JP2020516650A - 小分子 - Google Patents
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Abstract
Description
A-L-B
[式中、
A及びBは、独立して、式1A又は1B:
Lは、R1若しくはR2において式1Aの化合物と直接結合し、且つ/又はR3若しくはR4において式1Bの化合物と直接結合する連結基であり、Lは、-R5-[O(CH2)m]n-R6-(式中、m及びnは、独立して0〜10であり、R5及びR6は、共有結合、C1〜C10アルキレン、-OR7-、C1〜C10ポリエーテル、又は-O-の群から独立して選択される)であり;
R1は、(1)LがR1において式1Aの化合物と結合している場合は、共有結合若しくはC1〜C5アルキレンの群、又は(2)LがR2において式1Aの化合物と結合している場合は、H、NH2、C1〜C5アルキル、若しくはC(CN)C2H4の群のいずれかから選択され、
R2、R3、及びR4は、共有結合、H、NH2、C1〜C5アルキル、C(CN)C2H4の群から独立して選択され;
X及びYは、H、OH又はハロゲンの群から独立して選択され;
R7は、C1〜C5アルキレンである]、
を有する化合物、又は薬学的に許容されるその塩、水和物、溶媒和物、若しくは多形体が提供される。
R1a、R1b及びR1cは、H、NH2、C1〜C5アルキル、及びC(CN)C2H4から独立して選択され;
X1及びX2は、H、OH、ハロゲンから独立して選択され;
Y1及びY2は、H、OH、ハロゲンから独立して選択され;且つ
m及びnは、独立して0〜10である]
を有しうる。
直腸内又は膣内の投与用の組成物は、好ましくは、本発明のPROTAC化合物と、周囲温度で固体であるが体温で液体でありしたがって直腸若しくは膣腔内で溶融して活性化合物を放出する、カカオバター、ポリエチレングリコール若しくは坐剤ワックス等の好適な非刺激性の賦形剤又は担体とを混合することにより調製することができる坐剤である。同様の種類の固体組成物はまた、ラクトース又は乳糖、同様に高分子量ポリエチレングリコール及び同様のもの等の賦形剤を使用して、軟及び硬-充填のゼラチンカプセル剤における充填剤として利用されてよい。
生物学
siRNA阻害研究用に、トランスフェクションの日に70%のコンフルエンスを達成するために、3×105細胞を6-ウェルプレートの各ウェルに播種した。siRNA(SMARTpool:ON-TARGETplus VHL siRNA L-003936-00-0005)を、RNase無含有の1×siRNA緩衝液中の20μM溶液として調製した。負の対照siRNA(Life Technologies社からのsiRNA、cat.#4390843)を負の対照として使用した。トランスフェクションの日に、古い培地を新しい培地と入れ替えた。VHL標的siRNA及び負の対照の両方のsiRNA溶液(5μL)を、1.5mL管中の250μLのOpti-memに添加した。この溶液を二重反復で調製した。各管中の内容物をピペットで移すことにより混合した。リポフェクタミンRNAiMax(5μL)を、別の1.5mL管中の250μLのOpti-memに添加した。上記溶液を二重反復で調製した。各管中の内容物をピペットで移すことにより混合した。工程2からの溶液を、工程3において管に添加した。この溶液を、短時間のボルテックスにより混合し、室温で20分間インキュベートした。この管を短時間の遠心分離にかけた。トランスフェクション混合物の全量を、6-ウェルプレートに添加した。プレートを前後に静かに揺り動かして内容物を混合した。採取前に、プレートを37℃及び5%のCO2において48時間インキュベートした。
単一時点処置実験用に、翌日に80%のコンフルエンスを達成するために、細胞を、2mlの培地中でウェル当たり5×105細胞で6-ウェルプレートに移した。化合物のストック濃度を、最終の所望のストック濃度まで100%v/vのDMSOに粉末を可溶化させることにより調製した。
時間依存処置用に、細胞を、2mlの培地中でウェル当たり3×105細胞で6-ウェルプレートに移した。試料を、上に詳述したように又は単一時点実験のように調製した。採取前に、処置を所与の時間点において実行した。
細胞を、翌日に80%のコンフルエンスを達成するために、2mlの培地中でウェル当たり5×105細胞で6-ウェルプレートに移した。t=0において、所望のウェルに、MLN4924を3μMの最終濃度で、及び0.1%v/vのDMSOを添加した。DMSO(0.1%v/v最終濃度)を、全ウェルにおいてビヒクルの同一濃度を一致させるために、残りのウェルに添加した。t=3時間において、所望のウェルに、MG132を50μMの最終濃度で、及び0.1%v/vのDMSOを添加した。DMSO(0.1%v/v最終濃度)を、全ウェルにおいてビヒクルの同一濃度を達成するために、残りのウェルに添加した。t=3.5時間において、所望のウェルを、0.1%v/vのDMSO最終濃度中の1μMのCM11を用いて処置した。DMSO(0.1%v/v最終濃度)を、全ウェルにおいてビヒクルの同一濃度を得るために、残りのウェルに添加した。したがって、DMSOの合計最終濃度は0.3%v/vであった。採取前に、プレートを37℃及び5%のCO2において4時間インキュベートした。
細胞を、翌日に80%のコンフルエンスを達成するために、2mlの培地中でウェル当たり5×105細胞で6-ウェルプレートに移した。実験の日に、細胞を、CM11を用いた1μMの最終濃度における4時間の処置の前に、VH032を用いて150μMの最終濃度において30分間処置した。採取前に、プレートを37℃及び5%のCO2において所望の時間インキュベートした。
本実験用に、細胞を、翌日に80%のコンフルエンスを達成するために、2mlの培地中でウェル当たり5×105細胞で6-ウェルプレートに移した。実験の日に、細胞を、CM11を用いた1μMの最終濃度における4時間の処置の前に、IOX4を用いて50μMの最終濃度において30分間処置した。採取前に、プレートを37℃及び5%のCO2において所望の時間インキュベートした。
細胞を、10mlの緩衝液当たり、溶解緩衝液(20mMのTris、pH8、150mMのNaCl、1%のTriton×100)及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche社)に溶解させた。タンパク質抽出物用に、皿を氷上に置いた。培地を吸引し、組織層を氷冷リン酸緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄した。溶解緩衝液(120μl)を添加し、細胞を細胞スクレーパで表面から引き離した。遠心分離による不溶性画分の除去後、上清のタンパク質濃度を、Pierce(商標)Coomassie(Bradford)Protein Assay Kitにより決定した。タンパク質抽出物を、SDS-PAGEにより、4〜12%のTris-Acetate NuPage(登録商標)Novex(登録商標)(Life Technologies社)ポリアクリルアミドゲル上で分画し、湿式移送(wet transfer)を使用してニトロセルロース膜に転写した。次に、該膜を、0.1%w/vのTween-20を含むTris-緩衝食塩水(TBS)中、5%w/vのウシ血清アルブミン(BSA)を用いてブロッキングした。タンパク質の検出用に、所与の濃度における以下の一次抗体を使用した:抗-β-アクチン(Cell Signaling Technology社、4970S、13E5)1:2000、抗-VHL(Cell Signaling Technology社、#68547)1:1000、抗-Hif-1α(BD Biosciences社、610959、clone 54)1:1000、抗-ヒドロキシ-HIF-1α(Hyp564)(Cell Signaling Techonology社;#3434)1:1000、抗-PHD2(Bethyl Laboratories社;A300-322A)1:1000、抗-PHD3(Bethyl Laboratories社;A300-327A)1:1000、抗-CRBN(Proteintech社;11435-1-AP)1:1000。
ルシフェラーゼアッセイを、本質的に、Frostらに記載されるように34実施した。簡潔には、HRE-ルシフェラーゼレポーターを安定して発現している細胞(HeLa及びU2OS)を、示された回数、化合物を用いて処置した。細胞を受動溶解緩衝液(Promega社)中で採取し、3回の凍結-解凍サイクルを施した。可溶性溶解画分をアッセイに使用し、製造業者の使用説明(Promega社)に従って、Berthold Lumat LB 9507 Luminometerを使用して実施した。結果をタンパク質濃度に対して正規化し、3回の生物学的反復からの平均±標準誤差として報告した。
定量的リアルタイムPCRを、本質的に、Frostらに記載されるように34実施した。簡潔には、RNAを、HeLa細胞溶解産物からRNeasy Mini Kit(Qiagen社)を使用して抽出し、iScript cDNA Synthesisキット(Bio-Rad社)を使用して逆転写した。リアルタイムPCRを、C1000 Touch Thermal Cycler(Bio-Rad社)においてPerfeCTa SYBR Green FastMix(Quanta Biosciences社)を使用して実施した。mRNAレベルを、2回の技術的反復から平均Ct値に基づいて算出し、β-アクチンのmRNAレベルに対して正規化し、3回の生物学的反復からの平均±標準誤差として報告した。
等温滴定熱量測定(ITC)。
滴定をITC200マイクロ熱量計(GE Healthcare社)で実施した。PROTAC(CM11、CMP98又はCMP99)を、20mMのビス-トリスプロパン、150mMのNaCl、1mMのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)を含有する、pH7.4の緩衝液中で、100mMのDMSOストック液から150μMに希釈した。最終DMSO濃度は0.15%v/vであった。VBCタンパク質実験を、20mMのビス-トリスプロパン、150mMのNaCl、1mMのTCEP、0.15%v/vのDMSOを含有する、pH7.4の緩衝液中で実行した。滴定は、VCBタンパク質溶液(20μM、細胞中)に、2μLの化合物溶液(150μM、シリンジ中)を、2秒/μLの速度で、120秒の時間間隔で、19回注入することから構成される。化合物溶液(0.4μL)の最初の注入を行い、データ解析中に廃棄した。全ての実験を、シリンジを600rpmで撹拌しながら、25℃で実施した。データを単一部位結合モデルに当てはめて、製造業者により提供されたMicrocal LLC ITC200 Originソフトウェアを使用して、化学量論のn、解離定数のKd及び結合エンタルピーのΔHを得た。
SEC実験をAKTA pure system(GE Healthcare社)において、室温で実行した。溶液中のオリゴマー状態のVCB複合体を、20mMのBis-Tris(pH7)、150mMのNaCl及び1mMの1,4-ジチオトレイトール(DTT)を含有する緩衝液中で、公知の分子量の球状タンパク質(GE Healthcare社、28-4038-41/42)で較正したSuperdex 200 Increase 10/300 GLカラム(GE Healthcare社)を使用して、ゲル濾過により分析した。VBCタンパク質(50μM)を、注入前に、CM11(30μM)、CMP98(30μM)、CMP99(30μM)、VH032(30μM)又はDMSO(0.5%)と共に20分間、室温でインキュベートした。各注入用の試料容量は200μLで、流動速度は0.5mL/分であった。溶出ピークを、280nmにおける紫外線吸収を使用して監視した。
VCB複合体を、EZ-link NHS-PEG4-ビオチン(Thermo Scientific社)と1:1のモル比で混合し、室温で1時間インキュベートした。反応を、1Mのトリス-HCl、pH7.5を使用してクエンチし、未反応のNHS-ビオチンを、20mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl及び1mMのDTTで平衡状態にしたPD-10 MiniTrap脱塩カラム(GE Healthcare社)を用いて除去した。
全てのアッセイを、室温で、384-ウェルプレート中で、最終アッセイ容量はウェル当たり25μLで実施し;プレートを、試薬の添加の間には透明フィルムで密封した。全ての試薬を、50mMのHEPES、pH7.5、100mMのNaCl、0.1%(w/v)のウシ血清アルブミン及び0.02%(w/v)の3-[(コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS)中で希釈した、5×ストックとして調製した。ビオチン化したVCB(最終20nM)及びHis6-VCB(最終20nM)を、ホモ-PROTAC濃度(0.5〜200nM;5分の3に連続希釈)の範囲で1時間インキュベートした。抗-Hisアクセプタービーズ(PerkinElmer社、最終10μg/mL)を添加し、プレートを更に1時間インキュベートした。ストレプトアビジン-コーティングしたドナービーズ(PerkinElmer社、最終10μg/mL)を添加し、プレートを最終の1時間インキュベートした。プレートを、PHERAstar FS(BMG Labtech社)で、680nmの励起波長及び615nmの発光波長で光学モジュールを使用して読み取った。強度値を、PROTAC濃度に対してlog10スケール上でプロットした。
VHLホモ-PROTACの設計を、我々のグループにより最近特徴付けされた2つの強力なVHLリガンド、VH032及びVH298(図1b)2,3上の、誘導体化の位置を慎重に考慮することから始めた。上記リガンドを特徴付ける強い結合親和性を保持するために、共結晶構造を解析して、そこから該リガンドがその結合モード(図1a)を乱されることなく誘導体化されうる溶媒曝露領域を特定した。本解析及び前述のVHL標的とするPROTACの考慮により、VH032の左側(LHS)末端アセチル基のメチル基を、リンカーに対する好適な連結点と指摘した12,13。誘導体化に利用できる第2の溶媒-曝露位置は、Halotagを標的とするPROTAC35でこれまでに利用された、右側(RHS)のフェニル基であった。誘導体化の影響を調査するために、3種類のホモ-PROTAC:a)各リガンドのLHSアセチル基を介して対称性(図2a);b)RHSフェニル基を介して対称性(図2b);及びc)1つの弾頭中のアセチル基及び他の弾頭中のフェニルを介して非対称性(図2c)を設計した。b及びcの場合では、非誘導体化末端LHSにおいて、アセチル(VH032における)又はシアノ-シクロプロピル部分(VH298における)のいずれかに、VHL阻害剤単独の文脈において結合親和性、細胞浸透性及び細胞活性の増加をもたらす修飾3を保持することを決定した。リンカーの長さの影響の可能性を評価するために、3、4又は5個のいずれかのエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール鎖で構成されているリンカーを選択して、2つのVHLリガンドを連結した。
第1の種類のホモ-PROTAC(図2a)の合成のために、ジオキサン中のNaHの存在下で、ブロモ酢酸tert-ブチルと、トリ-、テトラ-及びペンタ-エチレングリコールとを反応させることにより、続いて、精製後にDCM中50%のTFAで処理することにより、両端に遊離カルボキシレート基を持つ対称性PEGリンカー4、5及び6を得た(図3)。VHLリガンド7(前述のように調製)38と、リンカー4、5及び6とを、それぞれ2:1比で、カップリング剤としてのHATU及び塩基としてのDIPEAの存在下でアミドカップリングすることにより、最終化合物CM9、CM10及びCM11を得た(図3)。対称性シス-シス化合物CMP98の合成のために、化合物8(参考文献38)をリンカー6とカップリングして、所望の生成物を得た(図3)。
次に、我々の全てのホモ-PROTACをHeLa細胞中で試験し、タンパク質レベルを、1μM濃度での10時間の化合物処理後、ウエスタンブロット法により監視した(図8a)。CM09、CM10及びCM11の、細胞中のVHL枯渇を誘発する際立った有効性(図8a)、及びVHLの短アイソフォームより優先的に長アイソフォームに相当するバンドに関する著しい選択的分解が観察された。VHL遺伝子は3個のエクソンを含み、それはVHLの2つの主要なアイソフォームをコードする:213アミノ酸の長さ、30kDa形態(pVHL30)及び160アミノ酸の長さ、19kDa形態(pVHL19)。pVHL19は、53アミノ酸の長さのアミン-末端ドメイン又はN-末端テール(pVHL-N)が欠如しており、これは代わりにpVHL30に存在する。両方のアイソフォームがヒト細胞中に発現するけれども、pVHL19は、ヒト組織中でより顕著な形態である56。最も活性的な化合物は、VH032の末端LHSアセチル基から対称的に連結している。異なる位置での連結は効果がないことが立証されており、VHLリガンド上の連結パターンが果たす重大な役割を示唆している。対照化合物CMP98及びCMP99は、VHLの分解を誘発することができず(図8a)、ホモ-PROTAC活性が、トランスエピマーによる、VHLの生産的な(productive)2価のリクルートに依存することを実証している。リンカーの長さもまた、細胞性効力に影響を及ぼすと思われた。実際、より短いリンカー長で有効性の低下が観察され、CM10及びCM11が、pVHL30の完全なノックダウンを達成する最も活性的な化合物であり、続いてCM09が標的タンパク質の82%を枯渇させた。興味深いことに、短アイソフォームpVHL19のいくらかの分解も、低いけれども(およそ10%の枯渇)観察された。CRL2-VHL複合体57の中心サブユニット、クリン2のレベルもまた、CM10及びCM11を用いた処置時に最大22%低下した(図8a)。
PROTACの触媒的作用様式に対する鍵は、3成分複合体の形成である13、15。我々のホモ-PROTAC化合物の場合は、VHLは、E3リガーゼ及び基質の両方として作用する。したがって、我々は、次に、細胞活性の根底にあると考えられる3成分複合体VHL:ホモ-PROTAC:VHLを監視し、且つ生物物理学的に特徴付けしようとした。溶液中でのこの3成分複合体種の形成を検討評価するために、等温滴定熱量測定(ITC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)及びAlphaLISA近接アッセイを実施した(図12)。VCB複合体(VHLと共にエロンギンB及びエロンギンC)に対するCM11のITC滴定では、結合の化学量論(n値)は、VH032に対する1ではなく、0.6であると見出された(図12a、Table 1(表1))。この結果は、VHLと1:1比で結合するVH032とは対照的に19、CM11のVHLとの1:2のモル比における結合と一致する。注目すべきことに、CM11に関して測定されたKd値は11nMであった(Table 1(表1))。滴定曲線の更に精密な検討により、曲線の変曲中の1点のみが特徴となっていることが明らかになった。実際、実験で使用されたタンパク質濃度が20μMであったため、この実験に関して算出されたc値([P]tot/Kdと定義される)は2500であり、これは結合親和性の正確な測定のために必須であるcの上限(およそ500〜1000)をかなり超えている。したがって、この解析により、我々がCM11の結合親和性を過小評価した可能性があることが示唆され、すなわち、Kd≦118nMであると結論付けることができる。これは、VH032と比較した場合、18倍を超える親和力(協同性αとしても公知)に相当する。ホモ2価分子のそのような大きい親和力が、例えばBET阻害剤MT1のような他の系について以前に観察された。CM11とVHLとの間の結合相互作用は、大きな見掛けの結合エンタルピー(ΔH=-12.3kcal mol-1)によって引き起こされ、一方、エントロピー項(entropic term)はわずかに望ましくなかった(-TΔS=1.4kcal mol-1)。この観察により、CM11の熱力学的特性はまた、VH032の熱力学的特性と比較した場合、いかに大きく異なるかということが強調され、VH032の場合、結合ΔHは、CM11について観察された結合ΔHのおよそ半分であり、且つエンタルピー項及びエントロピー項の両方が結合のΔGに望ましく寄与している(Table 1(表1))。対照的に、CMP99結合に関して得られた熱力学的値は、VH032の値と完全に一致した(Table 1(表1))。詳細には、CMP99は、2つの部分の1つの中のシス-Hypの存在に起因して予期されるように、VHLと1:1比で結合し、VH032と同等のΔH及びKd値を示した。予期されたように、不活性のシス-シスエピマーであるCMP98について、結合は検出されなかった。CM11、CMP98及びCMP99の積分熱曲線の重ね合わせを図12bに示し、3つの化合物の異なる挙動を視覚的に強調する。CM10は、CM11と比較して同様の熱力学的結合パラメーターを示し、n値は0.7に等しく、且つ32nMの低Kdを有した。代わりにCM09に関しては、1に近い化学量論が見出され、滴定の最後には、この系には1:1複合体が主に集合していることが示唆され(図19及び図20)、その低親和力と一致している(Table 1(表1))。ITC実験もまた、化合物CMP106、CMP108、CMP112及びCMP113を用いて実行し、その結果は以下で論じる。
いくつかの実施形態では、E3ユビキチンリガーゼを効果的に二量体化し、それ自体の自己破壊を誘発する、小分子手法であるホモ-PROTACが記載されている。E3リガーゼVHLに対する強力なリガンドを使用することにより、ナノモル濃度におけるpVHLの長アイソフォームの著しく速く、強く且つ選択的な分解を誘発する一連の対称性ホモ-2価分子を開発した。化合物誘発性の分解は、VHLリガンドに関する連結パターンに非常に強く依存した。最も活性のホモ-PROTACであるCM11は、4時間後に既に10nMにおいてpVHL30の完全枯渇を誘発する。pVHL30の強力で且つ選択性の分解は、およそ100nMの半分解濃度(DC50)で、細胞活性において親阻害剤VH032と比較して1000倍を超える注目すべき増加を伴い長期持続した。機構的に、CM11活性が、プロテアソーム活性、Cul2NEDD化、及びVHL結合に、詳細にはVHLとの親和性(avid)の2:1複合体の形成に厳密に依存することが示された。したがって、このデータは、高度に協同的な3成分複合体VHL-CM11-VHLがVHL自体の誘発された分解の原因となりうる重要な種として機能するというモデルを支持しており(図13)、これは将来の構造研究の正当な根拠となる。興味深いことに、CM11はまたクリン2の細胞レベルの低下ももたらし、これはCRL2VHL複合体の一部としてのクリン2の直接的ユビキチン化の結果であると我々は仮定している。我々の知る限りでは、これは、PROTACが、直接的に標的とされたタンパク質と同じ複合体の一部を形成しているタンパクの分解を誘発することができるということの最初の実証である。
化合物CMP85及びCMP86(図23に示す構造)の合成用に、リンカー26、及び26で使用したものと同じ経路を取り入れて2個のPEG単位を有するその類似体43を合成した(図24)。次にこれらのリンカーを化合物27とカップリングして、それぞれ化合物28及び44を得た。それに続くtert-ブチル基の脱保護により、4個のPEG単位の長さを有する化合物29、及び代わりに2個のPEG単位を有する化合物45を得た(図24)。
以下において、細胞中のVHLを標的とするPROTAC化合物の生物学的評価の結果を概説する。
・VHL:CM09、CM10及びCM11により、長アイソフォームpVHL30の優先的な又は選択的な分解としての特色である、VHLレベルの完全枯渇が実証された。しかしながら、短アイソフォームpVHL19のいくらかの分解も、およそ20%のみであったけれども観察された。他の化合物はいずれも、VHLの分解を誘発することはできなかった。
・クリン2:一連の化合物を用いた処置が、CLR2VHLの他のサブユニットに影響を及ぼすかどうかを検討評価するために、クリン2のタンパク質レベルを評価した。CM10及びCM11は、およそ20%の低下を誘発することにより、クリン2レベルに影響を及ぼすことを示した。
・CRBN:CRBNレベルに関して、CMP85及びCMP86を用いた処置時に検出可能な効果は観察されなかった。
・HIF-1α及びHdy-HIF-1α。VHL分解剤が、HIF-1α、詳細にはそのヒドロキシル化形態(Hdy-HIF-1α)の蓄積を誘発しうるかどうかを評価するために、これらのタンパク質のレベルを評価した。siRNA実験中に、VHLノックダウンはHIF-1α枯渇をもたらさないことが観察された。実際、非常に低レベルのVHLでさえも、HIF-1αに対して高効率の触媒作用となり、それに続く効果的なHIF-1α分解をもたらすことが可能である。予期されたように、VHL枯渇はHIF-1αレベルに対して有意に影響を与えることはなかった(検出されたHIF-1αバンドをビヒクル対照DMSOと比較されたい)。それにもかかわらず、活性VHL分解剤CM09、CM10及びCM11により、HIF-1αレベルのわずかな増加が誘発された(より長い曝露を伴うHIF-1αバンドを参照)。この効果は、Hdy-HIF-1αに関してよりいっそう顕著であり、VHLノックダウンから予期されるように、安定化されたHIFがヒドロキシル化形態であることと一致した。
・PHD2及びPHD3:化合物を用いた処置に起因する細胞の潜在的な低酸素応答を研究するために、PHD2及びPHD3のレベルを考慮した。これらのタンパク質のレベルに対する効果はこの濃度では観察されなかった。
全ての化学物質を販売業者から購入し、特に明記されない限り、更に精製することなく使用した。反応物を磁気撹拌し、市販の無水溶媒を使用した。無水条件を必要とする全ての反応を、アルゴン又は窒素雰囲気下で、炉乾燥したガラス器具を使用して実行した。HPLC-グレードの溶媒を全ての反応に使用した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、シリカゲル(Merck社のシリカゲル60 F254nm)を使用して実行した。順相TLCを、予めコーティングしたシリカプレート上で(Kieselgel60 F254、BDH)、UV光(UV254/365nm)及び/又は塩基性の過マンガン酸カリウム溶液又は他の好適な染色を介して可視化して実行した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(FCC)を、Teledyne Isco社のCombiflash Rf又はRf200iを使用して実施し、プレパックドカラムRediSep Rf Normal Phase Disposable Columnsを使用した。NMRスペクトルを、Bruker社のAscend 400又は500で記録した。化学シフトを、残留溶媒ピーク(CDCl3=7.26ppm)を基準として、百万分率で報告した。スペクトルの報告において以下の略語、s(1重項)、d(2重項)、t(3重項)、q(4重項)、m(多重項)、dd(2重項の2重項)を使用した。主要な回転異性体NMRスペクトルのみを報告した。高分解能質量スペクトル(HRMS)をBruker社のmicroTOFで記録した。低分解能MS及び分析用HPLCトレースを、Agilent Technologies社の6130四重極LC/MSに接続され、Agilentダイオードアレイ検出器に接続された、Agilent Technologies社の1200シリーズHPLCで記録した。使用したカラムは、Waters社のXBridgeカラム(50mm×2.1mm、粒径3.5μm)であった。流動速度は0.6mL/分であった。分取HPLCを、Waters社のXBridge C18カラム(100mm×19mm;粒径5μm)を備えたGilson社のPreparative HPLC Systemで実施した。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) 9.29 (1H, s), 8.65 (1H, s), 8.02 (1H, t, J=6.4 Hz), 7.12 (1H, d, J=7.7 Hz), 6.99 (1H, d, J=8.0 Hz), 6.94 (1H, d, J=1.8 Hz), 6.86 (1H, dd, J=1.8, 7.7 Hz), 4.72 (1H, t, J=8.0 Hz), 4.54 (1H, s), 4.44 - 4.35 (2H, m), 4.19 (1H, dd, J=5.5, 14.6 Hz), 3.87 (1H, d, J=11.0 Hz), 3.62 (1H, dd, J=3.7, 11.0 Hz), 3.50 (1H, s), 2.49 (3H, s), 2.43 - 2.37 (1H, m), 2.13 - 2.06 (1H, m), 1.66 - 1.37 (4H, m), 0.89 (8H, s); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.8, 170.8, 165.8, 155.8, 150.5, 148.3, 133.3, 131.6, 131.2, 123.9, 120.9, 119.6, 118.2, 70.1, 58.6, 58.3, 56.7, 55.7, 40.0, 35.7, 26.2, 18.6, 17.9, 17.8, 17.2, 16.1, 13.8.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 3.81 (4H, s), 3.51 - 3.46 (12H, m), 1.26 (18H, s). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 169.1, 80.9, 70.1, 70.0, 68.5, 27.5.分析データは、既報告のデータ39と一致した。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 3.86 (4H, s), 3.55 - 3.49 (16H, m), 1.31 (9H, s).分析データは、既報告のデータ39と一致した。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.94 (4H, s), 3.66 - 3.56 (20H, m), 1.40 (18H, s).分析データは、既報告のデータ39と一致した。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.28 - 7.19 (5H, m), 4.50 (2H, s), 3.66 - 3.52 (20H, m), 2.50 (1H, s). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) 138.2, 128.3, 127.8, 127.6, 73.2, 72.7, 70.61, 70.58, 70.53, 70.51, 70.2, 69.4, 61.7
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.28 - 7.20 (5H, m), 4.50 (2H, s), 3.95 (2H, s), 3.65 - 3.55 (20H, m), 1.40 (9H, s). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ169.7, 128.4, 127.7, 127.6, 81.5, 73.2, 70.7, 70.7, 70.6, 70.6, 69.4, 69.1, 28.1. HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ C23H38O8の計算値: 442.26; 実測値: 387.2.
BAIB(3.546g、11.01mmol、2.2eq.)及びTEMPO(171.87mg、1.10mmol、0.22eq.)を、前に得た油状物(1.764g、5mmol、1eq.)を含有するACN/H2Oの1:1溶液に添加した。得られた混合物を、出発物質の完全変換まで室温で撹拌した。粗製物を、ISOLUTE(登録商標)PE-AXアニオン交換カラムを使用して精製した。該カラムをメタノールで平衡処理し、反応混合物をカラムに注入し、パッドに吸着させた。カラムをメタノールで洗浄し(×3)、全ての未結合材料を溶出させた。次に、標題生成物を、メタノール中のギ酸の50%溶液を使用して溶出させた。有機相を蒸発乾固させ、標題化合物を油状物として得た。収量:1.200g、3.27mmol(65%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ, ppm 4.12 (2H, s), 3.98 (2H, s), 3.72 - 3.60 (16H, m), 1.43 (9H, s). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ, ppm 172.6, 169.7, 81.6, 71.0, 70.59, 70.56, 70.54, 70.46, 70.38, 70.35, 70.30, 68.9, 68.8, 28.1.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.33 - 4.30 (4H, m), 3.72 - 3.69 (4H, m), 3.62 - 3.56 (12H, m), 3.02 (6H, s).分析データは、既報告のデータと一致した[Kimuraら、J.Polym.Sci.Part A:Polym.Chem.54、(2016年)]。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.32 - 4.30 (2H, m), 3.95 (2H, s), 3.71 - 3.57 (18H, m), 3.02 (3H, s), 1.41 (9H, s). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 169.7, 81.5, 70.72, 70.65, 70.61, 70.58, 70.5, 69.3, 69.0, 37.7, 28.1.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 9.00 (1H, s), 7.45 (1H, t, J = 5.9 Hz), 7.39 - 7.33 (4H, m), 7.29 (1H, d, J = 8.9 Hz), 4.71 (1H, t, J = 8.0 Hz), 4.59 - 4.48 (3H, m), 4.34 (1H, dd, J = 5.2, 14.6 Hz), 4.08 - 3.92 (5H, m), 3.69 - 3.61 (18H, m), 2.52 (3H, s), 2.47 - 2.41 (1H, m), 2.19 - 2.11 (1H, m), 1.46 (9H, s), 0.97 (9H, s). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 171.3, 171.1, 170.5, 170.0, 151.7, 139.1, 129.4, 128.3, 82.0, 71.1, 70.6, 70.4, 70.4, 70.3, 70.3, 70.2, 70.2, 68.9, 58.7, 57.3, 56.8, 43.1, 36.3, 35.1, 28.1, 26.4, 15.1. HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ C38H58N4O11S2の計算値: 778.38; 実測値: 779.4.
一般的方法Bに従って、化合物13(5.5mg、0.006mmol、1eq.)、化合物8(2.77mg、0.006mmol、1eq.)、HATU(2.28mg、0.006mmol、1eq.)、HOAT(1mg、0.006mmol、1eq.)、DIPEA(2.23mg、0.002ml、0.018mmol、3eq.)から、CMP99を白色固体として得た。収量:4.5mg、0.004mmol(66%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): d, ppm 8.74 (2H, d, J = 2.8 Hz), 7.37 - 7.34 (9H, m), 7.18 (1H, d, J = 8.9 Hz), 4.76 - 4.64 (3H, m), 4.59 - 4.44 (5H, m), 4.37 - 4.26 (2H, m), 4.05 - 3.59 (27H, m), 2.52 (6H, s), 2.31 - 2.11 (4H, m), 0.96 (9H, s), 0.95 (9H, s). HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ C56H78N8O13S2の計算値: 1134.51; 実測値: 1135.58.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (2H, s), 7.48 - 7.45 (2H, m), 7.31 - 7.27 (8H, m), 7.23 (2H, d, J=10.2 Hz), 4.64 - 4.59 (2H, m), 4.52 - 4.46 (4H, m), 4.41 - 4.38 (2H, m), 4.31 - 4.25 (2H, m), 4.01 - 3.94 (4H, m), 3.82 (2H, d, J=15.7 Hz), 3.62 - 3.52 (12H, m), 2.45 (6H, s), 2.42 - 2.34 (2H, m), 2.12 - 2.06 (2H, m), 1.19 (2H, s), 0.89 (18H, s); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.2, 169.9, 169.6, 149.3, 147.5, 137.3, 130.6, 129.9, 128.4, 127.1, 69.9, 69.5, 69.3, 69.1, 57.6, 56.1, 55.9, 42.2, 35.5, 34.6, 25.4, 15.1. HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ C54H74N8O12S2の計算値: 1090.49; 実測値: 1091.4.
1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 9.28 (2H, s), 7.43 - 7.36 (10H, m), 5.39 (2H, s), 4.77 (10H, s), 4.59 (2H, s), 4.50 - 4.43 (4H, m), 4.42 - 4.38 (2H, m), 4.26 (2H, d, J=17.2 Hz), 3.96 - 3.92 (4H, m), 3.77 (2H, d, J=11.1 Hz), 3.73 - 3.68 (2H, m), 3.56 (16H, m), 3.22 - 3.20 (10H, m), 2.43 (6H, s), 2.16 - 2.14 (2H, m), 2.13 (2H, m), 2.02 - 1.95 (2H, m); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173.1, 172.4, 170.7, 170.3, 153.3, 153.2, 144.5, 140.0, 134.0, 129.2, 129.0, 128.4, 128.3, 127.8, 70.9, 70.5, 70.2, 70.1, 69.7, 68.2, 67.7, 59.7, 59.4, 56.8, 56.7, 54.9, 42.9, 42.3, 39.9, 37.6, 36.3, 35.7, 34.7, 25.6, 25.5, 13.1. HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ C56H78N8O13S2の計算値: 1134.51; 実測値: 1135.55.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (2H, s), 7.41 - 7.38 (2H, m), 7.29 (10H, t, J=7.6 Hz), 4.66 - 4.61 (2H, m), 4.49 - 4.41 (6H, m), 4.35 - 4.29 (2H, m), 3.98 - 3.91 (6H, m), 3.62 - 3.50 (24H, m), 2.45 (6H, s), 2.42 - 2.35 (2H, m), 2.11 - 2.06 (2H, m), 0.88 (18H, s); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 171.2, 170.9, 170.4, 150.3, 148.5, 138.3, 131.6, 130.9, 129.5, 128.1, 71.2, 70.61, 70.59, 70.5, 70.4, 70.3, 58.6, 57.0, 43.2, 36.5, 35.6, 26.4, 16.1. HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ C58H82N8O14S2の計算値: 1178.54; 実測値: 1179.60.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.09 (2H, s), 8.02 (2H, s), 7.31 (4H, d, J=8.5 Hz), 7.22 (4H, d, J=8.0 Hz), 7.16 (2H, d, J=9.2 Hz), 4.75 - 4.64 (4H, m), 4.51 (2H, d, J=8.9 Hz), 4.41 - 4.37 (2H, m), 4.24 - 4.17 (2H, m), 3.94 (4H, d, J=3.2 Hz), 3.84 - 3.81 (4H, m), 3.62 - 3.54 (20H, m), 2.49 - 2.47 (2H, m), 2.44 (6H, s), 2.26 - 2.17 (4H, m), 0.93 (18H, s); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173.2, 171.5, 169.7, 151.8, 138.8, 132.9, 129.5, 129.2, 128.3, 71.2, 71.1, 70.6, 70.48, 70.45, 70.4, 70.3, 59.9, 58.5, 56.5, 43.2, 35.6, 35.2, 26.4, 15.0. HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ C58H82N8O14S2の計算値: 1178.54; 実測値: 1179.60.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (2H, s), 7.41 - 7.38 (2H, m), 7.26 (2H, d, J=8.1 Hz), 7.00 (2H, d, J=8.1 Hz), 6.91 - 6.88 (2H, m), 6.85 - 6.81 (2H, m), 4.57 - 4.52 (2H, m), 4.44 - 4.36 (8H, m), 4.19 - 4.08 (4H, m), 3.89 - 3.53 (22H, m), 2.45 (6H, s), 2.24 - 2.17 (2H, m), 2.08 - 2.02 (2H, m), 1.61 - 1.37 (8H, m), 0.88 (18H, s); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.9, 170.0, 165.4, 156.9, 150.4, 148.5, 132.3, 131.7, 130.0, 126.9, 122.0, 119.6, 112.9, 70.7, 70.41, 70.38, 70.2, 69.6, 67.9, 58.9, 58.4, 56.6, 39.2, 37.0, 36.0, 26.3, 17.9, 17.7, 16.2, 13.7. HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ C64H84N10O14S2の計算値: 1280.56; 実測値: 1281.66.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.60 (2H, s), 7.39 - 7.35 (2H, m), 7.26 (2H, d, J=7.6 Hz), 6.91 - 6.88 (2H, m), 6.83 - 6.80 (2H, m), 6.36 - 6.13 (2H, m), 4.60 - 4.32 (10H, m), 4.18 - 4.05 (4H, m), 3.97 - 3.79 (6H, m), 3.71 - 3.54 (18H, m), 2.44 (6H, s), 2.17 - 1.86 (8H, m), 0.87 (18H, s); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 171.3, 171.1, 171.0, 170.7, 170.5, 156.8, 156.8, 150.3, 148.5, 132.2, 131.7, 130.0, 129.8, 127.1, 126.9, 122.1, 122.0, 112.8, 112.8, 71.3, 70.7, 70.6, 70.5, 70.5, 70.5, 70.4 , 70.2, 70.1, 69.7, 67.9, 58.9, 58.6, 57.6, 57.5, 56.9, 56.7, 42.7, 39.1, 39.0, 37.1, 36.4, 35.4, 35.1, 26.4, 26.4, 23.2, 23.1, 16.2. HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ C58H82N8O14S2の計算値: 1178.54; 実測値: 1281.66.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (1H, s), 7.33 - 7.25 (2H, m), 6.97 (1H, d, J=9.1 Hz), 6.92 - 6.89 (1H, m), 6.84 (1H, d, J=1.5 Hz), 4.59 - 4.55 (1H, m), 4.45 - 4.38 (4H, m), 4.22 - 4.10 (2H, m), 3.93 - 3.54 (24H, m), 2.46 (3H, s), 2.32 - 2.24 (1H, m), 2.10 - 2.04 (1H, m), 1.63 - 1.52 (2H, m), 1.45 - 1.39 (12H, m), 0.87 (9H, s); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.6, 170.1, 169.7, 165.4, 156.9, 150.3, 148.5, 132.3, 131.7, 130.0, 126.9, 122.0, 119.7, 112.9, 81.7, 70.72, 70.66, 70.5, 70.4, 70.3, 69.6, 69.0, 68.0, 58.8, 58.4, 56.6, 39.3, 36.7, 35.8, 28.1, 26.3, 17.8, 16.2, 13.7. HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ C43H63N5O12Sの計算値: 873.42; 実測値: 874.49.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ, ppm 8.67 (1H, s), 7.32 (2H, d, J = 7.8 Hz), 6.95 (1H, dd, J = 1.6, 7.6 Hz), 6.88 (1H, d, J = 1.8 Hz), 4.65 - 4.60 (1H, m), 4.53 - 4.43 (2H, m), 4.39 - 4.36 (1H, m), 4.24 - 4.13 (2H, m), 4.00 (2H, d, J = 7.0 Hz), 3.92 - 3.87 (2H, m), 3.77 - 3.59 (20H, m), 3.08 (2H, s), 2.51 (3H, s), 2.38 - 2.31 (1H, m), 1.98 (3H, s). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 171.2, 170.8, 170.4, 169.7, 156.8, 150.3, 148.5, 132.2, 131.7, 129.8, 126.9, 122.0, 112.8, 81.6, 70.8, 70.71, 70.69, 70.60, 70.57, 70.55, 70.52, 70.49, 70.47, 70.1, 69.6, 69.3, 69.02, 68.98, 67.9, 58.6, 57.5, 56.7, 39.0, 37.7, 36.5, 35.2, 28.1, 26.4, 23.2, 16.1. HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ C40H62N4O12Sの計算値: 822.41; 実測値: 823.5.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (2H, s), 7.58 - 7.54 (1H, m), 7.31 - 7.25 (5H, m), 7.02 (1H, d, J=9.7 Hz), 6.88 - 6.85 (1H, m), 6.78 (1H, d, J=1.5 Hz), 4.59 - 4.56 (2H, m), 4.47 - 4.25 (6H, m), 4.13 - 3.52 (20H, m), 2.47 - 2.42 (6H, m), 2.34 - 2.27 (1H, m), 2.19 - 2.03 (5H, m), 1.63 - 1.52 (2H, m), 1.48 - 1.37 (2H, m), 0.90 (18H, s); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 171.2, 171.1, 170.7, 170.3, 165.4, 156.6, 150.3, 148.4, 148.3, 138.3, 132.0, 131.8, 131.7, 130.7, 129.5, 129.4, 127.9, 126.9, 122.0, 119.7, 112.6, 71.0, 70.7, 70.5, 70.4, 70.32, 70.28, 70.25, 69.6, 67.9, 59.1, 58.8, 58.5, 57.3, 57.1, 56.7, 43.1, 39.0, 37.3, 36.8, 36.2, 35.4, 26.4, 26.3, 17.9, 17.7, 16.1, 16.0, 13.7. HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ C61H83N9O14S2の計算値: 1229.55; 実測値: 1230.66.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.61 (2H, s), 7.49 - 7.45 (1H, m), 7.32 - 7.24 (6H, m), 6.90 - 6.87 (1H, m), 6.79 (1H, d, J=2.4 Hz), 6.24 (1H, d, J=8.9 Hz), 4.61 - 4.29 (10H, m), 4.11 - 3.52 (27H, m), 2.44 (6H, s), 2.30 (1H, t, J=13.3 Hz), 2.18 - 2.03 (3H, m), 0.87 (9H, s); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 171.2, 171.1, 170.7, 170.4, 156.7, 150.3, 148.4, 138.3, 132.2, 130.9, 129.7, 129.4, 128.0, 127.0, 122.0, 112.8, 70.9, 70.6, 70.5, 70.4, 70.3, 70.2, 69.6, 67.9, 59.0, 58.8, 57.7, 57.1, 43.1, 39.0, 37.1, 36.8, 35.6, 35.5, 26.42, 26.38, 23.0, 16.13, 16.06. HRMS (ESI) m/z: [M+H]+ C58H82N8O14S2の計算値: 1178.54; 実測値: 1179.6.
DCM中のジオール(1eq.)の溶液に、ブロモ酢酸tert-ブチル(8eq.)、TBABr(1.1eq.)及び37%w/wのNaOH水溶液を添加した。反応混合物を室温で終夜強く撹拌した。有機相を水性層から分離し、次に水性相をDCMで抽出した(×3)。有機層を収集し、MgSO4で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。粗製物を、フラッシュクロマトグラフィーにより、ヘプタン中の10%〜50%v/vの酢酸エチルで溶出させて精製した。
無水EtOH(0.05M)中のベンジル化出発物質の溶液を、H-キューブ機(cube machine)に、1mL/分の速度、10気圧のH2、70℃において流入した。溶媒を減圧下で蒸発させ、最終化合物を得た。
乾燥DMF中のジカルボン酸リンカー(1eq.)の溶液に、COMU(2eq.)及びDIPEA(5eq.)を添加した。この溶液を10分間撹拌し、次に、乾燥DMF中のVHL-リガンドアミン7(2.1eq.)及びDIPEA(5eq.)の懸濁液に添加した。この混合物を、出発物質の存在がLC-MSにより検出されなくなるまで室温で撹拌した。氷を添加し、揮発性物質を減圧下で蒸発させ、粗製物を得て、これをHPLCにより、ギ酸の0.1%v/v水溶液中の20%〜70%v/vのアセトニトリル勾配を使用して精製して、最終化合物を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.87(4H, s), 3.45 (4H, t, J=6.1 Hz), 3.38 - 3.30 (8H, m), 1.67 - 1.51 (12H, m), 1.41 (18H, s).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.26 (s, 2H), 4.09 (s, 4H), 3.58 (t, J=6.1 Hz, 4H), 3.48 - 3.41 (m, 8H), 1.75 - 1.60 (m, 12H).13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ: 173.1, 71.7, 70.6, 70.4, 67.9, 26.4, 26.3, 26.1.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 7.28 - 7.19 (m, 10H), 4.49 (s, 2H), 4.43 (s, 2H), 3.62 - 3.54 (m, 10H), 3.51 - 3.48 (m, 2H), 3.43 - 3.36 (m, 4H), 1.61 - 1.48 (m, 4H), 1.42 - 1.31 (m, 2H).
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 4.00 (s, 2H), 3.92 (s, 2H), 3.69 - 3.60 (m, 10H), 3.57 - 3.53 (m, 2H), 3.52 - 3.46 (m, 2H), 3.43 (t, J=7.1 Hz, 2H), 1.67 - 1.56 (m, 4H), 1.46 (d, J=0.6 Hz, 18H), 1.43 - 1.37 (m, 2H). 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ: 169.8, 81.5, 81.4, 71.6, 71.3, 70.7, 70.6, 70.1, 69.0, 68.8, 29.5, 29.4, 28.1, 22.6.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.15 (s, 2H), 4.11 (s, 2H), 4.02 (s, 2H), 3.71 - 3.40 (m, 16H), 1.65 - 1.52 (m, 4H), 1.43 - 1.34 (m, 2H)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.88 (s, 4H), 3.53 (t, J=6.5 Hz, 4H), 3.44 (t, J=6.4 Hz, 4H), 3.34 (t, J=6.9 Hz, 4H), 1.85 - 1.78 (m, 4H), 1.55 - 1.47 (m, 4H), 1.41 (s, 18H), 1.36 - 1.29 (m, 2H).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.11 (s, 2H), 4.06 (s, 4H), 3.64 (t, J=5.9 Hz, 4H), 3.54 (t, J=5.9 Hz, 4H), 3.42 (t, J=6.4 Hz, 4H), 1.88 - 1.81 (m, 4H), 1.60 - 1.52 (m, 4H), 1.36 (dt, J=7.6, 11.9 Hz, 2H). 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ: 173.3, 71.1, 69.6, 68.2, 67.9, 29.4, 29.2, 22.7.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 7.25 - 7.22 (m, 10H), 4.40 (s, 4H), 3.47 (s, 4H), 3.39 - 3.35 (m, 8H), 1.58 - 1.47 (m, 8H), 1.37 - 1.29 (m, 4H).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.53 (t, J=6.1 Hz, 4H), 3.49 (s,4H), 3.49 (s, 4H), 3.40 (t, J=6.6 Hz,4H), 2.93(s, 2H), 1.58 -1.45(m, 8H), 1.37-1.29 (m, 4H).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.33 - 7.22 (m, 5H), 4.55 (s, 2H), 3.74 (dd, J=5.7, 11.2 Hz, 2H), 3.59 - 3.55 (m, 6H), 3.53 (t, J=6.5 Hz, 2H), 3.47 (t, J=6.4 Hz, 2H), 3.44 - 3.37 (m, 4H), 2.44 (t, J=5.7 Hz, 1H), 1.87 - 1.76 (m, 4H), 1.61 - 1.57 (m, 4H).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.66 - 3.60 (m, 4H), 3.51 - 3.38 (m, 8H), 3.38 - 3.31 (m, 4H), 1.79 - 1.69 (m, 4H), 1.57 - 1.50 (m, 4H).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.99 (s, 2H), 3.68 - 3.42 (m, 12H), 3.41 - 3.36 (m, 4H), 1.88 - 1.77 (m, 4H), 1.59 - 1.55 (m, 4H), 1.44 (s, 18H).
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 4.14 (s, 2H), 4.07 (s, 2H), 3.73 - 3.69 (m, 2H), 3.65 - 3.59 (m, 4H), 3.59 - 3.53 (m, 4H), 3.49 (t, J=6.3 Hz, 2H), 3.47 - 3.40 (m, 4H), 1.89 - 1.81 (m, 4H), 1.62 - 1.57 (m, 4H).
13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ: 173.9, 173.7, 71.3, 71.0, 70.8, 70.0, 69.6, 68.7, 68.6, 68.1, 68.0, 67.6, 29.7, 29.5, 26.3, 26.2.
1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ: 8.77 (s, 2H), 7.34 (dd, J=7.4, 23.2 Hz, 8H), 4.59 (dd, J=2.4, 9.4 Hz, 2H), 4.50 - 4.38 ( m, 6H), 4.27 (t, J=4.3 Hz, 1H), 4.24 (t, J=4.3 Hz, 1H), 3.94 (dd, J=15.3, 22.3 Hz, 2H), 3.85 (dd, J=15.3, 24.4 Hz, 2H), 3.76 (d, J=10.7 Hz, 2H), 3.72 - 3.68 (m, 2H), 3.61 - 3.40 (m, 14H), 3.35 (dt, J=1.0, 6.5 Hz, 2H), 2.37 (s, 6H), 2.16 - 2.09 (m, 2H), 2.02 - 1.96 (m, 2H), 1.57 - 1.45 (m, 4H), 1.39 - 1.32 (m, 2H), 0.94 (s, 18H).
13C-NMR (101 MHz, MeOD) δ: 174.4, 174.3, 172.1, 172.0, 171.7, 152.9, 149.0, 140.3, 133.4, 131.5, 130.5, 130.4, 129.5, 129.0, 72.9, 72.3, 72.2, 71.7, 71.6, 71.5, 71.2, 71.1, 70.7, 60.8, 58.1, 58.0, 43.7, 38.9, 37.2, 37.1, 30.5, 30.4, 27.0, 26.9, 23.8, 15.8.
HRMS: 実測値1177.6435 [M+H+].
1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ: 8.77 (s, 2H), 7.34 (dd, J=8.3, 23.6 Hz, 8H), 4.59 (d, J=12.0 Hz, 2H), 4.50 - 4.40 (m, 6H), 4.26 (dd, J=4.9, 15.9 Hz, 2H), 3.86 (dd, J=15.3, 23.4 Hz, 4H), 3.77 (d, J=11.4 Hz, 2H), 3.70 (dd, J=3.9, 11.1 Hz, 2H), 3.46 (t, J=6.0 Hz, 4H), 3.38 - 3.28 (m, 8H), 2.37 (s, 6H), 2.16 - 2.10 (m, 2H), 2.02 - 1.96 (m, 2H), 1.62 - 1.52 (m, 8H), 1.51 - 1.45 (m, 4H), 0.93 (s, 18H).
13C-NMR (101 MHz, MeOD) δ: 174.3, 172.1, 172.0, 171.7, 152.8, 149.1, 140.3, 133.4, 131.5, 130.5, 130.4, 129.5, 129.0, 72.7, 71.7, 71.5, 71.1, 70.7, 60.8, 58.1, 58.0, 43.7, 39.0, 37.2, 27.6, 27.5, 27.4, 15.9.
HRMS: 実測値1175.6623 [M+H+].
1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ: 8.76 (s, 2H), 7.37 - 7.30 (m, 8H), 4.60 (d, J=9.4 Hz, 2H), 4.50 - 4.24 (m, 8H), 3.87 (d, J=6.5 Hz, 4H), 3.77 (d, J=11.2 Hz, 2H), 3.70 (dd, J=3.8, 11.5 Hz, 2H), 3.55 - 3.49 (m, 4H), 3.43 (dt, J=1.2, 6.2 Hz, 4H), 3.33 - 3.29 (m, 4H), 2.37 (s, 6H), 2.16 - 2.10 (m, 2H), 2.03 - 1.96 (m, 2H), 1.80 - 1.74 (m, 4H), 1.47 - 1.40 (m, 4H), 1.30 - 1.23 (m, 2H), 0.93 (s, 18H).
13C-NMR (101 MHz, MeOD) δ: 174.3, 171.8, 171.6, 152.8, 149.0, 140.2, 133.4, 131.5, 130.5, 130.3, 129.5, 128.9, 71.9, 71.0, 70.8, 69.8, 68.3, 60.8, 58.1, 57.9, 43.7, 38.9, 37.2, 30.9, 30.5, 26.9, 23.9, 15.8.
HRMS: 実測値1161.6446 [M+H+].
1H-NMR (500 MHz, MeOD) δ: 9.00 (d, J=1.1 Hz, 2H), 7.45 (dd, J=8.4, 23.1 Hz, 8H), 4.71 - 4.68 (m, 2H), 4.55 (tt, J=12.4, 11.9 Hz, 6H), 4.36 (d, J=15.5 Hz, 2H), 4.03 (d, J=3.6 Hz, 2H), 3.97 (d, J=5.9 Hz, 2H), 3.89 - 3.78 (m, 4H), 3.71 - 3.68 (m, 2H), 3.64 - 3.36 (m, 14H), 2.49 (s, 6H), 2.26 - 2.19 (m, 2H), 2.13 - 2.06 (m, 2H), 1.90 - 1.84 (m, 2H), 1.85 - 1.79 (m, 2H), 1.61 - 1.55 (m, 4H), 1.04 (d, J=3.4 Hz, 18H).
13C-NMR (101 MHz, MeOD) δ: 174.4, 174.3, 172.1, 171.9, 171.8, 171.7, 153.3, 140.6, 131.1, 130.4, 129.0, 72.3, 71.8, 71.2, 71.1, 70.9, 69.9, 69.4, 68.7, 68.4, 60.8, 58.2, 58.1, 58.0, 43.7, 38.9, 37.2, 37.1, 31.1, 31.0, 27.5, 27.0, 15.4. HRMS: 実測値1191.6137 [M+H+].
1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ: 8.89 (s, 2), 7.46 (d, J=8.7 Hz, 8H), 4.99 (td, J=3.3, 52.9 Hz, 2H), 4.69 (s, 2H), 4.65 (dd, J=2.9, 21.3 Hz, 2H), 4.60 - 4.34 (m, 6H), 4.08 - 4.03 (m, 6H), 3.77 - 3.59 (m, 22H), 2.49 (s, 6H), 1.06 (s, 18H).
19F-NMR (376.45 MHz, MeOD): -201.87 ,13C-NMR (101 MHz, MeOD) δ: 170.9, 170.5, 169.2, 169.1, 151.5, 147.7, 138.6, 130.2, 129.0, 127.5, 94.0, 92.1, 70.9, 70.2, 70.1, 70.1, 69.6, 69.5, 64.4, 64.1, 56.1, 50.9, 42.4, 35.3, 25.5, 14.4. HRMS: 実測値1215.5214 [M+H+].
BAIB、ビス-アセトキシヨードベンゼン;
CID、二量体形成の化学的誘発剤;
CRL、クリンRINGリガーゼ;
DC50、半分解濃度;
DCM、ジクロロメタン;
DIPEA、N,N-ジイソプロピエチルアミン;
DMF、ジメチルホルムアミド;
DMSO、ジメチルスルホキシド;
HATU、1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3イトリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート;
Hdy-HIF-1α、ヒドロキシル化形態のHIF-1α;
HIF-1α、低酸素誘導因子アルファ;
Hyp、ヒドロキシプロリン;
HOAT、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール;
IAPS、アポトーシスタンパク質の阻害剤;
ITC、等温滴定熱量測定;
LHS、左側;
PEG、ポリエチレングリコール;
PHD、プロリルヒドロキシラーゼドメイン含有タンパク質;
PPI、タンパク質-タンパク質相互作用;
PROTACS、標的タンパク質分解誘導キメラタンパク質;
RHS、右側;
SEC、サイズ排除クロマトグラフィー;
TEMPO、2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-イル)オキシル又は(2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-イル)オキシダニル;
TFA、トリフルオロ酢酸;
VHL、フォンヒッペル-リンダウ;
HRE、低酸素応答要素。
[参考文献]
Claims (21)
- 構造:
A-L-B
[式中、
A及びBは、独立して、式1A又は1B:
Lは、R1若しくはR2において式1Aの化合物と直接結合し、且つ/又はR3若しくはR4において式1Bの化合物と直接結合する連結基であり、Lは、-R5-[O(CH2)m]n-R6-(式中、m及びnは、独立して0〜10であり、R5及びR6は、共有結合、C1〜C10アルキレン、-OR7-、C1〜C10ポリエーテル、又は-O-の群から独立して選択される)であり;
R1は、(1)LがR1において式1Aの化合物と結合している場合は、共有結合若しくはC1〜C5アルキレンの群、又は(2)LがR2において式1Aの化合物と結合している場合は、H、NH2、C1〜C5アルキル、若しくはC(CN)C2H4の群のいずれかから選択され、
R2、R3、及びR4は、共有結合、H、NH2、C1〜C5アルキル、C(CN)C2H4の群から独立して選択され;
X及びYは、H、OH又はハロゲンの群から独立して選択され;
R7は、C1〜C5アルキレンである]
を有する化合物、又は薬学的に許容されるその塩、水和物、溶媒和物、若しくは多形体である、化合物。 - Xが、H又はハロゲンである、請求項1に記載の化合物。
- YがOHである、請求項1又は2に記載の化合物。
- A又はBのいずれかが、式1Aによる化合物であり、Aが、式1C:
- Aが、式1Aの化合物であり、Bが、式1Aの化合物である、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
- Lが、式1AのR1を介してAに連結している、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
- Lが、式1AのR1を介してBに連結している、請求項1から6のいずれか一項に記載の化合物。
- R5が化学結合であり、R6が化学結合であり、mが2であり、nが3、4又は5である、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物。
- nが5である、請求項8に記載の化合物。
- 式2、式3又は式4:
R1a、R1b及びR1cは、H、NH2、C1〜C5アルキル、及びC(CN)C2H4から独立して選択され;
X1及びX2は、H、OH、ハロゲンから独立して選択され;
Y1及びY2は、H、OH、ハロゲンから独立して選択され;且つ
m及びnは、独立して0〜10である]
を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物。 - nが3〜5である、請求項10に記載の化合物。
- mが1〜4である、請求項10又は11に記載の化合物。
- リンカーLが、12〜20原子の長さの直鎖である、請求項1から12のいずれか一項に記載の化合物。
- リンカー鎖が、炭素及び/又は酸素原子を含む、請求項13に記載の化合物。
- 前記リンカー鎖が、アルキレン基及び/又はエーテル基及び/又はポリエーテル基を含む、請求項14に記載の化合物。
- 以下の群:
- 化合物(5)である、請求項16に記載の化合物。
- 請求項1から17のいずれか一項に記載の1種又は複数の化合物及び薬学的に許容されるそれらのためのビヒクル又は希釈剤を含む医薬組成物。
- 慢性腎疾患に起因する貧血、がん化学療法に起因する貧血、虚血、虚血性再灌流傷害、心筋梗塞、脳卒中、急性肺傷害、小腸炎症、創傷治癒及び移植後合併症、ミトコンドリア呼吸鎖障害並びにT-細胞応答を増強させることにより治療可能な腫瘍学的状態の少なくとも1つの治療のための、請求項1から17のいずれか一項に記載の化合物又は請求項18に記載の医薬組成物の使用方法。
- 対象における標的タンパク質の活性を調節する方法であって、請求項1から17のいずれか一項に記載の化合物又は請求項18に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
- 前記標的タンパク質が、E3ユビキチンリガーゼタンパク質である、請求項20に記載の方法。
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