、請求項1〜13の何れか1項に記載の組成物。
- 前記植物由来のアニオン性ナノフィブリルセルロースが、水中で0.1重量%の濃度で、20NTU以下、好ましくは10NTU以下、より好ましくは6NTU以下の濁度を有し、好ましくは、濁度は20と1NTUの間、より好ましくは10と2NTUの間である、請求項1〜14の何れか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が透明である、請求項1〜15の何れか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、細胞外マトリックス成分、血清、成長因子及びタンパク質からなる群から選択される添加物をさらに含む、請求項1〜16の何れか1項に記載の組成物。
- マトリックスが生細胞と請求項1〜17の何れか1項に記載の組成物を含み、前記細胞は前記マトリックス中に三次元又は二次元の配置で存在する、細胞培養マトリックス。
- 増殖細胞の培養のための請求項1〜17の何れか1項に記載の組成物を製造する方法であって、
a.アニオン性ナノフィブリルセルロースを提供すること;及び
b.前記アニオン性ナノフィブリルセルロースを水と混合すること、
を含む、前記方法。 - 細胞又は組織の三次元又は二次元培養のための方法であって、増殖細胞の培養のための請求項1〜17の何れか1項に記載の組成物を提供し、前記組成物、又は請求項18に記載のマトリックス内に少なくとも1つの細胞を接種すること;及び培養して細胞塊を得ること、を含む方法。
- 起源が異なる少なくとも2つの細胞型が共培養として培養される、請求項19に記載の方法。
- 前記組成物が、少なくとも細胞塊の一部を放出するのに十分な時間の間、セルラーゼにより酵素的に処理される、請求項19又は20に記載の方法。
- 酵素処理の後に、セルラーゼは不活性化されるか又は細胞塊から除去される、請求項21に記載の方法。
- 請求項1〜18の何れか1項に記載の組成物の、増殖細胞を培養するための使用。
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