JP2020516232A - ライゲーション増幅を使用する分子検出 - Google Patents

ライゲーション増幅を使用する分子検出 Download PDF

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Abstract

検出分子を使用して試料中の標的分子を検出するための組成物、キット、方法およびシステムが、本明細書に開示されている。一局面では、試料中の標的分子を検出カプレットと接触させるステップを含む方法が提供され、上記検出カプレットが、第１の核酸および第２の核酸を含み、各核酸が、標的認識領域および自己ハイブリダイゼーション領域を有し、上記第１の核酸の上記標的認識領域が、上記標的分子の第１の領域に結合し、上記第２の核酸の上記標的認識領域が、上記標的分子の第２の領域に結合し、上記第１の核酸の上記自己ハイブリダイゼーション領域および上記第２の核酸の上記自己ハイブリダイゼーション領域がハイブリダイズされて、二本鎖核酸標識を形成する。

Description

相互参照
この出願は、２０１６年１２月１６日に出願された米国仮出願第６２／４３５，４２４号、２０１７年３月３１日に出願された米国仮出願第６２／４８０，１０７号および２０１７年５月２３日に出願された米国仮出願第６２／５０９，９９５号（これらの各々は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
連邦政府により資金提供された研究についての陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＮＩＮＤＳ Ｇｒａｎｔ ＳＢＩＲ １Ｒ４３ＮＳ０９２１８０−０１の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
平均して、一次抗体当たりおおよそ約１５個のフルオロフォアのシグナルをもたらす、伝統的な二次抗体染色に匹敵するシグナルレベルを得ることは、困難な課題となり得る。多重に標識されたアンチセンスオリゴマーは、一次抗体当たりおおよそ数個のフルオロフォアのシグナルを生じることができるが、アンチセンスオリゴマーの高密度標識は、フルオロフォアの間にクエンチングをもたらすことがある。二次増幅に匹敵する、より高いシグナル強度を生じるためのライゲーション増幅方法が、本明細書に開示されている。
試料中の標的分子を検出するための組成物、キット、方法およびシステムが、本明細書に開示されている。一態様では、試料中の標的分子を検出カプレットと接触させるステップを含む方法であって、検出カプレットが、第１の核酸および第２の核酸を含み、各核酸が、標的認識領域および自己ハイブリダイゼーション領域を有し、第１の核酸の標的認識領域が、標的分子の第１の領域に結合し、第２の核酸の標的認識領域が、標的分子の第２の領域に結合し、第１の核酸の自己ハイブリダイゼーション領域および第２の核酸の自己ハイブリダイゼーション領域がハイブリダイズされて、二本鎖核酸標識を形成する、方法が、ここに開示されている。
一部の事例では、二本鎖核酸標識は、少なくとも２個の連続した塩基対、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００または少なくとも２５０個の連続した塩基対を有する。
一部の事例では、二本鎖核酸標識は、オーバーハングを有する。一部の事例では、オーバーハングは、少なくとも１個の不対合ヌクレオチド、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００または少なくとも２５０個の不対合ヌクレオチドを有する。
一部の事例では、標的分子は、ＲＮＡ分子である。一部の事例では、標的分子は、ｍＲＮＡ分子である。一部の事例では、第１の核酸および第２の核酸は、一本鎖ＤＮＡである。一部の事例では、標的分子の第１の領域および第２の領域は、２〜１５ヌクレオチド離れている。一部の事例では、標的分子の第１の領域および第２の領域は、２〜５ヌクレオチド離れている。一部の事例では、標的分子の第１の領域および第２の領域は、５〜１０ヌクレオチド離れている。一部の事例では、標的分子の第１の領域および第２の領域は、１０〜１５ヌクレオチド離れている。一部の事例では、標的分子の第１の領域および第２の領域は、１５〜２０ヌクレオチド離れている。
一部の事例では、本方法は、クロスリンカーを使用して、検出カプレットを試料に固定するステップをさらに含む。一部の事例では、第１の核酸または第２の核酸は、遊離アミン（−ＮＨ２）修飾を有する。一部の事例では、検出カプレットを固定するステップは、検出カプレットをアミン特異的クロスリンカーと接触させるステップを含む。
一部の事例では、オーバーハングは、１個のヌクレオチドを含む。一部の事例では、オーバーハングは、複数のヌクレオチドを含む。一部の事例では、オーバーハングは、少なくとも約２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００個のヌクレオチドを含む。一部の事例では、本方法は、二本鎖核酸標識をＤＮＡリガーゼと接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、本方法は、二本鎖核酸標識を少なくとも１個の検出標識と接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的なオーバーハングを有する二本鎖核酸である。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的な一本鎖核酸である。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、複数の検出標識を含む。一部の事例では、二本鎖核酸標識および少なくとも１個の検出標識は、ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションされる。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個の検出標識を含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、切断可能なリンカーを含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、切断可能なリンカーを含まない。
一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、検出タグを含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、複数の検出タグを含む。一部の事例では、検出タグは、量子ドットを含む。一部の事例では、検出タグは、フルオロフォアを含む。一部の事例では、フルオロフォアは、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセインまたはシアニンを含む。一部の事例では、本方法は、検出タグを検出し、これにより、試料中の標的分子の存在を検出するステップを含む。一部の事例では、本方法は、試料を複数の検出カプレットと接触させるステップを含む。一部の事例では、複数の検出カプレットのそれぞれは、異なる標的分子に結合する。
一部の事例では、試料は、インタクトな組織試料である。一部の事例では、本方法は、インタクトな組織試料が、２０〜１０００ｎｍの間の厚さの切片にスライスされ得るように、樹脂にインタクトな組織試料を包埋するステップを含む。一部の事例では、インタクトな組織試料は、骨髄組織試料、胃腸管組織試料、肺組織試料、肝臓組織試料、前立腺組織試料、神経系組織試料、泌尿生殖器系組織試料、脳組織試料、乳房組織試料、筋肉組織試料または皮膚組織試料である。一部の事例では、本方法は、インタクトな組織試料の脱水を含む。一部の事例では、本方法は、インタクトな組織試料の脱水を含まない。一部の事例では、本方法は、試料中の標的分子の存在に関連する状態または疾患を診断するステップを含む。一部の事例では、状態または疾患は、腎臓疾患、感染性疾患、代謝性疾患、前がん性状態、がん性状態または脳障害である。一部の事例では、試料は、パラフィン包埋組織試料である。一部の事例では、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料である。
一部の事例では、本方法は、二本鎖核酸標識を第３の核酸と接触させるステップをさらに含み、第３の核酸は、第１の核酸の配列、第２の核酸の配列またはその両方に相補的な配列を含む。一例では、第３の核酸は、第１の核酸の配列に相補的な配列を含む。一例では、第３の核酸は、第２の核酸の配列に相補的な配列を含む。一例では、第３の核酸は、第１の核酸の配列および第２の核酸の配列に相補的な配列を含む。一部の事例では、第３の核酸は、第１の核酸の配列、第２の核酸の配列またはその両方に結合する。一例では、第３の核酸は、第１の核酸の配列に結合する。一例では、第３の核酸は、第２の核酸の配列に結合する。一例では、第３の核酸は、第１の核酸の配列および第２の核酸の配列に結合する。
一部の事例では、二本鎖核酸標識における第１の核酸および第２の核酸はそれぞれ、少なくとも１個の不対合ヌクレオチドを有する。一部の事例では、二本鎖核酸標識における第１の核酸および第２の核酸はそれぞれ、少なくとも１個の不対合ヌクレオチド、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００または少なくとも２５０個の不対合ヌクレオチドを有する。一部の事例では、第３の核酸は、第１の核酸の不対合配列、第２の核酸の不対合配列またはその両方に相補的な配列を含む。一部の事例では、第３の核酸は、第１の核酸の不対合配列全体に相補的な配列を含む。一部の事例では、第３の核酸は、第２の核酸の不対合配列全体に相補的な配列を含む。一部の事例では、第３の核酸は、第１の核酸の不対合配列全体に相補的な第１の配列、および第２の核酸の不対合配列全体に相補的な第２の配列を含む。
一部の事例では、第３の核酸は、第１の核酸の配列および第２の核酸の配列に結合し、これにより、多方向分枝を作り出す。一部の事例では、多方向分枝は、ｎ方向分枝であり、ｎ方向分枝は、一緒に連結されて核酸構造を形成する、ｎ個の一本鎖核酸を含む。核酸構造は、ｎ個の末端および／またはｎ個のオーバーハングを有することができる。例えば、多方向分枝は、３方向分枝であり得、３方向分枝は、一緒に連結されて３個の末端および／または３個のオーバーハングを有する核酸構造を形成する、３個の一本鎖核酸を含む（例えば、図１７Ａ〜図１７Ｃおよび図１６Ｃを参照）。一部の事例では、３方向分枝は、少なくとも２個のオーバーハングを含む。一部の事例では、前記少なくとも２個のオーバーハングのうち少なくとも２個は、同じ配列または特有の配列を含む。一部の事例では、前記少なくとも２個のオーバーハングのうち少なくとも２個は、相補的配列を含む。
一部の事例では、本方法は、第３の核酸を第４の核酸と接触させるステップをさらに含み、第４の核酸は、第１の核酸の配列、第２の核酸の配列、第３の核酸の配列、またはこれらのいずれかの組み合わせに相補的な配列を含む。一部の事例では、第４の核酸は、第３の核酸の配列および第１または第２の核酸の配列に結合し、これにより、４方向分枝を作り出す（例えば、図１６Ｃを参照）。一部の事例では、４方向分枝は、一緒に連結されて４個の末端および／または４個のオーバーハングを有する核酸構造を形成する、４個の一本鎖核酸を含む。一部の事例では、４方向分枝は、少なくとも３個のオーバーハングを含む。一部の事例では、少なくとも３個のオーバーハングのうち少なくとも２個は、同じ配列または特有の配列を含む。一部の事例では、少なくとも３個のオーバーハングのうち少なくとも２個は、相補的配列を含む。
一部の事例では、本方法は、オーバーハングのうち少なくとも１個を検出標識と接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、本方法は、第３の核酸を検出標識と接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、本方法は、第４の核酸を検出標識と接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、検出標識は、多方向分枝を含む。一部の事例では、多方向分枝は、３方向分枝または４方向分枝である。一部の事例では、検出標識は、オーバーハングのうち少なくとも１個に相補的なオーバーハングを含む。一部の事例では、検出標識は、直接的ハイブリダイゼーション、酵素的ライゲーションまたは化学的ライゲーションによって、オーバーハングのうち少なくとも１個に連結される。
別の態様では、試料中の標的分子を検出分子およびアンチセンスオリゴマーと接触させるステップを含む方法であって、検出分子が、標的分子に結合する少なくとも１個のリガンドを含み、少なくとも１個のリガンドが、一本鎖核酸に連結されており、一本鎖核酸が、アンチセンスオリゴマーとハイブリダイズされて、オーバーハングを有する二本鎖核酸標識を形成する、方法が本明細書に開示されている。一部の事例では、検出分子またはアンチセンスは、少なくとも３個のヌクレオチド、例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０または少なくとも５００個のヌクレオチドを含む。一部の事例では、検出分子またはアンチセンスは、５００個以下のヌクレオチド、例えば、５個以下、１０個以下、１５個以下、２０個以下、２５個以下、３０個以下、３５個以下、４０個以下、４５個以下、５０個以下、６０個以下、７０個以下、８０個以下、９０個以下、１００個以下、１５０個以下、２００個以下、２５０個以下、３００個以下、３５０個以下、４００個以下、４５０個以下または５００個以下のヌクレオチドを含む。一部の事例では、検出分子またはアンチセンスは、約３〜５００個のヌクレオチド、例えば、約３〜５００、約３〜４００、約３〜３００、約３〜２００、約３〜１００、約３〜５０、約３〜２０、約３〜１０、約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約１０〜５０、約１０〜２０、約２０〜５００、約２０〜４００、約２０〜３００、約２０〜２００、約２０〜１００、約２０〜５０、約５０〜５００、約５０〜４００、約５０〜３００、約５０〜２００、約５０〜１００、約１００〜５００、約１００〜４００、約１００〜３００、約１００〜２００、約２００〜５００、約２００〜４００、約２００〜３００、約３００〜５００、約３００〜４００または約４００〜５００個のヌクレオチドを含む。例えば、検出分子またはアンチセンスは、約３〜１５０個のヌクレオチドを含むことができる。
一部の事例では、リガンドは、抗体である。一部の事例では、標的分子は、タンパク質である。一部の事例では、オーバーハングは、１個のヌクレオチドを含む。一部の事例では、オーバーハングは、複数のヌクレオチドを含む。一部の事例では、本方法は、二本鎖核酸標識をＤＮＡリガーゼと接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、本方法は、二本鎖核酸標識を少なくとも１個の検出標識と接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的なオーバーハングを有する二本鎖核酸である。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、複数の検出標識である。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的な一本鎖核酸である。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、複数の検出標識を含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個の検出標識を含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、切断可能なリンカーを含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、切断可能なリンカーを含まない。
一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、検出タグを含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、複数の検出タグを含む。一部の事例では、検出タグは、量子ドットを含む。一部の事例では、検出タグは、フルオロフォアを含む。一部の事例では、フルオロフォアは、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセインまたはシアニンを含む。一部の事例では、本方法は、検出タグを検出し、これにより、試料中の標的分子の存在を検出するステップを含む。一部の事例では、本方法は、試料を複数の検出分子と接触させるステップを含む。一部の事例では、複数の検出分子のそれぞれは、異なる標的分子に結合する。
一部の事例では、検出標識は、少なくとも３個のヌクレオチド、例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０または少なくとも５００個のヌクレオチドを含む。一部の事例では、検出標識は、５００個以下のヌクレオチド、例えば、５個以下、１０個以下、１５個以下、２０個以下、２５個以下、３０個以下、３５個以下、４０個以下、４５個以下、５０個以下、６０個以下、７０個以下、８０個以下、９０個以下、１００個以下、１５０個以下、２００個以下、２５０個以下、３００個以下、３５０個以下、４００個以下、４５０個以下または５００個以下のヌクレオチドを含む。一部の事例では、検出標識は、約３〜５００個のヌクレオチド、例えば、約３〜５００、約３〜４００、約３〜３００、約３〜２００、約３〜１００、約３〜５０、約３〜２０、約３〜１０、約１０〜５００、約１０〜４００、約１０〜３００、約１０〜２００、約１０〜１００、約１０〜５０、約１０〜２０、約２０〜５００、約２０〜４００、約２０〜３００、約２０〜２００、約２０〜１００、約２０〜５０、約５０〜５００、約５０〜４００、約５０〜３００、約５０〜２００、約５０〜１００、約１００〜５００、約１００〜４００、約１００〜３００、約１００〜２００、約２００〜５００、約２００〜４００、約２００〜３００、約３００〜５００、約３００〜４００または約４００〜５００個のヌクレオチドを含む。例えば、検出標識は、約３〜１５０個のヌクレオチドを含むことができる。
一部の事例では、試料は、インタクトな組織試料である。一部の事例では、本方法は、インタクトな組織試料が、２０〜１０００ｎｍの間の厚さの切片にスライスされ得るように、樹脂にインタクトな組織試料を包埋するステップを含む。一部の事例では、インタクトな組織試料は、骨髄組織試料、胃腸管組織試料、肺組織試料、肝臓組織試料、前立腺組織試料、神経系組織試料、泌尿生殖器系組織試料、脳組織試料、乳房組織試料、筋肉組織試料または皮膚組織試料である。一部の事例では、本方法は、インタクトな組織試料の脱水を含む。一部の事例では、本方法は、インタクトな組織試料の脱水を含まない。一部の事例では、本方法は、試料中の標的分子の存在に関連する状態または疾患を診断するステップを含む。一部の事例では、状態または疾患は、腎臓疾患、感染性疾患、代謝性疾患、前がん性状態、がん性状態または脳障害である。
一部の事例では、標的分子は、遺伝子編集アッセイにおける構成成分を含む。一部の事例では、遺伝子編集アッセイは、ＣＲＩＳＰＲアッセイである。一部の事例では、遺伝子編集アッセイは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓアッセイである。一部の事例では、遺伝子編集アッセイは、ＮｇＡｇｏアッセイである。一部の事例では、構成成分は、Ｃａｓヌクレアーゼ、標的ＤＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ドナー修復鋳型またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の事例では、構成成分は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。一部の事例では、構成成分は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含む。一部の事例では、標的分子は、細胞分子を含む。一部の事例では、標的分子は、細胞表面分子を含む。一部の事例では、標的分子は、炭水化物、脂質、タンパク質または核酸を含む。一部の事例では、標的分子は、タンパク質を含む。一部の事例では、タンパク質は、細胞骨格タンパク質、細胞外マトリクスタンパク質、血漿タンパク質、凝固因子、急性期タンパク質、血液タンパク質、細胞接着、膜貫通輸送タンパク質、イオンチャネル、シンポート（ｓｙｎｐｏｒｔ）／アンチポートタンパク質、ホルモン、増殖因子、受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、免疫系タンパク質、栄養素貯蔵もしくは輸送タンパク質、シャペロンタンパク質、酵素、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の事例では、標的分子は、核酸を含む。一部の事例では、核酸は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、非コードＲＮＡ分子、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。
一部の事例では、本方法は、二本鎖核酸標識を検出標識と接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、検出標識は、多方向分枝を含む。一部の事例では、多方向分枝は、３方向分枝または４方向分枝である。一部の事例では、検出標識は、二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的なオーバーハングを含む。一部の事例では、検出標識は、直接的ハイブリダイゼーション、酵素的ライゲーションまたは化学的ライゲーションによって、二本鎖核酸標識のオーバーハングに連結される。
一部の事例では、本方法は、検出標識を第２の検出標識と接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、第２の検出標識は、多方向分枝を含む。一部の事例では、多方向分枝は、３方向分枝または４方向分枝である。一部の事例では、第２の検出標識は、検出標識のオーバーハングに相補的なオーバーハングを含む。
別の態様では、検出カプレットを含む組成物であって、検出カプレットが、第１の核酸および第２の核酸を含み、各核酸が、標的認識領域および自己ハイブリダイゼーション領域を有し、第１の核酸の標的認識領域が、標的分子の第１の領域に結合し、第２の核酸の標的認識領域が、標的分子の第２の領域に結合し、第１の核酸の自己ハイブリダイゼーション領域および第２の核酸の自己ハイブリダイゼーション領域がハイブリダイズされて、二本鎖核酸標識を形成する、組成物が本明細書に開示されている。一部の事例では、二本鎖核酸標識は、少なくとも２個の連続した塩基対、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５個の連続した塩基対を有する。一部の事例では、二本鎖核酸標識は、オーバーハングを有する。一部の事例では、オーバーハングは、１個のヌクレオチドを含む。一部の事例では、オーバーハングは、複数のヌクレオチドを含む。一部の事例では、オーバーハングは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個のヌクレオチドを含む。一部の事例では、オーバーハングは、少なくとも１個の不対合ヌクレオチド、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５個の不対合ヌクレオチドを有する。一部の事例では、標的分子は、ｍＲＮＡ分子である。一部の事例では、第１の核酸および第２の核酸は、一本鎖ＤＮＡである。一部の事例では、第１の核酸および第２の核酸のそれぞれは、遊離アミン（−ＮＨ２）修飾を有する。一部の事例では、本組成物は、ＤＮＡリガーゼをさらに含む。一部の事例では、本組成物は、少なくとも１個の検出標識をさらに含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的なオーバーハングを有する二本鎖核酸である。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的な一本鎖核酸である。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、複数の検出標識を含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個の検出標識を含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、切断可能なリンカーを含まない。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、切断可能なリンカーを含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、検出タグを含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、複数の検出タグを含む。一部の事例では、検出タグは、量子ドットを含む。一部の事例では、検出タグは、フルオロフォアを含む。一部の事例では、フルオロフォアは、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセインまたはシアニンを含む。一部の事例では、本組成物は、複数の検出カプレットを含む。一部の事例では、複数の検出カプレットのそれぞれは、異なる標的分子に結合する。
別の態様では、本組成物は、第３の核酸をさらに含み、第３の核酸は、第１の核酸の配列、第２の核酸の配列またはその両方に相補的な配列を含む。一部の事例では、第３の核酸は、第１の核酸の配列に相補的な配列を含む。一部の事例では、第３の核酸は、第２の核酸の配列に相補的な配列を含む。一部の事例では、第３の核酸は、第１の核酸の配列および第２の核酸の配列に相補的な配列を含む。一部の事例では、第３の核酸は、第１の核酸の配列および第２の核酸の配列に結合し、これにより、多方向分枝を作り出す。一部の事例では、多方向分枝は、３方向分枝である。一部の事例では、３方向分枝は、少なくとも２個のオーバーハングを含む。
一部の事例では、本組成物は、第４の核酸をさらに含み、第４の核酸は、第１の核酸の配列、第２の核酸の配列、第３の核酸の配列、またはこれらのいずれかの組み合わせに相補的な配列を含む。一部の事例では、第４の核酸は、第３の核酸の配列および第１または第２の核酸の配列に結合し、これにより、４方向分枝を作り出す。一部の事例では、４方向分枝は、少なくとも３個のオーバーハングを含む。一部の事例では、オーバーハングのうち少なくとも２個は、同じ配列または特有の配列を含む。一部の事例では、前記オーバーハングのうち少なくとも２個は、相補的配列を含む。
一部の事例では、本組成物は、検出標識をさらに含む。一部の事例では、検出標識は、多方向分枝を含む。一部の事例では、多方向分枝は、３方向分枝または４方向分枝である。一部の事例では、検出標識は、オーバーハングのうち少なくとも１個に相補的なオーバーハングを含む。
別の態様では、検出分子およびアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、検出分子が、標的分子に結合する少なくとも１個のリガンドを含み、少なくとも１個のリガンドが、一本鎖核酸に連結されており、一本鎖核酸がアンチセンスオリゴマーにハイブリダイズされて、オーバーハングを有する二本鎖核酸標識を形成する、組成物が本明細書に開示されている。一部の事例では、リガンドは、抗体である。一部の事例では、標的分子は、タンパク質である。一部の事例では、オーバーハングは、１個のヌクレオチドを含む。一部の事例では、オーバーハングは、複数のヌクレオチドを含む。一部の事例では、オーバーハングは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個のヌクレオチドを含む。一部の事例では、本組成物は、ＤＮＡリガーゼをさらに含む。一部の事例では、本組成物は、少なくとも１個の検出標識をさらに含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的なオーバーハングを有する二本鎖核酸である。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的な一本鎖核酸である。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個の検出標識を含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、切断可能なリンカーを含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、切断可能なリンカーを含まない。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、検出タグを含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、複数の検出タグを含む。一部の事例では、検出タグは、量子ドットを含む。一部の事例では、検出タグは、フルオロフォアを含む。一部の事例では、フルオロフォアは、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセインまたはシアニンを含む。一部の事例では、本組成物は、複数の検出分子を含む。一部の事例では、複数の検出分子のそれぞれは、異なる標的分子に結合する。
一部の事例では、標的分子は、遺伝子編集アッセイにおける構成成分を含む。一部の事例では、遺伝子編集アッセイは、ＣＲＩＳＰＲアッセイである。一部の事例では、遺伝子編集アッセイは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓアッセイである。一部の事例では、遺伝子編集アッセイは、ＮｇＡｇｏアッセイである。一部の事例では、構成成分は、Ｃａｓヌクレアーゼ、標的ＤＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ドナー修復鋳型またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の事例では、構成成分は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。一部の事例では、構成成分は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含む。一部の事例では、標的分子は、細胞分子を含む。一部の事例では、標的分子は、細胞表面分子を含む。一部の事例では、標的分子は、炭水化物、脂質、タンパク質または核酸を含む。一部の事例では、標的分子は、タンパク質を含む。一部の事例では、タンパク質は、細胞骨格タンパク質、細胞外マトリクスタンパク質、血漿タンパク質、凝固因子、急性期タンパク質、血液タンパク質、細胞接着、膜貫通輸送タンパク質、イオンチャネル、シンポート／アンチポートタンパク質、ホルモン、増殖因子、受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、免疫系タンパク質、栄養素貯蔵もしくは輸送タンパク質、シャペロンタンパク質、酵素、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の事例では、標的分子は、核酸を含む。一部の事例では、核酸は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、非コードＲＮＡ分子、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。
一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的なオーバーハングを含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、多方向分枝を含む。一部の事例では、多方向分枝は、３方向分枝または４方向分枝である。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、直接的ハイブリダイゼーション、酵素的ライゲーションまたは化学的ライゲーションによって、二本鎖核酸標識のオーバーハングに連結される。
一部の事例では、本組成物は、第２の検出標識をさらに含む。一部の事例では、第２の検出標識は、前記少なくとも１個の検出標識の前記オーバーハングに相補的なオーバーハングを含む。一部の事例では、第２の検出標識は、多方向分枝を含む。一部の事例では、多方向分枝は、３方向分枝または４方向分枝である。
別の態様では、上述の方法において使用することができるキットであって、第１の核酸および第２の核酸を含む検出カプレットであって、各核酸が、標的認識領域および自己ハイブリダイゼーション領域を有し、第１の核酸の標的認識領域が、標的分子の第１の領域に結合し、第２の核酸の標的認識領域が、標的分子の第２の領域に結合し、第１の核酸の自己ハイブリダイゼーション領域および第２の核酸の自己ハイブリダイゼーション領域がハイブリダイズされて、二本鎖核酸標識を形成する、検出カプレットと、検出カプレットを標的分子と接触させる際に使用するための第１の試薬とを含む、キットが本明細書に開示されている。一部の事例では、二本鎖核酸標識は、オーバーハングを有する。一部の事例では、本キットは、上述の１種または複数の組成物を含む。
別の態様では、上述の方法において使用することができるキットであって、検出分子およびアンチセンスオリゴマーであって、検出分子が、標的分子に結合する少なくとも１個のリガンドを含み、少なくとも１個のリガンドが、一本鎖核酸に連結されており、一本鎖核酸がアンチセンスオリゴマーにハイブリダイズされて、オーバーハングを有する二本鎖核酸標識を形成する、検出分子およびアンチセンスオリゴマーと、検出カプレットを標的分子と接触させる際に使用するための第１の試薬とを含む、キットが本明細書に開示されている。
一部の事例では、本キットは、標的分子の検出において使用するための第２の試薬をさらに含む。
一部の事例では、標的分子は、遺伝子編集アッセイにおける構成成分を含む。一部の事例では、遺伝子編集アッセイは、ＣＲＩＳＰＲアッセイである。一部の事例では、遺伝子編集アッセイは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓアッセイである。一部の事例では、遺伝子編集アッセイは、ＮｇＡｇｏアッセイである。一部の事例では、構成成分は、Ｃａｓヌクレアーゼ、標的ＤＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ドナー修復鋳型またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の事例では、構成成分は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。一部の事例では、構成成分は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含む。一部の事例では、標的分子は、細胞分子を含む。一部の事例では、標的分子は、細胞表面分子を含む。一部の事例では、標的分子は、炭水化物、脂質、タンパク質または核酸を含む。一部の事例では、標的分子は、タンパク質を含む。一部の事例では、タンパク質は、細胞骨格タンパク質、細胞外マトリクスタンパク質、血漿タンパク質、凝固因子、急性期タンパク質、血液タンパク質、細胞接着、膜貫通輸送タンパク質、イオンチャネル、シンポート／アンチポートタンパク質、ホルモン、増殖因子、受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、免疫系タンパク質、栄養素貯蔵もしくは輸送タンパク質、シャペロンタンパク質、酵素、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の事例では、標的分子は、核酸を含む。一部の事例では、核酸は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、非コードＲＮＡ分子、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。
一部の事例では、本キットは、本明細書に開示されている組成物のいずれかを含む。
本開示の追加的な態様および利点は、当業者であれば、本開示の単なる説明的な実施形態が示され記載されている、次の詳細な説明から容易に明らかになるであろう。理解できるであろうが、本開示は、他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、様々な明らかな観点から修正が可能であり、これらは全て、本開示から逸脱するものではない。したがって、図面および記載は、本質的に制限的ではなく説明的として考慮されるべきである。
参照による組み込み
本明細書で言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれていると特にかつ個々に示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれている。
本発明の新規特色は、添付の特許請求の範囲に特に明記されている。本発明の特色および利点をより良く理解するには、本発明の原理が利用されている説明的な実施形態を明記する次の詳細な説明、および下に示す添付の図面または図（本明細書において同様に、「ＦＩＧ．」および「ＦＩＧＳ．」）を参照することが求められるであろう。
図１は、本明細書に記載されている組成物、キット、方法およびシステムを使用する例示的なプロセスを例証する。
図２Ａは、組織試料中の標的分子を検出するための例示的なライゲーションオリゴマー化方法を例証する。
図２Ｂは、組織試料中の標的分子を検出するための例示的な鋳型によるオリゴマー化方法を例証する。
図３は、単一グアニン（Ｇ）オーバーハングを有する二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）標識に連結された抗体を例証する。
図４Ａは、第１の核酸および第２の核酸を含む検出カプレットを例証し、各核酸は、認識領域（例えば、ＲＮＡ認識領域）、自己ハイブリダイゼーション領域および固定可能な末端を有することができる。図４Ｂは、第１の核酸および第２の核酸の自己ハイブリダイゼーション領域がハイブリダイズされて、オーバーハングを有する二本鎖核酸標識を形成することができることを例証する。
図５は、検出分子の二本鎖核酸標識が、ライゲーション反応により、同じ配列を有する４個の二本鎖検出標識により増幅され得ることを例証する。
図６は、本開示の方法を実行する例としての制御システムを模式的に例証する。
図７Ａ〜図７Ｊは、１０枚の（７０ｎｍ）切片からのＤＮＡタグ付けされたアセチル化チューブリンの最大投射（ｍａｘ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）を例証する。図７Ａは、ライゲーションオリゴマー化により可視化されたＤＮＡ標識された一次を例証する。図７Ｂは、同じ組織切片における伝統的な蛍光二次によって可視化された同じＤＮＡ−一次を例証する。図７Ｃは、図４Ａおよび図４Ｂと同じ組織における蛍光標識されたアンチセンスオリゴマーにより可視化されたＤＮＡ標識された一次を例証する。図７Ｄ〜図７Ｆは、図７Ａ〜図７Ｃの接写図を例証する（黄色のボックスによって強調されている）。図７Ｄは、図７Ｅには存在しない、核のオフターゲットライゲーション可視化へのポイントを例証する（白色の矢じり）。図７Ｆは、オフターゲットシグナルを同様に被ったアンチセンス検出を例証するが、核の標識はより少ない。図７Ｇ〜図７Ｉは、異なる組織において、ＤＮＡ標識されたシナプシン抗体が、ホスファターゼおよび超音波処理ＤＮＡによるブロッキング後に可視化され得ることを例証する。図７Ｇは、二次検出図７Ｈ（白色の矢じり）と同等のオフターゲット標識（白色の矢じり）をもたらす、核標識の有意な減少を例証する。図７Ｉは、超音波処理ＤＮＡによるブロッキングが、アンチセンス検出ノイズも改善したことを例証する。図７Ｊは、対数目盛りで、各方法の重ね合わせた強度ヒストグラムを例証する。
図８は、皮質における２７枚の切片の投射を含有するパネルを例証する。
図９は、９種の抗体を使用した、同じ構造（皮質シナプス）の同時標的化を例証する。
図１０Ａ〜図１０Ｄは、タグ配列決定を使用した、マルチプレックス化抗原の迅速検出の例を例証する。図１０Ａは、オリゴマーモジュールの逐次検出と、それに続く制限エンドヌクレアーゼ切断による蛍光標識されたオリゴマーの除去のサイクル１を例証する。図１０Ｂは、オリゴマーモジュールの逐次検出と、それに続く制限エンドヌクレアーゼ切断による蛍光標識されたオリゴマーの除去のサイクル２を例証する。図１０Ｃは、オリゴマーモジュールの逐次検出と、それに続く制限エンドヌクレアーゼ切断による蛍光標識されたオリゴマーの除去のサイクル３を例証する。図１０Ｄは、イメージングサイクルにわたって生成された色の組み合わせを使用して、抗原毎の最終画像を再構築することができることを例証する。 図１０Ａ〜図１０Ｄは、タグ配列決定を使用した、マルチプレックス化抗原の迅速検出の例を例証する。図１０Ａは、オリゴマーモジュールの逐次検出と、それに続く制限エンドヌクレアーゼ切断による蛍光標識されたオリゴマーの除去のサイクル１を例証する。図１０Ｂは、オリゴマーモジュールの逐次検出と、それに続く制限エンドヌクレアーゼ切断による蛍光標識されたオリゴマーの除去のサイクル２を例証する。図１０Ｃは、オリゴマーモジュールの逐次検出と、それに続く制限エンドヌクレアーゼ切断による蛍光標識されたオリゴマーの除去のサイクル３を例証する。図１０Ｄは、イメージングサイクルにわたって生成された色の組み合わせを使用して、抗原毎の最終画像を再構築することができることを例証する。
図１１Ａは、ＧＦＰ標識ニューロンを囲むシナプシン標識を例証する。図１１Ｂは、蛍光ＤＮＡオリゴマーを使用した、シナプシンのパス１検出を例証する。図１１Ｃは、蛍光ＤＮＡオリゴマーを使用した、シナプシンのパス２検出を例証する。図１１Ｄは、二次抗体を使用した、シナプシンのパス３検出を例証する。図１１Ｅは、全３パスの合成図を例証する。
図１２Ａは、１０ｕｍパラフィン切片（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織）において得られる、ＤＮＡコンジュゲート抗ａｃチューブリン抗体を使用して可視化されたアセチル化チューブリンを例証する。図１２Ｂは、エンドヌクレアーゼ溶液において３０分後の同じ切片が、アセチル化チューブリンシグナルを除去したことを例証する。図１２Ｃは、二次抗体を使用して再染色された同じ組織を例証する。図１２Ｄは、図１２Ａおよび図１２Ｃの黄色のボックスにおけるアセチル化チューブリン構造の接写図を例証する。図１２Ｅは、グリオーマを有する皮質組織におけるアセチル化チューブリン染色を例証する。
図１３Ａ〜図１３Ｂは、２種のライゲーション関連方法を比較する。図１３Ａは、ライゲーションオリゴマー化方法による蛍光増幅を例証する。フルオロフォアを有する低分子ＤＮＡ二重鎖が、粘着末端の特異的認識により、伸びている鎖へと逐次ライゲーションされ、蛍光シグナルの増幅をもたらす。図１３Ｂは、鋳型オリゴマー化による蛍光増幅を例証する。蛍光増幅は、フルオロフォアを有する一本鎖低分子ＤＮＡの逐次ハイブリダイゼーションおよびライゲーションにより起こり、蛍光シグナルの増幅をもたらす。
図１４Ａ〜図１４Ｆは、アーカイブイメージングのためのＤＮＡ−抗体アーカイブ免疫組織化学を例証する。図１４Ａは、抗原におけるＤＮＡコンジュゲートされた一次を例証する。図１４Ｂは、コンジュゲートのアンチセンス検出を例証する。図１４Ｃは、鋳型によるライゲーション検出および組織のイメージングを例証する。図１４Ｄは、エンドヌクレアーゼを使用した全検出ＤＮＡの除去を例証する。図１４Ｅ〜図１４Ｆは、組織が、二本鎖（図１４Ｅ）または一本鎖形態（図１４Ｆ）のいずれかで脱水および貯蔵され得ることを例証する。図１４Ｅは、組織が、二本鎖または一本鎖形態のいずれかで脱水および貯蔵され得ることを例証する。アンチセンスは、変性または酵素消化により除去され得る。図１４Ｆは、アンチセンスの除去の際に、ＤＮＡコンジュゲート一次で染色された組織が、本来の抗体染色状態に戻り、よって、新鮮な蛍光検出の準備ができていることを例証する。
図１５Ａ〜図１５Ｆは、シグナル増幅および検出の例を例証する。図１５Ａは、タグ付けされた標的が、タグにおける相補的領域に塩基対合する単一プローブによって認識され得ることを示す。図１５Ｂは、長いプローブが、ｎ個の検出標識（例えば、検出器（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）…ｎ個の検出器）をドッキングすることができることを示す。図１５Ｃは、長い一次検出器標識（例えば、一次検出器）が、短いプローブにハイブリダイズされ得ることを示す。図１５Ｄは、一本鎖オリゴの付加の代わりに、単独にまたは多重に標識された二重鎖検出器を使用することができることを示す。図１５Ｅは、直鎖状二重鎖検出器の代わりに、ｎ−分枝状検出器を使用して、伸長された標識構造を構築することができることを示す。図１５Ｆは、ｎ−分枝状構造の伸長において、直鎖状および分枝状検出器を混合することができることを示す。
図１６Ａ〜図１６Ｅは、直鎖状および分枝状二重鎖ライゲーションオリゴマー化の例を例証する。図１６Ａは、特有の相補的末端［αおよびα’］および［βおよびβ’］を有する標識された二重鎖核酸単位を示す。図１６Ｂは、交互のα／βおよびα’／β’標識された二重鎖単位を使用した直鎖状増幅を示す。図１６Ｃは、例示的な３方向および４方向分枝構造を示す。図１６Ｄは、３方向分枝のサイクリングによって生成される構造を示す。図１６Ｅは、４方向分枝のサイクリングによって生成される構造を示す。
図１７Ａ〜図１７Ｃは、ｉｎ ｓｉｔｕ核酸検出における分枝状増幅の例を例証する。図１７Ａは、２個の隣接する核酸プローブが、ステムヘアピン構造を生成することができ、そこに、二次プローブがハイブリダイズすることを示す。図１７Ｂは、２個の核酸近接プローブが、３方向分枝状構造を生成することができることを示す。図１７Ｃは、プローブのハイブリダイゼーションが、分枝状増幅において直接的に使用され得る３方向分枝構造を生成することを示す。
図１８Ａ〜図１８Ｉは、分枝状オリゴマー化が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織におけるシグナルを大幅に増幅することを例証する。図１８Ａは、ａｌｅｘａ−５９４標識された二次抗体を用いた画像を示す。図１８Ｂは、２サイクルによる分枝状「Ｔ」およびａｌｅｘａ−５９４標識された直鎖状検出器を用いた画像を示す。図１８Ｃは、４サイクルによる分枝状「Ｔ」およびａｌｅｘａ−５９４標識された直鎖状検出器を用いた画像を示す。図１８Ｄは、６サイクルによる分枝状「Ｔ」およびａｌｅｘａ−５９４標識された直鎖状検出器を用いた画像を示す。図１８Ｅは、８サイクルによる分枝状「Ｔ」およびａｌｅｘａ−５９４標識された直鎖状検出器を用いた画像を示す。図１８Ｆは、１０サイクルによる分枝状「Ｔ」およびａｌｅｘａ−５９４標識された直鎖状検出器を用いた画像を示す。図１８Ｇは、細胞体マスクのオーバーレイによる６サイクル増幅の例を示す。図１８Ｈは、図１８Ｇにおいて使用された細胞体マスクを示す。図１８Ｉは、二次抗体（菱形）および２〜１０サイクルの分枝状オリゴマー化（丸）の細胞体マスク内のピクセルの平均ピクセル強度を示す。
図１９Ａ〜図１９Ｆは、ＤＮＡタグ付けされた抗アセチル化チューブリン一次抗体で標識され、６３×／１．４ＮＡにおいて油浸下で撮像されたマウス脳皮質の７０ｎｍ厚切片の例示的な画像を例証する。図１９Ａは、ａｌｅｘａ−５９４標識された二次抗体を用いた画像を示す。図１９Ｂは、２サイクルによる分枝状「Ｔ」およびａｌｅｘａ−５９４標識された直鎖状検出器を用いた画像を示す。図１９Ｃは、４サイクルによる分枝状「Ｔ」およびａｌｅｘａ−５９４標識された直鎖状検出器を用いた画像を示す。図１９Ｄは、６サイクルによる分枝状「Ｔ」およびａｌｅｘａ−５９４標識された直鎖状検出器を用いた画像を示す。図１９Ｅは、８サイクルによる分枝状「Ｔ」およびａｌｅｘａ−５９４標識された直鎖状検出器を用いた画像を示す。図１９Ｆは、二次抗体（菱形）および２〜８サイクルの分枝状オリゴマー化（丸）の平均画像強度（１６ビット画像からの灰色の値）を示す。
別段の定めがない限り、本明細書で使用されているあらゆる技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。本明細書に記載されているものと同様または均等ないかなる方法および材料が、本明細書における製剤または単位用量の実施または検査において使用されてもよいが、一部の方法および材料をここに記載する。他に言及がなければ、本明細書で用いられているまたは考慮されている技法は、標準的な方法論である。材料、方法および実施例は、単に説明的であり、限定的ではない。
１種または複数の発明に関する実施形態の詳細が、本明細書における添付の図面、特許請求の範囲および明細書に明記されている。本明細書に開示および考慮されている発明に関する実施形態の他の特色、目的および利点は、それが明確に除外されていない限り、他のいずれかの実施形態と組み合わせることができる。
本明細書において、別段の指示がない限り、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」その他等の用語は、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味する。
本明細書において、別段の指示がない限り、いずれかの実施形態を、他のいずれかの実施形態と組み合わせることができる。
本明細書において、別段の指示がない限り、本明細書における一部の発明に関する実施形態は、数的範囲を考慮する。範囲が存在する場合、範囲は、範囲の終点を含む。その上範囲内の全ての部分範囲および値が、あたかも明確に書き出されたかのように存在する。
参照数値に関連した用語「約」は、ある値から当該値プラスまたはマイナス１０％の範囲を含むことができる。例えば、「約１０」の量は、９、１０および１１の参照数を含む、９〜１１の量を含む。参照数値に関連した用語「約」は、ある値から当該値プラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の範囲を含むこともできる。
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、複数の参照を含むように本明細書で使用されている。
選択肢（例えば、「または（ｏｒ）」）の使用は、選択肢のいずれか一方、両方、またはこれらのいずれかの組み合わせを意味するものと理解されたい。
用語「核酸」は、本明細書において、いずれかの長さのポリマー形態のヌクレオチドを一般に指す。核酸は、プリンおよびピリミジン塩基、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然のまたは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むことができる。核酸は、一本または二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドの骨格は、ＲＮＡもしくはＤＮＡに典型的に見出すことができる、糖およびリン酸基、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ等、修飾されたヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断され得る。よって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチドという用語は、本明細書に記載されているもの等、アナログを一般に含む。このようなアナログは、核酸またはオリゴヌクレオチド配列に取り込まれると、溶液中の天然に存在する核酸配列とのハイブリダイゼーションが可能になるような、天然に存在するヌクレオシドまたはヌクレオチドと共通したいくつかの構造的特色を有する分子である。典型的には、このようなアナログは、塩基、リボースまたはホスホジエステル部分を置き換えるおよび／または修飾することにより、天然に存在するヌクレオシドおよびヌクレオチドから得られる。変化を調整して、望み通りに、ハイブリッド形成を安定化もしくは不安定化する、または相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションの特異性を増強することができる。核酸分子は、ＤＮＡ分子であり得る。核酸分子は、ＲＮＡ分子であり得る。核酸分子は、合成分子であり得る。核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子と対合する合成分子であり得る。
本明細書において、用語「ＩＨＣ」または「免疫組織化学」は、組織切片の細胞における抗原（例えば、タンパク質または核酸）を選択的にイメージングするプロセスを指す。この方法は、生体組織における特異的抗原に結合する抗体を用いることができる。検出シグナル（例えば、蛍光）は、本明細書に提供されているライゲーション増幅方法によって増幅することができる。一部の実施形態では、検出シグナルは、ライゲーションオリゴマー化により増幅される。一部の実施形態では、検出シグナルは、鋳型によるオリゴマー化により増幅される。
本発明の実施は、分子生物学の分野における慣例的な技法を利用する。本発明における使用の一般方法を開示している基礎の教科書は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０年）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年）を含む。
概要
試料中の標的分子を検出するための組成物、キット、方法およびシステムが本明細書に開示されている。図１は、本明細書に記載されている組成物、キット、方法およびシステムを使用する例示的なプロセスを例証する。先ず、検出分子を使用して、試料（例えば、組織全体試料）を接触させることができる。検出分子の存在は、イメージング装置（ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）（例えば、顕微鏡）によって検出することができる。次に、コンピュータシステムを使用して、１種もしくは複数の組織型、試料中の１種もしくは複数の標的分子、および／または１種もしくは複数の状態を同定することができる。結果は、疾患または状態の同定または診断のために医者または医師へと通信することができる。
一部の実施形態では、本明細書に提供されているライゲーション増幅方法は、試料中の標的分子を、オーバーハングを有する検出分子（例えば、検出カプレット）と接触させるステップと、検出分子を、相補的オーバーハングを有する１個または複数の二本鎖核酸と接触させるステップと、ＤＮＡリガーゼを使用して、１個または複数の二本鎖核酸を検出分子にライゲーションするステップと（例えば、検出シグナルを増幅するために）を含むことができる。本方法は、本明細書において、ライゲーションオリゴマー化と称することもできる。
別の実施形態では、本明細書に提供されているライゲーション増幅方法は、試料中の標的分子を、オーバーハングを有する検出分子（例えば、検出カプレット）と接触させるステップと、検出分子を、検出分子のオーバーハング配列に相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）な１個または複数の一本鎖核酸と接触させるステップと、ＤＮＡリガーゼを使用して、１個または複数の一本鎖核酸を検出分子にライゲーションするステップと（例えば、検出シグナルを増幅するために）を含むことができる。本方法は、本明細書において、鋳型によるオリゴマー化と称することもできる。用語「鋳型によるオリゴマー化」および「制御されたオリゴマー化」は、検出カプレットオーバーハングに相補的な少なくとも１個の一本鎖検出標識を接触させるステップを含む、ライゲーション増幅の方法を指すよう、本明細書で互換的に使用することができる。組織試料２０１における標的分子を検出するためのライゲーションオリゴマー化または鋳型によるオリゴマー化を含む例示的な方法が、図２Ａ、図２Ｂおよび図１３に例証されている。図２Ａは、組織試料２０１における標的分子を検出するための例示的なライゲーションオリゴマー化方法を例証する。一部の事例では、標的分子は、ｍＲＮＡ分子２０２であり得る。本方法は、標的分子を検出カプレットと接触させるステップを含むことができ、検出カプレットは、第１の核酸２０３および第２の核酸２０４を含む。第１の核酸２０３および第２の核酸２０４はそれぞれ、標的認識領域２０５Ａ＆２０５Ｂおよび自己ハイブリダイゼーション領域２０６Ａ＆２０６Ｂを有することができる。第１の核酸の標的認識領域２０５Ａは、標的分子の第１の領域に結合することができ、第２の核酸の標的認識領域２０５Ｂは、標的分子の第２の領域に結合することができる。第１の核酸の自己ハイブリダイゼーション領域２０６Ａおよび第２の核酸の自己ハイブリダイゼーション領域２０６Ｂは、ハイブリダイズされて、二本鎖核酸標識２０６Ａ＆２０６Ｂを形成することができる。二本鎖核酸標識２０６Ａ＆２０６Ｂは、少なくとも３個の連続した塩基対を有することができる。二本鎖核酸標識２０６Ａ＆２０６Ｂは、オーバーハング２０７を有することができる。本方法は、二本鎖核酸標識２０６Ａ＆２０６Ｂを検出標識２０８と接触させるステップをさらに含むことができ、検出標識２０８は、二本鎖核酸標識２０６のオーバーハング２０７に相補的なオーバーハング２０９を有する二本鎖核酸である。検出標識２０８は、検出タグ（例えば、フルオロフォア）を含むことができる。本方法は、検出標識をＤＮＡリガーゼ２１０と接触させるステップをさらに含むことができ、ＤＮＡリガーゼ２１０は、検出標識２０８および二本鎖核酸標識２０６Ａ＆２０６Ｂをライゲーションすることができる。
本明細書に提供されているライゲーションオリゴマー化方法は、ＤＮＡリガーゼ２１０をさらに含むことができ、ライゲーションプロセスを複数回反復して、複数の二本鎖検出標識２０８を二本鎖核酸標識２０６Ａ＆２０６Ｂに付加し、イメージング適用のための検出シグナルを増幅する。
図２Ｂは、組織試料２０１における標的分子を検出するための例示的な鋳型によるオリゴマー化方法を例証する。例えば、本明細書に提供されている鋳型によるオリゴマー化方法は、検出カプレットをさらに含むことができ、検出カプレットは、第１の核酸２０３および第２の核酸２０４を含む。第１の核酸２０３および第２の核酸２０４はそれぞれ、標的認識領域２０５Ａ＆２０５Ｂおよび自己ハイブリダイゼーション領域２０６Ａ＆２０５Ｂを有することができる。鋳型によるオリゴマー化の一部の実施形態では、本方法は、二本鎖核酸標識２０６Ａ＆２０６Ｂを検出標識２０８と接触させるステップをさらに含むことができ、検出標識２０８は、二本鎖核酸標識２０６のオーバーハング２０７に相補的なオーバーハング２０９を有する二本鎖核酸である。検出標識２０８は、検出タグ（例えば、フルオロフォア）を含むことができる。本方法は、検出標識をＤＮＡリガーゼ２１０と接触させるステップをさらに含むことができ、ＤＮＡリガーゼ２１０は、検出標識２０８および二本鎖核酸標識２０６Ａ＆２０６Ｂをライゲーションすることができる。本方法は、鎖２１３にオーバーハング２１１を合成するステップをさらに含むことができる。鋳型によるオリゴマー化の別の実施形態では、検出カプレットは、複数のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドを含むオーバーハング２１１をさらに含むことができ、オーバーハングは、複数の一本鎖核酸検出標識２１２に相補的である。検出標識２１２は、検出タグ（例えば、フルオロフォア）を含むことができる。鋳型によるオリゴマー化方法は、複数の検出標識２１２をＤＮＡリガーゼ２１０と接触させるステップをさらに含むことができ、ＤＮＡリガーゼ２１０は、複数の検出標識２１２およびオーバーハング２１１をライゲーションすることができる。一部の実施形態では、少なくとも２個の検出標識の配列は、同一である、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または少なくとも１５または少なくとも１６または少なくとも１７または少なくとも１８または少なくとも１９または少なくとも２０個の検出標識は、同一である。一部の実施形態では、少なくとも第１の検出標識の配列は、少なくとも第２の検出標識の配列と異なる。一部の実施形態では、複数の検出標識は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の検出標識２１２を含むことができ、第１の検出標識の配列は、オーバーハング２１１の少なくとも第１の２個の連続したヌクレオチドに相補的であり、第２の検出標識の配列は、オーバーハング２１１の少なくとも第２の２個の連続したヌクレオチドに相補的であり、第３の検出標識の配列は、オーバーハング２１１の少なくとも第３の２個の連続したヌクレオチドに相補的である、等々。本明細書に提供されている方法は、イメージング適用のための検出シグナルを増幅することができる。
一部の実施形態では、蛍光検出シグナルは、図１３Ａに示す通り、ライゲーションオリゴマー化により増幅される。一部の実施形態では、蛍光検出シグナルは、図１３Ｂに示す通り、フルオロフォアを有する一本鎖低分子ＤＮＡの逐次ハイブリダイゼーションおよびライゲーションにより蛍光増幅が起こる、鋳型オリゴマー化により増幅される。
本明細書に開示されている方法は、試料または検出分子を少なくとも１個の検出標識（例えば、二本鎖ＤＮＡ）と接触させるステップを含むことができ、少なくとも１個の検出標識は、二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的なオーバーハングを有する。本明細書に開示されている方法は、試料または検出分子を少なくとも１個の検出標識（例えば、一本鎖ＤＮＡ）と接触させるステップを含むことができ、少なくとも１個の検出標識は、検出カプレットの第１または第２の鎖のいずれかのオーバーハングに相補的である。少なくとも１個の検出標識は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ等、核酸分子であり得る。例えば、二本鎖核酸標識が、５’−ＴＡＧ−３’のオーバーハング配列を有する場合、検出標識は、３’−ＡＴＣ−５’の相補的オーバーハング配列を有することができる。例えば、一本鎖核酸標識の配列が、５’−ＧＧＴＡ−３’である場合、オーバーハング配列は、３’−ＣＣＡＴ−５’を含む。検出標識のオーバーハング配列は、特定の二本鎖核酸標識のオーバーハングに特有に相補的であり得る。検出標識のオーバーハング配列は、複数の二本鎖核酸標識、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９〜２０個の間の二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的であり得る。同様に、二本鎖核酸標識のオーバーハング配列は、特定の検出標識のオーバーハングに特有に相補的であり得る。二本鎖核酸標識のオーバーハング配列は、複数の検出標識、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９〜２０個の間の検出標識のオーバーハングに相補的であり得る。
本明細書に開示されている方法は、試料または検出分子を少なくとも１個のＤＮＡリガーゼと接触させるステップを含むことができる。ＤＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成の触媒により、ＤＮＡ鎖を一緒に接合することを容易にすることができる。例えば、ＤＮＡリガーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたは哺乳動物ＤＮＡリガーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶを含むことができる。
例えば、ＤＮＡリガーゼを使用して、二本鎖核酸標識は、第１の検出標識にライゲーションされて、増幅された二本鎖核酸標識を形成することができる。増幅された二本鎖核酸標識は、第２の検出標識にライゲーションされて、別の増幅された二本鎖核酸標識を形成することができる。このプロセスを複数回反復して、複数の検出標識を含む増幅された二本鎖核酸標識を形成することができる。一部の事例では、第１の検出標識は、第２の検出標識と同じ配列を有することができる。図５に示す通り、検出分子５２０の二本鎖核酸標識５１０は、ライゲーション反応により、同じ配列を有する４個の二本鎖検出標識５３０により増幅することができる。一部の事例では、第１の検出標識は、第２の検出標識とは異なる配列を有することができる。一部の事例では、検出分子５２０は、図２Ｂに例証される通り、鋳型によるオリゴマー化ライゲーション反応により、同じ配列を有する４個の一本鎖検出標識により増幅することができる。一部の事例では、検出分子５２０は、図２Ｂに例証される通り、鋳型によるオリゴマー化ライゲーション反応により、１個の二本鎖核酸分子５１０および同じ配列を有する３個の一本鎖検出標識により増幅することができる。
検出分子を使用した標的分子の検出
試料中の標的分子を検出するための組成物、キット、方法およびシステムが本明細書に開示されている。標的分子は、試料中の目的のいずれかの分子であり得る。標的分子は、炭水化物、脂質、タンパク質または核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。標的分子は、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡまたは非コードＲＮＡ分子であり得る。
本方法は、試料を、標的分子に結合する検出分子と接触させるステップを含むことができる。検出分子は、少なくとも１個のリガンド（例えば、抗体）、ビーズまたは核酸を含むことができる。リガンドは、一本鎖核酸に連結された抗体であり得る。一本鎖核酸は、一本鎖核酸に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴマーにハイブリダイズされて、二本鎖核酸標識を形成することができ、二本鎖核酸標識は、オーバーハングを有する。一本鎖核酸およびアンチセンスオリゴマーのハイブリダイゼーションは、標的分子へのリガンドの結合後に行うことができる。一本鎖核酸およびアンチセンスオリゴマーのハイブリダイゼーションは、標的分子へのリガンドの結合前に行うことができる。一部の事例では、リガンドは、二本鎖核酸標識に連結された抗体であり得、二本鎖核酸標識は、オーバーハングを有する。
オーバーハング
用語「オーバーハング」は、本明細書において、核酸（例えば、ＤＮＡ）分子の末端における不対合ヌクレオチドのストレッチを指す。このような不対合ヌクレオチドは、どちらの鎖にあってもよく、３’または５’オーバーハングのいずれかを作り出す。オーバーハングは、単一のヌクレオチドを含むことができる。例えば、図３において、検出分子は、単一グアニン（Ｇ）オーバーハング３２０を有する二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）標識に連結された抗体３１０である。別の例では、次の配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子は、単一ヌクレオチドオーバーハングを形成することができる：
５’−ＡＴＣＴＧＡＣＴＡ−３’
３’−ＴＡＧＡＣＴＧＡ−５’
オーバーハングは、単一のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドを含むことができる。一部の事例では、オーバーハングは、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９または少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むことができる。一部の事例では、オーバーハングは、約１〜約２０個のヌクレオチド、例えば、約１〜約２、約１〜約３、約１〜約４、約１〜約５、約１〜約１０、約１〜約１５、約１〜約２０、約２〜約３、約２〜約４、約２〜約５、約２〜約１０、約２〜約１５、約２〜約２０、約３〜約４、約３〜約５、約３〜約１０、約３〜約１５、約３〜約２０、約４〜約５、約４〜約１０、約４〜約１５、約４〜約２０、約５〜約１０、約５〜約１５、約５〜約２０、約１０〜約１５、約１０〜約２０または約１５〜約２０個のヌクレオチドを含むことができる。例えば、オーバーハング配列は、ＴＡＧ、ＣＡＴ、ＡＣＡ、ＣＡＴまたはＡＡＴであり得る。別の例では、次の配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子は、３ヌクレオチドオーバーハングを形成することができる：
５’−ＡＴＣＴＧＡＣＴＡＣＡ−３’
３’−ＴＡＧＡＣＴＧＡ−５’
検出カプレット
検出分子は、標的分子に結合する複数のヌクレオチドを含むことができる。例えば、検出分子は、第１の核酸および第２の核酸を含む検出カプレットであり得る。第１および第２の核酸は、一本鎖ＤＮＡであり得る。
第１および／または第２の核酸は、複数のヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５または少なくとも約１００個のヌクレオチドを含むことができる。第１および／または第２の核酸は、約５〜１５０個のヌクレオチドの長さ、例えば、約５〜１５０、約５〜１３０、約５〜１１０、約５〜９０、約５〜７０、約５〜５０、約５〜３０、約５〜１０、約１０〜１５０、約１０〜１３０、約１０〜１１０、約１０〜９０、約１０〜７０、約１０〜５０、約１０〜３０、約３０〜１５０、約３０〜１３０、約３０〜１１０、約３０〜９０、約３０〜７０、約３０〜５０、約５０〜１５０、約５０〜１３０、約５０〜１１０、約５０〜９０、約５０〜７０、約７０〜１５０、約７０〜１３０、約７０〜１１０、約７０〜９０、約９０〜１５０、約９０〜１３０、約９０〜１１０、約１１０〜１５０、約１１０〜１３０または約１３０〜１５０個のヌクレオチドを含むことができる。
認識領域
図４Ａの例において例証される通り、第１の核酸は、第１の標的分子（例えば、ｍＲＮＡ）に結合する第１の認識領域２０５Ａ（例えば、ＲＮＡ認識領域）を有する。同様に、第２の核酸は、第２の標的分子（例えば、ｍＲＮＡ）に結合する第２の認識領域２０５Ａ（例えば、ＲＮＡ認識領域）を有する。一部の事例では、第１および第２の標的分子は、同じ分子であり得る。一部の事例では、第１の標的分子および第２の標的分子は、異なる分子であり得る。第１および／または第２の核酸の認識領域は、認識領域の配列に相補的な標的分子の配列にハイブリダイズすることにより、標的分子に結合する。
認識領域は、単一のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドを含むことができる。一部の事例では、認識領域は、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９または少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むことができる。一部の事例では、認識領域は、約１〜約２０個のヌクレオチド、例えば、約１〜約２、約１〜約３、約１〜約４、約１〜約５、約１〜約１０、約１〜約１５、約１〜約２０、約２〜約３、約２〜約４、約２〜約５、約２〜約１０、約２〜約１５、約２〜約２０、約３〜約４、約３〜約５、約３〜約１０、約３〜約１５、約３〜約２０、約４〜約５、約４〜約１０、約４〜約１５、約４〜約２０、約５〜約１０、約５〜約１５、約５〜約２０、約１０〜約１５、約１０〜約２０または約１５〜約２０個のヌクレオチドを含むことができる。
第１の認識領域および第２の認識領域は、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９または少なくとも約２０ヌクレオチド離れている、標的分子の２個の配列を認識することができる。第１の認識領域および第２の認識領域は、約１〜約２０ヌクレオチド、例えば、約１〜約２、約１〜約３、約１〜約４、約１〜約５、約１〜約１０、約１〜約１５、約１〜約２０、約２〜約３、約２〜約４、約２〜約５、約２〜約１０、約２〜約１５、約２〜約２０、約３〜約４、約３〜約５、約３〜約１０、約３〜約１５、約３〜約２０、約４〜約５、約４〜約１０、約４〜約１５、約４〜約２０、約５〜約１０、約５〜約１５、約５〜約２０、約１０〜約１５、約１０〜約２０または約１５〜約２０ヌクレオチド離れている、標的分子の２個の配列を認識することができる。例えば、図４Ｂにおいて、第１の認識領域および第２の認識領域は、３ヌクレオチド（図４Ｂにおける「ＵＣＡ」および「ＣＣＵ」）離れている、標的ｍＲＮＡ分子の２個の配列を認識することができる。
自己ハイブリダイゼーション領域
第１の核酸は、第１の自己ハイブリダイゼーション領域２０６Ａを含むことができる（図４Ａ）。同様に、第２の核酸は、第２の自己ハイブリダイゼーション領域２０６Ｂを含むことができる。第１および第２の自己ハイブリダイゼーション領域の配列は、相補的であり得る。第１および第２の自己ハイブリダイゼーション領域は、センス−アンチセンスハイブリダイゼーションによりハイブリダイズして、二本鎖核酸標識を形成することができる。二本鎖核酸標識は、部分的に二本鎖かつ部分的に一本鎖であり得る。
自己ハイブリダイゼーション領域は、単一のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドを含むことができる。一部の事例では、自己ハイブリダイゼーション領域は、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９または少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むことができる。一部の事例では、自己ハイブリダイゼーション領域は、約１〜約２０個のヌクレオチド、例えば、約１〜約２、約１〜約３、約１〜約４、約１〜約５、約１〜約１０、約１〜約１５、約１〜約２０、約２〜約３、約２〜約４、約２〜約５、約２〜約１０、約２〜約１５、約２〜約２０、約３〜約４、約３〜約５、約３〜約１０、約３〜約１５、約３〜約２０、約４〜約５、約４〜約１０、約４〜約１５、約４〜約２０、約５〜約１０、約５〜約１５、約５〜約２０、約１０〜約１５、約１０〜約２０または約１５〜約２０個のヌクレオチドを含むことができる。
本明細書における方法は、第１の核酸および第２の核酸の自己ハイブリダイゼーション領域をハイブリダイズさせて、本明細書に記載されているオーバーハング２０７（例を図４Ａおよび図４Ｂに示す）を有する二本鎖核酸標識を形成するステップを含むことができる。
試料への検出分子の固定
検出カプレットは、試料（例えば、組織）への検出カプレットの固定に使用することができる３’および／または５’修飾を含むことができる。組織への検出カプレットの固定は、標的分子（例えば、ｍＲＮＡ）の検出性に負の影響を与えることなく、様々な処理を可能にすることができる。
第１および第２の核酸を含む検出カプレットは、遊離アミン（−ＮＨ２）修飾（図４Ａに示す）等、３’または５’修飾を有することができる。本明細書に開示されている方法は、ＮＨＳエステルクロスリンカー、イミドエステルクロスリンカーまたはジフルオロクロスリンカー等、アミン反応性クロスリンカーを接触させるステップを含むことができる。ＮＨＳエステルクロスリンカーは、グルタル酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）、スベリン酸ビス（スルホスクシニミジル）（ＢＳ３）、トリス−（スクシニミジル）アミノトリアセテート（ＴＳＡＴ）、ペグ化スベリン酸ビス（スルホスクシニミジル）（ＢＳ（ＰＥＧ）５、ＢＳ（ＰＥＧ）９）、ジチオビス（プロピオン酸スクシニミジル）（ＤＳＰ）、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スルホスクシニミジル）（ＤＴＳＳＰ）、酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）、ビス（２−（スクシニミドオキシカルボニルオキシ）エチル）スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、エチレングリコールビス（コハク酸スクシニミジル）（ＥＧＳ）またはスルホ−ＥＧＳであり得る。イミドエステルクロスリンカーは、アジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）、ピメルイミド酸ジメチル（ＤＭＰ）、スベルイミノ酸ジメチル（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ）（ＤＭＳ）またはＷａｎｇおよびＲｉｃｈａｒｄ試薬（ＤＴＢＰ）であり得る。ジフルオロクロスリンカーは、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）であり得る。
検出標識およびライゲーション増幅
本明細書に開示されている方法は、試料または検出分子を少なくとも１個の検出標識（例えば、二本鎖ＤＮＡ）と接触させるステップを含むことができ、少なくとも１個の検出標識は、二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的なオーバーハングを有する。少なくとも１個の検出標識は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ等、核酸分子であり得る。例えば、二本鎖核酸標識が、５’−ＴＡＧ−３’のオーバーハング配列を有する場合、検出標識は、３’−ＡＴＣ−５’の相補的オーバーハング配列を有することができる。検出標識のオーバーハング配列は、特定の二本鎖核酸標識のオーバーハングに特有に相補的であり得る。検出標識のオーバーハング配列は、複数の二本鎖核酸標識、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９〜２０個の間の二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的であり得る。同様に、二本鎖核酸標識のオーバーハング配列は、特定の検出標識のオーバーハングに特有に相補的であり得る。二本鎖核酸標識のオーバーハング配列は、複数の検出標識、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９〜２０個の間の検出標識のオーバーハングに相補的であり得る。検出標識は、１個または複数の検出タグを含むことができる。検出標識は、手動アセンブリおよび／または自己アセンブリに適応され得る少なくとも１個のオーバーハングを有することができる。一部の事例では、検出標識は、手動アセンブリに適応させることができ、より大型の複合体（例えば、シグナリング複合体）を構築するために、個々のユニットの系列適用を有することができる。一部の事例では、検出標識は、自己アセンブリに適応させることができ、より大型の複合体（例えば、シグナリング複合体）を構築するために、全構成成分の同時適用を有することができる。
本明細書に開示されている方法は、試料または検出分子を少なくとも１個のＤＮＡリガーゼと接触させるステップを含むことができる。ＤＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成の触媒により、ＤＮＡ鎖を一緒に接合することを容易にすることができる。例えば、ＤＮＡリガーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたは哺乳動物ＤＮＡリガーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶを含むことができる。
例えば、ＤＮＡリガーゼを使用して、二本鎖核酸標識は、第１の検出標識にライゲーションされて、増幅された二本鎖核酸標識を形成することができる。増幅された二本鎖核酸標識は、第２の検出標識にライゲーションされて、別の増幅された二本鎖核酸標識を形成することができる。このプロセスを複数回反復して、複数の検出標識を含む増幅された二本鎖核酸標識を形成することができる。一部の事例では、第１の検出標識は、第２の検出標識と同じ配列を有することができる。図５に示す通り、検出分子５２０の二本鎖核酸標識５１０は、ライゲーション反応により、同じ配列を有する４個の二本鎖検出標識５３０により増幅することができる。一部の事例では、第１の検出標識は、第２の検出標識とは異なる配列を有することができる。一部の事例では、検出分子５２０は、図２Ｂに例証される通り、鋳型によるオリゴマー化ライゲーション反応により、同じ配列を有する４個の一本鎖検出標識により増幅することができる。一部の事例では、検出分子５２０は、図２Ｂに例証される通り、鋳型によるオリゴマー化ライゲーション反応により、１個の二本鎖核酸分子５１０および同じ配列を有する３個の一本鎖検出標識により増幅することができる。
天然および合成核酸は、直接的ハイブリダイゼーション、酵素的ライゲーションまたは化学的ライゲーションによって接合することができる。一部の事例では、直接的ハイブリダイゼーションは、塩基対合のみによる核酸の接合を含む。直接的ハイブリダイゼーションは、非共有結合性であり得、接合された構造の安定性は、塩濃度および温度等の環境因子に対して感受性となり得る。酵素的ライゲーションは、核酸の直接的共有結合連結をもたらすことができるが、タンパク質リガーゼを要求する場合がある。化学的ライゲーションは、２個の核酸を共有結合により接合する簡便な方法をもたらすことができる。化学的ライゲーション形態は、次のものを含むことができる：アルデヒドを使用して３’および５’アミノ基により核酸を架橋して、鎖を直接的に接合すること；３’および５’スルフヒドリル基を酸化して、ジスルフィド連結された核酸鎖を生成すること；ならびに隣接する核酸鎖の３’および５’末端を共有結合により接合することができる、生体直交型（ｂｉｏ−ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）「クリック」ケミストリー、例えば、３’標識アジドおよび５’標識アルキンは、Ｃｕ（Ｉ）触媒環化付加により接合して、通常のリン酸結合の代わりにトリアゾール共有結合連結を形成することができる（Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒ， Ａ． Ｈ．およびＢｒｏｗｎ， Ｔ．、Ｃｌｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．、Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．４５巻、１２５８〜１２６７頁（２０１２年））。ライゲーションは、酵素的ライゲーション、化学的架橋、例えば、アルデヒドもしくはスルフヒドリル架橋、またはアルキン−アジド環化付加等の生体直交型「クリック」ケミストリーによってなすことができる。
分枝状オリゴマー化
より大型の複合体の生成に使用される検出標識は、直鎖状または分枝状のいずれかであり得る。直鎖状検出標識のみでできた構造は、直鎖状モジュールの数に対して線形にシグナルを増幅することができる。分枝状、または直鎖状および分枝状の組み合わせでできた構造では、検出標識は、分枝する検出標識の数に対して指数関数的に増幅され得るシグナルをもたらすことができる。分枝状オリゴマー化の構造および効果を実施例１１〜１４に示す。
一部の事例では、多方向分枝は、ｎ方向分枝であり、ｎ方向分枝は、一緒に連結されて核酸構造を形成する、ｎ個の一本鎖核酸を含む。核酸構造は、ｎ個の末端および／またはｎ個のオーバーハングを有することができる。例えば、多方向分枝は、３方向分枝であり得、３方向分枝は、一緒に連結されて３個の末端および／または３個のオーバーハングを有する核酸構造を形成する、３個の一本鎖核酸を含む（例えば、図１７Ａ〜図１７Ｃおよび図１６Ｃを参照）。別の例では、多方向分枝は、４方向分枝であり得る。４方向分枝は、一緒に連結されて４個の末端および／または４個のオーバーハングを有する核酸構造を形成する、４個の一本鎖核酸を含むことができる。
検出タグ
検出標識は、少なくとも１個の検出タグを含むことができる。一部の事例では、検出標識は、複数の検出タグを含むこともできる。一部の事例では、検出標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９〜２０個の間の検出タグを含むことができる。一部の事例では、複数の検出タグは、同じ種類の検出タグであり得る。一部の事例では、複数の検出タグは、２種類以上の検出タグを含むことができる。一部の事例では、複数の検出タグは、同じ色を有する２種類以上の検出タグを含むことができる。一部の事例では、複数の検出タグは、異なる色を有する２種類以上の検出タグを含むことができる。一部の事例では、複数の検出タグは、２色以上を含むことができる。
少なくとも１個の検出タグは、リンカー、例えば、切断可能または切断不能なリンカーによって検出標識に取り付けることができる。一部の事例では、複数の検出タグは、それぞれ互いに７〜１０個の間の塩基をおいて間隔をあけて、検出標識に取り付けられる。一部の事例では、複数の検出タグは、各タグが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４〜１５個の間の塩基をおいて間隔をあけるように、取り付けられる。一部の実例では、複数の検出タグは、２〜１０個の間の検出タグを含むことができる。一部の事例では、複数の検出タグは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９〜２０個の間の検出タグを含むことができる。
一部の事例では、検出タグは、量子ドット（ＱＤ）であり得る。一部の事例では、検出タグは、フルオロフォアであり得る。本明細書に記載されている方法およびシステムにおいて、当業者にとって公知のいかなるフルオロフォアおよび／またはＱＤを用いてもよい。一部の例示的な実例では、フルオロフォアは、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセインまたはシアニンを含むことができる。一部の事例では、検出タグの配置および数は、検出の空間的分解能を増強するように最適化することができる。
一部の事例では、検出タグは、ハプテンであり得る。ハプテンは、アニリン、アニリン誘導体（ｏ−、ｍ−またはｐ−アミノ安息香酸）、ウルシオール、ヒドララジン、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはジニトロフェノールを含むことができる。例えば、ハプテンは、ジゴキシゲニンであり得る。ハプテン（例えば、ジゴキシゲニン）は、吸収性または蛍光分子の生成を触媒することができる酵素標識された抗体（例えば、ＨＲＰ、ＡＰ）によって認識され得る。
核酸標識との検出タグのハイブリダイゼーションは、電場の印加を含むことができる。一部の事例では、電場は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０秒間印加することができる。一部の事例では、電場は、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５〜５分間の間印加することができる。一部の事例では、電場は、最大５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０分間印加することができる。一部の事例では、電場は、１〜６０分間の間印加することができる。
本明細書に開示されている方法は、試料および／または検出分子を、ホスファターゼおよび／または超音波処理されたサケ精子等の別の二本鎖ＤＮＡと接触させるステップを含むことができる。ホスファターゼおよび／または別の二本鎖ＤＮＡ（例えば、超音波処理されたサケ精子）を使用して、ＤＮＡ（クロマチン）およびＤＮＡ結合タンパク質の存在による、核および／またはサイトゾルにおける望まれないシグナルを低下させることができる。
本明細書に記載されている方法の実行に適したシステム、およびかかるシステムによる使用のためのキットも提供されている。
配列決定による検出
本明細書に記載されている方法は、各核酸標識の配列の決定を含む検出ステップを含むことができる。一般に、本明細書における核酸標識を配列決定するために、ｉｎ−ｓｉｔｕで行われ得るいずれかの配列決定方法を利用することができる。これらは、例えば、当業者にとって公知の他の方法の中でもとりわけ、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定を含む。本明細書に記載されている方法およびシステムによる使用のために、市販の核酸配列決定キットを最適化することができる。
一部の事例では、各核酸標識の配列は、合成による配列決定によって決定することができる。一部の実例では、各核酸標識の配列は、ハイブリダイゼーションによる配列決定によって決定することができる。ハイブリダイゼーションによる配列決定は、後述する実施例に記載されているタグハイブリダイゼーション方法の使用が関与し得る。
タグ配列決定は、直接的配列決定の変形であり、後述する実施例に記載されている４個の約１５ｍｅｒ単位からなる約６０塩基対（ｂｐ）であるタグを使用する。一部の事例では、各オリゴマーは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の核酸の長さである。一部の事例では、ハイブリダイゼーションによるタグ「配列決定」は、ＱＤ標識オリゴマーと共に使用される。ＱＤの使用は、適度に高速なＳＴＯＲＭ様イメージングを可能にする。さらに、量子ドットは、光活性化される必要がなく、光退色に対して抵抗性であり、励起のために単一色を要求する。一部の事例では、タグ配列決定は、切断可能な蛍光標識と共に使用される。
本明細書に記載されている方法の実行に適したシステム、およびかかるシステムによる使用のためのキットも提供されている。
アレイ断層撮影
インタクトな組織においてアレイ断層撮影（ＡＴ）を行って、組織における複数のタンパク質の空間的に分解された同定を容易にするための組成物、キット、方法およびシステムも、本明細書に開示されている。一部の事例では、本方法は、脳組織等、神経回路構造を撮像することができる。
現在実施されているＡＴプロセスの１バージョンが、化学的固定、脱水、および樹脂中の包埋を含む、電子顕微鏡に使用されているものと同様の組織処理を含むことを注記することができる。組織ブロックは、ダイアモンドナイフを使用して、ウルトラミクロトームにおいてカットされる。ブロック側面に塗布されたコンタクトセメントは、連続切片が一緒に密着して、長いリボンを形成することを確実にする。これらは、コーティングされたカバーガラス上に収集され、このコーティングは、包埋された組織切片に緊密に接着するように操作されており、切片を信頼のおけるオートフォーカスのために平らに保持し、複数の染色サイクルを通して維持する。アレイは、抗体、レクチンまたは他の試薬を使用して染色され、多くの場合回折限界で、自動蛍光顕微鏡によって検出される。抗体はストリッピングすることができ、染色およびイメージングを複数回反復して、所与の組織容積から高次元データセットを構築することができる。アレイは、重金属で染色して、電界放射走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって撮像することもできる。画像をステッチし、整列し、各光学（およびＳＥＭ）サイクルを、全チャネルを含む３Ｄ容積へと統合する。容積を解析して、例えば、様々なマーカーの間の空間的関係性を評価し、シナプス、細胞型および他の目的の特色の同定および特徴付けをもたらすことができる。
インタクトな組織
本明細書に記載されている方法およびシステムを使用して、インタクトな組織試料においてアレイ断層撮影を行うことができる。本明細書に記載されているインタクトな組織は、１つの次元において薄切され、他の２つの次元において近接している組織を含む。このような組織は、最小限の解離によって特徴付けされる。インタクトな組織試料は、薄切後に、試料が、組織全体で正常に見出される組織構造および他の細胞を保持する組織試料である。本明細書に記載されている方法およびシステムのためのインタクトな組織を固定する例示的な方法は、後述する実施例１に提示されている。その上、当業者にとって公知のインタクトな組織試料を単離および固定する方法を、本明細書に記載されている方法およびシステムのために用いることができる。本明細書に記載されている方法の一部では、インタクトな組織は、組織を２０〜１０００ｎｍの間の厚さの切片にスライスすることができるように、樹脂に包埋することができる。一部の事例では、試料は、パラフィン包埋組織試料である。一部の事例では、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料である。一部の方法では、切片の厚さは、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００ｎｍであり得る。一部の方法では、切片の厚さは、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ｎｍであり得る。一部の事例では、本方法は、インタクトな組織の脱水を含まなくてよい。一部の事例では、組織は、脱水および樹脂包埋されない。一部の事例では、切片収集器を利用して、ウルトラミクロトームにおいて産生されたリボンを自動的に収集し、これを、顕微鏡スライドからマイクロタイタープレートに及ぶサイズの、コーティングされた高精度カバーガラスの予め画定された領域に置く。本方法によって研究することができるインタクトな組織試料は、例えば、１種または複数の状態の検出のための生検された組織を含むことができる。
組織におけるオフターゲットバックグラウンドシグナルのブロッキングおよび洗浄
組織不均一性は、特異的な生物学的シグナルを不明瞭にする非特異的バックグラウンドシグナルの原因となり得る、複雑な化学的環境を呈し得る。望まれないオフターゲットシグナルを低下させるために、非標識一本または二本鎖核酸、アルカリホスファターゼ、ポリメラーゼ、リガーゼおよびヌクレアーゼ等の酵素、ＰＥＧ等の荷電ポリマー、ヘパリン等の荷電多糖、ならびにＢＳＡおよびカゼイン等のタンパク質の混合物を含むブロッキング溶液を使用することができる。ブロッキング溶液は、手順において組織の標識、染色、検出または洗浄に使用される溶液のいずれかに添加することができる。塩およびｐＨレベルを使用して、望まれないオフターゲットバックグラウンドを低下または除去することもできる。溶液における塩およびｐＨレベルを使用して、特異性および／またはシグナル強度を改善することができる。塩およびｐＨレベルを使用して、望まれないバックグラウンドを除去することもできる；例えば、タンパク質安定性の破壊のための過塩素酸塩、グアニジウム、尿素、またはホフマイスター順列で高いイオンの塩等、カオトロピック塩の使用。ホルムアミド、尿素またはホルムアルデヒド等、核酸ハイブリダイゼーションを不安定化し得る化学物質を、標識、染色、検出または洗浄において使用して、オフターゲットシグナルを防止または除去することもできる。
インタクトな組織のアレイ断層撮影
インタクトな組織試料を、特定のタンパク質に結合する少なくとも１個の抗体と接触させるステップであって、前記抗体が、核酸に連結されている、ステップと、前記核酸を検出し、これにより、組織試料中の前記タンパク質の存在を検出するステップとを含む方法が、本明細書に提供されている。ある態様では、本方法は、インタクトな組織を複数の抗体と接触させるステップを含むことができ、特異的タンパク質に結合する各抗体は、特有の核酸に連結されている。一部の事例では、複数の抗体における各抗体は、異なるタンパク質に結合することができる。抗体は、同じまたは異なるアイソタイプのものであり得、核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むことができる。一部の事例では、異なるタンパク質に結合する抗体は、同じまたは異なるアイソタイプのものであり得る。一部の方法では、少なくとも１個の抗体は、組織に架橋され得る。一部の事例では、本明細書に記載されている方法は、インタクトな組織を複数の抗体と接触させるステップを含むことができ、特異的タンパク質に結合する各抗体は、特有の核酸に連結されている。
試料中の標的分子を検出カプレットと接触させるステップを含む方法であって、検出カプレットが、第１の核酸および第２の核酸を含み、各核酸が、標的認識領域および自己ハイブリダイゼーション領域を有し、第１の核酸の標的認識領域が、標的分子の第１の領域に結合し、第２の核酸の標的認識領域が、標的分子の第２の領域に結合し、第１の核酸の自己ハイブリダイゼーション領域および第２の核酸の自己ハイブリダイゼーション領域がハイブリダイズされて、二本鎖核酸標識を形成する、方法も本明細書に提供されている。一部の事例では、二本鎖核酸標識は、オーバーハングを有する。一部の事例では、本方法は、二本鎖核酸標識をＤＮＡリガーゼと接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、本方法は、二本鎖核酸標識を少なくとも１個の検出標識と接触させるステップをさらに含む。一部の事例では、少なくとも１個の検出標識は、二本鎖核酸標識のオーバーハングに相補的なオーバーハングを有する二本鎖核酸である。一部の事例では、二本鎖核酸標識および少なくとも１個の検出標識は、ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションされる。
本明細書に記載されている方法の一部では、複数の抗体の検出は、空間的に分解され得る。本明細書に記載されている方法およびシステムの一部は、マイクロ流体チャンバの使用を含む。一部の方法は、完全に自動化され得る。
本明細書に記載されている一部の方法を使用して、組織試料のタンパク質組成を同定する、および／または上述の生理的状態もしくは疾患を診断することができる。一部の方法を使用して、特定のインタクトな組織の組織クラスを同定することができる。
本明細書に記載されている方法の一部では、抗体と組織との接触は、電場の印加を含むことができる。一部の事例では、電場は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０秒間印加することができる。一部の事例では、電場は、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５分間の間印加することができる。一部の事例では、電場は、最大５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０分間印加することができる。一部の事例では、電場は、１〜６０分間の間印加することができる。
本明細書に記載されている方法の実行に適したシステム、およびかかるシステムによる使用のためのキットも提供されている。
マルチプレックス検出アッセイ
本明細書に開示されている組成物、キット、方法およびシステムは、検出アッセイ（例えば、マルチプレックス検出アッセイ）において使用することもできる。一部の事例では、検出アッセイは、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、遺伝子発現またはＳＮＰ検出のための）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）（例えば、遺伝子発現のための）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、ハイスループット配列決定（例えば、数百万個の短いＤＮＡ配列を並行して産生する）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅または配列決定を要求する適用のための）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、ライゲーションによるＤＮＡ配列決定において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、蛍光マイクロビーズアレイにおいて使用することができる。
一部の事例では、検出アッセイは、タンパク質マイクロアレイ（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用または小分子結合を測定するための）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、抗体マイクロアレイ（例えば、抗体が配置されたタンパク質アレイの一種）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、ファージディスプレイ（例えば、相互作用するタンパク質または他の分子に関して大型のタンパク質ライブラリーをスクリーニングするための）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、抗体プロファイリング（例えば、臓器ドナー集団のパネルに対する複数ＨＬＡ抗体同定または反応性予測）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、Ｌｕｍｉｎｅｘ／ＸＭＡＰ原理に基づくマルチプレックス化において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、結合抗体マルチプレックスアッセイ（ＢＡＭＡ）（例えば、複数抗体アイソタイプおよび／またはサブクラスのプロファイリングのための）において使用することができる。
一部の事例では、検出アッセイは、組織マイクロアレイ（例えば、複数の組織試料を解析するための）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、細胞マイクロアレイ（例えば、材料のパネルに対する細胞応答を観察するための）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、化合物マイクロアレイ（例えば、比活性に関して複数の化合物をアッセイするための）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、ウエスタンブロットのマルチプレックス検出（例えば、ウエスタンブロットにおける２種またはそれよりも多い標的の同時検出のための）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、マルチプレックスバイオマーカー解析（例えば、尿を解析するための）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えば、マイクロタイタープレートを使用した並列化処理のための）において使用することができる。一部の事例では、検出アッセイは、フローサイトメトリーにおいて使用することができる。
一部の事例では、検出アッセイは、検出アッセイを使用して、試料中の複数の標的を同時に検出することができる。一部の事例では、検出アッセイは、試料中の少なくとも２種の標的、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０または少なくとも５００種の標的を同時に検出することができる。一部の事例では、検出アッセイは、試料中の２〜５００種の標的、例えば、２〜５、２〜１０、２〜１００、２〜５００、５〜１０、５〜１００、５〜５００、１０〜１００、１０〜５００または１００〜５０種の標的を同時に検出することができる。
一部の事例では、検出アッセイは、細胞を検出することができる。一部の事例では、細胞は、特定の型の細胞であり得る。一部の事例では、細胞は、特定の起源を有することができる（例えば、特定の臓器に由来）。一部の事例では、細胞は、特定の状態を有することができる（例えば、健康な細胞、がん細胞）。一部の事例では、検出アッセイは、試料中の複数の標的を検出することができる。一部の事例では、複数の標的は、複数の細胞である。一部の事例では、複数の細胞は、異なる型の細胞である。一部の事例では、複数の細胞は、異なる起源を有する（例えば、異なる臓器に由来）。一部の事例では、複数の細胞は、異なる状態を有する（例えば、健康な細胞、がん細胞）。
一部の事例では、検出アッセイは、標的分子を検出することができる。標的分子は、試料中のいずれかの目的の分子であり得る。標的分子は、炭水化物、脂質、タンパク質または核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。標的分子は、ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡまたは非コードＲＮＡ分子であり得る。
一部の事例では、標的分子は、細胞分子であり得る。一部の事例では、細胞分子は、外側の環境から全ての細胞の内部を隔てる細胞膜の内側の分子であり得る。一部の事例では、細胞分子は、炭水化物、脂質、タンパク質または核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。
一部の事例では、標的分子は、細胞表面分子であり得る。一部の事例では、細胞表面分子は、外側の環境から全ての細胞の内部を隔てる細胞膜における分子であり得る。一部の事例では、細胞表面分子は、炭水化物、脂質、タンパク質または核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。
一部の事例では、検出アッセイは、タンパク質を検出することができる。一部の事例では、検出アッセイは、複数のタンパク質を検出することができる。一部の事例では、タンパク質は、アクチン、Ａｒｐ２／３、フォルミン（Ｆｏｒｍｉｎ）、コロニン、ジストロフィン、ＦｔｓＺ、ケラチン、ミオシンおよびチューブリン等、細胞骨格タンパク質であり得る。一部の事例では、タンパク質は、コラーゲン、エラスチン、Ｆ−スポンジン（ｓｐｏｎｄｉｎ）、ピカチュリン（Ｐｉｋａｃｈｕｒｉｎ）およびフィブロネクチン等、細胞外マトリクスタンパク質であり得る。一部の事例では、タンパク質は、血清アミロイドＰ成分および血清アルブミン等、血漿タンパク質であり得る。一部の事例では、タンパク質は、補体タンパク質（例えば、Ｃ１−阻害剤、Ｃ３−コンバターゼ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤、トロンビンおよびフォンヴィルブランド因子等、凝固因子であり得る。一部の事例では、タンパク質は、急性期タンパク質（例えば、Ｃ反応性タンパク質）であり得る。一部の事例では、タンパク質は、ヘモグロビン（例えば、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン）等、血液タンパク質であり得る。一部の事例では、タンパク質は、カドヘリン、エペンジミン（Ｅｐｅｎｄｙｍｉｎ）、インテグリン、ＮＣＡＭおよびセレクチン等、細胞接着であり得る。一部の事例では、タンパク質は、ＣＦＴＲ、グリコホリンＤおよびスクランブラーゼ等、膜貫通輸送タンパク質であり得る。一部の事例では、タンパク質は、イオンチャネルであり得る。一部の事例では、タンパク質は、ニコチン性アセチルコリン受容体およびＧＡＢＡａ受容体等、リガンド開口型イオンチャネルであり得る。一部の事例では、タンパク質は、カリウムチャネル、カルシウムチャネルおよびナトリウムチャネル等、電位開口型イオンチャネルであり得る。一部の事例では、タンパク質は、グルコース輸送体等、シンポート／アンチポートタンパク質であり得る。一部の事例では、タンパク質は、ホルモンまたは増殖因子であり得る。一部の事例では、タンパク質は、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）等、増殖因子であり得る。一部の事例では、タンパク質は、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）およびオキシトシン等、ペプチドホルモンであり得る。一部の事例では、タンパク質は、受容体であり得る。一部の事例では、タンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体（例えば、ロドプシン）等、膜貫通受容体であり得る。一部の事例では、タンパク質は、エストロゲン受容体等、細胞内受容体であり得る。一部の事例では、タンパク質は、ヒストンおよびプロタミン等、ＤＮＡ結合タンパク質であり得る。一部の事例では、タンパク質は、Ｃ−ｍｙｃ、ＦＯＸＰ２、ＦＯＸＰ３、ＭｙｏＤおよびＰ５３等、転写調節タンパク質であり得る。一部の事例では、タンパク質は、ＳＲＲＴ等、ＲＮＡ結合タンパク質であり得る。一部の事例では、タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）、主要組織適合抗原およびＴ細胞受容体等、免疫系タンパク質であり得る。一部の事例では、タンパク質は、フェリチン等、栄養素貯蔵または輸送タンパク質であり得る。一部の事例では、タンパク質は、ＧｒｏＥＬ等、シャペロンタンパク質であり得る。一部の事例では、タンパク質は、酵素であり得る。
ゲノム編集適用
本明細書に開示されている組成物、キット、方法およびシステムは、ゲノム編集アッセイにおいて使用することもできる。ゲノム編集アッセイは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）アッセイであり得る。ゲノム編集アッセイは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）ヌクレアーゼアッセイであり得る。ゲノム編集アッセイは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）アッセイであり得る。ゲノム編集アッセイは、ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）アッセイであり得る。ゲノム編集アッセイは、メガヌクレアーゼアッセイであり得る。ゲノム編集アッセイは、ＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉアルゴノート）アッセイであり得る。
本明細書に開示されている組成物、キット、方法およびシステムは、ＣＲＩＳＰＲ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）アッセイにおける構成成分を検出することができる。一部の事例では、構成成分は、Ｃａｓヌクレアーゼまたはそのバリアントであり得る。Ｃａｓヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ配列の位置における一方または両方の鎖の切断を方向付けることができる。例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ配列の一本鎖を切断する、１個または複数の不活性化された触媒ドメインを有するニッカーゼであり得る。Ｃａｓヌクレアーゼの非限定的な例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｐｆ１、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、それらのバリアント、それらの変異体、およびそれらの誘導体が挙げられる。
一部の事例では、構成成分は、標的ＤＮＡであり得る。一部の事例では、構成成分は、Ｃａｓ９を標的ゲノムＤＮＡに標的化させるガイド配列を含有するＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、単一ガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）であり得る。一部の事例では、構成成分は、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）等、Ｃａｓ９と相互作用する足場配列であり得る。一部の事例では、構成成分は、ドナー修復鋳型であり得る。ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、発現カセットまたは発現ベクターにクローニングすることができる。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＰＣＲによって産生され、発現カセットに含有される。例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、ＰＣＲ増幅され、プロモーター配列、例えば、Ｕ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列に付属させることができる。他の実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター、例えば、Ｕ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、および転写制御エレメント、エンハンサー、Ｕ６終止配列、１個または複数の核局在化シグナル等を含有する発現ベクターにクローニングされる。一部の実施形態では、発現ベクターは、マルチシストロニック（ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）またはバイシストロニックであり、蛍光タンパク質、エピトープタグおよび／または抗生物質抵抗性マーカーをコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。バイシストロニック発現ベクターのある特定の実例では、例えば、蛍光タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列は、ウイルス２Ａペプチド等、自己切断ペプチドをコードする配列を使用して、例えば、抗生物質抵抗性マーカーをコードする第２のヌクレオチド配列に連結される。口蹄疫ウイルス２Ａ（Ｆ２Ａ）；ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａ（Ｅ２Ａ）；ブタテッショウウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）およびＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）を含む２Ａペプチドは、２個のタンパク質が、同じＲＮＡ転写物から同時に、ただし別々に発現され得るように、高い切断効率を有する。
本明細書に開示されている組成物、キット、方法およびシステムは、ＮｇＡｇｏアッセイにおける構成成分を検出することができる。一部の事例では、構成成分は、エンドヌクレアーゼであり得る。一部の事例では、構成成分は、アルゴノートエンドヌクレアーゼであり得る。一部の事例では、構成成分は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり得る。一部の事例では、構成成分は、ガイドｓｓＤＮＡであり得る。一部の事例では、構成成分は、５’リン酸化ｓｓＤＮＡ（ｇＤＮＡ）であり得る。一部の事例では、ｇＮＤＡは、約１０〜約１００ヌクレオチド、例えば、約１０〜約２０ヌクレオチド、約１０〜約４０ヌクレオチド、約１０〜約６０ヌクレオチド、約１０〜約８０ヌクレオチド、約１０〜約１００ヌクレオチド、約２０〜約４０ヌクレオチド、約２０〜約６０ヌクレオチド、約２０〜約８０ヌクレオチド、約２０〜約１００ヌクレオチド、約４０〜約６０ヌクレオチド、約４０〜約８０ヌクレオチド、約４０〜約１００ヌクレオチド、約６０〜約８０ヌクレオチド、約６０〜約１００ヌクレオチドまたは約８０〜約１００ヌクレオチドであり得る。一部の事例では、ｇＮＤＡは、約２０ヌクレオチドであり得る。一部の事例では、ｇＮＤＡは、約２４ヌクレオチドであり得る。一部の事例では、ｇＮＤＡは、約３０ヌクレオチドであり得る。
状態または疾患
生理的状態または疾患は、かかる状態または疾患に関連する標的分子（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ）の同定によって、本明細書に提供されている方法によって診断することができる。一部の事例では、標的分子は、インタクトな組織試料に見出され得る。状態または疾患は、例えば、半月体形成性糸球体腎炎（ｃｒｅｓｃｅｎｔｉｃ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）等の腎臓疾患、生検リンパ節組織の試験によって診断され得る感染性疾患、アミロイドーシスを含む代謝性疾患、および精巣生検から検出され得る繁殖可能性レベルを含むことができる。前がん性およびがん性状態は、本明細書に記載されている方法を生検インタクト腫瘍組織に適用することにより同定することができる。生検によって一般に試験される他の組織は、本明細書に記載されている方法およびシステムによって解析することができ、例えば、骨髄、胃腸管、肺、肝臓、前立腺、神経系、泌尿生殖器系、脳、乳房、筋肉および皮膚が挙げられる。
一部の事例では、状態または疾患は、脳障害、例えば、聴神経腫、後天性脳傷害、脳梁欠損症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、動脈瘤、失語症、動静脈奇形、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、自閉症、バッテン病、ベーチェット病、眼瞼痙攣、脳腫瘍および／またはがん、脳性ループス、脳性麻痺、痙性斜頸、シャルコー−マリー−トゥース障害、キアリ奇形、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、昏睡、振盪、クロイツフェルト−ヤコブ病、認知症（非アルツハイマー型）、ダウン症候群、自律神経障害、失読症、統合運動障害、ジストニア、脳炎、てんかん、本態性振戦、フリートライヒ運動失調症、ゴーシェ病、ギラン−バレー症候群、ハンチントン病、水頭症、頭蓋内圧亢進、白質ジストロフィー、閉じ込め症候群（ＬｉＳ）、メニエール病、髄膜炎、髄膜炎菌性疾患、片頭痛、僅かに意識がある状態、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、多系統萎縮症、筋ジストロフィー、重症筋無力症、ナルコレプシー、パーキンソン病、末梢性ニューロパチー、プラダー−ウィリー症候群、進行性核上性麻痺、不穏下肢症候群、レット症候群、シャイドレーガー症候群、睡眠障害、痙攣性発声障害、脳卒中、くも膜下出血、シデナム舞踏病、テイ−サックス病、トゥレット症候群、一過性脳虚血発作、横断脊髄炎、外傷性脳傷害、三叉神経痛、結節性硬化症、植物状態、ならびにフォンヒッペル−リンダウ症候群を含むこともできる。
一部の事例では、状態または疾患は、がんを含むこともできる。がんは、再発性および／または難治性がんであり得る。がんの例として、肉腫、癌腫、リンパ腫または白血病が挙げられるがこれらに限定されない。
一部の事例では、肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合もしくは支持組織のがんである。肉腫として、骨がん、線維肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、両側性前庭神経鞘腫、骨肉腫、軟部組織肉腫（例えば、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢肉腫（ｃｙｓｔｏｓａｒｃｏｍａ ｐｈｙｌｌｏｉｄｅｓ）、皮膚線維肉腫、類腱腫、類上皮肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管性肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫および滑膜肉腫）を挙げることができるがこれらに限定されない。
一部の事例では、癌腫は、身体の表面を覆い、ホルモンを産生し、腺を構成する細胞である上皮細胞で始まるがんである。癌腫として、乳がん、膵がん、肺がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、腎臓がん、膀胱がん、胃がん、前立腺がん、肝臓がん、卵巣がん、脳がん、膣がん、外陰部がん、子宮がん、口腔がん、陰茎がん、精巣がん、食道がん、皮膚がん、ファロピウス管のがん、頭頸部がん、消化管間質がん、腺癌、皮膚または眼内メラノーマ、肛門領域のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、尿道のがん、腎盂のがん、尿管のがん、子宮内膜のがん、子宮頸部のがん、脳下垂体のがん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹グリオーマ、および脊髄軸腫瘍（ｓｐｉｎａｌ ａｘｉｓ ｔｕｍｏｒ）を挙げることができるがこれらに限定されない。がんは、基底細胞癌、扁平上皮、メラノーマ、非メラノーマまたは光線性（日光）角化症等、皮膚がんであり得る。
がんは、肺がんであり得る。肺がんは、気管から分岐して肺に供給する気道（気管支）、または肺の小さな気嚢（肺胞）で始まることができる。肺がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌および中皮腫を含むことができる。ＮＳＣＬＣの例として、扁平上皮細胞癌、腺癌および大細胞癌を挙げることができる。中皮腫は、肺および胸腔（胸膜）の内層または腹部（腹膜）の内層のがん性腫瘍であり得る。中皮腫は、アスベスト曝露によるものであり得る。がんは、神経膠芽腫等、脳がんであり得る。
がんは、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍であり得る。ＣＮＳ腫瘍は、グリオーマまたは非グリオーマとして分類することができる。グリオーマは、悪性グリオーマ、高悪性度グリオーマ、びまん性内因性橋グリオーマであり得る。グリオーマの例として、星状細胞腫、乏突起神経膠腫（または乏突起神経膠腫および星状細胞腫エレメントの混合物）および上衣腫を挙げることができる。星状細胞腫として、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形神経膠芽腫、重細胞性星状細胞腫、多形性黄色星状膠細胞腫および上衣下巨細胞星状細胞腫を挙げることができるがこれらに限定されない。乏突起神経膠腫は、低悪性度乏突起神経膠腫（または乏突起星状細胞腫（ｏｌｉｇｏａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ））および退形成型乏突起膠腫を含むことができる。非グリオーマは、髄膜腫、下垂体腺腫、原発性ＣＮＳリンパ腫および髄芽腫を含むことができる。がんは、髄膜腫であり得る。
リンパ腫は、リンパ球のがんであり得、ＢまたはＴリンパ球のいずれかから発生し得る。２種の主要型のリンパ腫は、ホジキン病として以前に公知のホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫であり得る。ホジキンリンパ腫は、リード−シュテルンベルク細胞の存在を特徴とすることができる。非ホジキンリンパ腫は、ホジキンリンパ腫でないあらゆるリンパ腫であり得る。非ホジキンリンパ腫は、緩徐進行性リンパ腫および中悪性度リンパ腫（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ）であり得る。非ホジキンリンパ腫として、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ性組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小細胞リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性浸出性リンパ腫およびリンパ腫様肉芽腫症を挙げることができるがこれらに限定されない。
白血病は、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病または慢性骨髄球性白血病であり得る。追加的な種類の白血病は、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄単球性白血病および若年性骨髄単球性白血病を含むことができる。
疾患および／または状態として、粥状動脈硬化、炎症性疾患、自己免疫性疾患、リウマチ性心疾患を挙げることができるがこれらに限定されない。炎症性疾患の例として、尋常性ざ瘡、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、関節炎（変形性関節症、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎）、喘息、粥状動脈硬化、セリアック病、慢性前立腺炎、クローン病、大腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維筋痛症、糸球体腎炎、肝炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｕｓ）（ＳＬＥ）、腎炎、パーキンソン病、骨盤腹膜炎、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎および脈管炎が挙げられるがこれらに限定されない。
一部の事例では、状態または疾患は、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、抗シンテターゼ（ａｎｔｉｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）症候群、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性末梢性ニューロパチー、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ぶどう膜炎、バロー（Ｂａｌｏ）病／バロー同心円性硬化症、ベーチェット病、ベルジェ病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、慢性再発性多巣性骨髄炎、慢性閉塞性肺疾患、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素病、補体成分２欠乏、接触性皮膚炎、頭蓋動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚性白血球破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病１型、びまん性皮膚性全身性硬化症、ドレスラー症候群、薬物誘導性ループス、円板状エリテマトーデス、湿疹、子宮内膜症、腱付着部炎関連関節炎（ｅｎｔｈｅｓｉｔｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、胎児赤芽球症、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンス症候群、進行性骨化性線維形成異常、線維化肺胞炎（または特発性肺線維症）、胃炎、胃腸管類天疱瘡、巨細胞動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン−バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、別名、妊娠性類天疱瘡、化膿性汗腺炎、ヒューズ−ストービン（Ｈｕｇｈｅｓ−Ｓｔｏｖｉｎ）症候群、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄性疾患、特発性肺線維症、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、別名、若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート−イートン筋無力症症候群、白血球破砕性脈管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ルーゲーリック病（同様に筋萎縮性側索硬化症）、ルポイド肝炎、別名、自己免疫性肝炎、エリテマトーデス、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、混合型結合組織疾患、限局性強皮症、ムッハ−ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、視神経脊髄炎（同様にデビック病）、神経性筋強直症、眼性瘢痕性類天疱瘡（ｏｃｃｕｌａｒ ｃｉｃａｔｒｉｃｉａｌ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌に関連する小児自己免疫性精神神経系障害）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルク（Ｐａｒｒｙ Ｒｏｍｂｅｒｇ）症候群、パーソネージ−ターナー症候群、毛様体扁平部炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性ニューロパチー、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発軟骨炎、ライター症候群、不穏下肢症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュミット症候群、別の形態のＡＰＳ、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、血清病、シェーグレン症候群、脊椎関節症、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、スイート症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎（「巨細胞動脈炎」としても公知）、血小板減少症、トロサ−ハント症候群、横断脊髄炎、潰瘍性大腸炎、混合型結合組織疾患とは異なる未分化結合組織疾患、未分化脊椎関節症、蕁麻疹様脈管炎、脈管炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられるがこれらに限定されない、自己免疫性疾患であり得る。
本明細書に開示されている組成物、キット、方法およびシステムは、植え込み式機器に対する被験体の応答の検出、モニター、診断および／または予測に有用でもあり得る。例示的な医療機器として、ステント、置換用心臓弁、植え込み式小脳刺激装置、人工股関節置換用関節、乳房インプラントおよび膝インプラントを挙げることができるがこれらに限定されない。
本明細書に開示されている組成物、キット、方法およびシステムは、１種もしくは複数の病原体由来核酸分子、または１種もしくは複数の病原体によって引き起こされる１種もしくは複数の疾患もしくは状態の検出、モニター、定量化または評価に有用でもあり得る。例示的な病原体として、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、ＶｉｂｒｉｏまたはＹｅｒｓｉｎｉａを挙げることができるがこれらに限定されない。追加的な病原体として、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａを挙げることができるがこれらに限定されない。
１種または複数の病原体に起因する疾患または状態は、結核、肺炎、食物由来疾病、テタヌス、腸チフス、ジフテリア、梅毒、ハンセン病、細菌性膣炎、細菌性髄膜炎、細菌性肺炎、尿路感染、細菌性胃腸炎および細菌性皮膚感染を含むことができる。細菌性皮膚感染の例として、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓによって引き起こされ得る膿痂疹；リンパ性伝播による表皮深層の連鎖球菌の細菌性感染によって引き起こされ得る丹毒；および正常皮膚細菌叢または外因的細菌によって引き起こされ得る蜂巣炎を挙げることができるがこれらに限定されない。
病原体は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、ＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓおよびＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ等、真菌であり得る。真菌によって引き起こされる疾患または状態の例として、いんきんたむし（ｊｏｃｋ ｉｔｃｈ）、酵母感染、白癬および水虫を挙げることができるがこれらに限定されない。
病原体は、ウイルスであり得る。ウイルスの例として、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エプスタイン−バーウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎）、単純ヘルペスウイルス（１および２型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、呼吸器多核体ウイルス、風疹ウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスを挙げることができるがこれらに限定されない。ウイルスによって引き起こされる疾患または状態の例として、感冒、インフルエンザ、肝炎、ＡＩＤＳ、水痘、風疹、ムンプス、麻疹、疣贅および灰白髄炎を挙げることができるがこれらに限定されない。
病原体は、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ（例えば、Ａ．ａｓｔｒｏｎｙｘｉｓ、Ａ．ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ、Ａ．ｃｕｌｂｅｒｔｓｏｎｉ、Ａ．ｈａｔｃｈｅｔｔｉ、Ａ．ｐｏｌｙｐｈａｇａ、Ａ．ｒｈｙｓｏｄｅｓ、Ａ．ｈｅａｌｙｉ、Ａ．ｄｉｖｉｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｂｒａｃｈｉｏｌａ（例えば、Ｂ ｃｏｎｎｏｒｉ、Ｂ．ｖｅｓｉｃｕｌａｒｕｍ）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ（例えば、Ｃ．ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ）、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ（例えば、Ｅ．ｃｕｎｉｃｕｌｉ、Ｅ．ｈｅｌｌｅｍ、Ｅ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ（例えば、Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ（例えば、Ｅ．ｂｉｅｎｅｕｓｉ）、Ｇｉａｒｄｉａ（例えば、Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ）、Ｉｓｏｓｐｏｒａ（例えば、Ｉ．ｂｅｌｌｉ）、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｃｅｙｌｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ（例えば、Ｎ．ｆｏｗｌｅｒｉ）、Ｎｏｓｅｍａ（例えば、Ｎ．ａｌｇｅｒａｅ、Ｎ．ｏｃｕｌａｒｕｍ）、Ｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ、Ｔｒａｃｈｉｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ（例えば、Ｔ．ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈｔｈｅｒａ、Ｔ．ｈｏｍｉｎｉｓ）およびＶｉｔｔａｆｏｒｍａ（例えば、Ｖ．ｃｏｒｎｅａｅ）等、原生動物であり得る。
コンピュータ制御システム
本開示は、本開示の方法を実行するようにプログラムされたコンピュータ制御システムを提供する。図６は、本開示の方法に従って遺伝子型データを解析するようにプログラムされたまたは他の仕方で構成されたコンピュータシステム６０１を示す。コンピュータシステム６０１は、例えば、遺伝パターンスコアによる解析および／または関連パターンスコアによる解析等、本開示の遺伝子型解析の様々な態様を調節することができる。
コンピュータシステム６０１は、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサとなり得る、中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書において同様に「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」）６０５を含む。コンピュータシステム６０１は、メモリまたはメモリ場所６１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読出し専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置６１５（例えば、ハードディスク）、１個または複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース６２０（例えば、ネットワークアダプタ）、ならびにキャッシュ、他のメモリ、データ記憶および／または電子ディスプレイアダプタ等の周辺機器６２５も含む。メモリ６１０、記憶装置６１５、インターフェース６２０および周辺機器６２５は、マザーボード等、通信バス（実線）を介してＣＰＵ６０５と通信している。記憶装置６１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置（またはデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム６０１は、通信インターフェース６２０を活用してコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）６３０に操作可能にカップリングされ得る。ネットワーク６３０は、インターネット、インターネットおよび／またはエクストラネット、またはインターネットと通信したイントラネットおよび／またはエクストラネットであり得る。ネットワーク６３０は、一部の事例では、遠隔通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク６３０は、クラウドコンピュータ処理等、分散型コンピュータ処理を可能にし得る１個または複数のコンピュータサーバを含むことができる。ネットワーク６３０は、一部の事例では、コンピュータシステム６０１を活用して、コンピュータシステム６０１にカップリングされた機器がクライアントまたはサーバとして振る舞うことを可能にし得る、ピアツーピアネットワークを実行することができる。
ＣＰＵ６０５は、プログラムまたはソフトウェアにおいて具体化され得る、機械可読命令のシーケンスを実行することができる。命令は、メモリ６１０等、メモリ場所において記憶され得る。ＣＰＵ６０５によって行われる演算の例として、フェッチ、デコード、実行およびライトバックを挙げることができる。ＣＰＵ６０５は、遺伝子の特色に基づくランキング（ＦＲＯＧ）の方法、バリアント遺伝パターンランキング（ＶＩＰＲ）の方法、分離パターンを決定する方法、遺伝パターンを決定する方法、関連スコアを決定する方法、ならびに表現型、遺伝子型および本開示の方法に関連するいずれかのデータのランキングの方法を行うためにプログラムされたプロセッサであり得る。
記憶装置６１５は、ドライバ、ライブラリーおよび保存されたプログラム等、ファイルを記憶することができる。記憶装置６１５は、ユーザーによって作成されたプログラムおよび記録されたセッション、ならびにプログラムに関連するアウトプット（複数可）を記憶することができる。記憶装置６１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザー優先度およびユーザープログラムを記憶することができる。コンピュータシステム６０１は、一部の事例では、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム６０１と通信したリモートサーバに位置する等、コンピュータシステム６０１に対して外部である１個または複数の追加的なデータ記憶装置を含むことができる。
コンピュータシステム６０１は、ネットワーク６３０を介して１個または複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム６０１は、ユーザー（例えば、オペレータ）のリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例として、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートもしくはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応機器、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））またはパーソナルデジタルアシスタントが挙げられる。ユーザーは、ネットワーク６３０を経由してコンピュータシステム６０１にアクセスすることができる。
本明細書に記載されている方法は、例えば、メモリ６１０または電子記憶装置６１５等、コンピュータシステム４０１の電子記憶場所に記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードにより実行され得る。機械実行可能または機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供され得る。使用の際に、コードは、プロセッサ６０５によって実行され得る。一部の事例では、コードは、記憶装置６１５から回収され、プロセッサ６０５による迅速なアクセスのためにメモリ６１０に記憶され得る。一部の局面では、電子記憶装置６１５が除外されることがあり、機械実行可能命令は、メモリ６１０に記憶される。
コードは、コードの実行に適応されたプロセッサを有する機械による使用のために事前にコンパイルおよび構成され得る、またはランタイムにおいてコンパイルされ得る。コードは、コードが、事前にコンパイルされたまたはコンパイルとしての（ａｓ−ｃｏｍｐｉｌｅｄ）様式で実行することを可能にするように選択され得るプログラミング言語で供給され得る。
コンピュータシステム６０１等、本明細書に提供されているシステムおよび方法の態様は、プログラミングにおいて具体化され得る。技術の様々な態様は、典型的に、機械可読媒体の一型において送られるまたは具体化される、機械（またはプロセッサ）実行可能コードおよび／または関連データの形態の、「製品」または「製造品」と考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、読出し専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスク等、電子記憶装置に記憶され得る。「記憶」型の媒体は、ソフトウェアプログラミングのいずれかの時点で非一時的記憶をもたらし得る、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブその他等、コンピュータの有形メモリ、プロセッサその他またはそれらの関連モジュールのいずれかまたは全てを含むことができる。ソフトウェアの全体または一部は、時に、インターネットまたは様々な他の遠隔通信ネットワークを介して通信され得る。かかる通信は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサから別のコンピュータまたはプロセッサへの、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへの、ソフトウェアのローディングを可能にし得る。よって、ソフトウェアエレメントを有することができる別の型の媒体は、ローカル機器間の物理インターフェースを越えて、有線および光学的地上通信線ネットワークを介して、ならびに様々な空中を介したリンク（ａｉｒ−ｌｉｎｋ）にわたって使用される等、光波、電波および電磁波を含む。有線または無線リンク、光リンクその他等、かかる波を運ぶ物理的エレメントも、ソフトウェアを有する媒体として考慮され得る。本明細書において、非一時的有形「記憶」媒体に制限されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」等の用語は、実行のためのプロセッサへの命令の提供に関与するいかなる媒体も指す。
したがって、コンピュータ実行可能コード等、機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理的伝送媒体が挙げられるがこれらに限定されない、多くの形態をとることができる。不揮発性記憶媒体は、例えば、図面に示すデータベース等の実行に使用され得るもの等、いずれかのコンピュータ（複数可）その他における記憶機器のいずれか等、光または磁気ディスクを含む。揮発性記憶媒体は、かかるコンピュータプラットフォームのメインメモリ等、ダイナミックメモリを含む。有形伝送媒体は、コンピュータシステム内のバスを含むワイヤを含む、同軸ケーブル；銅線および光ファイバを含む。搬送波伝送媒体は、無線周波数（ＲＦ）および赤外（ＩＲ）データ通信の際に生成されるもの等、電気もしくは電磁シグナルまたは音波もしくは光波の形態をとることができる。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的形態は、例えば、次のものを含む：フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他のいずれかの磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤまたはＤＶＤ−ＲＯＭ、他のいずれかの光学媒体、パンチカード、紙テープ、孔のパターンを有する他のいずれかの物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、他のいずれかのメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を輸送する搬送波、かかる搬送波を輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／またはデータを読み取ることができる他のいずれかの媒体。コンピュータ可読媒体のこれらの形態の多くは、実行のためのプロセッサへの１種または複数の命令の１種または複数のシーケンスを運ぶことに関与し得る。
コンピュータシステム６０１は、例えば、遺伝解析、原因バリアント発見解析および診断を含むことができる、本開示の方法に従った遺伝子型解析のグラフィカルおよび／または数値形態で、ディスプレイ、グラフ、チャートおよび／またはリストを提供するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）を含む電子ディスプレイを含むことができるまたはそれと通信することができる。ＵＩの例は、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブに基づくユーザーインターフェースを限定することなく含む。
ランキングによって作成されたデータは、ディスプレイすることができる（例えば、コンピュータに）。データは、数値および／またはグラフィカル形態でディスプレイすることができる。例えば、データは、リストとして、統計量（例えば、ｐ値、標準偏差）として、チャート（例えば、円チャート）として、グラフ（例えば、折れ線グラフ、棒グラフ）として、ヒストグラムとして、マップとして、ヒートマップとして、タイムラインとして、ツリーチャートとして、フローチャートとして、統計地図として、バブルチャート、ポーラーエリア（ｐｏｌａｒ ａｒｅａ）図表として、図表として、ストリームグラフとして、ガント（Ｇａｎｔｔ）チャートとして、ノーラン（Ｎｏｌａｎ）チャートとして、スミス（ｓｍｉｔｈ）チャートとして、シェブロンプロットとして、プロットとして、ボックスプロットとして、ドットプロットとして、確率プロットとして、散布図プロットとして、およびバイプロットとして、またはこれらのいずれかの組み合わせとしてディスプレイすることができる。
被験体
多くの場合、本方法は、被験体、好ましくは、ヒトに対して使用される。被験体は、男性または女性であり得る。被験体は、胎児、乳児、小児、青年、ティーンエイジャーまたは成人であり得る。被験体は、いかなる年齢の患者でもあり得る。例えば、被験体は、約１０歳未満の患者であり得る。例えば、被験体は、少なくとも約０、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００歳の患者であり得る。被験体は、子宮内に存在することができる。多くの場合、被験体は、処置レジメンを受けている、または処置レジメン（例えば、免疫抑制療法）に関して評価されている患者または他の個体である。しかし、一部の実例では、被験体は、処置レジメンを受けていない。例えば、被験体は、健康な被験体であり得る。
一部の事例では、被験体は、哺乳動物または非哺乳動物であり得る。好ましくは、被験体は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、サル、チンパンジー）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、齧歯類、マウス、ＳＣＩＤマウス、ラット、モルモットまたはヒツジ等、哺乳動物である。一部の方法では、これらの遺伝子の種バリアントまたはホモログは、非ヒト動物モデルにおいて使用することができる。種バリアントは、互いに機能特性において最大配列同一性および類似性を有する、異なる種における遺伝子であり得る。かかる種バリアントヒト遺伝子の多くは、スイスプロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）データベースに収載され得る。
本明細書に開示されている方法は、固形臓器または固形臓器の断片のレシピエントである移植レシピエントに対して使用することができる。固形臓器は、肺、腎臓、心臓、肝臓、膵臓、大腸、小腸、胆嚢、生殖器またはこれらの組み合わせであり得る。一部の実例では、移植レシピエントは、組織または細胞のレシピエントであり得る。組織または細胞は、羊膜、皮膚、骨、血液、骨髄、血液幹細胞、血小板、臍帯血、角膜、中耳、心臓弁、静脈、軟骨、腱、靱帯、神経組織、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）、幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞またはこれらの組み合わせであり得る。
本明細書に記載されている実施例および実施形態が、単に説明を目的としており、これを踏まえた様々な修正または変更が、当業者に示唆されるであろうこと、また、本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
本明細書に記載されている実施例および実施形態が、単に説明を目的としており、これを踏まえた様々な修正または変更が、当業者に示唆されるであろうこと、また、本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
実施例において用いられている試薬は、市販されている、または本技術分野で公知の市販の器具、方法もしくは試薬を使用して調製することができる。前述の実施例は、本発明の様々な態様および本発明の方法の実施を例証する。実施例は、本発明の多くの異なる実施形態の徹底的な記載の提供を意図するものではない。よって、前述の発明について、理解を明確にする目的で例証および例として、ある程度詳細に記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、前述の発明に多くの変更および修正をなすことができることが容易に分かるであろう。
（実施例１ 組織調製）
一般に、Ｍｉｃｈｅｖａ， Ｋ． Ｄ．、Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ， Ｎ．、Ｂｕｓｓｅ， Ｂ．、およびＳｍｉｔｈ， Ｓ． Ｊ．（２０１０年）、Ａｒｒａｙ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ： Ｒｏｄｅｎｔ Ｂｒａｉｎ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２０１０年（１１巻）に概要が述べられている組織調製方法を使用した（組織型および組織が得られる生物の差に関して適応および最適化させることにより）。
次の通りにマウス脳を解剖および固定した：
解剖ツールをセットアップし、ＰＢＳおよび濾過された固定液を調製し、気泡を生じないよう流動の準備ができた。２％グルタルアルデヒドおよび２％脱重合パラホルムアルデヒドを、６．８〜７．２の間のｐＨを有する０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解した。
齧歯類を殺さずに麻酔し、心臓を露出させ、右心房をカットし、カニューレを左心室に挿入した。約１ｃｍに短縮した、ほぼ２０Ｇの鈍な針を使用した。一部の事例では、大動脈が脆弱でなく容易に破壊もされない生物に対しては、大動脈にカニューレ挿入するのが最適である。次に、重力流；または一部の実例では、灌流ポンプの使用により、固定液を約１０分間流動させた。次に、これを最大５ｍｌのＰＢＳにより灌流させた。
次に、約５ｃｃのヘパリン処理された生理食塩水をチューブに入れて、血液を流すのを助けた。固定液による灌流を１０分間行った。固定の２０分以内に脳を取り出した。全脳を同じ固定液で一晩、冷蔵庫内で後固定（ｐｏｓｔｆｉｘ）した。０．１Ｍリン酸緩衝液で２回すすいだ後に、組織を最大１週間４℃で貯蔵した。
ある特定の事例では、厚い組織切片が解析され、これは樹脂包埋組織に関しておよそ２００ｎｍ〜１μｍである。厚い切片が、単位時間当たりより大きい容積のイメージングを可能にすることが認められる。イメージングは、高い倍率で、または比較的低い倍率の対物レンズ、１０〜２０×により行うことができる。例えば、腫瘍等、生検された組織の解析において、より低い倍率で厚い切片の解析を行うことが好まれる場合がある。より低い倍率は、細胞下分解能（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）による組織の大きい視野の解析を可能にする。
一部の事例では、組織は、脱水および樹脂包埋されず、むしろ、後述する標識方法が、固定され水分補給された組織の染色に関して検証された抗体に適用される。
一部の事例では、切片収集器を利用して、ウルトラミクロトームにおいて産生されたリボンを自動的に収集し、これを、顕微鏡スライドからマイクロタイタープレートに及ぶサイズの、コーティングされた高精度カバーガラスの予め画定された領域に置く。
（実施例２ ライゲーション増幅されたマルチプレックス化検出抗原（ＬＡＭＤＡ））
試薬：
１．ＤＮＡコンジュゲート抗体
２．粘着性オーバーハング（例えば、ＧＧＧ）を有するアンチセンス検出オリゴマー
３．５’リン酸、内部フルオロフォア（例えば、Ａｌｅｘａ ５９４）および末端の粘着末端（例えば、５’ＣＣＣ＆３’ＧＧＧ）を有する二本鎖オリゴマー（ＤＳＯ）
４．Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ − ＰＥＧを含有するリガーゼ溶液
５．制限エンドヌクレアーゼ − フルオロフォアの除去に使用される。ＤＳＯは、特有のエンドヌクレアーゼが特定の色を除去することができるように設計されている（例えば、ＣＣＣＧＧＧ＝ＳＭＡ１）。室温で１００％活性を有するエンドヌクレアーゼが使用される（例えば、ＳＭＡ１、ＢａｍＨ１＆Ｓａｃ１）
６．トリス緩衝液 − ０．１％Ｔｗｅｅｎおよび５０ｍＭグリシンを含有する０．０５Ｍトリス − ヌクレアーゼを含まない水において作製され、次いでオートクレーブされる
７．核酸ハイブリダイゼーションおよび検出のためのＲｏｃｈｅブロッキング試薬（Ｓｉｇｍａ １１０９６１７６００１） − １０％（ｗ／ｖ）ストック［１０×］
８．グルタルアルデヒド
９．水素化ホウ素ナトリウム
１０．ヌクレアーゼを含まない水
手順：
１．プレブロッキング − １％（ｗ／ｖ）［１×］ブロッキング試薬を含有するトリス緩衝液に組織を１分間置く。
２．抗体染色 − １％（ｗ／ｖ）［１×］ブロッキング試薬を含有するトリス緩衝液においてＤＮＡ−抗体を一晩希釈する。抗体の濃度は、抗体 対 抗体基準で決定される。
３．一次洗浄 − それぞれ１分間を３回で、トリス緩衝液で組織を洗浄する。ヌクレアーゼを含まない水で１回洗浄することにより完了する（インキュベートする必要はない）。＞３種のＤＮＡ−抗体が使用される場合、すなわち、多重検出ラウンドが予想される場合、水における１％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）により１分間固定する。水で１分間洗浄し、次いでトリス（Ｔｗｅｅｎおよびグリシンを含まない）における１％水素化ホウ素ナトリウムで組織を１分間処理する（自己蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ）を除去するため）。水で１分間洗浄する。
４．ＤＮＡハイブリダイゼーション（全ステップを室温で） − リガーゼ緩衝液においてアンチセンス検出オリゴマーを希釈して、最終濃度１００ｎＭとする。組織の上にリガーゼ緩衝液を置く。その間に、組織上の検出オリゴ（ｏｌｉｇｏ）溶液と同じ容積で、リガーゼ緩衝液において２×濃度の２００ｎＭ ＤＳＯを調製する。
５．ライゲーション反応 − 組織オリゴ混合物を有する２０ｕｌ溶液当たり１ｕｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを置き、次いでＤＳＯリガーゼ緩衝液混合物を添加し、混合する。５分間静置する。
６．二次洗浄 − ヌクレアーゼを含まない水で組織を洗浄し、続いてトリス緩衝液によるそれぞれ１分間の３回の洗浄を行う。
７．マウントおよび撮像 − 再度水で洗浄し、次いで試料をマウントし、撮像する。
８．洗浄および脱染 − ヌクレアーゼを含まない水で洗浄し、消化緩衝液における制限エンドヌクレアーゼを組織上に置き、５分間インキュベートする。続いて水洗浄。
９．再染色 − 他のＤＮＡ−抗体を撮像する必要がある場合、ＤＮＡハイブリダイゼーションを再度開始する。
切断可能なリンカー
１．リン酸緩衝液における２％ヒドラジンにおける切断；３０〜１２０分間、ＲＴ：Ｄｄｅ
２．１０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）リン酸緩衝液における切断；２０分間、ＲＴ、暗所；ジオール
３．５０ｍＭ亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２０４）における切断；ジアゾ
（実施例３ ホスファターゼおよび超音波処理ＤＮＡによるブロッキングによるライゲーション増幅）
実施例１および２に記載されているものと同様の試薬およびプロトコールを本実施例で使用した。
図７Ａ〜図７Ｊに示す通り、ホスファターゼおよび超音波処理ＤＮＡによるブロッキングによるライゲーション増幅は、シグナル対ノイズ比を改善した。図７Ａは、１０枚の（７０ｎｍ）切片からのＤＮＡタグ付けされたアセチル化チューブリンの最大投射を示す。図７Ａは、ライゲーションオリゴマー化により可視化されたＤＮＡ標識された一次を示す。図７Ｂは、同じ組織切片における伝統的蛍光二次によって可視化された同じＤＮＡ−一次を示す。図７Ｃは、図７Ａおよび図７Ｂと同じ組織における蛍光標識アンチセンスオリゴマーにより可視化されたＤＮＡ標識された一次を示す。図７Ｄ〜図７Ｆは、図７Ａ〜図７Ｃの接写図を示す（黄色のボックスによって強調）。図７Ｄにおける白色の矢じりは、核のオフターゲットライゲーション可視化へのポイントを示し、これは図７Ｅには存在しない（白色の矢じり）。図７Ｆは、オフターゲットシグナルを同様に被ったアンチセンス検出を示すが、核の標識はより低い。図７Ｇ〜図７Ｉは、異なる組織において、ＤＮＡ標識シナプシン抗体が、ホスファターゼおよび超音波処理ＤＮＡによるブロッキング後に可視化されることを示す。図７Ｇは、二次検出図７Ｈ（白色の矢じり）と同等のオフターゲット標識（白色の矢じり）をもたらす、核標識の有意な減少を示す。図７Ｉは、超音波処理ＤＮＡによるブロッキングが、アンチセンス検出ノイズも改善したことを示す。図７Ｊは、対数目盛りで、各方法の重ね合わせた強度ヒストグラムを示す。
（実施例４ ＤＮＡコンジュゲート抗体を使用したディープマルチプレックス化）
実施例１および２に記載されているものと同様の試薬およびプロトコールを本実施例で使用した。
図８は、皮質における２７枚の切片の投射を含有するパネルを示す。マークされた（ＤＮＡ）全タンパク質は、蛍光標識ＤＮＡオリゴマーを使用して検出した。ＧｌｕＲ１（ウサギ）およびＮＲ１（マウス）は、先ず二次抗体を使用して検出し、一次は、組織に適用され、グルタルアルデヒドで固定されている。他の全抗体を同時にインキュベートし、次いでグルタルアルデヒドを使用して組織に固定した。ＶＧｌｕＴ１（モルモット）およびＭＢＰ（ニワトリ）は、適切な種特異的抗体を使用して検出した。各抗体は、個々に、および高密度標識条件下で同様のパターンを示した。マウスおよびウサギ抗体の最終適用は、このパネルにおける全抗体による組織の高密度標識を示す。
（実施例５ ディープマルチプレックス化標的化の９種の抗体）
実施例１および２に記載されているものと同様の試薬およびプロトコールを本実施例で使用した。
本実施例（図９に示す）は、９種の抗体を使用した同じ構造（皮質シナプス）の同時標的化が、抗体標識に影響を与えず、シナプス周囲の緊密なタンパク質検出を破壊しないことを実証した。９種の抗体を次に示す：２種のシナプス前足場タンパク質（Ｂａｓｓｏｏｎ、シナプシン）、３種のシナプス前小胞タンパク質（シナプス小胞タンパク質２、シナプトフィジン、小胞グルタミン酸輸送体１）、２種のシナプス後足場タンパク質（Ｈｏｍｅｒ、シナプス後密度タンパク質９５）、および２種のシナプス後受容体タンパク質（グルタミン酸受容体１、ＮＭＤＡ受容体１）。
シナプス前およびシナプス後構造を定義するタンパク質マーカーは、単一標識の場合と同様に、高密度条件（同じ構造の９種の同時標的化）下で標識した。さらに、本発明者らの本方法を使用して、この１８種のタンパク質チャネルデータの取得は、複数イメージングセッションにより、ほんの１日を要した一方、伝統的アレイ断層撮影方法（Ｍｉｃｈｅｖａら）を使用すると、これは１週間かかったであろう。
（実施例６ タグ配列決定を使用したマルチプレックス化抗原の迅速検出）
実施例１および２に記載されているものと同様の試薬およびプロトコールを本実施例で使用した。
一部の事例では、ハイブリダイゼーションによるタグ配列決定が用いられる。これは、直接的配列決定の変形であり、４個の約１５ｍｅｒ単位からなる約６０塩基対（ｂｐ）であるタグを使用する。このアプローチにより、特有の組み合わせの数は、４ｎである、またはｎ＝４に対して２５６である。組織試料中の例えば１００種のタンパク質の検出のため、１００種の抗体のそれぞれが、位置のそれぞれにおいて、４種の特有の１５ｍｅｒ（Ａ、Ｔ、ＣまたはＧに対応）からなるタグを有し、総計で１６種の特有のオリゴマーを要求する。「配列決定」は、いずれの末端からであってもよい。要求されることは、位置ｍを配列決定する場合、位置ｍにおけるタグオリゴマーに相補的な４種のオリゴマーが導入されることだけである。例えば、タグの遠位末端における４種の特有の配列に相補的な、それぞれ識別可能なフルオロフォアで標識されたオリゴマーが、導入され読み出される；次に、リンカーを切断することにより、またはｄｓＤＮＡを酵素により切断して、フルオロフォアを放出することにより、フルオロフォアが除去される。後者の方法は、遠位末端からの配列決定を要求する。このタグ配列決定方法は、各ラウンドにおける各フルオロフォアの使用を可能にするため、特有のタグの数の式は、ｐｎ（ｐ＝蛍光チャネルの数、ｎ＝読み取りデータの数）である（図１０に示す通り、上で、本発明者らはｐ＝４と仮定）。
例えば、図１０Ａ〜図１０Ｄにおいて、タグ配列決定を使用したマルチプレックス化抗原の迅速検出の例を示す。図１０Ａ〜図１０Ｃは、オリゴマーモジュールの逐次検出と、それに続く制限エンドヌクレアーゼ切断による蛍光標識されたオリゴマーの除去を示す。図１０Ｄは、イメージングサイクルにわたって生成された色組み合わせの使用を示し、抗原毎の最終画像が再構築される。特有の抗原の潜在的な数は、ｐｎ（ｐ＝蛍光チャネル、例えば、特有の検出オリゴマーの数；ｎ＝モジュールの数）である。図１０において、３種のモジュールおよび３種の蛍光チャネルが存在するため、３３＝２７種の潜在的な抗原が存在する。モジュール数または蛍光チャネル数のいずれかを増加させることにより、本発明者らは、短い時間量で数百種の抗原を容易に撮像することができ、例えば、４種のモジュール群および４種の蛍光チャネル＝２５６種の潜在的な抗原である。
ハイブリダイゼーションによるタグ「配列決定」は、ＱＤ標識オリゴマーにより十分に機能する。ＱＤの使用は、４から６またはそれよりも多くへの、ｐの増加を可能にする。ｐ＝６およびｎ＝３を仮定すると、僅か６×３＝１８種の特有のオリゴマーおよび３種の読み取りデータを使用して、２１６種の抗体を特有に標識することができる。ＱＤの使用は、適度に高速なＳＴＯＲＭ様イメージングを可能にする。量子ドット点滅を活用して、平面におけるほぼ１５ｎｍでの３次元超分解能イメージングを得ることができることが実証された。さらに、量子ドットは、光活性化される必要はなく、光退色に対して抵抗性であり、励起に単一色を要求する。
（実施例７ 単一抗体のマルチラウンド配列決定）
実施例１および２に記載されているものと同様の試薬およびプロトコールを本実施例で使用した。
実施例６における方法を使用して長いＤＮＡタグを有する抗体を生成し、逐次的な読み取りデータにより撮像し、個々のタグ間で優れた読み取りデータ間一貫性を得た。画像の統合により、単一抗原を特有に同定することが可能になった（図１１Ａ〜図１１Ｅに示す）。
図１１Ａは、ＧＦＰ標識されたニューロンを囲むシナプシン標識を示す。ＧＦＰ樹状突起および細胞体周囲のシナプシン標識は、総容積からシナプシン斑点を抽出するためのマスクとしての拡張バージョンのＧＦＰ標識を使用して計算により強調した。図１１Ｂは、蛍光ＤＮＡオリゴマーを使用した、シナプシンのパス１検出を示す。基準として同じシナプシン染色の二次検出を使用して、ＤＮＡを使用して、１１１９７０個の二次標識されたシナプシン斑点のうち１０３７６１個が検出されたこと（または７．３％偽陰性率）が決定された。ＤＮＡ標識された斑点が二次標識された斑点に対応しない、３．９％偽陽性率も存在した（図１１Ｄに示す）。図１１Ｃは、蛍光ＤＮＡオリゴマーを使用した、シナプシンのパス２検出を示す。二次と比較して（図１１Ｄに示す）、パス２は、９．５％偽陰性率および３．５％偽陽性率を有した。第１のパスと比較して、パス２は、５％偽陰性率および２．４％偽陽性率を有した。図１１Ｅは、全３パスの合成図を示す。
本実施例は、「タグ配列決定」が、１対１のＤＮＡ抗体コンジュゲーションおよび超分解能イメージングを用いずとも、実際に可能であったこと、また、本方法を使用して、困難かつ非効率的な化学または複雑なイメージング方法を使用せずに、高度マルチプレックス化抗原を撮像することができることを実証した。
（実施例８ ＤＮＡコンジュゲート抗体を使用した、腫瘍組織の厚いパラフィン切片における抗原の可視化）
実施例１および２に記載されているものと同様の試薬およびプロトコールを本実施例で使用した。
本実施例は、本明細書に開示されている方法が、薄い（５０〜１００ｎｍ）樹脂包埋組織を超えて有用であることを実証した。本実施例における試料は、がん研究および診断適用において一般的に使用される、より厚いパラフィン包埋組織切片（５〜２０ｕｍ）（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織）において得られた。アセチル化チューブリンに対する抗体を使用して、検出方法が、細胞分化した正常脳組織におけるアセチル化チューブリンの密度を明らかにした一方、より低分化のがん細胞が、この安定形態のチューブリンを発現しなかったことが実証された。
図１２Ａ〜図１２Ｅに示す通り、１０ｕｍパラフィン切片において全試料を得た。図１２Ａは、ＤＮＡコンジュゲート抗ａｃチューブリン抗体を使用して可視化されたアセチル化チューブリンを示す。ホスファターゼおよび超音波処理ＤＮＡによるブロッキング後にライゲーション増幅を使用して、検出を行った。図１２Ｂは、エンドヌクレアーゼ溶液における３０分間の後の同じ切片が、アセチル化チューブリンシグナルを除去したことを示す。血管の自己蛍光およびより長い露光時間による残存蛍光。図１２Ｃは、二次抗体を使用して、同じ組織を再染色したことを示す。図１２Ｄは、図１２Ａおよび図１２Ｃの黄色のボックスにおけるアセチル化チューブリン構造の接写図を示す。図１２Ｅは、グリオーマを有する皮質組織におけるアセチル化チューブリン染色を示す。トレースされた軸索の強い染色は、安定アセチル化チューブリンが最高密度であった一方、未分化腫瘍は、この安定形態のチューブリンを発現しなかった。
（実施例９ アーカイブイメージングのためのＤＮＡ−抗体）
ＤＮＡの安定性（例えば、５００年間の半減期）および脱水の場合、長い期間の後であってもその機能特徴を保持するＤＮＡの能力は、ＤＮＡコンジュゲート抗体を、免疫組織化学（ＩＨＣ）検出のための理想的なアーカイブ試薬とする。本実施形態では、ＤＮＡコンジュゲート抗体は、ライゲーションされた蛍光検出オリゴの消化および除去の際にその本来の配列に戻る末端制限部位を用いて設計されるため、これを将来のアーカイブ検出のために調製する。抗体コンジュゲートＤＮＡにおける末端（…ＧＧＧ［ヘミ−ＳＭＡ１部位］）は、ライゲーション検出後に完全ＳＭＡ１部位（…ＧＧＧｃｃｃ…）を生成することができる（図１４Ａ）。イメージングおよびＳＭＡ１による切断（…ＧＧＧ ｘ ｃｃｃ…）後に、抗体コンジュゲートＤＮＡ鎖は、末端（…ＧＧＧ）を有する本来の配列に戻る（図１４Ｂ〜図１４Ｄ）。抗体に取り付けられたＤＮＡは、二本鎖であり得る。ＤＮＡコンジュゲート抗体は、二本鎖形態でアーカイブされ得る。別の実施形態では、ＤＮＡコンジュゲート抗体は、一本鎖形態でアーカイブされ得る。二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡよりも安定であり得る。アーカイブされたＤＮＡコンジュゲート抗体が、二本鎖形態の場合、イメージングのためにライゲーション検出を開始する前に、アーカイブ回復（ａｒｃｈｉｖａｌ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）の際にアンチセンス鎖を除去することができる。アンチセンス鎖の除去は、貯蔵前に行うことができる。アンチセンス鎖の除去は、変性（化学物質または熱）、ニッカーゼ促進変性（この場合、ニッカーゼが、アンチセンスをより短いセグメントとし、これにより融解温度を低下させる）またはＲＮＡアンチセンス（この場合、ＲＮＡｓｅが、二重鎖のＲＮＡ部分を選択的に除去することができる）により達成することができる（図１４Ｅ）。アンチセンスの除去の際に、染色された組織は、本来の抗体染色状態に戻り、これにより、新鮮な蛍光検出の準備ができる（図１４Ｆ）。
（実施例１０ 分枝状オリゴマー化によるシグナル増幅）
図１５Ａ〜図１５Ｆは、分枝状標識核酸を使用したシグナル増幅による、生体試料中の核酸およびタンパク質結合試薬の改善された検出の例を提供した。
図１５Ａは、試料中の標的分子（例えば、標的）が、本明細書に記載されている方法によって検出されることを示す。標的分子は、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または増幅プロセスによって検出される他の分子もしくは構造であり得る。標的は、標的分子に結合することができるリガンドを含む検出分子によって接触される。リガンドは、１個または複数の一本鎖核酸（例えば、タグ）に連結される。タグは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはＲＮＡの非天然誘導体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのように塩基対合することができる合成塩基であり得る。タグは、相補的領域およびオーバーハング領域を含むアンチセンスオリゴマー（例えば、プローブ）によって認識される。タグの相補的領域は、タグにおける相補的領域にハイブリダイズされ得る。プローブは、オーバーハングを有する二本鎖核酸を形成することができる。オーバーハング領域は、塩基対合により、検出標識（例えば、図１５Ａにおける標識された検出器）のドッキングを可能にすることができる。１種または複数の検出標識は、ライゲーションオリゴマー化または鋳型による（ハイブリダイゼーション）オリゴマー化により付加することができる。プローブは、任意の長さのものであってもよく、例えば、２５０塩基よりも短くなることができる。
図１５Ｂは、長いプローブが、ｎ個の検出標識（例えば、検出器…ｎ個の検出器）をドッキングすることができることを示す。検出器鎖は、３〜１５０塩基であり得る。一部の事例では、検出器のドッキングは、末端オーバーハングがない核酸を作り出すことができる。一部の事例では、検出器のドッキングは、末端オーバーハングを作り出すことができる。存在する場合、末端オーバーハングは、標識されていても標識されていなくてもよい、ヘアピン末端の直鎖状もしくは分枝状伸長または付加を可能にすることができる（図１５Ｄを参照）。
図１５Ｃは、プローブが相対的に短くなることができ、長い一次検出器標識（例えば、一次検出器）が、プローブにハイブリダイズされ得ることを示す。そして次に、一次検出器は、複数の標識された二次検出器鎖の塩基対合（ｐａｒｉｎｇ）標的であり得る。一次検出器、プローブおよびタグは、標識されていても標識されていなくてもよい。
図１５Ｄは、一本鎖オリゴの付加の代わりに、単独にまたは多重に標識された二重鎖検出器を使用することができることを示す。この二重鎖は、手動サイクリングまたは自己アセンブリのいずれかによりｎ倍に伸長され得る。この構造の末端は、オーバーハング、平滑末端またはヘアピンであり得る。
図１５Ｅは、直鎖状二重鎖検出器の代わりに、ｎ−分枝状検出器を使用して、伸長された標識された構造を構築することができることを示す。例えば、第１の検出標識（Ｄ１）の配列の部分は、プローブのオーバーハングに相補的である。Ｄ１は、プローブにハイブリダイズされる。第２の検出標識（Ｄ２）は、Ｄ１の配列の別の部分にハイブリダイズする。第３の検出標識（Ｄ３）は、Ｄ１およびＤ２の部分に相補的でありこれにハイブリダイズされ、これにより、分枝状検出器を作り出す。分枝状検出器は、第４の検出標識（Ｄ４）に結合することによりさらに伸長され得、Ｄ４は、第５の検出標識（Ｄ５）および第６の検出標識（Ｄ６）にさらにハイブリダイズされ得る。この構造の末端は、オーバーハング、平滑末端またはヘアピンであり得る。
図１５Ｆは、直鎖状および分枝状検出器が、ｎ−分枝状構造の伸長において混合され得ることを示す。直鎖状検出器は、図１５Ｃにおいて認められる通り、二重鎖または短いもしくは長い一本鎖と二次検出器のいずれかであり得る。この構造は、単位のサイクリングまたは自己アセンブリのいずれかにより構築することができる。この構造の末端は、オーバーハング、平滑末端またはヘアピンであり得る。
（実施例１１ 直鎖状および分枝状二重鎖ライゲーションオリゴマー化）
図１６Ａ〜図１６Ｆは、直鎖状および分枝状二重鎖ライゲーションオリゴマー化の例を提供した。標識された直鎖状核酸モジュール（例えば、検出標識）は、一末端において、試料中の目的の分子を標的とすることができる二本鎖核酸（例えば、リガンドおよびアンチセンスオリゴマーに連結された一本鎖核酸によって形成される）にライゲーションすることができる。標識された直鎖状核酸モジュールは、他の末端において、分枝状二重鎖核酸モジュールにライゲーションすることができる。ライゲーションは、酵素的ライゲーションまたは化学的架橋によってもたらすことができる。直鎖状核酸モジュールは、二重鎖または一本鎖核酸のいずれかであり得る。直鎖状核酸モジュールは、１個または複数の検出タグ（例えば、フルオロフォア）によりタグ付けすることができる。直鎖状核酸モジュールが一本鎖である場合、これは、１個または複数の検出タグで標識された、１個または複数の相補的一本鎖核酸オリゴをアニールすることにより標識することができる。直鎖状モジュールは、いかなる長さのものであってもよく、５’および３’末端の両方における特有のまたは相補的なオーバーハングのいずれかを用いて設計することができる。オーバーハングが特有である場合（例えば、αおよびβは、特有の末端である）、直鎖状モジュールは、自己オリゴマー化しなくてよい（図１６Ａを参照）。図１６Ａは、特有の相補的末端［αおよびα’］および［βおよびβ’］を有する標識された二重鎖核酸単位を示す。円形のドットは、種々のモダリティによって検出され得る標識を表す。標識は、蛍光分子および他の蛍光実体、ならびに酵素、ペプチドおよび放射性同位元素を含むことができる。一部の事例では、密度は、標識の種類および核酸鎖の長さに依存するであろうことから、核酸鎖当たりの標識の数は、示されている円形のドットの数に制限されない。増幅を達成するために、単位のサイクリングを使用することができる。オーバーハングが相補的である場合（図示せず）、例えば、直鎖状核酸モジュールは、相補的末端αおよびα’を有し、検出単位は自己集合することができる。
図１６Ｂに示す通り、抗体または別の核酸等、核酸にタグ付けされた構造は、相補的一本鎖プローブをアニールし、これにより、直鎖状および分枝状標識単位と適合性のオーバーハングを形成することにより検出することができる。図１６Ｂには、交互のα／βおよびα’／β’標識された二重鎖単位を使用した直鎖状増幅が示されている。
図１６Ｃは、分枝状核酸構造が、同じ特有の相補的末端により生成され得ることを示す。例示的な３方向および４方向分枝構造を図１６Ｃに示す。
図１６Ｄは、シグナルの２ｙ増幅をもたらし得る３方向分枝のサイクリングを示し、式中、ｙ＝サイクルの数である。示されている構造は、交互のα／βおよびα’／β’標識された３方向分枝単位のサイクリングにより生成することができる（図１６Ｃ）。
図１６Ｅは、シグナルの３ｙ増幅をもたらし得る４方向分枝のサイクリングを示し、式中、ｙ＝サイクルの数である。示されている構造は、交互のα／βおよびα’／β’標識された４方向分枝単位のサイクリングにより生成することができる（図１６Ｃ）。ｎ分枝状単位のサイクリングは、（ｎ−１）ｙの増幅をもたらすことができ、式中、ｎ＝分枝単位の分枝の数であり、ｙ＝行われたサイクルの数である。図に示されている分枝状単位の末端は、相補的末端を用いて設計することができ、これにより、構造の自己集合を可能にする。
系列サイクリングによる２個の相補的モジュールの制御された逐次適用は、オリゴマー化およびシグナル増幅を促進することができる（図１６Ｂ）。３方向、４方向またはｎ方向分枝が、モジュールのサイクリング内に導入されて、シグナル増幅を増加させることができる（図１６Ｃ〜図１６Ｅ）。３方向分枝は、３個のオーバーハングを有するＴ字構造を作り出す３個の一本鎖核酸によって生成することができる。４方向分枝は、４個のオーバーハングを有する十字構造を作り出す４個の一本鎖核酸によって生成することができる、等々。分枝状および／または非分枝状構造の逐次適用は、式：（ｎ−１）ｙによって表すことができるオリゴマー化サイクルの数によって指示される、シグナルの指数関数的増幅を可能にすることができ、式中、ｎ＝分枝単位の分枝の数であり、ｙ＝行われたサイクルの数である。
さらに、分枝状核酸構造は、エンドヌクレアーゼ部位または切断可能なリンカーを有する標識を用いて設計することができ、そのどちらも、検出タグ（例えば、蛍光部分）のその後の除去に使用することができる。これは、組織試料中のタンパク質および／または核酸の高度にマルチプレックス化された同定のための標識された核酸構造の系列適用、検出および除去を可能にすることができる。さらに、本明細書に記載されている分枝状および直鎖状検出器単位は、記載されている構造の自己集合を可能にすることができるように、相補的末端を有することができる。
（実施例１２ ｉｎ ｓｉｔｕ核酸検出の分枝状増幅）
分枝状検出方法を使用して、組織における核酸を検出することができる（図１７Ａ〜図１７Ｃ）。この適用において、２種の特異的認識プローブは、標的核酸における隣接する配列を標的とすることができる（図１７Ａ）。プローブは、相補的領域を有することができ、それによって、２個の分子がごく近接している場合、核酸ハイブリダイゼーションは、２個の分子を一緒にまとめることができる（図１７Ａ）。本実施例では、２個の隣接する核酸プローブは、ステムヘアピン構造を生成し、その際、二次プローブがハイブリダイズすることができる。さらに、図１７Ｂ〜図１７Ｃは、２個のプローブが、二次一本鎖核酸プローブによって認識され得る２個の特有の配列を有し得ることを示し、近接するプローブへのハイブリダイゼーションの際に、上述の分枝状オリゴマー化の開始ポイントとなり得る３方向分枝状構造を生成することができる（図１６Ｃ〜図１６Ｄ）。
（実施例１３ 分枝状オリゴマー化は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織におけるシグナルを大幅に増幅する）
図１８Ａ〜図１８Ｆは、ＤＮＡタグ付けされた抗アセチル化チューブリン一次抗体で標識されたＦＦＰＥマウス脳皮質の５μｍ厚切片の例示的な画像を示す。ａｌｅｘａ−５９４標識された二次抗体（図１８Ａ）または分枝状オリゴマー化（図１８Ｂ〜図１８Ｆ）により一次抗体を検出した。タグに相補的な検出器プローブと共に、次いで２（図１８Ｂ）、４（図１８Ｃ）、６（図１８Ｄ）、８（図１８Ｅ）または１０（図１８Ｆ）サイクルによる分枝状「Ｔ」およびａｌｅｘａ−５９４標識された直鎖状検出器のサイクルと共に、組織をインキュベートし、サイクルは、１個の「Ｔ」および１個の直鎖状検出器ライゲーション反応を含む。主要な画像は、同一の露光およびコントラストで示す；挿入図は、最適なコントラスト設定におけるそれぞれの部分領域を示す。
図１８Ｇは、細胞体マスクのオーバーレイによる６サイクル増幅の例を示す（図１８Ｈにおける白色領域）。図１８Ｉは、二次抗体（菱形）および２〜１０サイクルの分枝状オリゴマー化（丸）の細胞体マスク内のピクセルの平均ピクセル強度を示す。異なるチャネル（Ａｌｅｘａ ６４７）における蛍光二次抗体の染色パターンを使用して、マスクを作り出した。全体的に見て、分枝状オリゴマー化例は、サイクルの数が増加するにつれてシグナル増幅を実証した。
（実施例１４ 分枝状オリゴマー化は、樹脂包埋組織におけるシグナルを大幅に増幅する）
図１９Ａ〜図１９Ｆは、ＤＮＡタグ付けされた抗アセチル化チューブリン一次抗体で標識され、６３×／１．４ＮＡにおいて油浸下で撮像されたマウス脳皮質の７０ｎｍ厚切片の例示的な画像を示す。ａｌｅｘａ−５９４標識された二次抗体（図１９Ａ）または分枝状オリゴマー化（図１９Ｂ〜図１９Ｅ）により一次抗体を検出した。タグに相補的な検出器プローブと共に、次いで２（図１９Ｂ）、４（図１９Ｃ）、６（図１９Ｄ）または８（図１９Ｅ）サイクルによる分枝状「Ｔ」およびａｌｅｘａ−５９４標識された直鎖状検出器のサイクルと共に組織をインキュベートし、サイクルは、１個の「Ｔ」および１個の直鎖状検出器ライゲーション反応を含む。主要な画像は、同一の露光およびコントラストで示す。挿入図は、同じ血管の中央に置かれた、最適なコントラスト設定におけるそれぞれの部分領域を示し、ＤＡＰＩ染色された核は青色で、チューブリン免疫蛍光は緑色で示す。図１９Ｆは、二次抗体（菱形）および２〜８サイクルの分枝状オリゴマー化（丸）の平均画像強度（１６ビット画像からの灰色の値）を示す。

Claims (177)

  1. 試料中の標的分子を検出カプレットと接触させるステップを含む方法であって、前記検出カプレットが、第１の核酸および第２の核酸を含み、各核酸が、標的認識領域および自己ハイブリダイゼーション領域を有し、前記第１の核酸の前記標的認識領域が、前記標的分子の第１の領域に結合し、前記第２の核酸の前記標的認識領域が、前記標的分子の第２の領域に結合し、前記第１の核酸の前記自己ハイブリダイゼーション領域および前記第２の核酸の前記自己ハイブリダイゼーション領域がハイブリダイズされて、二本鎖核酸標識を形成する、方法。
  2. 前記二本鎖核酸標識が、少なくとも３個の連続した塩基対を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記二本鎖核酸標識が、オーバーハングを有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記標的分子が、ｍＲＮＡ分子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記第１の核酸および前記第２の核酸が、一本鎖ＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記標的分子の前記第１の領域および前記第２の領域が、２〜１５ヌクレオチド離れている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. クロスリンカーを使用して、前記検出カプレットを前記試料に固定するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第１の核酸または前記第２の核酸が、遊離アミン（−ＮＨ２）修飾を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記検出カプレットを固定するステップが、前記検出カプレットをアミン特異的クロスリンカーと接触させるステップを含む、請求項７または８に記載の方法。
  10. 前記オーバーハングが、１個のヌクレオチドを含む、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記オーバーハングが、複数のヌクレオチドを含む、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記オーバーハングが、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個のヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記二本鎖核酸標識をＤＮＡリガーゼと接触させるステップをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記二本鎖核酸標識を少なくとも１個の検出標識と接触させるステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記少なくとも１個の検出標識が、前記二本鎖核酸標識の前記オーバーハングに相補的なオーバーハングを有する二本鎖核酸である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記少なくとも１個の検出標識が、前記二本鎖核酸標識の前記オーバーハングに相補的な一本鎖核酸である、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記少なくとも１個の検出標識が、複数の検出標識を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記二本鎖核酸標識および前記少なくとも１個の検出標識が、前記ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションされる、請求項１４または１５に記載の方法。
  19. 前記少なくとも１個の検出標識が、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個の検出標識を含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記少なくとも１個の検出標識が、切断可能なリンカーを含む、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記少なくとも１個の検出標識が、検出タグを含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記少なくとも１個の検出標識が、複数の検出タグを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記検出タグが、量子ドットを含む、請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 前記検出タグが、フルオロフォアを含む、請求項２１または２２に記載の方法。
  25. 前記フルオロフォアが、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセインまたはシアニンを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記検出タグを検出し、これにより、前記試料中の前記標的分子の存在を検出するステップを含む、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記標的分子を複数の検出カプレットと接触させるステップを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記複数の検出カプレットのそれぞれが、異なる標的分子に結合する、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記試料が、インタクトな組織試料である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記インタクトな組織試料が、２０〜１０００ｎｍの間の厚さの切片にスライスされ得るように、樹脂に前記インタクトな組織試料を包埋するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記試料中の前記標的分子の存在に関連する状態または疾患を診断するステップを含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 試料中の標的分子を検出分子およびアンチセンスオリゴマーと接触させるステップを含む方法であって、前記検出分子が、前記標的分子に結合する少なくとも１個のリガンドを含み、前記少なくとも１個のリガンドが、一本鎖核酸に連結されており、前記一本鎖核酸が前記アンチセンスオリゴマーとハイブリダイズされて、オーバーハングを有する二本鎖核酸標識を形成する、方法。
  33. 前記リガンドが、抗体である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記標的分子が、タンパク質である、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. 前記オーバーハングが、１個のヌクレオチドを含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記オーバーハングが、複数のヌクレオチドを含む、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記オーバーハングが、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個のヌクレオチドを含む、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記二本鎖核酸標識をＤＮＡリガーゼと接触させるステップをさらに含む、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記二本鎖核酸標識を少なくとも１個の検出標識と接触させるステップをさらに含む、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記少なくとも１個の検出標識が、前記二本鎖核酸標識の前記オーバーハングに相補的なオーバーハングを有する二本鎖核酸である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記少なくとも１個の検出標識が、複数の検出標識である、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記少なくとも１個の検出標識が、前記二本鎖核酸標識の前記オーバーハングに相補的な一本鎖核酸である、請求項４０に記載の方法。
  43. 前記少なくとも１個の検出標識が、複数の検出標識を含む、請求項４１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記少なくとも１個の検出標識が、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個の検出標識を含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記少なくとも１個の検出標識が、切断可能なリンカーを含む、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記少なくとも１個の検出標識が、切断可能なリンカーを含まない、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記少なくとも１個の検出標識が、検出タグを含む、請求項３２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記検出タグが、フルオロフォアを含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記フルオロフォアが、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセインまたはシアニンを含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記検出タグを検出し、これにより、前記試料中の前記標的分子の存在を検出するステップを含む、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記試料を複数の検出分子と接触させるステップを含む、請求項３２〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記複数の検出分子のそれぞれが、異なる標的分子に結合する、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記試料が、インタクトな組織試料である、請求項３２〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記インタクトな組織試料が、２０〜１０００ｎｍの間の厚さの切片にスライスされ得るように、樹脂に前記インタクトな組織試料を包埋するステップを含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記インタクトな組織試料が、骨髄組織試料、胃腸管組織試料、肺組織試料、肝臓組織試料、前立腺組織試料、神経系組織試料、泌尿生殖器系組織試料、脳組織試料、乳房組織試料、筋肉組織試料または皮膚組織試料である、請求項２９または５３に記載の方法。
  56. 前記試料中の前記標的分子の存在に関連する状態または疾患を診断するステップを含む、請求項２６または５０に記載の方法。
  57. 前記状態または疾患が、腎臓疾患、感染性疾患、代謝性疾患、前がん性状態、がん性状態または脳障害である、請求項５６に記載の方法。
  58. 検出カプレットを含む組成物であって、前記検出カプレットが、第１の核酸および第２の核酸を含み、各核酸が、標的認識領域および自己ハイブリダイゼーション領域を有し、前記第１の核酸の前記標的認識領域が、標的分子の領域に結合し、前記第２の核酸の前記標的認識領域が、前記標的分子の第２の領域に結合し、前記第１の核酸の前記自己ハイブリダイゼーション領域および前記第２の核酸の前記自己ハイブリダイゼーション領域がハイブリダイズされて、二本鎖核酸標識を形成する、組成物。
  59. 前記二本鎖核酸標識が、少なくとも３個の連続した塩基対を有する、請求項５８に記載の組成物。
  60. 前記二本鎖核酸標識が、オーバーハングを有する、請求項５８または５９に記載の組成物。
  61. 前記オーバーハングが、１個のヌクレオチドを含む、請求項６０に記載の組成物。
  62. 前記オーバーハングが、複数のヌクレオチドを含む、請求項６０に記載の組成物。
  63. 前記オーバーハングが、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個のヌクレオチドを含む、請求項６０に記載の組成物。
  64. 前記標的分子が、ｍＲＮＡ分子である、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
  65. 前記第１の核酸および前記第２の核酸が、一本鎖ＤＮＡである、請求項５８〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
  66. 前記第１の核酸および前記第２の核酸のそれぞれが、遊離アミン（−ＮＨ２）修飾を有する、請求項５８〜６５のいずれか一項に記載の組成物。
  67. ＤＮＡリガーゼをさらに含む、請求項５８〜６６のいずれか一項に記載の組成物。
  68. 少なくとも１個の検出標識をさらに含む、請求項５８〜６７のいずれか一項に記載の組成物。
  69. 前記少なくとも１個の検出標識が、前記二本鎖核酸標識の前記オーバーハングに相補的なオーバーハングを有する二本鎖核酸である、請求項６８に記載の組成物。
  70. 前記少なくとも１個の検出標識が、前記二本鎖核酸標識の前記オーバーハングに相補的な一本鎖核酸である、請求項６８に記載の組成物。
  71. 前記少なくとも１個の検出標識が、複数の検出標識を含む、請求項６８または７０のいずれか一項に記載の組成物。
  72. 前記少なくとも１個の検出標識が、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個の検出標識を含む、請求項６９または７０に記載の組成物。
  73. 前記少なくとも１個の検出標識が、切断可能なリンカーを含む、請求項６８〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
  74. 前記少なくとも１個の検出標識が、検出タグを含む、請求項６８〜７３のいずれか一項に記載の組成物。
  75. 前記少なくとも１個の検出標識が、複数の検出タグを含む、請求項７４に記載の組成物。
  76. 前記検出タグが、量子ドットを含む、請求項７４または７５に記載の組成物。
  77. 前記検出タグが、フルオロフォアを含む、請求項７４または７５に記載の組成物。
  78. 前記フルオロフォアが、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセインまたはシアニンを含む、請求項７７に記載の組成物。
  79. 検出分子およびアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、前記検出分子が、標的分子に結合する少なくとも１個のリガンドを含み、前記少なくとも１個のリガンドが、一本鎖核酸に連結されており、前記一本鎖核酸が前記アンチセンスオリゴマーにハイブリダイズされて、オーバーハングを有する二本鎖核酸標識を形成する、組成物。
  80. 前記リガンドが、抗体である、請求項７９に記載の組成物。
  81. 前記標的分子が、タンパク質である、請求項７９または８０に記載の組成物。
  82. 前記オーバーハングが、１個のヌクレオチドを含む、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の組成物。
  83. 前記オーバーハングが、複数のヌクレオチドを含む、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の組成物。
  84. 前記オーバーハングが、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個のヌクレオチドを含む、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の組成物。
  85. ＤＮＡリガーゼをさらに含む、請求項７９〜８４のいずれか一項に記載の組成物。
  86. 少なくとも１個の検出標識をさらに含む、請求項７９〜８５のいずれか一項に記載の組成物。
  87. 前記少なくとも１個の検出標識が、前記二本鎖核酸標識の前記オーバーハングに相補的なオーバーハングを有する二本鎖核酸である、請求項８６に記載の組成物。
  88. 前記少なくとも１個の検出標識が、前記二本鎖核酸標識の前記オーバーハングに相補的な一本鎖核酸である、請求項８６に記載の組成物。
  89. 前記少なくとも１個の検出標識が、複数の検出標識を含む、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の組成物。
  90. 前記少なくとも１個の検出標識が、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個の検出標識を含む、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の組成物。
  91. 前記少なくとも１個の検出標識が、切断可能なリンカーを含む、請求項８６〜９０のいずれか一項に記載の組成物。
  92. 前記少なくとも１個の検出標識が、切断可能なリンカーを含まない、請求項８６〜９０のいずれか一項に記載の組成物。
  93. 前記少なくとも１個の検出標識が、検出タグを含む、請求項８６〜９２のいずれか一項に記載の組成物。
  94. 前記少なくとも１個の検出標識が、複数の検出タグを含む、請求項９３に記載の組成物。
  95. 前記検出タグが、量子ドットを含む、請求項９３または９４に記載の組成物。
  96. 前記検出タグが、フルオロフォアを含む、請求項９３または９４に記載の組成物。
  97. 前記フルオロフォアが、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセインまたはシアニンを含む、請求項９６に記載の組成物。
  98. 複数の検出分子を含む、請求項７９〜９７のいずれか一項に記載の組成物。
  99. 前記複数の検出分子のそれぞれが、異なる標的分子に結合する、請求項９８に記載の組成物。
  100. 請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキットであって、前記キットは、以下：
    第１の核酸および第２の核酸を含む検出カプレットであって、各核酸が、標的認識領域および自己ハイブリダイゼーション領域を有し、前記第１の核酸の前記標的認識領域が、標的分子の第１の領域に結合し、前記第２の核酸の前記標的認識領域が、前記標的分子の第２の領域に結合し、前記第１の核酸の前記自己ハイブリダイゼーション領域および前記第２の核酸の前記自己ハイブリダイゼーション領域がハイブリダイズされて、二本鎖核酸標識を形成する、検出カプレットと、
    前記検出カプレットを前記標的分子と接触させる際に使用するための第１の試薬と
    を含む、キット。
  101. 前記二本鎖核酸標識が、オーバーハングを有する、請求項１００に記載のキット。
  102. 請求項３２〜５７のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキットであって、前記キットは、以下：
    検出分子およびアンチセンスオリゴマーであって、前記検出分子が、標的分子に結合する少なくとも１個のリガンドを含み、前記少なくとも１個のリガンドが、一本鎖核酸に連結されており、前記一本鎖核酸が前記アンチセンスオリゴマーにハイブリダイズされて、オーバーハングを有する二本鎖核酸標識を形成する、検出分子およびアンチセンスオリゴマーと、
    検出カプレットを前記標的分子と接触させる際に使用するための第１の試薬と
    を含む、キット。
  103. 前記標的分子の検出における使用のための第２の試薬をさらに含む、請求項１００〜１０２のいずれか一項に記載のキット。
  104. 前記標的分子が、遺伝子編集アッセイにおける構成成分を含む、請求項１または３２に記載の方法。
  105. 前記遺伝子編集アッセイが、ＣＲＩＳＰＲアッセイである、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記構成成分が、Ｃａｓヌクレアーゼ、標的ＤＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ドナー修復鋳型、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１０４または１０５に記載の方法。
  107. 前記構成成分が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含む、請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記遺伝子編集アッセイが、ＮｇＡｇｏアッセイである、請求項１０４に記載の方法。
  109. 前記標的分子が、細胞分子である、請求項１または３２に記載の方法。
  110. 前記標的分子が、細胞表面分子である、請求項１または３２に記載の方法。
  111. 前記標的分子が、炭水化物、脂質、タンパク質または核酸である、請求項１０９または１１０に記載の方法。
  112. 前記標的分子が、タンパク質を含む、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記タンパク質が、細胞骨格タンパク質、細胞外マトリクスタンパク質、血漿タンパク質、凝固因子、急性期タンパク質、血液タンパク質、細胞接着、膜貫通輸送タンパク質、イオンチャネル、シンポート／アンチポートタンパク質、ホルモン、増殖因子、受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、免疫系タンパク質、栄養素貯蔵もしくは輸送タンパク質、シャペロンタンパク質、酵素、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記標的分子が、核酸を含む、請求項１１１に記載の方法。
  115. 前記核酸が、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、非コードＲＮＡ分子、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記標的分子が、遺伝子編集アッセイにおける構成成分を含む、請求項５８または７９に記載の組成物。
  117. 前記遺伝子編集アッセイが、ＣＲＩＳＰＲアッセイである、請求項１１６に記載の組成物。
  118. 前記構成成分が、Ｃａｓヌクレアーゼ、標的ＤＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ドナー修復鋳型、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１１６または１１７に記載の組成物。
  119. 前記構成成分が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含む、請求項１１８に記載の組成物。
  120. 前記遺伝子編集アッセイが、ＮｇＡｇｏアッセイである、請求項１１６に記載の組成物。
  121. 前記標的分子が、細胞分子である、請求５８または７９に記載の組成物。
  122. 前記標的分子が、細胞表面分子である、請求項５８または７９に記載の組成物。
  123. 前記標的分子が、炭水化物、脂質、タンパク質または核酸である、請求項１２１または１２２に記載の組成物。
  124. 前記標的分子が、タンパク質を含む、請求項１２３に記載の組成物。
  125. 前記タンパク質が、細胞骨格タンパク質、細胞外マトリクスタンパク質、血漿タンパク質、凝固因子、急性期タンパク質、血液タンパク質、細胞接着、膜貫通輸送タンパク質、イオンチャネル、シンポート／アンチポートタンパク質、ホルモン、増殖因子、受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、免疫系タンパク質、栄養素貯蔵もしくは輸送タンパク質、シャペロンタンパク質、酵素、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１２４に記載の組成物。
  126. 前記標的分子が、核酸を含む、請求項１２３に記載の組成物。
  127. 前記核酸が、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、非コードＲＮＡ分子、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１２６に記載の組成物。
  128. 前記標的分子が、遺伝子編集アッセイにおける構成成分を含む、請求項１００または１０２に記載のキット。
  129. 前記遺伝子編集アッセイが、ＣＲＩＳＰＲアッセイである、請求項１２８に記載のキット。
  130. 前記構成成分が、Ｃａｓヌクレアーゼ、標的ＤＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ドナー修復鋳型、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１２８または１２９に記載のキット。
  131. 前記構成成分が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含む、請求項１３０に記載のキット。
  132. 前記遺伝子編集アッセイが、ＮｇＡｇｏアッセイである、請求項１２８に記載のキット。
  133. 前記標的分子が、細胞分子である、請求項１００または１０２に記載のキット。
  134. 前記標的分子が、細胞表面分子である、請求項１００または１０２に記載のキット。
  135. 前記標的分子が、炭水化物、脂質、タンパク質または核酸である、請求項１３３または１３４に記載のキット。
  136. 前記標的分子が、タンパク質を含む、請求項１３５に記載のキット。
  137. 前記タンパク質が、細胞骨格タンパク質、細胞外マトリクスタンパク質、血漿タンパク質、凝固因子、急性期タンパク質、血液タンパク質、細胞接着、膜貫通輸送タンパク質、イオンチャネル、シンポート／アンチポートタンパク質、ホルモン、増殖因子、受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、免疫系タンパク質、栄養素貯蔵もしくは輸送タンパク質、シャペロンタンパク質、酵素、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１３６に記載のキット。
  138. 前記標的分子が、核酸を含む、請求項１３５に記載のキット。
  139. 前記核酸が、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、非コードＲＮＡ分子、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１３８に記載のキット。
  140. 前記二本鎖核酸標識を第３の核酸と接触させるステップをさらに含み、前記第３の核酸が、前記第１の核酸の配列、前記第２の核酸の配列またはその両方に相補的な配列を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  141. 前記第３の核酸が、前記第１の核酸の前記配列、前記第２の核酸の前記配列またはその両方に結合する、請求項１４０に記載の方法。
  142. 前記第３の核酸が、前記第１の核酸の前記配列および前記第２の核酸の前記配列に結合し、これにより、３方向分枝を作り出す、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記３方向分枝が、少なくとも２個のオーバーハングを含む、請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記第３の核酸を第４の核酸と接触させるステップをさらに含み、前記第４の核酸が、前記第１の核酸の配列、前記第２の核酸の配列、前記第３の核酸の配列、またはこれらのいずれかの組み合わせに相補的な配列を含む、請求項１４０に記載の方法。
  145. 前記第４の核酸が、前記第３の核酸の前記配列および前記第１の核酸の前記配列または前記第２の核酸の前記配列に結合し、これにより、４方向分枝を作り出す、請求項１４４に記載の方法。
  146. 前記４方向分枝が、少なくとも３個のオーバーハングを含む、請求項１４５に記載の方法。
  147. 前記オーバーハングのうち少なくとも２個が、同じ配列または特有の配列を含む、請求項１４３または１４６に記載の方法。
  148. 前記オーバーハングのうち少なくとも２個が、相補的配列を含む、請求項１４３または１４６に記載の方法。
  149. 前記オーバーハングのうち少なくとも１個を検出標識と接触させるステップをさらに含む、請求項１４０〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
  150. 前記検出標識が、３方向分枝または４方向分枝を含む、請求項１４９に記載の方法。
  151. 前記検出標識が、前記オーバーハングのうち前記少なくとも１個に相補的なオーバーハングを含む、請求項１４９に記載の方法。
  152. 前記検出標識が、直接的ハイブリダイゼーション、酵素的ライゲーションまたは化学的ライゲーションによって、前記オーバーハングのうち前記少なくとも１個に連結される、請求項１４９〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
  153. 第３の核酸をさらに含み、前記第３の核酸が、前記第１の核酸の配列、前記第２の核酸の配列またはその両方に相補的な配列を含む、請求項５８〜７８のいずれか一項に記載の組成物。
  154. 前記第３の核酸が、前記第１の核酸の前記配列および前記第２の核酸の前記配列に結合し、これにより、３方向分枝を作り出す、請求項１５３に記載の組成物。
  155. 前記３方向分枝が、少なくとも２個のオーバーハングを含む、請求項１５４に記載の組成物。
  156. 第４の核酸をさらに含み、前記第４の核酸が、前記第１の核酸の配列、前記第２の核酸の配列、前記第３の核酸の配列、またはこれらのいずれかの組み合わせに相補的な配列を含む、請求項１５５に記載の組成物。
  157. 前記第４の核酸が、前記第３の核酸の前記配列および前記第１の核酸の前記配列または前記第２の核酸の前記配列に結合し、これにより、４方向分枝を作り出す、請求項１５６に記載の組成物。
  158. 前記４方向分枝が、少なくとも３個のオーバーハングを含む、請求項１５７に記載の組成物。
  159. 前記オーバーハングのうち少なくとも２個が、同じ配列または特有の配列を含む、請求項１５５または１５８に記載の組成物。
  160. 前記オーバーハングのうち少なくとも２個が、相補的配列を含む、請求項１５５または１５８に記載の組成物。
  161. 検出標識をさらに含む、請求項１５３〜１６０のいずれか一項に記載の組成物。
  162. 前記検出標識が、３方向分枝または４方向分枝を含む、請求項１６１に記載の組成物。
  163. 前記検出標識が、前記オーバーハングのうち前記少なくとも１個に相補的なオーバーハングを含む、請求項１６２に記載の組成物。
  164. 前記二本鎖核酸標識を検出標識と接触させるステップをさらに含む、請求項３２〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  165. 前記検出標識が、３方向分枝または４方向分枝を含む、請求項１６４に記載の方法。
  166. 前記検出標識が、前記二本鎖核酸標識の前記オーバーハングに相補的なオーバーハングを含む、請求項１６５に記載の方法。
  167. 前記検出標識が、直接的ハイブリダイゼーション、酵素的ライゲーションまたは化学的ライゲーションによって、前記二本鎖核酸標識の前記オーバーハングに連結される、請求項１６４〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
  168. 前記検出標識を第２の検出標識と接触させるステップをさらに含む、請求項１６４〜１６７のいずれか一項に記載の方法。
  169. 前記第２の検出標識が、３方向分枝または４方向分枝を含む、請求項１６８に記載の方法。
  170. 前記第２の検出標識が、前記検出標識の前記オーバーハングに相補的なオーバーハングを含む、請求項１６９に記載の方法。
  171. 前記少なくとも１個の検出標識が、前記二本鎖核酸標識の前記オーバーハングに相補的なオーバーハングを含む、請求項８６に記載の組成物。
  172. 前記少なくとも１個の検出標識が、３方向分枝または４方向分枝を含む、請求項１７１に記載の組成物。
  173. 前記少なくとも１個の検出標識が、直接的ハイブリダイゼーション、酵素的ライゲーションまたは化学的ライゲーションによって、前記二本鎖核酸標識の前記オーバーハングに連結される、請求項１７１または１７２に記載の組成物。
  174. 第２の検出標識をさらに含む、請求項１７１〜１７３のいずれか一項に記載の組成物。
  175. 前記第２の検出標識が、前記少なくとも１個の検出標識の前記オーバーハングに相補的なオーバーハングを含む、請求項１７４に記載の組成物。
  176. 前記第２の検出標識が、３方向分枝または４方向分枝を含む、請求項１７５に記載の組成物。
  177. 前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を含む、請求項１００〜１０３および１２８〜１３９のいずれか一項に記載のキット。
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