CN110573507B - 小分子 - Google Patents

Abstract

提出了具有通式结构A‑L‑B的化合物，其中A和B独立地是式1A或1B的E3泛素连接酶蛋白结合配体化合物。还提出了包含这些化合物的药物组合物及使用方法。

Description

小分子

发明领域

本发明涉及小分子E3泛素连接酶蛋白结合配体化合物，和它们在蛋白质水解靶向嵌合体(PROteolysis Targeted Chimera，PROTAC)中的效用，及其制备方法，以及在医学中的用途。本发明特别涉及能够诱导E3泛素连接酶的自泛素化并引发其随后的蛋白酶体降解的PROTAC。

发明背景

E3泛素连接酶正在成为针对小分子调节和药物发现的有吸引力的靶标。E3使底物蛋白和泛素彼此紧密靠近，以催化泛素分子向底物的转移。底物泛素化可引发不同的细胞结局，其中最具有特征性的特征之一是多泛素化(poly-ubiquitination)和随后的蛋白酶体降解。人基因组包含＞600种预测的E3连接酶，这些酶在正常细胞生理学和疾病状态中起着重要作用，使得它们成为抑制剂发现的有吸引力的靶标。然而，E3连接酶不包含用于与小分子结合的深(deep)且“可被药物靶向(druggable)”的活性位点。因此，E3连接酶活性的阻断需要靶向蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)，并且经常延伸、平坦和溶剂暴露的PPI表面使其成为药物设计的挑战。迄今为止，仅开发了数种强效的抑制剂，大多数化合物与E3底物识别位点结合，例如MDM2，凋亡蛋白抑制剂(inhibitor ofapoptosis protein，IAP)，希-林(von Hippel-Lindau，VHL)连接酶^1-3和KEAP1。E3：底物相互作用的抑制剂在生物物理结合与细胞效力之间的有效浓度可存在差异³，这是由于来自高亲和力内源性底物的竞争，其由于抑制作用而显著提高了其细胞浓度。这造成了局限性，例如需要使用高浓度的抑制剂，这可导致脱靶(off-target)效应和细胞毒性，以及对酶活性的不完全阻断。而且，E3连接酶是多结构域和多亚基的酶，并且靶向单个结合位点使得其他骨架的骨架区域保持不受影响并使其他相互作用发挥作用。结果，E3连接酶抑制可能无效或无法概括(recapitulate)基因敲除或敲低。因此，需要靶向E3连接酶的新化学形式。

E3连接酶不仅是用于抑制的靶标。已发现具有天然或合成来源的化合物与E3连接酶结合并促进新蛋白质的募集。这些界面化合物诱导连接酶-靶标PPI的从头形成(de novoformation)，这有效地操纵了针对新底物的E3泛素化活性，从而实现了靶蛋白的降解。一类具有E3连接酶活性的小分子操纵者(small molecule hijacker)包括单价化合物。这些所谓的“分子胶(molecular glue)”包括植物激素生长素(auxin)，它与Cullin RING连接酶(CRL)CRL1-TIR1结合以靶向Aux/IAA家族的转录阻遏蛋白，以及免疫调节药物(immunomodulatory drug，IMiD)沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomalidomide)及类似物CC-885，它们都与CRL4-CRBN连接酶的亚基cereblon(CRBN)结合，并将CRBN的活性重定向到不同的底物。^4-10最近，发现磺胺类抗癌药物indisulam可诱导剪接因子RBM39通过募集CRL4-DCAF15活性而降解。表现出相似作用机理的一类不同的化合物是称为蛋白质水解靶向嵌合体(PROTAC)的二价分子。PROTAC包含由接头连接的连接酶的第一弹头部分(first warhead moiety)和靶蛋白的第二弹头。¹¹PROTAC、连接酶与靶标之间三元复合体的形成引发邻近诱导的靶标泛素化和降解。弹头配体(warhead ligand)已被用于开发强效的且具有细胞活性的PROTAC，其募集不同的连接酶，包括CRL2-VHL、^12-15CRL4-CRBN、^16-20和IAP。^21-22其中被PROTAC成功降解的靶标是BET蛋白Brd2、Brd3和Brd4，^{12，14- 17}FKBP，^16，20蛋白激酶^13，18等^13，21。PROTAC的一个具有吸引力的特征是其亚化学计量的催化活性，¹³这不需要与用常规抑制剂一样完全占据靶标结合位点，导致降解浓度可比其单独组成部分的抑制浓度低数个数量级。此外，诱导的靶标耗尽可具有与靶标抑制相比更持久的细胞效应，并且可克服补偿性细胞反馈机制(例如靶标水平的升高)。至关重要的是，已示出，PROTAC分子可以在弹头配体的固有结合选择性之外展现出更多的蛋白质降解选择性^{12，15，１８}。我们最近关于靶向CRL2-VHL的Brd4选择性PROTAC的结构研究表明了在连接酶与靶标之间的特异性配体诱导的PPI的重要性，其有助于稳定且高度密集的三元复合体的合作形成。¹⁵

本发明人现已发现，使用适当设计的PROTAC，可以靶向E3连接酶本身以进行泛素化和蛋白酶体降解。对于至少某些方面，本发明人已发现包含两个E3结合部分实例的PROTAC可能能够形成三元复合体，其中相同的E3既起泛素化酶作用又起新底物作用。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了具有结构A-L-B的化合物，或其可药用盐、水合物、溶剂合物或多晶型物：

其中A和B独立地是式1A或1B的E3泛素连接酶蛋白结合配体化合物：

其中L是在R¹或R²处与式1A化合物直接键合和/或在R³或R⁴处与式1B化合物直接键合的连接基团，并且其中L是-R⁵-[O(CH₂)_m]_n-R⁶-，其中m和n独立地是0至10，并且R⁵和R⁶独立地选自下组：共价键、C1-C10亚烷基、-OR⁷-、C1-C10聚醚或-O-；

其中R¹选自以下中的任一者：组(1)当L在R¹处与式1A化合物键合时：共价键或C1-C5亚烷基；或组(2)当L在R²处与式1A化合物键合时：H、NH₂、C1-C5烷基或C(CN)C₂H₄；

其中R²、R³和R⁴独立地选自下组：共价键、H、NH₂、C1-C5烷基、C(CN)C₂H₄；

其中X和Y独立地选自下组：H、OH或卤素；

以及

其中R⁷是C1-C5亚烷基。

因此，式A-L-B化合物可包含通过接头L与式1A或1B化合物连接的式1A或1B化合物。在其中A和/或B是式1A化合物的一些实施方案中，式1A化合物可通过R¹或R²与接头L连接。在其中A和/或B是式1B化合物的一些实施方案中，式1B化合物可通过R³或R⁴与接头L连接。

如本文所述的具有通式A-L-B的化合物可在以下描述中称为“PROTAC-化合物”，“HOMO-PROTAC化合物”(其中部分A与部分B相同)，“Hetero-PROTAC化合物”(其中部分A与部分B不同)，或简称为“本发明的化合物”。

发明人出乎意料地发现具有如上限定的结构A-L-B的化合物能够通过利用E3泛素化机制本身来诱导细胞内E3泛素连接酶蛋白的降解。因此，表明了具有结构A-L-B的化合物与两个E3泛素连接酶蛋白形成三级结构，以使得一个E3泛素连接酶蛋白将通过结构A-L-B的化合物与之连接的另一个E3泛素连接酶蛋白泛素化。还表明了该泛素化是由于两个E3泛素连接酶蛋白在三级结构中被迫紧密接近而诱导的，所述三级结构通过E3泛素连接酶蛋白与式1A或1B化合物的结合而形成的。

此外，已发现本发明的化合物能够以亚化学计量的浓度引发降解，从而表明该化合物至少部分地催化了降解。

在一些实施方案中，X可以是H或卤素。

在其中X是卤素的一些实施方案中，X可选自F、Cl、Br或I。例如，X可选自F或Cl。X可以是F。

在一些实施方案中，Y可以是OH。通常，Y在下式1C中所示的“向下(down)”位置。

在其中A或B是根据式1A化合物的实施方案中，A或B可具有式1C：

在一些实施方案中，A可以是式1A化合物，并且B可以是式1A化合物。

L可通过式1A的R¹与A连接。L可通过式1A的R¹与B连接。

或者，L可通过式1A的R²与A连接，并且L可以是被连接的。

在一些实施方案中，R⁵可以是化学键，R⁶可以是化学键，m可以是2并且n可以是3、4或5。

在一些优选的实施方案中，n是5。

一些实施方案的化合物可具有式2、3或4：

其中R^2a、R^2b和R^2c独立地选自H、NH₂、C1-C5烷基和C(CN)C₂H₄；R^1a、R^1b和R^1c独立地选自H、NH₂、C1-C5烷基和C(CN)C₂H₄；

X¹和X²独立地选自H、OH、卤素；

Y¹和Y²独立地选自H、OH、卤素；以及

m和n独立地是0至10。

优选地，对于式2、3或4的化合物，n是3至5。通常，m是1至4。优选地，m是2，以使得接头由聚乙二醇亚基形成。

在一些实施方案中，R^1a、R^1b和R^1c可独立地选自C1-C5烷基或C(CN)C₂H₄。在另外的实施方案中，R^1a、R^1b和R^1c可独立地选自C1烷基(即甲基或Me)和C(CN)C₂H₄。

在一些实施方案中，R^2a、R^2b和R^2c可以是H。

在一些实施方案中，Y¹和Y²可以是OH；X¹和X²可以是H；R^la、R^1b和R^1c可独立地是Me或C(CN)C₂H₄；且R^2a、R^2b和R^2c可以是H。

在一些优选的实施方案中，接头L是长度为12至20个原子的直链。已发现，当基团A和B间隔开时，本发明的化合物对于诱导靶蛋白的降解是最有用的。因此，在不希望受理论束缚的情况下，已发现长度为12至20个原子的直链的接头L将基团A和B间隔开足够的距离以允许它们与其靶标结合位点结合而不相互干扰，同时确保靶蛋白保持足够的接近，以使与A和B中的任一者或二者结合的E3泛素连接酶蛋白可使靶蛋白泛素化，从而标记该蛋白以通过细胞的机器(machinery)进行后续降解。

L可以是长度为15至18个原子的直链。例如，L可以是长度为15、16、17或18个原子的直链。

通常，接头链可包含碳和/或氧原子。例如，接头链可包含亚烷基团和/或醚基团和/或聚醚基团。

替选地，例如，接头链可以是肽链或核苷酸链。

如本文所用，术语“可药用盐”是指通过本发明的方法形成的化合物的那些盐，它们在合理的医学判断范围内适用于与人和低等动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、变应性应答等，并且与合理的收益/风险比相称。可药用盐是本领域公知的。这些盐可在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或者通过使游离碱官能团与合适的有机酸反应而单独制备。适用于本文中用途的可药用盐的一些实例包括但不限于无毒的酸加成盐，其是与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或与有机酸(例如乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的或者通过使用本领域中使用的其他方法(例如离子交换)形成的氨基的盐。

其他可药用盐包括但不限于己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐(camphorate)、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。其他可药用盐在适当时包括无毒的铵、季铵和使用反离子形成的胺阳离子，所述反离子例如卤化物、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有1至6个碳原子的烷基、磺酸根和芳基磺酸根。

在本文的一个优选方面中，用于本文所限定的结构A-L-B-的PROTAC化合物的式I化合物表示为限定的立体异构体。这样的化合物的绝对构型可使用本领域已知的方法(例如如X射线衍射或NMR)和/或来自已知立体化学的原料中的启示来确定。

根据本发明的药物组合物将优选包含所指出的立体异构体的基本上立体异构纯的制备物。

如本文所提及的化合物和中间体的纯立体异构体形式被限定为基本上不含所述化合物或中间体的相同基本分子结构的其他对映体或非对映体形式的异构体。特别地，术语“立体异构纯的”涉及立体异构体过量至少80％(即最小90％的一种异构体和最大10％的其他可能的异构体)至立体异构体过量100％(即，100％的一种异构体且不含其他异构体)的化合物或中间体，更特别地，立体异构体过量90％至100％，甚至更特别地立体异构体过量94％至100％，最特别地立体异构体过量97％至100％的化合物或中间体。术语“对映体纯的”和“非对映体纯的”应以类似的方式理解，但随后分别考虑所讨论的混合物的对映体过量和非对映体过量。

本文详述的化合物和中间体的纯立体异构形式可通过应用本领域已知的过程获得。例如，对映体可通过其非对映体盐与旋光性酸或碱的选择性结晶而彼此分离。其实例是酒石酸、二苯甲酰基-酒石酸、二甲苯酰基酒石酸和樟脑磺酸。或者，对映体可通过使用手性固定相的色谱技术分离。所述纯立体化学异构形式也可来源于适当原料的相应纯立体化学异构形式，条件是反应立体定向性地发生。优选地，如果期望特定的立体异构体，则通过立体定向性的制备方法合成所述化合物。这些方法将有利地采用对映体纯的原料。

用于如本文所限定的具有结构A-L-B的PROTAC化合物中的式1A或1B化合物的非对映体外消旋体可通过常规方法单独获得。可有利地采用的适当的物理分离方法是，例如，选择性结晶和色谱法，例如柱色谱法。

根据本发明的第二方面，提供了选自下组的化合物：

在一个优选的实施方案中，所述化合物选自化合物(7)至(13)的组。例如，该化合物可以是化合物(7)。

本发明在第三方面中扩展到药物组合物，其包含一种或更多种根据第一或第二方面的化合物以及用于此的可药用载剂或稀释剂。

本发明的PROTAC化合物可通过任何常规途径作为药物组合物施用，所述途径特别是经肠内(例如经口，例如以片剂或胶囊剂的形式)、或经肠胃外(例如以可注射溶液或混悬剂的形式)、表面地(例如以洗剂、凝胶剂、软膏剂或乳膏剂的形式，或者以鼻剂或栓剂的形式)。包含游离形式或可药用盐形式的本发明的PROTAC化合物与至少一种可药用载体或稀释剂组合的药物组合物可通过混合、制粒或包衣方法以常规方式制备。例如，经口组合物可以是片剂或明胶胶囊剂，其包含活性成分以及a)稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸)；b)润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、其镁盐或钙盐、和/或聚乙二醇)；对于片剂，还包含c)黏合剂(例如硅酸铝镁、淀粉糊、明胶、黄芪胶(tragacanth)、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮)；如果需要的话，还包含d)崩解剂(例如淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐，或泡腾合剂)；和/或e)吸收剂、着色剂、调味剂和甜味剂。可注射组合物可以是等张水溶液或悬浮剂，并且栓剂可由脂肪乳剂或悬浮剂制备。组合物可被灭菌和/或可包含辅料，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可包含其他有治疗价值的物质。用于透皮施加的合适制剂包括有效量的本发明的PROTAC化合物以及载体。载体可包含可吸收的药理学可接受的溶剂，以帮助通过宿主的皮肤。例如，透皮装置是绷带的形式，其包含：背衬构件；装有化合物以及任选的载体的贮存器；任选地速率控制屏障，以在延长的时间内以受控和预定的速率将化合物递送至宿主的皮肤；以及将装置固定至皮肤的部件。也可使用基质透皮制剂。用于表面施加(例如施加至皮肤和眼)的合适制剂优选是本领域公知的水性溶液、软膏剂、乳膏剂或凝胶剂。这样的制剂可包含增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。

本发明的药物组合物包含治疗有效量的与一种或更多种可药用载体一起配制的本发明的PROTAC化合物。如本文所用，术语“可药用载体”意指任何类型的无毒的惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂辅助剂。

本发明的药物组合物可经口、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、表面(如通过散剂、软膏剂或滴剂)、含服，或作为经口或经鼻喷雾剂施用于人和其他动物。

用于经口施用的液体剂型包括可药用乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性化合物外，液体剂型还可包含本领域常用的惰性稀释剂(例如如水或其他溶剂)、增溶剂和乳化剂(例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇(tetrahydrofurfuryl alcohol)、聚乙二醇、和脱水山梨醇的脂肪酸酯，及其混合物。除惰性稀释剂外，经口组合物还可包含辅料，例如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂和香料剂。

可根据已知技术使用合适的分散剂或湿润剂和助悬剂来配制可注射制剂(例如无菌的可注射水性或油质悬浮液)。无菌注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如如在1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的载剂和溶剂中，可使用的是水、林格溶液(Ringer’s solution)，U.S.P.和等张氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，在注射剂的制备中使用脂肪酸例如油酸。为了延长药物的作用，通常需要减慢皮下或肌内注射的药物的吸收。这可通过使用水溶性差的结晶或无定形物质的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率转而可取决于晶体尺寸和晶体形式。或者，通过将药物溶解或悬浮在油载剂中来实现肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。用于直肠或阴道施用的组合物优选是栓剂，其可通过将本发明的PROTAC化合物与合适的无刺激性的赋形剂或载体(例如可可豆脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合而制备，所述赋形剂或载体在环境温度下为固体，但在身体温度下为液体，并因此在直肠或阴道腔中融化并释放出活性化合物。相似类型的固体组合物也可使用例如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂用作软填充明胶胶囊剂和硬填充明胶胶囊剂中的填料。

PROTAC化合物也可以微包封形式与一种或更多种上述赋形剂一起提供。片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可用包衣和壳(例如肠溶包衣、控释包衣和药物配制领域公知的其他包衣)制备。在这样的固体剂型中，可将活性化合物与至少一种惰性稀释剂(例如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。按照惯常做法，这些剂型还可包含除惰性稀释剂以外的其他物质，例如压片润滑剂和其他压片助剂(例如硬脂酸镁和微晶纤维素)。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。

用于本发明化合物的表面或透皮施用的剂型包括软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、散剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂或贴剂。将活性成分在无菌条件下与可药用载体和可能需要的任何所需的防腐剂或缓冲剂混合。眼用制剂、滴耳剂、眼软膏剂、散剂和溶液剂也被认为在本发明的范围内。除本发明的活性化合物外，软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂还可包含赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌，或其混合物。

除本发明的PROTAC化合物外，散剂和喷雾剂还可包含赋形剂，例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂还可包含典型的推进剂，例如氯氟烃。透皮贴剂具有提供化合物向身体的受控递送的附加优点。这样的剂型可通过将化合物溶解或分配在适当的介质中来制备。吸收增强剂也可用于提高化合物穿过皮肤的通量。可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制速率。

在第四方面中，本发明提供了如本文所限定的具有结构A-L-B的PROTAC化合物，其用作药物。

在本发明的第五方面中，提供了使用根据第一或第二方面中的任一项的化合物或根据第三方面的药物组合物用于治疗以下疾病中的至少一种的方法：由于慢性肾疾病引起的贫血²³、由于癌症化学治疗引起的贫血²⁴、缺血²⁵、缺血再灌注损伤²⁶、心肌梗死²⁷、卒中²⁷、急性肺损伤²⁸、肠道炎症²⁹、伤口愈合³⁰和移植后并发症³¹、线粒体呼吸链功能障碍³²和可通过增强T细胞应答治疗的肿瘤病症³³。

根据本发明的第六方面，提供了调节对象中靶蛋白的活性的方法，该方法包括向所述对象施用治疗有效量的根据第一或第二方面的化合物或根据第三方面的药物组合物。

如本文所用，术语“对象”是指哺乳动物。因此，对象是指例如狗、猫、马、牛、猪、豚鼠等。优选地，对象是人。当对象是人时，该对象在本文中也可称为患者。

术语“治疗有效量”意指有效治疗、治愈或改善疾病、病症或病的量。

优选地，靶蛋白是E3泛素连接酶蛋白。通常，E3泛素连接酶蛋白选自CRL2-VHL、CRL4-CRBN。E3泛素连接酶蛋白可选自＞230种cullinRING连接酶中的任一种，例如CRL1-Skp2、CRL1-bTrCP、CRL1-Fbw、CRL1-Fbxo、CRL1-Fbxl、CRL2-LRR1、CRL2-FEM1、CRL3-Keap1、CRL3-KLHL、CRL3-SPOP、CRL4-DDB2、CRL4-DCAF、CRL4-CSA、CRL4-CDT2、CRL5-SOCS、CRL5-ASB。其他E3泛素连接酶蛋白可选自MDM2、c-Cbl、APC-C、FANCL、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE3D、Parkin、SIAH、XIAP、UHRF1、TRAF6、PELI2、RNF2、RNF4等。

适当地，第一至第六方面的优选和任选特征可以是第一至第六方面中的其他的优选和任选特征。

附图简述

现在将参照附图通过非限制性实例描述本发明的一些实施方案。

图1：(a)与VH298配合的VHL的晶体结构(PDB代码5LLI)。VHL以表面表示(surfacerepresentation)示出，结合配体以棒表示(sticks representation)。(b)VHL抑制剂VH032和VH298的化学结构。

图2：Homo-PROTAC化合物的一般化学结构和设计。指示了乙酰基和苯基处的连接位点。

图3：由乙酰基CM09、CM10、CM11对称的Homo-PROTAC化合物和阴性对照化合物CMP98的合成。

图4：具有顺-反构型的阴性对照Homo-PROTAC化合物CMP99的合成。

图5：VHL结合部分17和18的合成。

图6：从苯基对称衍生的Homo-PROTAC CMP106和CMP108的合成。

图7：不对称的Homo-PROTAC CMP112和CMP113的合成。

图8：HOMO-PROTAC的生物学评价。(a)用0.1％DMSO、VH032(150μM)和1μM所示化合物将HeLa细胞处理10小时。在SDS-PAGE之后，相应地通过使用相应特异性抗体的Western印迹来分析单个蛋白质的丰度。(b)用靶向VHL蛋白的si-RNA或阴性对照si-RNA处理(48小时)，以及用CM11(1μM)或0.1％v/v DMSO将不同的细胞系处理10小时。

图9：用升高浓度的HOMO-PROTAC CM11将HeLa细胞处理4小时或24小时。

图10：来自经受0.1％DMSO、CoCl2(100mM)、IOX2(150mM)，VH032(250mM或1mM)或1mM CM11的HeLa细胞的裂解物的时程免疫印迹(Time-course immunoblot)。

图11.化合物活性是CRL2VHL和蛋白酶体依赖性的。在不存在或存在蛋白酶体抑制剂MG132、MLN4924、VHL抑制剂VH032或PHD2抑制剂IOX4的情况下，用CM11处理的HeLa细胞。

图12.与VHL结合的Homo-PROTAC的生物物理研究。(a)相对于VCB的CM11 CMP99或CMP98滴定的积分ITC热曲线的叠加。(b)将CM11、CMP98、CMP99、VH032或DMSO与VCB一起孵育后，对复合体形成的SEC测定。(c)AlphaLISA：针对VCB滴定CM09、CM10、CM11和CMP98的强度值。每个点是四个技术重复的平均值(±SEM)强度。

图13：提出的Homo-PROTAC CM11的作用机理模型。

图14：用指定浓度下的指定化合物将稳定表达HRE-萤光素酶报告质粒的HeLa或U2OS细胞处理指定时间。

图15：HeLa中的CA9 mRNA表达的剂量应答曲线(16小时)。

图16：用升高浓度的所示化合物将Hela细胞处理4小时或24小时。

图17：U2OS中的浓度依赖性实验(10小时处理)(左)和来自U2OS的裂解物的时程实验(右)。

图18：来自经受0.1％DMSO、CoCl2(100μM)、IOX2(150μM)、VH032(250μM或1μM)或1μM所示化合物的HeLa细胞的裂解物的时程免疫印迹。

图19：针对VCB的CM09(a)、CM10(b)和CM11(c)的积分ITC热曲线。

图20：相对于VCB的CM11、CM09或CM10滴定的积分ITC热曲线的叠加。

图21：在CM11、CM09、CM10或DMSO(黑色)与VCB孵育后，复合体形成的SEC测定。

图22：靶向cereblon的免疫调节药物。(a)化学结构。(b)与CRBN结合的泊马度胺的晶体结构(PDB代码4CI3)⁵。

图13：被设计成在一端募集CRL4^CRBN而在另一端募集CRL2^VHL的Hetero-PROTAC的结构。

图24：中间体29和45的合成。

图25∶52(CMP85)和51(CMP86)的合成。

图26：环化反应的副产物53。

图27：CM09、CM10、CM11的化学结构。

图28：用1μM的CM09、CM10、CM11、DAT265、CMP85或CMP86、0.1％DMSO、CoCl₂(100μM)、IOX2(50μM)、IOX4(50μM)处理HeLa、Hek293和U2OS细胞。

图29：针对VCB的CMP106的积分ITC热曲线。

图30：针对VCB的CMP108的积分ITC热曲线。

图31：针对VCB的CMP1l2的积分ITC热曲线。

图32：针对VCB的CMP113的积分ITC热曲线。

图33：针对VCB的CM09、CM10、CM11、CMP112、CMP113、CMP106、CMP98和CMP99的积分ITC热曲线的叠加。

发明详述

尽管下面详细讨论本发明的多种实施方案的制造和使用，但应理解，本发明提供了许多可应用的发明构思，这些构思可在广泛多种特定的情况下呈现。本文讨论的特定实施方案仅是对制造和使用本发明的特定方式的举例说明，并不限定本发明的范围。

为了促进对本发明的理解，下面定义了许多术语。本文所定义的术语具有与本发明有关的领域的普通技术人员通常理解的含义。例如“一个/种”和“该/所述”的术语并非旨在仅指代单数实体，而是包括其的一般类别，其中的特定实例可用于举例说明。本文中的术语用于描述本发明的一些特定实施方案，但是除了权利要求中所概述的以外，它们的用法不限定本发明。

生物学

使购自ATCC的人细胞系HeLa、U2OS和HEK 293在37℃和5％CO₂下在补充有10％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺、100μg ml^-1青霉素/链霉素的DMEM中增殖。将细胞维持不超过30代。使用Lonza的MycoAlert试剂盒对所有细胞系的支原体污染进行常规测试。

小干扰RNA。

为了进行siRNA抑制研究，将3×10⁵个细胞接种到6孔板的每个孔中，以在转染当天达到70％的汇合。将siRNA(SMARTpool：ON-TARGETplus VHL siRNA L-003936-00-0005)制备为无RNase的1×siRNA缓冲液中的20μM溶液。阴性对照siRNA(来自Life Technologies的siRNA，cat.#4390843)用作阴性对照。转染当天，将旧培养基替换为新鲜培养基。将VHL靶向siRNA和阴性对照二者的siRNA溶液(5μL)添加至1.5mL管中的250μL Opti-mem。一式两份制备该溶液。通过移液将每个管中的内容物混合。将Lipofectamine RNAiMax(5μL)添加至另一个1.5mL管中的250μL Opti-mem。一式两份制备该溶液。通过移液将每个管中的内容物混合。将来自步骤2中的溶液添加至步骤3中的管。将溶液通过短暂涡旋混合，然后在室温下孵育20分钟。将管短暂离心。将全部体积的转染混合物添加至6孔板。将板轻轻地来回旋转以混合内容物。收获前，将板在37℃和5％CO₂下孵育48小时。

单点处理

对于单时间点处理实验，将细胞转移至6孔板中，其中2ml培养基中每孔5×10⁵个细胞，以在第二天达到80％汇合。通过将粉末溶解在100％v/v DMSO中以达到最终所需的储备浓度来制备化合物的储备浓度。

在处理当天，就在处理之前，使用DMEM将所有化合物样品制成100倍浓缩的化合物溶液。将实验样品(20μL)添加至装有2ml培养基的6孔板。最终DMSO浓度为0.1％v/v。在收获之前，将细胞在37℃和5％CO₂下孵育所需的时间。

时程实验

对于时间依赖性处理，将细胞转移至6孔板中，其中2ml培养基中每孔3×10⁵个细胞。如以上详述或单时间点实验制备样品。在收获前的指定时间点进行处理。

ML4924和MG132处理

将细胞转移至6孔板中，其中2ml培养基中每孔5×10⁵个细胞，以在第二天达到80％汇合。在t＝0时，将MLN4924以3μM的最终浓度和0.1％v/v的DMSO添加至所需的孔中。将DMSO(0.1％v/v最终浓度)添加至剩余的孔，以在所有孔中匹配相同的载剂浓度。在t＝3小时时，将MG 132以50μM的最终浓度和0.1％v/v的DMSO添加到所需的孔中。将DMSO(0.1％v/v最终浓度)添加至剩余的孔，以在所有孔中实现相同的载剂浓度。在t＝3.5小时时，用0.1％v/v DMSO终浓度的1μM CM11处理所需的孔。将DMSO(0.1％v/v最终浓度)添加至剩余的孔，以在所有孔中获得相同的载剂浓度。因此，DMSO的总最终浓度为0.3％v/v。收获前，将板在37℃和5％CO₂下孵育4小时。

VH032的竞争实验

将细胞转移至6孔板，其中2ml培养基中每孔5×10⁵个细胞，以在第二天达到80％汇合。在实验当天，将细胞用最终浓度为150μM的VH032处理30分钟，随后用最终浓度为1μM的CM11处理4小时。在收获前，将板在37℃和5％CO₂下孵育所需的时间。

与IOX4和CM11共同处理以研究上游效应实验

对于本实验，将细胞转移至6孔板，其中2ml培养基中每孔5×10⁵个细胞，以在第二天达到80％汇合。在实验当天，将细胞用终浓度为50μM的IOX4处理30分钟，随后用终浓度为1μM的CM11处理4小时。在收获前，将板在37℃和5％CO₂下孵育所需的时间。

免疫印迹

将细胞在每10ml缓冲液中的裂解缓冲液(20mM Tris pH 8，150mM NaCl，1％Triton x100)和蛋白酶抑制剂混合物(Roche)中裂解。对于蛋白质提取物，将盘放在冰上。吸出培养基，将组织层用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline，PBS)洗涤两次。添加裂解缓冲液(120μl)，并用细胞刮刀将细胞从表面分离。通过离心除去不溶性部分后，通过Pierce^TM考马斯(Bradford)蛋白质测定试剂盒确定上清液的蛋白质浓度。通过在4％至12％Tris-乙酸盐(Life Technologies)聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE来分级蛋白质提取物，并使用湿转移(wet transfer)将其转移至硝酸纤维素膜。然后用Tris缓冲盐水(Tris-buffered saline，TBS)中的5％w/v牛血清白蛋白(Bovineserum albumin，BSA)以及0.1％w/v吐温-20封闭膜。为了检测蛋白质，使用了给定浓度的以下一抗：抗β-肌动蛋白(Cell Signaling Technology，4970S，13E5)1∶2000；抗VHL(CellSignaling Technology，#68547)1∶1000；抗Hif-1α(BD Biosciences，610959，克隆54)1∶1000；抗羟基-HIF-1α(Hyp564)(Cell Signaling Techonology；#3434)1∶1000；抗PHD2(Bethyl Laboratories；A300-322A)1∶1000；抗PHD3(Bethyl Laboratories；A300-327A)1∶1000；抗CRBN(Proteintech；11435-1-AP)1∶1000。

用辣根过氧化物酶偶联的二抗(Cell Signaling Technology)孵育后，使用增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)Western印迹检测试剂盒(Amersham)在Amersham Hyperfilm ECL膜(Amersham)上对信号进行显影。

使用ImageJ软件进行条带定量，并报告为作为相对于泳道上样对照的每个蛋白条带的比的相对量。然后将获得的值以0.1％DMSO载剂对照进行归一化。

萤光素酶测定

基本上如Frost等所述³⁴进行。简言之，用化合物处理稳定表达HRE萤光素酶报道分子的细胞(HeLa和U2OS)，持续指定的时间。在被动裂解缓冲液(Promega)中收获细胞，并使细胞进行三个冻融循环。将可溶性裂解物级分用于根据制造商的说明(Promega)使用Berthold Lumat LB 9507发光计进行的测定。将结果归一化为蛋白质浓度，并报告为来自三个生物学重复的平均值±s.e.m。

定量实时PCR

基本上如Frost等所述³⁴进行。简言之，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从HeLa细胞裂解物中提取RNA，并使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)反转录。在C1000触摸型热循环仪(Bio-Rad)中使用PerfeCTa SYBR Green FastMix(Quanta Biosciences)进行实时PCR。基于两个技术重复的平均Ct值计算mRNA水平，将其以β-肌动蛋白的mRNA水平进行归一化，并报告为来自三个生物学重复的平均值±s.e.m。

生物物理测定

等温滴定量热法(Isothermal titration calorimetry，ITC)

在ITC200微量热计(GE Healthcare)上进行滴定。将PROTAC(CM11、CMP98或CMP99)从100mM DMSO储备溶液稀释成含有20mM Bis-tris丙烷，150mM NaCl，1mM tris(2-羧乙基)膦(TCEP)，pH 7.4的缓冲液中的150μM。最终DMSO浓度为0.15％v/v。在含有20mM Bis-tris丙烷，150mM NaCl，1mM TCEP，0.15％v/v DMSO，pH 7.4的缓冲液中进行VBC蛋白实验。滴定由以下组成：将2μL化合物溶液(150μM，在注射器中)以2秒/μL的速率以120秒的时间间隔注射到VCB蛋白溶液(20μM，在细胞中)19次。进行化合物溶液的初次注射(0.4μL)，并在数据分析期间将其丢弃。所有实验均在25℃下进行，同时以600rpm的速度搅拌注射器。使用制造商提供的Microcal LLC ITC200Origin软件，将数据拟合成单个结合位点模型，以获得化学计量值n、解离常数K_d和结合焓ΔH。尺寸排阻色谱法(Size exclusion chromatography，SEC)

SEC实验是在室温下在AKTA纯体系(GE Healthcare)中进行的。使用用已知分子量的球状蛋白(GE Healthcare，28-4038-41/42)校准的Superdex 200提高10/300GL柱(GEHealthcare)通过在含有20mM Bis-Tris(pH 7)，150mM NaCl和1mM 1，4-二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液中进行凝胶过滤来分析溶液中VCB复合体的低聚状态。在注射之前，将VBC蛋白(50μM)与CM11(30μM)、CMP98(30μM)、CMP99(30μ￡M)、VH032(30μM)或DMSO(0.5％)在室温下孵育20分钟。每次注射的样品体积为200μL，流量为0.5mL/分钟。使用280nm处的紫外线吸光度监测峰洗脱。

VCB的生物素化

将VCB复合体与EZ-连接NHS-PEG₄-生物素(Thermo Scientific)以1∶1的摩尔比混合，并在室温下孵育1小时。使用1M Tris-HCl(pH 7.5)淬灭反应，并用PD-10 MiniTrap脱盐柱(GE Healthcare)除去未反应的NHS-生物素，该柱用20mM HEPES(pH 7.5)，150mM NaCl和1mM DTT平衡。

AlphaLISA分析

所有测定均在室温下于384孔板中进行，其中最终测定体积为每孔25μL。在添加试剂之间用透明膜密封板。将所有试剂制备成稀释在50mM HEPES(pH 7.5)，100mM NaCl，0.1％(w/v)牛血清白蛋白和0.02％(w/v)3-[((胆酰胺基丙基)二甲基铵]-1-丙烷磺酸盐)(CHAPS)中的5×储备液。将生物素化的VCB(最终20nM)和His₆-VCB(最终20nM)与一系列Homo-PROTAC浓度(0.5至200nM；五分之三的连续稀释)孵育1小时。添加抗His接受体珠(PerkinElmer，最终10μg/mL)，再将板孵育一小时。添加涂有链霉亲和素的供体珠(PerkinElmer，最终10μg/mL)，并将板孵育最后1小时。使用其中激发波长为680nm且发射波长为615nm的光学模块在PHERAstar FS(BMG Labtech)上读取板。将强度值相对于PROTAC浓度以log₁₀比例作图。

合理设计

对VHL Homo-PROTAC的设计始于对由我们小组最近表征的两个强效VHL配体(VH032和VH298)上的衍生化位置的仔细考虑(图1b)。^2，3为了保留表征该配体的强结合亲和力，对共晶结构进行分析以确定配体可来源于其的溶剂暴露区域，而不会干扰其结合模式(图1a)。对先前靶向VHL的PROTAC的该分析和考虑指出，VH032左手侧(left-hand side，LHS)末端乙酰基的甲基是接头的合适连接点。^12，13如先前用靶向Halotag的PROTAC那样，可用于衍生化的第二溶剂暴露位置是右手侧(right-hand side，RHS)的苯基。³⁵为研究衍生化的影响，我们设计了三类Homo-PROTAC：a)通过每个配体的LHS乙酰基对称(图2a)；b)通过RHS苯基对称(图2b)；以及c)通过一个弹头中的乙酰基和另一个弹头中的苯基不对称(图2c)。在b和c情况下，我们决定在未衍生化的末端LHS上保留乙酰基(如在VH032中那样)或氰基-环丙基部分(如在VH298中那样)，这样的修饰导致在单独的VHL抑制剂的情况下，结合亲和力、细胞通透性和细胞活性提高。³为评价接头长度的潜在影响，选择了包含具有三个、四个或五个乙二醇单元的聚乙二醇链的接头以连接两个VHL配体。

已知的是，Hyp的反式差向异构体是VHL结合的绝对要求，并且在天然HIF底物肽³⁶和VHL配体^3，13二者的背景下，相应的顺式差向异构体均消除了与VHL的结合。因此，我们基于第一系列的结构(图2a)设计了两种不同的PROTAC，目的是将它们用作对照：顺式-顺式差向异构体，其被预期完全无活性；以及顺式-反式差向异构体化合物，其被预期与单个VHL分子以1∶1的方式保持结合，因此可能发挥抑制剂而不是降解剂的作用。

合成

为了合成第一类Homo-PROTAC(图2a)，通过使溴乙酸叔丁酯与三乙二醇、四乙二醇和五乙二醇在二氧六环中的NaH的存在下反应，并且随后在纯化之后通过用DCM中的50％TFA处理，来获得在任一端处带有游离羧酸根基团的对称PEG接头4、5和6(图3)。通过将VHL配体7(如前所述制备)³⁸与接头4、5和6分别以2∶1的比在作为偶联剂的HATU和作为碱的DIPEA的存在下进行酰胺偶联来获得最终化合物CM9、CM10和CM11(图3)。为了合成对称的顺式-顺式化合物CMP98，将化合物8(参考文献38)与接头6偶联，以得到所需的产物(图3)。

为了制备不对称的顺式-反式化合物CMP99，建立了合成单保护的二羧酸酯接头的合成途径。由于与较长的PEG相比易于纯化，因此，五乙二醇是所选择的接头，同时得到平均接头长度的对照化合物(在这样的情况下为PEG-4)。将五乙二醇以71％的产率转化为单苄基醚9，使其在双相条件(DCM/37％NaOH水溶液和化学计量的四丁基溴化铵)下与叔丁基溴乙酸反应。通过催化氢化对苄基进行脱保护后，通过用TEMPO和双乙酰氧基碘苯(BAIB)氧化来实现羧酸部分的形成，以65％的产率得到化合物11(图4)。然后使用上述条件，将化合物7与接头11偶联，以得到化合物12。使用TFA使叔丁基脱保护，随后与8偶联，以66％的产率得到CMP99(图4)。

为了合成第二类对称Homo-PROTAC(图2b)，决定使用化合物17和18作为VHL弹头。通用的前体16是按照先前报道的程序³⁵合成的，其中进行了微小的修改，从而导致了产率和纯度的提高(图5)。实际上，我们观察到将HATU与HOAT组合用于Boc-L-Hyp和Boc-叔亮氨酸二者的偶联步骤仅形成了所需的产物，避免了双酰化次级产物的形成，⁵⁴当单独使用HATU时更显著。通过在HATU、HOAT和DIPEA或乙酰基咪唑和TEA存在下用1-氰基环丙烷羧酸处理化合物16获得化合物17或18(图5)。17的合成也使用乙酸酐进行，但是在该反应过程中，观察到不仅在期望的位置而且在苯环的羟基上形成了二乙酰化的次级产物，但其可被分离。

这类化合物的PEG接头被设计成在任一端包含甲磺酸酯基，可将其在单个步骤中与VHL配体的苯酚偶联。通过对五乙二醇进行甲磺酰化制备接头19，并在K₂CO₃存在下使接头19与化合物17或18以1∶2的比反应，以良好的产率分别得到CMP106和CMP108(图6)。

对于合成不对称的Homo-PROTAC，将PEG 10转化成甲磺酰化的衍生物20，并使其与17或18反应，以高产率分别获得21和22(图7)。在进行叔丁基的脱保护和酰胺与化合物7偶联后，可高产率地获得最终化合物CMP112和CMP113(图7)。

生物学评价

接下来，我们在HeLa细胞中测试了我们所有的Homo-PROTAC，并在1μM浓度的化合物处理10小时之后通过Western印迹监测蛋白质水平(图8a)。我们观察到CM09、CM10和CM11在诱导细胞中的VHL耗尽方面具有显著有效性(图8a)，以及对应于VHL的长同种型的条带显著选择性降解，优先于短同种型。VHL基因包含三个外显子，它编码两种主要的VHL同种型：一个长213个氨基酸的30kDa形式(pVHL30)和一个长160个氨基酸的19kDa形式(pVHL19)。pVHL19缺少一个53个氨基酸长的氨基末端结构域或N末端尾(pVHL-N)，而其存在于pVHL30中。尽管这两种同种型都在人细胞中表达，但pVHL19是人组织中最突出的形式。⁵⁶最具有活性的化合物从VH032的末端LHS乙酰基对称连接。在不同位置的连接被证明是无效的，表明连接模式对VHL配体起着关键作用。对照化合物CMP98和CMP99不能诱导VHL降解(图8a)，表明Homo-PROTAC活性取决于反式差向异构体对VHL的产生性二价募集。接头的长度似乎也影响细胞效力。实际上，在较短的接头长度上观察到效力降低，其中CM10和CM11是最具活性的化合物，实现了pVHL30完全敲低；其次是CM09，其耗尽了82％的靶蛋白。有趣的是，还观察到了短同种型pVHL19的一些降解，尽管降解程度很低(约10％耗尽)。用CM10和CM11处理后，CRL2-VHL复合体的中央亚基Cullin2⁵⁷的水平也降低了多至22％(图8a)。

用CM10和CM11处理也显示出是可检测的，尽管HIF-1α的羟基化形式的蛋白质水平提高很少(Hdy-HIF-1α，图8a)。由于母体抑制剂VH032在相同的1μM浓度下完全无效(参见参考文献³和下文中的图8)，因此该效应不能归因于VHL抑制，因此被认为是化合物诱导的蛋白质降解的结果。然而，当以＞100μM的浓度使用时，HIF-1α的水平显著低于用母体抑制剂VH032所观察到的(图8a，另见参考文献³)。通过在三种不同细胞系中的siRNA实验进行的VHL敲低与CM11诱导的敲低一致，并且也不足以诱导显著的HIF稳定化(图8b)。siRNA结果还证实，观察到在化合物处理下强度降低的条带确实对应于VHL。

为了评估Homo-PROTAC对pVHL19的选择性敲低是否可诱导HIF转录活性，我们首先使用了萤光素酶报告分子测定。³⁷将低氧应答元件(Hypoxia response element，HRE)-萤光素酶报告分子Hela-HRE和U2OS-HRE细胞用不同浓度的CM11且在不同时间下处理，相对于DMSO对照处理，未检测到HIF依赖性萤光素酶活性提高(图14)。这些结果在qRT-PCR测定中得到证实，其中未检测到已知HIF靶基因CA9的mRNA水平的上调(图15)。数据共同表明，未降解的pVHL19足以有效维持低水平的HIF-1α，并且需要完全敲低所有VHL同种型以在细胞中实现有效的HIF稳定化，如在vhl^-/-细胞(例如VHL缺陷型肾癌细胞)中观察到的那样。

接下来，我们将注意力转向进一步表征由活性Homo-PROTAC CM09-11诱导的蛋白质降解的作用方式。为了探询它们的相对细胞效力，在收获之前的4和24小时的两个不同时间点时进行剂量依赖性处理。相对于相应的DMSO对照，所有化合物均证实pVHL30以浓度依赖性方式优先降解(CM11参见图9，CM09和CM10参见图16)。

CM11被证明是最强效的Homo-PROTAC，已在10nM下在4小时之后诱导pVHL30完全耗尽(DC₉₉＝10nM，图9)。在24小时后保留选择性pVHL30的敲低，其中半降解浓度(DC₅₀)为10至100nM。CM11的有效降解浓度比单独的组成性配体VH032的抑制浓度低＞3个数量级，后者仅在约100μM下在细胞中有活性，这强调了两种作用方式之间细胞效力的巨大差异。用CM11处理后，Cullin2的细胞水平降低了多至73％(图9)。如先前所观察到的，与低氧诱导对照CoCl₂、PHD抑制剂IOX2和VH032相比，Homo-PROTAC的选择性pVHL30敲低仅导致HIF-1α水平的轻微提高(图9)。然而，当在高微摩尔浓度下测试时，Homo-PROTAC优先于VHL降解剂而充当VHL抑制剂，这与所谓的“钩效应(hook-effect)”一致，由此二元1∶1复合体的形成与产生性催化的2∶1复合体的形成竞争，并最终取代了后者。⁵⁹在用所有三种化合物以100μM处理后，Hdy-HIF-1α的稳定化确实与单独使用VH032所获得的效果相当(CM11参见图9，CM09和CM10参见图16)。为了确认Homo-PROTAC在不同细胞系中的细胞活性，进行了类似实验，使用相同浓度范围(1nM至100μM)的CM09、CM10和CM11处理U2OS细胞10小时。观察到一致的细胞活性谱，证实所观察到的作用与细胞类型无关(图17)。

接下来，我们探询了Homo-PROTAC的时间依赖性活性。观察到随时间推移逐渐去除VHL蛋白，证实了pVHL30超过短同种型的选择性耗尽(CM11参见图10，CM09和CM10参见图18)。特别地，证实CM11是最有效的化合物，在处理的2小时之后已将pVHL30水平降低多于70％，并且在8小时之后基本上完成。耗尽效应保留达12小时；然而，有趣的是，在24至36小时处理之后检测到pVHL30的水平升高11％，然后在48小时之后再次下降。用CM09处理之后，即使在更长的时间点，也观察到pVHL的不完全降解(图18)。如前所述，对于所有三种化合物，均观察到Hdy-HIF-1α随时间推移的较小的稳定化，最显著的是用CM11处理之后。处理U2OS细胞所获得的结果与在先前实验中观察到的一致。然而，在该细胞系中，所有三种化合物都能够诱导pVHL30随时间推移的完全降解(图17)。我们假设这可能是由于VHL在U2OS中的表达水平更低，导致了与VHL水平较高的细胞系相比，细胞耗尽更快。在2小时的处理之后，CM09和CM10实现了靶蛋白的完全降解。被证实也是该细胞系中最有效的化合物的CM11，已在1小时之后实现了pVHL30的完全降解。有趣的是，CM09在36小时后丧失了其细胞效力。相比之下，即使在这些较长的时间点，CM10和CM11均仍保留其效力(图17)。

表1.Homo-PROTAC的热力学结合参数概述，以及由ITC测量的VHL抑制剂VH032(来自19)针对短和长VHL同种型的比较。

为了获得有关Homo-PROTAC细胞活性的机制的见解，检测了对CRL2-VHL和蛋白酶体活性的依赖性。通过使用NAE1抑制剂MLN4924抑制Cullin2的类泛素化(neddVlation)来评估Homo-PROTAC诱导的蛋白质降解对CRL2-VHL的依赖性，该抑制剂可阻断CRL(包括CRL2-VHL)的活性。通过用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞来探询蛋白酶体依赖性。为了限制已知的MLN4924和MG132的细胞毒性，用MLN4924预处理HeLa细胞3小时，随后用MG132预处理30分钟，然后再向培养基添加CM11，并在收获前将细胞再孵育4小时。进行了用DMSO、MLN4924、MG132和CM11及其组合的单一处理，以分清化合物处理的单独作用和联合作用。当用MG132预处理细胞时，由CM11诱导的pVHL30的降解被完全消除，建立了预期的蛋白酶体依赖性化学干预(图11)。CM11诱导的降解也可通过用MLN4924预处理来阻止，证实了对CRL2VHL活性的依赖性(图11)。当在CM11之前用MLN4924和MG132共处理细胞时，观察到了相同的效果(图11)。Cullin2水平的免疫印迹证实了通过MLN4924有效阻断了Cul2的类泛素化(图11)。为了评估CM11降解活性是否取决于VHL结合，使用VHL抑制剂VH032进行了竞争实验。²⁰在将CM11添加到培养基中之前，用VH032以150μM预处理HeLa细胞30分钟。收获前将板再孵育4小时。正如预期的那样，VH032阻断了pVHL降解(图11)，这与VHL诱导自身降解的假设相一致。相比之下，用PHD2抑制剂IOX4进行预处理不会影响CM11的细胞活性(图11)。

生物物理评估

PROTAC的催化作用方式的关键是三元复合体的形成。^13，15在我们的Homo-PROTAC化合物的情况下，VHL既充当E3连接酶又充当底物。因此，我们接下来试图监测和在生物物理学上表征被认为构成细胞活性的基础的三元复合体VHL：Homo-PROTAC：VHL。为了评估该三元复合体物质在溶液中的形成，进行了等温滴定量热法(ITC)，尺寸排阻色谱法(SEC)和AlphaLISA邻近测定(图12)。在针对VCB复合体(VHL以及延伸蛋白B(ElonginB)和延伸蛋白C)的CM11的ITC滴定中，发现结合的化学计量值(n值)为0.6，而在VH032的情况下则为1(图12a，表1)。此结果与CM11与VHL以1∶2的摩尔比结合一致，而与VH032与VHL以1∶1比结合相对。¹⁹值得注意的是，针对CM11测得的K_d值为11nM(表1)。更仔细地检查滴定曲线发现，曲线的反曲过程中只有一点起重要作用。实际上，由于实验中使用的蛋白质浓度为20μM，因此该实验计算出的c值(限定为[P]_tot/K_d)为2500，其远高于c的上限(约500至1000)，该上限是精确测量结合亲和力的前提。因此，该分析表明我们可能低估了CM11的结合亲和力，即我们可得出结论K_d为≤118nM。这对应于与VH032相比＞18倍的亲合力(也称为合作性α)。先前已用其他体系观察到如此大的同质二价分子(例如BET抑制剂MT1)的亲合力。CM11和VHL之间的结合相互作用是由大的表观结合焓(ΔH＝-12.3kcal mol^-1)驱动的，而熵项则稍为不利(-TAS＝1.4kcal mol^-1)。该观察结果强调了与VH032相比，CM11的热力学特征也有很大不同，在这样的情况下，结合ΔH是在CM11的情况下观察到的约一半，并且焓和熵项均对结合的AG有利(表1)。相比之下，获得的CMP99结合的热力学值与VH032的完全一致(表1)。具体地，由于两个部分之一中存在顺式-Hyp，如预期的那样CMP99与VHL以1∶1的比结合，并且表现出与VH032相当的ΔH和K_d值。如预期的那样，未检测到与无活性顺式-顺式差向异构体CMP98的结合。CM11、CMP98和CMP99的积分热曲线的叠加示于图12b中，并从视觉上突出了这三种化合物的不同行为。CM10显示出与CM11相似的热力学结合参数，其中n值等于0.7，Kd低至32nM。相比之下，发现CM09的化学计量值接近1，这表明在滴定结束时，该系统主要由1∶1的复合体构成(图19和20)，这与其较低的亲合力一致(表1)。还使用化合物CMP106、CMP108、CMP112和CMP113进行了ITC实验，结果讨论如下。

SEC实验表明，相对于载剂对照，VCB在存在活性化合物CM11(2∶1蛋白质∶配体的比)的情况下迁移更快(图12b)。基于用具有已知分子量的球状蛋白进行的校准运行(参见下面的方法)，以一定体积洗脱的移动的峰对应于约90kDa分子量的物质，表明该峰对应于三元复合体(VCB)₂∶CM11。相比之下，在用无活性的CMP98、CMP99或配体VH032孵育之后，VCB没有移动。仅在含有CMP99的样品中，存在以13.5ml洗脱的一个小峰(图12b)。该峰可能是由于低密集性的三元复合体的形成。有趣的是，Schofield及其同事观察到包含顺式羟基脯氨酰的HIF-1α肽与VHL的弱结合。³⁶这样的弱结合可能由三元复合体中的高亲合力增强，可能是在细胞内进行生物测试时所观察到的VHL水平小幅降低的原因(图8a)。与CM11相比，CM10和CM09以相同的保留体积洗脱显示出三元复合体的形成(图21)。用所评价的任何化合物中均未观察到聚集迹象，因为所有观察到的峰均在空隙体积后很好地洗脱。

最后，我们采用AlphaLISA邻近测定比较了通过CM09、CM10和CM11的三元复合体形成。该测定显示出CM11的最高强度信号，而检测的CM09和CM10的复合体形成水平可忽略不计(图12c)。由于SEC在所有三种化合物的情况下均检测到了三元物质，因此在AlphaLISA中检测到的最小强度可能反映了CM09和CM10无法在测定所需的低浓度下产生大量的三元群体。这些结果表明，CM11是驱动三元复合体形成的最有效的Homo-PROTAC，与CM11在ITC中显示出最高的亲合力和2∶1的化学计量值完全一致。总之，生物物理数据支持CM11作为体外最具有合作性的Homo-PROTAC，并提供了解释其在细胞内强效的VHL降解活性的分子原理。

讨论

在一些实施方案中，描述了Homo-PROTAC，其是使E3泛素连接酶有效二聚化以诱导其自身自毁的小分子方法。使用E3连接酶VHL的强效配体，开发了一系列对称的homo-二价分子，这些分子在纳摩尔浓度下诱导pVHL的长同种型显著快速、极大的和选择性的降解。化合物诱导的降解强烈地取决于VHL配体的连接模式。最具有活性的Homo-PROTAC CM11已在10nM下诱导pVHL30在4小时之后的完全耗尽。pVHL30的强效和选择性降解是持久的，其中半降解浓度(DC₅₀)为约100nM，与母体抑制剂VH032相比，细胞活性显著提高＞1000倍。从机理上讲，已表明CM11活性严格依赖于蛋白酶体活性、Cul2类泛素化和VHL结合，特别是依赖于与VHL形成亲合(avid)的2∶1复合体。因此，数据支持了这样的模型，在该模型中，高度合作的三元复合体VHL-CM11-VHL充当导致VHL自身降解的关键物质(图13)，这将有待进一步的结构研究。有趣的是，CM11还导致Cullin2的细胞水平降低，我们认为这是Cullin2作为CRL2^VHL复合体的一部分直接泛素化的结果。据我们所知，这是首次证明PROTAC可诱导与直接靶向的蛋白质形成同一复合体一部分的蛋白质降解。

与短VHL同种型相比，pVHL30的优先诱导降解是出乎意料的，这是这项工作的有趣结果。该观察结果为我们和其他研究人员提供了最新证据，即由抑制剂设计的募集多于单个蛋白质种内同源物或同种型的化学降解剂可独立于靶标接合而提高靶标降解选择性的层次。^12，15，18作为VHL的二元接合，发现弹头在两种VHL同种型之间相似(表1)，观察到的选择性可能是由于合作性的巨大差异，这会影响三元复合体的相对群体。¹⁵然而，相对于VHL的长同种型，CM11实际上在体外表现出对短的同种型的更大的亲合力(表1)。因此，我们认为VHL降解的显著选择性不太可能是由于三元复合体的合作性的大的差异。我们还认为，优先且更有效的赖氨酸泛素化不太可能发挥作用，因为长同种型(1至53)中存在的额外区域不包含单个赖氨酸残基。另一方面，预测该区域本质上是无序的，并且实际上已显示出包含无序的N-末端区域的蛋白质更容易发生蛋白酶体降解。还已知当与延伸蛋白B和延伸蛋白C复合时，VHL对蛋白酶体降解具有抗性，因此观察到优先耗尽的形式可以是游离的VHL，即不与延伸蛋白结合，或其他蛋白酶体敏感性形式。解决这些问题对于将来的研究将非常重要。

通过CM11对pVHL30的选择性降解导致HIF-α在细胞中的稳定程度降至最低，因此未引发细胞中的HIF依赖性活性。这突显了使用CM11以探询特定VHL同种型的生物学功能的潜在益处，而不会掩盖低氧应答的下游效应。关于VHL同种型的个体作用了解甚少。研究已强调如何不需要pVHL30的53个残基的额外区域来阻遏肿瘤，以及这两种同种型如何可在体内具有HIF依赖性肿瘤阻遏功能。已提出了pVHL的其他HIF非依赖性的作用，包括pVHL在胶原蛋白装配中的作用。然而，在这些生物学功能中不同同种型的个体作用仍然难以捉摸。此外，许多HIF非依赖性的作用被认为与Hyp识别无关，因此无法使用当前基于Hyp的VHL抑制剂进行化学探测。因此，CM11对pVHL30的选择性和急性敲低为解决这些问题提供了新颖的化学工具。

总而言之，我们提出了CM11，用于快速，选择性pVHL30敲低的化学探针。CM11为传统的敲低RNAi方法和基因编辑敲除技术(例如CRISPR-Cas9)提供了替选的有利的化学工具。与CM11的使用有关的信息将在新建立的“化学探针门户(Chemical Probes Portal)”(http：//www.chemicalprobes.org/)中提供。³⁸我们预期CM11将在均对研究和剖析pVHL的多效性生物学功能感兴趣的化学生物学家和细胞生物学家中具有广泛用途。更一般而言，我们提供了第一个概念验证，即二价分子可被设计成诱导E3连接酶破坏自身。这样的策略可提供一种强大的新方法，以单独使用抑制剂可能无法实现的方式对E3连接酶进行药物靶向。

合成招募CRL4^CRBN和CRL2^VHL的PROTAC

为了合成化合物CMP85和CMP86(图23所示的结构)，采用与用于26相同的途径合成接头26及其具有两个PEG单元的类似物43(图24)。然后将这些接头偶联至化合物27，分别递送化合物28和44。随后对叔丁基进行脱保护得到化合物29，其具有四个PEG单元的长度；以及45，其具有两个PEG单元的长度(图24)。

化合物48(所需的沙利度胺衍生物，参见图25)如Lu等先前公开的那样¹⁷合成。在第一步中，将3-氟邻苯二甲酸用乙酸酐脱水，以高产率获得化合物46。将化合物46与L-谷氨酰胺反应，随后用4M HCl溶液处理，导致形成化合物47。在1，1’-羰基二咪唑(CDI)和DMAP存在下，在回流下进行47的环化。此步骤的建议时间为5小时。2.5小时后，可通过LC-MS观察到副产物的形成。因此，即使反应未完成，也将反应冷却至室温，并通过过滤收集所得固体。在通过经二氧化硅的柱色谱法进行的纯化步骤中，以良好的产率分离出化合物48。副产物也被分离并通过NMR分析并鉴定为化合物53(图26)。化合物53是在邻苯二甲酸酐的4位处被咪唑的氮孤对(nitrogen lone pair)进行芳族亲核取代的产物，其本身是47与CDI之间反应的副产物。

通过与N-Boc-乙二胺偶联并随后在酸性条件下进行Boc脱保护，可在两个步骤中将化合物48转化为化合物50(图25)。将后者与29或45偶联，以良好产率分别得到化合物52(CMP85)和51(CMP86)。

VHL靶向化合物的生物学评价

以下部分概述了靶向细胞中VHL的PROTAC化合物的生物学评价结果。

为了评估化合物在细胞内的活性，将HeLa细胞用1μM的Homo-PROTAC CM09、CM10和CM11处理(图27)，所述CM09、CM10和CM11的合成如下，并且上述PROTAC募集CRL4^CRBN以靶向VHL，即CMP85和CMP86。使用二甲基亚砜(DMSO载剂，0.1％v/v)、CoCl₂(HIF-1α的化学诱导剂)、IOX2和IOX4(PHD2的选择性抑制剂)，VH032(选择性VHL抑制剂)作为对照。将处理10小时和细胞裂解之后获得的样品通过SDS-PAGE解析，随后通过使用相应的特异性抗体的Western印迹探测以下蛋白质(图28)：

·VHL：CM09、CM10和CM11表现出VHL水平完全耗尽，这是长同种型pVHL30的优先降解或选择性降解的特征。然而，也观察到了短同种型pVHL19的一些降解，尽管只有约20％。其他化合物均不能诱导VHL的降解。

·Cullin2：为了评估用该系列化合物处理是否会对CLR2^VHL的其他亚基有任何影响，评价了Cullin2的蛋白质水平。示出CM10和CM11通过诱导约20％的降低来影响Cullin2水平。

·CRBN：用CMP85和CMP86处理后，未观察到CRBN水平的可检测到的影响。

·HIF-1α和Hdy-HIF-1α。为了评价VHL降解剂是否可诱导HIF-1α的积累，特别是其羟基化形式(Hdy-HIF-1α)的积累，对这些蛋白质的水平进行了评价。在siRNA实验中观察到VHL敲低不会导致HIF-1α耗尽。实际上，即使非常低的VHL水平都能对HIF-1α进行高效催化，从而导致随后的有效HIF-1α降解。如所预期的，VHL耗尽对HIF-1α水平没有明显影响(将检测到的HIF-1α条带与载剂对照DMSO进行比较)。然而，活性VHL降解剂CM09、CM10和CM11诱导HIF-1α水平略有提高(参见更长暴露的HIF-1α条带)。这样的作用在Hdy-HIF-1α上甚至更为明显，如从VHL敲低所预期的，这与羟基化形式的稳定的HIF相一致。

·PHD2和PHD3：为了研究由于用化合物处理而引起的细胞潜在的低氧应答，考虑了PHD2和PHD3的水平。在该浓度下未观察到对这些蛋白质水平的影响。

在另一些细胞系中进行了相同的实验，以进一步评估我们化合物对细胞效应的一致性，因为不同的细胞系可能具有不同的蛋白质的不同的表达水平。例如，已知HEK293具有较高的总VHL表达水平，我们通过Western印迹证实了这一点(图28)。在HEK 293中观察到了相同的活性谱，即CM09-11优先降低了pVHL30的水平(图28)。没有观察到对其他蛋白质水平的重大影响。在U2OS细胞中进行的实验显示了相同的结果，证实了用CM09、CM10和CM11处理后观察到的效果与细胞类型无关，并且在所有受试的细胞系中均一致(图28)。

还使用化合物CMP106、CMP108、CMP112和CMP113进行了ITC实验(数据显示在图29至32中)。除了化合物CMP108的数据无法拟合成结合曲线外，所有其他化合物都表现出与单个弹头配体非常相似的结合亲和力(合作性为约1)，表明它们的合作性远低于CM11，这与它们在细胞中缺乏活性相一致。该结论在图33中得到了说明，其中化合物CM09至CM11、CMP112至CMP113、CMP106以及对照化合物CMP98和CMP99的ITC滴定都叠加在单个图中，突出了CM11的显著效力和合作性。

材料和方法

除非另有说明，否则所有化学品均购自商业供应商并且无需进一步纯化即可使用。磁力搅拌反应；使用市售无水溶剂。所有需要无水条件的反应都是在氩气或氮气气氛下，使用烘箱干燥的玻璃器皿进行的。HPLC级溶剂用于所有反应。使用硅胶(Merck 60F254nm)进行快速柱色谱法。正相TLC在预涂覆的二氧化硅板(Kieselgel 60 F254，BDH)上进行，并通过UV光(UV 254/365nm)和/或碱性高锰酸钾溶液或其他合适的染色剂进行可视化。使用Teledyne Isco Combiflash Rf或Rf200i进行快速柱色谱法(FCC)，使用预装柱RediSep Rf正相一次性柱。NMR谱是在Bruker Ascend 400或500上记录的。化学位移以相对于残留溶剂峰(CDCl₃＝7.26ppm)的百万分率报告。在报告谱时使用以下缩略语，s(单峰)，d(双峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，m(多重峰)，dd(双二重峰)。仅报告了主要的旋转异构体NMR谱。高分辨率质谱(High Resolution Mass Spectra，HRMS)记录在Bruker microTOF上。在与Agilent Technologies 6130四极杆LC/MS连接的Agilent Technologies 1200系列HPLC上记录了低分辨率MS和分析型HPLC迹线，该Agilent Technologies 6130四极杆LC/MS与Agilent二极管阵列检测器连接。所使用的柱是Waters XBridge柱(50mm×2.1mm，粒度3.5μm)。流量为0.6mL/分钟。制备型HPLC在具有Waters XBridge C18柱(100mm x 19mm；5μm粒度)的Gilson制备型HPLC系统上进行。

一般方法A：将PEG溶解在无水二氧六环中，并在搅拌下添加NaH。将所得混合物在室温下搅拌3小时。使用冰浴将混合物冷却至0℃，并逐滴添加溴乙酸叔丁酯。将所得混合物在室温O/N下搅拌。滤出沉淀物，并将有机相蒸发至干。将所得油状物用乙酸乙酯吸收，用水洗涤，经MgSO₄干燥并蒸发至干。通过柱色谱法使用庚烷中50％至100％v/v的乙酸乙酯梯度纯化所得油状物。

一般方法B：将叔丁酯1、2、3或12溶解在DCM中的50％v/v三氟乙酸溶液中。将所得溶液搅拌1小时或搅拌至原料完全转化。在高真空下除去溶剂。将所得羧酸无需任何进一步纯化即可作为粗制品用于下一步骤中。向羧酸在1ml DMF中的溶液添加HATU(1当量)和HOBT(1当量)，并将该溶液在室温下搅拌5分钟。添加胺6、31或32，并通过添加DIPEA(3当量)将反应混合物的pH调节至＞9。将混合物在室温下搅拌直至通过LC-MS未检测到原料的存在。添加水，并将混合物用乙酸乙酯(×3)萃取。将合并的有机相用盐水(×2)洗涤，经MgSO₄干燥，并在减压下蒸发，以得到相应的粗制品，将其通过使用0.1％氨水溶液中的20％至95％v/v梯度的乙腈的HPLC进行纯化，以得到所需化合物。

一般方法C：将甲磺酸酯(mesilate)、化合物6、31、32和K₂CO₃(41.46mg，0.3mmol，6当量)在DMF中的混合物在70℃下搅拌O/N。将反应混合物滤出，以得到粗制产品，将其通过使用在0.1％甲酸水溶液中的5％至95％v/v梯度的乙腈的HPLC进行纯化，以得到所需化合物。

(2S，4R)-4-羟基-N-(2-羟基-4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺盐酸盐(15)

向反式-N-(叔丁氧基羰基)-4-羟基-L-脯氨酸(890mg，3.84mmol，1当量)在DMF中的溶液添加HATU(1.46g，3.84mmol，1当量)和HAOT(522mg，3.84mmol，1当量)，将溶液在室温下搅拌5分钟。添加14(846mg，3.84mmol，1当量)，并通过添加DIPEA(3当量)将反应混合物的pH调节至＞9，并且将混合物在室温下搅拌直至通过LC-MS未检测到原料的存在。添加水，并将混合物用乙酸乙酯(×3)萃取。将合并的有机相用盐水(×2)洗涤，经MgSO₄干燥，并在减压下蒸发，以得到相应的粗制品，将其通过使用庚烷中的0至80％v/v梯度的丙酮的快速柱色谱法纯化，以得到标题化合物。产率：1.298g，3mmol(78％)。分析数据与之前报道的数据相匹配。³⁵

将N-Boc保护的化合物溶解在DCM中。添加等体积的二氧六环中的4M HCl，并将反应混合物在室温下搅拌2小时。在氮气流下除去溶剂，并在减压下干燥。将所得粗制品无需任何进一步纯化即可用于下一步骤(定量产率)。分析数据与之前报道的数据相匹配。³⁵

(2S，4R)-1-((S)-2-氨基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(2-羟基-4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺盐酸盐(16)

向反式-N-(叔丁氧基羰基)-4-羟基-L-脯氨酸(890mg，3.84mmol，1当量)在DMF中的溶液添加HATU(1.46g，3.84mmol，1当量)和HAOT(522mg，3.84mmol，1当量)，并将溶液在室温下搅拌5分钟。添加14(846mg，3.84mmol，1当量)，并通过添加DIPEA(3当量)将反应混合物的pH调节至＞9，并且将混合物在室温下搅拌直至通过LC-MS未检测到原料的存在。添加水，并将混合物用乙酸乙酯(×3)萃取。将合并的有机相用盐水(×2)洗涤，经MgSO₄干燥，并在减压下蒸发，以得到相应的粗制品，将其通过使用庚烷中的0至80％v/v梯度的丙酮的快速柱色谱法纯化，以得到标题化合物。产率：1.915g，3.61mmol(94％)。分析数据与先前报道的数据匹配³⁵。

将N-Boc保护的化合物溶解在DCM中。添加等体积的二氧六环中的4M HCl，并将反应混合物在室温下搅拌2小时。在氮气流下除去溶剂，并在减压下干燥。将所得粗制品无需任何进一步纯化即可用于下一步骤(定量产率)。分析数据与先前报道的数据匹配³⁵。

(2S，4R)-1-((S)-2-(1-氰基环丙烷-1-甲酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(2-羟基-4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(18)

将1-氰基环丙烷羧酸(69mg，0.62mmol，1当量)溶解在3ml DMF中。添加HATU(235mg，0.62mmol，1当量)和HOAT(84.4mg，0.62mmol，1当量)，并将所得混合物在室温下搅拌5分钟。添加16的胺前体(300mg，0.62mmol，1当量)，并使用DIPEA(400mg，0.5ml，3.1mmol，5当量)将pH调节至pH＞9。将所得混合物在室温下搅拌，直至原料完全转化。添加水，并将混合物用乙酸乙酯(×3)萃取。将合并的有机相用盐水(×1)洗涤，经MgSO₄干燥，并蒸发，以得到相应的粗制化合物，将其通过使用庚烷中的10％至70％梯度的丙酮的快速柱色谱法纯化，以得到标题化合物，为白色固体。产率：200mg，0.37mmol(60％)。HRMS(ESI)m/z：C₂₇H₃₃N₅O₅S[M+H]⁺计算值：539.22；观察值：540.3。

¹H NMR(400MHz，CDCl3)9.29(1H，s)，8.65(1H，s)，8.02(1H，t，J＝6.4Hz)，7.12(1H，d，J＝7.7Hz)，6.99(1H，d，J＝8.0Hz)，6.94(1H，d，J＝1.8Hz)，6.86(1H，dd，J＝1.8，7.7Hz)，4.72(1H，t，J＝8.0Hz)，4.54(1H，s)，4.44-4.35(2H，m)，4.19(1H，dd，J＝5.5，14.6Hz)，3.87(1H，d，J＝11.0Hz)，3.62(1H，dd，J＝3.7，11.0Hz)，3.50(1H，s)，2.49(3H，s)，2.43-2.37(1H，m)，2.13-2.06(1H，m)，1.66-1.37(4H，m)，0.89(8H，s)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ 172.8，170.8，165.8，155.8，150.5，148.3，133.3，131.6，131.2，123.9，120.9，119.6，118.2，70.1，58.6，58.3，56.7，55.7，40.0，35.7，26.2，18.6，17.9，17.8，17.2，16.1，13.8.

(2S，4R)-l-((S)-2-乙酰胺基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(2-羟基-4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(17)

将胺前体16(100.7mg，0.240mmol，1当量)溶解在1ml DMF中，向该溶液添加乙酰咪唑(31.7mg，0.288mmol，1.2当量)和DIPEA(0.090ml，0.48mmol，2当量)。在室温下搅拌混合物48小时后，在减压下蒸发溶剂，以得到相应的粗制品，将其通过使用在0.1％甲酸水溶液中的5％至95％v/v梯度的乙腈的HPLC纯化，以得到标题化合物。产率：91mg，0.187mmol(78％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl3)9.25(1H，s)，8.70(1H，s)，7.97(1H，t，J＝6.5Hz)，7.15(1H，d，J＝7.5Hz)，6.83-6.80(2H，m)，6.72(1H，d，J＝8.8Hz)，4.92-4.88(1H，m)，4.57(1H，s)，4.52-4.42(2H，m)，4.26-4.14(2H，m)，3.59(1H，dd，J＝2.9，11.1Hz)，2.53-2.45(4H，m)，2.24-2.17(1H，m)，1.85(3H，s)，0.83(9H，s)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ 171.8，171.2，155.9，150.7，148.1，132.8，131.7，131.0，124.2，120.6，117.1，70.3，58.1，57.7，57.1，39.8，35.5，34.8，26.3，22.6，16.0.

HRMS(ESI)m/z：C₂₄H₃₂N₄O₅S[M+H]⁺计算值：488.21；观察值：484.3。3，6，9，12-四氧杂十四烷二酸二叔丁酯(1)

按照一般方法A，由10ml二氧六环中的三乙二醇(1.125g，1ml，7.49mmol，1当量)、矿物油中的60％NaH(595.75mg，14.9mmol，2当量)和溴乙酸叔丁酯(2.905g，2.19ml，14.9mmol，2当量)在高真空后获得化合物1，为油状物。产率：538mg，1.42mmol(19％)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ 3.81(4H，s)，3.51-3.46(12H，m)，1.26(18H，s).¹³C NMR(126MHz，CDCl₃)δ 169.1，80.9，70.1，70.0，68.5，27.5.

分析数据与先前报道的数据匹配。³⁹

3，6，9，12，15-五氧杂十七烷二酸二叔丁酯(2)

按照一般方法A，由10ml二氧六环中的四乙二醇(1.125g，1ml，5.49mmol，1当量)、矿物油中的60％NaH(463mg，11.5mmol，2当量)和溴乙酸叔丁酯(2.25g，1.7ml，11.5mmol，2当量)在高真空后获得化合物2，为油状物。产率：500mg，1.18mmol(10％)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ 3.86(4H，s)，3.55-3.49(16H，m)，1.31(9H，s)·分析数据与先前报道的数据匹配³⁹。

3，6，9，12，15，18-六氧杂二十烷二酸二叔丁酯(3)

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按照一般方法A，由10ml二氧六环中的五乙二醇(1.126g，1ml，4.72mmol，1当量)、矿物油中的60％NaH(377mg，9.45mmol，2当量)和溴乙酸叔丁酯(1.872g，1.7ml，11.5mmol，2当量)在高真空后获得化合物3，为油状物。产率：300mg，0641mmol(14％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 3.94(4H，s)，3.66-3.56(20H，m)，1.40(18H，s)·分析数据与先前报道的数据匹配³⁹。

1-苯基-2，5，8，11，14-五氧杂十六烷-16-醇(9)

在0℃下，将五乙二醇(9.53g，50mmol，5当量)逐滴添加到矿物油中的60％NaH(800mg，20mmol，2.5当量)在20ml DMF中的悬浮液。将所得混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物冷却至0℃，添加苄基氯(1ml，1.1g，8.72mmol，1当量)。将所得混合物在室温下搅拌O/N。用饱和NH₄Cl溶液淬灭反应，水相用乙酸乙酯(×3)萃取。将合并的有机相经MgSO₄干燥并蒸发至干。将所得油状物通过柱色谱法纯化(庚烷中的0至60％的乙酸乙酯)，以得到标题化合物，为油状物。产率：2.055g，6.25mmol(71％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 37.28-7.19(5H，m)，4.50(2H，s)，3.66-3.52(20H，m)，2.50(1H，s).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)138.2，128.3，127.8，127.6，73.2，72.7，70.61，70.58，70.53，70.51，70.2，69.4，61.7

1-苯基-2，5，8，11，14，17-六氧杂十九烷-19-酸叔丁酯(10)

向搅拌的9(2.055g，6.25mmol，1当量)在12.8ml DCM中的溶液添加37％的NaOH溶液(12.8ml)，随后添加溴乙酸叔丁酯(4.882g，25mmol，4当量)和TBABr(2118mg，6.37mmol，1.02当量)。将所得溶液在室温下搅拌O/N。将反应混合物用乙酸乙酯(×3)萃取。合并有机相，用盐水(×1)洗涤，经MgSO₄干燥并真空浓缩。将所得棕色油状物通过柱色谱法纯化(石油中的0至30％的乙酸乙酯)，以得到标题化合物，为无色油状物。产率：2.216g，5mmol(80％)。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ 7.28-7.20(5H，m)，4.50(2H，s)，3.95(2H，s)，3.65-3.55(20H，m)，1.40(9H，s).¹³C NMR(126MHz，CDCl₃)δ 169.7，128.4，127.7，127.6，81.5，73.2，70.7，70.7，70.6，70.6，69.4，69.1，28.1.

HRMS(ESI)m/z：C₂₃H₃₈O₈[M+H]⁺计算值：442.26；观察值：387.2。

19，19-二甲基-17-氧代-3，6，9，12，15，18-六氧杂二十烷酸(11)

将10(2.216g，5mmol，1当量)溶解在75ml乙醇中，添加Pd/C(10重量％)，并将所得混合物置于氢气下并在室温下搅拌，直至原料完全转化。将反应混合物通过硅藻土过滤，将硅藻土垫用乙醇洗涤数次。将滤液真空浓缩，以得到油状物，将其无需进一步纯化即可用于下一步骤。产率：1.764g，5mmol(定量)。

将BAIB(3.546g，11.01mmol，2.2当量)和TEMPO(171.87mg，1.10mmol，0.22当量)添加至含有先前获得的油状物(1.764g，5mmol，1当量)的ACN/H₂O 1∶1溶液。将所得混合物在室温下搅拌直至原料完全转化。使用PE-AX阴离子交换柱纯化粗制品。用甲醇平衡柱，将反应混合物倒入柱中，使其吸附在垫中。将柱用甲醇(×3)洗涤以洗脱所有未结合的物质。然后，使用甲醇中的50％的甲酸溶液洗脱标题产物。将有机相蒸发至干，以得到标题化合物，为油状物。产率：1.200g，327mmol(65％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ，ppm 4.12(2H，s)，3.98(2H，s)，3.72-3.60(16H，m)，1.43(9H，s).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ，ppm172.6，169.7，81.6，71.0，70.59，70.56，70.54，70.46，70.38，70.35，70.30，68.9，68.8，28.1.

3，6，9，12-四氧杂十四烷-1，14-二基二甲烷磺酸酯(19)

将五乙二醇(476.56mg，0.423ml，2mmol，1当量)溶解在4ml无水DCM中。将所得混合物的温度冷却至0℃，并添加甲磺酰氯(687.3mg，0.464ml，16mmol，3当量)，随后添加三乙胺(1011.9g，1.39ml，10mmol，5当量)。将所得混合物在0℃下搅拌4小时。添加10％的NaHSO₄水溶液直至pH＝3。用DCM(×5)萃取水相。合并有机相，经MgSO₄干燥并真空浓缩，以得到标题化合物，为橙色油状物。产率：701mg，1.77mmol(89％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 4.33-4.30(4H，m)，3.72-3.69(4H，m)，3.62-3.56(12H，m)，3.02(6H，s).

分析数据与先前报道的数据[Kimura等，J.Polym.Sci.PartA：Polym.Chem.54，(2016).]匹配。

17-((甲磺酰基)氧基)-3，6，9，12，15-五氧杂十七烷酸叔丁酯(20)

将10(251mg，0.712mmol，1当量)溶解在1.4ml无水DCM中。将所得混合物的温度冷却至0℃，并添加甲磺酰氯(122.3mg，0.082ml，1.068mmol，1.5当量)，随后添加三乙胺(216.14mg，0.3ml，2.136ml，3当量)。将所得混合物在0℃下搅拌4小时。添加10％的NaHSO₄水溶液直至pH＝3。用DCM(×5)萃取水相。合并有机相，用MgSO₄干燥并真空浓缩，以得到标题化合物，为橙色油状物。产率：276mg，0.641mmol(90％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 4.32-4.30(2H，m)，3.95(2H，s)，3.71-3.57(18H，m)，3.02(3H，s)，1.41(9H，s).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ 169.7，81.5，70.72，70.65，70.61，70.58，70.5，69.3，69.0，37.7，28.1.

(S)-19-((2S，4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-20，20-二甲基-17-氧代-3，6，9，12，15-五氧杂-18-氮杂二十一烷酸叔丁酯(12)

向PEG接头11(78.8mg，0.215mmol，1当量)在1.5ml DMF中的溶液添加HATU(81.74mg，0.215mmol，1当量)、HOAT(29.26mg，0.215mmol，1当量)，将DIPEA和溶液在室温下搅拌5分钟。添加化合物7(100mg，0.215mmol，1当量)，并通过添加DIPEA(80.13mg，0.106ml，0.645mmol，3当量)将反应混合物的pH调节至＞9。将混合物在室温下搅拌直至通过LC-MS未检测到原料的存在。在减压下蒸发溶剂，以得到相应的粗制品，将其通过使用0.1％氨水溶液中的20％至95％v/v梯度的乙腈的HPLC纯化，以得到标题化合物，为白色固体。产率：75.6mg，0.094mmol(44％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ ppm9.00(1H，s)，7.45(1H，t，J＝5.9Hz)，7.39-7.33(4H，m)，7.29(1H，d，J＝8.9Hz)，4.71(1H，t，J＝8.0Hz)，4.59-4.48(3H，m)，4.34(1H，dd，J＝5.2，14.6Hz)，4.08-3.92(5H，m)，3.69-3.61(18H，m)，2.52(3H，s)，2.47-2.41(1H，m)，2.19-2.11(1H，m)，1.46(9H，s)，0.97(9H，s).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ 171.3，171.1，170.5，170.0，151.7，139.1，129.4，128.3，82.0，71.1，70.6，70.4，70.4，70.3，70.3，70.2，70.2，68.9，58.7，57.3，56.8，43.1，36.3，35.1，28.1，26.4，15.1.

HRMS(ESI)m/z：C₃₈H₅₈N₄O₁₁S₂[M+H]⁺计算值：778.38；观察值：779.4。

N¹-((R)-1-((2R，4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-N¹⁷-((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-3，6，9，12，15-五氧杂十七烷二酰胺(CMP99)

按照一般方法B，由化合物12(75.6mg，0.094mmol，1当量)和三氟乙酸(1ml DCM中1ml)获得羧酸衍生物，为油状物。将粗制品无需进一步纯化即可用于下一步骤。产率：70mg，0.094mmol(定量)。MS(ESI)m/z：C₃₄H₅₀N₄O₁₁S[M+H]⁺计算值：722.32；观察值：723.3。

按照一般方法B，由化合物13(5.5mg，0.006mmol，1当量)、化合物8(2.77mg，0.006mmol，1当量)、HATU(2.28mg，0.0.006mmol，1当量)，HOAT(1mg，0.0.006mmol，1当量)、DIPEA(2.23mg，0.002ml，0.018mmol，3当量)获得CMP99，为白色固体。产率：4.5mg，0.004mmol(66％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl3)：d，ppm 8.74(2H，d，J＝2.8Hz)，7.37-7.34(9H，m)，7.18(1H，d，J＝8.9Hz)，4.76-4.64(3H，m)，4.59-4.44(5H，m)，4.37-4.26(2H，m)，4.05-3.59(27H，m)，2.52(6H，s)，2.31-2.11(4H，m)，0.96(9H，s)，0.95(9H，s).

HRMS(ESI)m/z：C₅₆H₇₈N₈O₁₃S₂[M+H]⁺计算值：1134.51；观察值：1135.58。

N¹，N¹⁴-双((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-3，6，9，12-四氧杂十四烷二酰胺(CM09)

按照一般方法B，由化合物1(6.80mg，0.018mmol，1当量)、化合物7(20mg，0.045mmol，2.5当量)、HATU(17mg，0.045mmol，2.5当量)、HOAT(6.12，0.045mmol，2.5mmol)、DIPEA(6.98mg，0.054mmol，3当量)获得化合物CM09，为白色固体。产率：8mg，0.007mmol(40％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 8.61(2H，s)，7.48-7.45(2H，m)，7.31-7.27(8H，m)，7.23(2H，d，J＝10.2Hz)，4.64-4.59(2H，m)，4.52-4.46(4H，m)，4.41-4.38(2H，m)，4.31-4.25(2H，m)，4.01-3.94(4H，m)，3.82(2H，d，J＝15.7Hz)，3.62-3.52(12H，m)，2.45(6H，s)，2.42-2.34(2H，m)，2.12-2.06(2H，m)，1.19(2H，s)，0.89(18H，s)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ170.2，169.9，169.6，149.3，147.5，137.3，130.6，129.9，128.4，127.1，69.9，69.5，69.3，69.1，57.6，56.1，55.9，42.2，35.5，34.6，25.4，15.1.

HRMS(ESI)m/z：C₅₄H₇₄N₈O₁₂S₂[M+H]⁺计算值：1090.49；观察值：1.091.4。

N¹，N¹⁷-双((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-3，6，9，12，15-五氧杂十七烷二酰胺(CM10)

按照一般方法B，由化合物2(7.60mg，0.018mmol，1当量)、化合物7(20mg，0.045mmol，2.5当量)、HATU(17mg，0.045mmol，2.5当量)、HOAT(6.12，0.045mmol，2.5mmol)、DIPEA(6.98mg，0.054mmol，3当量)获得化合物CM10，为白色固体。产率：6mg，0.005mmol(30％)。

¹H NMR(400MHz，MeOD)δ 9.28(2H，s)，7.43-7.36(10H，m)，5.39(2H，s)，4.77(10H，s)，4.59(2H，s)，4.50-4.43(4H，m)，4.42-4.38(2H，m)，4.26(2H，d，J＝17.2Hz)，3.96-3.92(4H，m)，3.77(2H，d，J＝11.1Hz)，3.73-3.68(2H，m)，3.56(16H，m)，3.22-3.20(10H，m)，2.43(6H，s)，2.16-2.14(2H，m)，2.13(2H，m)，2.02-1.95(2H，m)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ173.1，172.4，170.7，170.3，153.3，153.2，144.5，140.0，134.0，129.2，129.0，128.4，128.3，127.8，70.9，70.5，70.2，70.1，69.7，68.2，67.7，59.7，59.4，56.8，56.7，54.9，42.9，42.3，39.9，37.6，36.3，35.7，34.7，25.6，25.5，13.1.

HRMS(ESI)m/z：C₅₆H₇₈N₈O₁₃S₂[M+H]⁺计算值：1134.51；观察值：1135.55。

N¹，N²⁰-双((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-3，6，9，12，15，18-六氧杂二十烷二酰胺(CM11)

按照一般方法B，由化合物3(8.39mg，0.018mmol，1当量)、化合物7(20mg，0.045mmol，2.5当量)、HATU(17mg，0.045mmol，2.5当量)、HOAT(6.12，0.045mmol，2.5mmol)、DIPEA(6.98mg，0.054mmol，3当量)获得化合物CM11，为白色固体。产率：11.74mg，0.0099mmol(55％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 8.61(2H，s)，7.41-7.38(2H，m)，7.29(10H，t，J＝7.6Hz)，4.66-4.61(2H，m)，4.49-4.41(6H，m)，4.35-4.29(2H，m)，3.98-3.91(6H，m)，3.62-3.50(24H，m)，2.45(6H，s)，2.42-2.35(2H，m)，2.11-2.06(2H，m)，0.88(18H，s)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ 171.2，170.9，170.4，150.3，148.5，138.3，131.6，130.9，129.5，128.1，71.2，70.61，70.59，70.5，70.4，70.3，58.6，57.0，43.2，36.5，35.6，26.4，16.1.

HRMS(ESI)m/z：C₅₈H₈₂N₈O₁₄S₂[M+H]⁺计算值：1178.54；观察值：1179.60。

N¹，N²⁰-双((S)-1-((2S，4S)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-3，6，9，12，15，18-六氧杂二十烷二酰胺(CMP98)

按照一般方法B，由化合物3(7.12mg，0.028mmol，1当量)、化合物8(18.06，0.040mmol，2.1当量)、HATU(15.2mg，0.040mmol，2当量)、HOAT(5.44mg，0.040mmol，2当量)、DIPEA(7.45mg，0.0010ml，3当量)获得化合物CMP98，为白色固体。产率：10.58mg，0.0089mmol(45％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 9.09(2H，s)，8.02(2H，s)，7.31(4H，d，J＝8.5Hz)，7.22(4H，d，J＝8.0Hz)，7.16(2H，d，J＝9.2Hz)，4.75-4.64(4H，m)，4.51(2H，d，J＝8.9Hz)，4.41-4.37(2H，m)，4.24-4.17(2H，m)，3.94(4H，d，J＝3.2Hz)，3.84-3.81(4H，m)，3.62-3.54(20H，m)，2.49-2.47(2H，m)，2.44(6H，s)，2.26-2.17(4H，m)，0.93(18H，s)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ 173.2，171.5，169.7，151.8，138.8，132.9，129.5，129.2，128.3，71.2，71.1，70.6，70.48，70.45，70.4，70.3，59.9，58.5，56.5，43.2，35.6，35.2，26.4，15.0.

HRMS(ESI)m/z：C₅₈H₈₂N₈O₁₄S₂[M+H]⁺计算值：1178.54；观察值：1179.60。

(2S，2’S，4R，4’R)-N，N’-((((3，6，9，12-四氧杂十四烷-1，14-二基)双(氧基))双(4-(4-甲基噻唑-5-基)-2，1-亚苯基))双(亚甲基))双(1-((S)-2-(1-氰基环丙烷-1-甲酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺)(CMP108)

按照一般方法C，由18(27mg，0.05mmol，2当量)、19(11.83mg，0.03mmol，1.2当量)和K₂CO₃(41.46mg，0.3mmol，6当量)获得标题化合物，为白色固体。产率：9.1mg，0.007mmol(28％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 8.61(2H，s)，7.41-7.38(2H，m)，7.26(2H，d，J＝8.1Hz)，7.00(2H，d，J＝8.1Hz)，6.91-6.88(2H，m)，6.85-6.81(2H，m)，4.57-4.52(2H，m)，4.44-4.36(8H，m)，4.19-4.08(4H，m)，3.89-3.53(22H，m)，2.45(6H，s)，2.24-2.17(2H，m)，2.08-2.02(2H，m)，1.61-1.37(8H，m)，0.88(18H，s)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ 170.9，170.0，165.4，156.9，150.4，148.5，132.3，131.7，130.0，126.9，122.0，119.6，112.9，70.7，70.41，70.38，70.2，69.6，67.9，58.9，58.4，56.6，39.2，37.0，36.0，26.3，17.9，17.7，16.2，13.7.

HRMS(ESI)m/z：C₆₄H₈₄N₁₀O₁₄S₂[M+H]⁺计算值：1280.56；观察值：1281.66。

(2S，2’S，4R，4’R)-N，N’-((((3，6，9，12-四氧杂十四烷-1，14-二基)双(氧基))双(4-(4-甲基噻唑-5-基)-2，1-亚苯基)双(亚甲基)双(1-((S)-2-乙酰胺基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺)(CMP106)

按照一般方法C，由17(24.3mg，0.05mmol，2当量)、19(11.83mg，0.03mmol，1.2当量)和K₂CO₃(41.46mg，0.3mmol，6当量)获得标题化合物，为白色固体。产率：7.8mg，0.006mmol(26％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 8.60(2H，s)，7.39-7.35(2H，m)，7.26(2H，d，J＝7.6Hz)，6.91-6.88(2H，m)，6.83-6.80(2H，m)，6.36-6.13(2H，m)，4.60-4.32(10H，m)，4.18-4.05(4H，m)，3.97-3.79(6H，m)，3.71-3.54(18H，m)，2.44(6H，s)，2.17-1.86(8H，m)，0.87(18H，s)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ 171.3，171.1，171.0，170.7，170.5，156.8，156.8，150.3，148.5，132.2，131.7，130.0，129.8，127.1，126.9，122.1，122.0，112.8，112.8，71.3，70.7，70.6，70.5，70.5，70.5，70.4，70.2，70.1，69.7，67.9，58.9，58.6，57.6，57.5，56.9，56.7，42.7，39.1，39.0，37.1，36.4，35.4，35.1，26.4，26.4，23.2，23.1，16.2.

HRMS(ESI)m/z：C₅₈H₈₂N₈O₁₄S₂[M+H]⁺计算值：1178.54；观察值：1281.66。

(14-(2-(((2S，4R)-1-((S)-2-(1-氰基环丙烷-1-甲酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺基)甲基)-5-(4-甲基噻唑-5-基)苯氧基)-3，6，9，12-四氧杂十四基)碳酸叔丁酯(22)

按照一般方法C，由18(27mg，0.05mmol，1当量)、20(26mg，0.06mmol，1.2当量)和K₂CO₃(20.73mg，0.15mmol，3当量)获得标题化合物，为白色固体。产率：17mg，0.02mmol(33％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 8.61(1H，s)，7.33-7.25(2H，m)，6.97(1H，d，J＝9.1Hz)，6.92-6.89(1H，m)，6.84(1H，d，J＝1.5Hz)，4.59-4.55(1H，m)，4.45-4.38(4H，m)，4.22-4.10(2H，m)，3.93-3.54(24H，m)，2.46(3H，s)，2.32-2.24(1H，m)，2.10-2.04(1H，m)，1.63-1.52(2H，m)，1.45-1.39(12H，m)，0.87(9H，s)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ 170.6，170.1，169.7，165.4，156.9，150.3，148.5，132.3，131.7，130.0，126.9，122.0，119.7，112.9，81.7，70.72，70.66，70.5，70.4，70.3，69.6，69.0，68.0，58.8，58.4，56.6，39.3，36.7，35.8，28.1，26.3，17.8，16.2，13.7.

HRMS(ESI)m/z：C₄₃H₆₃N₅O₁₂S[M+H]⁺计算值：873.42；观察值：874.49。

17-(2-(((2S，4R)-1-((S)-2-乙酰胺基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺基)甲基)-5-(4-甲基噻唑-5-基)苯氧基)-3，6，9，12，15-五氧杂十七烷酸叔丁酯(21)

按照一般方法C，从17(24.3mg，0.05mmol，1当量)、20(26mg，0.06mmol，1.2当量)和K₂CO₃(20.73mg，0.15mmol，3当量)获得标题化合物，为白色固体。产率：17mg，0.021mmol(33％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ，ppm 8.67(1H，s)，7.32(2H，d，J＝7.8Hz)，6.95(1H，dd，J＝1.6，7.6Hz)，6.88(1H，d，J＝1.8Hz)，4.65-4.60(1H，m)，4.53-4.43(2H，m)，4.39-4.36(1H，m)，4.24-4.13(2H，m)，4.00(2H，d，J＝7.0Hz)，3.92-3.87(2H，m)，3.77-3.59(20H，m)，3.08(2H，s)，2.51(3H，s)，2.38-2.31(1H，m)，1.98(3H，s).¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ 171.2，170.8，170.4，169.7，156.8，150.3，148.5，132.2，131.7，129.8，126.9，122.0，112.8，81.6，70.8，70.71，70.69，70.60，70.57，70.55，70.52，70.49，70.47，70.1，69.6，69.3，69.02，68.98，67.9，58.6，57.5，56.7，39.0，37.7，36.5，35.2，28.1，26.4，23.2，16.1.

HRMS(ESI)m/z：C₄₀H₆₂N₄O₁₂S[M+H]⁺计算值：822.41；观察值：823.5。

(2S，4R)-1-((S)-2-(叔丁基)-20-(2-(((2S，4R)-1-((S)-2-(1-氰基环丙烷-1-甲酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酰胺基)甲基)-5-(4-甲基噻唑-5-基)苯氧基)-4-氧代-6，9，12，15，18-五氧杂-3-氮杂二十烷酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(CMP113)

按照一般方法B，由化合物20(17mg，0.02mmol，1当量)和三氟乙酸(在0.5ml DCM中的0.5ml)获得羧酸衍生物，为油状物。产率：15.7mg，0.019mmol(定量)。HRMS(ESI)m/z：C₃₉H₅₅N₅O₁₂S[M+H]⁺计算值：817.36；观察值：818.4。

由获得的0.5ml DMF中的羧酸(15.7mg，0.019mmol，1当量)、HATU(7.22mg，0.019mmol，1当量)、HOAT(2.58mg，0.019mmol，1当量)、化合物7(8.73mg，0.019mmol，1当量)和DIPEA(3当量)分离出最终化合物，为白色固体。产率：6.3mg，0.005mmol(27％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 8.61(2H，s)，7.58-7.54(1H，m)，7.31-7.25(5H，m)，7.02(1H，d，J＝9.7Hz)，6.88-6.85(1H，m)，6.78(1H，d，J＝1.5Hz)，4.59-4.56(2H，m)，4.47-4.25(6H，m)，4.13-3.52(20H，m)，2.47-2.42(6H，m)，2.34-2.27(1H，m)，2.19-2.03(5H，m)，1.63-1.52(2H，m)，1.48-1.37(2H，m)，0.90(18H，s)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ 171.2，171.1，170.7，170.3，165.4，156.6，150.3，148.4，148.3，138.3，132.0，131.8，131.7，130.7，129.5，129.4，127.9，126.9，122.0，119.7，112.6，71.0，70.7，70.5，70.4，70.32，70.28，70.25，69.6，67.9，59.1，58.8，58.5，57.3，57.1，56.7，43.1，39.0，37.3，36.8，36.2，35.4，26.4，26.3，17.9，17.7，16.1，16.0，13.7.

HRMS(ESI)m/z：C₆₁H₈₃N₉O₁₄S₂[M+H]⁺计算值：1229.55；观察值：1230.66。

(2S，4R)-1-((S)-2-乙酰胺基-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(2-(((S)-19-((2S，4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-羰基)-20，20二甲基-17-氧代-3，6，9，12，15-五氧杂-18-氮杂二十一烷基)氧基)-4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(CMP112)

按照一般方法B，由化合物20(17mg，0.021mmol，1当量)和三氟乙酸(0.5ml DCM中的0.5ml)获得羧酸衍生物或38，为油状物。产率：13mg，0.017mmol(定量)。HRMS(ESI)m/z：C₃₆H₅₄N₄O₁₂S[M+H]⁺计算值：766.35；观察值：767.4。

由0.5ml DMF中的羧酸(13mg，0.017mmol，1当量)、HATU(6.49mg，0.017mmol，1当量)、HOAT(2.31mg，0.017mmol，1当量)、化合物7(7.90mg，0.017mmol，1当量)和DIPEA(3当量)获得标题化合物，为白色固体。产率：6mg，0.005mmol(30％)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 8.61(2H，s)，7.49-7.45(1H，m)，7.32-7.24(6H，m)，6.90-6.87(1H，m)，6.79(1H，d，J＝2.4Hz)，6.24(1H，d，J＝8.9Hz)，4.61-4.29(10H，m)，4.11-3.52(27H，m)，2.44(6H，s)，2.30(1H，t，J＝13.3Hz)，2.18-2.03(3H，m)，0.87(9H，s)；¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ 171.2，171.1，170.7，170.4，156.7，150.3，148.4，138.3，132.2，130.9，129.7，129.4，128.0，127.0，122.0，112.8，70.9，70.6，70.5，70.4，70.3，70.2，69.6，67.9，59.0，58.8，57.7，57.1，43.1，39.0，37.1，36.8，35.6，35.5，26.42，26.38，23.0，16.13，16.06.

HRMS(ESI)m/z：C₅₈H₈₂N₈O₁₄S₂[M+H]⁺计算值：1178.54；观察值：1179.6。

一般方法D：

向二醇(1当量)在DCM中的溶液添加溴乙酸叔丁酯(8当量)、TBABr(1.1当量)和37％w/w的NaOH水溶液。将反应混合物在室温下剧烈搅拌过夜。从水层分离有机相，然后将水相用DCM(×3)萃取。收集有机层，经MgSO₄干燥并在减压下蒸发。通过用庚烷中的10％至50％v/v的乙酸乙酯洗脱的快速色谱法纯化粗制品。

一般方法E：

在H₂ 10atm，70℃下使苄基化的原料在无水EtOH(0.05M)中的溶液以1mL/分钟的速度在H-cube机器中流动。在减压下蒸发溶剂，以得到最终化合物。

一般方法F：

向二羧酸接头(1当量)的无水DMF溶液添加COMU(2当量)和DIPEA(5当量)。将该溶液搅拌10分钟，然后将其添加至VHL-配体胺7(2.1当量)和DIPEA(5当量)在无水DMF中的悬浮液。将混合物在室温下搅拌，直至通过LC-MS未检测到原料的存在。添加冰，并将挥发物在减压下蒸发，以得到粗制品，将其通过使用0.1％v/v甲酸水溶液中的20％至70％v/v梯度的乙腈的HPLC纯化，以得到最终化合物。

4，4’-(丁烷-1，4-二基双(氧基))双(丁-1-醇)(101)

/>

如Knuf等报道⁴⁰的那样制备化合物101。分析数据与先前报道的数据匹配。

3，8，13，18-四氧杂二十碳二酸二叔丁酯(102)

按照一般方法D，由在37％w/w的NaOH水溶液(4mL)和DCM(4mL)中的化合物101(198mg，0.8449mmol)制备。获得化合物102，为油状物(158mg，产率：40％)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)6：3.87(4H，s)，3.45(4H，t，J＝6.1Hz)，3.38-3.30(8H，m)，1.67-1.51(12H，m)，1.41(18H，s).

3，8，13，18-四氧杂二十烷二酸(103)

按照一般方法B，由TFA/DCM 1∶1(2mL)中的化合物102(158mg，0.3415mmol)开始制备。获得化合物103，为油状物(120mg，产率：定量)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.26(s，2H)，4.09(s，4H)，3.58(t，J＝6.1Hz，4H)，3.48-3.41(m，8H)，1.75-1.60(m，12H).¹³C-NMR(101MHz，CDCl₃)δ：173.1，71.7，70.6，70.4，67.9，26.4，26.3，26.1.

5-(苄氧基)戊-1-醇(104)

在0℃下，将1，5-戊二醇(3.430g，3.45mL，0.033mol，4当量)逐滴添加到NaH(670mg，0.016mol，2eq)在DMF(14mL)中的悬浮液。添加催化量的NaI，随后添加苄基溴(1.360g，0.95mL，0.008mol，1当量)。将混合物在室温下搅拌过夜。

用NH₄Cl饱和水溶液淬灭反应。随后用乙酸乙酯(×3)萃取。收集有机层并在减压下蒸发。通过由庚烷中的40％至90％的乙酸乙酯洗脱的快速色谱法纯化粗制品，以得到期望的产物(1.08g，产率：70％)。

分析数据与先前报道的数据匹配。⁴¹

2-(2-(2-(苄氧基)乙氧基)乙氧基)甲磺酸乙酯(105)

按照先前报道的方法⁴²获得化合物105。分析数据与报道的数据匹配。

1，18-二苯基-2，5，8，11，17-五氧杂-十八烷(106)

在0℃和N₂气氛下，将化合物104(228.58mg，1.177mmol，2.5当量)添加至1MNaHMDS在THF(107.95mg，0.588mL，0.588mmol，1.25当量)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时。在此时间后，添加化合物105(150.00mg，0.471mmol，1当量)在DMF中的溶液，并将混合物在130℃下用微波照射2小时。

在此时间之后，蒸发溶剂，将反应用5％NaHSO₄水溶液淬灭，并用DCM(×3)萃取。收集有机层，经MgSO₄干燥，过滤并在减压下蒸发。通过快速色谱法纯化粗制品，由庚烷中的0％至50％v/v的乙酸乙酯洗脱，以得到期望的化合物106，为油状物(114mg，产率：58％)。

¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)δ：7.28-7.19(m，10H)，4.49(s，2H)，4.43(s，2H)，3.62-3.54(m，10H)，3.51-3.48(m，2H)，3.43-3.36(m，4H)，1.61-1.48(m，4H)，1.42-1.31(m，2H).

3，6，9，12，18-五氧杂二十烷二酸二叔丁酯(107)

由化合物106(265mg，0.610mmol)开始，按照一般方法E，以得到脱保护的化合物，为油状物(131mg)，将其无需任何进一步纯化即可用于下一步骤。

按照一般方法D，由37％w/w NaOH水溶液(2.2mL)和DCM(2.2mL)中的脱保护的化合物(131mg，0.5544mmol)获得化合物107，为油状物(122mg，产率：47％)。

¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)δ：4.00(s，2H)，3.92(s，2H)，3.69-3.60(m，10H)，3.57-3.53(m，2H)，3.52-3.46(m，2H)，3.43(t，J＝7.1Hz，2H)，1.67-1.56(m，4H)，1.46(d，J＝0.6Hz，18H)，1.43-1.37(m，2H).¹³C-NMR(101MHz，CDCl₃)δ：169.8，81.5，81.4，71.6，71.3，70.7，70.6，70.1，69.0，68.8，29.5，294，28.1，22.6.

3，6，9，12，18-五氧杂二十烷二酸(108)

按照一般方法B，由2mL TFA/DCM 1∶1中的化合物107(90mg，0.1937mmol)开始制备。获得化合物108，为油状物(66mg，产率：定量)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.15(s，2H)，4.11(s，2H)，4.02(s，2H)，3.71-3.40(m，16H)，1.65-1.52(m，4H)，1.43-1.34(m，2H)

1，5-双(烯丙氧基)戊烷(109)

由1，5-戊二醇(500mg，4.8mmol)开始并按照所报道的方法⁴³获得化合物109。

分析数据与先前报道的数据匹配。

3，3’-(戊烷-1，5-二基双(氧基))双(丙烷-1-醇)(110)

在0℃下将化合物109(500mg，2.71mmol，1当量)在无水THF(4.2mL)中的溶液逐滴添加至0.5M的9-硼双环[3.3.1]壬烷在THF(993mg，16.28mL，8.14mmol，3当量)中的溶液，并将所得溶液在室温下搅拌过夜。

用MeOH(3.17mL)、30％w/w NaOH水溶液(6.35mL)、30％v/v水性H₂O₂(6.35mL)淬灭反应，并将混合物搅拌2小时。然后将其用乙酸乙酯(×3)萃取。收集有机层，用盐水洗涤，经MgSO₄干燥并在减压下蒸发。通过由庚烷中的0％至100％的乙酸乙酯洗脱的快速色谱法纯化粗制品，以得到期望的产物，为油状物(483mg，产率：81％)。分析数据与先前报道的数据匹配⁴³。

3，7，13，17-四氧杂十九烷二酸二叔丁酯(111)

按照一般方法D，在37％w/w NaOH水溶液(4mL)和DCM(4mL)中由化合物110(214mg，0.9714mmol)获得化合物111。获得期望的产物，为油状物(65mg，产率：15％)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：3.88(s，4H)，3.53(t，J＝6.5Hz，4H)，3.44(t，J＝6.4Hz，4H)，3.34(t，J＝6.9Hz，4H)，1.85-1.78(m，4H)，1.55-1.47(m，4H)，1.41(s，18H)，1.36-1.29(m，2H).

3，7，13，17-四氧杂十九烷二酸(112)

按照一般方法B，由TFA/DCM 1∶1(2mL)中的化合物111(64mg，0.1427mmol)开始制备。获得化合物112，为油状物(47.5mg，产率：定量)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.11(s，2H)，4.06(s，4H)，3.64(t，J＝5.9Hz，4H)，3.54(t，J＝5.9Hz，4H)，3.42(t，J＝6.4Hz，4H)，1.88-1.81(m，4H)，1.60-1.52(m，4H)，1.36(dt，J＝7.6，11.9Hz，2H).¹³C-NMR(101MHz，CDCl₃)δ：173.3，71.1，69.6，68.2，67.9，29.4，29.2，22.7.

4-甲基苯磺酸5-(苄氧基)戊酯(113)

在0℃下向化合物104(1.910g，9.8387mmol，1当量)和三乙胺(1.65mL，11.8226mmol，1.2当量)在DCM(15mL)中的溶液添加p-TsCl(2.063g，10.8226mmol，1.1当量)在DCM(15mL)中的溶液。将混合物搅拌过夜。然后添加饱和碳酸氢钠水溶液。将水相与有机层分离，并用DCM(×2)萃取。收集有机层，并用5％HCl水溶液洗涤。通过用庚烷中的0％至60％v/v乙酸乙酯洗脱的快速色谱法纯化粗制品，以得到所需产物(1.9g，产率：55％)。分析数据与先前报道的数据匹配。⁴⁴

1，18-二苯基-2，8，11，17-四氧杂十八烷(114)

将化合物113(1.9g，5.6863mmol，2.4当量)、乙二醇(147mg，2.3696mmol，1当量)和TBA硫酸氢盐(804mg，2.3693mmol，1当量)的混合物溶解在甲苯(8mL)和50％NaOH水溶液(6mL)中。将混合物剧烈搅拌过夜。从水层分离有机相，然后将其用乙酸乙酯(×3)萃取。收集有机层，经MgSO₄干燥并在减压下蒸发。通过快速色谱法纯化粗制品，用乙酸乙酯在庚烷中的混合物v/v从100％庚烷至100％乙酸乙酯洗脱。获得期望的化合物，为油状物(200mg，产率：8.5％)。

¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)δ：7.25-7.22(m，10H)，4.40(s，4H)，3.47(s，4H)，3.39-3.35(m，8H)，1.58-1.47(m，8H)，1.37-1.29(m，4H).

5，5’-(乙烷-1，2-二基双(氧基))双(戊-1-醇)(115)

由化合物114(200mg，0.8535mmol)开始，按照一般方法E，以获得化合物115，为油状物(35mg，产率：31％)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：3.53(t，J＝6.1Hz，4H)，3.49(s，4H)，3.49(s，4H)，3.40(t，J＝6.6Hz，4H)，2.93(s，2H)，1.58-1.45(m，8H)，1.37-1.29(m，4H).

1，2-二(1，3-二氧六环-2-基)乙烷(118)

根据公开的程序⁴⁵，由2，5-二甲氧基四氢呋喃(10.0g，75.6659mmol)开始制备化合物118。分析数据与先前报道的数据匹配。

3，3’-(丁烷-1，4-二基双(氧基)双(丙烷-1-醇)(119)

根据所公开的程序⁴⁵相应地由化合物118开始制备化合物119。分析数据与先前报道的数据匹配。

1-苯基2，5，9，14-四氧杂十七烷17-醇(120)

将化合物120(1.1g，5.3325mmol，3当量)溶解在甲苯(10mL)和50％w/w NaOH水溶液(5mL)中。添加TBABr(590mg，1.7775mmol，1当量)、催化量的TBAI和苄基-2-溴乙基醚(382mg，1.7775mmol，1当量)，并将反应混合物剧烈搅拌48小时。将有机层与水相分离，并将水相用DCM(×3)萃取。将粗制品通过由DCM中的0％至5％v/v MeOH洗脱的快速色谱法纯化，以获得产物，为油状物(350mg，57％)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.33-7.22(m，5H)，4.55(s，2H)，3.74(dd，J＝5.7，11.2Hz，2H)，3.59-3.55(m，6H)，3.53(t，J＝6.5Hz，2H)，3.47(t，J＝6.4Hz，2H)，3.44-3.37(m，4H)，2.44(t，J＝5.7Hz，1H)，1.87-1.76(m，4H)，1.61-1.57(m，4H).

3-(4-(3-(2-羟基乙氧基)丙氧基)丁氧基)丙-1-醇(121)

从化合物120(350mg，1.028mmol)开始并按照一般方法E获得产物。转化不是定量的，因此通过从100％DCM至9∶1v/v DCM/MEOH洗脱的快速色谱法将产物121与起始物质分离(87mg，产率：34％)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：3.66-3.60(m，4H)，3.51-3.38(m，8H)，3.38-3.31(m，4H)，1.79-1.69(m，4H)，1.57-1.50(m，4H).

3，6，10，15，19-五氧杂二十一烷二酸二叔丁酯(122)

按照一般方法D，在37％w/w的NaOH水溶液(1.5mL)和DCM(1.5mL)中由化合物121(87mg，0.3475mmol)获得化合物122。获得所需产物，为油状物(47mg，产率：28％)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ：3.99(s，2H)，3.68-3.42(m，12H)，3.41-3.36(m，4H)，1.88-1.77(m，4H)，1.59-1.55(m，4H)，1.44(s，18H).

3，6，10，15，19-五氧杂二十一烷二酸(123)

按照一般方法B，从在TFA/DCM 1∶1(1mL)中的化合物122(47mg，0.0983mmol)开始制备。获得化合物123，为油状物(35mg，产率：定量)。

¹H-NMR(500MHz，CDCl3)δ：4.14(s，2H)，4.07(s，2H)，3.73-3.69(m，2H)，3.65-3.59(m，4H)，3.59-3.53(m，4H)，3.49(t，J＝6.3Hz，2H)，3.47-3.40(m，4H)，1.89-1.81(m，4H)，1.62-1.57(m，4H).

13C-NMR(101MHz，CDCl3)δ：173.9，173.7，71.3，71.0，70.8，70.0，69.6，68.7，68.6，68.1，68.0，67.6，29.7，29.5，26.3，26.2.

N1，N20-双((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-3，6，9，12，18-五氧杂二十烷二酰胺(124)

根据一般方法F相应地从化合物7(20mg，0.0428mmol)和化合物108(7.2mg，0.02038mmol)开始制备化合物124。获得5mg(产率：21％)。

¹H-NMR(500MHz，MeOD)δ：8.77(s，2H)，7.34(dd，J＝7.4，23.2Hz，8H)，4.59(dd，J＝2.4，9.4Hz，2H)，4.50-4.38(m，6H)，4.27(t，J＝4.3Hz，1H)，4.24(t，J＝4.3Hz，1H)，3.94(dd，J＝15.3，22.3Hz，2H)，3.85(dd，J＝15.3，24.4Hz，2H)，3.76(d，J＝10.7Hz，2H)，3.72-3.68(m，2H)，3.61-3.40(m，14H)，3.35(dt，J＝1.0，6.5Hz，2H)，2.37(s，6H)，2.16-2.09(m，2H)，2.02-1.96(m，2H)，1.57-1.45(m，4H)，1.39-1.32(m，2H)，0.94(s，18H).

¹³C-NMR(101MHz，MeOD)δ：174.4，174.3，172.1，172.0，171.7，152.9，149.0，140.3，133.4，131.5，130.5，130.4，129.5，129.0，72.9，72.3，72.2，71.7，71.6，71.5，71.2，71.1，70.7，60.8，58.1，58.0，43.7，38.9，37.2，37.1，30.5，30.4，27.0，26.9，23.8，15.8.

HRMS：实测值1177.6435[M+H⁺]。

N1，N20-双((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-3，8，13，18-四氧杂二十烷二酰胺(125)

根据一般方法F，相应地从化合物7(20mg，0.0428mmol)和化合物103(7.1mg，0.02038mmol)开始制备化合物125。获得6.7mg(产率：28％)。

¹H-NMR(500MHz，MeOD)δ：8.77(s，2H)，7.34(dd，J＝8.3，23.6Hz，8H)，4.59(d，J＝12.0Hz，2H)，4.50-4.40(m，6H)，4.26(dd，J＝4.9，15.9Hz，2H)，3.86(dd，J＝15.3，23.4Hz，4H)，3.77(d，J＝11.4Hz，2H)，3.70(dd，J＝3.9，11.1Hz，2H)，3.46(t，J＝6.0Hz，4H)，3.38-3.28(m，8H)，2.37(s，6H)，2.16-2.10(m，2H)，2.02-1.96(m，2H)，1.62-1.52(m，8H)，1.51-1.45(m，4H)，0.93(s，18H).

¹³C-NMR(101MHz，MeOD)δ：174.3，172.1，172.0，171.7，152.8，149.1，140.3，133.4，131.5，130.5，130.4，129.5，129.0，72.7，71.7，71.5，71.1，70.7，60.8，58.1，58.0，43.7，39.0，37.2，27.6，27.5，27.4，15.9.

HRMS：实测值1175.6623[M+H⁺]。

N1，N19-双((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-3，7，13，17-四氧杂十九烷二酰胺(126)

根据一般方法F相应地从化合物7(20mg，0.0428mmol)和化合物112(6.8mg，0.0204mmol)开始制备化合物126。获得6.6mg，为白色固体(产率：28％)。

¹H-NMR(500MHz，MeOD)δ：8.76(s，2H)，7.37-7.30(m，8H)，4.60(d，J＝9.4Hz，2H)，4.50-4.24(m，8H)，3.87(d，J＝6.5Hz，4H)，3.77(d，J＝11.2Hz，2H)，3.70(dd，J＝3.8，11.5Hz，2H)，3.55-3.49(m，4H)，3.43(dt，J＝1.2，6.2Hz，4H)，3.33-3.29(m，4H)，2.37(s，6H)，2.16-2.10(m，2H)，2.03-1.96(m，2H)，1.80-1.74(m，4H)，1.47-1.40(m，4H)，1.30-1.23(m，2H)，0.93(s，18H).

¹³C-NMR(101MHz，MeOD)δ：174.3，171.8，171.6，152.8，149.0，140.2，133.4，131.5，130.5，130.3，129.5，128.9，71.9，71.0，70.8，69.8，68.3，60.8，58.1，57.9，43.7，38.9，37.2，30.9，30.5，26.9，23.9，15.8.

HRMS：实测值1161.6446[M+H⁺]。

N1，N21-双((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-3，6，10，15，19-五氧杂二十一烷二酰胺(128)

根据一般方法F，由化合物7(20mg，0.0428mmol)和化合物123(7.5mg，0.02038mm0l)开始制备化合物128。获得6.5mg，为白色固体(产率：27％)。

¹H-NMR(500MHz，MeOD)δ：9.00(d，J＝1.1Hz，2H)，7.45(dd，J＝8.4，23.1Hz，8H)，4.71-4.68(m，2H)，4.55(tt，J＝12.4，11.9Hz，6H)，4.36(d，J＝15.5Hz，2H)，4.03(d，J＝3.6Hz，2H)，3.97(d，J＝5.9Hz，2H)，3.89-3.78(m，4H)，3.71-3.68(m，2H)，3.64-3.36(m，14H)，2.49(s，6H)，2.26-2.19(m，2H)，2.13-2.06(m，2H)，1.90-1.84(m，2H)，1.85-1.79(m，2H)，1.61-1.55(m，4H)，1.04(d，J＝3.4Hz，18H).

¹³C-NMR(101MHz，MeOD)δ：174.4，174.3，172.1，171.9，171.8，171.7，153.3，140.6，131.1，130.4，129.0，72.3，71.8，71.2，71.1，70.9，69.9，69.4，68.7，68.4，60.8，58.2，58.1，58.0，43.7，38.9，37.2，37.1，31.1，31.0，27.5，27.0，15.4.

HRMS：实测值1191.6137[M+H⁺]。

(S)-1-((2R，3R，4S)-3-氟-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-氯化铵(129)

根据专利WO 2018/051107 A1相应地制备化合物129。分析数据与先前报道的数据匹配。

N1，N20-双((S)-1-((2R，3R，4S)-3-氟-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基)-3，6，9，12，15，18-六氧杂二十烷二酰胺(130)

根据一般方法F相应地从化合物129(16.9mg，0.0348mmol)和3，6，9，12，15，18-六氧杂二十烷二酸(6.17mg，0.0174mmol)开始制备。获得7.5mg(35％产率)，为白色固体。

¹H-NMR(400MHz，MeOD)δ：8.89(s，2)，7.46(d，J＝8.7Hz，8H)，4.99(td，J＝3.3，52.9Hz，2H)，4.69(s，2H)，4.65(dd，J＝2.9，21.3Hz，2H)，4.60-4.34(m，6H)，4.08-4.03(m，6H)，3.77-3.59(m，22H)，2.49(s，6H)，1.06(s，18H).

¹⁹F-NMR(376.45MHz，MeOD)：-201.87，¹³C-NMR(101MHz，MeOD)δ：170.9，170.5，169.2，169.1，151.5，147.7，138.6，130.2，129.0，127.5，94.0，92.1，70.9，70.2，70.1，70.1，69.6，69.5，64.4，64.1，56.1，50.9，42.4，35.3，25.5，14.4.

HRMS：实测值1215.5214[M+H⁺]。

缩略语

BAIB：双乙酰氧基碘苯；

CID：二聚化的化学诱导剂；

CRL：Cullin RING连接酶；

DC50：半降解浓度；

DCM：二氯甲烷；

DIPEA：N，N-二异丙基乙胺；

DMF：二甲基甲酰胺；

DMSO：二甲基亚砜；

HATU：1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3Y三唑并[4，5-b]吡啶3-氧化六氟磷酸盐；

Hdy-HIF-1α：HIF-1α的羟基化形式；

HIF-1α：低氧诱导因子α；

Hyp：羟脯氨酸；

HOAT：1-羟基-7-氮杂苯并三唑；

IAPS：凋亡蛋白抑制剂；

ITC：等温滴定量热法；

LHS：左手侧；

PEG：聚乙二醇；

PHD：包含脯氨酰羟化酶结构域的蛋白质；

PPI：蛋白质-蛋白质相互作用；

PROTACS：蛋白质水解靶向嵌合体；

RHS：右手侧；

SEC：尺寸排阻色谱法；

TEMPO：2，2，6，6-四甲基哌啶-1-基)氧基或(2，2，6，6-四甲基哌啶-1-基)氧烷基；

TFA：三氟乙酸；

VHL：希-林(von Hippel-Lindau)；

HRE：低氧反应元件。

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Claims (4)

1.化合物，其选自下组：

2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是化合物(5)。

3.药物组合物，其包含一种或更多种根据权利要求1或2所述的化合物，以及用于此的可药用载剂或稀释剂。

4.根据权利要求1或2所述的化合物或根据权利要求3所述的药物组合物在制造用于治疗以下疾病中的至少一种之药物中的用途：由于慢性肾疾病引起的贫血、由于癌症化学治疗引起的贫血、缺血、缺血再灌注损伤、心肌梗死、卒中、急性肺损伤、肠道炎症、伤口愈合和移植后并发症、线粒体呼吸链功能障碍和可通过增强T细胞应答治疗的肿瘤病症。