JP2020513795A - 前立腺癌検出 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2017年2月28日に出願された米国仮特許出願第62/464,800号に優先権を主張し、この出願の内容は、参照により、その全体が援用される。
本発明の科学技術の理解を促進するために、多数の用語及び語句を下記に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体を通して記載されている。
本明細書に提供されるのは、前立腺癌スクリーニングについての科学技術であり、特に排他的ではないが、前立腺癌の存在を検出するための方法、組成物、及び関連用途である。
いくつかの実施形態において、この科学技術は、表1、表3または表13からのDMR(DMR番号1〜140)を含むマーカーの組み合わせのメチル化状態を評価することに関する。いくつかの実施形態において、1個より多いマーカーのメチル化状態を評価することは、被検体中の新生物(たとえば、前立腺癌)を同定するためのスクリーンまたは診断の特異度及び/または感度を上昇させる。
5−メチルシトシンの存在について核酸を分析する、最も頻繁に使用されている方法は、DNA中の5−メチルシトシン、またはそれらの多様性の検出について、Frommer,et al.(Frommer et al.(1992)Proc.Natl. Acad.Sci.USA89:1827−31、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に明示的に援用される)によって記載される亜硫酸水素塩方法に基づく。5−メチルシトシンをマッピングする亜硫酸水素塩方法は、5−メチルシトシンではなく、シトシンが亜硫酸水素塩(hydrogen sulfite)(亜硫酸水素塩(bisulfite)としても知られている)のイオンと反応する知見に基づく。この反応をつぎのステップに従い通常実施する。第一に、シトシンは、亜硫酸水素塩と反応し、スルホン化されたシトシンを形成する。つぎに、スルホン化反応中間体の自発的脱アミノ化は、スルホン化されたウラシルをもたらす。最終的に、このスルホン化されたウラシルは、アルカリ状態下で脱スルホン化され、ウラシルを形成する。ウラシルがアデニンを含む塩基対を形成するが5−メチルシトシンがグアニンを含む塩基対を形成する(したがって、シトシンのように挙動する)ため検出が可能である。これは、たとえば、亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシング(Grigg G,&Clark S,Bioessays(1994)16:431−36;Grigg G,DNA Seq.(1996)6:189−98)、またはたとえば、米国特許第5,786,146号に開示されるようなメチル化特異的PCR(MSP)などによって、メチル化されていないシトシンとメチル化されたシトシンの判別を可能にする。
この科学技術のいくつかの実施形態において、つぎのステップ:
1)DMR(たとえば、表1及び13に提供されるような、たとえば、DMR1〜140)を含む少なくとも1つのマーカー内のメチル化されたCpGジヌクレオチドとメチル化されていないCpGジヌクレオチドとを区別する、少なくとも1つの試薬、または一連の試薬と、被検体から得られる核酸(たとえば、糞便試料または前立腺組織または血漿試料などの体液から単離される、たとえば、ゲノムDNA)を接触させるステップ、及び
2)前立腺癌を検出するステップ(たとえば、80%以上の感度、及び80%以上の特異度によって提供される)、
を含む方法を提供する。
1)ACOXL、AKR1B1_3644、ANXA2、CHST11_2206、FLJ45983、GAS6、GRASP、HAPLN3、HCG4P6、HES5_0822、ITPRIPL1、KCNK4、MAX.chr1.61519554−61519667、MAX.chr2.97193166−97193253、MAX.chr3.193、MAX.chr3.72788028−72788112、RAI1_7469、RASSF2、SERPINB9_3389、SLC4A11、及びTPM4_8047からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1つのマーカー内の、メチル化されたCpGジヌクレオチドとメチル化されていないCpGジヌクレオチドとを区別する、少なくとも1つの試薬、または一連の試薬と、被検体から得られる核酸(たとえば、糞便試料または前立腺組織などの体液から単離される、たとえば、ゲノムDNA)を接触させるステップ、ならびに
2)前立腺癌を検出するステップ(たとえば、80%以上の感度、及び80%以上の特異度によって提供される)、
を含む方法を提供する。
1)SERPINB9_3479、FLOT1_1665、HCG4P6_4618、CHST11_2206、MAX.chr12.485、GRASP_0932、GAS6_6425、MAX.chr3.193、MAX.chr2.971_3164、MAX.chr3.727_8028、HES5_0840、TPM4_8037、SLCO3A1_6187、ITPRIPL1_1244、AKR1B1_3644、RASGRF2_6325、ZNF655_6075、PAMR1_7364、ST6GALNAC2_1113、CCNJL_9070、KCNB2_9128、IGFBP7_6412、及びWNT3A_5487からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1つのマーカー内のメチル化されたCpGジヌクレオチドとメチル化されていないCpGジヌクレオチドとを区別する、少なくとも1つの試薬、または一連の試薬と、被検体から得られる核酸(たとえば、糞便試料または前立腺組織などの体液から単離される、たとえば、ゲノムDNA)を接触させるステップ、及び
2)前立腺癌を検出するステップ(たとえば、80%以上の感度、及び80%以上の特異度によって提供される)、
を含む方法を提供する。
1)max.chr3.193、HES5、SLCO3A1、及びTPM4_8047からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域から選択される少なくとも1つのマーカー内の、メチル化されたCpGジヌクレオチドとメチル化されていないCpGジヌクレオチドとを区別する、少なくとも1つの試薬、または一連の試薬と、被検体から得られる核酸(たとえば、血漿試料から単離される、たとえば、ゲノムDNA)を接触させるステップ、ならびに
2)前立腺癌を検出するステップ(たとえば、80%以上の感度、及び80%以上の特異度によって提供される)、
を含む方法を提供する。
この例は、実施例II、III、IV、V及びVIについての材料及び方法を提供する。
本研究は、Mayo Clinic Institutional Review Board(Rochester,MN)によって承認された。新鮮凍結(FF)組織、血漿、及びバフィーコート試料は、IRBに承認された患者バイオバンクによって提供された。腫瘍組織切片は、診断を確認し、新生物細胞充実性を推定するために、専門のGI病理学者によって再々度検討された。つぎに、これらの切片にマクロダイセクションを行った。QiaAmp Mini kit(Qiagen,Valencia CA)を使用してゲノムDNAを精製した後に、AMPure XPキット(Beckman Coulter,Brea CA)によって再精製した。
各試料のDNAの150ngを26ulのTe緩衝液(5.77ng/ul)中で希釈した。これは、1倍の最終濃度のCutSmart緩衝液(New England Biolabs)中で1ul(20単位)のMspIにより一晩、消化された。3’オーバーハングを末端修復し、2ul(10単位)のKlenow DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を含む、0.6ulの100mM dATP、0.06ulの100mM dCTP、及び0.06ulのdGTPの混合物によってAにテーリングを生じた。生成物を20分間30度で、20分間37度でインキュベートし、そして4度で保持した。末端修復後に、2倍のAgencourt Ampure XPビーズ(Beckman Coulter)によって生成物を精製し、2回70%のEtOHによって洗浄し、20ulの水中に溶出させた。16度で一晩インキュベートされた、1倍のT4リガーゼ緩衝液中で1ulのT4リガーゼ(400単位)を使用して、Illuminaアダプターをこの生成物に連結した。この生成物は、65度で20分間処置され、酵素を熱失活させた。連結後、2倍のAgencourt Ampure XPビーズ(Beckman Coulter)によって生成物を精製し、2回70%のEtOHによって洗浄し、47ulの水中で溶出させた。45ulの生成物は、それらのプロトコルに記載されるように、EZ−96DNAメチル化キット(Zymo Research)によって、亜硫酸水素塩で変換された。変換された生成物を2倍のAgencourt Ampure XPビーズ(Beckman Coulter)によって精製し、2回70%のEtOHによって洗浄し、22ulの水中で溶出させた。50ulの総容積中に、16ulの亜硫酸水素塩に変換された生成物(prodict)、1ul(2.5単位)のPfuTurbo Cx hotstart DNAポリメラーゼ、0.5ulのdNTP(それぞれ25mM)、6ulのIlluminaインデックス(それぞれ2.5uM)、及び1倍のPfuTurbo Cx hotstart DNAポリメラーゼ緩衝液を使用して、PCRを介してIlluminaインデックスを加えた。生成物は、0.7倍でAmpure XPを使用して、上澄みを採取した後に、1.2倍でAmpure XPを伴い、ビーズに結合したものを貯蔵したことにより選択された、デュアルサイズであった。最終生成物を40ul中に溶出させた。Pico Green(Molecular Probes)によってDNA分子量の収率を決定し、Tecan蛍光光度計上で測定した。High Sensitivity DNAチップによってAgilent2100(Agilent)上でDNAサイズを決定した。生成物のモル濃度を計算し、これらの試料を10nMに対して4試料/プールで等モルにプールした。
ランダム化されたレーン割り当てに従い、これらの試料をフローセル上にロードした。Mayo Clinic Medical Genome Facilityにおける次世代シーケンシングコアによってIllumina HiSeq2000上でシーケンシングを実施した。リードは、101サイクルに対して一方向であった。各フローセルレーンは、1億から1億2000万のリードを生成し、これは、アライメントを取った配列について30から50倍のシーケンシング深度の中央値カバレッジに十分であった。標準Illuminaパイプラインソフトウェアは、塩基を呼び出し、fastqフォーマット中でリードを生成した。配列リード評価及びクリーンアップ、基準ゲノムに対するアラインメント、メチル化状態抽出、ならびにCpG報告及びアノテーションのためにSAAP−RRBS(Reduced Representation Bisulfite Sequencing用の流線解析及びアノテーションパイプライン)を使用した。低カバレッジ(≦10)を有するCpGを除外した。第三級分析は、情報価値のない、または低い試料カバレッジのCpGを除外することからなり、スライドさせる100bpのウインドウ内で、低いバックグラウンド及び高密度のクラスターを含むメチル化されたCpG領域を特定する。リード深度基準は、症例と対照との間の%メチル化における10%の差異を検出する、所望の統計学上の能力に基づいた。統計的有意性は、リード計数に基づき、1DMRあたりのメチル化パーセンテージのロジスティック回帰によって決定された。個々の被検体にわたるリード深度を変えることを説明するために、過分散ロジスティック回帰モデルを使用し、そこで分散パラメータは、あてはめられたモデルから残差のピアソンのカイ二乗統計量を使用して推定された。DMRは、それらの有意性レベルに従いランク付けされ、さらに対照群中の%メチル化ががんにおいて≦1%及び≧10%であった場合を考察した。ほとんどの臓器部位において、これは、数百個の可能性のある候補をもたらした。利用された追加のフィルタは、受信者動作特性曲線(AUC)、%メチル化症例/対照倍率変化(FC)、及びDMR(及び対照におけるそれらの欠如)全体を通じてCpGの陽性試料間の同時メチル化の下での範囲であった。
上記に列挙された基準によって決定されるような、PCa発見データセットから120箇所の最も見込みのあるDMRについて、メチル化特異的PCR(MSP)マーカーアッセイを開発した。ソフトウェア(Methprimer−University of California,San Francisco CA)または手動のいずれか一方によって、プライマーを設計した。これらのアッセイをSYBR Green qPCRによって、亜硫酸水素塩に変換された対照(メチル化されたゲノムDNA及びメチル化されていないゲノムDNA)、変換されていない対照、及び非鋳型対照上で厳密に試験し、最適化した。陰性対照と交差反応させたアッセイを再設計したか、廃棄したかのいずれかであった。加えて、融解曲線分析を実施し、特異的増幅が起こっていたことを確実にした。技術的妥当性確認フェーズについて、RRBS発見に使用された同一試料をqMSPによって再試験した。メチル化盲検であるように設計された、β−アクチンアッセイを、合計のDNAコピーを表す共通因子として使用した。ロジスティック回帰によって、このデータを分析し、バックグラウンド結果に対するAUC及びシグナルを発見値と比較した。約27%のマーカーは、期待以下であり、除去された。qMSPによって、独立した組織試料の伸長セット上で、残り(N=72)を試験した。これらの結果をロジスティックに分析し、転帰測定基準は、AUC、FC、及びロバストな症例の試料の%メチル化であった。
最良のメチル化マーカーが前立腺外で実施した方法を評価するために、以前に配列決定された他の主ながん(結腸、膵臓、食道、肝臓、及び胃の)と比較して、前立腺試料にわたる妥当性確認DMRについてのシーケンシングリードを使用して、比較に基づくCpGの%メチル化マトリックスを構築した。マーカーの最終パネルを選択し、1)生体組織妥当性確認フェーズにおける全体的な性能、及び2)他のがんにわたるこれらのマーカーの部位特異的特性、に基づき血漿中で試験した。血液中のPCaを最も良く検出するために、非PCa DNAの過剰量を与え、汎用がんシグナル及び前立腺特異的がんシグナルの両方を示したロバストなマーカーパネルを選択した。
以下の自動化シリカビーズ方法(たとえば、米国特許出願第15/335,111号を参照する)によって、3〜4mLの預けられ、凍結された血漿からDNAを抽出した:
本実施例は、RRBS結果及び技術的妥当性確認結果を説明する。
独立したアーカイブ症例及び対照組織から抽出されたDNA上でのqMSP生物学的妥当性確認のために、実施例IIに記載される実験を通して特定された、最も良く実施した候補のマーカーを選択した。
前立腺組織内のPCaの7を上回るグリーソンスコア対6のグリーソンスコア間で区別することができるマーカーを特定する、追加の実験を行った。これらのような実験は、QuARTs−X(定量的アレル特異的リアルタイム標的及びシグナルアッセイ)を利用した(たとえば、米国特許出願第15/335,096号を参照する)。表5は、前立腺組織内で、PCaグリーソン7+対グリーソン6についての、100%でのマーカー感度、及び倍率変化を示す(オリゴ配列は表6に提供される)。
実験を行い、その中で候補のマーカー配列を汎がんRRBSシーケンシングデータセットにわたるインシリコと比較し、各マーカーについて部位特異的メチル化の程度を計測した。
実験を行い、盲検下独立血漿試料中で試験して、臨床培地中でのPCa検出を評価するために、1セットの高性能のPCaマーカーを選択した。
前立腺癌についての治療決定は、主観的であり、精度を欠く、グリーソングレードによって導かれることが多い。発見及び早期妥当性確認において、メチル化されたDNAマーカー(MDM)を予後関連によって特定した(実施例Iを参照する)。さらに実験を行い、前立腺全摘除術(RP)後、>12年経過観察によって、独立した群からのアーカイブ組織を使用して、生化学的な再発を予測する際に、新規のMDMの値を評価した。
追加の実験を行い、1)前立腺組織内のPCaの、7を上回るグリーソンスコア対6のグリーソンスコアと、2)6を上回るPCaのグリーソンスコア対非がん性前立腺組織とを区別することができるマーカーを特定した。これらのような実験は、QuARTs−X(定量的アレル特異的リアルタイム標的及びシグナルアッセイ)を利用した(たとえば、米国特許出願第15/335,096号を参照する)。
既知の臨床情報を有する、凍結DNA組織試料をMayo Clinicリポジトリから取得した。QiagenからのDNeasy Blood&Tissueキットを使用して、製造者のプロトコルに従い、DNAを組織から抽出した。約100ngの抽出されたDNAを、亜硫酸水素塩変換反応に進展させた。
1.10μLの阻害溶液をディープウェルプレート(DWP)中の各ウェルに加える。
2.各試料の80μLをDWP中に加える。
3.30〜40μLに設定されたピペットによるピペッティングによって、慎重に混合し、泡立つのを回避する。
4.1分間、3000xgでDWPを密封し、遠心分離した。
5.42℃で20分間インキュベートする。
6.各ウェルに120μLのBIS SLNを加える。
7.8分冷却する。
8.最初の3分中に混合しながら、65℃で75分間インキュベートする。
9.750μLのBND SLNを加える。
10.シリカビーズ(BND BDS)の予備混合、そしてDWPのウェルへの50μLのシリカビーズ(BND BDS)の追加。
11.30℃、1,200rpmで30分間、ヒーター振盪機上で混合する。
12.5分間、プレートマグネット上でビーズを結合させた後に、溶液を吸引し、破棄する。
13.1mLの洗浄緩衝液(CNV WSH)を加えた後に、プレートをヒーター振盪機へ移動させ、1,200rpmで3分間混合する。
14.5分間、プレートマグネット上でビーズを結合させた後に、溶液を吸引し、破棄する。
15.0.25mLの洗浄緩衝液(CNV WSH)を加えた後に、プレートをヒーター振盪機へ移動させ、1,200rpmで3分間混合する。
16.2分間、マグネット上でビーズを結合させた後に、溶液を吸引し、破棄する。
17.0.2mLの脱スルホン化緩衝液(DES SLN)を追加し、1,200rpmで7分間、30℃で混合する。
18.2分間、マグネット上でビーズを結合させた後に、溶液を吸引し、破棄する。
19.0.25mLの洗浄緩衝液(CNV WSH)を加えた後に、プレートをヒーター振盪機へ移動させ、1,200rpmで3分間混合する。
20.2分間、マグネット上でビーズを結合させた後に、溶液を吸引し、破棄する。
21.0.25mLの洗浄緩衝液(CNV WSH)を加えた後に、プレートをヒーター振盪機へ移動させ、1,200rpmで3分間混合する。
22.2分間、マグネット上でビーズを結合させた後に、溶液を吸引し、破棄する。
23.ヒーター振盪機へ移動させ、1,200rpmで混合しながら70℃で15分間インキュベートすることによって、プレートを乾燥させることを可能にする。
24.DWP中のすべての試料にわたり、80μLの溶出緩衝液(ELU BFR)を加える。
25.1,200rpmで混合しながら、65℃で25分間インキュベートする。
26.溶出液を96ウェルプレートへ手動で移動させ、ホイルシールによってプレートを密封した後に、−80℃で保管する。
27.回収可能/移動可能な容積は、約65μLである。
マルチプレックスPCR(mPCR)セットアップ:
1−対象となる各メチル化されたマーカーについての順方向プライマー及び逆方向プライマーをそれぞれ750nMの最終濃度まで含む10倍のプライマー混合物を調製する。10mMのTris−HCl、pH 8、0.1mMのEDTAを希釈液として使用する。
2−100mMのMOPSを、pH7.5、75mMのMgCl2、0.08%のTween20、0.08%のIGEPAL CA−630、2.5mMのdNTPを含む、10倍のmPCR緩衝液を調製する。
3−以下のようにmPCRマスターミックスを調製する:
5−25μLのマスターミックスを96ウェルのABI Veritiプレートに加える。
6−各試料の50μLを各ウェルに移動させ、上下に数回、ピペッティングすることによって各試料を混合する。
7−アルミニウムホイルシールによってプレートを密封する。
8−加熱蓋サーマルサイクラー中に置き、以下のプロファイル「QX12サイクル」を使用するサイクルに進む:
a.ディープウェルプレートを取得し、180μLの10mMのTris−HCl、pH8、0.1mMのEDTAを各ウェルに移動させる。
b.96ウェルスタンプによって増幅されたプレートのホイルシール中に穴を慎重に開ける。
c.新しいチップ、及び50μLに対して200μLのピペッターセット(エアロゾルを生成しない)を使用して、ピペッティングを繰り返すことによって、75μLの増幅された試料を混合する(混合のために振盪機を使用しない)。
d.新しいチップ、及び20μLに対して20μLのピペッターセット(エアロゾルを生成しない)を使用して、20μLの増幅された試料をそれぞれ予め充填されたウェルに加える。
e.新しいチップ、及び100μLに対して200μLのピペッターセット(エアロゾルを生成しない)を使用して、ピペッティングを繰り返すことによって、希釈された試料を混合する(混合のために振盪機を使用しない)。
f.希釈されたプレートをプラスチックシールによって密封する。
g.1,000rpmで1分間、希釈されたプレートを遠心分離する。
h.希釈されていない、いずれかの残りのmPCR生成物を新しいアルミニウムホイルシールによって密封する。−80℃で置く。
1−魚DNA希釈液(20ng/μL)を解凍し、このアッセイに必要とされるプラスミドキャリブレーターを希釈するために使用する。以下の表を希釈指針として使用する:
5−10μLの適切なキャリブレーターまたは希釈されたmPCR試料を加える。
6−プレートをABI透明プラスチックシールによって密封する。
7−1分間、3000rpmを使用して、プレートを遠心分離する。
8−つぎのサーマルプロトコル「Quarts 5+40」を実施するようにプログラミングされるABIサーマルサイクラー中に、プレートを置いた後に、この機器を起動させる。
1−1チューブの魚DNAの希釈液(20ng/μL)、2チューブの1.62倍のオリゴ混合物を解凍し、調製されたキャリブレーターシリーズをHamilton STARlet Deck上に置くために必要とする。
2−Hamilton STARlet Deck上に載せる前に、すべての試薬をボルテックスし、遠心分離する。
3−試料を含むディープウェルプレートをマグネット上に載せる。
4−以下の図に示されるように、50μLのCOREチップのフルトレイをデッキ上に置く。
5−以下の図に示されるように、少なくとも1ロウ全部のデッキ上に1000μLのCOREチップを置く。
6−バーコードを機械の正面に向けながら(後部左隅中のA1ウェルに関して)、以下の図面に示されるように、空のABI96ウェルプレートをSTARletデッキ上に載せる。
7−画面上のデッキレイアウト及びソフトウェアのインストラクションに従い、示されたキャリア位置中に試薬を載せる(以下の第二図を参照する)。
8−以下の図に示されるように、2個のキャップのないバーコードを付けられた空のチューブをデッキ上に載せる。
9−Hamilton上で「QuARTSONLYV4.0_BA_20160127」方法を実行する。
10−この方法を完了すると、96ウェルQuARTSプレートを取り除き、透明プラスチックカバーによって密封する。
11−1分間、3000rpmを使用して、プレートを遠心分離する。
12−つぎに、以下のサーマルプロトコルを実施するようにプログラミングされるABIサーマルサイクラー中にプレートを置いた後に、この機器:「Quarts5+40」を起動させる。
これらの実験は、
1)特異的メチル化DNAマーカー(SERPINB9_3479、GRASP_0932、SLCO3A1_6187、ITPRIPL1_1244、AKR1B1_3644、RASGRF2_6325、ZNF655_6075、PAMR1_7364、ST6GALNAC2_1113、CCNJL_9070、KCNB2_9128、IGFBP7_6412、及びWNT3A_5487)は、非常に高悪性度のがん性前立腺組織(たとえば7.0以上(たとえば、7、8、9、10)のグリーソンスコア)を低悪性度のがん性前立腺組織(たとえば、7未満(たとえば、6)のグリーソンスコア)と区別すること、ならびに、
2)特異的メチル化DNAマーカー(SERPINB9_3479、FLOT1_1665、HCG4P6_4618、CHST11_2206、MAX.chr12.485、GRASP_0932、GAS6_6425、MAX.chr3.193、MAX.chr2.971_3164、MAX.chr3.727_8028、HES5_0840、TPM4_8037、SLCO3A1_6187、ITPRIPL1_1244、AKR1B1_3644、RASGRF2_6325、ZNF655_6075、PAMR1_7364、ST6GALNAC2_1113、CCNJL_9070、KCNB2_9128、IGFBP7_6412、及びWNT3A_5487)は、がん性前立腺組織(たとえば、6.0以上(たとえば、6、7、8、9、10)のグリーソンスコアを非がん性前立腺組織と区別すること、
を特定した。
Claims (105)
- ヒト患者からの試料を特徴付ける方法であって、
a)DNAをヒト患者の試料から取得すること、
b)表1または13からの可変メチル化領域(DMR)1〜140からなる群から選択されるDMR中の塩基を含むDNAメチル化マーカーのメチル化状態をアッセイすること、
c)前記1個以上のDNAメチル化マーカーの前記アッセイされたメチル化状態を、前立腺癌を有さないヒト患者についての前記1個以上のDNAメチル化マーカーについてのメチル化レベル基準と比較すること、
を備える、前記方法。 - 前記試料は、糞便試料、組織試料、前立腺組織試料、血液試料、血漿試料、または尿試料である、請求項1に記載の前記方法。
- 前記試料は、前立腺組織試料であり、前記DMRは、DMR番号63、3、64、70、7、39、8、10、11、12、14、41、81、16、17、18、20、21、44、25、及び47から選択される、または
前記試料は、血漿試料であり、前記DMRは、DMR番号17、12、45、及び47から選択される、
請求項1に記載の前記方法。 - 複数のDNAメチル化マーカーをアッセイすることを備える、請求項1に記載の前記方法。
- 2から11個のDNAメチル化マーカーをアッセイすることを備える、請求項1に記載の前記方法。
- 12から140個のDNAメチル化マーカーをアッセイすることを備える、請求項1に記載の前記方法。
- 前記試料中の前記1個以上のDNAメチル化マーカーの前記メチル化状態をアッセイすることは、1塩基の前記メチル化状態を決定することを備える、請求項1に記載の前記方法。
- 前記試料中の前記1個以上のDNAメチル化マーカーの前記メチル化状態をアッセイすることは、複数の塩基においてメチル化の程度を決定することを備える、請求項1に記載の前記方法。
- 順鎖のメチル化状態をアッセイすること、または逆鎖のメチル化状態をアッセイすることを備える、請求項1に記載の前記方法。
- 前記DNAメチル化マーカーは、100以下の塩基の1領域である、請求項1に記載の前記方法。
- 前記DNAメチル化マーカーは、500以下の塩基の1領域である、請求項1に記載の前記方法。
- 前記DNAメチル化マーカーは、1000以下の塩基の1領域である、請求項1に記載の前記方法。
- 前記DNAメチル化マーカーは、5000以下の塩基の1領域である、請求項1に記載の前記方法。
- 前記DNAメチル化マーカーは、1塩基である、請求項1に記載の前記方法。
- 前記DNAメチル化マーカーは、高CpG密度プロモーター中にある、請求項1に記載の前記方法。
- 前記アッセイは、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、またはターゲットキャプチャーを使用することを備える、請求項1に記載の前記方法。
- 前記アッセイは、配列番号:1〜234から選択されるメチル化特異的オリゴヌクレオチドの使用を備える、請求項1に記載の前記方法。
- ACOXL、AKR1B1_3644、ANXA2、CHST11_2206、FLJ45983、GAS6、GRASP、HAPLN3、HCG4P6、HES5_0822、ITPRIPL1、KCNK4、MAX.chr1.61519554−61519667、MAX.chr2.97193166−97193253、MAX.chr3.193、MAX.chr3.72788028−72788112、RAI1_7469、RASSF2、SERPINB9_3389、SLC4A11、及びTPM4_8047からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、前記DNAメチル化マーカーを含む、請求項1に記載の前記方法。
- SERPINB9_3479、FLOT1_1665、HCG4P6_4618、CHST11_2206、MAX.chr12.485、GRASP_0932、GAS6_6425、MAX.chr3.193、MAX.chr2.971_3164、MAX.chr3.727_8028、HES5_0840、TPM4_8037、SLCO3A1_6187、ITPRIPL1_1244、AKR1B1_3644、RASGRF2_6325、ZNF655_6075、PAMR1_7364、ST6GALNAC2_1113、CCNJL_9070、KCNB2_9128、IGFBP7_6412、及びWNT3A_5487からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、前記DNAメチル化マーカーを含む、請求項1に記載の前記方法。
- max.chr3.193、HES5、SLCO3A1、及びTPM4_8047からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、前記DNAメチル化マーカーを含む、請求項1に記載の前記方法。
- ヒト患者から取得される試料を特徴付ける方法であって、
a)表1及び13からのDMR1〜140からなる群から選択されるDMR中の塩基を含む前記試料中のDNAメチル化マーカーのメチル化状態を決定すること、
b)前記患者試料からの前記DNAメチル化マーカーの前記メチル化状態を、前立腺癌を有さないヒト被検体からの正常な対照試料からの前記DNAメチル化マーカーのメチル化状態と比較すること、
c)前記ヒト患者及び前記正常な対照試料の前記メチル化状態における差異の信頼区間及び/またはp値を決定すること、
を備える、前記方法。 - 前記信頼区間は、90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%であり、前記p値は、0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001、または0.0001である、請求項21に記載の前記方法。
- ヒト被検体から取得される試料を特徴付ける方法であって、
DMRを含む核酸を亜硫酸水素塩試薬と反応させ、亜硫酸水素塩と反応した核酸を生成すること、
前記亜硫酸水素塩と反応した核酸を配列決定し、前記亜硫酸水素塩と反応した核酸のヌクレオチド配列を提供すること、
前記亜硫酸水素塩と反応した核酸の前記ヌクレオチド配列を、前立腺癌を有さない被検体からの前記DMRを含む核酸のヌクレオチド配列と比較し、前記2個の配列中の差異を特定すること、
を備える、前記方法。 - ヒト被検体から取得される試料を特徴付けるシステムであって、
試料の前記メチル化状態を決定するように構成される分析コンポーネント、
前記試料の前記メチル化状態を、データベースに記録される対照試料または基準試料メチル化状態と比較するように構成されるソフトウェアコンポーネント、及び
メチル化状態の組み合わせに基づき単一値を決定し、前立腺癌関連メチル化状態のユーザに警告するように構成される警告コンポーネント、
を備える、前記システム。 - 前記試料は、DMRを含有する核酸を含む、請求項24に記載の前記システム。
- 核酸を単離するコンポーネントをさらに備える、請求項24に記載の前記システム。
- 試料を採取するコンポーネントをさらに含む、請求項24に記載の前記システム。
- 前記試料は、糞便試料、組織試料、前立腺組織試料、血液試料、血漿試料、または尿試料である、請求項24に記載の前記システム。
- 前記データベースは、DMRを含有する核酸配列を含む、請求項24に記載の前記システム。
- 前記データベースは、前立腺癌を有さない被検体からの核酸配列を含む、請求項24に記載の前記システム。
- 被検体から取得される試料中で前立腺癌についてスクリーニングする方法であって、
1)被検体から取得される試料中のマーカーのメチル化状態をアッセイすること、及び
2)前記マーカーの前記メチル化状態が前立腺癌を有さない被検体にアッセイされる前記マーカーのメチル化状態と異なるときに前立腺癌を有すると前記被検体を特定すること、
を備え、
前記マーカーは表1または13からDMR1〜140からなる群から選択される可変メチル化領域(DMR)中に塩基を含む、
前記方法。 - 複数のマーカーをアッセイすることを備える、請求項31に記載の前記方法。
- 前記試料中の前記マーカーの前記メチル化状態をアッセイすることは、1塩基の前記メチル化状態を決定することを備える、請求項31に記載の前記方法。
- 前記試料中の前記マーカーの前記メチル化状態をアッセイすることは、複数の塩基においてメチル化の程度を決定することを備える、請求項31に記載の前記方法。
- 前記マーカーの前記メチル化状態は、前記マーカーの正常なメチル化状態と比較して、前記マーカーの増加した、または減少したメチル化を備える、請求項31に記載の前記方法。
- 前記マーカーの前記メチル化状態は、前記マーカーの正常なメチル化状態と比較して、前記マーカーのメチル化の異なるパターンを有する、請求項31に記載の前記方法。
- 順鎖のメチル化状態をアッセイすること、または逆鎖のメチル化状態をアッセイすることを備える、請求項31に記載の前記方法。
- 前記マーカーは、100以下の塩基の1領域である、請求項31に記載の前記方法。
- 前記マーカーは、500以下の塩基の1領域である、請求項31に記載の前記方法。
- 前記マーカーは、1000以下の塩基の1領域である、請求項31に記載の前記方法。
- 前記マーカーは、5000以下の塩基の1領域である、請求項31に記載の前記方法。
- 前記マーカーは、1塩基である、請求項31に記載の前記方法。
- 前記マーカーは、高CpG密度プロモーター中にある、請求項31に記載の前記方法。
- 前記試料は、糞便試料、組織試料、前立腺組織試料、血液試料、血漿試料、または尿試料である、請求項31に記載の前記方法。
- 前記アッセイは、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、またはターゲットキャプチャーを使用することを備える、請求項31に記載の前記方法。
- 前記アッセイは、配列番号:1〜234からなる群から選択されるメチル化特異的オリゴヌクレオチドの使用を備える、請求項31に記載の前記方法。
- ACOXL、AKR1B1_3644、ANXA2、CHST11_2206、FLJ45983、GAS6、GRASP、HAPLN3、HCG4P6、HES5_0822、ITPRIPL1、KCNK4、MAX.chr1.61519554−61519667、MAX.chr2.97193166−97193253、MAX.chr3.193、MAX.chr3.72788028−72788112、RAI1_7469、RASSF2、SERPINB9_3389、SLC4A11、及びTPM4_8047からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、前記マーカーを含む、請求項31に記載の前記方法。
- SERPINB9_3479、FLOT1_1665、HCG4P6_4618、CHST11_2206、MAX.chr12.485、GRASP_0932、GAS6_6425、MAX.chr3.193、MAX.chr2.971_3164、MAX.chr3.727_8028、HES5_0840、TPM4_8037、SLCO3A1_6187、ITPRIPL1_1244、AKR1B1_3644、RASGRF2_6325、ZNF655_6075、PAMR1_7364、ST6GALNAC2_1113、CCNJL_9070、KCNB2_9128、IGFBP7_6412、及びWNT3A_5487からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、前記マーカーを含む、請求項31に記載の前記方法。
- max.chr3.193、HES5、SLCO3A1、及びTPM4_8047からなる群から選択されるアノテーションを有する染色体領域は、前記マーカーを含む、請求項31に記載の前記方法。
- 1)亜硫酸水素塩試薬、及び
2)表1及び13からDMR1〜140からなる群から選択されるDMRからの配列を含み、前立腺癌を有さない被検体と関連するメチル化状態を有する対照核酸、
を含む、キット。 - 亜硫酸水素塩試薬及びオリゴヌクレオチドを請求項47に従い含む、キット。
- 被検体から試料を取得する試料コレクター、
前記試料から核酸を単離する試薬、
亜硫酸水素塩試薬、及び
オリゴヌクレオチド、
を請求項47に従い備える、キット。 - 前記試料は、糞便試料、組織試料、前立腺組織試料、血液試料、血漿試料、または尿試料である、請求項52に記載の前記キット。
- DMR及び亜硫酸水素塩試薬を含有する核酸を含む、組成物。
- DMR及びオリゴヌクレオチドを含有する核酸を請求項47に従い含む、組成物。
- DMR及びメチル化感受性制限酵素を含有する核酸を含む、組成物。
- DMR及びポリメラーゼを含有する核酸を含む、組成物。
- 被検体から取得される試料中で前立腺癌についてスクリーニングする方法であって、
a)表1及び13からのDMR1〜140からなる群から選択されるDMR中に塩基を含む前記試料中のマーカーのメチル化状態を決定すること、
b)前記被検体試料からの前記マーカーの前記メチル化状態を、前立腺癌を有さない被検体からの正常な対照試料からの前記マーカーのメチル化状態と比較すること、
c)前記被検体試料及び前記正常な対照試料の前記メチル化状態における差異の信頼区間及び/またはp値を決定すること、
を備える、前記方法。 - 前記信頼区間は、90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%、99.9%、または99.99%であり、前記p値は、0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001、または0.0001である、請求項58に記載の前記方法。
- 被検体から取得される試料中の前立腺癌についてスクリーニングする方法であって、
DMRを含む核酸を亜硫酸水素塩試薬と反応させ、亜硫酸水素塩と反応した核酸を生成すること、
前記亜硫酸水素塩と反応した核酸を配列決定し、前記亜硫酸水素塩と反応した核酸のヌクレオチド配列を提供すること、
前記亜硫酸水素塩と反応した核酸の前記ヌクレオチド配列を、前立腺癌を有さない被検体からの前記DMRを含む核酸のヌクレオチド配列と比較し、前記2個の配列中の差異を特定すること、及び
差異が存在するときに前記被検体を、前立腺癌を有すると特定すること、
を備える、前記方法。 - 被検体から取得される試料中の前立腺癌についてスクリーニングするシステムであって、
試料の前記メチル化状態を決定するように構成される分析コンポーネント、
前記試料の前記メチル化状態を、データベースに記録される対照試料または基準試料メチル化状態と比較するように構成されるソフトウェアコンポーネント、及び
メチル化状態の組み合わせに基づき単一値を決定し、前立腺癌関連メチル化状態のユーザに警告するように構成される警告コンポーネント、
を備える、前記システム。 - 前記試料は、DMRを含有する核酸を含む、請求項61に記載の前記システム。
- 核酸を単離するコンポーネントをさらに備える、請求項61に記載の前記システム。
- 試料を採取するコンポーネントをさらに含む、請求項61に記載の前記システム。
- 糞便試料、前立腺組織試料、血液試料、及び/または血漿試料を採取するコンポーネントをさらに備える、請求項61に記載の前記システム。
- 前記データベースは、DMRを含有する核酸配列を含む、請求項61に記載の前記システム。
- 前記データベースは、前立腺癌を有さない被検体からの核酸配列を含む、請求項61に記載の前記システム。
- 各核酸は、DMRを含有する配列を含む、1セットの単離された核酸。
- 各核酸は、前立腺癌を有さない被検体からの配列を含む、請求項68に記載の前記1セットの核酸。
- 請求項68または69に従う前記1セットの核酸、及び前記1セットの核酸と関連する核酸配列のデータベースを含む、システム。
- 亜硫酸水素塩試薬をさらに含む、請求項70に記載の前記システム。
- 核酸シーケンサーをさらに備える、請求項70に記載の前記システム。
- 生物学的試料を特徴付ける方法であって、
(a)ヒト個体の生物学的試料中のACOXL、AKR1B1_3644、ANXA2、CHST11_2206、FLJ45983、GAS6、GRASP、HAPLN3、HCG4P6、HES5_0822、ITPRIPL1、KCNK4、MAX.chr1.61519554−61519667、MAX.chr2.97193166−97193253、MAX.chr3.193、MAX.chr3.72788028−72788112、RAI1_7469、RASSF2、SERPINB9_3389、SLC4A11、及びTPM4_8047から選択される2個以上の遺伝子についてのCpG部位のメチル化レベルを、
前記生物学的試料中のゲノムDNAを亜硫酸水素塩によって処置すること、
前記選択された2個以上の遺伝子についてのプライマーの以下のセット:
ACOXLについての配列番号:93及び94からなる1セットのプライマー、
AKR1B1_3644についての配列番号:27及び28からなる1セットのプライマー、
ANXA2についての配列番号:89及び90からなる1セットのプライマー、
CHST11_2206についての配列番号:85及び86からなる1セットのプライマー、
FLJ45983についての配列番号:31及び32からなる1セットのプライマー、
GAS6についての配列番号:117及び118からなる1セットのプライマー、
GRASPについての配列番号:33及び34からなる1セットのプライマー、
HAPLN3についての配列番号:37及び38からなる1セットのプライマー、
HCG4P6についての配列番号:39及び40からなる1セットのプライマー、
HES5_0822についての配列番号:41及び42からなる1セットのプライマー、
ITPRIPL1についての配列番号:45及び46からなる1セットのプライマー、
KCNK4についての配列番号:125及び126からなる1セットのプライマー、
MAX.chr1.61519554−61519667についての配列番号:91及び92からなる1セットのプライマー、
MAX.chr2.97193166−97193253についての配列番号:49及び50からなる1セットのプライマー、
MAX.chr3.193についての配列番号:51及び52からなる1セットのプライマー、
MAX.chr3.72788028−72788112についての配列番号:53及び54からなる1セットのプライマー、
RAI1_7469についての配列番号:55及び56からなる1セットのプライマー、
RASSF2についての配列番号:57及び58からなる1セットのプライマー、
SERPINB9_3389についての配列番号:129及び130からなる1セットのプライマー、
SLC4A11についての配列番号:59及び60からなる1セットのプライマー、及び、
TPM4_8047についての配列番号:123及び124からなる1セットのプライマー、
を使用して、前記亜硫酸水素塩に処置されたゲノムDNAを増幅すること、及び
メチル化特異的PCR、定量的メチル化特異的PCR、メチル化感受性DNA制限酵素分析、定量的亜硫酸水素塩パイロシーケンシング、または亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングPCRによって前記CpG部位の前記メチル化レベルを決定すること、
を通じて、測定すること、
(b)前記メチル化レベルを、前立腺癌を有さない対照試料中の対応する1セットの遺伝子のメチル化レベルと比較すること、ならびに
(c)前記2個以上の遺伝子において測定される前記メチル化レベルがそれぞれの前記対照試料において測定される前記メチル化レベルより高いときに、前記個体が前立腺癌を有すると判定すること、
を備える、前記方法。 - 前記生物学的試料は、血液試料または組織試料である、請求項73に記載の前記方法。
- 前記組織は、前立腺組織である、請求項74に記載の前記方法。
- 前記CpG部位は、コード領域または調節領域中に存在する、請求項73に記載の前記方法。
- 2個以上の遺伝子についてのCpG部位の前記メチル化レベルを前記測定することは、前記CpG部位の前記メチル化スコアを決定すること、及び前記CpG部位の前記メチル化頻度を決定することからなる群から選択される決定を備える、請求項73に記載の前記方法。
- 血漿試料を特徴付ける方法であって、
(a)ヒト個体の血漿試料中のmax.chr3.193、HES5、SLCO3A1、及びTPM4_8047から選択される2個以上の遺伝子についてのCpG部位のメチル化レベルを、
前記生物学的試料中のゲノムDNAを亜硫酸水素塩によって処置すること、
前記選択された2個以上の遺伝子についての以下の1セットのプライマー:
max.chr3.193についての配列番号:174及び175からなる1セットのプライマー、
HES5についての配列番号:180及び181からなる1セットのプライマー、
SLCO3A1についての配列番号:171及び172からなる1セットのプライマー、及び
TPM4_8047についての配列番号:189及び190からなる1セットのプライマー、
を使用して前記亜硫酸水素塩に処置されたゲノムDNAを増幅すること、及び
メチル化特異的PCR、定量的メチル化特異的PCR、メチル化感受性DNA制限酵素分析、定量的亜硫酸水素塩パイロシーケンシング、または亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングPCRによって前記CpG部位の前記メチル化レベルを決定すること、
を通じて、測定すること、
(b)前記メチル化レベルを、前立腺癌を有さない対照試料中の対応する1セットの遺伝子のメチル化レベルと比較すること、ならびに
(c)前記2個以上の遺伝子において測定される前記メチル化レベルがそれぞれの前記対照試料において測定される前記メチル化レベルより高いときに、前記個体が前立腺癌を有すると判定すること、
を備える、前記方法。 - 前記CpG部位は、コード領域または調節領域中に存在する、請求項78に記載の前記方法。
- 2個以上の遺伝子についてのCpG部位の前記メチル化レベルを前記測定することは、前記CpG部位の前記メチル化スコアを決定すること、及び前記CpG部位の前記メチル化頻度を決定することからなる群から選択される決定を備える、請求項78に記載の前記方法。
- 生物学的試料を特徴付ける方法であって、
生物学的試料が前記ヒト個体からの前立腺組織試料である場合に、ヒトの前記生物学的試料中のACOXL、AKR1B1_3644、ANXA2、CHST11_2206、FLJ45983、GAS6、GRASP、HAPLN3、HCG4P6、HES5_0822、ITPRIPL1、KCNK4、MAX.chr1.61519554−61519667、MAX.chr2.97193166−97193253、MAX.chr3.193、MAX.chr3.72788028−72788112、RAI1_7469、RASSF2、SERPINB9_3389、SLC4A11、及びTPM4_8047、または
生物学的試料がヒト個体からの血漿試料である場合に、前記ヒト個体の前記生物学的試料中のmax.chr3.193、HES5、SLCO3A1、及びTPM4_8047、
のいずれか一方から選択される2個以上の遺伝子についてのCpG部位のメチル化レベルを、
前記生物学的試料中のゲノムDNAを亜硫酸水素塩によって処置すること、
前記選択された2個以上の遺伝子についての1セットのプライマーを使用して前記亜硫酸水素塩に処置されたゲノムDNAを増幅すること、ならびに
メチル化特異的PCR、定量的メチル化特異的PCR、メチル化感受性DNA制限酵素分析、定量的亜硫酸水素塩パイロシーケンシング、または亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングPCRによって前記CpG部位の前記メチル化レベルを決定すること、
を通じて、測定すること、
を備える、前記方法。 - 前記メチル化レベルを、前立腺癌を有さない対照試料中の対応する1セットの遺伝子のメチル化レベルと比較すること、及び
前記2個以上の遺伝子において測定される前記メチル化レベルがそれぞれの前記対照試料において測定される前記メチル化レベルより高いときに、前記個体が前立腺癌を有すると判定すること、
をさらに備える、請求項81に記載の前記方法。 - 前記生物学的試料が組織試料である場合に、前記選択された2個以上の遺伝子についての以下の1セットのプライマー:
ACOXLについての配列番号:93及び94からなる1セットのプライマー、
AKR1B1_3644についての配列番号:27及び28からなる1セットのプライマー、
ANXA2についての配列番号:89及び90からなる1セットのプライマー、
CHST11_2206についての配列番号:85及び86からなる1セットのプライマー、
FLJ45983についての配列番号:31及び32からなる1セットのプライマー、
GAS6についての配列番号:117及び118からなる1セットのプライマー、
GRASPについての配列番号:33及び34からなる1セットのプライマー、
HAPLN3についての配列番号:37及び38からなる1セットのプライマー、
HCG4P6についての配列番号:39及び40からなる1セットのプライマー、
HES5_0822についての配列番号:41及び42からなる1セットのプライマー、
ITPRIPL1についての配列番号:45及び46からなる1セットのプライマー、
KCNK4についての配列番号:125及び126からなる1セットのプライマー、
MAX.chr1.61519554−61519667についての配列番号:91及び92からなる1セットのプライマー、
MAX.chr2.97193166−97193253についての配列番号:49及び50からなる1セットのプライマー、
MAX.chr3.193についての配列番号:51及び52からなる1セットのプライマー、
MAX.chr3.72788028−72788112についての配列番号:53及び54からなる1セットのプライマー、
RAI1_7469についての配列番号:55及び56からなる1セットのプライマー、
RASSF2についての配列番号:57及び58からなる1セットのプライマー、
SERPINB9_3389についての配列番号:129及び130からなる1セットのプライマー、
SLC4A11についての配列番号:59及び60からなる1セットのプライマー、
TPM4_8047についての配列番号:123及び124からなる1セットのプライマー、
を使用する、請求項81に記載の前記方法。 - 前記生物学的試料が血漿試料である場合に、前記選択された2個以上の遺伝子についての以下の1セットのプライマー:
max.chr3.193についての配列番号:174及び175からなる1セットのプライマー、
HES5についての配列番号:180及び181からなる1セットのプライマー、
SLCO3A1についての配列番号:171及び172からなる1セットのプライマー、ならびに
TPM4_8047についての配列番号:189及び190からなる1セットのプライマー、
を使用する、請求項81に記載の前記方法。 - 前記組織試料は、前立腺組織試料である、請求項81に記載の前記方法。
- 前記CpG部位は、コード領域または調節領域中に存在する、請求項81に記載の前記方法。
- 2個以上の遺伝子についてのCpG部位の前記メチル化レベルを前記測定することは、前記CpG部位の前記メチル化スコアを決定すること、及び前記CpG部位の前記メチル化頻度を決定することからなる群から選択される決定を備える、請求項81に記載の前記方法。
- 生物学的試料を特徴付ける方法であって、
(a)ヒト個体の生物学的試料中のSERPINB9_3479、FLOT1_1665、HCG4P6_4618、CHST11_2206、MAX.chr12.485、GRASP_0932、GAS6_6425、MAX.chr3.193、MAX.chr2.971_3164、MAX.chr3.727_8028、HES5_0840、TPM4_8037、SLCO3A1_6187、ITPRIPL1_1244、AKR1B1_3644、RASGRF2_6325、ZNF655_6075、PAMR1_7364、ST6GALNAC2_1113、CCNJL_9070、KCNB2_9128、IGFBP7_6412、及びWNT3A_5487から選択される2個以上の遺伝子についてのCpG部位のメチル化レベルを、
前記生物学的試料中の遺伝子DNAを亜硫酸水素塩によって処置すること、
前記選択された2個以上の遺伝子についての以下の1セットのプライマーを使用して前記亜硫酸水素塩に処置されたゲノムDNAを増幅すること、及び
メチル化特異的PCR、定量的メチル化特異的PCR、メチル化感受性DNA制限酵素分析、定量的亜硫酸水素塩パイロシーケンシング、または亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングPCRによって前記CpG部位の前記メチル化レベルを決定すること、
を通じて、測定すること、
(b)前記メチル化レベルを、前立腺癌を有さない対照試料中の対応する1セットの遺伝子のメチル化レベルと比較すること、ならびに
(c)前記2個以上の遺伝子において測定される前記メチル化レベルがそれぞれの前記対照試料において測定される前記メチル化レベルより高いときに、前記個体が前立腺癌を有すると判定すること、
を備える、前記方法。 - 前記生物学的試料は、血液試料または組織試料である、請求項88に記載の前記方法。
- 前記組織は、前立腺組織である、請求項89に記載の前記方法。
- 前記CpG部位は、コード領域または調節領域中に存在する、請求項88に記載の前記方法。
- 2個以上の遺伝子についてのCpG部位の前記メチル化レベルを前記測定することは、前記CpG部位の前記メチル化スコアを決定すること、及び前記CpG部位の前記メチル化頻度を決定することからなる群から選択される決定を備える、請求項88に記載の前記方法。
- 前記選択された2個以上の遺伝子についての前記1セットのプライマーは、
MAX.chr3.727_8028についての配列番号:177及び178または177及び219からなる1セットのプライマー、
RASGRF2_6325についての配列番号:220及び221からなる1セットのプライマー、
ZNF655_6075についての配列番号:210及び211からなる1セットのプライマー、
PAMR1_7364についての配列番号:223及び224からなる1セットのプライマー、
ST6GALNAC2_1113についての配列番号:216及び217からなる1セットのプライマー、
CCNJL_9070についての配列番号:229及び230からなる1セットのプライマー、
KCNB2_9128についての配列番号:213及び214からなる1セットのプライマー、
IGFBP7_6412についての配列番号:226及び227からなる1セットのプライマー、
WNT3A_5487についての配列番号:232及び233からなる1セットのプライマー、
SERPINB9_3479についての配列番号:147及び148からなる1セットのプライマー、
FLOT1_1665についての配列番号:150及び151からなる1セットのプライマー、
HCG4P6_4618についての配列番号:153及び154からなる1セットのプライマー、
CHST11_2206についての配列番号:156及び157からなる1セットのプライマー、
MAX.chr12.485についての配列番号:159及び160からなる1セットのプライマー、
GRASP_0932についての配列番号:162及び163からなる1セットのプライマー、
GAS6_6425についての配列番号:165及び166からなる1セットのプライマー、
MAX.chr3.193についての配列番号:174及び175からなる1セットのプライマー、
MAX.chr2.971についての配列番号:198及び199からなる1セットのプライマー、
HES5_0840についての配列番号:180及び181からなる1セットのプライマー、
TPM4_8037についての配列番号:189及び190からなる1セットのプライマー、
SLCO3A1_6187についての配列番号:171及び172からなる1セットのプライマー、
ITPRIPL1_1244についての配列番号:195及び196からなる1セットのプライマー、ならびに
AKR1B1_3644についての配列番号:201及び202からなる1セットのプライマー、
から選択される、請求項88に記載の前記方法。 - がん性前立腺組織を特徴付ける方法であって、
(a)ヒト個体の生物学的試料中のSERPINB9_3479、GRASP_0932、SLCO3A1_6187、ITPRIPL1_1244、AKR1B1_3644、RASGRF2_6325、ZNF655_6075、PAMR1_7364、ST6GALNAC2_1113、CCNJL_9070、KCNB2_9128、IGFBP7_6412、及びWNT3A_5487から選択される2個以上の遺伝子についてのCpG部位のメチル化レベルを、
前記生物学的試料中のゲノムDNAを亜硫酸水素塩によって処置すること、
前記選択された2個以上の遺伝子についての以下の1セットのプライマーを使用して前記亜硫酸水素塩に処置されたゲノムDNAを増幅すること、及び
メチル化特異的PCR、定量的メチル化特異的PCR、メチル化感受性DNA制限酵素分析、定量的亜硫酸水素塩パイロシーケンシング、または亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングPCRによって前記CpG部位の前記メチル化レベルを決定すること、
を通じて、測定すること、
(b)前記メチル化レベルを、6のグリーソンスコアを有する前立腺癌組織からの対応する1セットの遺伝子のメチル化レベルと比較すること、ならびに
(c)前記2個以上の遺伝子において測定される前記メチル化レベルが6のグリーソンスコアを有する前立腺癌組織からの前記対応する1セットの遺伝子において測定される前記メチル化レベルより高いときに、前記個体が7を上回るグリーソンスコアを有する前立腺癌組織を含むと判定すること、
を備える、前記方法。 - 前記CpG部位は、コード領域または調節領域中に存在する、請求項94に記載の前記方法。
- 2個以上の遺伝子についてのCpG部位の前記メチル化レベルを前記測定することは、前記CpG部位の前記メチル化スコアを決定すること、及び前記CpG部位の前記メチル化頻度を決定することからなる群から選択される決定を備える、請求項94に記載の前記方法。
- 前記選択された2個以上の遺伝子についての前記1セットのプライマーは、
SERPINB9_3479についての配列番号:147及び148からなる1セットのプライマー、
GRASP_0932についての配列番号:162及び163からなる1セットのプライマー、
SLCO3A1_6187についての配列番号:171及び172からなる1セットのプライマー、
ITPRIPL1_1244についての配列番号:195及び196からなる1セットのプライマー、
AKR1B1_3644についての配列番号:201及び202からなる1セットのプライマー、
RASGRF2_6325についての配列番号:220及び221からなる1セットのプライマー、
ZNF655_6075についての配列番号:210及び211からなる1セットのプライマー、
PAMR1_7364についての配列番号:223及び224からなる1セットのプライマー、
ST6GALNAC2_1113についての配列番号:216及び217からなる1セットのプライマー、
CCNJL_9070についての配列番号:229及び230からなる1セットのプライマー、
KCNB2_9128についての配列番号:213及び214からなる1セットのプライマー、
IGFBP7_6412についての配列番号:226及び227からなる1セットのプライマー、ならびに
WNT3A_5487についての配列番号:232及び233からなる1セットのプライマー、
から選択される、請求項94に記載の前記方法。 - SERPINB9_3479、FLOT1_1665、HCG4P6_4618、CHST11_2206、MAX.chr12.485、GRASP_0932、GAS6_6425、MAX.chr3.193、MAX.chr2.971_3164、MAX.chr3.727_8028、HES5_0840、TPM4_8037、SLCO3A1_6187、ITPRIPL1_1244、AKR1B1_3644、RASGRF2_6325、ZNF655_6075、PAMR1_7364、ST6GALNAC2_1113、CCNJL_9070、KCNB2_9128、IGFBP7_6412、及びWNT3A_5487から選択される遺伝子中の1つ以上のCpG部位の前記メチル化レベルを測定する方法であって、
a)前立腺癌を有するのではないかと疑われる、またはこれを有するヒト個体の生物学的試料からゲノムDNAを抽出すること、
b)前記抽出されたゲノムDNAを亜硫酸水素塩によって処置すること、
c)SERPINB9_3479、FLOT1_1665、HCG4P6_4618、CHST11_2206、MAX.chr12.485、GRASP_0932、GAS6_6425、MAX.chr3.193、MAX.chr2.971_3164、MAX.chr3.727_8028、HES5_0840、TPM4_8037、SLCO3A1_6187、ITPRIPL1_1244、AKR1B1_3644、RASGRF2_6325、ZNF655_6075、PAMR1_7364、ST6GALNAC2_1113、CCNJL_9070、KCNB2_9128、IGFBP7_6412、及びWNT3A_5487から選択される遺伝子中の前記1つ以上のCpG部位に特異的なプライマー対からなるプライマーによって前記亜硫酸水素塩に処置されたゲノムDNAを増幅すること、ならびに
d)メチル化特異的PCR、定量的メチル化特異的PCR、メチル化感受性DNA制限酵素分析または亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングPCRによって、SERPINB9_3479、FLOT1_1665、HCG4P6_4618、CHST11_2206、MAX.chr12.485、GRASP_0932、GAS6_6425、MAX.chr3.193、MAX.chr2.971_3164、MAX.chr3.727_8028、HES5_0840、TPM4_8037、SLCO3A1_6187、ITPRIPL1_1244、AKR1B1_3644、RASGRF2_6325、ZNF655_6075、PAMR1_7364、ST6GALNAC2_1113、CCNJL_9070、KCNB2_9128、IGFBP7_6412、及びWNT3A_5487から選択される遺伝子中の1つ以上のCpG部位の前記メチル化レベルを測定すること、
を備える、前記方法。 - 前記試料は、前立腺組織試料である、請求項98に記載の前記方法。
- SERPINB9_3479、FLOT1_1665、HCG4P6_4618、CHST11_2206、MAX.chr12.485、GRASP_0932、GAS6_6425、MAX.chr3.193、MAX.chr2.971_3164、MAX.chr3.727_8028、HES5_0840、TPM4_8037、SLCO3A1_6187、ITPRIPL1_1244、AKR1B1_3644、RASGRF2_6325、ZNF655_6075、PAMR1_7364、ST6GALNAC2_1113、CCNJL_9070、KCNB2_9128、IGFBP7_6412、及びWNT3A_5487に特異的な前記プライマー対は、
MAX.chr3.727_8028についての配列番号:177及び178または177及び219からなる1セットのプライマー、
RASGRF2_6325についての配列番号:220及び221からなる1セットのプライマー、
ZNF655_6075についての配列番号:210及び211からなる1セットのプライマー、
PAMR1_7364についての配列番号:223及び224からなる1セットのプライマー、
ST6GALNAC2_1113についての配列番号:216及び217からなる1セットのプライマー、
CCNJL_9070についての配列番号:229及び230からなる1セットのプライマー、
KCNB2_9128についての配列番号:213及び214からなる1セットのプライマー、
IGFBP7_6412についての配列番号:226及び227からなる1セットのプライマー、
WNT3A_5487についての配列番号:232及び233からなる1セットのプライマー、
SERPINB9_3479についての配列番号:147及び148からなる1セットのプライマー、
FLOT1_1665についての配列番号:150及び151からなる1セットのプライマー、
HCG4P6_4618についての配列番号:153及び154からなる1セットのプライマー、
CHST11_2206についての配列番号:156及び157からなる1セットのプライマー、
MAX.chr12.485についての配列番号:159及び160からなる1セットのプライマー、
GRASP_0932についての配列番号:162及び163からなる1セットのプライマー、
GAS6_6425についての配列番号:165及び166からなる1セットのプライマー、
MAX.chr3.193についての配列番号:174及び175からなる1セットのプライマー、
MAX.chr2.971についての配列番号:198及び199からなる1セットのプライマー、
HES5_0840についての配列番号:180及び181からなる1セットのプライマー、
TPM4_8037についての配列番号:189及び190からなる1セットのプライマー、
SLCO3A1_6187についての配列番号:171及び172からなる1セットのプライマー、
ITPRIPL1_1244についての配列番号:195及び196からなる1セットのプライマー、ならびに
AKR1B1_3644についての配列番号:201及び202からなる1セットのプライマー、
からなる、請求項98に記載の前記方法。 - ACOXL、AKR1B1_3644、ANXA2、CHST11_2206、FLJ45983、GAS6、GRASP、HAPLN3、HCG4P6、HES5_0822、ITPRIPL1、KCNK4、MAX.chr1.61519554−61519667、MAX.chr2.97193166−97193253、MAX.chr3.193、MAX.chr3.72788028−72788112、RAI1_7469、RASSF2、SERPINB9_3389、SLC4A11、及びTPM4_8047から選択される遺伝子中の1つ以上のCpG部位の前記メチル化レベルを測定する方法であって、
a)前立腺癌を有するのではないかと疑われる、またはこれを有するヒト個体の生物学的試料からゲノムDNAを抽出すること、
b)前記抽出されたゲノムDNAを亜硫酸水素塩によって処置すること、
c)ACOXL、AKR1B1_3644、ANXA2、CHST11_2206、FLJ45983、GAS6、GRASP、HAPLN3、HCG4P6、HES5_0822、ITPRIPL1、KCNK4、MAX.chr1.61519554−61519667、MAX.chr2.97193166−97193253、MAX.chr3.193、MAX.chr3.72788028−72788112、RAI1_7469、RASSF2、SERPINB9_3389、SLC4A11、及びTPM4_8047から選択される遺伝子中の前記1つ以上のCpG部位に特異的なプライマー対からなるプライマーによって前記亜硫酸水素塩に処置されたゲノムDNAを増幅すること、ならびに
d)メチル化特異的PCR、定量的メチル化特異的PCR、メチル化感受性DNA制限酵素分析または亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングPCRによって、ACOXL、AKR1B1_3644、ANXA2、CHST11_2206、FLJ45983、GAS6、GRASP、HAPLN3、HCG4P6、HES5_0822、ITPRIPL1、KCNK4、MAX.chr1.61519554−61519667、MAX.chr2.97193166−97193253、MAX.chr3.193、MAX.chr3.72788028−72788112、RAI1_7469、RASSF2、SERPINB9_3389、SLC4A11、及びTPM4_8047から選択される遺伝子中の1つ以上のCpG部位の前記メチル化レベルを測定すること、
を備える、前記方法。 - 前記試料は、前立腺組織試料である、請求項101に記載の前記方法。
- ACOXL、AKR1B1_3644、ANXA2、CHST11_2206、FLJ45983、GAS6、GRASP、HAPLN3、HCG4P6、HES5_0822、ITPRIPL1、KCNK4、MAX.chr1.61519554−61519667、MAX.chr2.97193166−97193253、MAX.chr3.193、MAX.chr3.72788028−72788112、RAI1_7469、RASSF2、SERPINB9_3389、SLC4A11、及びTPM4_8047に特異的な前記プライマー対は、
ACOXLについての配列番号:93及び94からなる1セットのプライマー、
AKR1B1_3644についての配列番号:27及び28からなる1セットのプライマー、
ANXA2についての配列番号:89及び90からなる1セットのプライマー、
CHST11_2206についての配列番号:85及び86からなる1セットのプライマー、
FLJ45983についての配列番号:31及び32からなる1セットのプライマー、
GAS6についての配列番号:117及び118からなる1セットのプライマー、
GRASPについての配列番号:33及び34からなる1セットのプライマー、
HAPLN3についての配列番号:37及び38からなる1セットのプライマー、
HCG4P6についての配列番号:39及び40からなる1セットのプライマー、
HES5_0822についての配列番号:41及び42からなる1セットのプライマー、
ITPRIPL1についての配列番号:45及び46からなる1セットのプライマー、
KCNK4についての配列番号:125及び126からなる1セットのプライマー、
MAX.chr1.61519554−61519667についての配列番号:91及び92からなる1セットのプライマー、
MAX.chr2.97193166−97193253についての配列番号:49及び50からなる1セットのプライマー、
MAX.chr3.193についての配列番号:51及び52からなる1セットのプライマー、
MAX.chr3.72788028−72788112についての配列番号:53及び54からなる1セットのプライマー、
RAI1_7469についての配列番号:55及び56からなる1セットのプライマー、
RASSF2についての配列番号:57及び58からなる1セットのプライマー、
SERPINB9_3389についての配列番号:129及び130からなる1セットのプライマー、
SLC4A11についての配列番号:59及び60からなる1セットのプライマー、ならびに
TPM4_8047についての配列番号:123及び124からなる1セットのプライマー、
からなる、請求項101に記載の前記方法。 - max.chr3.193、HES5、SLCO3A1、及びTPM4_8047から選択される遺伝子中の1つ以上のCpG部位の前記メチル化レベルを測定する方法であって、
a)前立腺癌を有するのではないかと疑われる、またはこれを有するヒト個体の血漿試料からゲノムDNAを抽出すること、
b)前記抽出されたゲノムDNAを亜硫酸水素塩によって処置すること、
c)max.chr3.193、HES5、SLCO3A1、及びTPM4_8047から選択される遺伝子中の前記1つ以上のCpG部位に特異的なプライマー対からなるプライマーによって前記亜硫酸水素塩に処置されたゲノムDNAを増幅すること、ならびに
d)メチル化特異的PCR、定量的メチル化特異的PCR、メチル化感受性DNA制限酵素分析または亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングPCRによって、max.chr3.193、HES5、SLCO3A1、及びTPM4_8047から選択される遺伝子中の1つ以上のCpG部位の前記メチル化レベルを測定すること、
を備える、前記方法。 - max.chr3.193、HES5、SLCO3A1、及びTPM4_8047に特異的な前記プライマー対は、
max.chr3.193についての配列番号:174及び175からなる1セットのプライマー、
HES5についての配列番号:180及び181からなる1セットのプライマー、
SLCO3A1についての配列番号:171及び172からなる1セットのプライマー、ならびに
TPM4_8047についての配列番号:189及び190からなる1セットのプライマー、
からなる、請求項98に記載の前記方法。
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