JP2020507077A - 有害事象を示すマーカーとしてのｐｒｏａｄｍ - Google Patents

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Abstract

本発明は、対象の有害事象、特に死亡、の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化に関する。本発明は、前述の対象の試料中のプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することを含む方法に関し、ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルは、前述の対象の前述の有害事象の指標であり、ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルは、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、前述の対象の前記有害事象は、比較に基づき特定される。本発明はさらに、本発明の方法を実施するためのキットに関する。

Description

本発明は、対象の有害事象、特に死亡の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化に関する。本発明は、対象の試料中のプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、ｐｒｏＡＤＭのレベルが、前述の対象の有害事象の指標である、決定すること、ならびに／または対象の試料中の少なくとも１つのヒストン、特にヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２Ａ、および／もしくはＨ３のレベルを決定することであって、少なくとも１つのヒストンのレベルが、前述の対象の有害事象の指標である、決定することを含む方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法を実施するためのキットに関する。
病院の集中治療室（ＩＣＵ）は通常、最も重症の患者および最も高い死亡率を有する部である（Ｋａｎｅｋｏ−Ｗａｄａ Ｆｄｅ，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ−Ｃｈｅｒｉｔ ｅｔ ａｌ．２０１５）。これは、主にＩＣＵの長期滞在、現代的かつ高価な技術、および集中治療の全体的な複雑さにより、あらゆる医療システムにとって非常に高価な要素である（Ｈａｌｐｅｒｎ ａｎｄ Ｐａｓｔｏｒｅｓ ２０１０）。集中治療医学のかなりの努力にもかかわらず、ＩＣＵの死亡率は、分析した患者集団およびその重症度の状態に応じて、６．４％〜最大４０％の範囲である（Ｍａｙｒ，Ｄｕｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２００６）。ＩＣＵにおける有害転帰および死亡の主な原因は、多臓器機能不全症候群（ＭＯＤＳ）などの臓器不全、および敗血症に関連している（Ｖｉｎｃｅｎｔ ２００８、Ｆｅｒｒｅｉｒａ ａｎｄ Ｓａｋｒ ２０１１）。敗血症患者のサブグループに関して、ヨーロッパにおける死亡率は、さらにより高く、２７％〜５４％の範囲である（Ｖｉｎｃｅｎｔ ２００８）。
有害または致命的事象／転帰を有するハイリスク患者を特定するために（ｉ）、ＩＣＵ入院後の早期判断において臨床医を助けるために（ｉｉ）、臨床治療およびリソースを最適化するために（ｉｉｉ）、かつ最終的にＩＣＵ死亡を減少させるために、短期および長期転帰などの決定的なパラメータに関する知識は、高い価値を有する（Ｍａｙｒ，Ｄｕｎｓｅｒ ｅｔ ａｌ．２００６）。今までのところ、重症度スコアは、リスクおよび重症度評価、ならびに重篤な患者の転帰予測に主に使用されている。主なＩＣＵスコアリングシステムは、それぞれ１７、１４、または６の生理学的または臓器特異的パラメータに基づく、急性生理学および慢性健康評価（ＡＰＡＣＨＥ）スコア、単純化急性生理学スコア（ＳＡＰＳ）、および逐次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコアである（Ｂｏｕｃｈ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ２００８）。患者の転帰を予測するそれらの能力にもかかわらず、そのようなスコアは、様々な不利点も有する。例えば、スコアの各単一パラメータが評価および判断される必要がある。したがって、スコアの結果の決定は時間がかかり（１日以上）、これは、迅速なテストが高く評価されているＩＣＵケアでは特に不利である。さらに、そのようなスコアは全ての評価している臨床医の主観に依存し、頻繁に再較正される必要がありそして個々に決定されるべきいくつかのパラメータに頼る必要がある。
したがって、対象、特に重篤な対象における有害事象の診断、予後、リスク評価および／またはリスク層別化についての単純で迅速かつ客観的な基準が必要とされている。
したがって、本発明の根底にある技術的問題は、対象の有害事象、特に致命的事象、例えば死亡（ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）／死亡（ｄｅａｔｈ）を予測するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供するための手段および方法の提供である。
技術的問題は、本明細書の以下に提供され、添付の特許請求の範囲において特徴付けられるような、実施形態を提供することによって解決される。
本発明は、対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のための方法に関し、前述の方法は、対象の試料中のプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することを含み、ｐｒｏＡＤＭまたはそのフラグメントの前述のレベルは、前述の対象の前述の有害事象を示す、方法に関する。
さらに、対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のための方法に関し、前述の方法は、対象の試料中の少なくとも１つのヒストンまたはそのフラグメントのレベルを決定することを含み、前述の少なくとも１つのヒストンまたはそのフラグメントの前述のレベルは、前述の対象の前述の有害事象を示す。
さらに、本発明は、対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のための方法に関し、前述の方法は、少なくとも１つのヒストンのレベルおよびプロアドレノメジュリンのレベル（ｐｒｏＡＤＭ）を決定することを含む。少なくとも１つのヒストンのレベルおよびｐｒｏＡＤＭのレベルおよび／またはそのフラグメントは、前述の対象の前述の有害事象の指標である。本明細書で使用される場合、「ｐｒｏＡＤＭ」は、特に明記しない限り、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭおよび成熟ＡＤＭなどのフラグメントも包含する。
本発明は上記の技術的問題を解決する。以下および添付の実施例に記載されるように、少なくとも１つのヒストン、特にヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３のレベル、および／またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、対象の有害事象、例えば死亡との強い統計的関係を実証することが臨床研究において予想外に見出された。例示的な実施例１を参照のこと。したがって、少なくとも１つのヒストンタンパク質および／または前述のｐｒｏＡＤＭ、例えばＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、有害事象の予測のためのマーカーとして使用できることが本明細書に記載されている。特に、実施例は、そのようなマーカーが生存者または非生存者、すなわち対象の死亡の予測に使用できることを文書化している。
添付の実施例では、驚くべきことに、参照レベル未満であるか、またほぼ参照レベルに等しく、例えば約０．９ｎｍｏｌ／Ｌである対象のｐｒｏＡＤＭ（特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベルが、有害事象が約２８日以内に起こらないことを示すことが実証された。ｐｒｏＡＤＭの約０．９ｎｍｏｌ／Ｌの参照レベルは、非生存者の特定において１００％の感度を提供し、すなわち、この閾値未満のレベルは、２８日の期間内に生存するであろう患者を確実に特定する。ｐｒｏＡＤＭについての約１．８ｎｍｏｌ／Ｌの参照レベルもまた、添付の実施例における有害事象、例えば死亡を確実に予測する。したがって、ｐｒｏＡＤＭのレベルは、例えば約２８日以内に、対象が生存するかどうかを示す。
対象が疾患および／または状態、例えば臓器不全の重症度によって層別化されている場合、ｐｒｏＡＤＭ（特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）が非生存者または生存者を識別するのに信頼できることがさらに実証された。予測方法は原則として、任意の数の臓器不全、すなわち、任意のＳＯＦＡスコアを有する対象に対して機能する。ｐｒｏＡＤＭ（特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベルの検出は、全ての重症度群における非生存者、すなわち、任意のＳＯＦＡスコアの特定を可能にする。これは、あまり重篤ではない患者（６未満のＳＯＦＡスコア）にとって特に重要であり、これは、この群が、敗血症の臨床経過における最も初期の提示、および／または臨床（特にＩＣＵもしくはＥＤ）環境におけるこの疾患のより重症度の低い形態のいずれかを表すためである。したがって、ｐｒｏＡＤＭ（特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）は、早期敗血症管理のための信頼できるマーカーであり、これは、それが迅速な予後値を提供し、かつ診断的介入および治療決定を導くのを助けるためである。
対象が、あまり重篤ではない対象（例えば、６以下のＳＯＦＡスコア）、中程度に重篤な対象（例えば、７〜１２のＳＯＦＡスコア）、または重篤な対象（例えば、１３以上のＳＯＦＡスコア）に分類され得ることが、添付の実施例に示される。したがって、対象は、ＳＯＦＡスコアに基づき分類され得る。ｐｒｏＡＤＭ（特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）の予測値は、それを対象のＳＯＦＡスコアの決定と組み合わせることによって改善され得る。しかしながら、このマーカーの予測値は、ＳＯＦＡスコアの決定が必要とされないようなものであり、言い換えれば、本発明の方法のいくつかの態様では、対象のｐｒｏＡＤＭ（好ましくはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベルは決定されるが、ＳＯＦＡスコアは決定されない。添付の実施例では、ｐｒｏＡＤＭ（特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベルが、疾患重症度の程度が低い対象（あまり重篤ではない対象）の場合、試験マーカーの中で最高の性能を示すことが示された。そのような対象は、６以下のＳＯＦＡスコアを有し得る。特に、約１．８ｎｍｏｌ／Ｌの参照レベルよりも低い、あまり重篤ではない患者のｐｒｏＡＤＭ（特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベルが、有害事象、特に死亡が約２８日以内に起こらないことを示すことが実証された。実施例２、表９を参照されたい。さらに、ｐｒｏＡＤＭはまた、中等度の重症度の罹患対象の場合、乳酸塩などの他のマーカーと比較して有害事象の予測にも有利である。そのような対象は、７〜１２のＳＯＦＡスコアを有し得る。特に、約３．２ｎｍｏｌ／Ｌの参照レベルよりも低い、中等度の重症度の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルが、有害事象、特に死亡が約２８日以内に起こらないことを示すことが実証された。実施例２、表９を参照されたい。最後に、ｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、重篤な対象の有害事象を確実に予測する。特に、５．６ｎｍｏｌ／Ｌの参照レベルよりも低い重篤な対象のｐｒｏＡＤＭのレベルが、有害事象、特に死亡が約２８日以内に起こらないことを示すことが実証された。実施例２、表９を参照のこと。
したがって、ｐｒｏＡＤＭ（特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベルは、対象のリスクを予測し、したがってどの療法が最も好適であるかを臨床医が判断するのに役立つ。したがって、ｐｒｏＡＤＭのレベルは、診療所における患者の治療を改善する。したがって、ｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、特に、さらなる集中治療、例えば、ＩＣＵまたは救急科（ＥＤ）での治療を必要としない対象を特定するために、集中治療室の管理でも使用され得る。特に、約０．９ｎｍｏｌ／Ｌ（好ましくは０．８８ｎｍｏｌ／Ｌ）よりも低いｐｒｏＡＤＭ基準値は、ＩＣＵまたはＥＤへの入院後２８日以内の死亡を「除外」することを可能にする。したがって、このカットオフは、明らかな臓器不全の臨床的兆候がまだ明らかになっていない場合に、早期の臨床決定を導くのに有用である。したがって、本発明の方法は、この目的のために使用され得る。（さらなる）集中治療（例えば、ＩＣＵまたはＥＤにおいて）を必要としないが、例えば、一般病棟に移され得る対象の特定は、ＩＣＵまたはＥＤにおける費用負担者の費用を削減し、ベッドを解放する。
特定の態様では、本発明の方法は、死亡を予測するため、または臓器不全の臨床的徴候がまだ明らかにされていない対象（６以下、好ましくは４以下、より好ましくは３以下などの低いＳＯＦＡスコアを有する対象に対応する患者）を層別化するために使用される。
加えて、ｐｒｏＡＤＭ（特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベルがまた、前述の対象のＳＯＦＡスコアを修正するために使用され得ることが添付の実施例に示されている。例えば、ＳＯＦＡは、前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルに基づき適応され得、例えば増加し得、前述の修正ＳＯＦＡスコアは、前述の有害事象の指標である。
特に、対象のＳＯＦＡスコアは、対象が約１．８ｎｍｏｌ／Ｌよりも高いｐｒｏＡＤＭレベルを有する場合に１増加し得る。そのような修正ＳＯＦＡスコアは、予測をさらに改善する。実施例２を参照されたい。
ＳＯＦＡスコアの代わりに、またはそれに加えて、クイックＳＯＦＡ（ｑＳＯＦＡ）スコアも決定され得る。
添付の実施例において、少なくとも１つのヒストン、特にＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３のレベルが、対象の有害事象、例えば死亡と強く関連していることも驚くべきことに実証されている。特に、添付の実施例は、ヒストンのレベルが、約２８日以内に、約７日以内に、または約３日以内に起こる死亡などの有害事象と統計的に関連していることを実証する。添付の実施例は、マーカーのレベルの増加が、有害事象、例えば死亡が対象において起こることを示すことを明らかにした。添付の実施例１、例えば表１〜６を参照されたい。さらに、ヒストンのレベルは、例えば７日または３日以内に起こる短い有害事象と特に相関することが実証された。さらに、呼吸器疾患を患っている対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルは、７日以内に起こる有害事象、例えば死亡と相関することが見出された。例えば、表４を参照されたい。加えて、尿路感染症を患っている対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルは、２８日以内に起こる有害事象、例えば死亡と相関することが見出された。例えば、表５を参照されたい。さらに、悪性腫瘍を患っている対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルは、２８日以内に起こる有害事象、例えば死亡と相関することが見出された。例えば、表６を参照されたい。
さらに、驚くべきことに、添付の実施例において、ｐｒｏＡＤＭのレベル、例えばフラグメントＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、対象の有害事象、例えば死亡と強く相関していることも実証されている。特に、添付の実施例は、ｐｒｏＡＤＭのレベルが、約２８日以内、約７日以内、または約３日以内に起こる有害事象、例えば死亡と統計的に関連していることを実証している。例えば、表２および３を参照されたい。特に、添付の実施例は、ｐｒｏＡＤＭのレベルが、２８日以内に起こるか、または７日以内に起こる有害事象、例えば死亡の指標であることを実証している。例えば、表２および３を参照されたい。
さらに、マーカーのレベルの組み合わせが決定されれば予測がさらに改善されることが添付の実施例に記載されている。特に、ｐｒｏＡＤＭのレベルに加えて少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することは、有害事象、例えば死亡の予後診断をさらに改善した。表１〜３を参照されたい。少なくとも１つのヒストンまたはｐｒｏＡＤＭのレベルに加えてさらなるマーカーおよび／またはパラメータのレベルを決定することは、有害事象、例えば死亡の予測をさらに改善することが添付の実施例に記載されている。例示的な表１〜３を参照のこと。例えば、臨床スコアを決定することはｐｒｏＡＤＭまたはヒストンのレベルに基づく予測も改善することが添付の実施例において実証されている。また、アルドラーゼＢなどのバイオマーカーのレベルの決定は、ｐｒｏＡＤＭまたはヒストンのレベルに基づく予測を改善する。したがって、本発明はまた、さらなるマーカーおよび／またはパラメータのレベル、すなわちマーカーパネルの使用を決定することを含む方法に関する。
本発明は、とりわけ、従来の方法に対して以下の利点を有する：本発明の方法およびキットは、迅速で、客観的で、使いやすく、そして有害事象の予測に正確である。本発明の方法およびキットは、マーカーに関する。なぜなら、ヒストンのレベルおよびｐｒｏＡＤＭのレベルは、日常的に得られた血液試料または対象から得られたさらなる体液において決定され得るからである。さらに、ヒストンまたはｐｒｏＡＤＭのレベルの決定は非常に速い。したがって、本発明の方法およびキットは有害事象、例えば、死亡の迅速な評価、ならびに診断および予後診断に適している。したがって、迅速な決定はまた、有害事象の発生のリスクを回避または低減する迅速な治療決定にも適している。さらに、１つの特定の値としてのバイオマーカー測定の単純な結果のために、この方法または本発明のキットを使用するときに医療スタッフの主観的な偏りはない。したがって、再現性は、例えば、ＳＯＦＡスコアで採用されるような生理学的パラメータについての主観的スコアリングと比較して改善されている。ヒストンまたはｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、予測をさらに改善し、重篤な患者の全体的な状態を評価するための特定の感度および特異性に分析を適応させるために、さらなるマーカー（複数可）および／またはパラメータ（複数可）、例えばＳＯＦＡスコアなどの臨床スコアと組み合わされ得る。
したがって、本明細書で提供される方法およびキットは、対象の発生する有害事象、例えば死亡（ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）／死亡（ｄｅａｔｈ）の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化において有利である。
本明細書の上記および添付の実施例に文書化されているように、ヒストンのレベルおよびｐｒｏＡＤＭのレベルは、驚くべきことに、対象における死亡などの有害事象と相関することがわかった。したがって、本発明は、対象の有害事象、特に死亡の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のための方法およびキットに関する。
さらに、本発明は、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルが有害事象、特に死亡の指標となる、対象のモニタリング、治療ガイダンスおよび／または治療管理のための方法およびキットに関する。本明細書の上記および下記に提供される定義はまた、そのような態様に適用される。
特に、本発明は、対象の有害事象、特に死亡の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のための方法に関し、前述の方法は、
（ｉ）前述の対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することであって、少なくとも１つのヒストンの前述のレベルが、前述の対象の前述の有害事象、特に死亡の指標である、決定すること、および／または
（ｉｉ）前述の対象の試料中のプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、前述の対象の前述の有害事象、特に死亡の指標である、決定することを含む。
本明細書で使用される場合、「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」という用語などは、対象の試料中のヒストンもしくはそのフラグメントのレベルを決定すること、または対象の試料中の２つ以上のヒストンもしくはそのフラグメントのレベルを決定することを指す。特に、「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」は、対象の試料中のヒストンのレベルを決定することを指し得、好ましくは、ヒストンは、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２Ａ、およびＨ３からなる群から選択される。特に、ヒストンＨ２Ｂのレベルが決定される。さらに、「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」は、対象の試料中のヒストンのレベルを決定することを指し得、特に、ヒストンＨ４のレベルが決定される。さらに、「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」は、対象の試料中の２つのヒストンのレベルを決定することを指し得、好ましくは、ヒストンＨ２ＢよびＨ４のレベルが決定される。さらに、「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」は、対象の試料中の３つのヒストンのレベルを決定することを指し得、好ましくは、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、およびＨ２Ａのレベルが決定される。さらに、「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」は、対象の試料中の４つのヒストンのレベルを決定することを指し得、好ましくは、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３のレベルが決定される。
したがって、本発明の文脈において、「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」は、ヒストンＨ２Ｂのレベル、ヒストンＨ４のレベル、ヒストンＨ２Ａのレベル、および／またはヒストンＨ３のレベルを決定することを指し得る。
特に、用語「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」などは、対象の試料中のヒストンのレベルを決定することを指し得る。したがって、本発明はまた、対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、リスク層別化、および／またはモニタリングのための方法に関し、前述の方法は、試料中のヒストンまたはそのフラグメントのレベルを決定することを含み、ヒストンまたはそのフラグメントの前述のレベルは、前述の有害事象、特に死亡の指標である。
本明細書中で使用される場合、「ヒストン」もしくは「ヒストンタンパク質」または「ヒストン」もしくは「ヒストンタンパク質」とは、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、もしくはＨ４などの標準的ヒストン（複数可）、ならびにＨ３．３、Ｈ２Ａ．Ｚなどのヒストン変異体、またはそれらのフラグメント（複数可）を指す。ヒストンは、ＤＮＡがクロマチン構造を集合させるために包み込まれる八量体粒子を形成する（Ｌｕｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９７ Ｓｅｐ １８；３８９（６６４８）：２５１−６０）。例えば、ヒストンタンパク質Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４（それぞれ２つ）は八量体を形成し、これは１６５塩基対のＤＮＡによって包まれてクロマチンの基本サブユニットであるヌクレオソームを形成する。ヒストンはまた、複数の病態生理学的過程において核の外側で検出される（ＷＯ２００９ ／ ０６１９１８）。細胞外ヒストンの存在は、炎症過程を含む様々な病因を患っている患者の血液中に記載されている。活性化免疫細胞からのヒストン放出は細胞外トラップによって仲介され得る。活性化好中球は、感染を制御および除去する究極のメカニズムとして、細胞外繊維、いわゆる好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を放出することができる（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４；３０３（５６６３）：ｐ．１５３２−５）。ヒストンが患者の血流中に放出され得る他の機序には、細胞のアポトーシス、壊死、乾癬または壊死症が含まれる。
特に、少なくとも１つのヒストンは、Ｈ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３からなる群から選択される。したがって、本発明の方法およびキットにおいて決定されるべきヒストンのレベルは、特にヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２Ａ、および／またはＨ３のレベルである。ヒストンの配列は当業者に知られている。ヒストンの例示的な配列は、配列番号１〜４に示されている。ヒストンＨ４の例示的なアミノ酸配列は、配列番号１に示されている。ヒストンＨ２Ａの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。ヒストンＨ３の例示的なアミノ酸配列は、配列番号３に示されている。ヒストンＨ２Ｂの例示的なアミノ酸配列は、配列番号４に示されている。特に、少なくとも１つのヒストンは、Ｈ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３からなる群から選択される。より具体的には、少なくとも１つのヒストンは、Ｈ２Ｂ、Ｈ４、およびＨ２Ａからなる群から選択される。より具体的には、少なくとも１つのヒストンは、Ｈ２ＢおよびＨ４である。より具体的には、少なくとも１つのヒストンはＨ２ＢまたはＨ４である。
「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」などは、試料中の少なくとも１つのヒストンまたは少なくとも１つのヒストンのフラグメントのレベルを決定することを指すことが理解される。特に、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２Ａ、および／またはＨ４のレベルが試料中で決定される。したがって、試料中で決定された少なくとも１つのヒストンは、遊離ヒストンであり得るか、または試料中で決定された少なくとも１つのヒストンは生じ得、かつ巨大分子錯体中、例えば、八量体、ヌクレオソーム、および／またはＮＥＴ中に集合し得る。したがって、試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルは、遊離ヒストンタンパク質および／または高分子複合体中に集合したヒストンタンパク質のレベルを含み得る。
本発明の特定の態様において、ヒストンまたはそのフラグメントのレベルは、ヌクレオソーム、オクタマーまたは好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）などの巨大分子複合体に組み立てられていない試料中で決定され得る。そのようなヒストン（複数可）は、本明細書において「遊離ヒストン（複数可）」と呼ばれる。したがって、少なくとも１つのヒストンのレベルは特に少なくとも１つの遊離ヒストンのレベルであり得る。
そのような遊離ヒストンのレベルは、モノヌクレオソームまたはオクタマーのように、組み立てられた化学量論的高分子複合体においては接近不可能であるヒストンのアミノ酸配列または構造エピトープの検出によって決定され得る。そのような構造では、ヒストンの特定の領域が覆われているため、好中球細胞外トラップ（「ＮＥＴ」）について示されているように立体的にアクセスできない（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３（５６６３）：ｐ．１５３２−５，２００４）。さらに、八量体またはヌクレオソームでは、ヒストンの領域も個々のヒストン間などの分子内相互作用に関与している。したがって、本発明の文脈において決定されるヒストンの領域／ペプチド／エピトープは、ヒストンが遊離ヒストンであるか、または高分子複合体に集合しているヒストンであるかを決定し得る。例えば、イムノアッセイに基づく方法では、エピトープが構造的にアクセスできないので、利用される抗体は、それらがヌクレオソームの八量体コアの一部である場合、ヒストン、例えばＨ４を検出しないかもしれない。以下に、遊離ヒストンを決定するために使用され得るヒストンの領域／ペプチド／エピトープが例示される。例えば、ヒストンのＮ末端またはＣ末端尾部の領域／ペプチド／エピトープは、それらが本発明による高分子複合体中に集合しているかまたは遊離ヒストンであるかに関係なく、ヒストンを決定するために使用することができる。
ヒストンの決定は翻訳後修飾ヒストンタンパク質を含み得ることが理解される。したがって、翻訳後修飾は、アミノ酸の脱アセチル化またはアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化およびシトルリン化を含み得る。
この文脈における「化学量論的」は、無傷錯体、例えばモノヌクレオソームまたは八量体に関する。「遊離ヒストンタンパク質」は、クロマチン非結合ヒストンも含み得る。例えば、「遊離ヒストンタンパク質」はまた、個々のヒストンタンパク質または非八量体ヒストン複合体を含み得る。遊離ヒストンは、個々のヒストンに（例えば、一過性に）結合され得、例えば、ヒストンは、ホモまたはヘテロ二量体を形成し得る。遊離ヒストンは、ホモまたはヘテロ四量体も形成し得る。ホモ四量体またはヘテロ四量体は、４分子のヒストン、例えば、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３および／またはＨ４からなり得る。典型的なヘテロ四量体は２つのヘテロ二量体によって形成され、各ヘテロ二量体はＨ３およびＨ４からなる。ヘテロ四量体がＨ２ＡおよびＨ２Ｂによって形成され得ることもまた、本明細書において理解される。ヘテロ四量体は、Ｈ３およびＨ４からなる１つのヘテロ二量体、ならびにＨ２ＡおよびＨ２Ｂからなる１つのヘテロ二量体によって形成され得ることもまた本明細書で想定される。したがって、遊離ヒストンは、本明細書において呼ばれ、核酸、例えばヌクレオソームに結合したヒストン八量体からなる（「化学量論的」）巨大分子複合体に集合していない単量体、ヘテロ二量体または四量体ヒストンタンパク質であり得る。さらに、遊離ヒストンも核酸に結合させることができ、前述の遊離ヒストンは（「化学量論的」）巨大分子複合体、例えば無傷のヌクレオソーム中に集合していない。好ましくは、遊離ヒストンは本質的に核酸を含まない。
少なくとも１つのヒストンのフラグメントは、そのフラグメントが特定のヒストンのレベルの明白な決定を可能にする限り、任意の長さ、例えば少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０または１００アミノ酸を有することができる。少なくとも１つのヒストンのフラグメントは、ヒストンの独立したフラグメント、例えばヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３のフラグメントを指す。対象の試料中のヒストンのレベルを決定するのに適している、ヒストンの様々な例示的フラグメントを本明細書中以下に開示する。ヒストンのレベルは、ヒストンのＮ末端またはＣ末端の尾部にわたるフラグメントを決定することによって決定され得ることもまた本明細書において理解される。さらに、本発明の文脈において決定されるべきヒストンまたはそのフラグメントはまた、例えば翻訳後修飾によって修飾されてもよい。例示的な翻訳後修飾はアセチル化、シトルリン化、脱アセチル化、メチル化、脱メチル化、脱離、異性化、リン酸化およびユビキチン化であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「プロアドレノメジュリン」または「ｐｒｏＡＤＭ」は、プロアドレノメジュリンまたはそのフラグメント、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭを指す。「ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定すること」などは、ｐｒｏＡＤＭまたはそのフラグメントを決定することを指すことが理解される。フラグメントがｐｒｏＡＤＭのレベルの明白な決定を可能にする限り、フラグメントは任意の長さ、例えば少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０または１００アミノ酸を有することができる。本発明の特に好ましい態様において、「ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定すること」は、中部領域のプロアドレノメジュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することを指す。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、ｐｒｏＡＤＭのフラグメントである。ペプチドアドレノメジュリン（ＡＤＭ）は、５２個のアミノ酸を含む血圧降下ペプチドとして発見され、それはヒトフェノクロモサイトメトリーから単離された（Ｋｉｔａｍｕｒａら、１９９３）。アドレノメジュリン（ＡＤＭ）は、１８５個のアミノ酸を含む前駆体ペプチドとしてコードされる（「プレプロアドレノメジュリン」または「プレ−ｐｒｏＡＤＭ」）。ＡＭＤの例示的なアミノ酸配列は、配列番号５に示されている。ＡＤＭはプレｐｒｏＡＤＭアミノ酸配列の９５〜１４６位を含み、それらのスプライス産物である。「プロアドレノメジュリン」（「ｐｒｏＡＤＭ」）は、シグナル配列を有さないプレｐｒｏＡＤＭ（アミノ酸１〜２１）、すなわちプレｐｒｏＡＤＭのアミノ酸残基２２〜２８５を指す。「中間領域プロアドレノメジュリン」（「ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ」）は、プレ−ｐｒｏＡＤＭのアミノ酸４２〜９５を指す。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの例示的なアミノ酸配列は、配列番号６に示されている。プレｐｒｏＡＤＭまたはＭＲｐｒｏＡＤＭのペプチドおよびそのフラグメントを本明細書に記載の方法に使用できることも本明細書では想定されている。例えば、ペプチドまたはそのフラグメントは、プレｐｒｏＡＤＭのアミノ酸２２〜４１（ＰＡＭＰペプチド）またはプレｐｒｏＡＤＭのアミノ酸９５〜１４６（成熟アドレノメジュリン）を含み得る。ｐｒｏＡＤＭのＣ末端フラグメント（プレｐｒｏＡＤＭのアミノ酸１５３〜１８５）は、アドレノテンシンと呼ばれる。ｐｒｏＡＤＭペプチドのフラグメントまたはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのフラグメントは、例えば、少なくとも約５、１０、２０、３０、またはそれ以上のアミノ酸を含み得る。したがって、ｐｒｏＡＤＭのフラグメントは、例えば、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＰＡＭＰ、アドレノテンシンおよび成熟アドレノメジュリンからなる群から選択することができ、好ましくは本明細書ではフラグメントはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭである。
ｐｒｏＡＤＭまたは少なくとも１つのヒストンに対して配列同一性を有するポリペプチドを決定することができることも本明細書において想定されている。例えば、配列番号５もしくは６に対して、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号４のそれぞれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリペプチドが、本発明の方法およびキットにおいて決定され得、より高い値の配列同一性が好ましい。本発明によれば、２つ以上のアミノ酸配列の文脈における「配列同一性」、「相同性」または「ホモロジーパーセント」または「同一」または「同一性パーセント」または「同一性パーセンテージ」という用語は、当該技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを使用するか、または手動アライメントおよび目視検査によって測定した場合、比較ウィンドウにわたって（好ましくは全長にわたって）、または測定された指定された領域にわたって最大の対応が得られるように比較および整列されたときに、同じ、または特定の同じ割合のアミノ酸を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。例えば、７０％〜９０％以上（好ましくは９５％以上）の配列同一性を有する配列は、実質的に同一であると見なされ得る。そのような定義は、試験配列の相補体にも適用される。好ましくは、記載された同一性は、少なくとも約１０〜約１５アミノ酸長の領域にわたって、より好ましくは少なくとも約２０〜約３５アミノ酸長の領域にわたって、最も好ましくは全長にわたって存在する。当業者は、例えば、当該技術分野で既知のようなＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２（１９９４），４６７３−４６８０）またはＦＡＳＴＤＢ（Ｂｒｕｔｌａｇ Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６（１９９０），２３７−２４５）に基づくものなどのアルゴリズムを使用して、配列間／中の同一性パーセントを決定する方法を知るであろう。
本明細書で使用される場合、マーカーの「レベル」は、試料中のマーカーの分子実体の量を指す。言い換えれば、マーカーの濃度は、試料中で決定される。例えば、ｐｒｏＡＤＭもしくはそのフラグメント、好ましくはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの濃度、および／またはヒストン（複数可）Ｈ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ３、および／もしくはＨ２Ａ、もしくはそのフラグメント（複数可）の濃度は、対象の試料中で決定される。
本明細書で使用される場合、「少なくとも１つのヒストンのレベル」という用語は、少なくともヒストンの分子実体の量、例えば、対象から得られる試料中のＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２Ａ、および／もしくはＨ３、またはそれらのフラグメントの量を指す。言い換えれば、少なくとも１つのヒストンタンパク質またはそのフラグメントの濃度は、試料中で決定される。
本明細書で使用される場合、「マーカープロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベル」あるいは「マーカープロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）またはそのフラグメントのレベル」という用語は、対象から得られる試料中のマーカープロアドレノメジュリンまたはそのフラグメントの分子実体の量を指す。言い換えれば、マーカーの濃度は、試料中で決定される。したがって、「マーカー中間領域プロアドレノメジュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベル」という用語は、対象から得られる試料中のマーカー中間領域プロアドレノメジュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）の分子実体の量を指す。上記のように、プロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）、好ましくはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのフラグメントが検出および定量化され得ることも、本明細書において想定される。また、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのフラグメントが検出および定量化され得る。ｐｒｏＡＤＭまたはそのフラグメント（好ましくはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定するための、または少なくとも１つのヒストンまたはそのフラグメントのレベルを決定するための適切な方法は、本明細書中以下に記載される。
本明細書中で使用される場合、「有害事象」とは、生命を脅かすかまたは生命を脅かす対象の健康状態／状態を意味する。したがって、有害事象は、例えば診断され確認されている、例えば約２８日、１４日、７日、３日など、同じ対象の以前の健康状態と比較した、対象の健康状態／状態の重大な悪化を指す。劣化の１日前、１２時間後、５時間後、１時間以内。または同様の疾患または病状に罹患している対象の健康状態と比較して、すなわち、疾患または病的障害の進行が、試験された対象において生命を脅かすか、または生命を脅かすようになる。有害事象はまた、健康な対象の健康状態と比較した、対象の健康状態／状態の重大な悪化を指すこともある。本明細書では、健康状態／状態、生命を脅かす対象の状態／状態または生命を脅かす進行の重大な悪化は、対象が死亡するリスクがあること、すなわち対象の致命的な結果がありそうであることを意味し得る。重大な悪化、重大な健康状態／状態、または生命を脅かす健康状態／状態もまた、臨床スコア、例えばＳＯＦＡスコアによって評価／診断することができる。例えば、１４を超えるＳＯＦＡスコアは、対象の重大な健康状態を示す非常に深刻な健康状態を示す。０〜６のＳＯＦＡスコアは、あまり重篤ではない健康状態を示し、７〜１４のＳＯＦＡスコアは、重症な健康状態を示す。例えば、対象の健康状態は、臓器機能不全、多臓器機能不全、または感染症などの疾患もしくは医学的障害により、深刻に悪化する可能性がある。したがって、「有害事象」という用語は、生命を脅かすものであるか、または生命を脅かすものになる臓器機能不全、多臓器機能不全、感染症などの疾患または病状を指し得る。例えば、臓器機能不全または多臓器機能不全はそのような重大な悪化をもたらす可能性があり、したがって「有害事象」という用語は臓器機能不全または多臓器不全、特に臓器不全または多臓器不全も指すことがある。例えば、疾患または医学的障害は、そのような深刻な悪化をもたらす可能性があり、したがって「有害事象」という用語はまた、疾患（複数可）または医学的障害（複数可）を指し得、前述の疾患（複数可）または医学的障害（複数可）は、生命を脅かす疾患（複数可）または医学的障害（複数可）を意味し得る。対象はまた、疾患（複数可）および／または医学的障害（複数可）に罹患している可能性があり、そのようなシナリオにおける有害事象は、疾患（複数可）または医学的障害（複数可）の進行が生命を脅かすときの状態であり、すなわち有害事象はまた、疾患または障害の生命を脅かす進行も指すことがある。疾患または病状は、呼吸器疾患、尿路感染症、感染性および非感染性の病因に関連した炎症反応、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック、臓器不全（複数可）、心血管疾患、血液疾患、播種性凝固、糖尿病、悪性腫瘍、肝疾患、腎疾患、免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、グラム陰性細菌感染症、グラム陽性細菌感染症、腹部感染症、ならびに免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）からなる群から選択され得る。この疾患はまた、感染症（複数可）であってもよい。特定の態様では、対象は、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、グラム陰性菌感染症、および／またはグラム陽性菌感染症を患っている。呼吸器疾患はまた、呼吸器感染症（院外感染性肺炎（ＣＡＰ）または下気道感染症（ＬＲＴＩ）など）も指し得る。非常に具体的な態様では、対象は、真菌感染症を患っている。
本明細書で使用される場合、「免疫抑制対象」という用語は、少なくとも１人の健康な対象と比較して抑制された免疫系を有する対象を指す。そのような免疫抑制対象は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を患っていてもよいか、または放射線療法を受けており、かつ／または免疫抑制薬を受けている対象であってもよい。
本明細書において好ましくは、対象は、好ましくは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｓｔ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ／Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅによるＳＥＰＳＩＳ−２の定義に基づく、重症敗血症または敗血症性ショックを患っている。
本発明の特定の態様において、有害事象は死亡である。言い換えれば、有害事象は、本発明の特定の態様において対象の死亡である。したがって、「有害事象」という用語は、「死亡（ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）」または「死亡（ｄｅａｔｈ）」を特に意味する。本明細書で使用される場合、「死亡（ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）」は、対象が死亡すること、すなわち致命的な転帰を意味する。したがって、本発明の方法およびキットは、対象が死亡するかどうか、および／または対象が死亡するリスクがあるかどうかを決定／予測する。
本明細書で使用される場合、一般用語「臓器不全」はまた、２つ以上の臓器が機能不全を有することを意味し得る、すなわち、他に述べられない限り、それはまた臓器不全に関連し得る。「臓器機能不全」または「複数の臓器機能不全」という用語は、１つの臓器または２つ以上の臓器が、例えば、少なくとも１人の健康な対象の臓器（複数可）などの罹患していない臓器と比較して、その／それらの正常な機能を果たさない対象における状態に関する。例えば、少なくとも１人の健康な対象の臓器と比較して、臓器は活性が低下しているか、または臓器機能障害を有する対象において異常に活動的である可能性がある。好ましくは、臓器機能不全を有する臓器（複数可）は、例えば、少なくとも１人の健康な対象の罹患していない臓器（複数可）と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％、１００％、または２００％の活性の低減または増加を有し得る。特に、臓器機能障害（複数可）は、臓器不全（複数可）を引き起こす可能性がある。したがって、「臓器不全」は、臓器不全も指すことが好ましい。「臓器不全」とは、例えば外部の臨床的介入なしには正常な恒常性を維持することができない程度までの臓器不全を指す。「臓器不全」はまた、例えば外部の臨床的介入なしには臓器の正常な恒常性を維持することができない程度までの臓器不全を指すこともある。「臓器不全（複数可）」はまた、例えば、外部の臨床的介入なしには対象の正常な恒常性が維持され得ない程度までの臓器機能不全（複数可）も指し得る。本発明の特定の態様において、臓器不全は臓器不全または少なくとも１つの臓器不全である。「臓器不全」という一般用語はまた、２つ以上の臓器が不全を有することも意味し得、すなわち、それは、特に明記しない限り臓器不全にも関連し得る。本明細書では、臓器機能不全が、多臓器機能不全とも称され得ることが理解される。本明細書では、臓器不全が、多臓器不全とも称され得ることが理解される。例示的な臓器機能不全または臓器不全は、循環性ショック、血液障害、肝不全、神経障害、腎不全、呼吸不全、および代謝性アシドーシスである。したがって、本発明の文脈において、臓器機能不全または少なくとも１つの機能不全は、好ましくは、循環器ショック、血液障害、肝不全、神経障害、腎不全、呼吸不全および代謝性アシドーシスからなる群から選択することができる。本明細書では、対象はまた、例えば、循環性ショック、血液障害、肝不全、神経障害、腎不全、呼吸不全、および代謝性アシドーシスからなる群から選択される２、３、４つの臓器機能不全の組み合わせである２つ以上の臓器機能不全または不全を有し得ることが理解される。
本発明の特定の態様において、少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルは、約２８日以内に起こる前述の有害事象の指標である。本明細書中で使用される場合、用語「内に生じる有害事象」とは、対象がその特定の期間内に有害事象を経験する可能性がある、または経験する、有する、または有することを意味する。
本明細書で使用される場合、「有害事象が起こらない」という用語は、その事象が、例えば約２８日以内に起こらないことを意味する。例えば、対象の死亡は、この時間範囲内で起こらない。したがって、これは、対象が、例えば約２８日以内に生存していることを示す。
少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、約２８日、約２５日、約２０日、約１５日、約１４日、約１３日、約１２日、約１１日、約１０日、約９日、約８日、約７日、約６日、約５日、約４日、約３日、約２日、または約１日以内に起こる前述の有害事象の指標である。少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、１４日以内に起こる前述の有害事象の指標となり得る。特に、少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、７日以内に起こる前記有害事象の指標となり得る。特に、少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、３日以内に起こる前記有害事象の指標となり得る。
本発明の特に好ましい態様では、少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルは、約２８日以内に起こる対象の死亡の指標である。少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、約２８日、約２５日、約２０日、約１５日、約１４日、約１３日、約１２日、約１１日、約１０日、約９日、約８日、約７日、約６日、約５日、約４日、約３日、約２日、または約１日以内に起こる死亡の指標となり得る。少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、１４日以内に起こる死亡の指標となり得る。特に、少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、７日以内に起こる死亡の指標となり得る。特に、少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、３日以内に起こる死亡の指標となり得る。
本発明の好ましい態様において、前述の対象のＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルは、約２８日以内に起こるまたは約７日以内に起こる前述の対象の有害事象、特に死亡の指標である。
本発明の特定の態様では、少なくとも１つのヒストンのレベルは、約７日、好ましくは約３日以内に起こる有害事象、死亡の指標である。特に、Ｈ２Ｂのレベルは、約７日以内、好ましくは約３日以内に起こることさえある有害性の指標である。
本発明の特定の態様では、少なくとも１つのヒストンのレベルは、約７日、好ましくは約３日以内に起こる有害事象、死亡の指標である。特に、Ｈ４のレベルは、約７日以内、好ましくは約３日以内に起こることさえある有害性の指標である。
本発明の特定の態様では、少なくとも１つのヒストンのレベルおよびｐｒｏＡＤＭのレベルは、２８日以内に起こる前述の対象の有害事象、特に死亡の指標である。
「前記有害事象を示す」という用語は、対象が前記有害事象、例えば死亡を経験したその／有している／罹患しているか、または可能性があることを意味する。したがって、対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルは、有害事象、例えば対象の死亡を示す。
本発明の方法はまた、少なくとも１つのヒストンのレベルが対象の試料中で決定され、少なくとも１つのヒストンの前述のレベルが少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され、少なくとも１つのヒストンのレベルが前述の有害事象の指標である、方法に関する。
好ましくは、本発明はまた、プロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが対象の試料中で測定され、前述のｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルがｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、ｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが有害事象の指標である、方法に関する。
この方法はまた、少なくとも１つのヒストンのレベルが決定され、対象の試料中のプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが決定される方法にも関し、少なくとも１つのヒストンの前述のレベルは、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され、ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルはｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、前述の対象における前述の有害事象は、比較ステップに基づいて特定される。
本明細書で使用される場合、用語「少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較される」またはその文法的な変形は、対象の少なくとも１つのヒストンのレベルが少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較されることを意味する。したがって、対象のヒストンのレベルは、同じヒストンの対応する参照レベルと比較される。例えば、対象の試料中で決定されたヒストンＨ２Ｂのレベルは、ヒストンＨ２Ｂの参照レベルと比較される。これは、他のヒストンにも準用される。少なくとも１つのヒストンの参照レベルは、特に、ヒストンＨ２Ｂのレベル、ヒストンＨ４のレベル、ヒストンＨ２Ａのレベルおよび／またはヒストンＨ３のレベルである。
本明細書で使用される場合、用語「ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較される」またはその文法的な変形は、対象のｐｒｏＡＤＭのレベルがｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較されることを意味する。少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのフラグメント（複数可）のレベルが決定される場合、参照レベルはまた、対応する対応するフラグメント（複数可）のレベルであり得る。
本明細書中で使用される場合、「参照レベル」は、本発明の好ましい態様において、有害事象がないことを示す、対応するマーカーの正常レベルを反映し得る。したがって、そのような参照レベルは、対象の生命を脅かす状態または特に死亡（ｄｅａｔｈ）／死亡（ｍｏｒｔａｌｉｔｙ）を示さない、正常レベルの対応するマーカーを反映する。したがって、参照レベルは、少なくとも１人の参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであり得、参照対象（複数可）は、約２８日以内、好ましくは約１４日、より好ましくは約７日以内、または特に好ましくは約３日以内に有害事象を有さない。
参照レベルは、健康な対象のグループ（例えば、コホート）の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルを表し得る。したがって、参照レベルは、好ましくは、少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／または健康な対象のｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルである。健康な対象は、診断（および確認）された疾患および／または障害のない対象である。健康な対象は、好ましくは正常に機能する臓器を有し得、すなわち臓器機能不全（複数可）もしくは臓器不全（複数可）、および／または上記のような診断された疾患（複数可）もしくは医学的障害（複数可）を有しない。したがって、参照レベルは、健康な対象の試料において決定される少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであり得る。参照対象または健康な対象は、本明細書では、好ましくは対象の群または健康な対象の群、例えば対象のコホートとして定義される。健常者は臓器不全や臓器不全はない。したがって、参照レベルは、臓器機能不全または臓器不全を有しない対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであり得る。したがって、参照レベルは、臓器不全または臓器不全がないことを示すレベルであり得る。
好ましい実施形態では、ｐｒｏＡＤＭ（好ましくは、本明細書ではＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）の参照レベルは、約０．７ｎｍｏｌ／Ｌ〜約２．０ｎｍｏｌ／Ｌである。より好ましい実施形態では、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約０．８ｎｍｏｌ／Ｌ〜約１．９ｎｍｏｌ／Ｌである。より好ましい実施形態では、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約０．９ｎｍｏｌ／Ｌ〜約１．８ｎｍｏｌ／Ｌである。より好ましい実施形態では、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約０．８８ｎｍｏｌ／Ｌ〜約１．７９ｎｍｏｌ／Ｌである。より好ましい実施形態では、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約０．９ｎｍｏｌ／Ｌまたは約１．８ｎｍｏｌ／Ｌである。最も好ましい実施形態では、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約０．８８ｎｍｏｌ／Ｌ〜約１．７９ｎｍｏｌ／Ｌである。適用される参照レベルは、予測のための所望の特異性および感度に依存し、すなわち、約０．９ｎｍｏｌ／Ｌ（好ましくは０．８８ｎｍｏｌ／Ｌ）のｐｒｏＡＤＭ（好ましくはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）などのより低い閾値は、有害事象を経験しない対象を確実に特定する（特に死亡、すなわち、２８日の期間内に生存者を明確に特定する）。
特定の実施形態では、（ｉ）ｐｒｏＡＤＭの参照レベル（例えば、約０．９ｎｍｏｌ／Ｌ〜１．８ｎｍｏｌ／Ｌ）以下である対象のｐｒｏＡＤＭのレベルは、有害事象、特に死亡が２８日以内に起こらないことの指標であるか、または（ｉｉ）ｐｒｏＡＤＭの参照レベル（例えば、約０．９ｎｍｏｌ／Ｌ〜１．８ｎｍｏｌ／Ｌ）よりも高い対象のｐｒｏＡＤＭのレベルは、有害事象、特に死亡が２８日以内に起こるか、もしくは起こるであろうことの指標である。
提供された方法の感度および特異性は、試験の分析品質に依存するだけではない。感度および特異性はまた、異常（例えば死亡）または正常な結果を構成するものの定義にも依存する。有害事象を伴うおよび伴わない対象についての、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベル、好ましくはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルの分布は重複してもよい。そのような条件下では、試験は、正常と機能不全の状態を１００％の精度で絶対的に区別しない。当業者は、対象の状態自体、または対象の少なくとも１つのさらなるメーカーおよび／もしくはパラメータが、データの解釈を補助することができ、このさらなる情報が、重複領域におけるより信頼性の高い予後診断を可能にするという事実を知っている。状態自体は、対象の一般的な健康状態を指し得る。対象の一般的な健康状態は、どの参照レベルを選択するかの決定に影響を及ぼし得る。添付の実施例は、どの参照レベルが特定の状態に最も適していることが示されたかを実証している。この知識を用いて、参照レベルは、さらに適合され得る。
例えば、適切な参照レベルは、対象の一般的な健康状態に依存し得る。一般的な健康状態は、ＳＯＦＡスコアに基づき決定され得る。例えば、約１．８ｎｍｏｌ／ＬのｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、あまり重篤ではない対象、例えば、６以下のＳＯＦＡスコアを有する対象に用いられ得る。約３．２ｎｍｏｌ／ＬのｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、中程度に重篤な対象、例えば、７〜１２のＳＯＦＡスコアを有する対象に用いられ得る。約５．５ｎｍｏｌ／ＬのｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、重篤な対象、例えば、１３以上のＳＯＦＡスコアを有する患者に用いられ得る。
好ましい実施形態では、対象のＳＯＦＡスコアが６以下である場合、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約１．８ｎｍｏｌ／Ｌであり得るか、対象のＳＯＦＡスコアが７〜１２である場合、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約３．２ｎｍｏｌ／Ｌであり得るか、または対象のＳＯＦＡスコアが１３以上である場合、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約５．６ｎｍｏｌ／Ｌであり得る。最も好ましい実施形態では、対象のＳＯＦＡスコアが６以下である場合、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約１．８ｎｍｏｌ／Ｌであり得るか、または対象のＳＯＦＡスコアが７〜１２である場合、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約３．２ｎｍｏｌ／Ｌであり得る。
したがって、適切な参照レベルは、少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメータ（例えば、性別、群、および年齢）のレベル（複数可）を決定することによって選択され得る。少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメータのレベルはまた、参照レベルと比較することができ、前述の参照レベルの前述の少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメータの対応するレベルと比較した対象の前述の少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメータの類似または同一の値／レベルは、対象が有害事象を経験する／有する／罹患するリスクが減少していることを示し、かつ／または前述の参照レベルの前述の少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメータの対応するレベルと比較した、前述の少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメータのより高いもしくはより低いレベルは、有害事象を経験する／有する／罹患するリスクが増加していることを示す。
加えて、下記および添付の実施例に記載のＲＯＣ試験が、最も好適な予測を提供する適切な参照レベルを選択するために用いられ得る。
適切な参照レベルはまた、対象が患っている疾患／障害によっても影響され得る。例えば、添付の実施例は、真菌感染症を患っている対象が最高のｐｒｏＡＤＭレベルを示すことを示す。したがって、対象が真菌感染症を患っている場合、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、５．６ｎｍｏｌ／Ｌであり得る。
さらに、参照レベルはまた、少なくとも１つの参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであってもよく、前述の参照対象は疾患および／または医学的障害を患っており、疾患または障害の進行は生命を脅かすものではない。言い換えれば、参照レベルはまた、少なくとも１つの参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであってもよく、前述の対象（複数可）は、疾患および／または医学的障害を患っており、有害事象、特に死亡は、２８日、７日、または３日以内に起こらない。
さらに、参照レベルはまた、少なくとも１つの参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであってもよく、前述の対象（複数可）は、疾患および／または医学的障害、ならびに感染症（敗血症または敗血症障害など）を患っており、有害事象、特に死亡は、２８日、７日、または３日以内に起こらない。言い換えれば、参照対象の有害事象は、２８日、７日、または３日以内に起こらない。特に、参照対象は、試験される対象と同じ疾患または病状／障害を患っている。
さらに、参照レベルはまた、少なくとも１つの参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／または少なくとも１つの参照対象のｐｒｏＡＤＭのレベルであってもよく、前述の参照対象（複数可）は、感染症ではなく、疾患および／または医学的障害に罹患しており、有害事象、特に死亡は２８日以内、７日以内または３日以内に発生しない。
さらに、参照レベルはまた、少なくとも１つの参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであってもよく、前述の参照対象（複数可）は、ＳＩＲＳを含む疾患および／または医学的障害を患っており、という外対象（複数可）は、感染症を患っておらず、有害事象、特に死亡は、２８日、７日、または３日以内に起こらない。
本明細書で使用される場合、少なくとも１つの参照対象は、２つ以上の参照対象を指す。特に、少なくとも１つの参照対象は、参照対象の群またはコホートである。本明細書中以下に記載されるように、例えば参照としてマーカーのレベルを決定するための手段および方法が記載される。
本明細書で使用される参照レベルは、典型的には所定のレベルであり、すなわち、それは、ポイントオブケアで後で使用するための基準、例えばＩＣＵまたはＥＤとして予め決定されている。
本発明の好ましい態様において、有害事象は死亡である。これらの態様では、参照レベルはまた、少なくとも１つの参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであってもよく、参照対象（複数可）は、約２８日以内、約１４日以内、約７日以内、または約３日以内に死亡しない。さらに、これらの態様では、参照レベルはまた、少なくとも１つの参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであってもよく、前述の対象（複数可）は、疾患および／または医学的障害を患っており、参照対象（複数可）は、約２８日以内、約１４日以内、約７日以内、または約３日以内に死亡しない。さらに、これらの態様では、参照レベルはまた、少なくとも１つの参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであってもよく、前述の対象（複数可）は、疾患および／または医学的障害、ならびに感染症を患っており、参照対象（複数可）は、約２８日以内、約１４日以内、約７日以内、または約３日以内に死亡しない。さらに、これらの態様では、参照レベルはまた、少なくとも１つの参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであってもよく、前述の対象（複数可）は、疾患および／または医学的障害を患っており、感染症を患っておらず、参照対象（複数可）は、約２８日以内、約１４日以内、約７日以内、または約３日以内に死亡しない。さらに、これらの態様では、参照レベルはまた、少なくとも１つの参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであってもよく、前述の対象（複数可）は、ＳＩＲＳを含む疾患および／または医学的障害を患っており、前述の対象（複数可）は、感染症を患っておらず、参照対象（複数可）は、約２８日以内、約１４日以内、約７日以内、または約３日以内に死亡しない。
本明細書で実証されるように、参照レベルと比較したときの、少なくとも１つのヒストンの増加したレベル（もしくは少なくとも１つのヒストンのレベルの増加）および／またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの増加したレベル（もしくはｐｒｏＡＤＭのレベルの増加）は、有害事象、特に死亡の指標である。特に、有害事象は、上記のように２８日、７日、または３日以内に起こる。したがって、前述の有害事象を示す前述の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／または前述のｐｒｏＡＤＭのレベルは、参照レベルと比較して増加したレベルであり得る。
したがって、本発明の方法は、前述の対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することを含む方法を含み、少なくとも１つの参照レベルと比較した、前述の対象の前述の少なくとも１つのヒストンの増加したレベルは、前述の対象の前前述の記有害事象、特に死亡を示す。
さらに、本発明は、前述の対象の試料中のｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定することを含み、前述のｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較した、前述の対象の前述のｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルの増加は、前述の対象の前述の有害事象、特に死亡を示す。
さらに、本発明は、前述の対象の試料中のｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定することを含む方法を含み、ｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、前述の対象の前述の有害事象の指標であり、好ましくは、前述の有害事象は、約２８日以内に起こるか、またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの減少したレベルもしくは同等のレベルは、前述の対象の前述の有害事象が、好ましくは約２８日内に起こらないことの指標である。
さらに、本発明は、前述の対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することと、前述の対象の試料中のｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定することとを含む方法を含み、少なくとも１つのヒストンの参照レベルおよび前述のｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの前述の対象の前述の少なくとも１つのヒストンの増加したレベル、および前述の対象の前述のｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、前述の対象の前述の有害事象、特に死亡の指標である。
本発明はまた、
（ｉ）前述の対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することであって、
少なくとも１つのヒストンの前述のレベルが、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され、
少なくとも１つのヒストンの前述の参照レベルと比較したときの前述の対象の前述の少なくとも１つのヒストンの増加したレベルが、前述の対象における前述の有害事象の指標である、決定すること、および／または
（ｉｉ）前述の対象の試料中のプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、
ｐｒｏＡＤＭの前記レベルが、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、
前述の参照レベルのｐｒｏＡＤＭと比較した前述の対象の前述のｐｒｏＡＤＭの増加したレベルが、前述の対象における前述の有害事象の指標である、決定すること、を含む方法に関する。
言い換えれば、本発明はまた、以下を含む方法に関する。
（ｉ）、対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することであって、
少なくとも１つのヒストンの前述のレベルが、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され、
少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較したときの少なくとも１つのヒストンのレベルの増加が、前述の対象の前述の有害事象の指標である、決定すること、および／または
（ｉｉ）前述の対象の試料中のプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、
ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、
ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときのｐｒｏＡＤＭのレベルの増加が、前述の対象の前述の有害事象の指標である、決定すること。
本発明はまた、以下を含む方法に関し得る。
（ｉ）前述の対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することであって、
少なくとも１つのヒストンの前述のレベルが、前の分析から得られた同じ対象の少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され、
少なくとも１つのヒストンの前述の参照レベルと比較したときの少なくとも１つのヒストンのレベルの増加が、前述の対象における前述の有害事象の指標である、決定すること、および／または
（ｉｉ）前述の対象の試料中のプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、
ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、前の分析から得られた同じ対象のｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、
ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルと比較したときのｐｒｏＡＤＭのレベルの増加が、前述の対象における前述の有害事象の指標である、決定すること。
本明細書で使用される場合、「前の分析から得られた」は、前の時間、例えば、次の分析の２８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、または１日前における同じ対象の試料中のマーカーレベルの決定を指し、そのような態様では、マーカーの前述の前に決定されたレベルは、参照レベルとして考慮される。
本明細書で使用されると場合、用語「（その）マーカーのレベルの増加」は、マーカーのレベルが増加することを意味し、すなわちそれはマーカーのレベルの増加を指す。したがって、「（その）マーカーのレベルの増加」という用語は、本明細書において「（その）マーカーの増加したレベル」という用語と互換的に使用される。対象のマーカーのレベルの増加またはマーカーのレベルの増加は、マーカーのレベルが少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、またはさらにそれ以上であることを意味する。好ましくは、マーカーの参照レベルより少なくとも約３０％高い。
本発明の文脈において、「参照レベルと比較した少なくとも１つのヒストンのレベルの増加」という用語などは、本明細書において、「前述の参照レベルと比較した前述の対象の少なくとも１つのヒストンの増加したレベル」という用語、または「前述の参照レベルと比較した少なくとも１つのヒストンの増加したレベル」という用語などと互換的に使用される。そのような用語は、対象の少なくとも１つのヒストンのレベル、例えばＨ２Ｂのレベル、Ｈ４のレベル、Ｈ２Ａのレベルおよび／またはＨ３のレベルが少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも約１５％であることを意味する。２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約７０％少なくとも１つのヒストンの参照レベルよりも、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約１００％高い。言い換えれば、最も好ましい態様において、前述の少なくとも１つのヒストンの増加したレベル（またはそのレベルの増加）は、少なくとも１つのヒストンの前述の参照レベルの約２倍高い可能性がある。約２倍のレベルの増加はさらに有害事象、例えば死亡率のリスクを増加させる。例えば、表１で実証されるようなＨ４の１．４５のハザード比は、有害事象のリスクがさらに４５％増加することを意味する。したがって、そのような値はまた、強い相関および診断のための最適なマーカーの指標でもある。
本明細書で使用される場合、「参照レベルと比較したｐｒｏＡＤＭのレベルの増加」という用語などは、本明細書において、「前述の参照レベルと比較した前述の対象のｐｒｏＡＤＭの増加したレベル」という用語、または「前述の参照レベルと比較したｐｒｏＡＤＭの増加したレベル」という用語などと互換的に使用される。そのような用語は、対象のｐｒｏＡＤＭのレベル、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、ｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの参照レベルよりも少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、またはさらにより好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約１００％高いことを意味する。言い換えれば、最も好ましい態様において、前述のｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、前述のｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルの約２倍高い場合がある。
本明細書で使用される場合、「参照レベルと比較したｐｒｏＡＤＭのレベルの減少」という用語などは、本明細書において、「前述の参照レベルと比較した前述の対象のｐｒｏＡＤＭの減少したレベル」という用語、または「前述の参照レベルと比較したｐｒｏＡＤＭの減少したレベル」という用語などと互換的に使用される。そのような用語は、対象のｐｒｏＡＤＭのレベル、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、ｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの参照レベルよりも少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、またはさらにより好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約１００％低いことを意味する。言い換えれば、最も好ましい態様では、前述のｐｒｏＡＤＭの減少したレベルは、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルの約２倍低くなり得る。
「等しい」という用語はまた、そのレベルが参照レベルと同様であり得るレベルを含む。したがって、「等しい」という用語は、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して＋／−１０％、好ましくは＋／−５％、より好ましくは＋／−２％、または最も好ましくは同じもしくは同一である、対象のｐｒｏＡＤＭのレベルを指す。
本明細書で使用される場合、「参照レベルと比較したｐｒｏＡＤＭのレベルの減少または同等のレベル」という用語は、対象のｐｒｏＡＤＭのレベル、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、参照レベルと比較して＋／−１０％、＋／−５％、＋／−２％、または同じもしくは同一であるか、あるいはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの参照レベルよりも少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、またはさらにより好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約１００％低いことを意味する。
本明細書では、参照レベルおよび決定されたマーカーレベル（すなわち、ポイントオブケアで個々の参照について決定されたレベル、例えばＩＣＵまたはＥＤ）は、レベルが決定されるアッセイ／方法に応じて変わり得ることが理解される。例えば、質量分析に基づく方法によって決定された参照レベルおよび決定されたマーカーレベルは、イムノアッセイによって決定されたそれぞれのレベルとは異なり得る。添付の実施例は、マーカーのレベルがいくつかの方法、例えばイムノアッセイおよび質量分析に基づく方法によって決定され得ることを実証する。参照レベルは、コックス回帰分析などの添付の実施例に例示されるような統計的方法によって最適化することができる。ハザード比も計算され得る。例えば、かつ添付の実施例に例示されるように、０よりも高いハザード比（ＨＲ＞０）は、より悪い予後診断、すなわち有害事象が起こる可能性が高いことを示し、０より小さいハザード比は、良好な予後診断、すなわち有害事象が起こる可能性が低いことを示す。したがって、当業者は参照レベルを決定する方法を知っている。例えば、レベル（参照レベルを含む）は、例えば、対象（または参照対象）の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、例えばＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定することによって、イムノアッセイによって決定され得る。
本発明のある特定の態様では、少なくとも１つのヒストンの参照レベルは、約１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約８０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約７０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約４５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約４０ｎｇ／ｍＬ、または最も好ましくは約３５ｎｇ／ｍＬであり得る。本発明のある特定の態様では、少なくとも１つのヒストンの参照レベルは、約１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約３０ｎｇ／ｍＬ、または最も好ましくは約３５ｎｇ／ｍＬであり得る。
本発明の特定の実施形態において、少なくとも１つのヒストンの参照レベルは、約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬから約９０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬから約６０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬであり得る。好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌから約４０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１５ｎｇ／ｍｌから約４０ｎｇ／ｍｌ、または最も好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌから約４０ｎｇ／ｍｌである。
本発明のある特定の態様では、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約４ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは約５ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは約７ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは約８ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは約９ｎｍｏｌ／Ｌ、または特に好ましくは約６ｎｍｏｌ／Ｌであり得る。
さらに、レベル（参照レベルを含む）は、相対的定量を決定する方法または目的のタンパク質もしくはそのフラグメントの絶対定量を決定する方法などの質量分析に基づく方法によって決定することができる。
相対定量化「ｒＳＲＭ」は、以下によって達成され得る。
１．試料中で検出された所与の標的フラグメントペプチドからのＳＲＭ（選択反応モニタリング）シグネチャーピーク面積を、少なくとも第２、第３、第４、またはそれ以上の生体試料中の標的フラグメントペプチドの同じＳＲＭシグネチャーピーク面積と比較することによって、標的タンパク質の増加または減少した存在を決定する。
２．試料中に検出された所与の標的ペプチドからのＳＲＭシグネチャーピーク面積と、異なる別々の生物学的供給源に由来する他の試料中の他のタンパク質からのフラグメントペプチドから生じたＳＲＭシグネチャーピーク面積とを比較することによって標的タンパク質の存在の増減を決定する。ペプチドフラグメントについての２つの試料間のＳＲＭサインピーク面積比較は、例えば各試料中で分析されたタンパク質の量に対して正規化される。
３．ヒストンタンパク質のレベルの、様々な細胞条件下でそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルへの変化を正規化するために、所与の標的ペプチドについてのＳＲＭシグネチャーピーク面積を、同じ生体試料内の異なるタンパク質に由来する他のフラグメントペプチドからのＳＲＭシグネチャーピーク面積と比較することによって、標的タンパク質の増加または減少した存在を決定する。
４．これらのアッセイは、非修飾フラグメントペプチドおよび標的タンパク質の修飾フラグメントペプチドの両方に適用することができ、修飾には、リン酸化および／またはグリコシル化、アセチル化、メチル化（モノ、ジ、トリ）、シトルリン化、ユビキチン化が含まれる。修飾ペプチドの相対レベルは、未修飾ペプチドの相対量を決定するのと同じ方法で決定される。
所与のペプチドの絶対定量化は、以下によって達成され得る。
１．個々の生体試料中の標的タンパク質からの所与のフラグメントペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、生体試料からタンパク質溶解物中にスパイクされた内部フラグメントペプチド標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較する。内部標準は、調べられている標的タンパク質からのフラグメントペプチドの標識合成バージョンまたは標識された組換えタンパク質であり得る。この標準は、消化の前（組換えタンパク質にとって必須）または後に既知量で試料中にスパイクされ、生体試料中の内部フラグメントペプチド標準および天然フラグメントペプチドの両方について別々にＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積が決定され得、両方のピーク面積の比較が後に続く。これは未修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに適用することができ、ここで修飾はリン酸化および／またはグリコシル化、アセチル化、メチル化（例えばモノ、ジ、またはトリメチル化）、シトルリン化、ユビキチン化、ここで、修飾ペプチドの絶対レベルは、未修飾ペプチドの絶対レベルを決定するのと同じ方法で決定することができる。
２．ペプチドはまた、外部較正曲線を使用して定量化され得る。正規曲線アプローチは、内部標準として一定量の重いペプチド、および試料中にスパイクされた様々な量の軽い合成ペプチドを使用する。マトリックス効果を説明するための標準曲線を構築するために、試験試料のものと同様の代表的なマトリックスが使用される必要がある。その上、逆曲線法は、マトリックス中の内因性分析物の問題を回避し、一定量の軽いペプチドは、内因性分析物の上にスパイクされて内部標準を作り出し、様々な量の重いペプチドは、スパイクされて一組の濃度標準を作り出す。正規曲線または逆曲線のいずれかと比較される試験試料は、較正曲線を作り出すために使用されるマトリックス中にスパイクされた内部標準と同じ量の標準ペプチドでスパイクされる。
したがって、当業者は、添付の実施例にも例示されているように、マーカーレベル、特に適切な参照レベルを決定する方法を知っている。
本発明の方法およびキットはまた、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭに加えて少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメータを決定することも含み得る。
本明細書で使用される場合、パラメータは、特定のシステムを定義するのを助けることができる特性、特徴、または測定可能な要因である。パラメータは、疾患／障害／臨床状態リスク、好ましくは有害事象などの健康および生理学に関連する評価にとって重要な要素である。さらに、パラメータは、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、または治療的介入に対する薬理学的反応の指標として客観的に測定および評価される特性として定義される。例示的なパラメータは、急性生理学および慢性健康評価スコア（ＡＰＡＣＨＥスコアＩ〜ＩＶ）、単純化急性生理学スコア（ＳＡＰＳ Ｉ〜ＩＩＩスコア）、逐次臓器不全評価スコア（ＳＯＦＡスコア）、クイックＳＯＦＡ（ｑＳＯＦＡ）スコア、単純化急性生理学スコアＩＩ（ＳＡＰＳＩＩスコア）、死亡確率モデル（ＭＰＭ Ｉ〜ＩＩＩ）、多臓器機能不全スコア（ＭＯＤＳ）、治療介入スコアリングシステム（ＴＩＳＳ）、９項目の看護作業負荷使用スコア（ｎｉｎｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ ｏｆ ｎｕｒｓｉｎｇ ｍａｎｐｏｗｅｒ ｕｓｅ ｓｃｏｒｅ）（ＮＥＭＳ）、世界脳神経外科学会連盟（ＷＦＮＳ）の等級付け、およびグラスゴー・コーマ・スケール（ＧＣＳ）、ＣＵＲＢ−６５肺炎重症度スコア、肺炎重症度指数（ＰＳＩ）、年齢、性別、家族歴、民族、体重、肥満指数（ＢＭＩ）、膀胱鏡検査報告、白血球数、ＣＴスキャン、血圧、心拍数、降圧治療、液体摂取、喘鳴、体温、糖尿病の存在、ならびに現在の喫煙習慣からなる群から選択され得る。
本明細書で使用される場合、「マーカー」、「代理」、「予後診断マーカー」、「因子」、または「バイオマーカー」もしくは「生物学的マーカー」などの用語は、互換的に使用され、疾患／障害／臨床状態リスク、好ましくは有害事象などの健康および生理学に関連する評価の指標として機能する測定可能かつ定量化可能な生物学的マーカー（例えば、特定のタンパク質もしくは酵素濃度、しくはそのフラグメント、特定のホルモン濃度もしくはそのフラグメント、または生物学的物質もしくはそのフラグメントの存在）に関する。マーカーは、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、または治療的介入に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定および評価され得る特性として定義される。バイオマーカーは、試料中で（血液、血漿、尿、または組織検査として）測定され得る。前述の対象の少なくとも１つのさらなるマーカーは、プロカルシトニン、カルシトニン、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、トロポニン、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、膵臓結石タンパク質（ＰＳＰ）、骨髄性細胞で発現する受容体１（ＴＲＥＭ１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１、インターロイキン−２４（ＩＬ−２４）その他のＩＬ、プレセプシン（ｓＣＤ１４−ＳＴ）、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、アルファ−１−アンチトリプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ９））、クロモグラニンＡ、Ｓ１００Ａタンパク質、Ｓ１００Ｂタンパク質および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）またはそれらのフラグメントからなる群から選択され得る。
本発明の特定の態様では、前述の対象の少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメータは、前述の試料中のアルドラーゼＢのレベル、前述の試料中のコペプチンのレベル、前述の試料中のプロエンドセリン−１のレベル、前述の試料中の乳酸塩のレベル、前述の試料中のプロカルシトニン（ＰＣＴ）のレベル、前述の対象の逐次臓器不全評価スコア（ＳＯＦＡスコア）、単純化急性生理学スコア（ＳＡＰＳＩＩスコア）、前述の対象の急性生理学および慢性健康評価ＩＩ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコア、ならびに前述の試料中の可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１（ｓＦｌｔ−１）のレベルからなる群から選択され得る。
本発明の特定の態様において、前述の対象の少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメータは、プロカルシトニン、カルシトニン、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、トロポニン、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、膵臓結石タンパク質（ＰＳＰ）、骨髄細胞で発現するトリガー受容体１（ＴＲＥＭ１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１、インターロイキン２４（ＩＬ−２４）その他のＩＬ、プレセプシン（ｓＣＤ１４−ＳＴ）、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、アルファ−１−アンチトリプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ７）、クロモグラニンＡ、Ｓ１００Ａタンパク質、Ｓ１００Ｂタンパク質、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、年齢、性別、家族歴、民族、体重、肥満指数（ＢＭＩ）、膀胱鏡検査報告、白血球数、ＣＴスキャン、血圧、心拍数、降圧治療、リキッドイン服用、喘鳴、体温、糖尿病の有無、現在の喫煙習慣、急性生理および慢性健康評価スコア（ＡＰＡＣＨＥスコアＩ〜ＩＶ）、簡易急性生理機能スコア（ＳＡＰＳ Ｉ〜ＩＩＩスコア）、逐次的臓器不全評価スコア（ＳＯＦＡスコア）、死亡確率モデル（ＭＰＭ Ｉ−ＩＩＩ）、多臓器不全スコア（ＭＯＤＳ）、治療介入スコアリングシステム（ＴＩＳＳ）、９項目の看護作業負荷使用スコア（ＮＥＭＳ）、世界神経外科学会（ＷＦＮＳ）グレーディング、グラスゴーコマスケール（ＧＣＳ）からなる群から選択され得る。
本明細書で使用される場合、「アルドラーゼＢ」は、クラスＩフルクトース１，６−ビスホスフェートアルドラーゼ酵素の３つのイソ酵素（Ａ、Ｂ、およびＣ）のうちの１つであるフルクトース−ビスホスフェートアルドラーゼＢまたは肝臓型アルドラーゼを指す。対象の試料中のアルドラーゼＢのレベルは、質量分析法に基づく方法によって決定することができる。
「コペプチン」はまた、「ＣＴ−ｐｒｏＡＶＰ」または「バソプレシンのＣ末端部分」とも呼ばれる。バソプレシンは、強力な血管収縮薬である。ＣＴ−ｐｒｏＡＶＰのレベルは、以下に記載されるように、イムノアッセイによって対象の血漿または血清中で測定され得る。
本明細書で使用される場合、「乳酸塩」は、血中で測定された最大乳酸塩濃度を指す。通常、乳酸塩濃度は、毎日またはさらにより頻繁に評価される。血中の乳酸濃度は、乳酸オキシダーゼ分光光度法によって決定することができる。
本明細書中で使用される場合、「プロカルシトニン」または「ＰＣＴ」は、アミノ酸残基１〜１１６、２〜１１６、３〜１１６またはそれらのフラグメントに及ぶペプチドに関する。したがって、プロカルシトニンフラグメントの長さは、少なくとも１２アミノ酸、好ましくは５０アミノ酸以上、より好ましくは１１０アミノ酸以上である。ＰＣＴは、グリコシル化、脂質化、または誘導体化などの翻訳後修飾を含み得る。プロカルシトニンは、カルシトニンおよびカタカルシンの前駆体である。したがって、通常の条件下では、循環中のＰＣＴレベルは、非常に低い（約０．０５ｎｇ／ｍＬ未満）。対象の試料中のＰＣＴのレベルは、以下に記載されるようにイムノアッセイによって決定され得る。
本明細書で使用される場合、「逐次臓器不全評価スコア」または「ＳＯＦＡスコア」は、集中治療室（ＩＣＵ）または救急科（ＥＤ）に滞在中の患者の状態を追跡するために使用される１つのスコアである。ＳＯＦＡスコアは、人の臓器機能の程度または不全率を決定するためのスコアリングシステムである。スコアは、６つの異なるスコアに基づき、各１つが呼吸器系、心血管系、肝臓系、凝固系、腎臓系、および神経系に対する。平均および最高の両方のＳＯＦＡスコアが転帰の予測因子である。ＩＣＵまたはＥＤにおける最初の２４〜４８時間のＳＯＦＡスコアの増加は、少なくとも５０％〜９５％の死亡率を予測する。９未満のスコアは３３％で予測死亡率を与え、一方１４を超えると９５％に近いかまたは９５％を超えることができる。
本明細書で使用される場合、「ＳＡＰＳ ＩＩ」または「単純化急性生理学スコアＩＩ」は、疾患または障害の重症度を分類するためのシステムに関する（Ｌｅ Ｇａｌｌ ＪＲ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｓｃｏｒｅ（ＳＡＰＳ ＩＩ）ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ／Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｓｔｕｄｙ．ＪＡＭＡ．１９９３；２７０（２４）：２９５７−６３を参照されたい）。ＳＡＰＳ ＩＩスコアは、１２個の生理学的変数および３個の疾患関連変数で構成されている。ポイントスコアは、１２個の日常的な生理学的測定、以前の健康状態に関する情報、およびＩＣＵまたはＥＤへの入院時に得られたいくつかの情報から計算される。ＳＡＰＳ ＩＩスコアはいつでも、好ましくは２日目に決定することができる。「最悪の」測定値は、最高の点数に相関する基準として定義される。ＳＡＰＳ ＩＩスコアは、０〜１６３点の範囲である。分類システムは、以下のパラメータを含む：年齢、心拍数、収縮期血圧、体温、グラスゴー・コーマ・スケール、人工呼吸器またはＣＰＡＰ、ＰａＯ２、ＦｉＯ２、尿量、血中尿素窒素、ナトリウム、カリウム、重炭酸塩、ビリルビン、白血球、慢性疾患、および入院の種類。死亡率と合計ＳＡＰＳ ＩＩスコアとの間にはＳ字形相関がある。対象の死亡率は、２９点のＳＡＰＳＩＩスコアで１０％であり、死亡率は、４０点のＳＡＰＳＩＩスコアで２５％であり、死亡率は、５２点のＳＡＰＳＩＩスコアで５０％であり、死亡率は、６４点のＳＡＰＳＩＩスコアで７５％であり、死亡率は、７７点のＳＡＰＳＩＩスコアで９０％である（Ｌｅ Ｇａｌｌ ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。
本明細書中で使用される場合、「ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ」または「急性生理学および慢性健康評価ＩＩ」は、重症度分類の採点システムである（Ｋｎａｕｓら、１９８５）。それは、集中治療室（ＩＣＵ）または救急科（ＥＤ）への患者の入院から２４時間以内に適用され得、１２個の異なる生理学的パラメータに基づき決定され得る。
本明細書で使用される場合、「クイックＳＯＦＡスコア」または「ｑＳＯＦＡスコア」は、患者の臓器機能不全または死亡リスクを示すスコアリングシステムである。スコアは、３つの基準に基づく：１）精神状態の変化、２）１００ｍｍ Ｈｇ未満の収縮期血圧の低下、３）毎分２２呼吸を超える呼吸数。これらの状態のうちの２つ以上を有する患者は、臓器機能不全を有するか、死亡するリスクがより高い。
本明細書中で使用される場合、「可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１」または「ｓＦｌｔ−１」は、血管成長を引き起こすタンパク質を無効にするチロシンキナーゼタンパク質である。可溶性Ｆｌｔ−１（ｓＦｌｔ−１）は、様々な組織によって産生されるＶＥＧＦ受容体１（Ｆｌｔ−１）のスプライス変異体である。対象の試料中のｓＦＬＴ１のレベルは、質量分析法に基づくアッセイおよびイムノアッセイによって決定することができる。
本明細書で使用される場合、「ＣＵＲＢ−６５」スコア（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）は、対象の以下の危険因子に関連する：
−新たな発病の混乱（８以下の略式精神試験スコア（ＡＭＴＳ）として定義される（Ｈｏｄｋｉｎｓｏｎ，１９７２））、
−７ｍｍｏｌ／Ｌ（１９ｍｇ／ｄＬ）を超える血中尿素窒素、
−毎分３０呼吸以上の呼吸数、
−９０ｍｍＨｇ未満の血圧、６０ｍｍＨｇ以下の収縮期または拡張期血圧、
−６５歳以上。
各危険因子は、１点を取り、最大スコアは５である。
本明細書で使用される場合、「肺炎重症度指数」（ＰＳＩ）は、院外感染性肺炎患者間の罹患率および死亡率の確率を計算するための臨床予測規則に関する（Ｆｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
本発明の方法またはキットは、少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベル、ならびに上記のようなさらなるマーカーおよび／またはパラメータのレベルを決定することを含み得る。
好ましい態様では、本発明の前述の方法またはキットは、ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルおよび前述のＳＯＦＡスコアを決定することを含み得る。さらに、本発明の前述の方法またはキットは、前述の対象のｐｒｏＡＤＭの前述のレベル、前述のＳＯＦＡスコア、および乳酸塩の前述のレベルを決定することを含み得る。
本発明の方法および使用されるキットはまた、ＳＡＰＳ ＩＩスコア、ＳＯＦＡスコアおよび／またはＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアなどの少なくとも１つのさらなるパラメータを決定することを含み得る。例えば、方法は、対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベル、ならびに対象のＳＡＰＳ ＩＩスコアを決定することを含み得る。好ましくは、方法は、前述の対象の前述の試料中の少なくとも１つのヒストンの前述のレベル、および前述の対象の前述のＳＡＰＳＩＩスコアを決定することを含む。少なくとも１つのヒストンのレベルおよびＳＡＰＳＩＩスコアは、２８日以内に起こる前記対象の有害事象、特に死亡の指標となり得る。
好ましくは、前述の方法は、前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭのレベルおよび前述の対象の前述のＳＡＰＳＩＩスコアを決定することを含む。ｐｒｏＡＤＭおよびＳＡＰＳＩＩスコアのレベルは、２８日以内または７日以内に起こる前述の対象の有害事象、特に死亡を示し得る。
さらに、この方法は、対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベル、ならびに対象のＳＯＦＡスコアを決定することを含み得る。
さらに、この方法は、対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭの濃度、ならびに対象の試料中のＰＣＴのレベルを決定することを含み得る。さらに、この方法は、対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭの濃度、ならびに対象の試料中のアルドラーゼＢのレベルを決定することを含み得る。
本明細書中で使用される場合、「対象」（または「患者」）は脊椎動物であり得る。本発明の文脈において、「対象」という用語は、ヒトおよび動物の両方、特に哺乳動物、および他の生物を含む。したがって、本明細書に提供される方法は、ヒト対象および動物対象の両方に適用可能である。したがって、前述の対象は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ種、ウマ、ラクダ、または霊長類などの動物であり得る。好ましくは、対象は、哺乳動物である。最も好ましくは、対象はヒトである。
本明細書で提供される方法は、健康な対象、または任意の疾患（複数可）もしくは障害（複数可）を患っている対象である任意の対象に対して使用され得る。好ましい態様では、対象は、疾患、障害、または病状を患っている。試験される対象は重篤な患者であり得、好ましくは前述の対象は集中治療室に入院する。本明細書で使用されるように、重篤な病気は、対象または患者が生命を脅かす状況にあることを意味する。
対象または参照対象（複数可）は、疾患または病状／障害を患っていてもよく、前述の疾患または病状／障害は、呼吸器疾患、尿路感染症、感染性および非感染性の病因に関連した炎症反応、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック、臓器不全（複数可）、心血管疾患、糖尿病、悪性腫瘍（複数可）、肝疾患、腎疾患、免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、グラム陰性細菌感染症、グラム陽性細菌感染症、ならびに免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）からなる群から選択され得る。本明細書において、ｐｒｏＡＤＭレベル（特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭレベル）の検出に基づく本発明の方法は、真菌感染症を患っている対象における有害事象の予測に特に有用である。それはまた、気道、特に下気道の感染症を患っている対象にとって特に有用である。
対象はまた、骨および／または組織の欠損、例えば骨の骨折に続く感染症を患っていてもよい。
さらに、対象は、手術のために選ばれてもよい。これは、対象が手術を受けることを意味する。この手術は、入院の理由または症状である疾患および／または障害に関連付けられていてもよい。
特に、対象は呼吸器疾患、尿路感染症、および／または悪性腫瘍を患っている。
本発明の文脈における「全身性炎症」は、好ましくは、炎症性サイトカインの放出および生物学的要因、化学的要因または遺伝的要因によって引き起こされ得る活性化された自然免疫系によって特徴付けられる状態に関する。重篤な「全身性炎症」は、臓器不全および死亡につながる可能性がある。
本発明の文脈における「ＳＩＲＳ」は、感染の徴候のない全身性炎症反応症候群である。それは、以下の臨床症状のうちの１つより多くを含むが、これらに限定されない：（１）３８℃より高いかまたは３６℃より低い体温。（２）毎分９０回を超える心拍数。（３）毎分２０呼吸を超える呼吸数、または３２ｍｍＨｇ未満のＰａＣＯ2によって示されるような過換気によって表される頻呼吸。（４）白血球数の変化、例えば１２，０００／ｍｍ3を超える数、４，０００／ｍｍ3未満の数、または１０％を超える未熟好中球の存在（Ｂｏｎｅら、ＣＨＥＳＴ １０１（６）：１６４４−５５，１９９２）。
本発明の文脈における「敗血症」は、感染に対する全身性反応を指す。あるいは、敗血症は、ＳＩＲＳと確認された感染プロセスまたは感染との組み合わせとして見られ得る。敗血症は、感染症および全身性炎症反応の両方の存在によって定義される臨床症候群として特徴付けられ得る（Ｌｅｖｙ ＭＭ ｅｔ ａｌ．２００１ ＳＣＣＭ／ＥＳＩＣＭ／ＡＣＣＰ／ＡＴＳ／ＳＩＳ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｐｓｉｓ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２００３ Ａｐｒ；３１（４）：１２５０−６）。本明細書で使用される「敗血症」という用語は、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショックを含むがこれらに限定されない。この文脈における重症敗血症は、臓器機能不全、低灌流異常、または敗血症誘発性低血圧に関連する敗血症を意味する。低灌流異常には、乳酸アシドーシス、乏尿症、および精神状態の急激な変化が含まれる。敗血症誘発性低血圧は、低血圧の他の原因（例えば、心原性ショック）がない場合の、約９０ｍｍ Ｈｇ未満の収縮期血圧の存在またはベースラインからの約４０ｍｍ Ｈｇ以上のその低減によって定義される。敗血症性ショックは、低灌流異常または臓器機能不全の存在と共に、適切な輸液蘇生法にもかかわらず持続する敗血症誘発性低血圧を伴う重症敗血症として定義される（Ｂｏｎｅら、ＣＨＥＳＴ １０１（６）：１６４４−５５、１９９２）。
「敗血症」という用語には、ＳＥＰＳＩＳ−２の定義に基づく重症敗血症または敗血症性ショックも含まれる（Ｂｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。「敗血症」という用語には、ＳＥＰＳＩＳ−３の定義内に入る対象も含まれる（Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
本明細書で使用される「敗血症」という用語は、敗血症の発症における全ての可能な段階に関する。
本明細書で使用される場合、本発明の範囲内の「感染症」は、病原性または潜在的に病原性の微生物による通常は無菌の組織または体液の侵入によって引き起こされる病理学的プロセスを意味し、細菌、ウイルス、真菌、および／または寄生虫による感染（複数可）に関する。したがって、感染症は、細菌感染症、ウイルス感染症、および／または真菌感染症であり得る。感染症は、局所感染症または全身感染症であり得る。さらに、感染症を患っている対象は、同時に２つ以上の感染源（複数可）を患っている可能性がある。例えば、感染症を患っている対象は、細菌感染症およびウイルス感染症、ウイルス感染症および真菌感染症、細菌感染症および真菌感染症、ならびに細菌感染症、真菌感染症、およびウイルス感染症を患っている可能性がある。
特に、対象は敗血症を患っている。さらに、対象は、好ましくは呼吸器疾患、好ましくは下気道の感染症を患っていてもよい。本明細書で使用される場合、呼吸器疾患は、高等生物においてガス交換を可能にする臓器および組織に影響を与える病理学的状態を含み、また上気道、気管、気管支、細気管支、肺胞、胸膜および胸腔、ならびに呼吸の神経および筋肉の状態も含む。
特に、本発明の方法およびキットにおいて、前述の呼吸器疾患に罹患している前述の対象の前述の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルは、有害事象、特に７日以内に起こる死亡の指標となる。
特に、本発明の方法およびキットにおいて、対象は、尿路感染症を患っており、前述の尿路感染症を患っている前述の対象の前述の試料中の少なくとも１つのヒストンの前述のレベルは、２８日以内に起こる有害事象、特に死亡の指標である。
特に、本発明の方法およびキットにおいて、対象は悪性腫瘍に罹患しており、前記悪性腫瘍に罹患している前記対象の前記試料中の少なくとも１つのヒストンの前記レベルは７日以内に起こる有害事象、特に死亡の指標である。
本明細書中で使用される場合、用語「試料」は、対象から得られる生物学的試料である。「試料」は、本明細書で使用される場合、例えば、患者などの関心対象の診断、予後診断、または評価の目的で得られた体液または組織の試料を指し得る。好ましくは、本明細書において、試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、痰、および胸水などの体液の試料である。特に、試料は、血液、血漿、血清、または尿である。試料は、分画または精製手順、例えば、全血の血清または血漿成分への分離などによって処理（前処理）され得る。そのような前処理はまた、希釈、濾過、遠心分離、濃縮、沈降、沈殿、または透析を含み得るが、これらに限定されない。前処理はまた、酸、塩基、緩衝剤、塩、溶媒、反応性染料、洗剤、乳化剤、キレート剤などの化学的または生化学的物質の溶液への添加も含み得る。好ましくは、試料は血液試料、より好ましくは血清試料または血漿試料である。
本発明の文脈における「血漿」は、遠心分離後に得られる抗凝固剤を含有する血液の実質的に無細胞の上清である。抗凝血剤の例としては、ＥＤＴＡまたはクエン酸塩などのカルシウムイオン結合化合物、およびヘパリン酸塩またはヒルジンなどのトロンビン阻害剤が挙げられる。無細胞血漿は、抗凝固処理された血液（例えば、クエン酸塩処理された、ＥＤＴＡまたはヘパリン処理された血液）を、例えば、２０００〜３０００ｇで少なくとも１５分間遠心分離することによって得ることができる。
本発明の文脈における「血清」は、血液を凝固させた後に収集される全血の液体画分である。凝固した血液（血餅）が遠心分離されると、血清が上清として得られ得る。
本明細書で使用される場合、「尿」は、排尿（または排尿）と呼ばれる過程を通して腎臓によって分泌され、尿道を通して排泄される体の液体製品である。
上記のように、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルは、対象の試料中で決定される。当業者は、試料中のバイオマーカーのレベルを決定するために使用され得る方法／アッセイを知っている。
上記のように、少なくとも１つのヒストンのレベル、特にヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２Ａおよび／またはＨ３のレベルが決定される。特に、ヒストンまたはヒストンフラグメントが決定され得る。そのようなフラグメントは、本明細書において以下に例示される。
そのようなヒストンまたはそのフラグメントはまた遊離ヒストンを表し得る。例えば、本発明の方法、キット、および抗体は、遊離ヒストンのペプチドまたはエピトープを特に検出し得る。そのようなアミノ酸の伸長はまた、本明細書においてヒストンの中央領域または中央部分とも呼ばれる。以下において、本明細書に提供される方法を用いて遊離ヒストンを検出するためにも使用され得るペプチドまたはエピトープが記載される。
特に、少なくとも１つのヒストンはヒストンＨ４であり得、配列番号１によるヒストンＨ４のアミノ酸残基２２〜１０２に及ぶ配列の少なくともペプチドが決定される。特に、少なくとも１つのヒストンは、ヒストンＨ４であり、配列番号１の残基６０〜６７、配列番号１の残基４６〜５６、配列番号１の残基６７〜７８、配列番号１の残基２２〜３０、配列番号１の残基６７〜７８、配列番号１の残基９２〜１０２、配列番号１の残基２２〜３４、配列番号１の残基４６〜１０２、配列番号１の残基４６〜５５、配列番号１の残基８０〜９１、配列番号１の残基２４〜３５、および配列番号１の残基６８〜７７に及ぶアミノ酸配列からなる群から選択される配列の少なくともペプチドが決定される。例えば、２つのペプチドが決定され得る。
特に、少なくとも１つのヒストンはヒストンＨ４であり、ペプチドは配列番号１の残基４６〜５６および配列番号１の残基６７〜７８に及ぶアミノ酸配列から決定される。
さらに、少なくとも１つのヒストンはヒストンＨ２Ａであり、配列番号２によるヒストンＨ２Ａのアミノ酸残基２０〜１１８に及ぶ配列の少なくともペプチドが決定される。特に、少なくとも１つのヒストンは、ヒストンＨ２Ａであり、配列番号２の残基２１〜５３配列番号２の残基２１〜２９、配列番号２の残基３０〜５３、配列番号２の残基１２０〜１２９、配列番号２の残基２１〜２９、配列番号２の残基８２〜８８、配列番号２の残基８９〜９５、および配列番号２の残基１００〜１１８に及ぶアミノ酸配列からなる群から選択される配列の少なくともペプチドが決定される。
さらに、少なくとも１つのヒストンはヒストンＨ３であり、配列番号３によるヒストンＨ３のアミノ酸残基２７〜６２に及ぶ配列の少なくともペプチドが決定される。さらに、少なくとも１つのヒストンはヒストンＨ３であり、少なくとも配列番号３のアミノ酸残基２７〜３７および／または配列番号３のアミノ酸残基５２〜６２に及ぶ配列のペプチドが決定される。
さらに、少なくとも１つのヒストンはヒストンＨ２Ｂであり、配列番号４によるヒストンＨ２Ｂのアミノ酸残基４１〜６９に及ぶ配列の少なくともペプチドが決定される。
さらに、少なくとも１つのヒストンはヒストンＨ２Ａであり、少なくとも１つのペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号７、８、９および１０からなる群から選択されると決定される。
さらに、少なくとも１つのヒストンはヒストンＨ４であり、ここで配列番号１１、１２、１３、１４、１５および１６からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドまたはそのフラグメントが決定される。
本明細書では、１、２、３、４またはそれ以上のペプチドを決定することができると理解される。
マーカー、例えば少なくとも１つのヒストンもしくはそのフラグメントおよび／またはｐｒｏＡＤＭもしくはそのフラグメントのレベルは、マーカーの濃度を確実に決定する任意のアッセイによって決定することができる。特に、質量分析（ＭＳ）および／またはイムノアッセイを添付の実施例に例示されているように使用することができる。本明細書中で使用される場合、イムノアッセイは、抗体もしくは抗体結合フラグメントもしくは免疫グロブリンの使用を通して溶液中の巨大分子／ポリペプチドの存在または濃度を測定する生化学的試験である。
あるいは、抗体の代わりに、ヒストン配列、ヒストンエピトープ、およびヒストンの構造的立体配座を特異的および／または選択的に認識する他の捕捉分子または分子足場も本発明の範囲に包含され得る。本明細書において、用語「捕捉分子」または「分子足場」は、試料からの標的分子または目的の分子、すなわち分析物（例えば、ヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭ）を結合するために使用され得る分子を含む。したがって、捕捉分子は、空間的にも、表面電荷、疎水性、親水性、ルイス供与体および／または受容体の存在または非存在などの表面の特徴に関しても適切に成形され、標的分子または目的の分子に特異的に結合する。これにより、結合は、例えば、イオン、ファンデルワールス力、π−π、Σ−π、疎水性もしくは水素結合相互作用、または捕捉分子もしくは分子足場と標的分子または関心のある分子との間の上記の相互作用もしくは共有結合性相互作用のうちの２つ以上の組み合わせによって媒介され得る。本発明の文脈において、捕捉分子または分子足場は、例えば、核酸分子、炭水化物分子、ＰＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、および糖タンパク質からなる群から選択され得る。捕獲分子または分子足場は、例えば、アプタマー、ＤＡＲｐｉｎｓ（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ａｎｋｙｒｉｎ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ａｆｆｉｍｅｒｓなどを含む。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子をいう。本発明によると、抗体は、モノクローナル抗体ならびにポリクローナル抗体であってもよい。特に、少なくとも１つのヒストンに特異的に結合するおよび／またはｐｒｏＡＤＭに特異的に結合する抗体が使用される。目的の分子、例えば少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、またはそのフラグメントに対するその親和性が、目的の分子を含む試料に含まれる他の分子に対するよりも、少なくとも５０倍高く、好ましくは１００倍高く、最も好ましくは少なくとも１０００倍高い場合、抗体は特異的であるとみなされる。所与の特異性を有する抗体をどのように開発しそして選択するかは、当該技術分野において周知である。本発明の文脈において、モノクローナル抗体が好ましい。抗体または抗体結合フラグメントは、本明細書に定義されたマーカーまたはそのフラグメントに特異的に結合する。特に、抗体または抗体結合フラグメントは、少なくとも１つのヒストンタンパク質の本明細書に定義されたペプチドに結合する。したがって、本明細書に定義されたペプチドはまた、抗体が特異的に結合するエピトープであり得る。さらに、本発明の方法およびキットにおいて、ｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭに特異的に結合する抗体または抗体結合フラグメントが使用される。例示的なイムノアッセイは、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光および蛍光イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、発光ベースのビーズアレイ、磁気ビーズベースのアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、迅速試験フォーマット、希土類クリプテートアッセイであってもよい。さらに、ポイントオブケア試験および例えば免疫クロマトグラフィーストリップ試験などの迅速試験形式に適したアッセイを使用することができる。
本発明のある態様では、方法は、対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のための方法であって、前述の方法は、
（ｉ）対象の試料を得ることと、
（ｉｉ）試料を、前述の少なくとも１つのヒストンおよび／または前述のｐｒｏＡＤＭのエピトープに特異的な抗体（複数可）またはその抗原結合フラグメント（複数可）もしくは誘導体（複数可）と接触させ、抗体（複数可）またはその抗原結合フラグメント（複数可）もしくは誘導体（複数可）と前述の少なくとも１つのヒストンおよび／または前述のｐｒｏＡＤＭとの間の結合を検出することによって、前述の対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを検出することと、を含み、
（ｉｉｉ）少なくとも一つのヒストンの前述のレベルおよび／またはプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）の前述のレベルは、前述の対象の前述の有害事象の指標である。
本発明のある特定の態様では、方法は、
ａ）試料を
（ｉ）ヒストンまたはｐｒｏＡＤＭの第１のエピトープに特異的な第１の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と、かつ
（ｉｉ）ヒストンまたはｐｒｏＡＤＭの第２のエピトープに特異的な第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と、接触させるステップと、
ｂ）第１および第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の、ヒストンまたはｐｒｏＡＤＭへの結合を検出するステップと、を含む、イムノアッセイである。
好ましくは、一方の抗体を標識し、他方の抗体を固相に結合させるか、または固相に選択的に結合させることができる。アッセイの特に好ましい態様では、抗体のうちの一方が標識される一方で、他方の抗体は、固相に結合されるか、または固相に選択的に結合され得る。第１の抗体および第２の抗体は、液体反応混合物中に分散して存在することができ、蛍光または化学発光消光または増幅に基づく標識系の一部である第１の標識成分は、第１の抗体に結合され、前述の標識系の第２の標識成分は、第２の抗体に結合され、これにより、検出されるべき両方の抗体の前述の少なくとも１つのヒストンおよび／または前述のｐｒｏＡＤＭへの結合後、測定溶液中の得られたサンドイッチ錯体の検出を可能にする測定可能なシグナルが発生する。標識系は、希土類クリプテートまたはキレートを、特にシアニンタイプの蛍光または化学発光染料と組み合わせて含むことができる。
好ましい実施形態では、この方法は異種サンドイッチイムノアッセイとして実施され、ここで抗体の１つは任意に選択された固相、例えば被覆試験管（例えばポリスチロール試験管；被覆管；ＣＴ）またはマイクロタイター上に固定される。他の抗体は、検出可能な標識に似ているかまたは標識への選択的結合を可能にする基を有し、そして形成されたサンドイッチ構造の検出に役立つ。適切な固相を用いた一時的な遅延またはその後の固定化も可能である。
本発明による方法は、均質な方法としてさらに具体化され得、検出されるべき抗体／複数の抗体およびマーカー、例えば、ヒストンもしくはｐｒｏＡＤＭまたはそのフラグメントによって形成されるサンドイッチ錯体は、液相中で懸濁状態のままである。この場合、２つの抗体が使用されるとき、両方の抗体が検出系の一部で標識され、それが、両方の抗体が単一のサンドイッチに統合される場合にシグナルの発生またはシグナルの誘発をもたらすことが好ましい。そのような技術は、特に蛍光増強または蛍光消光検出方法として具体化されるべきである。特に好ましい態様は、例えば、ＵＳ ４ ８８２ ７３３ Ａ、ＥＰ−Ｂ１ ０ １８０ ４９２、またはＥＰ−Ｂ１ ０ ５３９ ４７７、およびそれらで引用された従来技術に記載されているものなど、対で使用される検出試薬の使用に関する。このようにして、反応混合物中の単一の免疫複合体中に直接両方の標識成分を含む反応生成物のみが検出される測定が可能になる。例えば、そのような技術は、上記で引用された出願の教示を実装する、商標名ＴＲＡＣＥ（登録商標）（Ｔｉｍｅ Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｃｒｙｐｔａｔｅ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ）、またはＫＲＹＰＴＯＲ（登録商標）の下で提供されている。したがって、特に好ましい態様では、本明細書で提供される方法を実行するために診断装置が使用される。例えば、ヒストンもしくはｐｒｏＡＤＭまたはそのフラグメントのレベル、および／あるいは本明細書で提供される方法の任意のさらなるマーカーのレベルが決定される。特に好ましい態様において、診断装置はＫＲＹＰＴＯＲ（登録商標）である。
さらに、本発明のイムノアッセイ法は、好ましくは、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのエピトープ（複数可）に特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体、またはその抗原結合フラグメント（複数可）もしくは誘導体（複数可）を利用し得る。例示的なペプチドは、ｐｒｏＡＤＭおよび／または少なくとも１つのヒストンのレベルの決定に適し得る、本明細書中以下および上に記載されている。
例えば、本発明のイムノアッセイ法は、好ましくは、ヒストンＨ４のエピトープ（複数可）に特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体、またはその抗原結合フラグメント（複数可）もしくは誘導体（複数可）を利用し得、第１のエピトープおよび／または第２のエピトープは、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１０２に及ぶ配列中に存在するヒストンＨ４のエピトープである。
さらに、本発明のイムノアッセイ法は、配列番号１のアミノ酸残基４６〜５６に及ぶ配列中に存在するヒストンＨ４のエピトープに特異的な第１の抗体、その抗原結合フラグメント、または誘導体、および配列番号１のアミノ酸残基６７〜７８に及ぶ配列中に存在するヒストンＨ４のエピトープに特異的な第２の抗体、その抗原結合フラグメント、または誘導体を利用し得る。
例えば、本発明のイムノアッセイ方法は、好ましくは、ヒストンＨ２Ｂのエピトープ（複数可）に特異的な第１の抗体および／もしくは第２の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用し得、第１のエピトープおよび／または第２のエピトープは、配列番号４のアミノ酸残基４１〜６９に及ぶ配列中に存在するヒストンＨ２Ｂのエピトープである。
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、好ましくは、ヒストンＨ２Ａのエピトープに特異的な第１の抗体および／もしくは第２の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用してもよく、第１のエピトープおよび／または第２のエピトープは、配列番号２のアミノ酸残基２０〜１１８に及び配列中に存在するヒストンＨ２Ａのエピトープである。
さらに、本発明のイムノアッセイ法は、ヒストンＨ２Ａのエピトープに特異的な第１の抗体および／もしくは第２の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用することができ、第１のエピトープおよび／または第２のエピトープは、配列番号２のアミノ酸残基２１〜５３、２０〜１１８または１２０〜１２９に及ぶ配列中に存在するヒストンＨ２Ａのエピトープである。
さらに、本発明のイムノアッセイ法は、ヒストンＨ３のエピトープ（複数可）に特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体、またはその抗原結合フラグメント（複数可）もしくは誘導体（複数可）を利用し得、第３のエピトープおよび／または第２のエピトープは、配列番号１のアミノ酸残基２７〜６２に及ぶ配列中に存在するヒストンＨ３のエピトープである。
より好ましくは、本発明のイムノアッセイ法は、ヒストンＨ４のエピトープ（複数可）に特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体、またはその抗原結合フラグメント（複数可）もしくは誘導体（複数可）を利用し得、エピトープ（複数可）は、配列番号１の残基２２〜３０、配列番号１の残基４６〜５６、配列番号１の残基６７〜７８、配列番号１の残基９２〜１０２、配列番号１の残基２２〜３４、および配列番号１の残基４６〜１０２に及ぶアミノ酸配列からなる群から選択される。
さらに、本発明のイムノアッセイ法は、ヒストンＨ２Ａのエピトープ（複数可）に特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体、またはその抗原結合フラグメント（複数可）もしくは誘導体（複数可）を利用し得、エピトープ（複数可）は、配列番号２の残基２１〜５３、配列番号２の残基２１〜２９、配列番号２の残基３０〜５３、および配列番号２の残基１２０〜１２９に及ぶアミノ酸配列からなる群から選択される。
さらに、本発明のイムノアッセイ法は、配列番号４の４１〜６９に及ぶヒストンＨ２Ｂのエピトープ（複数可）に特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体、またはその抗原結合フラグメント（複数可）もしくは誘導体（複数可）を利用し得る。
さらに、本発明のイムノアッセイ法は、配列番号３の残基２７〜３６に及び、かつ／または配列番号３の残基５２〜６２に及ぶヒストンＨ３のエピトープ（複数可）に特異的である、第１の抗体および／もしくは第２の抗体、またはその抗原結合フラグメント（複数可）もしくは誘導体（複数可）を利用し得る。
さらに、本発明のイムノアッセイ法は、配列番号２によって表されるヒストンＨ２Ａ配列のアミノ酸残基２１〜５３および／または１２０〜１２９に及ぶ配列中に存在するヒストンＨ２Ａのエピトープに特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用し得る。
さらに、本発明のイムノアッセイ法は、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１０２に及ぶ配列中に存在するヒストンＨ４のエピトープに特異的である第１の抗体、その抗原結合フラグメント、または誘導体、および遊離ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、または好ましくはＨ３のエピトープに特異的である第２の抗体、その抗原結合フラグメント、または誘導体を利用し得る。
さらに、本発明のイムノアッセイ法は、配列番号４のアミノ酸残基４１〜６９に及ぶ配列中に存在するヒストンＨ２Ｂのエピトープに特異的である第１の抗体、その抗原結合フラグメント、または誘導体、および遊離ヒストンＨ２Ａ、Ｈ４、またはＨ３のエピトープに特異的である第２の抗体、その抗原結合フラグメント、または誘導体を利用し得る。
さらに、本発明のイムノアッセイ法は、配列番号２のアミノ酸残基２０〜１１８に及ぶ配列中に存在するヒストンＨ２Ｂのエピトープに特異的である第１の抗体、その抗原結合フラグメント、または誘導体、および遊離ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、またはＨ３のエピトープに特異的である第２の抗体、その抗原結合フラグメント、または誘導体を利用し得る。
さらに、本発明のイムノアッセイ法は、配列番号３のアミノ酸残基２７〜６２に及ぶ配列中に存在するヒストンＨ２Ｂのエピトープに特異的である第１の抗体、その抗原結合フラグメント、または誘導体、および遊離ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、またはＨ２Ａのエピトープに特異的である第２の抗体、その抗原結合フラグメント、または誘導体を利用し得る。
さらに、本発明のイムノアッセイ法は、配列番号２のアミノ酸残基２１〜５３、１２０〜１２９、または２０〜１１８に及ぶ配列中に存在するヒストンＨ２Ａのエピトープに特異的である第１の抗体、その抗原結合フラグメント、または誘導体、および遊離ヒストンＨ３、Ｈ４、または好ましくはＨ２Ｂのエピトープに特異的である第２の抗体、その抗原結合フラグメント、または誘導体を利用し得る。
本発明はさらに、上に詳述したようにヒストンタンパク質またはそのフラグメントのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントまたは誘導体に関する。ヒストンまたはｐｒｏＡＤＭ、好ましくはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭを検出するためにうまく用いられる例示的な抗体は、添付の実施例に示される。したがって、本発明は、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２Ａ、Ｈ３、および／またはｐｒｏＡＤＭ、好ましくはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのエピトープに特異的である抗体（複数可）、その抗原結合フラグメント（複数可）、または誘導体（複数可）に関する。抗体が特異的に結合している例示的なエピトープまたはペプチドは、本明細書において上記および下記に記載されている。
マーカー、例えば少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、添付の実施例に記載されるように質量分析（ＭＳ）に基づく分析によって決定され得る。そのような方法は、前記生物学的試料または例えば前記試料からのタンパク質消化物（例えばトリプシン消化物）中の例えばｐｒｏＡＤＭおよび／またはヒストンの１つ以上の修飾または未修飾フラグメントペプチドの存在、量または濃度を検出することを含み得る。クロマトグラフィー法を用いて試料を調製し、そして調製されそして場合により分離された試料をＭＳ分析にかける。例えば、特に少なくとも１つのヒストンペプチドの量を決定するために、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または並列反応モニタリング（ＰＲＭ）質量分析をＭＳ分析に使用することができる。本明細書において、「質量分析」または「ＭＳ」という用語は、化合物をそれらの質量によって同定するための分析技術を指す。質量分析の質量分解および質量決定能力を高めるために、試料は、ＭＳ分析の前に処理され得る。したがって、本発明は、免疫濃縮技術、試料調製に関する方法および／またはクロマトグラフィ法、好ましくは液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、より好ましくは高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）または超高速液体クロマトグラフィ（ＵＨＰＬＣ）と組み合わされ得るＭＳ検出法に関する。試料調製方法は、溶解、分画、ペプチドへの試料の消化、枯渇、濃縮、透析、脱塩、アルキル化、および／またはペプチド低減のための技術を含む。しかしながら、これらのステップは任意である。分析物イオンの選択的検出は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を用いて実施され得る。タンデム質量分析は、質量選択ステップ（本明細書で使用される場合、「質量選択」という用語は、特定のｍ／ｚまたは狭い範囲のｍ／ｚを有するイオンの単離を意味する）、続いて選択されたイオンの断片化、および得られた生成物（フラグメント）イオンの質量分析によって特徴付けられる。
当業者は、質量分析法によって試料中のマーカーのレベルをどのように定量化するかを知っている。例えば、相対定量化「ｒＳＲＭ」または絶対定量化を上記のように使用することができる。
本明細書中で使用される場合、本発明の文脈における「診断」は、対象における有害事象、特に死亡の認識および（早期）検出に関し、また鑑別診断も含み得る。有害事象の重症度の評価もまた、「診断」という用語によって包含され得る。例えば、状態がどれほど深刻であるか、および有害事象の発生の可能性がどれほどかの評価である。さらに、診断とは、対象における有害事象が発生したとき、例えば少なくとも約２８、７または３日以内に時間を予測することができることを意味する。
「予後」は、対象が、有害事象、特に死亡を経験する／有する／罹患する、帰結または特定のリスクの予測に関する。これはまた、前述の対象についての回復の見込みまたは有害な帰結の見込みの推定を含み得る。
本発明はまた、対象のモニタリング、治療ガイダンス、および／または治療制御のための方法およびキットに関し、方法は、
（ｉ）前述の対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することであって、少なくとも１つのヒストンの前述のレベルが、前述の対象の前述の有害事象の指標である、決定すること、および／または
（ｉｉ）前述の対象の試料中のプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、前述の対象の前述の有害事象の指標である、決定することを含む。
本発明の方法およびキットはまた、モニタリングに使用され得る。「モニタリング」は、既に診断された疾患または病状を追跡すること、例えば、疾患もしくは病状の進行または進行に対する特定の治療の影響を分析すること、および有害転帰、例えば、生命を脅かす健康状態もしくは死亡さえ予測することに関する。
本発明の文脈における「治療管理」という用語は、対象の治療的処置の監視および／または調整を指す。治療的処置の調整はまた、対象が以前に行われたようにさらに処置されるかどうか、または処置が適応されるかどうかの決定も含み得る。例えば、治療的処置の調整は、対象がＩＣＵまたはＥＤで維持されるかどうか、または対象が解放されるかどうかであり得る。
本発明において、用語「リスク評価」および「リスク層別化」は、さらなる予後に従って対象を異なるリスクグループに分類することに関する。リスク評価はまた、予防的および／または治療的措置を適用するための層別化にも関する。
本明細書で使用される場合、用語「治療ガイダンス」は、１つ以上のバイオマーカーの値および／または臨床パラメータおよび／または臨床スコアに基づく特定の療法または医学的介入の適用を指す。
本発明の方法は、部分的にコンピュータで実行され得る。例えば、検出されたマーカーのレベル、例えばｐｒｏＡＤＭレベルおよび／またはヒストンレベルを参照レベルと比較するステップは、コンピュータシステムにおいて実施され得る。コンピュータシステムでは、診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のための指標であるスコアを計算するために、決定されたマーカー（複数可）のレベルが、対象の他のマーカーレベルおよび／またはパラメータと組み合わされ得る。例えば、決定された値は、コンピュータシステムに入力されてもよい（医療従事者によって手動で、またはそれぞれのマーカーレベル（複数可）が決定された装置（複数可）から自動で、のいずれか）。コンピュータシステムは、直接ポイントオブケア（例えば、ＩＣＵもしくはＥＤ）にあってもよく、またはそれは、コンピュータネットワークを介して（例えばインターネットを介して）接続された遠隔地にあってもよい。典型的には、コンピュータシステムは、値（例えば、マーカーレベル、または年齢、血圧、体重、性別などのパラメータ）をコンピュータ可読媒体上に記憶し、事前定義および／または事前記憶された参照レベルまたは参照値に基づきスコアを計算する。得られたスコアは、ユーザ（通常は医師などの医療従事者）のために表示および／または印刷される。あるいは、または加えて、関連する予後診断、診断、評価、または層別化は、ユーザ（典型的には医師などの医療従事者）のために表示および／または印刷される。
したがって、本発明は、さらなる態様において、対象における有害事象の診断、予後予測、リスク評価、および／またはリスク層別化のためのシステムに関し、
（ｉ）対象の試料中のｐｒｏＡＤＭおよび／またはヒストンのレベル（ならびに任意にさらなるマーカーレベル）を決定するための試料分析器と、
（ｉｉ）典型的には決定されたレベル（複数可）と参照レベル（複数可）との比較に基づき、対象における有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化を計算するようにプログラムされたコンピュータサブシステムと、を備える。
コンピュータサブシステムは、検出されたマーカーレベル（複数可）を、本明細書に記載されるようなさらなるレベル（複数可）および／またはパラメータ（複数可）と組み合わせ得る。装置の出力は、スコアであってもよいか、または直接的に対象における有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／もしくはリスク層別化であってもよい。
関連する態様では、本発明は、コンピュータ上で実行するときに、対象の試料中のｐｒｏＡＤＭおよび／またはヒストンの決定されたレベルに基づき、対象における有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化を決定することを含むステップを実施する、コンピュータ可読媒体で具体化されるコンピュータプログラム製品に関する。典型的には、このステップは、本明細書に記載されるように、決定されたレベル（複数可）と参照レベル（複数可）との比較に基づく。
本発明はさらに、キット、キットの使用、およびそのようなキットが使用される方法に関する。本発明は、本明細書の上記および下記に提供される方法を実施するためのキットに関する。本明細書に提供される定義、例えば方法に関して提供される定義はまた、本発明のキットにも適用される。特に、本発明は、診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のためのキットに関し、前述のキットは、
（ｉ）前述の対象の前述の試料中の少なくとも１つのヒストンの前述のレベルを決定するための検出試薬、および
少なくとも１つのヒストンの前述の参照レベルを含む参照データであって、少なくとも１つのヒストンの前述の参照レベルと比較したときの前述の対象の前述の試料中の前述の少なくとも１つのヒストンの増加したレベルが、前述の対象の有害事象の指標である、検出試薬および参照データ、ならびに／または
（ｉｉ）前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルを決定するための検出試薬、および
ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルを含む参照データであって、
ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルと比較したときの前述の対象の前述のｐｒｏＡＤＭの増加したレベルが、前述の対象における前述の有害事象の指標である、検出試薬および参照データを含む。
さらに、本発明は、好ましくは、本発明の方法を実行するためのキットおよびその使用に関し、前述のキットは、前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルを決定するための検出試薬と、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルを含む参照データとを含み、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルと比較したときの前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭのレベルの増加は、前述の対象の有害事象の指標である。
さらに、本発明は、好ましくは、本発明の方法を実行するためのキットおよびその使用に関し、前述のキットは、前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルを決定するための検出試薬と、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルを含む参照データとを含み、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルと比較したときの前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭのレベルの減少またはｐｒｏＡＤＭの同等のレベルは、前述の対象の有害事象が約２８日以内に起こらないことを示す。
本発明はまた、対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のためのキット、およびそれらにおけるその使用キットに関し、
（ｉ）少なくとも１つのヒストンのレベルは、対象の試料中で決定され、
少なくとも１つのヒストンのレベルは、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され、
前述の対象の有害事象は、試料中で決定された少なくとも１つのヒストンのレベルと少なくとも１つのヒストンの参照レベルとの比較に基づき特定され、かつ／または
（ｉｉ）ｐｒｏＡＤＭのレベルは、対象の試料中で決定され、
ｐｒｏＡＤＭのレベルは、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、
対象の有害事象は、試料中で決定されたｐｒｏＡＤＭのレベルとｐｒｏＡＤＭの参照レベルとの比較に基づき特定される。
本発明はまた、対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のためのキットおよびその使用に関し、
（ｉ）キットは、対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルを決定するための検出試薬を含み、
少なくとも１つのヒストンのレベルは、前述の対象の有害事象の指標であり、かつ／または
（ｉｉ）キットは、対象の試料中のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルを決定するための検出試薬を含み、
前述のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルは、前述の対象の前述の有害事象の指標である。
本明細書で使用される場合、「参照データ」は、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、特にＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの参照レベルを含む。対象の試料中の少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルは、キットの参照データに含まれる参照レベルと比較され得る。決定されたマーカーのレベルの増加は有害事象、特に死亡の指標である。決定されたマーカー（複数可）の減少したレベルまたは同等のレベルは、有害事象、特に死亡が起こらないことを示す。参照レベルは本明細書において上記に記載されている。参照データはまた、少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルが比較される参照試料を含み得る。参照データはまた、本発明のキットの使用方法の取扱説明書を含み得る。
本明細書中で使用される場合、「検出試薬」などは、本明細書中に記載されるマーカー（例えば、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭ）を決定するために適切な試薬である。そのような例示的な検出試薬は、例えば、本明細書に記載のマーカーのペプチドまたはエピトープに特異的に結合するリガンド、例えば抗体またはそのフラグメントである。そのようなリガンドは、上記のようにイムノアッセイにおいて使用され得る。マーカー（複数可）のレベルを決定するためにイムノアッセイで用いられるさらなる試薬もキットに含まれ得、本明細書において検出試薬と見なされる。検出試薬はまた、ＭＳに基づく方法によってマーカーまたはそのフラグメントを検出するために使用される試薬にも関連し得る。したがって、そのような検出試薬はまた、ＭＳ分析のために試料を調製するために使用される試薬、例えば酵素、化学物質、緩衝剤などであり得る。質量分析計も検出試薬と見なすことができる。本発明による検出試薬はまた、例えば、マーカーのレベルを決定および比較するために使用され得る較正溶液であり得る。
与えられた定義および説明は、必要な変更を加えて以下の項目にも当てはまる。本発明はまた、特定の実施形態における以下の事項に関する。
１．対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のための方法であって、前述の方法は、
（ｉ）前述の対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することであって、少なくとも１つのヒストンの前述のレベルが、前述の対象の前述の有害事象の指標である、決定すること、および／または
（ｉｉ）前述の対象の試料中のプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、前述の対象の前述の有害事象の指標である、決定することを含む、方法。
２．前述の有害事象が２８日以内に起こるか、または前述の有害事象が２８日以内に起こらない、項目１に記載の方法。
３．
（ｉ１）少なくとも１つのヒストンの前述のレベルは、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され、かつ／または
（ｉｉ１）ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルは、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、かつ
（ｉｉｉ）前述の対象の前述の有害事象は、それぞれステップ（ｉ１）および／または（ｉｉ１）の比較に基づき特定される、項目１または２に記載の方法。
４．
（ｉ）少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較したときの少なくとも１つのヒストンのレベルの増加は、前述の対象の前述の有害事象の指標であり、かつ／または
（ｉｉ）ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときのｐｒｏＡＤＭのレベルの増加は、前述の対象の前述の有害事象の指標であり、好ましくは、前述の有害事象が約２８日以内に起こるか、または
前述のｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルと比較したときの前述の対象の前述のｐｒｏＡＤＭのレベルの減少、またはより低いレベルもしくは同等のレベルは、有害事象が好ましくは約２８日以内に起こらないことの指標である、項目１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５．前述の有害事象が、死亡、臓器機能不全、多臓器機能不全、および感染症などの疾患または医学的障害からなる群から選択される、項目１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．前述の有害事象が、死亡である、項目１〜５のいずれか１つに記載の方法。
７．ｐｒｏＡＤＭの参照レベルが、約０．９ｎｍｏｌ／Ｌ〜約１．８ｎｍｏｌ／Ｌである、項目３〜６のいずれか１つに記載の方法。
８．
（ｉ）前述の少なくとも１つのヒストンの増加したレベルは、少なくとも１つのヒストンの参照レベルの約２倍高く、かつ／または
（ｉｉ）前述のｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルの約２倍高い、項目１〜７のいずれか１つに記載の方法。
９．少なくとも１つのヒストンの前述の参照レベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭの参照レベルが、少なくとも１つの参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルである、項目３〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０．参照対象（複数可）は、健康な対象（複数可）および／または有害事象を有していない対象（複数可）である、項目３〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．少なくとも１つのヒストンの前述の参照レベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭの参照レベルが、前述の対象の前の分析から得られた少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルである、項目３〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前述のｐｒｏＡＤＭが、中間領域プロアドレノメジュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）である、項目１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．前述の対象のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、２８日以内に起こる前述の対象の前述の有害事象、好ましくは死亡の指標である、項目１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．前述の対象のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、７日以内に起こる前述の対象の前述の有害事象、好ましくは死亡の指標である、項目１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１５．前述の少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ３、および／またはヒストンＨ４である、項目１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．前述の少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ２Ｂである、項目１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．前述の対象の少なくとも１つのヒストンの前述のレベルが、７日以内または３日以内に起こる前述の対象の前述の有害事象、好ましくは死亡の指標である、項目１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．前述の方法が、前述の試料中の乳酸塩のレベル、少なくとも１つのヒストンのレベル、前述の試料中のアルドラーゼＢのレベル、前述の試料中のコペプチンのレベル、前述の試料中の乳酸塩のレベル、前述の試料中のプロカルシトニン（ＰＣＴ）のレベル、前述の対象の逐次臓器不全評価スコア（ＳＯＦＡスコア）、単純化急性生理学スコア（ＳＡＰＳＩＩスコア）、前述の対象の急性生理学および慢性健康評価ＩＩ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコア、ならびに前述の試料中の可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１（ｓＦｌｔ−１）のレベルからなる群から選択される、前述の対象の少なくとも１つのマーカーおよび／またはパラメータを決定することをさらに含む、項目１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．さらに、前述の対象の逐次臓器不全評価スコア（ＳＯＦＡスコア）が決定される、項目１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．
対象のＳＯＦＡスコアが６以下である場合、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約１．８ｎｍｏｌ／Ｌであるか、
対象のＳＯＦＡスコアが７〜１２である場合、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約３．２ｎｍｏｌ／Ｌであるか、または
対象のＳＯＦＡスコアが１３以上である場合、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約５．５ｎｍｏｌ／Ｌである、項目３〜１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．
約１．８ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの減少もしくは同等のレベル、および前述の対象の６以下のＳＯＦＡスコアは、前述の有害事象が起こらないことの指標であるか、
約３．２ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの減少もしくは同等のレベル、および前述の対象の７〜１２のＳＯＦＡスコアは、前述の有害事象が起こらないことの指標であるか、または
約５．６ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの減少もしくは同等のレベル、および前述の対象の１３以上のＳＯＦＡスコアは、前述の有害事象が起こらないことの指標であり、
好ましくは、前述の有害事象が約２８日以内に起こらない、項目１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．
約１．８ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの増加、および前述の対象の６以下のＳＯＦＡスコアは、前述の対象の前述の有害事象の指標であるか、
約３．２ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの増加、および前述の対象の７〜１２のＳＯＦＡスコアは、前述の対象の前述の有害事象の指標であるか、または
約５．６ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの増加、および前述の対象の１３以上のＳＯＦＡスコアは、前述の対象の前述の有害事象の指標であり、
好ましくは、前述の有害事象が約２８日以内に起こる、項目１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２３．前述の対象のＳＯＦＡスコアが、前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルに基づき増加し、前述の修正ＳＯＦＡスコアが、前述の有害事象の指標である、項目１９〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２４．対象のＳＯＦＡスコアは、対象が約１．８ｎｍｏｌ／Ｌよりも高いｐｒｏＡＤＭレベルを有する場合に１増加する、項目２３に記載の方法。
２５．前述の方法が、前述の対象の前述の試料中の少なくとも１つのヒストンの前述のレベルおよびｐｒｏＡＤＭの前述のレベルを決定することを含む、項目１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．少なくとも１つのヒストンの前述のレベルおよびｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、２８日以内に起こる前述の対象の前述の有害事象、特に死亡の指標である、項目２５に記載の方法。
２７．前述の方法が、前述の対象の前述の試料中の少なくとも１つのヒストンの前述のレベルおよび前述の対象の前述のＳＡＰＳＩＩスコアを決定することを含む、項目１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．少なくとも１つのヒストンの前述のレベルおよび前述ＳＡＰＳＩＩスコアが、２８日以内に起こる前述の対象の前述の有害事象、特に死亡の指標である、項目２７に記載の方法。
２９．前述の方法が、前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルおよび前述の対象の前述のＳＡＰＳＩＩスコアを決定することを含む、項目１〜２８にいずれか１つに記載の方法。
３０．ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルおよび前述のＳＡＰＳＩＩスコアが、２８日以内または７日以内に起こる前述の対象の前述の有害事象、特に死亡の指標である、項目２９に記載の方法。
３１．前述の方法が、前述の対象のｐｒｏＡＤＭの前述のレベル、前述のＳＯＦＡスコア、および乳酸塩の前述のレベルを決定することを含む、項目１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．前述の対象が、疾患または病状を患っている、項目１〜３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．前述の対象が、重篤な患者であり、前述の対象が、集中治療室に入院する、項目１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．前述の対象が、疾患または病状を患っており、前述の疾患または病状が、呼吸器疾患、尿路感染症、感染性および非感染性の病因に関連した炎症反応、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック、臓器不全（複数可）、心血管疾患、糖尿病、悪性腫瘍、肝疾患、腎疾患、免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、グラム陰性細菌感染症、グラム陽性細菌感染症、ならびに免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）からなる群から選択される、項目１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．前記対象が、敗血症を患っている、項目１〜３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．前述の対象が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を患っている対象、放射線治療を受けている対象、および／または免疫抑制薬を受けている対象などの免疫抑制対象である、項目１〜３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．前述の対象が、呼吸器疾患、好ましくは下気道の感染症を患っている、項目１〜３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．前述の呼吸器疾患を患っている前述の対象の前述の試料中の少なくとも１つのヒストンの前述のレベルが、７日以内に起こる死亡の指標である、項目３７に記載の方法。
３９．前述の対象が、尿路感染症を患っている、項目１〜３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．前述の尿路感染症を患っている前述の対象の前述の試料中の少なくとも１つのヒストンの前述のレベルが、２８日以内に起こる死亡の指標である、項目３９に記載の方法。
４１．前述の対象が、悪性腫瘍を患っている、項目１〜４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．前述の悪性腫瘍を患っている前述の対象の前述の試料中の少なくとも１つのヒストンの前述のレベルが、７日以内に起こる死亡の指標である、項目４１に記載の方法。
４３．マーカーまたはパラメータのレベルが、前述の対象の入院から約１２時間の間に決定される、項目１〜４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．前述の試料が、体液、血液、血漿、血清、または尿である、項目１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、質量分析法（ＭＳ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光および蛍光イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、発光ベースのビーズアレイ、磁気ビーズベースのアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、迅速試験フォーマット、ならびに希土類クリプテートアッセイからなる群から選択される方法を使用して決定される、項目１〜４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．方法が、イムノアッセイであり、アッセイは、均一相または不均一相中で実施される、項目４５に記載の方法。
４７．方法が、
ａ）試料を
（ｉ）ヒストンまたはｐｒｏＡＤＭの第１のエピトープに特異的な第１の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と、かつ
（ｉｉ）ヒストンまたはｐｒｏＡＤＭの第２のエピトープに特異的な第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と、接触させるステップと、
ｂ）第１および第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の、前述の第１のヒストンまたはｐｒｏＡＤＭへの結合を検出するステップと、を含む、イムノアッセイである、項目４５または４６に記載の方法。
４８．前述の第１または第２の抗体のうちの一方が標識され、他方の抗体が固相に結合されるか、または固相に選択的に結合されることが可能である、項目４７に記載の方法。
４９．第１の抗体および第２の抗体が、液体反応混合物中に分散して存在し、蛍光または化学発光消光または増幅に基づく標識系の一部である第１の標識成分が、第１の抗体に結合され、前述の標識系の第２の標識成分が、第２の抗体に結合され、これにより、検出されるべき両方の抗体の前述の少なくとも１つのヒストンまたは前述のｐｒｏＡＤＭへの結合後、測定溶液中の得られたサンドイッチ錯体の検出を可能にする測定可能なシグナルが発生する、項目４７または４８に記載の方法。
５０．標識系が、希土類クリプテートまたはキレートを、特にシアニンタイプの蛍光または化学発光染料と組み合わせて含む、項目４９に記載の方法。
５１．ＭＳ分析法が、反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、または並列反応モニタリング（ＰＲＭ）である、項目４５に記載の方法。
５２．前述の少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ４であり、配列番号１によるヒストンＨ４のアミノ酸残基２２〜１０２に及ぶ配列の少なくともペプチドが決定される、項目１〜５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．前述の少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ４であり、配列番号１の残基４７〜５９、配列番号１の残基６８〜７９、配列番号１の残基６０〜６７、配列番号１の残基２２〜３０、配列番号１の残基６７〜７８、配列番号１の残基９２〜１０２、配列番号１の残基２２〜３４、配列番号１の残基４６〜１０２、配列番号１の残基４６〜５５、配列番号１の残基８０〜９１、配列番号１の残基２４〜３５、および配列番号１の残基６８〜７７に及ぶアミノ酸配列からなる群から選択される配列の少なくともペプチドが決定される、項目１〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．前述の少なくとも２つのヒストンが、ヒストンＨ２Ａであり、配列番号１によるヒストンＨ２Ａのアミノ酸残基２０〜１１８に及ぶ配列の少なくともペプチドが決定される、項目１〜５１のいずれか１つに記載の方法。
５５．前述の少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ２Ａであり、配列番号２の残基２１〜５３、配列番号２の残基２１〜２９、配列番号２の残基３０〜５３、配列番号２の残基１２０〜１２９、配列番号２の残基２１〜２９、配列番号２の残基８２〜８８、配列番号２の残基８９〜９５、および配列番号２の残基１００〜１１８に及ぶアミノ酸配列からなる群から選択される配列の少なくともペプチドが決定される、項目１〜５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．前述の少なくとも３つのヒストンが、ヒストンＨ３であり、配列番号１によるヒストンＨ３のアミノ酸残基２７〜６２に及ぶ配列の少なくともペプチドが決定される、項目１〜５１のいずれか１つに記載の方法。
５７．前述の少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ３であり、配列番号３のアミノ酸残基２７〜３７に、かつ／または配列番号３のアミノ酸残基５２〜６２に及ぶ配列の少なくともペプチドが決定される、項目１〜５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．前述の少なくとも４つのヒストンが、ヒストンＨ２Ｂであり、配列番号１によるヒストンＨ２Ｂのアミノ酸残基４１〜６９に及ぶ配列の少なくともペプチドが決定される、項目１〜５１のいずれか１つに記載の方法。
５９．前述の少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ２Ａであり、配列番号７、８、９、および１０からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドまたはそのフラグメントが決定される、項目１〜５９のいずれか１つに記載の方法。
６０．前述の少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ４であり、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、および１６からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドまたはそのフラグメントが決定される、項目１〜５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．項目１〜６０のいずれか１つに記載の方法を実行するためのキットであって、前述のキットが、
（ｉ）前述の対象の前述の試料中の少なくとも１つのヒストンの前述のレベルを決定するための検出試薬、および
少なくとも１つのヒストンの前述の参照レベルを含む参照データであって、少なくとも１つのヒストンの前述の参照レベルと比較したときの前述の対象の前述の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルの増加が、前述の対象の有害事象の指標である、検出試薬および参照データ、ならびに／または
（ｉｉ）前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルを決定するための検出試薬、および
ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルを含む参照データであって、
ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルと比較したときの前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭのレベルの増加が、前述の対象における前述の有害事象の指標である、検出試薬および参照データを含む、キット。
６２．項目１〜２９のいずれか１つに記載の方法を実行するためのキットであって、前述のキットが、前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルを決定するための検出試薬と、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルを含む参照データとを含み、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルと比較したときの前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭのレベルの減少またはｐｒｏＡＤＭの同等のレベルは、前述の対象の有害事象が好ましくは約２８日以内に起こらないことの指標である、キット。
６３．項目１〜６０のいずれか１つに記載の方法における項目６１または６２に記載のキットの使用。
６４．対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のための項目６３に記載のキットの使用であって、
（ｉ）少なくとも１つのヒストンの前述のレベルは、前述の対象の前述の試料中で決定され、
前述の少なくとも１つのヒストンの前述のレベルは、少なくとも１つのヒストンの前述の参照レベルと比較され、
前述の対象の前述の有害事象は、前述の試料中で決定された少なくとも１つのヒストンの前述のレベルと少なくとも１つのヒストンの前述の参照レベルとの比較に基づき特定され、かつ／または
（ｉｉ）ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルは、前述の対象の前述の試料中で決定され、
ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルは、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルと比較され、
前述の対象の前述の有害事象は、前述の試料中で決定されたｐｒｏＡＤＭの前述のレベルとｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルとの比較に基づき特定される、使用。
６５．対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のためのキットの使用であって、
（ｉ）前述のキットは、対象の試料中の少なくとも１つのヒストンのレベルを決定するための検出試薬を含み、
少なくとも１つのヒストンの前述のレベルは、前述の対象の前述の有害事象の指標であり、かつ／または
（ｉｉ）前述のキットは、対象の試料中のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルを決定するための検出試薬を含み、
前述のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルは、前述の対象の前述の有害事象の指標である、使用。
本発明はまた、好ましい実施形態における以下の項目に関する。
１．対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のための方法であって、前述の方法が、
前述の対象の試料中のプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することを含み、ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、前述の対象の前述の有害事象の指標である、方法。
２．
ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、
前述の対象の前述の有害事象が、比較に基づき特定される、項目１に記載の方法。
３．
前述のｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルと比較したときの前述の対象の前述のｐｒｏＡＤＭのレベルの減少、またはより低いレベルもしくは同等のレベルは、有害事象が好ましくは約２８日以内に起こらないことの指標であるか、あるいは
ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの、ｐｒｏＡＤＭのレベルの増加またはｐｒｏＡＤＭのより高いレベルは、前述の対象の前述の有害事象の指標であり、好ましくは、前述の有害事象が約２８日以内に起こる、項目１または２に記載の方法。
４．ｐｒｏＡＤＭの参照レベルが、約０．７ｎｍｏｌ／Ｌ〜約２．０ｎｍｏｌ／Ｌ、好ましくは約０．８ｎｍｏｌ／Ｌ〜約１．９ｎｍｏｌ／Ｌである、項目１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５．前述の有害事象が、死亡である、項目１〜５のいずれか１つに記載の方法。
６．約０．９ｎｍｏｌ／Ｌを超える、好ましくは約１．９ｎｍｏｌ／Ｌを超える、より好ましくは約２．０ｎｍｏｌ／Ｌを超えるｐｒｏＡＤＭのレベルが、約２８日以内の対象の非生存の指標である、項目５に記載の方法。
７．約１．０ｎｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは約０．９ｎｍｏｌ／Ｌ未満、最も好ましくは約０．８８ｎｍｏｌ／Ｌ未満のｐｒｏＡＤＭのレベルが、対象が約２８日以内に生存することの指標である、項目１または２に記載の方法。
８．さらに、前述の対象の逐次臓器不全評価スコア（ＳＯＦＡスコア）が決定される、項目１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
９．
ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、６以上のＳＯＦＡスコアに対応する症状を有する対象について約１．８ｎｍｏｌ／Ｌであるか、
ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、７〜１２のＳＯＦＡスコアに対応する症状を有する対象について約３．２ｎｍｏｌ／Ｌであるか、または
ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、１３以上のＳＯＦＡスコアに対応する症状を有する対象について約５．５ｎｍｏｌ／Ｌである、項目２〜５のいずれか１つに記載の方法。
１０．
約１．８ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの減少もしくは同等のレベル、および前述の対象の６以下のＳＯＦＡスコアは、前述の有害事象が起こらないことの指標であるか、
約３．２ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの減少もしくは同等のレベル、および前述の対象の７〜１２のＳＯＦＡスコアは、前述の有害事象が起こらないことの指標であるか、または
約５．６ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの減少もしくは同等のレベル、および前述の対象の１３以上のＳＯＦＡスコアは、前述の有害事象が起こらないことの指標であり、
好ましくは、前述の有害事象が約２８日以内に起こらない、項目１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
１１．
約１．８ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの増加、および前述の対象の６以下のＳＯＦＡスコアは、前述の対象の前述の有害事象の指標であるか、
約３．２ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの増加、および前述の対象の７〜１２のＳＯＦＡスコアは、前述の対象の前述の有害事象の指標であるか、または
約５．６ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較したときの前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの増加、および前述の対象の１３以上のＳＯＦＡスコアは、前述の対象の前述の有害事象の指標であり、
好ましくは、前述の有害事象が約２８日以内に起こる、項目１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前述の対象のＳＯＦＡスコアが、前述の対象のｐｒｏＡＤＭのレベルに基づき増加し、前述の修正ＳＯＦＡスコアが、前述の有害事象の指標である、項目１９〜２３のいずれか１つに記載の方法。
１３．対象のＳＯＦＡスコアは、対象が約１．８ｎｍｏｌ／Ｌよりも高いｐｒｏＡＤＭレベルを有する場合に１増加する、項目１２に記載の方法。
１４．前述のｐｒｏＡＤＭのレベルの増加は、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルの約２倍高い、項目３〜５および９〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．前述のｐｒｏＡＤＭが、中間領域プロアドレノメジュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）または成熟ＡＤＭである、項目１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．前述の対象のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、２８日以内に起こる前述の対象の前述の有害事象、好ましくは死亡の指標である、項目１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１７．前述の方法が、少なくとも１つのヒストンのレベル、前述の試料中のプロカルシトニン（ＰＣＴ）のレベル、単純化急性生理学スコア（ＳＡＰＳＩＩスコア）、前述の対象の急性生理学および慢性健康評価ＩＩ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコア、前述の対象の肺炎重症度指数（ＰＳＩ）スコア、および前述の対象のＣＵＲＢ−６５スコアからなる群から選択される、前述の対象の少なくとも１つのマーカーおよび／またはパラメータを決定することをさらに含む、項目１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．マーカーまたはパラメータのレベルが、前述の対象の入院から約１２時間の間に決定される、項目１７に記載の方法。
１９．ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、前述の対象の入院から約１２時間の間に決定される、項目１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．前述の方法が、前述の対象のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルおよびＳＯＦＡスコアを決定することを含む、項目１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．前述の対象が、疾患または病状を患っている、項目１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．前述の対象が、重篤な患者であり、好ましくは前述の対象が、集中治療室または救急科に入院し、好ましくは前述の対象が、集中治療室に入院する、項目１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．前述の対象が、疾患または病状を患っており、前述の疾患または病状が、呼吸器疾患、尿路感染症、感染性および非感染性の病因に関連した炎症反応、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック、臓器不全（複数可）、心血管疾患、糖尿病、悪性腫瘍、肝疾患、腎疾患、免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、グラム陰性細菌感染症、グラム陽性細菌感染症、ならびに免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）からなる群から選択される、項目１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記対象が、敗血症を患っている、項目１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．前述の対象が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を患っている対象、放射線治療を受けている対象、および／または免疫抑制薬を受けている対象などの免疫抑制対象である、項目１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．前述の試料が、体液、血液、血漿、血清、または尿である、項目１〜２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、質量分析法（ＭＳ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光および蛍光イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、発光ベースのビーズアレイ、磁気ビーズベースのアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、迅速試験フォーマット、ならびに希土類クリプテートアッセイからなる群から選択される方法を使用して決定される、項目１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．方法が、イムノアッセイであり、アッセイは、均一相または不均一相中で実施される、項目２７に記載の方法。
２９．方法が、
ａ）試料を
（ｉ）はｐｒｏＡＤＭの第１のエピトープに特異的な第１の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と、かつ
（ｉｉ）ｐｒｏＡＤＭの第２のエピトープに特異的な第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と接触させるステップと、
ｂ）第１および第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の、ｐｒｏＡＤＭへの結合を検出するステップと、を含む、イムノアッセイである、項目２８に記載の方法。
３０．前述の第１または第２の抗体のうちの一方が標識され、他方の抗体が固相に結合されるか、または固相に選択的に結合されることが可能である、項目２９に記載の方法。
３１．第１の抗体および第２の抗体が、液体反応混合物中に分散して存在し、蛍光または化学発光消光または増幅に基づく標識系の一部である第１の標識成分が、第１の抗体に結合され、前述の標識系の第２の標識成分が、第２の抗体に結合され、これにより、検出されるべき両方の抗体の前述のｐｒｏＡＤＭへの結合後、測定溶液中の得られたサンドイッチ錯体の検出を可能にする測定可能なシグナルが発生する、項目２９または３０に記載の方法。
３２．標識系が、希土類クリプテートまたはキレートを、特にシアニンタイプの蛍光または化学発光染料と組み合わせて含む、項目３１に記載の方法。
３３．項目１〜３２のいずれか１つに記載の方法を実行するためのキットであって、前述のキットが、前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルを決定するための検出試薬と、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルを含む参照データとを含み、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルと比較したときの前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭのレベルの増加が、前述の対象の有害事象の指標である、キット。
３４．項目１〜３２のいずれか１つに記載の方法を実行するためのキットであって、前述のキットが、前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルを決定するための検出試薬と、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルを含む参照データとを含み、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルと比較したときの前述の対象の前述の試料中のｐｒｏＡＤＭのレベルの減少またはｐｒｏＡＤＭの同等のレベルは、前述の対象の有害事象が約２８日以内に起こらないことの指標である、キット。
３５．項目１〜２９のいずれか１つに記載の方法における項目３３または３４に記載のキットの使用。
３６．対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のための項目３３または３４に記載のキットの使用であって、
ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルは、前述の対象の前述の試料中で決定され、
ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルは、ｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルと比較され、
前述の対象の前述の有害事象は、前述の試料中で決定されたｐｒｏＡＤＭの前述のレベルとｐｒｏＡＤＭの前述の参照レベルとの比較に基づき特定される、使用。
３７．対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のためのキットの使用であって、
前述のキットは、対象の試料中のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルを決定するための検出試薬を含み、
前述のｐｒｏＡＤＭの前述のレベルは、前述の対象の前述の有害事象の指標である、使用。
３８．前述の比較が、コンピュータシステムで実施される、項目２〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３９．決定されたｐｒｏＡＤＭの値が、対象における有害事象の前述の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化の指標であるスコアの計算に使用される、項目１〜３２に記載の方法。
４０．加えて、対象の少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメータが、前述のスコアの計算に使用される、項目４０に記載の方法。
４１．前述の対象の少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメータが、少なくとも１つのヒストンのレベル、前述の試料中のプロカルシトニン（ＰＣＴ）のレベル、単純化急性生理学スコア（ＳＡＰＳＩＩスコア）、前述の対象の急性生理学および慢性健康評価ＩＩ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコア、前述の対象の肺炎重症度指数（ＰＳＩ）スコア、および前述の対象のＣＵＲＢ−６５スコアからなる群から選択される、項目４０に記載の方法。
本明細書で使用される場合、「備える」および「含む」という用語またはその文法的変化形は、少なくとも述べられた特徴、整数、ステップ、または構成要素を特定するものとして解釈されるべきであるが、１つの以上の追加の特徴、整数、ステップ、構成要素、またはその群の追加を除外するものではない。この用語は、記載された特徴、整数、ステップ、または追加の特徴を除外したステップまたは構成要素のみを特定すると理解される用語「からなる」および「から本質的になる」を包含する。
したがって、「含む」／「含む」／「有する」という用語は、任意のさらなる構成要素（または同様に特徴、整数、ステップなど）が存在し得ることを意味する。
「からなる」という用語は、さらなる構成要素（または同様の特徴、整数、ステップなど）が存在しないことを意味する。
「から本質的になる」という用語またはその文法的変化形は、本明細書で使用される場合、述べられた特徴、整数、ステップ、または構成要素を特定するものと解釈されるべきであるが、１つ以上の追加の特徴、整数、ステップ、構成要素、またはその群の追加を除外しないが、それらの追加の特徴、整数、ステップ、構成要素、またはその群が、請求されている組成物、装置、または方法の基本的で新規な特徴を実質的に変化させない場合のみである。
したがって、「から本質的になる」という用語は、特定のさらなる成分（または同様に特徴、整数、工程など）が存在し得ること、すなわち組成物、デバイスまたは方法の本質的な特徴に実質的に影響を及ぼさないものを意味する。言い換えれば、「から本質的になる」という用語（本明細書では「実質的に含む」という用語と互換的に使用することができる）は、必須の構成要素（または同様の特徴）に加えて組成物、装置または方法における他の構成要素の存在を可能にする。ただし、装置または方法の本質的な特徴は他の構成要素の存在によって実質的に影響されない。
「方法」という用語は、所与のタスクを達成するための方法、手段、技術および手順を指し、これらに限定されないが、既知の方法、手段、技法および手順から容易に開発される方法、手段、技法および手順を含む。化学、生物学および生物物理学的分野の専門家による。
「約」という用語は、好ましくは指示された数値の±１０％、より好ましくは指示された数値の±５％、そして特に指示された正確な数値を指す。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、示された数値の±１０％、具体的には、示された数値の±５％を指す。「約」という用語が使用されるときはいつでも、示された正確な数値への具体的な言及も含まれる。「約」という用語が、所与の核酸中のヌクレオチドの数などの整数で定量化されるパラメータと関連して使用される場合、示された数値の±１０％または±５％に対応する数は、最も近い整数に四捨五入される。例えば、表現「約２５アミノ酸」は、２３〜２８アミノ酸の範囲、特に２４〜２６アミノ酸の範囲を指し、そして好ましくは２５アミノ酸の具体的な値を指す。
診断試験および／または予後試験の感度および特異性は、試験の分析の「品質」だけに依存するのではなく、それらはまた、異常な結果を構成するものの定義にも依存する。実際には、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）は、典型的には、「正常」（すなわち、出生前障害または状態を有さない明らかに健康な個人）および「疾患」集団、例えば、有害事象、例えば、死亡を経験している／有している／患っている対象において、変数対その相対頻度の値をプロットすることによって計算される。（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのような）いずれかの特定のマーカーについて、疾患／状態のあるなしにかかわらず対象についてのマーカーレベルの分布はおそらく重複するであろう。そのような条件下では、試験は、正常と疾患を１００％の精度で完全に区別することはなく、重複の領域は、試験が正常と疾患を区別できない場所を示している可能性がある。それより下では試験は異常であると考えられ、それより上では試験は正常であると考えられ、またはそれを下回るまたは上回ると特定の条件、例えば異常事象を示す閾値が選択される。ＲＯＣ曲線の下の面積は、知覚された測定値が状態の正しい識別を可能にするであろう確率の尺度である。試験結果が必ずしも正確な数を与えない場合でも、ＲＯＣ曲線が使用され得る。結果をランク付けできる限り、ＲＯＣ曲線を作成することができる。例えば、「疾患」試料（または有害事象）に関する試験の結果は、程度に応じてランク付けされ得る（例えば、１＝低い、２＝正常、および３＝高い）。このランク付けは、「正常な」集団の結果と相関し得、ＲＯＣ曲線が作成され得る。これらの方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｈａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．１９８２．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ １４３：２９−３６を参照されたい。好ましくは、閾値は、約０．５より大きい、より好ましくは約０．７より大きい、さらにより好ましくは約０．８より大きい、さらにより好ましくは約０．８５より大きい、最も好ましくは約０．９より大きいＲＯＣ曲線面積を提供するように選択される。この文脈における「約」という用語は、所与の測定値の＋／−５％を指す。
ＲＯＣ曲線の横軸は（１−特異性）を表し、これは偽陽性の割合と共に増加する。曲線の縦軸は、感度を表し、これは真陽性率と共に増加する。したがって、選択された特定のカットオフについて、（１−特異性）の値が決定され得、対応する感度が得られ得る。ＲＯＣ曲線下の面積は、測定されたマーカーレベルが有害事象、特に死亡の正確な特定を可能にするであろう確率の尺度である。したがって、ＲＯＣ曲線下面積は試験の有効性を決定するために使用することができる。
他の実施形態では、陽性尤度比、陰性尤度比、オッズ比、またはハザード比は、リスクを予測するか、または障害もしくは状態（有害転帰）、すなわち、「罹患群」を診断する試験の能力の尺度として使用される。陽性尤度比の場合、１の値は、陽性の結果が「罹患」群と「対照」群の両方の対象間で等しく起こり得ることを示し、１より大きい値は、陽性の結果が罹患群においてより起こり得ることを示し、１未満の値は、陽性の結果が対照群においてより起こり得ることを示す。陰性尤度比の場合、１の値は、陰性の結果が「罹患」群と「対照」群の両方の対象間で等しく起こり得ることを示し、１より大きい値は、陰性の結果が試験群においてより起こり得ることを示し、１未満の値は、陰性の結果が対照群においてより起こり得ることを示す。
オッズ比の場合、１の値は、陽性の結果が「罹患」群と「対照」群の両方の対象間で等しく起こり得ることを示し、１より大きい値は、陽性の結果が罹患群においてより起こり得ることを示し、１未満の値は、陽性の結果が対照群においてより起こり得ることを示す。
ハザード比の場合、１の値は、エンドポイントの相対リスク（例えば、死亡）が「罹患」群と「対照」群の両方において等しいことを示し、１より大きい値は、リスクが罹患群においてより大きいことを示し、１未満の値は、リスクが対照群において大きいことを示す。
診断指標または予後指標と、診断または将来の臨床転帰の予後リスクとの関連付けは統計分析であることを当業者は理解するであろう。例えば、Ｘより低いマーカーレベルは、患者が、統計的有意性のレベルによって決定されるように、Ｘ以上のレベルを有する患者よりも有害事象／転帰を患う可能性が高いことを示し得る。加えて、ベースラインレベルからのマーカー濃度の変化は、患者の予後診断を反映するものであり得、マーカーレベルの変化の程度は、有害事象の重症度に関連し得る。統計的有意性は、多くの場合、２つ以上の集団を比較し、信頼区間および／またはｐ値を決定することによって決定され、例えば、Ｄｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３を参照されたい。好ましいｐ値であるが、本発明の好ましい信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％および９９．９９％である０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００１。
別途記載のない限り、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１））に記載されるように、確立された組換え遺伝子技術の方法を使用した。
本発明は、以下の非限定的な図面を参照することによってさらに説明される。
２８日目の死亡予測のためのカプラン・マイヤー分析 ２８日目の非生存者を特定するためのＡＵＲＯＣ分析（全コホート） ３つの重症度群におけるバイオマーカーレベルに応じて２８日目の非生存者を特定するためのＡＵＲＯＣ分析。 ＳＯＦＡスコアに基づき２８日目の非生存者を特定するためのＡＵＲＯＣ分析。
以下の非限定的な実施例を参照することにより本発明をさらに説明する。
実施例１
方法：
調査対象母集団
２０１３年６月１日から２０１４年６月１４日まで「ｃｅｎｔｒｅ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ（ＣＨＵ）ｄｅ Ｄｉｊｏｎ Ｂｏｕｒｇｏｇｎｅ」の医療集中治療室に入院した２３７人の重篤な患者を臨床研究に連続的に登録した。１８歳未満の患者を除外した。この研究は、施設内）治験審査委員会によって承認された。登録前に、書面によるインフォームドコンセントを患者自身から、または患者の近親者から得た。全ての患者は心血管疾患、真性糖尿病、悪性疾患、呼吸器疾患、肝疾患、腎臓病および免疫抑制を含む広範囲の疾患を示し、退院または病院での死亡までモニターされた。医療記録の遡及的レビュー、撮像、および微生物学的結果に基づき、２人の独立した医師が、国際的標準基準に従って、入院当日の患者を非敗血症（全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）または無ＳＩＲＳ）、重症敗血症、または敗血症性ショックに分類した（Ｂｏｎｅ，Ｂａｌｋ ｅｔ ａｌ．１９９２）。入院日、すなわち最初の２４時間に血液試料を採取した。病歴、身体診察の結果、定期的な血液分析（例：血液培養）、臨床検査以外の診断検査（例：ＳＩＲＳ基準、臓器不全基準）、治療的介入（例：人工呼吸器（ＭＶ）、バソプレッサ）を含むベースライン人口統計および臨床データ腎代替療法（ＲＲＴ））と結果のパラメータ（例：入院期間、全死亡率）を記録した。６つの臓器パラメータに基づく逐次臓器不全評価スコア（ＳＯＦＡスコア）、および１７個の主に生理学の変数に基づく単純化急性生理学スコア（ＳＡＰＳ ＩＩ）を入院時に計算した（Ｌｅ Ｇａｌｌ，Ｌｅｍｅｓｈｏｗ ｅｔ ａｌ．１９９３、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｍｏｒｅｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９６）。
バイオマーカー
血清乳酸レベルは、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅからのｅ５０１モジュールアナライザーを使用する比色アッセイによって測定した。乳酸塩の参照限界は、０．５〜２．２ｍｍｏｌ／Ｌであった。
ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（中間領域プロアドレノメジュリン）、コペプチン、およびＰＣＴ（プロカルシトニン）レベルを、ＫＲＹＰＴＯＲランダムアクセス分析器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂ・Ｒ・Ａ・Ｈ・Ｍ・Ｓ）などの超高感度アッセイを使用して、血漿試料中で決定した。ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のレベル、ならびにアルドラーゼＢのレベルは、例えば、以下に記載されるように、選択反応モニタリングまたは多重反応モニタリング（ＳＲＭ／ＭＲＭ）アッセイによって血漿試料中で決定された。マーカーに由来する特異的ペプチドは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術（ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｉｖａ質量分析計（ＭＳ）；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。各ペプチドについて同定されたペプチド配列およびその断片化イオン、いわゆる遷移は、血液試料中のマーカータンパク質レベルを監視するための有用な代理であることが見出された。同位体的に重く標識され得る合成ペプチドに対して最適化を行った。シグナル対ノイズに関して最良のペプチドを選択した。最適な滞留時間と、少なくともベスト４つの遷移は、各ペプチドのために設定された。
例示的なＭＳ定量化ならびにペプチドおよび遷移の選択
５μＬの各臨床血漿試料を２０μＬの８Ｍ尿素／２．５％ｎ−プロパノール／３００ｍＭトリス／１０ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ８．５に添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。１Ｍ重炭酸アンモニウム中で調製した５００ｍＭヨード酢酸を各試料ウェルに添加し、暗所において室温で１時間インキュベートした。１１３μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／５ｍＭ ＣａＣｌ２ ｐＨ ８．０を各ウェルに添加した。トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１５０μＬの２５ｍＭ酢酸で再水和し、１：１０（全タンパク質含有量：プロテアーゼ）の比率で添加し、３７℃で２０時間インキュベートする。最後に、２μＬのギ酸を添加して消化をクエンチした。次いでグルカゴン（１ｎｇ／μＬ）および標準的な重鎖ペプチドを注射前に添加した。
ＳＲＭアッセイは、ＨＰＬＣ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と組み合わせた三連四重極質量分析計ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｉｖａで開発した。逆相分離は、５から４０％Ｂまでの２０分の直線勾配で、４０分の総運転時間で行った（溶媒Ａ：水０．２％ＦＡ、溶媒Ｂ：ＡＣＮ ０．２％ＦＡ）。直線勾配中の流速を２４０μＬ／分に設定した。総注入体積は、曲線上の全ての試料および点に対して１６０μＬであった。１５０ｍｍ×２．１ｍｍのＡｃｃｕｃｏｒｅ ａＱカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５０℃の温度で運転した。
１３ Ｃおよび１５ Ｎ標識アルギニンまたはリジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ）を組み込んだ重標識合成ペプチドに対して最適化を行った。衝突エネルギー、チューブレンズ、および滞留時間などの個々の機器パラメータを、全ての遷移について自動的に試験した。複数回反復した後、ペプチドおよびトランジションの最適化リスト（すなわち、最高強度のシグナルおよび他のトランジションとの重複が最も少ない）、および対応する保持時間を、選択したペプチドあたり少なくとも４つのフラグメントトランジションで確定した。
クロマトグラフィー分離において軽および重標識遷移を共溶出することによってペプチドを同定した。ピンポイント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびスカイライン（ＭａｃＣｏｓｓ Ｌａｂ）ソフトウェアを時間整列、遷移の相対的定量化および標的タンパク質の定量化に使用した。
マーカーの相対的および絶対的定量化は、以下に記載されるような例示的方法を使用することによって行われた。
相対定量化：
１．生物学的試料中で検出された所与のペプチドからのＳＲＭシグネチャーピーク面積を、少なくとも第２、第３、第４またはそれ以上の生物学的試料中の同じフラグメントペプチドの同じＳＲＭシグネチャーピーク面積と比較することによってマーカーの存在の増加または減少を決定する。
２．生物学的試料中で検出された所与のペプチドからのＳＲＭシグネチャーピーク面積を、異なる別々の生物学的供給源から得られた他の試料中の他のタンパク質からのフラグメントペプチドから生じたＳＲＭシグネチャーピーク面積と比較することによるペプチドフラグメントについての２つの試料間のＳＲＭサインピーク面積比較は、各試料において分析されたタンパク質の量に対して正規化される。
３．マーカーの変化するレベルを、様々な細胞条件下でそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、所与のペプチドについてのＳＲＭシグネチャーピーク面積を、同じ生体試料内の異なるタンパク質に由来する他のフラグメントペプチドからのＳＲＭシグネチャーピーク面積と比較することによって、マーカーの存在の増加または減少を決定する。
４．これらのアッセイは、未修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチド、例えば、修飾が含まれるが、リン酸化および／またはグリコシル化、アセチル化、メチル化（モノ、ジ、トリ）、シトルリン化、ユビキチン化の両方に適用された。修飾ペプチドの相対量は、未修飾ペプチドの相対量を決定するのと同じ方法で決定した。
所与のペプチドの絶対定量化：
個々の生物学的試料中のマーカーからの所与のフラグメントペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、生物学的試料からタンパク質溶解物中にスパイクした内部フラグメントペプチド標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較する。
内部標準は、調べられていたマーカータンパク質または標識された組換えタンパク質由来のフラグメントペプチドの標識された合成バージョンであった。この標準を消化の前または後に既知量で試料にスパイクし、そして生物学的試料中の内部フラグメントペプチド標準および天然フラグメントペプチドの両方について別々にＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を決定し、続いて両方のピーク面積を比較した。
そのようなアッセイは、修飾が含まれるがこれらに限定されない、未修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに適用された。未修飾ペプチドの絶対レベルを決定するのと同じ方法で、修飾ペプチドを決定した。
ヒストンＨ４もイムノアッセイにより測定した。ヒストンＨ４イムノアッセイ（Ｈ４ ＩＡ）は、ＭａｇＰｌｅｘ−Ｃ Ｍｉｃｒｏｐｈｅｒｅｓ（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ Ｔｅｘａｓ）に結合された合成ペプチド（配列番号１のアミノ酸４６〜５６）に対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、および合成ペプチド（配列番号１のアミノ酸６７〜７８）に対するビオチン化ヒツジポリクローナル抗体（ｐＡｂ）からなる。合成ペプチド（配列番号１のアミノ酸４６〜１０２）を標準物質として使用した。試料は、ｘＰｏｎｅｎｔ ４．２システムを備えたＭＡｇＰｉｘ（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ａｕｓｔｉｎ Ｔｅｘａｓ）で測定した。データは、ＪＭＰ−１２（ＳＡＳ統計ソフトウェア、英国）からの５パラメータロジスティック回帰を用いて分析した。
統計分析
全ての分析はソフトウェアＲ ３．０．２を用いて実施した。
データは、括弧内に中央値および四分位数範囲［ＩＱＲ］として表されている。
分析された全てのバイオマーカーは非常に右に傾いた分布を示すので、モデル適合に対する極値の影響を減少させるために回帰モデルに含める前に値をｌｏｇ10変換した。
定量化限界（ＬｏＱ）を下回る値を、ＬｏＱを下回る小さい値で置き換えた。欠測値は置き換えなかった。各モデルは、モデルにおける全ての変数に関する完全なデータを有する全ての患者を含む。
０．０５未満のＰ値を有意と見なした。
生存分析のために、必要に応じて、ＩＣＵ入院後３、７または２８日目に追跡調査を打ち切った（最大追跡調査期間（ＦＵＰ））。評価されたＦＵＰの前に追跡調査に属していない患者（すなわち、早期退院または別の病棟への移動のため）を、ＩＣＵへの彼らの最後の訪問日に打ち切った。最大のＦＵＰで生存している患者をこの日に打ち切った。時間依存的転帰変数については、コックス回帰モデルを使用した。表示される結果は、尤度比Ｘ2検定（Ｌ．Ｒ．Ｘ2およびｐ値）、Ｃ指数（Ｈａｒｒｅｌ）、ならびに標準化ハザード比（ＨＲ）である。本明細書中のハザード比は、バイオマーカーレベルにおける２倍の変化（バイオマーカーの上位対下位四分位数）を指す。調整モデルでは、モデル性能に対するバイオマーカーの追加の効果を決定するために調整変数をモデルに含めた。
結果：
研究集団は２３７人の患者を含んでいた。２人の患者（１人のＳＩＲＳなしの患者、１人の敗血症患者）は、死亡データの相反する実証により分析から除外しなければならなかった。１７２人の患者（７３％）が重症敗血症または敗血症性ショックを示し、１５人の患者（６％）がＳＩＲＳを示し、４９人の患者（２１％）がＳＩＲＳを示さなかった。年齢の中央値は、６７［５９〜７７歳］であった。患者の大多数は、男性であった（６０％）。最も頻度の高い基礎疾患は、心血管疾患（３５％）、糖尿病（３１％）、および悪性腫瘍（２７％）であり、呼吸器疾患（１６％）、肝臓病（１２％）、腎臓病（１２％）、および免疫抑制（７％）が続いた。最も頻度の高い感染部位は、下気道（４６％）および尿路（４５％）であった。ＳＡＰＳ ＩＩスコア（５６［４０〜６９点］点）およびＳＯＦＡスコア（９［６〜１２点］点）は、入院時に増加した。臓器不全は、最も頻繁には呼吸不全（６１％）、循環性ショック（５６％）、および腎不全（４１％）であった。したがって、ＩＣＵ滞在中に多くの患者がＭＶ（７８％）、昇圧薬（６８％）、およびＲＲＴ（３７％）を必要とした。全ての原因のＩＣＵ死亡率は、３２％であり、ＩＣＵ滞在期間の中央値は、５．４［２．５〜１０．６］日であった。
年齢および性別で調整した単変量および二変量コックス回帰モデルを使用して、２３５人の重篤な患者全員における短期（例えば、３日目および７日目、すなわち、３日間および７日間）ならびに長期（２８日目、すなわち、２８日間）の死亡を分析した。ＩＣＵ入院後、２３人の患者（１０％）が３日目までに死亡し、４９人の患者（２１％）が７日までに死亡し、７４人の患者（３２％）が２８日までに死亡した。さらに、年齢および性別について調整された単変量コックス回帰モデルを使用して、下気道感染症、尿路感染症（ＵＴＩ）および悪性腫瘍を有する患者の亜集団における死亡を分析した。下気道感染症患者１０９人中２７人（２５％）が７日目までに死亡し、ＵＴＩ患者９４人中３４人（３６％）が悪性腫瘍患者６４人中１６人（２５％）で死亡したＩＣＵ入院後７日目までに死亡した。生存者と非生存者を区別する各コックス回帰モデルの検出力は、０〜１の範囲のＣ指数によって反映され、最良の予測コックス回帰モデルは、１に近いＣ指数を得る。加えて、ＨＲは、より悪い予後を示すＨＲ＞０および変数の保護効果を示すＨＲ＜０で計算される。
全ての分析された変数の中で、ＩＣＵ入院時のＳＡＰＳ ＩＩスコアは、２３５人の重篤な患者全員において、３日（Ｃ指数０．８７６、ＩＱＲ当たりのＨＲ ８．４２）、７日（Ｃ指数０．８０９、ＩＱＲ当たりのＨＲ ５．１５）、および２８日（Ｃ指数０．７７６、ＩＱＲ当たりのＨＲ ４．１９）死亡において最良の予測を示し、３日（Ｃ指数０．８６６、ＩＱＲ当たりのＨＲ ６．６８）および７日死亡（Ｃ指数０．７７８、ＩＱＲ当たりのＨＲ ３．８２）の予測におけるＩＣＵ入院時のＳＯＦＡスコアが後に続く（表１〜表３）。同様の結果が、敗血症患者のサブグループにおいて、かつＳＡＰＳ ＩＩスコアに対する下気道感染症を有する重篤な患者における７日死亡（Ｃ指数０．７７３、ＩＱＲ当たりのＨＲ ３．４７）の予測に関して得られる（表４）。
比較すると、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、全ての重篤な患者において、ＩＣＵ入院後７日目（Ｃ指数０．７６９、ＩＱＲ当たりのＨＲ ４．５３）および２８日目（Ｃ指数０．７６５、ＩＱＲ当たりのＨＲ ４．８６）に全てのバイオマーカーの中で生存者と非生存者を最も良く区別する（表２、３）。それは、全ての重篤な患者における２８日目の死亡の予測において、ＳＯＦＡスコアより優れている（表３）。同様の結果が敗血症患者のサブグループにおいても得られる。二変量解析では、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、全ての重篤な患者において、７日死亡の予測に対するＳＡＰＳ ＩＩまたはＳＯＦＡの性能（ＳＡＰＳ ＩＩ単独のＣ指数０．８０９と比較して、ＳＡＰＳ ＩＩおよびＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの組み合わせたモデルのＣ指数０．８３２）、ならびに２８日死亡の予測に対するＳＡＰＳ ＩＩの性能（ＳＡＰＳ ＩＩ単独のＣ指数０．７７６と比較して、ＳＡＰＳ ＩＩおよびＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの組み合わせたモデルのＣ指数０．８１０）を改善する（表２、表３）。これらの患者における３日死亡の予測に対するＳＡＰＳ ＩＩまたはＳＯＦＡおよびＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの組み合わせたモデルでは、予後値の改善がない（表１）。
他のバイオマーカーおよびスコアと比較して、ＰＣＴ（例、Ｃ指数０．６８９、全ての重症患者の２８日死亡の予測にはＩＱＲ １．９０）、およびアルドラーゼＢ（例、２８日死亡の予測にはＣ指数０．６６７、ＩＱＲあたりＨＲ １．４７ ＩＣＵ入院時に、全ての重症患者またはそのサブグループにおいて死亡と中等度の関連を示す（例、表１）。しかしながら、二変量コックス回帰モデルでは、ＰＣＴは、全ての重篤な患者における２８日死亡の予測に対するＳＡＰＳ ＩＩまたはＳＯＦＡの予後値を改善する（例えば、ＳＡＰＳ ＩＩおよびＰＣＴの組み合わせたモデルは、単変量分析におけるＳＡＰＳ ＩＩの０．７７６と比較して、０．７８６のＣ指数をもたらす）（例えば、表３）。加えて、アルドラーゼＢを含む二変量コックス回帰モデルは、全ての重篤な患者におけるＭＲ−ｐｒｏＡＤＭと７日死亡との関連性を改善する（０．７６９のＣ指数を有するＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの一変量モデルと比較して、０．７８０のＣ指数を有するＭＲ−ｐｒｏＡＤＭおよびアルドラーゼＢの組み合わせたモデル）（表２）。他の死亡分析において、ＰＣＴまたはアルドラーゼＢからＳＡＰＳ ＩＩ、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、またはヒストンによって、予測はさらに改善されなかった（表１〜表３）。
ＩＣＵ入院時のヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４のレベルは、全ての重篤な患者において、３日（例えば、Ｈ２Ｂ Ｃ指数０．７９３、ＩＱＲ当たりのＨＲ ２．７６）、７日（例えば、Ｈ２Ｂ Ｃ指数０．７６８、ＩＱＲ当たりのＨＲ ２．４０）、および２８日（例えば、Ｈ２Ｂ Ｃ指数０．７５２、ＩＱＲ当たりのＨＲ ２．４０）死亡と強く関連していた（表１〜表３）。同様の結果が敗血症患者のサブグループにおいても得られる。全てのヒストンの中でＨ２Ｂが最もよく機能し、Ｈ４、Ｈ２Ａ、およびＨ３がそれに続く（表１〜表６）。ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４の性能を他のバイオマーカーと比較すると、短期（３および７日）死亡に対するヒストンの顕著な予後値があり、すなわち、一方で、Ｈ２Ｂは、２８日死亡の予測においてＭＲ−ｐｒｏＡＤＭより劣る可能性がある（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ Ｃ指数０．７６５対Ｈ２Ｂ Ｃ指数０．７５２）。全ての重篤な患者において、Ｈ２ＢおよびＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、７日死亡と同等に関連しており（Ｈ２Ｂ Ｃ指数０．７９３対ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ Ｃ指数０．７８６）、Ｈ２Ｂは、３日死亡の予測に関してＭＲ−ｐｒｏＡＤＭより優れている（Ｈ２Ｂ Ｃ指数０．７６８対ＭＲｐｒｏＡＤＭ Ｃ指数０．７６９）（表１〜表３）。
二変量コックス回帰モデルでは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４は、ＳＡＰＳ ＩＩまたはＳＯＦＡ（例えば、２８日死亡の予測に対するＳＡＰＳ ＩＩ Ｃ指数０．７７６の単変量モデルと比較して、Ｈ２ＢおよびＳＡＰＳ ＩＩ Ｃの組み合わせたモデル Ｃ指数０．８１１）ならびにＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（２８日死亡の予測に対するＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ Ｃ指数０．７６５の単変量モデルと比較して、Ｈ２ＢおよびＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの組み合わせたモデル Ｃ指数０．７９５）の性能を改善する（表１〜表３）。下気道感染症を有する重篤な患者では、ＩＣＵ入院時のヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４は、バイオマーカーの中で７日死亡の最良の予測因子である（例えば、Ｈ２Ｂ Ｃ指数０．７８５、ＩＱＲ当たりのＨＲ ２．５６）（表４）。ＵＴＩを有する重篤な患者では、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４は、ＩＣＵ入院時の全ての変数の中で２８日死亡と最も強く関連している（例えば、Ｈ２Ｂ Ｃ指数０．７６４、ＩＱＲ当たりのＨＲ ２．５２）（表５）。ＩＣＵ入院時のヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４は、悪性腫瘍を有してＩＣＵに入院した重篤な患者の全変数の中で７日死亡と最も強い関連を示す（例えば、Ｈ２Ｂ Ｃ指数０．８１５、ＩＱＲ当たりのＨＲ ４．７９）（表６）。
表１：ユニおよび全ての批判の患者における３日間の死亡のｂｉｖａｒｉａｂｌｅ Ｃｏｘ回帰分析
重症患者の総数（ｎ）２３５人のうちの２４人の患者が、ＩＣＵ入院後３日目までに死亡した（事象）。ＩＣＵ入院時に測定されたスコアまたはバイオマーカーは、モデルに含まれる。全ての単変量または二変量モデルは、年齢および性別で調整される。自由度（ｄｆ）は、含まれる変数および調整の数を反映する。表示される結果は、尤度比Ｘ2検定（Ｌ．Ｒ．Ｘ2およびｐ値）、Ｃ指数（Ｈａｒｒｅｌ）、ならびに標準化ハザード比（ＨＲ）、さらに四分位範囲（ＩＱＲ）または２倍変化のいずれかの９５％信頼区間（ＣＩ）である。（ＳＡＰＳ ＩＩ：簡易急性生理スコアＩＩ；ＳＯＦＡ：逐次的臓器不全評価；ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ：中部プロアドレノメジュリン；ＰＣＴ：プロカルシトニン；ヒストンはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４により表され；Ｈ４もまたイムノアッセイにより測定された））。
表２：全ての重篤な患者における７日死亡の単変量および二変量コックス回帰分析
重症患者の総数（ｎ）２３５人のうちの４９人の患者が、ＩＣＵ入院後７日目までに死亡した（事象）。ＩＣＵ入院時に測定されたスコアまたはバイオマーカーは、モデルに含まれる。全ての単変量または二変量モデルは、年齢および性別で調整される。自由度（ｄｆ）は、含まれる変数および調整の数を反映する。表示される結果は、尤度比Ｘ2検定（Ｌ．Ｒ．Ｘ2およびｐ値）、Ｃ指数（Ｈａｒｒｅｌ）、ならびに標準化ハザード比（ＨＲ）、さらに四分位範囲（ＩＱＲ）または２倍変化のいずれかの９５％信頼区間（ＣＩ）である。（ＳＡＰＳ ＩＩ：簡易急性生理スコアＩＩ；ＳＯＦＡ：逐次的臓器不全評価ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ：中領域プロアドレノメジュリン；ＰＣＴ：プロカルシトニン；ヒストンはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４により表され；Ｈ４もまたイムノアッセイにより測定された（ＩＡ））
表３：全ての重篤な患者における２８日死亡の単変量および二変量コックス回帰分析
重症患者の総数（ｎ）２３５人のうちの７４人の患者がＩＣＵ入院後３日目までに死亡した（事象）。ＩＣＵ入院時に測定されたスコアまたはバイオマーカーは、モデルに含まれる。全ての単変量または二変量モデルは、年齢および性別で調整される。自由度（ｄｆ）は、含まれる変数および調整の数を反映する。表示される結果は、尤度比Ｘ2検定（Ｌ．Ｒ．Ｘ2およびｐ値）、Ｃ指数（Ｈａｒｒｅｌ）、ならびに標準化ハザード比（ＨＲ）、さらに四分位範囲（ＩＱＲ）または２倍変化のいずれかの９５％信頼区間（ＣＩ）である。（ＳＡＰＳ ＩＩ：簡易急性生理スコアＩＩ；ＳＯＦＡ：逐次的臓器不全評価ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ：中領域プロアドレノメジュリン；ＰＣＴ：プロカルシトニン；ヒストンはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４により表され；Ｈ４もまたイムノアッセイにより測定された（ＩＡ））
表４：下気道感染症を有する重篤な患者における７日死亡の単変量コックス回帰分析
下気道感染症の重症患者の総数（ｎ）１０９人のうちの２７人の患者が、ＩＣＵ入院後７日目までに死亡した（事象）。ＩＣＵ入院時に測定されたスコアまたはバイオマーカーは、モデルに含まれる。全ての単変量または二変量モデルは、年齢および性別で調整される。自由度（ｄｆ）は、含まれる変数および調整の数を反映する。表示される結果は、尤度比Ｘ2検定（Ｌ．Ｒ．Ｘ2およびｐ値）、Ｃ指数（Ｈａｒｒｅｌ）、ならびに標準化ハザード比（ＨＲ）、さらに四分位範囲（ＩＱＲ）または２倍変化のいずれかの９５％信頼区間（ＣＩ）である。（ＳＡＰＳ ＩＩ：簡易急性生理スコアＩＩ；ＳＯＦＡ：逐次的臓器不全評価ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ：中領域プロアドレノメジュリン；ＰＣＴ：プロカルシトニン；ヒストンはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４で表される）もまたイムノアッセイ（ＩＡ）により測定した
表５：尿路感染症を有する重篤な患者における２８日死亡の単変量コックス回帰分析
尿路感染症の重症患者の総数（ｎ）９４人のうち３４人の患者が、ＩＣＵ入院後２８日目までに死亡した（事象）。ＩＣＵ入院時に測定されたスコアまたはバイオマーカーは、モデルに含まれる。全ての単変量または二変量モデルは、年齢および性別で調整される。自由度（ｄｆ）は、含まれる変数および調整の数を反映する。表示される結果は、尤度比Ｘ2検定（Ｌ．Ｒ．Ｘ2およびｐ値）、Ｃ指数（Ｈａｒｒｅｌ）、ならびに標準化ハザード比（ＨＲ）、さらに四分位範囲（ＩＱＲ）または２倍変化のいずれかの９５％信頼区間（ＣＩ）である。（ＳＡＰＳ ＩＩ：簡易急性生理スコアＩＩ；ＳＯＦＡ：逐次的臓器不全評価ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ：中領域プロアドレノメジュリン；ＰＣＴ：プロカルシトニン；ヒストンはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４により表され；Ｈ４もまたイムノアッセイにより測定された（ＩＡ））
表６：悪性腫瘍を有する重篤な患者における７日死亡の単変量コックス回帰分析
悪性腫瘍の重症患者の総数（ｎ）６４人のうち１６人の患者が、ＩＣＵ入院後７日目までに死亡した（事象）。ＩＣＵ入院時に測定されたスコアまたはバイオマーカーは、モデルに含まれる。全ての単変量または二変量モデルは、年齢および性別で調整される。自由度（ｄｆ）は、含まれる変数および調整の数を反映する。表示される結果は、尤度比Ｘ2検定（Ｌ．Ｒ．Ｘ2およびｐ値）、Ｃ指数（Ｈａｒｒｅｌ）、ならびに標準化ハザード比（ＨＲ）、さらに四分位範囲（ＩＱＲ）または２倍変化のいずれかの９５％信頼区間（ＣＩ）である。（ＳＡＰＳ ＩＩ：簡易急性生理スコアＩＩ；ＳＯＦＡ：逐次的臓器不全評価ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ：中領域プロアドレノメジュリン；ＰＣＴ：プロカルシトニン；ヒストンはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４によって表される。Ｈ４もイムノアッセイ（ＩＡ）によって測定された。
実施例２：様々なレベルの疾患重症度を有する敗血症における死亡予測のためのプロアドレノメジュリンの優れた精度
背景：近年、新規の敗血症バイオマーカーの使用が増加している。しかしながら、病気の重症度に関するそれらの予後値は調査されていない。本研究において、我々は、プロカルシトニン、Ｃ反応性タンパク質、および乳酸塩と比較して、異なる程度の臓器不全を有する敗血症患者における死亡の予測における中間領域プロアドレノメジュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）の能力を検査した。
方法：これは、ＩＣＵに入院した重症敗血症または敗血症性ショック患者を登録している、２施設の前向き観察コホートであった。血漿バイオマーカーを入院の最初の１２時間の間に測定した。バイオマーカーと２８日死亡との関連を、コックス回帰分析およびカプラン・マイヤー曲線によって評価した。逐次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコアによって評価されるように、患者を３つの群に分けた。死亡に関するバイオマーカーの精度を、受信者動作特性曲線（ＡＵＲＯＣ）分析下の面積によって決定した。
結果：重症敗血症（２１．７％）または敗血症性ショック（７９．３％）を有する３２６人の患者が、３１．０％の２８日死亡率で登録された。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭおよび乳酸塩のみが、多変量分析における死亡と関連していた：ハザード比（ＨＲ）：８．５対３．４（ｐ＜０．００１）。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、全コホートにわたる分析において、２８日死亡予測に関して最良のＡＵＲＯＣを示した（ＡＵＲＯＣ［９５％ ＣＩ］：０．７９［０．７４〜０．８４］）（ｐ＜０．００１）。患者を臓器不全の程度によって層別化した場合、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、全ての重症度群（６以下のＳＯＦＡ、７〜１２のＳＯＦＡ、および１３以上のＳＯＦＡ）において死亡を予測する唯一のバイオマーカーであり、ＡＵＲＯＣ［９５％ ＣＩ］はそれぞれ、０．７５［０．６１〜０．８８］、０．７４［０．６６〜０．８３］、および０．７３［０．５９〜０．８６］（ｐ＜０．０５）であった。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ濃度が０．８８ｎｍｏｌ／Ｌ以下の患者は全て、最大２８日まで生存した。ＳＯＦＡが６以下の患者では、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭをＳＯＦＡスコアに追加することで、非生存者を特定するためのＳＯＦＡの能力が増加し、ＡＵＲＯＣ［９５％ＣＩ］はそれぞれ、０．７０［０．５８〜０．８２］および０．７７［０．６６〜０．８８］（両方に対してｐ＜０．０５）であった。
結論：敗血症における予後バイオマーカーの性能は、疾患の重症度によって大きく影響される。死亡を予測するためのＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの精度は、臓器不全の程度によって影響されない。その結果、これは、中等度の重症度を有するが死亡のリスクがある敗血症患者の早期特定において良好な候補である。
背景
抗生物質および早期血行動態管理の改善にもかかわらず、敗血症は、依然として集中治療室（ＩＣＵ）患者の主な死因である。ヨーロッパでは、急性疾患患者における敗血症の発生は、重症度に応じて２７％〜５４％の範囲のＩＣＵ死亡率をもたらす［１］。米国では、Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌは、毎年５０万人が敗血症を発症し、２０万人が死亡すると推定している［２］［３］。したがって、高リスクの敗血症患者の迅速な診断および評価が非常に望ましく、早期かつ特定の治療を開始する可能性が高まる。したがって、逐次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコアなどの臨床的重症度スコアが重要な役割を果たし得る［４］。しかしながら、敗血症の意思決定を導くためにこれらのスコアリングシステムを単独で使用することは、非常に批判されている［５］。ある範囲の重症度レベルで入院した敗血症患者の早期特定のための標準化された評価ツールは、臨床上の意思決定を助け、医療資源の使用を最適化するのに劇的な価値があるであろう。したがって、過去数十年にわたって、敗血症の分野において、他の疾患におけるよりもはるかに多くの予後バイオマーカーが提案されてきた。これらの分子の大部分は、炎症または凝固系に関連するホルモン、サイトカイン、または循環タンパク質であり、測定されるためにかなりの時間、労力、および費用を必要とし得る［６］。
アドレノメジュリン（ＡＤＭ）は、ホルモンとして作用することができ、血管拡張作用、抗炎症作用、および抗菌作用を含む異なる生理学的機能を有して、生理学的および感染ストレス中に複数の組織によって産生され、これは、補体活性のその調整および調節によってさらに強化される［７］。したがって、ＡＤＭは、それが内分泌細胞によってのみ産生された場合には非炎症性状態におけるホルモン様挙動によって、かつそれが偏在的に過剰発現した場合には敗血症におけるサイトカイン様挙動によって特徴付けられる「ホモカイン」と見なされる。さらに、外因性ＡＤＭが、敗血症の動物モデルにおいて急性肺損傷、血管透過性、および死亡を低減することが示されている一方で、内因性の過剰発現は、敗血症発作を同様に改善する［８］［９］。循環ＡＤＭの測定は、急速な分解および循環からのクリアランスによって複雑になり、結合タンパク質（補体因子Ｈ）によってさらに隠され、標準的なイムノアッセイによるその検出を妨げる。アミノ酸４５〜９２からなるプロアドレノメジュリンの中間領域フラグメント（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）はより安定しており、急速に分解された活性ＡＤＭペプチドのレベルを直接反映する［１０］。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ濃度の上昇は、院外感染性肺炎（ＣＡＰ）患者の血漿中で特定されており、状態のリスクおよび重症度評価に広く使用されている［１１］［１２］［１３］。しかしながら、重症敗血症および敗血症性ショック患者については入手可能なデータがほとんどない。加えて、敗血症における予後バイオマーカーの性能に対する疾患重症度の影響は、まだ適切に研究されていない。
本研究において、我々は、ＳＯＦＡスコアによって測定される３つの異なるレベルの疾患重症度において、他の標準バイオマーカー（プロカルシトニン（ＰＣＴ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、および乳酸塩）と比較して、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭレベルが敗血症患者における２８日死亡を予測する能力を評価することを目的とした。
方法
患者、選択基準および除外基準：本研究は、スペインおよびフランスの２つの集中治療室（ＩＣＵ）から連続して採用された患者の前向き観察コホートであった。１８歳以上の、かつ２０１３年４月から２０１６年１月までにＩＣＵに入院した成人患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｓｔ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ／Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅによるＳＥＰＳＩＳ−２の定義に基づき、重症敗血症または敗血症性ショックの基準を満たした後１２時間以内に登録された［１４］。登録患者はまた、２以上のＳＯＦＡスコアを有し、したがって敗血症に対する新しいＳＥＰＳＩＳ−３の定義の基準を満たしていた［１５］。ＩＣＵへの入院前の最後の３ヶ月間に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症を有する患者、および化学療法または全身性ステロイドを含む放射線療法を受けているか、または免疫抑制薬を受けている患者は、免疫抑制されていると見なされた。除外基準は、１８歳未満、妊娠の存在、ＩＣＵ入院後最初の１２時間以内のバイオマーカープロファイリングに利用可能な血液試料の非存在、またはインフォームドコンセントの欠如であった。医療記録から記録された臨床データには、人口統計データ、併存症、研究室、微生物学、およびバイオマーカーレベルが含まれていた。病気の重症度は、入院時に、逐次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコアを計算することによって評価した。
バイオマーカー評価
バイオマーカープロファイリングのための血漿試料を、ＩＣＵ入院の瞬間にできるだけ近いとき、および常に最初の１２時間以内に採取した。血漿ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ測定を、新しいサンドイッチイムノアッセイ（Ｋｒｙｐｔｏｒ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｐｌｕｓ Ａｎａｌｙｓｅｒ，ＢＲＡＨＭＳ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＴＲＡＣＥ技術（時間分解増幅クリプテート放射）によって実施し、検出限界は、０．０５ｎｍｏｌ／Ｌであった。ＰＣＴ測定を、化学分析器（Ｃｏｂａｓ ６０００，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍｅｙｌａｎ，Ｆｒａｎｃｅ）上で電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）によって実施し、検出限界は、０．０２ｎｇ／ｍＬであった。血清ＣＲＰおよび乳酸塩を、それぞれ粒子増強免疫濁度アッセイおよび比色定量アッセイ（ｅ５０１ Ｍｏｄｕｌｅ Ａｎａｌｙｓｅｒ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍｅｙｌａｎ，Ｆｒａｎｃｅ））によって測定し、検出限界はそれぞれ、０．１５ｍｇ／ｄＬおよび０．２ｍｍｏｌ／Ｌであった。
統計分析
生存者と非生存者との間の人口統計学的および臨床的特徴の違いは、カテゴリー変数についてχ２検定を使用して評価した。正規分布の有無に基づき連続変数を比較するために、スチューデントのｔ検定またはマン・ホイットニーＵ検定をそれぞれ使用した。バイオマーカーと死亡リスクとの関連を、交絡変数によって調整されたコックス回帰分析によって評価した。ＩＣＵに入院してから２８日後に時間を打ち切った。ＩＣＵ入院の最初の２４時間は、分析の１日目と見なされた。単変量回帰分析においてｐ＜０．０５をもたらす変数を多変量分析にさらに含んだ。正規分布に達するために、バイオマーカーを対数変換した。平均生存期間に対するバイオマーカーの影響は、カプラン・マイヤー曲線およびマンテル・ヘンツェルログランク検定を使用することによって評価した。コックス回帰分析と同様に、ＩＣＵに入院してから２８日後に時間を打ち切った。死亡に関するバイオマーカーの精度および予測値を、受信者動作特性（ＡＵＲＯＣ）曲線下の面積を計算することによって評価した。１つが９０％に近い感度を有し、もう１つが２８日目に非生存者を検出するための９０％に近い特異性を示す、２つの事前定義カットオフを使用して、ＳＯＦＡスコアによって評価されるように、患者を疾患重症度に応じて３つの群に分けた（図４）。ＩＢＭ ＳＰＳＳ ２０．０ソフトウェア（ＳＰＳＳ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ）を使用することによって、データを分析した。
結果
患者の特徴およびバイオマーカー濃度：重症敗血症（２１．７％）または敗血症性ショック（７９．３％）を有する３２６人の患者（３２６人）が、ＶａｌｌａｄｏｌｉｄおよびＤｉｊｏｎのそれぞれにおいて２５．５％および３４．９％の２８日死亡率、ならびに両施設にわたって３１．０％の総死亡率で登録された（表７）。年齢の中央値は、６５歳であり、患者の５４．３％が男性であった。生存者と比較して、非生存者はより年齢が高く、より高いＳＯＦＡスコア、および敗血症性ショック、機械的換気、腎代替療法、新生組織形成、心血管疾患、慢性腎不全、免疫抑制、および呼吸器疾患のより高い発生率を示した（全てｐ＜０．０５）。最も一般的な感染源は、転帰にかかわらず、呼吸器および泌尿器由来であった。感染源に応じた死亡率は、以下の通りであった：呼吸器感染症を患っている患者で３７．２％、泌尿器感染症を患っている患者で３２．４％、腹部感染症を患っている患者で２８．６％、一次または二次菌血症を示す患者で３５．５％、および他の源の感染症を有する患者で２５．６％。微生物学的同定に関しては、生存者および非生存者の両方が、グラム陰性、グラム陽性、およびウイルス病原体のバランスのとれた存在を示した。真菌感染症は、非生存者においてより頻繁であった。最も一般的な死因は、多臓器機能不全症候群（ｎ＝５８；５７．４％）、続いて難治性ショック（ｎ＝９、８．９％）、および難治性低酸素血症（ｎ＝８、７．９％）であった。治療努力の制限を２１人の患者に適用した。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＰＣＴ、および乳酸塩濃度が、生存者と比較して非生存患者で全て有意に上昇した（全てｐ＜０．０１）一方で、ＣＲＰレベルは、両群で同様のままであった。感染源に応じたＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルは、以下の通りであった［中央値（四分位範囲）］：呼吸器感染症［３．６ｎｍｏｌ／Ｌ（５．６）］、泌尿器感染症［４．６ｎｍｏｌ／Ｌ（５．４）］、腹部感染症［４．９ｎｍｏｌ／Ｌ（６．５）］、菌血症［３．８ｎｍｏｌ／Ｌ（５．１）］、および他の源の感染症において［３．５ｎｍｏｌ／Ｌ（５．８）］。感染している微生物に応じたＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルは、［中央値（四分位範囲）］：真菌感染症［６．１ｎｍｏｌ／Ｌ（５．６）］、グラム陰性細菌［４．９ｎｍｏｌ／Ｌ（５．９）］、グラム陽性細菌［４．１ｎｍｏｌ］／Ｌ（６．２）］、またはウイルス［１．２ｎｍｏｌ／Ｌ（３．４）］であった。
生存分析
ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＰＣＴ、および乳酸塩は、単変量コックス回帰分析において死亡率と有意な関連を示した（表８）。交絡因子を調整し、ＰＣＴ、ＣＲＰ、および乳酸塩と比較した後、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、死亡リスクとの最も強い独立した関連を示した（ハザード比：８．５、９５％信頼区間：４．２〜１７．４、ｐ＜０．００１）（表８）。加えて、カプラン・マイヤー分析は、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ値が０．８８ｎｍｏｌ／Ｌ以下の患者が、ＩＣＵ入院後最初の２８日以内に死亡しなかったことを示した（図１）。このカットオフがＡＵＲＯＣで非生存者を特定する際に１００％の感度を提供したため、これを選択した（図２）。
調整変数は、年齢、敗血症性ショック、心血管疾患、免疫抑制、慢性腎不全、新生組織形成、呼吸器感染源、腎代替療法、病院（Ｖａｌｌａｄｏｌｉｄ／Ｄｉｊｏｎ）、真菌感染症の存在、治療努力の制限であった。
バイオマーカー性能に対する疾患重症度の影響
ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、全コホートにわたる分析において、２８日死亡予測に関して最良のＡＵＲＯＣを示し、ＳＯＦＡスコアのものよりもさらに良好であった（図２）。患者を臓器不全の程度によって層別化した場合、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、最も重症度が低い患者（６以下のＳＯＦＡスコア）において、２８日目に非生存者と生存者を区別することが可能な唯一のバイオマーカーであった（ＡＵＲＯＣ［９５％信頼区間（９５％ ＣＩ）：］：０．７５［０．６１〜０．８８］）、（ｐ＝０．００６）（図３）。中程度に重篤な患者（ＳＯＦＡスコア７〜１２）では、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、乳酸塩で観察されたものよりも高いＡＵＲＯＣを示した（それぞれ０．７４［０．６６〜０．８３］対０．６１［０．５２〜０．７１］）（図３）。最も重篤な患者（１３以上のＳＯＦＡスコア）では、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭおよび乳酸塩は、同様のＡＵＲＯＣを有した（それぞれ０．７３［０．５９〜０．８６］対０．７２［０．５９〜０．８６］）（図３）。ＣＲＰもＰＣＴも、ＳＯＦＡスコアに基づき、いずれの重症度群における２８日死亡も予測しなかった。
非生存者を特定するためのＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの閾値（カットオフ）は、少なくとも０．８０の予め固定された感度を有するものから最高の特異性を示すものであった。ＳＯＦＡスコアが６以下、７〜１２、および１３以上の患者について、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭカットオフはそれぞれ、１．７９、３．２５、および５．５８ｎｍｏｌ／Ｌであった（表９）。
各重症度群におけるＩＣＵの滞在期間は、［平均、（ＳＤ）］：６以下のＳＯＦＡ：１１．０日（１８．３）；ＳＯＦＡ７〜１２：１２．４日（１６．０）；１３以上のＳＯＦＡ：８．４日（７．６）であった。各重症度群についての死亡率はそれぞれ、１２．８％、３０．６％、および５９．７％である。
ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、あまり重篤ではない患者における死亡予測を改善する
我々は、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ濃度が１．７９ｎｍｏｌ／Ｌを超える患者がＳＯＦＡスコアにおける１点増加を有すると見なされるように、死亡の予測におけるＭＲ−ｐｒｏＡＤＭおよびＳＯＦＡスコアの組み合わせを評価した。ＳＯＦＡが６以下の患者では、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ修正ＳＯＦＡスコア（ＡＤＭ−ＳＯＦＡ）は、ＳＯＦＡ単独と比較して、非生存者を特定する能力の増加を示し、ＡＵＲＯＣ［９５％ ＣＩ］：ＳＯＦＡ ０．７０［０．５８〜０．８２］およびＡＤＭ−ＳＯＦＡ ０．７７［０．６６〜０．８８］であった。
説明
敗血症の重症度は、ＳＯＦＡスコアによって評価される臓器不全の程度に依存し、これは、死亡リスクと直接関連している［１５］。それにもかかわらず、ますます多くのバイオマーカーの出現は、簡単かつ迅速な方法で予後診断精度を改善するための新しい道を提供し得る。これに関して、我々の研究は、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭが有望なバイオマーカーであり得ることを示唆している。しかしながら、敗血症におけるＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの予後的役割を評価する以前の研究は、相反する結果を提供した。Ｃｈｒｉｓｔ−Ｃｒａｉｎらは、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭが５３人の敗血症患者の群においてＩＣＵ死亡を検出するために０．８１のＡＵＲＯＣをもたらしたことを見出した［１６］。対照的に、Ｓｕｂｅｒｖｉｏｌａらは、１３７人の敗血症患者における院内死亡を予測するためのＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの制限された値を見出し、ＡＵＲＯＣは０．６２であった［１７］。さらに、Ｍａｒｉｎｏらは、敗血症、重症敗血症、または敗血症性ショックを有する１０１人の患者において、血漿アドレノメジュリンが疾患の重症度、昇圧薬の必要量、および２８日死亡と強く関連していたことを示した［１８］。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの予後的役割に関するこれらの異なる結果は、様々な研究にわたる患者の特徴、疾患重症度、感染源、外科対医学、および小さい試料サイズの違いによって説明され得る。
本研究では、敗血症における死亡を予測するためのバイオマーカーの性能が、ＩＣＵ入院時の臓器不全の程度に強く依存することを初めて実証した。患者を彼らのＳＯＦＡスコアに基づき層別化することによって、我々は、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭが全ての重症度群において非生存者を特定することが可能な唯一のバイオマーカーであったことを実証することができた。これは、あまり重篤ではない患者（６未満のＳＯＦＡスコア）にとって特に重要であり、これは、この群が、敗血症の臨床経過における最も初期の提示、および／またはＩＣＵ環境におけるこの疾患のより重症度の低い形態のいずれかを表すためである。したがって、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、早期敗血症管理プロトコルに組み込まれるのに良好な候補となり得、これは、それが迅速な予後値を提供し、診断的介入および治療決定を導く手助けをし、したがって心筋梗塞におけるトロポニンおよび肺塞栓症におけるｄ二量体の役割に似ているためである。この群の患者について特定されたＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのカットオフ値（１．７９ｎｍｏｌ／Ｌ）は、この点に関して非常に有用であり得る。このカットオフは、良好な感度および高い負の予測値で死亡を検出することが可能である。最後に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、敗血症のための新規療法を検査している臨床試験で患者を層別化するのに役立ち得る。
ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、中等度の臓器不全の患者（ＳＯＦＡスコア７〜１２）において、乳酸塩を含む他のより一般的に使用されるバイオマーカーよりも大きい死亡リスクの予測値を示した。対照的に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭおよび乳酸塩の両方が、最も重篤な患者（１３以上のＳＯＦＡ）において同様に機能した。したがって、我々の結果は、敗血症における予後バイオマーカーの発見のための研究をデザインするときに、臓器不全の程度を考慮することの重要性を裏付ける。
ＳＯＦＡスコアを使用することによる臓器不全の評価は、感染症が疑われる高リスク患者を特定するためにＳＥＰＳＩＳ−３合意によって最近提案された［１５］。我々の結果は、「正の」ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ値が、敗血症における死亡を予測するためのＳＯＦＡの能力を改善し得ることを示す。興味深いことに、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭとＰＳＩまたはＣＵＲＢ−６５などの臨床スコアとの組み合わせもまた、院外感染性肺炎（ＣＡＰ）または下気道感染症（ＬＲＴＩ）患者において、単独の臨床スコアよりも良好に機能した［１２］［１９］［２０］［２１］。結果として、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、死亡または有害事象を予測し、かつ臨床的決定を導く能力を有する信頼できるリスク層別化ツールとして使用され得る。したがって、敗血症の認識および予測を改善するために、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭと他の古典的重症度スコアおよび／またはバイオマーカーとを組み合わせる戦略を評価するさらなる臨床研究が保証される［２２］［２３］。
最後に、我々は、０．８８ｎｍｏｌ／Ｌより低いＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ値が、ＩＣＵ入院後２８日以内の死亡を「除外」することを可能にし得ることを観察した。このカットオフは、明らかな臓器不全の臨床的兆候がまだ明らかになっていない場合に、早期の臨床決定を導くのに特に有用であり得る。
経時的なＭＲ−ｐｒｏＡＤＭモニタリングは、一時的な傾向をさらに示し得、これは、特定の治療および療法の成功を示し得、その結果としてその転帰予測値を増加させ得る［２５］。最後に、我々のコホートでは、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭレベルは、感染源に応じてわずかに異なった。真菌感染症が最高レベルのＭＲ−ｐｒｏＡＤＭを誘導した一方で、ウイルス感染症は、最低レベルを誘導した。これはおそらく、真菌感染症がより高い疾患重症度（真菌感染症のない患者における９点に対して１２点のＳＯＦＡスコア中央値）をもたらした一方で、ウイルス感染症が、より軽度の疾患重症度（ウイルス感染症のない患者における９点に対して６．５のＳＯＦＡスコア中央値）をもたらしたという事実に関連する。
結論
我々の結果は、敗血症における死亡リスクを決定する際のバイオマーカーの性能が疾患重症度によって影響されることを実証している。中程度に重篤な患者では、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、他の標準的なバイオマーカーより優れていた。結果として、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、ＩＣＵの緊急入院を必要とする敗血症患者の早期特定を助け得、かつこれらの患者のその後の臨床管理を促進し得る。
略語のリスト
ＡＤＭ：アドレノメジュリン
ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ：中間領域プロアドレノメジュリン
ＣＲＰ：Ｃ反応性タンパク質
ＰＣＴ：プロカルシトニン
ＳＯＦＡ：逐次臓器不全評価スコア
ＣＩ：信頼区間
ＡＵＲＯＣ：受信者動作特性下の面積
ＰＰＶ：正の予測値
ＮＰＶ：負の予測値
ＬＲ：尤度比
ＨＲ：ハザード比
ＰＳＩ：肺炎重症度指数
ＲＲＴ：腎代替療法
本明細書に引用された全ての参考文献は、参照により完全に組み込まれる。
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１５．Ｓｉｎｇｅｒ Ｍ，Ｄｅｕｔｓｃｈｍａｎ ＣＳ，Ｓｅｙｍｏｕｒ ＣＷ，Ｓｈａｎｋａｒ−Ｈａｒｉ Ｍ，Ａｎｎａｎｅ Ｄ，Ｂａｕｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｅｐｓｉｓ ａｎｄ Ｓｅｐｔｉｃ Ｓｈｏｃｋ（Ｓｅｐｓｉｓ−３）．ＪＡＭＡ．２０１６；３１５：８０１−１０．
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１７．Ｓｕｂｅｒｖｉｏｌａ Ｂ，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｏｒｔｅｇａ Ａ，Ｒｕｉｚ Ｒｕｉｚ Ａ，Ｌｏｐｅｚ−Ｈｏｙｏｓ Ｍ，Ｓａｎｔｉｂａｎｅｚ Ｍ．Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｐｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｗ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｓｕＰＡＲ ａｎｄ ｐｒｏＡＤＭ ｉｎ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ＩＣＵ ａｄｍｉｓｓｉｏｎ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２０１３；３９：１９４５−５２．
１８．Ｍａｒｉｎｏ Ｒ，Ｓｔｒｕｃｋ Ｊ，Ｍａｉｓｅｌ ＡＳ，Ｍａｇｒｉｎｉ Ｌ，Ｂｅｒｇｍａｎｎ Ａ，Ｄｉ Ｓｏｍｍａ Ｓ．Ｐｌａｓｍａ ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｎｄ ｖａｓｏｐｒｅｓｓｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｄｍｉｔｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｐｓｉｓ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｌｏｎｄ．Ｅｎｇｌ．２０１４；１８：Ｒ３４．
１９．Ｃｈｒｉｓｔ−Ｃｒａｉｎ Ｍ，Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ ＮＧ，Ｓｔｏｌｚ Ｄ，Ｍｕｌｌｅｒ Ｃ，Ｂｉｎｇｉｓｓｅｒ Ｒ，Ｈａｒｂａｒｔｈ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏ−ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ［ＩＳＲＣＴＮ０４１７６３９７］．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｌｏｎｄ．Ｅｎｇｌ．２００６；１０：Ｒ９６．
２０．Ｃｏｕｒｔａｉｓ Ｃ，Ｋｕｓｔｅｒ Ｎ，Ｄｕｐｕｙ Ａ−Ｍ，Ｆｏｌｓｃｈｖｅｉｌｌｅｒ Ｍ，Ｊｒｅｉｇｅ Ｒ，Ｂａｒｇｎｏｕｘ Ａ−Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ，ａ ｕｓｅｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｒｉｓｋ ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ ｓｃｏｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．Ａｍ．Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．２０１３；３１：２１５−２１．
２１．Ｒｅｎａｕｄ Ｂ，Ｓｃｈｕｅｔｚ Ｐ，Ｃｌａｅｓｓｅｎｓ Ｙ−Ｅ，Ｌａｂａｒｅｒｅ Ｊ，Ａｌｂｒｉｃｈ Ｗ，Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｂ．Ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ａｄｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏ ＩＣＵ ｓｃｏｒｅ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．Ｃｈｅｓｔ．２０１２；１４２：１４４７−５４．
２２．Ｇｕｉｇｎａｎｔ Ｃ，Ｖｏｉｒｉｎ Ｎ，Ｖｅｎｅｔ Ｆ，Ｐｏｉｔｅｖｉｎ Ｆ，Ｍａｌｃｕｓ Ｃ，Ｂｏｈｅ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏ−ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ ａｎｄ ｐｒｏ−ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｏｆ ２８−ｄａｙ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２００９；３５：１８５９−６７．
２３．Ｔｒａｖａｇｌｉｎｏ Ｆ，Ｄｅ Ｂｅｒａｒｄｉｎｉｓ Ｂ，Ｍａｇｒｉｎｉ Ｌ，Ｂｏｎｇｉｏｖａｎｎｉ Ｃ，Ｃａｎｄｅｌｌｉ Ｍ，Ｓｉｌｖｅｒｉ ＮＧ，ｅｔ ａｌ．Ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ（ＰＣＴ） ａｎｄ Ｍｉｄ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｐｒｏ−Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ） ｉｎ ｒｉｓｋ ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ ｉｌｌ ｆｅｂｒｉｌｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（ＥＤ）．Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ ｓｃｏｒｅ．ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０１２；１２：１８４．
２４．Ｂｅｌｌｏ Ｓ，Ｌａｓｉｅｒｒａ ＡＢ，Ｍｉｎｃｈｏｌｅ Ｅ，Ｆａｎｄｏｓ Ｓ，Ｒｕｉｚ ＭＡ，Ｖｅｒａ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｐｏｗｅｒ ｏｆ ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ｉｎ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ａｅｔｉｏｌｏｇｙ．Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．２０１２；３９：１１４４−５５．
２５．Ａｎｄａｌｕｚ−Ｏｊｅｄａ Ｄ，Ｃｉｃｕｅｎｄｅｚ Ｒ，Ｃａｌｖｏ Ｄ，Ｌａｒｇｏ Ｅ，Ｎｏｇａｌｅｓ Ｌ，Ｍｕｎｏｚ ＭＦ，ｅｔ ａｌ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｐｒｏａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ ａｓ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｉｎ ｓｅｖｅｒｅ ｓｅｐｓｉｓ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．２０１５；７１：１３６−９．

Claims (39)

  1. 対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のための方法であって、前記方法が、
    前記対象の試料中のプロアドレノメジュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することを含み、ｐｒｏＡＤＭの前記レベルが、前記対象の前記有害事象を示し、
    ｐｒｏＡＤＭの前記レベルが、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、
    前記対象の前記有害事象が、比較に基づき特定され、
    （ａ）ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルが、約０．７ｎｍｏｌ／Ｌ〜約２．０ｎｍｏｌ／Ｌであるか、または
    （ｂ）
    （ｉ）ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルが、６以下の逐次臓器不全評価（ＳＯＦＡ）スコアに対応する症状を有する対象について約１．８ｎｍｏｌ／Ｌである、
    （ｉｉ）ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルが、７〜１２のＳＯＦＡスコアに対応する症状を有する対象について約３．２ｎｍｏｌ／Ｌである、もしくは
    （ｉｉｉ）ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルが、１３以上のＳＯＦＡスコアに対応する症状を有する対象について約５．５ｎｍｏｌ／Ｌである、方法。
  2. 前記ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルと比較したときの、前記対象の前記ｐｒｏＡＤＭのレベルの減少、より低いレベル、もしくは同等のレベルが、好ましくは約２８日以内に有害事象が起こらないことを示す、あるいは
    ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルと比較したときの、ｐｒｏＡＤＭの前記レベルの増加、またはｐｒｏＡＤＭのより高いレベルが、好ましくは約２８日以内に前記有害事象が起こる、前記対象の前記有害事象を示す、請求項１（ａ）に記載の方法。
  3. ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルが、約０．８ｎｍｏｌ／Ｌ〜約１．９ｎｍｏｌ／Ｌである、請求項１（ａ）または２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記有害事象が、死亡である、請求項１（ａ）、２、または３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 約０．９ｎｍｏｌ／Ｌを超える、好ましくは約１．９ｎｍｏｌ／Ｌを超える、より好ましくは約２．０ｎｍｏｌ／Ｌを超えるｐｒｏＡＤＭのレベルが、約２８日以内の対象の非生存の指標である、請求項４に記載の方法。
  6. 約１．０ｎｍｏｌ／Ｌ未満、好ましくは約０．９ｎｍｏｌ／Ｌ未満、最も好ましくは約０．８８ｎｍｏｌ／Ｌ未満のｐｒｏＡＤＭのレベルが、前記対象が約２８日以内に生存することの指標である、請求項１（ａ）または２のいずれか一項に記載の方法。
  7. さらに、前記対象の前記逐次臓器不全評価スコア（ＳＯＦＡスコア）が決定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  8. 約１．８ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルと比較したときの、前記対象のｐｒｏＡＤＭの前記レベルの減少もしくは同等のレベル、および前記対象の６以下のＳＯＦＡスコアが、前記有害事象が起こらないことを示す、
    約３．２ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルと比較したときの、前記対象のｐｒｏＡＤＭの前記レベルの減少もしくは同等のレベル、および前記対象の７〜１２のＳＯＦＡスコアが、前記有害事象が起こらないことを示す、または
    約５．６ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルと比較したときの、前記対象のｐｒｏＡＤＭの前記レベルの減少もしくは同等のレベル、および前記対象の１３以上のＳＯＦＡスコアが、前記有害事象が起こらないことを示し、
    好ましくは、前記有害事象が、約２８日以内に起こらない、請求項１（ｂ）に記載の方法。
  9. 約１．８ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルと比較したときの、前記対象のｐｒｏＡＤＭの前記レベルの増加、および前記対象の６以下のＳＯＦＡスコアが、前記対象の前記有害事象を示す、
    約３．２ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルと比較したときの、前記対象のｐｒｏＡＤＭの前記レベルの増加、および前記対象の７〜１２のＳＯＦＡスコアは、前記対象の前記有害事象を示す、または
    約５．６ｎｍｏｌ／ＬであるｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルと比較したときの前記対象のｐｒｏＡＤＭの前記レベルの増加、および前記対象の１３以上のＳＯＦＡスコアは、前記対象の前記有害事象を示し、
    好ましくは、前記有害事象が、約２８日以内に起こる、請求項１（ｂ）に記載の方法。
  10. 前記対象の前記ＳＯＦＡスコアが、前記対象のｐｒｏＡＤＭの前記レベルに基づいて増加し、前記修正ＳＯＦＡスコアが、前記有害事象を示す、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記対象が約１．８ｎｍｏｌ／Ｌよりも高いｐｒｏＡＤＭレベルを有する場合、前記対象の前記修正ＳＯＦＡスコアが１点増加する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ｐｒｏＡＤＭの前記レベルの前記増加が、ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルの約２倍である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ｐｒｏＡＤＭが、中間領域プロアドレノメジュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）または成熟ＡＤＭである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記対象のｐｒｏＡＤＭの前記レベルが、２８日以内に起こる前記対象の前記有害事象、好ましくは死亡を示す、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記方法が、前記試料中の少なくとも１つのヒストンのレベル、プロカルシトニン（ＰＣＴ）のレベル、前記対象の単純化急性生理学スコア（ＳＡＰＳＩＩスコア）、クイックＳＯＦＡ（ｑＳＯＦＡ）スコア、急性生理学および慢性健康評価ＩＩ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコア、前記対象の肺炎重症度指数（ＰＳＩ）スコア、および前記対象のＣＵＲＢ−６５スコアからなる群から選択される、前記対象の少なくとも１つのマーカーおよび／またはパラメータを決定することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記マーカーまたは前記パラメータのレベルが、前記対象の入院から約１２時間の間に決定される、請求項１５に記載の方法。
  17. ｐｒｏＡＤＭのレベルが、前記対象の入院から約１２時間の間に決定される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記方法が、前記対象のｐｒｏＡＤＭの前記レベルおよび前記ＳＯＦＡスコアを決定することを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記対象が、疾患または病状を患っている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記対象が、重篤な患者であり、好ましくは前記対象が、集中治療室または救急科に入院する、好ましくは前記対象が、集中治療室に入院する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記対象が、疾患または病状を患っており、前記疾患または病状が、呼吸器疾患、尿路感染症、感染性および非感染性の病因に関連した炎症反応、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック、臓器不全（複数可）、心血管疾患、糖尿病、悪性腫瘍、肝疾患、腎疾患、免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、グラム陰性細菌感染症、グラム陽性細菌感染症、ならびに免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記対象が、敗血症を患っている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記対象が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を患っている対象、放射線療法を受けている対象、および／または免疫抑制薬を受けている対象などの、免疫抑制対象である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記試料が、体液、血液、血漿、血清、または尿である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. ｐｒｏＡＤＭの前述のレベルが、質量分析法（ＭＳ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光および蛍光イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、発光ベースのビーズアレイ、磁気ビーズベースのアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、迅速試験フォーマット、ならびに希土類クリプテートアッセイからなる群から選択される方法を使用して決定される、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記方法が、イムノアッセイであり、前記アッセイが、均一相または不均一相中で実施される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記方法が、
    ａ）前記試料を
    （ｉ）ｐｒｏＡＤＭの第１のエピトープに特異的な第１の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体、および
    （ｉｉ）ｐｒｏＡＤＭの第２のエピトープに特異的な第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と接触させるステップと、
    ｂ）前記第１および第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の、ｐｒｏＡＤＭへの結合を検出するステップと、を含む、イムノアッセイである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記第１または第２の抗体のうちの一方が標識され、他方の抗体が固相に結合する、または固相に選択的に結合することが可能である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記第１の抗体および前記第２の抗体が、液体反応混合物中に分散して存在し、蛍光または化学発光消光または増幅に基づく標識系の一部である第１の標識構成成分が、前記第１の抗体に結合し、前記標識系の第２の標識構成成分が、前記第２の抗体に結合し、これにより、両方の抗体の前記ｐｒｏＡＤＭへの結合が検出された後、前記測定溶液中の得られたサンドイッチ錯体の検出を可能にする測定可能なシグナルが生成される、請求項２７または２８に記載の方法。
  30. 前記標識系が、特にシアニンタイプの蛍光または化学発光染料と組み合わせた希土類クリプテートまたはキレートを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、前記キットが、前記対象の前記試料中のｐｒｏＡＤＭの前記レベルを決定するための検出試薬と、ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルを含む参照データと、を含み、ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルと比較したときの前記対象の前記試料中のｐｒｏＡＤＭの前記レベルの増加が、前記対象の有害事象を示す、キット。
  32. 請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、前記キットが、前記対象の前記試料中のｐｒｏＡＤＭの前記レベルを決定するための検出試薬と、ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルを含む参照データと、を含み、ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルと比較したときの前記対象の前記試料中のｐｒｏＡＤＭの前記レベルの減少またはｐｒｏＡＤＭの同等のレベルが、前記対象の有害事象が約２８日以内に起こらないことを示す、キット。
  33. 請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法における請求項３１または３２に記載のキットの使用。
  34. 対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のための請求項３１または３２に記載のキットの使用であって、
    ｐｒｏＡＤＭの前記レベルが、前記対象の前記試料中で決定され、
    ｐｒｏＡＤＭの前記レベルが、ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルと比較され、
    前記対象の前記有害事象が、前記試料中で決定されたｐｒｏＡＤＭの前記レベルとｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルとの比較に基づき特定される、使用。
  35. 対象の有害事象の診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化のためのキットの使用であって、
    前記キットが、対象の試料中のｐｒｏＡＤＭのレベルを決定するための検出試薬を含み、
    前記ｐｒｏＡＤＭの前記レベルが、前記対象の前記有害事象を示す、使用。
  36. 前記比較が、コンピュータシステムで実施される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記決定されたｐｒｏＡＤＭの値が、前記対象における有害事象の前記診断、予後診断、リスク評価、および／またはリスク層別化を示すスコアの計算に使用される、請求項１〜３０に記載の方法。
  38. 加えて、前記対象の少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメータが、前記スコアの前記計算に使用される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記対象の前記少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメータが、前記試料中の少なくとも１つのヒストンのレベル、プロカルシトニン（ＰＣＴ）のレベル、前記対象の単純化急性生理学スコア（ＳＡＰＳＩＩスコア）、クイックＳＯＦＡ（ｑＳＯＦＡ）スコア、急性生理学および慢性健康評価ＩＩ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコア、前記対象の肺炎重症度指数（ＰＳＩ）スコア、および前記対象のＣＵＲＢ−６５スコアからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
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