JP2020510632A - セレブロンに対する小分子の親和性の測定方法 - Google Patents

Abstract

複合体は、そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、Ｃｙ５コンジュゲート小分子を含み、そのＣｙ５コンジュゲート小分子は、そのＣＲＢＮと結合し、治療化合物を特定するために、その複合体を使用すること。【選択図】図１

Description

相互参照
本願は、２０１７年２月３日に出願した米国特許仮出願第６２／４５４，６５４号の優先権の権利を主張するものであり、この出願の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

１． 技術分野
本開示は広くは、セレブロンと２つの光感受性分子とを含む複合体と、セレブロンと化合物との親和性の測定方法と、治療効果を持つ可能性のある化合物を特定するために、上記の複合体を用いることに関するものである。

２． 背景技術
タンパク質のセレブロン（ＣＲＢＮ）には、少なくとも２つのアイソフォームが存在し、一方は４４２個のアミノ酸分の長さであり、もう一方は４４１個のアミノ酸分の長さであり、ＣＲＢＮは、植物からヒトまで保存されている。ヒトでは、ＣＲＢＮ遺伝子は、常染色体劣性非症候群性精神遅滞（ＡＲＮＳＭＲ）の候補遺伝子として同定されている。Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００４，６３：１９２７−１９３１を参照されたい。ＣＲＢＮは当初、ラット脳内でカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質（ＳＬＯ１）と相互作用するＲＧＳを含有する新しいタンパク質として特徴付けられ、後に、網膜内でＡＭＰＫ１及びＤＤＢ１とともに電位依存性塩素チャネル（ＣＩＣ−２）と相互作用することが示された。Ｊｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，２００５，９４：１２１２−１２２４、Ｈｏｈｂｅｒｇｅｒ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２００９，５８３：６３３−６３７、Ａｎｇｅｒｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４３：５９０−５９３を参照されたい。ＤＤＢ１は元々、損傷ＤＮＡ結合タンパク質２（ＤＤＢ２）と会合するヌクレオチド除去修復タンパク質として同定された。その活性に異常があると、色素性乾皮症相補性Ｅ群（ＸＰＥ）の患者で修復欠損を引き起こす。ＤＤＢ１はまた、標的タンパク質のユビキチン化と、それに続くプロテアソーム分解を媒介する多数の異なるＤＣＸ（ＤＤＢ１−ＣＵＬ４−Ｘ−ボックス）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ複合体の構成要素として機能すると見られる。ＣＲＢＮもまた、大脳皮質の疾患に対する治療剤の開発の標的として同定されている。ＷＯ２０１０／１３７５４７Ａ１を参照されたい。

ＣＲＢＮは最近、いくつかの治療化合物、例えば、サリドマイド、ポマリドミド及びレナリドマイドに結合する重要な分子標的として同定された。これらの薬物は、ＣＲＢＮを標的とし、そのユビキチンリガーゼの基質特異性を改変して、特定のがん細胞において臨床活性を誘導する。結合した基質は、ＣＲＢＮ−ＣＲＬ４複合体によってユビキチン化され、その結果、２６Ｓプロテアソームによって分解される。ＣＲＢＮとこれらの化合物との相互作用を理解することで、有効性及び／または毒性の分子機構を定義可能になり、有効性及び毒性プロファイルが改善した薬物をもたらすことができる。

３． 発明の概要
一態様では、本発明で提供するのは、（ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、（ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子とを含む複合体であって、そのＣｙ５コンジュゲート小分子が、そのＣＲＢＮと結合する複合体である。

いくつかの実施形態では、この複合体は、ＤＤＢ１をさらに含む。

いくつかの実施形態では、そのＣｙ５コンジュゲート小分子は、ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する。

具体的な実施形態では、このＣｙ５コンジュゲート小分子は、下に示されている式（Ｉ）の構造を有する。

別の態様では、本発明で提供するのは、化合物がセレブロン（ＣＲＢＮ）に結合するかの判断方法であって、その化合物を複合体と接触させることを含み、その複合体が、（ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、（ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子を含み、そのＣｙ５コンジュゲート小分子がそのＣＲＢＮと結合する方法である。

いくつかの実施形態では、この複合体は、ＤＤＢ１をさらに含む。

いくつかの実施形態では、そのＣｙ５コンジュゲート小分子は、ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する。

具体的な実施形態では、このＣｙ５コンジュゲート小分子は、下に示されている式（Ｉ）の構造を有する。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させた後に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させる前に、ＦＲＥＴを測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させた後に、ＦＲＥＴが減少した場合に、その化合物がそのＣＲＢＮに結合すると判断することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴは、３４０ｎｍで励起して、６１５ｎｍでの発光（Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ発光）と６６５ｎｍでの発光（ＦＲＥＴ発光）をモニタリングすることによって観察する。

いくつかの実施形態では、その化合物をその複合体と接触させる前に、第１のＦＲＥＴ効率を求め、その化合物をその複合体と接触させた後に、第２のＦＲＥＴ効率を求め、このＦＲＥＴ効率は、６１５ｎｍでのＮｏｎ−ＦＲＥＴ発光に対する６６５ｎｍでのＦＲＥＴ発光の比率である。

いくつかの実施形態では、この方法は、その第２のＦＲＥＴ効率が、その第１のＦＲＥＴ効率よりも低い場合に、その化合物がそのＣＲＢＮに結合すると判断することをさらに含む。

さらに別の態様では、本発明で提供するのは、セレブロン（ＣＲＢＮ）に対する化合物の親和性の測定方法であって、その化合物を複合体と接触させることを含み、その複合体が、（ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、（ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子とを含み、そのＣｙ５コンジュゲート小分子がそのＣＲＢＮと結合する方法である。

いくつかの実施形態では、この複合体は、ＤＤＢ１をさらに含む。

いくつかの実施形態では、そのＣｙ５コンジュゲート小分子は、ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する。

具体的な実施形態では、このＣｙ５コンジュゲート小分子は、下に示されている式（Ｉ）の構造を有する。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させた後に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させる前に、ＦＲＥＴを測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴは、３４０ｎｍで励起して、６１５ｎｍでの発光（Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ発光）と６６５ｎｍでの発光（ＦＲＥＴ発光）をモニタリングすることによって観察する。

いくつかの実施形態では、その化合物をその複合体と接触させる前に、第１のＦＲＥＴ効率を求め、その化合物をその複合体と接触させた後に、第２のＦＲＥＴ効率を求め、このＦＲＥＴ効率は、６１５ｎｍでのＮｏｎ−ＦＲＥＴ発光に対する６６５ｎｍでのＦＲＥＴ発光の比率である。

いくつかの実施形態では、ＣＲＢＮに対するその化合物の親和性は、その第１のＦＲＥＴ効率とその第２のＦＲＥＴ効率との差を測定することによって求める。

さらに別の態様では、本発明で提供するのは、疾患を治療するための化合物の特定方法であって、その化合物を複合体と接触させることを含み、その複合体が、（ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、（ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子とを含み、そのＣｙ５コンジュゲート小分子がそのＣＲＢＮと結合する方法である。

いくつかの実施形態では、この複合体は、ＤＤＢ１をさらに含む。

いくつかの実施形態では、そのＣｙ５コンジュゲート小分子は、ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する。

具体的な実施形態では、このＣｙ５コンジュゲート小分子は、下に示されている式（Ｉ）の構造を有する。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させた後に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させる前に、ＦＲＥＴを測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させた後に、ＦＲＥＴが減少した場合に、その疾患の治療に、その化合物を使用できる可能性があり得ると判断することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴは、３４０ｎｍで励起して、６１５ｎｍでの発光（Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ発光）と６６５ｎｍでの発光（ＦＲＥＴ発光）をモニタリングすることによって観察する。

いくつかの実施形態では、その化合物をその複合体と接触させる前に、第１のＦＲＥＴ効率を求め、その化合物をその複合体と接触させた後に、第２のＦＲＥＴ効率を求め、このＦＲＥＴ効率は、６１５ｎｍでのＮｏｎ−ＦＲＥＴ発光に対する６６５ｎｍでのＦＲＥＴ発光の比率である。

いくつかの実施形態では、この方法は、その第２のＦＲＥＴ効率が、その第１のＦＲＥＴ効率よりも低い場合に、その疾患の治療に、その化合物を使用できる可能性があると判断することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この疾患は、ＣＲＢＮ介在性疾患である。

さらに別の態様では、本発明で提供するのは、本発明で提供する複合体を含む組成物である。

４． 図面の簡単な説明
小分子がセレブロンに結合する工程を示している。

セレブロンへの小分子の結合を判断するための、ＨＴＲＦベースのアッセイを示している。

セレブロンに対する化合物Ｂ、レナリドマイド及びポマリドミドのＴＲ−ＦＲＥＴによる相対的な結合親和性を示している。これらの条件下でのＩＣ５０は、レナリドマイド（○）では１．５μＭ、ポマリドミド（◇）では１．２μＭ、化合物Ｂ（□）では６０ｎｍであった。

化合物Ｂによる基質分解を示している。パートａ）は、化学発光の細胞ベースのアッセイによる、Ｉｋａｒｏｓの分解の定量結果を示している。求められたＥＣ_５０は、レナリドマイド（○）では６７ｎＭ、ポマリドミド（◇）では２４ｎＭ、化合物Ｂ（□）では１ｎＭであった。パートｂ）は、化学発光の細胞ベースのアッセイによる、Ａｉｏｌｏｓの分解の定量結果を示している。求められたＥＣ_５０は、レナリドマイド（○）では８７ｎＭ、ポマリドミド（◇）では２２ｎＭ、化合物Ｂ（□）では０．５ｎＭであった。パートｃ）は、示されている濃度でＤＭＳＯ、レナリドマイド、ポマリドミドまたは化合物Ｂと５時間インキュベートしたＤＦ１５細胞とＯＰＭ２細胞の全細胞抽出物のイムノブロット解析結果を示している。

ＤＤＢ１と化合物との複合体におけるセレブロンの結晶構造を示している。パートａ）は、ＤＤＢ１と化合物Ｂとの複合体におけるセレブロンの結晶構造を示している。挿入図は、結合した化合物Ｂの詳細を示しており、そのグルタルイミド環は、トリＴｒｐポケットに収まっており、そのフェニル環は、セレブロンのＥ３７７、Ｈ３７８、Ｐ３５２及びＨ３５３によって形成されている溝内にあるイソインドリノンから延びている。パートｂ）は、レナリドマイドとセレブロン（左パネル）及び化合物Ｂとセレブロン（右パネル）の結合表面相互作用の比較を示している。アミノ酸側鎖Ｆ１５０が表示されている。

５． 詳細な説明
様々ながんを治療するための免疫調節薬を含むいくつかの化合物は、ＣＲＬ４（ＣＵＬ４−ＲＢＸ１−ＤＤＢ１）ユビキチンリガーゼ複合体に対する基質レセプターであるセレブロン（ＣＲＢＮ）を標的とするとともに、このユビキチンリガーゼの基質特異性を変更して、がん細胞において臨床活性を誘導することが示されてきている。今では、いくつかの研究で、サリドマイドのような抗がん薬の作用機序には、タンパク質のＣＲＢＮへの結合が含まれることが示されているので、これらの薬物とＣＲＢＮとの結合について理解すれば有益であり、最終的には、治療効果の向上した新たな薬物を開発する助けとなる。

すなわち、当該技術分野では、様々な化合物とＣＲＢＮとの親和性の試験方法を開発して、ＣＲＢＮ結合性の新たな治療化合物を特定するニーズが存在する。

本発明で提供するのはとりわけ、化合物とＣＲＢＮとの親和性を測定し、ＣＲＢＮに結合する新たな小分子を特定し、これらの化合物の相対的親和性を定量するための迅速かつ容易に拡張可能なアッセイである。

セレブロン親和性、基質親和性、ならびにユビキチン化と分解の効率を含め、小分子の効能は、作用機序における多くの様々な工程によって誘導できる（図１を参照）。我々は、小分子がセレブロンに結合する工程を分離することによって、セレブロンへの各分子の結合が効能に寄与していると判断して、細胞活性を必要とせずに、化学反応の開始点を見出すことができる。

構造研究により、特定の臨床化合物が、そのグルタルイミド環を通じてセレブロンに結合し、ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケットに収まることが示されている。

下記の実施例に記載されているように（６項を参照）、本開示の新たなＨＴＲＦベースのアッセイは、ＣＲＢＮと化合物との高い親和性と低い親和性の両方を判断するための感度のよいハイスループットなスクリーニングフォーマットをもたらす。本開示の新たなＨＴＲＦベースのアッセイでは、ＣＲＢＮと、ドナー発色団またはフルオロフォアと、アクセプター発色団またはフルオロフォアとを含む複合体を使用する。より具体的には、本発明で提供する方法では、そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、セレブロンのトリトリプトファンポケット内で結合するＣｙ５コンジュゲート小分子とを含む複合体を使用する。ＣＲＢＮ結合化合物は、ＣＲＢＮのＮ末端のユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体とＣｙ５コンジュゲート小分子との相互作用及び／または立体配置を妨げることができ、その結果、ＦＲＥＴシグナルが低下する（図２を参照）。したがって、ＦＲＥＴを解析することによって、その化合物とＣＲＢＮとの親和性を求めることができる。本発明で提供するアッセイは、高親和性分子と、グルタルイミドのような低親和性断片のＩＣ５０を測定できる。このアッセイを用いて、既存の小分子と新規小分子について、小分子の親和性と細胞での効能を比較することもできる。

５．１ 定義
特許、出願、公開出願及びその他の刊行物はいずれも、参照により、本明細書に援用される。別段の定めのない限り、本明細書で使用するすべての技術用語と科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書用語に複数の定義が存在する場合には、別段の記載のない限り、本項の定義を優先する。

本明細書で使用する場合、「投与する」または「投与」とは、その物質が体外で存在している際の状態で、物質を患者に、粘膜送達、皮内送達、静脈内送達、筋肉内送達及び／または本明細書に記載されているかもしくは当該技術分野において知られているいずれかの他の物理的送達方法などによって注射したり、または別段の形で物理的に送達したりする行為を指す。疾患、障害もしくは状態、またはその症状を治療するときには、物質の投与は典型的には、疾患、障害もしくは状態、またはその症状の発症後に行う。疾患、障害もしくは状態、またはその症状を予防するときには、物質の投与は典型的には、疾患、障害もしくは状態、またはその症状の発症前に行う。

「がん」及び「がん性」という用語は、典型的には細胞の無秩序な成長によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはこの状態を説明するものである。がんの例としては、血液腫瘍（例えば、多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病）、ならびに固形腫瘍が挙げられるが、これらに限らない。他の例示的ながんは、本明細書の別の箇所に示されている。

「セレブロン」または「ＣＲＢＮ」という用語と、類似の用語は、ヒトＣＲＢＮタンパク質（例えば、ヒトＣＲＢＮアイソフォーム１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７３８６、またはヒトＣＲＢＮアイソフォーム２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１６６９５３、それぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される）のようないずれかのＣＲＢＮのアミノ酸配列を含むポリペプチド（「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では同義的に用いる）と、関連するポリペプチド（そのＳＮＰバリアントを含む）を指す。関連するＣＲＢＮポリペプチドには、特定の実施形態では、ＣＲＢＮ活性を保持し、及び／または抗ＣＲＢＮ免疫応答を起こすのに充分であるアレルバリアント（例えばＳＮＰバリアント）、スプライスバリアント、断片、誘導体、置換バリアント、欠失バリアント、挿入バリアント、融合ポリペプチド及び種間ホモログが含まれる。

本明細書で使用する場合、「セレブロン関連タンパク質」または「ＣＲＢＮ関連タンパク質」という用語は、直接または間接的に、ＣＲＢＮと相互作用するか、またはＣＲＢＮに結合するタンパク質を指す。特定の実施形態では、「セレブロン関連タンパク質」または「ＣＲＢＮ関連タンパク質」とは、ＣＲＢＮの基質、例えば、ＣＲＢＮを含むＥ３ユビキチンリガーゼ複合体のタンパク質基質、またはその下流基質である。特定の実施形態では、「セレブロン関連タンパク質」または「ＣＲＢＮ関連タンパク質」とは、ＣＲＢＮの結合タンパク質である。

「ＣＲＢＮ改変剤」または「ＣＭＡ」という用語は、ＣＲＢＮ Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を直接または間接的に調節する分子を指す。いくつかの実施形態では、ＣＭＡは、ＣＲＢＮに直接結合して、ＣＲＢＮタンパク質のコンホメーション変化を誘導できる。別の実施形態では、ＣＭＡは、ＣＲＢＮ Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の他のサブユニットに直接結合できる。

本明細書で使用する場合、「免疫調節化合物」または「免疫調節薬」という用語は概して、免疫応答を何らかの方法で改変できる分子または薬剤を指す。

本明細書で使用する場合、「組成物」という用語には、所定の成分（例えば、本発明で提供する複合体）を任意に所定の量で含む生成物と、所定の成分を任意に所定の量で組み合わせたことに直接または間接的に起因するいずれかの生成物が含まれように意図されている。

「有効量」または「治療有効量」という用語は、本明細書で使用する場合、所定の疾患、障害もしくは状態、及び／またはそれに関連する症状の重症度及び／または期間を低減及び／または改善するのに充分である、治療剤の量を指す。この用語には、所定の疾患、障害もしくは状態の進行もしくは増悪の低減もしくは改善、所定の疾患、障害もしくは状態の再発、発現もしくは発症の低減もしくは改善、及び／または別の治療剤の予防効果もしくは治療効果（複数可）の向上もしくは増進に必要な量も含まれる。いくつかの実施形態では、「有効量」または「治療有効量」は、本明細書で使用する場合、本発明で提供する治療剤の量のうち、所定の結果をもたらす量も指す。

「製薬学的に許容可能な」という用語は、本明細書で使用する場合、動物用として、より詳細にはヒト用として、連邦政府もしくは州政府の規制当局に認可されていること、またはＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａもしくはその他の概ね認識されているＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａに掲載されていることを意味する。

本明細書で使用する場合、別段に示されていない限り、「製薬学的に許容可能な塩」という用語には、その用語が言及している化合物の無毒の酸付加塩と塩基付加塩が含まれる。許容可能な無毒の酸付加塩には、当該技術分野において知られている有機及び無機の酸または塩基（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、ソルビン酸、アコニット酸、サリチル酸、フタル酸、エンボル酸、エナント酸などが挙げられる）に由来する塩が含まれる。

天然において酸性である化合物は、様々な製薬学的に許容可能な塩基と塩を形成できる。このような酸性化合物の製薬学的に許容可能な塩基付加塩を調製するのに用いることができる塩基は、無毒の塩基付加塩、すなわち、薬理学的に許容可能なカチオンを含む塩（以下に限らないが、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、特には、カルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩またはカリウム塩など）を形成する塩基である。好適な有機塩基としては、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン，ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、リシン及びプロカインが挙げられるが、これらに限らない。

本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語（本明細書では同義的に用いられている）は、３つ以上のアミノ酸が連続した配列で、ペプチド結合を通じて連結されているアミノ酸ポリマーを指す。「ポリペプチド」という用語には、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質アナログ、オリゴペプチドなどが含まれる。ポリペプチドという用語は、本明細書で使用する場合、ペプチドも指すことができる。ポリペプチドを構成するアミノ酸は、天然由来であっても、合成したものであってもよい。ポリペプチドは、生体試料から精製できる。

「難治性または耐性」という用語は、患者が、集中的な治療後でも、そのリンパ系、血液及び／または造血組織（例えば骨髄）に残存がん細胞（例えば、白血病細胞またはリンパ腫細胞）を有する状況を指す。

本明細書で使用する場合、別段に示されていない限り、「溶媒和物」という用語は、本発明で提供する化合物またはその塩であって、非共有結合分子間力により結合された溶媒を化学量論的量または非化学量論的量でさらに含む化合物またはその塩を意味する。溶媒が水である場合、溶媒和物は水和物である。

本明細書で使用する場合、別段に示されていない限り、「立体異性体的に純粋な」という用語は、化合物の立体異性体を１つ含むとともに、その化合物の他の立体異性体を実質的に含まない組成物を意味する。例えば、キラル中心を１つ有する化合物の立体異性体的に純粋な組成物は、その化合物の逆のエナンチオマーを実質的に含まないことになる。２つのキラル中心を有する化合物の立体異性体的に純粋な組成物は、その化合物の他のジアステレオマーを実質的に含まないことになる。典型的な立体異性体的に純粋な化合物は、その化合物の１つの立体異性体を約８０重量％超と、その化合物の他の立体異性体を約２０重量％未満、その化合物の１つの立体異性体を約９０重量％超と、その化合物の他の立体異性体を約１０重量％未満、その化合物の１つの立体異性体を約９５重量％超と、その化合物の他の立体異性体を約５重量％未満、及びその化合物の１つの立体異性体を約９７重量％超と、その化合物の他の立体異性体を約３重量％未満含む。本明細書で使用する場合、別段に示されていない限り、「立体異性的に濃縮された」という用語は、化合物の１つの立体異性体を約６０重量％超、化合物の１つの立体異性体を約７０重量％超、約８０重量％超を含む組成物を意味する。本明細書で使用する場合、別段に示されていない限り、「エナンチオマー的に純粋な」という用語は、キラル中心を１つ有する化合物の立体異性体的に純粋な組成物を意味する。同様に、「立体異性的に濃縮された」という用語は、キラル中心を１つ有する化合物の立体異性的に濃縮された組成物を意味する。

本明細書で使用する場合、「対象」と「患者」という用語は、同義的に用いられている。本明細書で使用する場合、対象は、霊長類動物以外の動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類動物（例えば、サル及びヒト）のような哺乳動物であることができる。具体的実施形態では、対象はヒトである。一実施形態では、対象は、疾患、障害または状態を有する哺乳動物（例えばヒト）である。別の実施形態では、対象は、疾患、障害または状態を発症するリスクのある哺乳動物（例えばヒト）である。

本明細書で使用する場合、「療法」という用語は、所定の疾患、障害または状態の予防、管理、治療及び／または改善で使用できるいずれかのプロトコール、方法及び／または薬剤を指す。特定の実施形態では、「療法（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）」及び「療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、所定の疾患、障害または状態の予防、管理、治療及び／または改善に有用な薬物療法、生物学的療法、支持療法及び／またはその他の療法であって、当業者（医療従事者など）に知られている療法である。

本明細書で使用する場合、別段の定めのない限り、「治療する」、「治療すること」及び「治療」という用語は、患者が所定の疾患、障害または状態を罹患しているときに行う行為を指す。本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療」及び「治療すること」という用語は、疾患、障害または状態の増悪、重症度及び／または期間の軽減または改善であって、１つ以上の療法の実施に起因する軽減または改善を指す。

本発明で提供する実施形態の実施の際には、別段に示されていない限り、分子生物学、微生物学及び免疫学の従来の技法であって、当業者の技術の範囲内である技法を用いることになる。このような技法は、文献で充分に説明されている。参照するのに特に好適なテキストの例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．）、Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ ＳＪ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｓｃｏｐｅｓ（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）及びＤ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶが挙げられる。

５．２ ＣＲＢＮと光感受性分子とを含む複合体
本発明で提供するのは、例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合する化合物をスクリーニングするか、または別段の形で特定する組成物、方法及びキットである。

一態様では、本発明で提供するのは、ＣＲＢＮを含む複合体であり、その複合体は、ドナー発色団またはフルオロフォアと、アクセプター発色団またはフルオロフォアをさらに含む。いくつかの実施形態では、そのドナー発色団もしくはフルオロフォア、またはアクセプター発色団もしくはフルオロフォアは、ＣＲＢＮのＮ末端に結合する。いくつかの実施形態では、そのドナー発色団もしくはフルオロフォア、またはアクセプター発色団もしくはフルオロフォアは、ＣＲＢＮの化合物結合性ポケットに結合する。より具体的ないくつかの実施形態では、ドナー発色団もしくはフルオロフォア、またはアクセプター発色団もしくはフルオロフォアの一方は、ＣＲＢＮのＮ末端に結合し、もう一方は、ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する。

いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、色素標識小分子化合物と複合体を形成するＣＲＢＮである。いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、（ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、（ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子とを含む複合体であり、そのＣｙ５コンジュゲート小分子は、そのＣＲＢＮと結合する。

いくつかの実施形態では、この複合体は、ＤＤＢ１をさらに含み、ＤＤＢ１は、ＣＲＢＮに結合する。

いくつかの実施形態では、そのＣｙ５コンジュゲート小分子は、ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する。

具体的な実施形態では、このＣｙ５コンジュゲート小分子は、下に示されている式（Ｉ）の構造を有する。

いくつかの具体的実施形態では、この複合体は、６×Ｈｉｓ−ＣＲＢＮ−ＤＤＢ１複合体と、ユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体及び式（Ｉ）のＣｙ５コンジュゲート小分子とを混合することによって調製する。より具体的な実施形態では、この複合体は、６０ｎＭの６×Ｈｉｓ−ＣＲＢＮ−ＤＤＢ１と、３ｎＭのユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体と、３０ｎＭの式（Ｉ）のＣｙ５コンジュゲート小分子とを混合することによって調製する。

別の態様では、本発明で提供するのは、色素標識小分子化合物と複合体を形成する結晶性ＣＲＢＮである。

さらに別の態様では、本発明で提供するのは、本発明で提供する各種複合体を含む組成物である。

５．３ ＣＲＢＮと化合物との親和性の測定方法
一態様では、本発明で提供するのは、化合物がセレブロン（ＣＲＢＮ）に結合するかの判断方法であって、その化合物を複合体と接触させることを含み、その複合体が、（ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、（ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子とを含み、そのＣｙ５コンジュゲート小分子がそのＣＲＢＮと結合する方法である。

いくつかの実施形態では、この複合体は、ＤＤＢ１をさらに含む。

いくつかの実施形態では、そのＣｙ５コンジュゲート小分子は、ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する。

具体的な実施形態では、このＣｙ５コンジュゲート小分子は、下に示されている式（Ｉ）の構造を有する。

蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、電子励起状態の２つの分子間の距離依存性相互作用であって、光子の発光なしに、励起がドナーフルオロフォアからアクセプターに移動する相互作用である。エネルギー移動のプロセスにより、ドナーフルオロフォアの蛍光強度の低減（消光）と励起状態寿命の低減が起こり、アクセプターがフルオロフォアである場合には、アクセプターの発光強度を向上させることができる。このエネルギー移動の効率は、ドナーとアクセプターとの距離の６乗に反比例し、これにより、ＦＲＥＴは、距離の小さい変化に対する感度が非常に高くなっている。ＦＲＥＴ効率は、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォア（及びそれらが結合している対応分子または原子）との距離の指標として使用でき、ＦＲＥＴ効率の低下は、距離の拡大と相関する（すなわち逆相関）。

ＣＲＢＮ結合化合物を、本発明で提供する複合体に接触させると、ＣＲＢＮのＮ末端にあるユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体と、Ｃｙ５コンジュゲート小分子との間の距離及び／または立体配置が変化するので、ＦＲＥＴ及び／またはＦＲＥＴ効率が変化する。したがって、ＦＲＥＴまたはＦＲＥＴ効率を測定することによって、ＣＲＢＮに対する化合物の親和性を求めることができる。

ＦＲＥＴは、蛍光または消光という２つの方法のうちの少なくとも１つで検出できる。蛍光においては、検出器をアクセプターフルオロフォアの発光スペクトルに設定し、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動と、アクセプターからの蛍光によって、結合が示される。消光においては、検出器をドナーフルオロフォアの発光スペクトルに設定し、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動と、ドナーからの発光の消光によって、結合が示される。

当業者であれば、ＦＲＥＴとＦＲＥＴ効率の測定方法がわかるであろう。これらの方法も、本開示に含まれている。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示の方法は、化合物を本開示の複合体と接触させた後に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、化合物を本開示の複合体と接触させる前に、ＦＲＥＴを測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、化合物を本開示の複合体と接触させた後に、ＦＲＥＴが減少した場合に、その化合物がＣＲＢＮに結合すると判断することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴは、３４０ｎｍで励起して、６１５ｎｍでの発光（Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ発光）と６６５ｎｍでの発光（ＦＲＥＴ発光）をモニタリングすることによって観察する。

いくつかの実施形態では、その化合物を本開示の複合体と接触させる前に、第１のＦＲＥＴ効率を求め、その化合物をその複合体と接触させた後に、第２のＦＲＥＴ効率を求め、このＦＲＥＴ効率は、６１５ｎｍでのＮｏｎ−ＦＲＥＴ発光に対する６６５ｎｍでのＦＲＥＴ発光の比率である。

いくつかの実施形態では、この方法は、その第２のＦＲＥＴ効率が、その第１のＦＲＥＴ効率よりも低い場合に、その化合物がＣＲＢＮに結合すると判断することをさらに含む。

別の態様では、本発明で提供するのは、セレブロン（ＣＲＢＮ）に対する化合物の親和性の測定方法であって、その化合物を複合体と接触させることを含み、その複合体が、（ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、（ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子とを含み、そのＣｙ５コンジュゲート小分子がそのＣＲＢＮと結合する方法である。

いくつかの実施形態では、この複合体は、ＤＤＢ１をさらに含む。

いくつかの実施形態では、そのＣｙ５コンジュゲート小分子は、ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する。

具体的な実施形態では、このＣｙ５コンジュゲート小分子は、下に示されている式（Ｉ）の構造を有する。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させた後に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させる前に、ＦＲＥＴを測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴは、３４０ｎｍで励起して、６１５ｎｍでの発光（Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ発光）と６６５ｎｍでの発光（ＦＲＥＴ発光）をモニタリングすることによって観察する。

いくつかの実施形態では、その化合物をその複合体と接触させる前に、第１のＦＲＥＴ効率を求め、その化合物をその複合体と接触させた後に、第２のＦＲＥＴ効率を求め、このＦＲＥＴ効率は、６１５ｎｍでのＮｏｎ−ＦＲＥＴ発光に対する６６５ｎｍでのＦＲＥＴ発光の比率である。

いくつかの実施形態では、ＣＲＢＮに対するその化合物の親和性は、その第１のＦＲＥＴ効率とその第２のＦＲＥＴ効率との差を測定することによって求める。

さらに別の態様では、本発明で提供するのは、２つのＣＲＢＮ結合化合物の親和性の比較方法であって、ＣＲＢＮに対する第１の化合物の第１の親和性を求めることと、ＣＲＢＮに対する第２の化合物の第２の親和性を求めることを含む方法である。

本発明で提供する各種方法のいくつかの実施形態では、試験する化合物は、ＣＲＢＮ改変剤（すなわちＣＭＡ）であることができる。本発明で提供する各種方法のいくつかの実施形態では、その化合物は、免疫調節化合物である。本発明で提供する各種方法のいくつかの実施形態では、その化合物は、免疫調節化合物ではない。

より具体的ないくつかの実施形態では、ＣＲＢＮに対するサリドマイドの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較したりする。別のより具体的な実施形態では、ＣＲＢＮに対するポマリドミドの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較したりする。別のより具体的な実施形態では、ＣＲＢＮに対するレナリドマイドの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較したりする。別のより具体的な実施形態では、ＣＲＢＮに対する化合物Ａの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較したりする。別のより具体的な実施形態では、ＣＲＢＮに対する化合物Ｂの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較したりする。さらに別のより具体的な実施形態では、ＣＲＢＮに対する化合物Ｄの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較したりする。さらに具体的な実施形態では、ＣＲＢＮに対する化合物Ｅの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較したりする。

５．４ 治療効果のある化合物の特定方法
下記の６．６項と６．７項に示されているように、細胞分解アッセイで示した場合、ＣＲＢＮに対する生化学的な結合親和性が高い化合物ほど、細胞活性での効能の向上とよく相関する。したがって、本発明で提供する方法であって、ＣＲＢＮに対する化合物の親和性の測定方法は、生物学的活性または治療効果を有する化合物の特定にも用いることができる。

別の態様では、本発明で提供するのは、疾患を治療するための化合物の特定方法であって、その化合物を複合体と接触させることを含み、その複合体が、（ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、（ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子とを含み、そのＣｙ５コンジュゲート小分子がそのＣＲＢＮと結合する方法である。

いくつかの実施形態では、この複合体は、ＤＤＢ１をさらに含む。

いくつかの実施形態では、そのＣｙ５コンジュゲート小分子は、ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する。

具体的な実施形態では、このＣｙ５コンジュゲート小分子は、下に示されている式（Ｉ）の構造を有する。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させた後に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させる前に、ＦＲＥＴを測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させた後に、ＦＲＥＴが減少した場合に、その疾患の治療に、その化合物を使用できる可能性があると判断することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴは、３４０ｎｍで励起して、６１５ｎｍでの発光（Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ発光）と６６５ｎｍでの発光（ＦＲＥＴ発光）をモニタリングすることによって観察する。

いくつかの実施形態では、その化合物をその複合体と接触させる前に、第１のＦＲＥＴ効率を求め、その化合物をその複合体と接触させた後に、第２のＦＲＥＴ効率を求め、このＦＲＥＴ効率は、６１５ｎｍでのＮｏｎ−ＦＲＥＴ発光に対する６６５ｎｍでのＦＲＥＴ発光の比率である。

いくつかの実施形態では、この方法は、その第２のＦＲＥＴ効率が、その第１のＦＲＥＴ効率よりも低い場合に、その疾患の治療に、その化合物を使用できる可能性があると判断することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この疾患は、ＣＲＢＮ介在性疾患である。

別の態様では、本発明で提供するのは、所定の下流の生物学的活性を有する化合物の特定方法であって、その化合物を複合体と接触させることを含み、その複合体が、（ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、（ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子とを含み、そのＣｙ５コンジュゲート小分子がそのＣＲＢＮと結合する方法である。

いくつかの実施形態では、この複合体は、ＤＤＢ１をさらに含む。

いくつかの実施形態では、そのＣｙ５コンジュゲート小分子は、ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する。

具体的な実施形態では、このＣｙ５コンジュゲート小分子は、下に示されている式（Ｉ）の構造を有する。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させた後に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させる前に、ＦＲＥＴを測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴは、３４０ｎｍで励起して、６１５ｎｍでの発光（Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ発光）と６６５ｎｍでの発光（ＦＲＥＴ発光）をモニタリングすることによって観察する。

いくつかの実施形態では、その化合物をその複合体と接触させる前に、第１のＦＲＥＴ効率を求め、その化合物をその複合体と接触させた後に、第２のＦＲＥＴ効率を求め、このＦＲＥＴ効率は、６１５ｎｍでのＮｏｎ−ＦＲＥＴ発光に対する６６５ｎｍでのＦＲＥＴ発光の比率である。

いくつかの実施形態では、その生物学的活性は、殺腫瘍作用である。別の実施形態では、その生物学的活性は、アポトーシス作用である。いくつかの実施形態では、その生物学的活性は、抗増殖性である。さらに別の実施形態では、その生物学的活性は、ＰＢＭＣ生存性である。いくつかの実施形態では、その生物学的活性は、毒性である。特定の実施形態では、その生物学的活性は、基質分解性である。一実施形態では、その生物学的活性は、Ａｉｏｌｏｓ分解性である。別の実施形態では、その生物学的活性は、Ｉｋａｒｏｓ分解性である。別の実施形態では、その生物学的活性は、免疫介在性作用である。別の実施形態では、その生物学的活性は、ＩＬ−２の誘導である。いくつかの実施形態では、その生物学的活性は、ＩＬ−２の抑制である。さらに別の実施形態では、その生物学的活性は、ＨｂＦ作用である。いくつかの実施形態では、その作用は、ＣＲＢＮ関連タンパク質に対する作用である。上記の生物学的活性の１つ、２つ、３つまたはそれを超える数を組み合わせたもののいずれも想定されている。

特定の実施形態では、生物学的活性は、１つの細胞種で観察されるが、別の細胞種では観察されない。いくつかの実施形態では、生物学的活性は、１つの種類の組織で観察されるが、別の種類の組織では観察されない。

特定の実施形態では、生物学的活性は、１つの種類の腫瘍（またはがん）で観察されるが、別の種類の腫瘍（またはがん）では観察されない。

いくつかの実施形態では、生物学的活性は、固形腫瘍（またはがん）で観察されるが、非固形腫瘍（またはがん）（例えば血液腫瘍）では観察されない。

いくつかの実施形態では、生物学的活性は、非固形腫瘍（またはがん）（例えば血液腫瘍）で観察されるが、固形腫瘍（またはがん）では観察されない。

特定の実施形態では、固形腫瘍またはがんは、乳房、腎臓、卵巣、大腸、膀胱、脳、肝臓または前立腺の腫瘍または癌である。いくつかの実施形態では、非固形腫瘍は、血液（ｂｌｏｏｄ）（血液（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ））癌である。

いくつかの実施形態では、例示的な腫瘍またはがんとしては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、妊娠性絨毛癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性混合リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、横紋筋肉腫、精巣癌、ウィルムス腫瘍、肛門癌、膀胱癌、乳癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、頭頸部癌、髄膜腫、神経線維腫、血管線維腫、肺（小細胞）癌、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、卵巣癌、脳腫瘍（星状細胞腫）、子宮頸癌、大腸癌、肝細胞癌、ヒト巨大肝細胞癌、カポジ肉腫、肺（非小細胞）癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、乳癌、大腸癌（ステージＩＩ）、骨腫瘍、骨原性肉腫、卵巣癌、子宮筋腫、精巣癌またはこれらを組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。

特定の実施形態では、ＣＭＡによって調節される生物学的活性は、対象において、ＣＭＡの治療上の有用性に直接的な作用を及ぼす。

別の態様では、本発明で提供するのは、所定の治療効果または所定の治療上の有用性を有する試験化合物の特定方法であって、その化合物を複合体と接触させることを含み、その複合体が、（ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、（ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子とを含み、そのＣｙ５コンジュゲート小分子がそのＣＲＢＮと結合する方法である。

いくつかの実施形態では、この複合体は、ＤＤＢ１をさらに含む。

いくつかの実施形態では、そのＣｙ５コンジュゲート小分子は、ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する。

具体的な実施形態では、このＣｙ５コンジュゲート小分子は、下に示されている式（Ｉ）の構造を有する。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させた後に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、その化合物をその複合体と接触させる前に、ＦＲＥＴを測定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＦＲＥＴは、３４０ｎｍで励起して、６１５ｎｍでの発光（Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ発光）と６６５ｎｍでの発光（ＦＲＥＴ発光）をモニタリングすることによって観察する。

いくつかの実施形態では、その化合物をその複合体と接触させる前に、第１のＦＲＥＴ効率を求め、その化合物をその複合体と接触させた後に、第２のＦＲＥＴ効率を求め、このＦＲＥＴ効率は、６１５ｎｍでのＮｏｎ−ＦＲＥＴ発光に対する６６５ｎｍでのＦＲＥＴ発光の比率である。

本発明で提供する各種方法のいくつかの実施形態では、その治療上の有用性は、ＣＲＢＮ関連疾患、障害またはその症状の管理または治療である。別の実施形態では、その治療上の有用性は、がんもしくは腫瘍、またはその症状の管理または治療である。いくつかの実施形態では、その腫瘍またはがんは、肝臓癌、腎臓癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、妊娠性絨毛癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性混合リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、横紋筋肉腫、精巣癌、ウィルムス腫瘍、肛門癌、膀胱癌、乳癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、頭頸部癌、髄膜腫、神経線維腫、血管線維腫、肺（小細胞）癌、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、卵巣癌、脳腫瘍（星状細胞腫）、子宮頸癌、大腸癌、肝細胞癌、ヒト巨大肝細胞癌、カポジ肉腫、肺（非小細胞）癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、乳癌、大腸癌（ステージＩＩ）、骨腫瘍、骨原性肉腫、卵巣癌、子宮筋腫、精巣癌またはこれらを組み合わせたものである。いくつかの実施形態では、そのがんまたは腫瘍は、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、固形腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ＤＬＢＣＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性骨髄芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、ＭＤＳまたはメラノーマである。

本発明で提供する各種方法のいくつかの実施形態では、その特定する化合物は、ＣＲＢＮ改変剤（すなわちＣＭＡ）である。本発明で提供する各種方法のいくつかの実施形態では、その特定する化合物は、免疫調節化合物である。本発明で提供する各種方法のいくつかの実施形態では、その特定する化合物は、免疫調節化合物ではない。

より具体的ないくつかの実施形態では、ＣＲＢＮに対するサリドマイドの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較して、別の化合物の治療上の有用性を判断したりする。他のより具体的な実施形態では、ＣＲＢＮに対するポマリドミドの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較して、別の化合物の治療上の有用性を判断したりする。他のより具体的な実施形態では、ＣＲＢＮに対するレナリドマイドの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較して、別の化合物の治療上の有用性を判断したりする。他のより具体的な実施形態では、ＣＲＢＮに対する化合物Ａの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較して、別の化合物の治療上の有用性を判断したりする。他のより具体的な実施形態では、ＣＲＢＮに対する化合物Ｂの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較して、別の化合物の治療上の有用性を判断したりする。さらに別のより具体的な実施形態では、ＣＲＢＮに対する化合物Ｄの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較して、別の化合物の治療上の有用性を判断したりする。さらに具体的な実施形態では、ＣＲＢＮに対する化合物Ｅの結合親和性を測定したり、及び／またはＣＲＢＮに対する別の化合物の親和性と比較して、別の化合物の治療上の有用性を判断したりする。

５．５ 細胞の種類
特定の実施形態では、本開示における生物学的活性は、指定の細胞種カテゴリーに基づくものである。このような細胞としては、いずれかのタイプの細胞、例えば、幹細胞、血液細胞（例えば末梢血単核球）、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、顆粒球、免疫細胞、腫瘍細胞またはがん細胞を挙げることができる。

例えば、Ｂ細胞（Ｂリンパ球）としては、血漿Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、Ｂ１細胞、Ｂ２細胞、辺縁帯Ｂ細胞及び濾胞性Ｂ細胞が挙げられる。Ｂ細胞は、免疫グロブリン（抗体、Ｂ細胞レセプター）を発現できる。一実施形態では、その細胞は、Ｋａｒｐａｓ４２２、ＴＭＤ８、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、ＯＣＩ−ＬＹ１０、Ｋａｒｐａｓ１１０６Ｐ、ＨＴ、ＳＵＤＨＬ−１０、Ｒｉｖａ、ＯＣＩ−ＬＹ１９、ＳＵＤＨＬ−４、ＳＵＤＨＬ−６、ＯＣＩ−ＬＹ３及びＦａｒａｇｅである。

特定の細胞集団は、市販の抗体（例えば、Ｑｕｅｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ（Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｄａｋｏ（Ｄｅｎｍａｒｋ））を組み合わせたものを用いて得たりまたは評価したりできる。

特定の実施形態では、その細胞株は、レナリドマイド耐性ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２またはＴＭＤ８細胞株である。特定の実施形態では、その細胞株は、ＤＬＢＣＬ細胞株である。いくつかの実施形態では、その細胞株は、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ（活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬ）細胞株、例えば、ＴＭＤ８、ＯＣＩ−ＬＹ１０、ＲｉｖａまたはＯＣＩ−ＬＹ３細胞株である。別の実施形態では、その細胞株は、ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬ（胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬ）細胞株、例えば、Ｋａｒｐａｓ４２２、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、Ｋａｒｐａｓ１１０６Ｐ、ＨＴ、ＳＵＤＨＬ−１０、ＯＣＩ−ＬＹ１９、ＳＵＤＨＬ−４またはＳＵＤＨＬ−６細胞株である。

いくつかの実施形態では、細胞の数と種類は例えば、フローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学（例えば、組織特異的抗体もしくは細胞マーカー特異的抗体による染色）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）のような標準的な細胞検出技法を用いて、形態の変化と細胞表面マーカーを測定することによって、光学顕微鏡もしくは共焦点顕微鏡を用いて、細胞の形態を調べることによって、及び／またはＰＣＲと遺伝子発現プロファイリングのように、当該技術分野において周知の技法を用いて、遺伝子発現の変化を測定することによって、モニタリングすることができる。これらの技法は、１つ以上の特定のマーカーに対して陽性である細胞を特定するのにも用いることができる。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、細胞を含む粒子の蛍光特性に基づき、その粒子を分離するための周知の方法である（Ｋａｍａｒｃｈ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５１：１５０−１６５）。個々の粒子の蛍光分子をレーザー励起させると、わずかな電荷が付与され、混合物から正の粒子と負の粒子を電磁分離できるようになる。一実施形態では、細胞表面マーカー特異的な抗体またはリガンドを別個の蛍光標識で標識する。細胞をセルソーターにかけて処理し、使用する抗体に結合する能力に基づき、細胞を分離させる。ＦＡＣＳで選別した粒子は、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートの個々のウェルに直接入れて、分離とクローニングを容易にしてよい。

特定の実施形態では、本発明で提供する方法において、細胞のサブセットを使用または検出する。特定の細胞集団を選別及び単離する方法は、当該技術分野において周知であり、細胞の大きさ、形態、または細胞内もしくは細胞外マーカーに基づくことができる。このような方法としては、フローサイトメトリー、フローソーティング、ＦＡＣＳ、ビーズベースの分離（磁気細胞選別など）、サイズベースの分離（例えば、ふるい、障害物の配列またはフィルター）、マイクロフルイディクスデバイスでの選別、抗体ベースの分離、沈降、親和性吸着、親和性抽出、密度勾配遠心分離、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションなどが挙げられるが、これらに限らない。

一実施形態では、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）またはタンパク質を精製して、遺伝子またはタンパク質発現解析によって、バイオマーカーの有無を測定する。特定の実施形態では、バイオマーカーの有無は、定量リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）、マイクロアレイ、フローサイトメトリーまたは免疫蛍光法によって測定する。別の実施形態では、バイオマーカーの有無は、酵素結合免疫吸着アッセイベースの方法（ＥＬＩＳＡ）または当該技術分野において知られているその他の類似の方法によって測定する。

５．６ 特定の生物学的活性のアッセイ方法
本発明で提供する方法の特定の実施形態では、その方法は、本発明で提供する結合アッセイによって特定した化合物の特定の生物学的活性をアッセイして、例えば、その化合物の治療効果の可能性を検証することをさらに含む。

特定の実施形態では、その生物学的活性は、基質分解性である。特定の実施形態では、その基質は、ＣＲＢＮ関連タンパク質である。一実施形態では、そのＣＲＢＮ関連タンパク質は、Ｉｋａｒｏｓである。別の実施形態では、そのＣＲＢＮ関連タンパク質は、Ａｉｏｌｏｓである。いくつかの実施形態では、そのＣＲＢＮ関連タンパク質を検出及び／または定量する。

いくつかの実施形態では、ＣＲＢＮ関連タンパク質、例えばＣＲＢＮの基質のタンパク質レベルを検出または測定する。いくつかのタンパク質検出方法と定量方法を用いて、ＣＲＢＮ関連タンパク質のレベルを測定できる。いずれかの好適なタンパク質定量方法を用いることができる。いくつかの実施形態では、抗体ベースの方法を使用する。使用できる例示的な方法としては、イムノブロッティング（ウエスタンブロット）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、フローサイトメトリー、サイトメトリックビーズアレイ、質量分析などが挙げられるが、これらに限らない。直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ及びサンドイッチＥＬＩＳＡを含め、いくつかのタイプのＥＬＩＳＡが広く用いられている。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、（ａ）試料と、そのＣＲＢＮ関連タンパク質に免疫特異的に結合する第１の抗体とを接触させること、（ｂ）その第１の抗体に結合したその試料と、検出可能な標識を有する第２の抗体とを接触させることであって、その第２の抗体が、そのＣＲＢＮ関連タンパク質に免疫特異的に結合し、その第２の抗体が、ＣＲＢＮ関連タンパク質上のエピトープのうち、その第１の抗体とは異なるエピトープに免疫特異的に結合することと、（ｃ）その試料に結合した第２の抗体の存在を検出することと、（ｄ）その第２の抗体の検出可能な標識の量に基づき、そのＣＲＢＮ関連タンパク質のタンパク質レベルを求めることを含む。

別の実施形態では、ＣＲＢＮ関連タンパク質、例えば、ＣＲＢＮの基質によって調節される下流の標的のｍＲＮＡレベルを検出または測定する。ｍＲＮＡレベルを検出または定量するいくつかの方法が当該技術分野において知られている。例示的な方法としては、ノーザンブロット、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ＰＣＲベースの方法などが挙げられるが、これらに限らない。ｍＲＮＡ配列、例えば、ＣＲＢＮ関連タンパク質のｍＲＮＡまたはその断片を用いて、少なくとも部分的に相補的であるプローブを調製できる。そして、そのプローブを用いて、ＰＣＲベースの方法、ノーザンブロット、ディップスティックアッセイのようないずれかの好適なアッセイによって、試料中のｍＲＮＡ配列を検出できる。

別の実施形態では、生体試料における化合物活性について試験するための核酸アッセイを調製できる。アッセイは典型的には、固体支持体と、その支持体と接触している少なくとも１つ核酸を含み、その核酸は、患者において、化合物による治療の際に発現が変化したｍＲＮＡ（ＣＲＢＮ関連タンパク質のｍＲＮＡなど）の少なくとも一部に対応する。そのアッセイは、その試料におけるｍＲＮＡの発現の変化を検出するための手段を有することもできる。

アッセイ方法は、所望のｍＲＮＡ情報の種類によって変化し得る。例示的な方法としては、ノーザンブロット及びＰＣＲベースの方法（例えばｑＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられるが、これらに限らない。ｑＲＴ−ＰＣＲのような方法は、試料中のｍＲＮＡの量を正確に定量することもできる。

いずれかの好適なアッセイプラットフォームを用いて、試料中のｍＲＮＡの存在を判断できる。例えば、アッセイは、ディップスティック、膜、チップ、ディスク、テストストリップ、フィルター、マイクロスフィア、スライド、マルチウェルプレートまたは光ファイバーの形態であってよい。アッセイシステムは、ｍＲＮＡに対応する核酸が結合されている固体支持体を有してもよい。この固体支持体は、例えば、プラスチック、シリコン、金属、樹脂、ガラス、膜、粒子、沈殿物、ゲル、ポリマー、シート、球体、多糖、キャピラリー、フィルム、プレートまたはスライドを含んでよい。アッセイ構成成分は、ｍＲＮＡを検出するためのキットとして、ともに調製及び包装することができる。

所望の場合、その核酸を標識して、標識ｍＲＮＡの集団を作製できる。概して、試料は、当該技術分野において周知である方法を用いて標識できる（例えば、ＤＮＡリガーゼ、ターミナルトランスフェラーゼを使用して、またはＲＮＡ骨格を標識することなどによって標識できる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９５及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。いくつかの実施形態では、試料は、蛍光標識で標識する。例示的な蛍光色素としては、キサンテン色素、フルオレセイン色素、ローダミン色素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６カルボキシ４’，５’ジクロロ２’，７’ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥまたはＪ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル６カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡまたはＴ）、６カルボキシＸローダミン（ＲＯＸまたはＲ）、５カルボキシローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ５またはＧ５）、６カルボキシローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ６またはＧ６）及びローダミン１１０、シアニン色素、例えばＣｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７色素、Ａｌｅｘａ色素、例えばＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ−５５５、クマリン、ジエチルアミノクマリン、ウンベリフェロン、ベンズイミド色素、例えばＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８、フェナントリジン色素、例えばＴｅｘａｓ Ｒｅｄ、エチジウム色素、アクリジン色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、キノリン色素、ピレン、フルオレセインクロロトリアジニル、Ｒ１１０、エオシン、ＪＯＥ、Ｒ６Ｇ、テトラメチルローダミン、リサミン、ＲＯＸ、ナフトフルオレセインなどが挙げられるが、これらに限らない。

典型的なｍＲＮＡアッセイ方法は、１）該当する表面結合プローブを得る工程と、２）特異的結合をもたらすのに充分な条件で、ｍＲＮＡ集団をその表面結合プローブにハイブリダイゼーションさせる工程と、（３）ハイブリダイゼーション後の洗浄を行って、ハイブリダイゼーションの際に結合しなかった核酸を除去する工程と、（４）ハイブリダイズしたｍＲＮＡを検出する工程を含むことができる。これらの工程のそれぞれで用いる試薬と、使用する条件は、具体的な用途に応じて変化し得る。

ハイブリダイゼーションは、好適なハイブリダイゼーション条件で行うことができ、その条件は、所望に応じて、ストリンジェンシーにおいて変化し得る。典型的な条件は、相補的な結合要素間、すなわち、表面結合プローブと試料中の相補的なｍＲＮＡとの間のプローブ／標的複合体を固体表面上に生成させるのに充分な条件である。特定の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いてよい。

ハイブリダイゼーションは典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で行う。標準的なハイブリダイゼーション技法（例えば、試料中の標的ｍＲＮＡをプローブに特異的に結合させるのに充分な条件下）は、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：８１８−８２１（１９９２）及びＷＯ９３／１８１８６に記載されている。一般的技法のいくつかの手引きを入手可能である（例えばＴｉｊｓｓｅｎ，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９９３）。インサイチューハイブリダイゼーションの好適な技法の説明については、Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１：４７０−４８０（１９８１）及びＡｎｇｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ （Ｓｅｔｌｏｗ ａｎｄ Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ，Ｅｄｓ．）Ｖｏｌ ７，ｐｇｓ４３−６５（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８５）を参照されたい。温度、塩濃度、ポリヌクレオチド濃度、ハイブリダイゼーション時間及び洗浄条件のストリンジェンシーなどを含む適切な条件の選択は、試料の供給源、捕捉物質の性質、予測される相補性の度合いなどを含む実験設計によって異なり、当業者においては、日常的な実験の要素として決定することができる。

代替的ではあるが、同等のハイブリダイゼーションと洗浄条件を用いて、同様のストリンジェンシーの条件をもたらすことができることを当業者は容易に認識するであろう。

ｍＲＮＡハイブリダイゼーション手順の後、典型的には、表面に結合したポリヌクレオチドを洗浄して、未結合の核酸を除去する。洗浄は、いずれかの利便的な洗浄プロトコールを用いて行ってよく、その洗浄条件は典型的には、上記のように、ストリンジェントな条件である。そして、標準的な技法を用いて、プローブへの標的ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを検出する。

ＰＣＲベースの方法のような他の方法を用いて、ＣＲＢＮ関連タンパク質の発現を追跡することもできる。ＰＣＲ法の例は、文献で見ることができる。ＰＣＲアッセイの例は、米国特許第６，９２７，０２４号で見ることができ、この特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。ＲＴ−ＰＣＲ法の例は、米国特許第７，１２２，７９９号で見ることができ、この特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。蛍光インサイチューＰＣＲの方法は、米国特許第７，１８６，５０７号に記載されており、この特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ標的の検出と定量の両方に、リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いることができる（Ｂｕｓｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．，１０９：３６５−３７９）。ｑＲＴ−ＰＣＲによって得られる定量結果は一般に、定性的データよりも情報量が多い。したがって、いくつかの実施形態では、細胞ベースのアッセイの際にｍＲＮＡレベルを測定するには、ｑＲＴ−ＰＣＲベースのアッセイが有用であることがある。ｑＲＴ−ＰＣＲ法は、患者への治療をモニタリングするのにも有用である。ｑＲＴ−ＰＣＲベースの方法の例は、例えば、米国特許第７，１０１，６６３号で見ることができ、この特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

通常の逆転写酵素ＰＣＲとアガロースゲルによる解析とは対照的に、リアルタイムＰＣＲからは、定量結果が得られる。リアルタイムＰＣＲの更なる利点は、使用が比較的容易なことと、利便的であることである。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００のようなリアルタイムＰＣＲ用の機器は、市販されており、配列検出用物質のＴａｑＭａｎのような試薬も市販されている。例えば、メーカーの指示に従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓを用いることができる。これらのキットは、ヒト、マウス及びラットのｍＲＮＡ転写産物を迅速かつ確実に検出及び定量するように、事前に調合した遺伝子発現アッセイである。例示的なＰＣＲプログラムは例えば、５０℃で２分、９５℃で１０分、９５℃で１５秒を４０サイクル行ってから、６０℃で１分行うものである。

特定のアンプリコンの蓄積と関連する蛍光シグナルが閾値と交差するサイクル数（ＣＴという）を求めるために、例えば、比較ＣＴ相対定量算出方法を用いる７５００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎソフトウェアｖ１．３を用いて、データを解析できる。この方法を用いると、出力は、発現レベルの変化倍率として表される。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、ソフトウェアによって自動的に判断されるように選択できる。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、ベースラインを上回るが、増幅曲線の指数関数的増加領域内に入るように充分低く設定する。

５．７ 化合物
いくつかの実施形態では、本発明で提供する方法は、化合物とＣＲＢＮとの親和性を試験するためのものである。本発明で提供する各種方法のいくつかの実施形態では、その化合物は、いずれかのＣＲＢＮ改変剤（すなわちＣＭＡ）であることができる。

本発明で提供するＣＭＡとしては、特定のがんを含むいくつかのタイプのヒト疾患を治療するのに有用であり得る化合物群である免疫調節化合物が挙げられるが、これらに限らない。本発明で提供する各種組成物及び方法の特定の実施形態では、ＣＭＡは、本発明で提供する免疫調節化合物である。別の実施形態では、ＣＭＡは、本発明で提供する免疫調節化合物ではない。

本明細書で使用する場合、別段に示されていない限り、「免疫調節化合物」または「免疫調節剤」という用語には、何らかの方法で免疫応答を改変できる分子または薬剤が含まれる。例えば、この用語には、ＬＰＳの誘導による、単球のＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ及びＣＯＸ−２の産生を阻害する特定の有機小分子を含めることができる。いくつかの実施形態では、本発明で提供する免疫調節化合物は、骨髄系細胞のＴＮＦ−αの産生を減少させることができる。いくつかの実施形態では、本発明で開示する免疫調節化合物は、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの分解を促進できる。別の実施形態では、本発明で開示する免疫調節化合物は、Ｔ細胞の強力な共刺激因子であり、用量依存的に細胞の増殖を大幅に増加させる。さらに別の実施形態では、本発明で開示する免疫調節化合物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットに対する共刺激作用よりも、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットに対する共刺激作用の方が大きくてもよい。加えて、その化合物は、骨髄系細胞応答に対する抗炎症特性を有するうえに、Ｔ細胞を効率的に共刺激して、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γの産生量を増加させ、Ｔ細胞の増殖とＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を向上させてもよい。さらに別の実施形態では、本発明で開示する免疫調節化合物は、サイトカインの活性化を通じて間接的にでも、直接的にでも、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞とナチュラルキラーＴ（「ＮＫＴ」）細胞に作用できてよいとともに、ＮＫ細胞が有益なサイトカイン（ＩＦＮ−γなどであるが、これに限らない）を産生する能力と、ＮＫ細胞とＮＫＴ細胞の細胞傷害活性を向上させる能力を高めてよい。

本発明で提供する例示的なＣＭＡとしては、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドミド、化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃ、化合物Ｄ及び化合物Ｅが挙げられるが、これらに限らない。

具体的な実施形態では、この化合物は、サリドマイドである。

別の具体的な実施形態では、この化合物は、レナリドマイドである。

さらに別の具体的な実施形態では、この化合物は、ポマリドミドである。

さらに別の具体的な実施形態では、この化合物は、下記の構造を有する３−（５−アミノ−２−メチル−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−３−イル）−ピペリジン−２，６−ジオン（「化合物Ａ」）、

またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形である。

化合物Ａは、米国特許第７，６３５，７００号に記載されているようにして調製でき、この特許の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。この化合物は、本明細書の教示に基づけば、当業者には明らかである他の方法に従って合成することもできる。特定の実施形態では、化合物Ａは、２０１１年３月１１日に出願された米国特許仮出願第６１／４５１，８０６号に記載されている結晶体であり、この仮出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、本発明で提供する方法において、化合物Ａの塩酸塩を使用する。化合物Ａを用いて、がんと他の疾患を治療、予防及び／または管理する方法は、２０１１年３月１１日に出願された米国特許仮出願第６１／４５１，９９５号に記載されており、この出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

さらに別の具体的な実施形態では、この化合物は、下記の構造を有する３−（４−（（４−（モルホリノメチル）ベンジル）オキシ）−１−オキソイソインドリン−２−イル）ピペリジン−２，６−ジオン（「化合物Ｂ」）、

またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形である。

化合物Ｂとその調製方法は、米国特許第８，５１８，９７２号に記載されており、この特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。化合物Ｂの例示的な作製方法は、下記の実施例６．１にも示されている。

さらに別の具体的な実施形態では、この化合物は、下記の構造を有する１−（３−クロロ−４−メチルフェニル）−３−（（２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−１−オキソイソインドリン−５−イル）メチル）尿素（「化合物Ｃ」）、

またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形である。

さらに別の具体的な実施形態では、この化合物は、下記の構造を有する２−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（（２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−１−オキソイソインドリン−５−イル）メチル）−２，２−ジフルオロアセトアミド（「化合物Ｄ」）、

またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形である。

さらに別の具体的な実施形態では、この化合物は、下記の構造を有する２−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−（（２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−１−オキソイソインドリン−５−イル）メチル）−２，２−ジフルオロアセトアミド（「化合物Ｅ」）、

またはその製薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、立体異性体、アイソトポローグ、プロドラッグ、水和物、共結晶、包接化合物もしくは結晶多形である。

化合物Ｄ及びＥとその調製方法は、米国特許第９，４９９，５１４号に記載されており、この特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

本発明で開示する様々な化合物は、１つ以上のキラル中心を含み、エナンチオマーのラセミ混合物またはジアステレオマーの混合物として存在できる。したがって、本発明でさらに提供するのは、上記のような化合物の立体異性体的に純粋な形態を使用することと、それらの形態の混合物を使用することである。例えば、特定の免疫調節化合物のエナンチオマーを等量または不等量含む混合物を用いてよい。これらの異性体は、不斉合成しても、キラルカラムまたはキラル分割剤のような標準的な技法を用いて分割してもよい。例えば、Ｊａｃｑｕｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ （Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）、Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３３：２７２５（１９７７）、Ｅｌｉｅｌ，Ｅ．Ｌ．，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１９６２）及びＷｉｌｅｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｔａｂｌｅｓ ｏｆ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐ．２６８（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ，Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ，ＩＮ，１９７２）を参照されたい。

記載されている化合物はいずれも、市販購入することができ、または本明細書に開示されている特許もしくは特許公開に記載されている方法に従って調製することができる。更に、光学的に純粋な化合物は、不斉合成することができ、または既知の分割剤もしくはキラルカラム及び他の標準的な有機合成化学技術を使用して分割することができる。

示されている構造とその構造に与えられた名称との間に矛盾がある場合には、示されている構造が優先されることに留意されたい。加えて、構造または構造の一部の立体化学が、例えば、太字または破線で示されていない場合、その構造またはその構造の一部は、そのすべての立体異性体を包含するものと解釈するものとする。

５．８ ＣＲＢＮ介在性疾患の治療
また、本発明で提供するのは、ＣＲＢＮ介在性疾患の治療及び予防方法であって、本発明で提供する各種方法を用いて特定した化合物を患者に投与することを含む方法である。特定の実施形態では、このＣＲＢＮ介在性疾患または障害は、がんである。特定の実施形態では、本発明で提供するのは、ＣＲＢＮ介在性疾患の治療及び予防方法で用いるものとして、本発明で提供する各種方法によって特定した化合物であって、その方法が、その化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形を患者に投与することを含む化合物である。

別の実施形態では、本発明で提供するのは、ＣＲＢＮ介在性疾患の管理方法であって、本発明で提供する各種方法を用いて特定した化合物を患者に投与することを含む方法である。特定の実施形態では、このＣＲＢＮ介在性疾患または障害は、がんである。特定の実施形態では、本発明で提供するのは、ＣＲＢＮ介在性疾患の管理方法で用いるものとして、本発明で提供する各種方法によって特定した化合物であって、その方法が、その化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形を患者に投与することを含む化合物である。

また、本発明で提供するのは、ＣＲＢＮ介在性疾患または障害（例えば、がん）の治療を以前受けたことがあるが、標準療法に応答しない患者と、治療をこれまで受けたことがない患者の治療方法である。いくつかの疾患または障害は、特定の年齢群における方が多く見られるが、本発明でさらに提供するのは、患者の年齢にかかわらず、患者を治療する方法である。また、本発明で提供するのは、問題の疾患または状態を治療しようとして手術を受けたことのある患者と、受けたことのない患者の治療方法である。本発明で提供するいくつかの実施形態では、本発明で提供する化合物は、上述のような、患者の治療方法で用いるためのものである。

がん患者によって、臨床症状は異なり、臨床転帰も様々であるので、患者に対して行う治療は、その患者の予後に応じて様々となり得る。熟練の臨床医は、過度の実験なしに、個々のがん患者の治療に効果的に使用できる具体的な二次薬剤、手術の種類及び非薬物ベースの標準療法の種類を容易に判断できるであろう。

本明細書で使用する場合、「がん」という用語には、固形腫瘍と血液腫瘍が含まれるが、これらに限らない。「がん」という用語は、皮膚組織、器官、血液及び血管の疾患を指し、膀胱、骨、血液、脳、乳房、頸部、胸部、大腸、子宮内膜、食道、眼、頭部、腎臓、肝臓、リンパ節、肺、口腔、首、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、胃、精巣、咽喉及び子宮の癌が挙げられるが、これらに限らない。具体的ながんとしては、進行性悪性腫瘍、アミロイドーシス、神経芽腫、髄膜腫、血管周囲細胞腫、多発性脳転移、多形性膠芽腫、神経膠肉腫、脳幹神経膠腫、予後不良悪性脳腫瘍、悪性神経膠腫、再発性悪性神経膠腫、退形星状細胞腫、退形成乏突起神経膠腫、神経内分泌腫瘍、直腸腺癌、デュークスＣ及びＤ大腸癌、切除不能大腸癌、転移性肝細胞癌、カポジ肉腫、核型急性骨髄芽球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚Ｂ細胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、低悪性度濾胞性リンパ腫、悪性メラノーマ、悪性中皮腫、悪性胸水中皮腫症候群、腹膜癌、漿液性乳頭状癌、婦人科肉腫、軟部組織肉腫、強皮症、皮膚血管炎、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、平滑筋肉腫、進行性骨化性線維異形成症、ホルモン抵抗性前立腺癌、切除後のハイリスク軟部組織肉腫、切除不能肝細胞癌、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、くすぶり型骨髄腫、無症候性骨髄腫、卵管癌、アンドロゲン非依存性前立腺癌、アンドロゲン非依存性ステージＩＶ非転移性前立腺癌、ホルモン非感受性前立腺癌、化学療法非感受性前立腺癌、甲状腺乳頭癌、濾胞性甲状腺癌、甲状腺髄様癌及び平滑筋腫が挙げられるが、これらに限らない。

特定の実施形態では、がんは、血液腫瘍である。特定の実施形態では、その血液腫瘍は、転移性である。特定の実施形態では、その血液腫瘍は、薬物耐性である。特定の実施形態では、そのがんは、骨髄腫またはリンパ腫である。

特定の実施形態では、そのがんは、固形腫瘍である。特定の実施形態では、その固形腫瘍は、転移性である。特定の実施形態では、その固形腫瘍は、薬物耐性である。特定の実施形態では、その固形腫瘍は、肝細胞癌、前立腺癌、卵巣癌または神経膠肉腫である。

特定の実施形態では、その化合物の治療有効量または予防有効量は、１日あたり約０．００５〜約１，０００ｍｇ、１日あたり約０．０１〜約５００ｍｇ、１日あたり約０．０１〜約２５０ｍｇ、１日あたり約０．０１〜約１００ｍｇ、１日あたり約０．１〜約１００ｍｇ、１日あたり約０．５〜約１００ｍｇ、１日あたり約１〜約１００ｍｇ、１日あたり約０．０１〜約５０ｍｇ、１日あたり約０．１〜約５０ｍｇ、１日あたり約０．５〜約５０ｍｇ、１日あたり約１〜約５０ｍｇ、１日あたり約０．０２〜約２５ｍｇまたは１日あたり約０．０５〜約１０ｍｇである。

特定の実施形態では、治療有効量または予防有効量は、１日あたり約０．００５〜約１，０００ｍｇ、１日あたり約０．０１〜約５００ｍｇ、１日あたり約０．０１〜約２５０ｍｇ、１日あたり約０．０１〜約１００ｍｇ、１日あたり約０．１〜約１００ｍｇ、１日あたり約０．５〜約１００ｍｇ、１日あたり約１〜約１００ｍｇ、１日あたり約０．０１〜約５０ｍｇ、１日あたり約０．１〜約５０ｍｇ、１日あたり約０．５〜約５０ｍｇ、１日あたり約１〜約５０ｍｇ、１日あたり約０．０２〜約２５ｍｇまたは１日おきに約０．０５〜約１０ｍｇである。

特定の実施形態では、この治療有効量または予防有効量は、１日あたり約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇまたは約１５０ｍｇである。

一実施形態では、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形の１日あたりの推奨投与量範囲であって、本明細書に記載されている状態に対する投与量範囲は、１日あたり約０．５ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲内であり、好ましくは、単一の１日１回用量として投与するか、または１日をかけて数回に分けて投与する。いくつかの実施形態では、その用量は、１日あたり約１ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲である。別の実施形態では、その用量は、１日あたり約０．５〜約５ｍｇの範囲である。１日あたりの具体的用量としては、１日あたり０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２１ｍｇ、２２ｍｇ、２３ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、３１ｍｇ、３２ｍｇ、３３ｍｇ、３４ｍｇ、３５ｍｇ、３６ｍｇ、３７ｍｇ、３８ｍｇ、３９ｍｇ、４０ｍｇ、４１ｍｇ、４２ｍｇ、４３ｍｇ、４４ｍｇ、４５ｍｇ、４６ｍｇ、４７ｍｇ、４８ｍｇ、４９ｍｇまたは５０ｍｇが挙げられる。

具体的な実施形態では、推奨開始投与量は、１日あたり０．０１ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇまたは５０ｍｇであってよい。別の実施形態では、推奨開始投与量は、１日あたり０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇまたは５ｍｇであってよい。その用量は、１５ｍｇ／日、２０ｍｇ／日、２５ｍｇ／日、３０ｍｇ／日、３５ｍｇ／日、４０ｍｇ／日、４５ｍｇ／日及び５０ｍｇ／日まで増やしてよい。

特定の実施形態では、この治療有効量または予防有効量は、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１〜約９ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１〜約８ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１〜約７ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１〜約６ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１〜約５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１〜約４ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１〜約３ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１〜約２ｍｇ／ｋｇ／日または約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ／日である。

投与量は、ｍｇ／ｋｇ／日以外の単位で表すこともできる。例えば、非経口投与用の用量は、ｍｇ／ｍ^２／日で表すことができる。当業者は、対象の身長もしくは体重、またはこれらの両方を与えられれば、用量をｍｇ／ｋｇ／日からｍｇ／ｍ^２／日に変換する方法が容易にわかるであろう（ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ａｎｉｍａｌｆｒａｍｅ．ｈｔｍを参照されたい）。例えば、６５ｋｇのヒトでは、１ｍｇ／ｋｇ／日の用量は、３８ｍｇ／ｍ^２／日とおおよそ等しい。

特定の実施形態では、本開示の化合物の投与量は、化合物の定常状態での血漿中濃度を約０．００１〜約５００μＭ、約０．００２〜約２００μＭ、約０．００５〜約１００μＭ、約０．０１〜約５０μＭ、約１〜約５０μＭ、約０．０２〜約２５μＭ、約０．０５〜約２０μＭ、約０．１〜約２０μＭ、約０．５〜約２０μＭまたは約１〜約２０μＭの範囲にするのに充分な量である。

別の実施形態では、本開示の化合物の投与量は、化合物の定常状態での血漿中濃度を約５〜約１００ｎｍ、約５〜約５０ｎｍ、約１０〜約１００ｎＭ、約１０〜約５０ｎＭまたは約５０〜約１００ｎＭの範囲にするのに充分な量である。

本明細書で使用する場合、「定常状態での血漿中濃度」という用語は、本発明で提供する化合物、例えば、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形の投与期間後に達する濃度である。定常状態に達すると、その化合物の血漿中濃度の時間依存性曲線には、微小ピークとトラフが見られる。

特定の実施形態では、本開示の化合物の投与量は、その化合物の最高血漿中濃度（ピーク濃度）を約０．００１〜約５００μＭ、約０．００２〜約２００μＭ、約０．００５〜約１００μＭ、約０．０１〜約５０μＭ、約１〜約５０μＭ、約０．０２〜約２５μＭ、約０．０５〜約２０μＭ、約０．１〜約２０μＭ、約０．５〜約２０μＭまたは約１〜約２０μＭの範囲にするのに充分な量である。

特定の実施形態では、本開示の化合物の投与量は、その化合物の最低血漿中濃度（トラフ濃度）を約０．００１〜約５００μＭ、約０．００２〜約２００μＭ、約０．００５〜約１００μＭ、約０．０１〜約５０μＭ、約１〜約５０μＭ、約０．０１〜約２５μＭ、約０．０１〜約２０μＭ、約０．０２〜約２０μＭ、約０．０２〜約２０μＭまたは約０．０１〜約２０μＭの範囲にするのに充分な量である。

特定の実施形態では、本開示の化合物の投与量は、その化合物の曲線下面積（ＡＵＣ）を約１００〜約１００，０００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬ、約１，０００〜約５０，０００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬ、約５，０００〜約２５，０００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬまたは約５，０００〜約１０，０００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬの範囲にするのに充分な量である。

治療する疾患と、対象の状態に応じて、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形は、経口投与経路、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＣＩＶ、大槽内注射もしくは注入、皮下注射または埋入）投与経路、吸入投与経路、経鼻投与経路、膣内投与経路、直腸投与経路、舌下投与経路、あるいは局所（例えば、経皮または局部）投与経路によって投与してよい。本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形は、各投与経路に適するように、単独でまたは組み合わせて、好適な投与単位で、製薬学的に許容可能な賦形剤、担体、アジュバント及びビヒクルとともに調合してよい。

一実施形態では、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形は、経口投与する。別の実施形態では、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形は、非経口投与する。さらに別の実施形態では、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形は、静脈内投与する。

本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形は、例えば単回ボーラス注射、経口用錠剤もしくは経口用丸剤のような単回用量として、または例えば、経時的な持続注入または経時的な分割ボーラス投与のように経時的に送達できる。本開示の化合物は、必要な場合、例えば、患者の疾患が安定するかもしくは退縮するまで、または患者の疾患が増悪するか、もしくは許容できない毒性が見られるまで、反復投与できる。例えば、固形腫瘍では、疾患の安定とは概して、測定可能な病巣の垂直直径が、直近の測定値から２５％以上増大していないことを意味する。Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ９２（３）：２０５−２１６（２０００）。疾患の安定または安定の欠如は、患者の症状の評価、身体診察、Ｘ線、ＣＡＴ、ＰＥＴまたはＭＲＩスキャン及び一般的に受け入れられているその他の評価モダリティを用いてイメージングした腫瘍の可視化のように、当該技術分野において知られている方法によって判断する。

本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形は、１日に１回（ＱＤ）投与することも、または１日に２回（ＢＩＤ）、１日に３回（ＴＩＤ）及び１日に４回（ＱＩＤ）など、１日あたりの投与量を複数回に分けて投与することもできる。加えて、投与は、持続投与（すなわち、連日にわたって毎日または毎日）、間欠投与、例えば、サイクルでの投与（すなわち、数日間、数週間または数ヶ月の休薬期間を含む）であることができる。本明細書で使用する場合、「毎日」という用語は、例えば、ある期間にわたって、治療化合物を各日に１回または２回以上投与することを意味するように意図されている。「持続的」という用語は、少なくとも１０日連続〜５２週間連続の期間で、治療化合物を毎日投与することを意味するように意図されている。「間欠的」または「間欠的に」という用語は、本明細書で使用する場合、規則的な間隔または不規則な間隔のいずれかで、停止したり開始したりすることを意味するように意図されている。例えば、本発明で提供する化合物の間欠投与は、１週間に１〜６日投与すること、サイクルで（例えば、２〜８週間連続して毎日投与した後に、最大で１週間、投与を行わない休薬期間を設けて）投与すること、または隔日で投与することである。「サイクル」という用語は、本明細書で使用する場合、治療化合物を毎日または持続的に投与するが、休薬期間を設けることを意味するように意図されている。

いくつかの実施形態では、投与頻度は、１日あたり約１回〜１カ月あたり約１回の範囲である。特定の実施形態では、投与は、１日に１回、１日に２回、１日に３回、１日に４回、１日おき、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回または４週間に１回である。一実施形態では、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形は、１日に１回投与する。別の実施形態では、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形を１日に２回投与する。さらに別の実施形態では、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形を１日に３回投与する。さらに別の実施形態では、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形を１日に４回投与する。

特定の実施形態では、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形を１日〜６カ月、１週間〜３カ月、１週間〜４週間、１週間〜３週間または１週間〜２週間、１日に１回投与する。特定の実施形態では、本発明で提供する化合物、またはその製薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を１週間、２週間、３週間または４週間、１日に１回投与する。一実施形態では、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形を１週間、１日に１回投与する。別の実施形態では、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形を２週間、１日に１回投与する。さらに別の実施形態では、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形を３週間、１日に１回投与する。さらに別の実施形態では、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形を４週間、１日に１回投与する。

さらに本発明で提供するのは、ＡＭＬ及び／またはＭＤＳのような各種血液癌と関連する１つ以上の臨床エンドポイントを得るための方法であって、本発明で提供する各種方法を用いて特定した化合物を治療有効量投与する必要のある患者に、その化合物を治療有効量投与することを含む方法である。

さらに本発明で提供するのは、血液癌である患者の全生存期間（ＯＳ）、完全寛解率（ＣＲＲ）、客観的奏効率（ＯＲＲ）、無増悪期間、無再発生存期間（ＲＦＳ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、無イベント生存期間、寛解持続期間、奏効期間及び／または寛解／奏効までの時間を向上させる方法であって、本発明で提供する各種方法を用いて特定した化合物を有効量投与することを含む方法である。特定の実施形態では、ＯＲＲには、完全寛解（ＣＲ）（すなわち、形態学的無白血病状態、形態学的ＣＲ、細胞遺伝学的ＣＲ、分子的ＣＲ及び不完全な血液の回復を伴う形態学的ＣＲ）と、部分寛解のすべての奏効が含まれる。

本明細書で使用する場合、全生存期間（ＯＳ）とは、臨床試験で無作為化した時点から、何らかの原因によって死亡するまでの時間を意味する。無増悪生存期間（ＰＦＳ）とは、臨床試験で無作為化した時点から、増悪または死亡するまでの時間を意味する。無イベント生存期間（ＥＦＳ）とは、試験に登録してから、疾患の増悪、何らかの理由による治療の中止または死亡を含め、治療のあらゆる失敗までの時間を意味する。全奏効率（ＯＲＲ）とは、完全奏功と部分奏効を示した患者の割合（％）の合計を意味する。奏効期間（ＤｏＲ）は、再発するかまたは疾患が憎悪するまで、奏効を示した時間である。

本明細書で使用する場合、「血液癌」には、骨髄腫、リンパ腫及び白血病が含まれる。一実施形態では、骨髄腫は、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、白血病は例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症、骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ヒトリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）白血病、肥満細胞症またはＢ細胞急性リンパ芽球性白血病である。いくつかの実施形態では、リンパ腫は例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、Ｂ細胞免疫芽球性リンパ腫、小非分割細胞性リンパ腫、ヒトリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）白血病／リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ＡＩＤＳ関連性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質転換リンパ腫、縦隔原発（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、リヒタートランスフォーメーション、節性辺縁帯リンパ腫またはＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。一実施形態では、血液癌は、例えば、ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫または辺縁帯リンパ腫を含む緩慢性リンパ腫である。

本発明で提供する各種方法を用いて特定した化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形は、組み合わせることも、本明細書に記載されているがんの治療及び／または予防に有用な他の治療剤と組み合わせて用いることもできる。

本明細書で使用する場合、「組み合わせて」という用語は、２つ以上の療法剤（例えば、１つ以上の予防剤及び／または治療剤）を使用することを含む。しかしながら、「組み合わせて」という用語を使用しても、疾患または障害のある患者に療法剤（例えば、予防剤及び／または治療剤）を投与する順序は制約されない。対象に第２の療法剤（例えば予防剤または治療剤）を投与する前（例えば、５分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、１２時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、９６時間前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、８週間前もしくは１２週間前）に、第２の療法剤の投与と同時に、または第２の療法剤の投与後（例えば、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後もしくは１２週間後）に、第１の療法剤（例えば、本発明で提供する化合物のような予防剤または治療剤、本発明で提供する化合物、例えば、本発明で提供する化合物、またはそのエナンチオマー、そのエナンチオマーの混合物、その製薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物、その水和物、その共結晶、その包接化合物もしくはその結晶多形など）を投与できる。三剤併用療法も本発明で想定されている。

本発明で提供する化合物と１つ以上の第２の活性剤の患者への投与は、同時または順次に、同じ投与経路または異なる投与経路によって行うことができる。特定の活性剤で用いる特定の投与経路の適性は、活性剤自体（例えば、血流に入る前に分解することなく、活性剤を経口投与できるか）と、治療するがんによって決まることになる。

本発明で提供する化合物の投与経路は、第２の療法剤の投与経路から独立している。一実施形態では、本発明で提供する化合物は、経口投与する。別の実施形態では、本発明で提供する化合物は、静脈内投与する。したがって、これらの実施形態によれば、本発明で提供する化合物は、経口投与または静脈内投与し、第２の療法剤は、経口投与、非経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、動脈内投与、経皮投与、舌下投与、筋肉内投与、直腸投与、経口腔投与、鼻腔内投与、リポソーム投与、吸入を介した投与、膣内投与、眼内投与、カテーテルもしくはステントによる局部送達を介した投与、皮下投与、脂肪内投与、関節内投与、髄腔内投与または徐放剤形での投与をすることができる。一実施形態では、本発明で提供する化合物と第２の療法剤は、同じ投与方法で、経口またはＩＶ投与する。別の実施形態では、本発明で提供する化合物は、１つの投与方法、例えばＩＶによって投与するが、第２の薬剤（抗がん剤）は、別の投与方法、例えば経口で投与する。

一実施形態では、第２の活性剤は、１日に１回または２回、約１〜約１０００ｍｇ、約５〜約５００ｍｇ、約１０〜約３５０ｍｇまたは約５０〜約２００ｍｇの量で、静脈内または皮下投与する。第２の活性剤の具体的な量は、使用する具体的な薬剤、治療または管理する疾患の種類、疾患の重症度及びステージ、ならびに患者に同時に投与する、本発明で提供する化合物と、いずれかの任意の追加の活性剤との量によって決まることになる。

下記の実施例は、例示として示されており、限定するために示されているものではない。
６．実施例
６．１ ３−［４−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンジルオキシ）−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル］−ピペリジン−２，６−ジオン（化合物Ｂ）の調製

この合成は、光学的に純粋な（Ｓ）３−（４−ヒドロキシ−１−オキソ−１，３−ジヒドロイソインドール−２−イル）ピペリジン−２，６−ジオン（１）で開始し、これを、カリウムカーボネートの存在下で１，４−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（２）でアルキル化して、ブロマイド３を得た。ブロマイド（３）をモルホリン（４）と反応させて、５を好収率で得た。その後、−７８℃でカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドによる５の環化を進行させて、キラル中心をそのまま残した状態で、イミド６を８２％の収率で得た。

実験：

４−［４−（４−ブロモメチルベンジルオキシ）−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル］−４−カルバモイル酪酸メチルエステル（３）：２Ｌの丸底フラスコに、（Ｓ）−メチル５−アミノ−４−（４−ヒドロキシ−１−オキソイソインドリン−２−イル）−５−オキソペンタノエート（１）（３０ｇ、１０３ｍｍｏｌ）と、１，４−ビス（ブロモメチル）ベンゼン（２）（８１ｇ、３０８ｍｍｏｌ）と、カリウムカーボネート（１４．１９ｇ、１０３ｍｍｏｌ）と、アセトニトリル（１．２Ｌ）を入れた。この混合物を５０℃で１２時間攪拌してから、室温まで冷却した。この混合物をろ過し、そのろ液をロータリーエバポレーターで濃縮した。得られた固体をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、シリカゲルカラムでＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨで溶出して精製して、４−［４−（４−ブロモメチルベンジルオキシ）−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル］−４−カルバモイル酪酸メチルエステル（３）を白色固体として得た（４０ｇ、収率８２％）。１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １．９８−２．１３ （ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ），２．１４−２．２３ （ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ），２．２３−２．３２ （ｍ，２Ｈ，ＣＨＨ，ＣＨＨ），３．５０ （ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），４．３４−４．６３ （ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），４．６７−４．８０ （ｍ，３Ｈ，ＣＨ２，ＮＣＨ），５．２５ （ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），７．１９ （ｓ，１Ｈ，ＮＨＨ），７．２４−７．３４ （ｍ，２Ｈ，Ａｒ），７．４１−７．５４ （ｍ，５Ｈ，Ａｒ），７．５８ （ｂｒ．ｓ，１Ｈ，ＮＨＨ）

４−カルバモイル−４−［４−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンジルオキシ）−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル］−酪酸メチルエステル（５）：メチル５−アミノ−４−（４−（４−（ブロモメチル）ベンジルオキシ）−１−オキソイソインドリン−２−イル）−５−オキソペンタノエート（３）（３６．５ｇ、７７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液に、モルホリン（４）（１４．７２ｍｌ、１６９ｍｍｏｌ）を室温で加えた。その混合物を室温で１時間攪拌した。得られた懸濁液をろ過し、そのろ液をロータリーエバポレーターで濃縮した。得られた油をＥｔＯＡｃに溶解し、水で洗浄した（５０ｍＬ×３）。その有機層をロータリーエバポレーターで濃縮して、４−カルバモイル−４−［４−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンジルオキシ）−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル］−酪酸メチルエステル（５）を泡状固体として得た（３９ｇ、収率９５％）。１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ ２．００−２．１２ （ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ），２．１４−２．２２ （ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ），２．２２−２．２９ （ｍ，２Ｈ，ＣＨＨ，ＣＨＨ），２．３０−２．３９ （ｍ，４Ｈ，ＣＨ２，ＣＨ２），３．４６ （ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），３．５０ （ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），３．５３−３．６３ （ｍ，４Ｈ，ＣＨ２，ＣＨ２），４．２８−４．５９ （ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），４．７３ （ｄｄ，Ｊ＝４．７，１０．２ Ｈｚ，１Ｈ，ＮＣＨ），５．２２ （ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），７．１４−７．２３ （ｍ，１Ｈ，ＮＨＨ），７．２６−７．３９ （ｍ，４Ｈ，Ａｒ），７．４１−７．５１ （ｍ，３Ｈ，Ａｒ），７．５８ （ｓ，１Ｈ，ＮＨＨ）

３−［４−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンジルオキシ）−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル］−ピペリジン−２，６−ジオン（６）：メチル５−アミノ−４−（４−（４−（モルホリノメチル）ベンジルオキシ）−イル−オキソイソインドリン−２−イル）−５−オキソペンタノエート（５）（４０ｇ、８３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液に、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（９．８０ｇ、８７ｍｍｏｌ）を−７８℃で加えた。この混合物をこの温度で３０分攪拌した。この反応混合物に、４５ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ溶液を加えてから、２００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加えた。この混合物を５００ｍＬのＥｔＯＡｃによって０℃で希釈し、５分攪拌し、分離した。その有機層を水（５０ｍＬ×３）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ロータリーエバポレーターで濃縮して、白色固体を得て、この固体をジエチルエーテル（３００ｍＬ）中で攪拌して、懸濁液を得た。この懸濁液をろ過して、３−［４−（４−モルホリン−４−イルメチル−ベンジルオキシ）−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル］−ピペリジン−２，６−ジオン（６）を白色固体として得た（２８．５ｇ、収率７２％）。ＨＰＬＣ：Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８、５μＭ、３．９×１５０ｍｍ、１ｍＬ／分、２４０ｎｍ、５分で９５／５アセトニトリル／０．１％Ｈ３ＰＯ４までグラジエント：Ｔ＝４．７８分（９８．５％）、ｍｐ：２０９〜２１１℃、１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ １．８６−２．０９ （ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ），２．２９−２．３８ （ｍ，４Ｈ，ＣＨ２，ＣＨ２），２．４４ （ｄｄ，Ｊ＝４．３，１３．０ Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨＨ），２．５３−２．６４ （ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ），２．８２−２．９９ （ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ），３．４６ （ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），３．５２−３．６１ （ｍ，４Ｈ，ＣＨ２，ＣＨ２），４．１８−４．５１ （ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），５．１１ （ｄｄ，Ｊ＝５．０，１３．３ Ｈｚ，１Ｈ，ＮＣＨ），５．２２ （ｓ，２Ｈ，ＣＨ２），７．２７−７．３８ （ｍ，５Ｈ，Ａｒ），７．４０−７．５３ （ｍ，３Ｈ，Ａｒ），１０．９８ （ｓ，１Ｈ，ＮＨ）、１３Ｃ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ６） ８ ２２．３６，３１．２１，４５．０９，５１．５８，５３．１４，６２．１０，６６．１７，６９．４１，１１４．９７，１１５．２３，１２７．６４，１２８．９９，１２９．８１，１２９．９５，１３３．３１，１３５．２９，１３７．６８，１５３．５０，１６８．０１，１７０．９８，１７２．８３、ＬＣＭＳ：Ｍ＋１ ４６５、元素分析 Ｃ２５Ｈ２７Ｎ３Ｏ５＋０．８６ Ｈ２Ｏに対する計算値：Ｃ： ６４．６３、Ｈ： ６．２２、Ｎ： ９．０４、実測値：Ｃ： ６４．３９、Ｈ： ６．１１、Ｎ： ８．８９、Ｈ２Ｏ： ３．２４

６．２ 化合物ＢによるＣＲＢＮ−ＤＤＢ１の環化
Ｍａｔｙｓｋｉｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１６，５３５（７６１１），２５２−７で以前説明されたようにして、環化に備えてＣＲＢＮ−ＤＤＢ１の精製を行った。化合物ＢによるＣＲＢＮ−ＤＤＢ１の環化は、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて行った。１ｍＭの化合物Ｂの存在下での３０ｍｇ／ｍＬのＣＲＢＮ−ＤＤＢ１と１：１で混合してから、２０℃にて、２００ｍＭのフッ化ナトリウム及び２０％ＰＥＧ３３５０を含む母液に対して平衡化した。２０％エチレングリコールを添加したリザーバー溶液において、結晶を凍結保護し、液体窒素下で冷却した。データをＡｄｖａｎｃｅ Ｐｈｏｔｏｎ ＳｏｕｒｃｅのビームラインＬＳ−ＣＡＴ２１ＩＤ−Ｆで収集した。４ＴＺ４のサーチモデルとともに、Ｐｈａｓｅｒを用いて、分子置換法によって、複合体結晶構造を解明した（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１４，２１（９），８０３−９を参照されたい）。その後、Ｒｅｆｍａｃ５を用いて、Ｃｏｏｔを用いたマニュアルモデル構築と精密化を行った（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ２０１１，６７（Ｐｔ４），３５５−６７を参照されたい）。

６．３ ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ
トロンビン切断／オルトニッケル工程を除外する以外は、他の箇所に記載されているようにして、このアッセイで使用する、完全長ヒトＤＤＢ１に結合した６×Ｈｉｓタグ化完全長ヒトＣＲＢＮを精製した。このアッセイでは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０のアッセイバッファーにおいて、６０ｎＭの６×Ｈｉｓタグ化ＣＲＢＮ−ＤＤＢ１と、３０ｎＭのＣｙ５コンジュゲートセレブロンモジュレーター及び３ｎＭのＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｅｕ−ａｎｔｉ−Ｈｉｓ Ｔａｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＰＶ５５９６）とを混ぜ合わせた。ＦＲＥＴは、３４０ｎｍで励起して、６１５ｎｍでの発光（Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ発光）と６６５ｎｍでの発光（ＦＲＥＴ発光）をモニタリングすることによって観察し、Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ発光に対するＦＲＥＴの比率（６６５ｎｍ／６１５ｎｍ）によって、ＦＲＥＴ効率を求める。競合するセレブロン調節化合物またはＤＭＳＯ担体を滴定し、１０分インキュベートしてから、ディレイが６０マイクロ秒のプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎでスキャンして、ＦＲＥＴ効率の喪失を定量する。

６．４ 細胞ベースの化学発光基質分解アッセイ
化合物を事前に点着した３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３７１２）に、セレブロン基質のＩｋａｒｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ及びＧＳＰＴ１を発現しているＤＦ１５多発性骨髄腫細胞であって、ｅＰＬタグ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）に融合した細胞を分注した。化合物は、音響ディスペンサー（ＥＤＣ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＴＳ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）によって、３８４ウェルプレートに、１０点用量応答曲線で、３倍希釈を用いて、１０μＭで開始して０．０００５μＭまで低下させて分注した。１ウェルあたりに、５０００個の細胞を含む２５μＬの培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％熱不活化ＦＢＳ＋２５ｍＭのＨｅｐｅｓ＋１ｍＭのピルビン酸ナトリウム＋１×ＮＥＡＡ＋０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８＋１×Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）を分注した。アッセイプレートを３７℃で、５％ＣＯ２とともに４時間インキュベートした。インキュベート後、２５μｌのＩｎＣＥＬＬ Ｈｕｎｔｅｒ（商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ、カタログ番号９６−０００２、Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を各ウェルに加え、室温で３０分、光から保護した状態でインキュベートした。３０分後、発光を発光測定装置ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（Ｃａｒｙ，ＮＣ）で計測した。化合物が所定の基質を分解するＥＣ５０値（５０％効果濃度）を求めるために、４パラメーターロジスティックモデル（シグモイド型用量応答モデル）（ＦＩＴ＝（Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／１＋（（Ｃ／ｘ）＾Ｄ））））（式中、Ｃは変曲点（ＥＣ５０）、Ｄは相関係数、それぞれ、Ａは適合度の下限、Ｂは適合度の上限である）を使用した。コントロール基質分解曲線の割合はいずれも、Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅ（ＩＤＢＳ）を用いて処理及び評価した。

６．５ 内因性基質タンパク質レベルのイムノブロット解析
１×１０^６個の細胞（ＤＦ１５及びＯＰＭ２のいずれか）をレナリドマイド、ポマリドミドまたは化合物Ｂで５時間処理してから回収した。１×冷ＰＢＳで速やかにリンスした後、細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ‘ｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって細胞を溶解した。１０ｕｇの全溶解液を各レーンに入れた。Ｂｉｏ−ＲａｄのＴｕｒｂｏ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。ウェスタンで用いた抗体には、Ｉｋａｒｏｓ（１４８５９Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａｉｏｌｏｓ（１５１０３Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、アクチン（Ａ５３１６、Ｓｉｇｍａ）及びＣＲＢＮ（Ｃｅｌｇｅｎｅの自家作製抗体）が含まれていた。

６．６ 化合物Ｂは、ＣＲＢＮに対して高い親和性を示す
レナリドマイドとポマリドミドのように、化合物Ｂは、セレブロンのトリＴｒｐポケット内で結合するグルタルイミド環と、セレブロンと基質の両方と相互作用できるイソインドリノン環とを含む。加えて、化合物Ｂの化学構造は、レナリドマイドとポマリドミドよりも延伸されており、追加のフェニルとモルホリノ部分を含み、それにより、セレブロンまたは基質とのさらなる相互作用が可能になる（図３を参照）。レナリドマイドとポマリドミドと化合物Ｂとの相対的な結合親和性を判断するために、我々は、ＴＲ−ＦＲＥＴセレブロン結合アッセイ（上記の６．３項に説明されている）を用いて、これらの化合物のＩＣ５０値を求めた。このアッセイでは、ＣＲＢＮのトリＴｒｐポケットからのＣｙ５コンジュゲートセレブロン調節化合物の変位をモニタリングする。これらのアッセイ条件下では、それぞれ、レナリドマイドのＩＣ５０値は１．５μＭで、ポマリドミドのＩＣ５０値は１．２μＭで、同程度であったが、化合物Ｂでは、これらよりも親和性が有意に高く、ＩＣ５０は約６０ｎｍであった（図３を参照）。

６．７ 細胞分解アッセイでは、化合物Ｂの方が、効能が高い
化合物Ｂは、生化学的な結合親和性の向上と一致して、ＩｋａｒｏｓまたはＡｉｏｌｏｓのリガンド依存性枯渇を測定した細胞分解アッセイでの効能も高かった（図４のパートａ）とｂ）を参照）。しかしながら、化合物Ｂは、ＧＳＰＴ１またはＣＫ１αをあまり分解しない。細胞において、化合物による処理が、ＩｋａｒｏｓとＡｉｏｌｏｓの分解に及ぼす作用を測定するために、我々は、ｅＰＬタグを組み込んだタンパク質の化学発光シグナルを追跡する細胞ベースのアッセイを用いた。化合物Ｂによる処理によって、Ｉｋａｒｏｓタンパク質レベルが喪失し、ＥＣ５０は、レナリドマイドでの６７ｎＭとポマリドミドでの２４ｎＭに対して、１ｎＭとなることを我々は見出している。化合物Ｂは、Ａｉｏｌｏｓに対しても同様に強力であり、ＥＣ５０は、レナリドマイドでの８７ｎＭとポマリドミドでの２２ｎＭに対して、０．５ｎＭである。加えて、基質の枯渇度は、化合物Ｂの方が大きく、タンパク質の再合成速度よりも、基質分解の方が効率的であることが示されている。化合物Ｂの細胞分解能が高いことは、生化学的アッセイで観察された結合親和性の向上と一致することから、セレブロン親和性の向上が、細胞での効能の向上に寄与する可能性が高いことが示唆されている。これに対して、レナリドマイドよりも、ポマリドミドで観察された、細胞での効能が３〜４倍高いのは、基質親和性の変化のような他の要因によるものである可能性が高い。

これらの作用が、内因性タンパク質と関連していることを確かめるために、我々は、ＤＦ１５細胞とＯＰＭ２細胞をレナリドマイド、ポマリドミド及び化合物Ｂで５時間処理した。化合物Ｂで処理したところ、レナリドマイドとポマリドミドよりも、ＩｋａｒｏｓとＡｉｏｌｏｓの分解が促進され（図４、パートｃ）を参照）、化学発光ベースの細胞内分解アッセイの結果と整合していた。

６．８ ＤＤＢ１及び化合物Ｂとの複合体におけるＣＲＢＮの結晶構造
化合物Ｂの方が、結合親和性が高くなる機序を調べるために、我々は、ヒトセレブロン（４０〜４４２番目のアミノ酸）とヒトＤＤＢ１（完全長）に結合した化合物Ｂの三元複合体の結晶構造を３．１Ａの分解能で求めた（図５のパートａ）を参照）。全体構造は、以前我々が報告した、セレブロン−ＤＤＢ１の構造によく似ており、セレブロンの面のうち、ＤＤＢ１相互作用部位とは反対側の面に、セレブロンモジュレーターの結合部位を有していた。

化合物Ｂのグルタルイミド環は、レナリドマイド、ポマリドミド及び１−（３−クロロ−４−メチルフェニル）−３−（（２−（２，６−ジオキソピペリジン−３−イル）−１−オキソイソインドリン−５−イル）メチル）尿素（化合物Ｃ）と同様の結合様式で、トリＴｒｐポケット内で結合し、イソインドリノン環は、レナリドマイド（図５）、ポマリドミド及び化合物Ｃと同様の結合様式で、表面上に結合している。化合物Ｂは、レナリドマイドとポマリドミドよりも延伸した構造を有し、その結晶構造によって、化合物Ｂのフェニル環は、セレブロン表面にＥ３７７、Ｈ３７８、Ｐ３５２及びＨ３５３によって形成された溝の中に位置することが示されている。モルホリン環は、残基Ｉ１５４及びＦ１０２で形成された疎水性ポケットの方に向いているが、この部分は、おそらくは動きが原因で、電子密度が充分には定義されていない。Ｆ１５０は、いくつかの他の構造とは対照的に、化合物Ｂのモルホリノ基に隣接して位置し、Ｆ１５０は、延伸したコンホメーションで見られる。しかしながら、このコンホメーションは、慎重に解釈する必要がある。Ｆ１５０は、他の構造では、移動性を示しているループの頂点に見られ、結晶格子定数に関与することが多いからである。

ＣＫ１ａ及びＧＳＰＴ１との複合体におけるセレブロンの構造によって、セレブロン基質との主要な相互作用部位が、特徴付けられている基質間で共有されていることが明らかになったとともに、ドッキング及び変異誘発試験により、ＩｋａｒｏｓとＡｉｏｌｏｓにおいて、同じ相互作用部位が予測された。この相互作用部位は、セレブロンの３つの水素結合ドナーであるＮ３５１、Ｈ３５７及びＷ４００によって形成されており、これらのドナーは、結合しているセレブロンモジュレーターのイソインドリノンまたはフタルイミド環に近い位置にある。これらの残基は、化合物Ｂのフェニル環とモルホリン環からは離れた位置にあるので、化合物活性の違いは、これらの部分とＩｋａｒｏｓまたはＡｉｏｌｏｓとの直接的な基質相互作用に起因する可能性は低い。その代わりに、セレブロン−ＤＤＢ１に結合したレナリドマイドと化合物Ｂの結晶構造を比較すると、親和性の向上が観察されるのは、化合物Ｂとセレブロンとの表面相互作用の向上とよく相関することが明らかになる（図５のパートｂ）を参照）。

本願を通じて、様々な刊行物が参照されている。本発明が関連する分野の現状をさらに充分に説明する目的で、これらの刊行物の開示内容は、本願での参照により、その全体が、本明細書に援用される。上に示した実施例と実施形態を参照して、本発明について説明してきたが、本発明の趣旨から逸脱しなければ、様々な修正を行えることを理解されたい。

Claims (35)

1. （ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、（ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子とを含む複合体であって、前記Ｃｙ５コンジュゲート小分子が前記ＣＲＢＮと結合する前記複合体。
2. ＤＤＢ１をさらに含む、請求項１に記載の複合体。
3. 前記Ｃｙ５コンジュゲート小分子が、前記ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する、請求項１または２に記載の複合体。
4. 前記Ｃｙ５コンジュゲート小分子が、下記の式（Ｉ）の構造を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
   

   
5. 化合物がセレブロン（ＣＲＢＮ）に結合するかの判断方法であって、前記化合物を複合体と接触させることを含み、前記複合体が、
   （ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、
   （ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子と、を含み、前記Ｃｙ５コンジュゲート小分子が前記ＣＲＢＮと結合する前記方法。
6. 前記複合体がＤＤＢ１をさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記Ｃｙ５コンジュゲート小分子が、前記ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する、請求項５または６に記載の方法。
8. 前記Ｃｙ５コンジュゲート小分子が、下記の式（Ｉ）の構造を有する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
   

   
9. 前記化合物を前記複合体と接触させた後に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することをさらに含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記化合物を前記複合体と接触させる前に、ＦＲＥＴを測定することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記化合物を前記複合体と接触させた後に、ＦＲＥＴが減少した場合に、前記化合物が前記ＣＲＢＮに結合すると判断することをさらに含む、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. ３４０ｎｍで励起して、６１５ｎｍでの発光（Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ発光）と６６５ｎｍでの発光（ＦＲＥＴ発光）をモニタリングすることによってＦＲＥＴを観察する、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記化合物を前記複合体と接触させる前に、第１のＦＲＥＴ効率を求め、前記化合物を前記複合体と接触させた後に、第２のＦＲＥＴ効率を求め、ＦＲＥＴ効率が、６１５ｎｍでのＮｏｎ−ＦＲＥＴ発光に対する６６５ｎｍでのＦＲＥＴ発光の比率である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記第２のＦＲＥＴ効率が、前記第１のＦＲＥＴ効率よりも低い場合に、前記化合物が前記ＣＲＢＮに結合すると判断することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
15. セレブロン（ＣＲＢＮ）に対する化合物の親和性の測定方法であって、前記化合物を複合体と接触させることを含み、前記複合体が、
    （ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、
    （ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子と、を含み、前記Ｃｙ５コンジュゲート小分子が前記ＣＲＢＮと結合する前記方法。
16. 前記複合体が、ＤＤＢ１をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記Ｃｙ５コンジュゲート小分子が、前記ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 前記Ｃｙ５コンジュゲート小分子が、下記の式（Ｉ）の構造を有する、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
    

    
19. 前記化合物を前記複合体と接触させた後に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することをさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記化合物を前記複合体と接触させる前に、ＦＲＥＴを測定することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. ３４０ｎｍで励起して、６１５ｎｍでの発光（Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ発光）と６６５ｎｍでの発光（ＦＲＥＴ発光）をモニタリングすることによってＦＲＥＴを観察する、請求項１９〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記化合物を前記複合体と接触させる前に、第１のＦＲＥＴ効率を求め、前記化合物を前記複合体と接触させた後に、第２のＦＲＥＴ効率を求め、ＦＲＥＴ効率が、６１５ｎｍでのＮｏｎ−ＦＲＥＴ発光に対する６６５ｎｍでのＦＲＥＴ発光の比率である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記第１のＦＲＥＴ効率と前記第２のＦＲＥＴ効率との差を測定することによって、ＣＲＢＮに対する前記化合物の親和性を求める、請求項２２に記載の方法。
24. 疾患を治療するための化合物の特定方法であって、前記化合物を複合体と接触させることを含み、前記複合体が、
    （ｉ）そのＣＲＢＮのＮ末端にユウロピウム−抗Ｈｉｓ抗体を有するＣＲＢＮと、
    （ｉｉ）Ｃｙ５コンジュゲート小分子と、を含み、前記Ｃｙ５コンジュゲート小分子が前記ＣＲＢＮと結合する前記方法。
25. 前記複合体がＤＤＢ１をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記Ｃｙ５コンジュゲート小分子が、前記ＣＲＢＮにおいてＴｒｐ３８０、Ｔｒｐ３８６及びＴｒｐ４００によって形成された疎水性のトリトリプトファンポケット内で結合する、請求項２４または２５に記載の方法。
27. 前記Ｃｙ５コンジュゲート小分子が、下記の式（Ｉ）の構造を有する、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
    

    
28. 前記化合物を前記複合体と接触させた後に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することをさらに含む、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記化合物を前記複合体と接触させる前に、ＦＲＥＴを測定することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記化合物を前記複合体と接触させた後に、ＦＲＥＴが減少した場合に、前記疾患の治療に、前記化合物を使用できる可能性があると判断することをさらに含む、請求項２８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. ３４０ｎｍで励起して、６１５ｎｍでの発光（Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ発光）と６６５ｎｍでの発光（ＦＲＥＴ発光）をモニタリングすることによってＦＲＥＴを観察する、請求項２８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記化合物を前記複合体と接触させる前に、第１のＦＲＥＴ効率を求め、前記化合物を前記複合体と接触させた後に、第２のＦＲＥＴ効率を求め、ＦＲＥＴ効率が、６１５ｎｍでのＮｏｎ−ＦＲＥＴ発光に対する６６５ｎｍでのＦＲＥＴ発光の比率である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記第２のＦＲＥＴ効率が、前記第１のＦＲＥＴ効率よりも低い場合に、前記疾患の治療に、前記化合物を使用できる可能性があると判断することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記疾患が、ＣＲＢＮ介在性疾患である、請求項２４に記載の方法。
35. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体を含む組成物。

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