BR112019015612A2 - Proadm como marcador que indica um evento adverso - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso, particularmente mortalidade, de um indivíduo. a invenção refere-se a um método que compreende a determinação de um nível de proadrenomedulina (proadm) em uma amostra do dito indivíduo, e em que o dito nível de proadm é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo, em que o dito nível de proadm é comparado com um nível de referência de proadm; e em que o dito evento adverso do dito indivíduo é identificado com base na comparação. a invenção refere-se ainda a kits para realizar os métodos da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROADM
COMO MARCADOR QUE INDICA UM EVENTO ADVERSO.
[0001] A presente invenção refere-se ao diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso, particularmente mortalidade, de um indivíduo. A invenção se refere a um método que compreende a determinação de um nível de pró-adrenomedulina (proADM) na amostra do indivíduo e em que o nível de proADM é indicativo do evento adverso do dito indivíduo e/ou determina um nível de pelo menos uma histona, particularmente histona H2B, H4, H2A e/ou H3, em uma amostra do indivíduo, e em que o nível de pelo menos uma histona é indicativa do evento adverso do dito indivíduo. A invenção se refere ainda a kits para realizar os métodos da invenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] A unidade de terapia intensiva (UTI) em um hospital é geralmente a unidade com os pacientes mais graves e as maiores taxas de mortalidade (Kaneko-Wada Fde, Dominguez-Cherit et al. 2015). É um componente muito caro para qualquer sistema de saúde, principalmente devido às longas estadias na UTI, tecnologias modernas e dispendiosas e a complexidade global de cuidados intensivos (Halpern e Pastores
2010) . Apesar dos elevados esforços da medicina intensiva, as taxas de mortalidade nas UTIs variam de 6,4% até 40%, dependendo da população de paciente analisada e a gravidade de seu estado (Mayr, Dünser et al., 2006). As principais causas de resultado adverso e morte na UTI estão relacionados a órgãos em falência, como a síndrome de disfunção de múltiplos órgãos (SDMO) e a sepse (Vincent 2008; Ferreira e Sakr
2011) . Para o subgrupo de pacientes sépticos, a taxa de mortalidade na Europa é ainda mais elevada, variando entre 27% e 54% (Vincent 2008). [0003] A fim de identificar pacientes de alto risco com eventos/resultados adversas ou fatais (i), para ajudar os médicos nas decisões
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2/150 iniciais após a admissão na UTI (ii), otimizar tratamentos e recursos clínicos (iii) e finalmente diminuir a mortalidade na UTI (iv), o conhecimento sobre parâmetros determinantes como resultados de curto e longo prazo são de alto valor (Mayr, Dunser et al. 2006). Até os dias de hoje, a pontuação de gravidade é usada principalmente para avaliação de risco e gravidade, bem como previsão de resultados de pacientes gravemente enfermos. Os sistemas de pontuação predominantes na UTI são a pontuação da avaliação em saúde da fisiologia aguda e doenças crônicas (APACHE), a pontuação fisiológico agudo simplificado (SAPS) e a pontuação de avaliação de falha de órgãos sequencial (SOFA), com base em 17, 14 ou 6 parâmetros fisiológicos ou específicos do órgão, respectivamente (Bouch e Thompson, 2008). Apesar de sua capacidade de prever o resultado de um paciente, essas pontuações também apresentam várias desvantagens. Por exemplo, cada parâmetro individual das pontuações deve ser analisado e avaliado. Portanto, a determinação dos resultados das pontuações é demorada (> 1 dia), o que é particularmente desvantajoso nos cuidados na UTI, onde os testes rápidos são altamente valorizados. Além disso, essas pontuações dependem da subjetividade de cada clínico avaliador, precisam ser recalibradas frequentemente e dependem de vários parâmetros para serem determinados individualmente.
[0004] Assim, há necessidade de critérios simples, rápidos e objetivos para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso em um indivíduo, particularmente em um paciente gravemente enfermo.
[0005] Portanto, o problema técnico subjacente à invenção é o fornecimento de meios e métodos para fornecer uma maneira rápida e confiável de prever um evento adverso, particularmente um evento fatal, por exemplo, mortalidade/morte de um indivíduo.
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3/150 [0006] O problema técnico é resolvido pela provisão das modalidades no presente documento apresentadas abaixo e conforme caracterizadas nas reivindicações anexas.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [0007] A invenção se refere a um método para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo, em que o dito método compreende determinar um nível de pró-adrenomedulina (proADM) em uma amostra do dito indivíduo e em que o nível de proADM ou o fragmento do mesmo é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo.
[0008] Além disso, a invenção se refere a um método para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo, em que o dito método compreende a determinação de um nível de pelo menos uma histona ou um fragmento do mesmo em uma amostra do dito indivíduo, e em que o dito nível de pelo menos uma histona ou o fragmento do mesmo é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo.
[0009] Além disso, a invenção se refere a um método para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo, em que o dito método compreende determinar um nível de pelo menos uma histona e um nível de pró-adrenomedulina (proADM) e/ou fragmento dos mesmos em uma amostra do dito indivíduo, e em que o dito nível de pelo menos uma histona e o dito nível de proADM e/ou de fragmento (ou fragmentos) são indicativos do dito evento adverso do dito indivíduo. Conforme usado no presente documento, proADM também abrange fragmentos tais como MR-proADM e ADM maduro, a menos que indicado de outra forma.
[0010] A presente invenção resolve o problema técnico acima identificado. Como documentado abaixo e nos exemplos anexos, foi inespe
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4/150 radamente constatado em um estudo clínico que os níveis de pelo menos uma histona, particularmente histona H2B, H4, H2A e H3, e/ou o nível de proADM, particularmente MR-proADM, demonstram uma forte relação estatística com um evento adverso, por exemplo, mortalidade dos indivíduos; consultar o Exemplo Ilustrativo 1. Consequentemente, é relatado documentado no presente documento que a dita pelo menos uma proteína histona e/ou o dito proADM, por exemplo, MR-proADM, pode ser usada como um marcador para a previsão de um evento adverso. Em particular, os exemplos documentam que tais marcadores podem ser empregados para a previsão de um sobrevivente ou não sobrevivente, isto é, mortalidade do indivíduo.
[0011] Nos exemplos anexados, foi surpreendentemente demonstrado que um nível de proADM (particularmente de MR-proADM) do indivíduo menor ou igual a cerca de um nível de referência, por exemplo, cerca de 0,9 nmol/l, indica que o adverso não ocorre dentro de cerca de 28 dias. Um nível de referência de cerca de 0,9 nmol/l de proADM fornece uma sensibilidade de 100% na identificação de não sobreviventes, isto é, um nível abaixo desse limiar identifica com segurança os pacientes que sobreviverão dentro do período de 28 dias. Um nível de referência de cerca de 1,8 nmol/l para proADM também prevê com segurança o evento adverso, por exemplo, mortalidade, nos exemplos anexos. Consequentemente, o nível de proADM indica se o indivíduo sobreviverá ou não, por exemplo, dentro de 28 dias.
[0012] Demonstrou-se ainda que proADM (particularmente MR-proADM) é confiável para discriminar não sobreviventes ou sobreviventes se os indivíduos foram estratificados pela gravidade da doença e/ou afecção, por exemplo, falência de órgãos. O método preditivo funciona em princípio para indivíduos com qualquer número de falhas de órgãos, ou seja, para qualquer pontuação SOFA. A detecção do nível de pro
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ADM (particularmente MR-proADM) permite a identificação de não sobreviventes em todos os grupos de gravidade, ou seja, para qualquer pontuação SOFA. Isso é particularmente importante para os pacientes menos graves (pontuação SOFA <6), uma vez que esse grupo representa a apresentação mais precoce no curso clínico da sepse e/ou a forma menos grave dessa doença no contexto clínico (particularmente na UTI ou na DE). Assim, proADM (particularmente MR-proADM) é um marcador confiável para o manejo precoce da sepse, uma vez que fornece um valor prognóstico rápido e ajuda a orientar as intervenções de diagnóstico e as decisões de tratamento.
[0013] É demonstrado nos exemplos anexos que os indivíduos podem ser classificados em indivíduos menos gravemente doentes (por exemplo, uma pontuação SOFA < 6), indivíduos com doença moderadamente grave (por exemplo, uma pontuação SOFA de 7 a 12) ou indivíduos gravemente doentes (por exemplo, pontuação SOFA > 13). Assim, os indivíduos podem ser classificados com base na pontuação SOFA. O valor preditivo da proADM (particularmente MR-proADM) pode ser melhorado combinando-o com a determinação da pontuação SOFA de um indivíduo. ‘No entanto, o valor preditivo desse marcador é tal que a determinação da pontuação SOFA não é necessária; em outras palavras, em alguns aspectos do método da invenção, o nível de proADM (de preferência, MR-proADM) de um indivíduo é determinado, mas a pontuação SOFA não é determinada. Nos exemplos anexados, foi mostrado que o nível de proADM (particularmente MR-proADM) mostra o melhor desempenho entre os marcadores testados no caso de indivíduos com um baixo grau de gravidade da doença (indivíduos menos gravemente doentes). Tais indivíduos podem ter uma pontuação SOFA de < 6. Em particular, foi demonstrado que o nível de proADM (particularmente MR-proADM) de indivíduos menos gravemente doentes que é inferior ao nível de referência de cerca de 1,8 nmol/l indica que o evento
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6/150 adverso não ocorre, particularmente a mortalidade, em cerca de 28 dias; consultar o Exemplo 2, Tabela 9. Além disso, a proADM também é vantajoso na previsão do evento adverso em comparação com outros marcadores, tais como o lactato, no caso de indivíduos moderadamente graves. Esses indivíduos podem ter uma pontuação SOFA de 7 a 12. Em particular, foi demonstrado que o nível de proADM de indivíduos com doença moderadamente grave que é menor do que o nível de referência de cerca de 3,2 nmol/l indica que o evento adverso não ocorre, particularmente mortalidade, dentro de 28 dias; consultar o Exemplo 2, Tabela 9. Finalmente, o nível de proADM também prevê com segurança um evento adverso de indivíduos gravemente doentes. Em particular, foi demonstrado que o nível de proADM de indivíduos gravemente doentes que é inferior ao nível de referência de 5,6 nmol/l indica que o evento adverso não ocorre, particularmente a mortalidade, em cerca de 28 dias; consultar o Exemplo 2, Tabela 9.
[0014] Consequentemente, o nível de proADM (particularmente MR-proADM) prevê o risco do indivíduo e, assim, ajuda o clínico na decisão de qual terapia é mais adequada. Portanto, o nível de proADM melhora o tratamento do paciente na clínica. Assim, o nível de proADM também pode ser usado no gerenciamento de unidades de terapia intensiva, particularmente para identificar indivíduos que não precisam de cuidados intensivos adicionais, por exemplo, tratamento na UTI ou no Departamento de Emergência (DE). Em particular, um valor de referência de proADM inferior a cerca de 0,9 nmol/l (de preferência 0,88 nmol/l) permite descartar a mortalidade nos 28 dias após a admissão na UTI ou DE. Esse ponto de corte é, portanto, útil para orientar decisões clínicas precoces, quando os sinais clínicos de falência evidente de órgãos ainda não são aparentes. Por isso, o método da invenção pode ser usado para esse propósito. A identificação de indivíduos que não necessitam (mais) de cuidados intensivos (por exemplo, na UTI ou DE),
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7/150 mas podem, por exemplo, ser transferidos para uma enfermaria geral reduz os custos para o portador de custos e libera leitos na UTI ou na DE.
[0015] Em um aspecto específico, o método da invenção é usado para prever a mortalidade ou estratificar indivíduos nos quais os sinais clínicos de falha orgânica ainda não se manifestaram (por exemplo, doentes correspondendo a indivíduos com uma pontuação SOFA baixa tal como < 6, de preferência < 4, com mais preferência < 3).
[0016] Além disso, é mostrado nos exemplos em anexo que o nível de proADM (particularmente MR-proADM) também pode ser usado para modificar a pontuação SOFA do dito indivíduo. Por exemplo, o SOFA pode ser adaptado, por exemplo, aumentado, com base no nível de proADM do dito indivíduo e em que a dita pontuação SOFA modificada é indicativa do dito evento adverso.
[0017] Em particular, a pontuação SOFA do indivíduo pode ser aumentada em um se o indivíduo tiver um nível proADM que é superior a cerca de 1,8 nmol/l. Essa pontuação SOFA modificada melhora ainda mais a previsão; consultar, por exemplo, o Exemplo 2.
[0018] Em vez disso, ou em adição à pontuação SOFA, também pode ser determinada a pontuação SOFA rápida (qSOFA).
[0019] Nos exemplos anexos, é também surpreendentemente demonstrado que o nível de pelo menos uma histona, particularmente H2B, H4, H2A e H3 está fortemente associado ao evento adverso, por exemplo, mortalidade, do indivíduo. Em particular, os exemplos anexos demonstram que os níveis das histonas estão estatisticamente associados ao evento adverso, por exemplo, mortalidade, que ocorre em cerca de 28 dias, cerca de 7 dias ou cerca de 3 dias. Os exemplos anexos revelaram que um aumento do nível do marcador indica que o evento adverso, por exemplo, mortalidade, ocorre no indivíduo; consultar o Exemplo 1 anexo, por exemplo, as Tabelas 1 a 6. Além disso, os níveis
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8/150 das histonas demonstraram estar particularmente correlacionados com eventos adversos curtos, por exemplo, ocorrendo dentro de 7 dias ou 3 dias. Além disso, verificou-se que o nível de pelo menos uma histona em uma amostra de indivíduos que sofriam de doença respiratória estava correlacionado com o evento adverso, por exemplo, mortalidade, ocorrendo dentro de 7 dias; consultar, por exemplo, a tabela 4. Além disso, verificou-se que o nível de pelo menos uma histona em uma amostra dos indivíduos que sofriam de infecção do trato urinário estava correlacionado com o evento adverso, por exemplo, mortalidade, ocorrendo dentro de 28 dias; consultar, por exemplo, a tabela 5. Além disso, verificou-se que o nível de pelo menos uma histona em uma amostra do indivíduo que sofria de malignidades estava correlacionado com o evento adverso, por exemplo, mortalidade, ocorrendo dentro de 28 dias; consultar, por exemplo, a tabela 6.
[0020] Adicionalmente, é também surpreendentemente demonstrado nos exemplos anexos que o nível de proADM, por exemplo, o nível do fragmento de MR-proADM, está fortemente correlacionado com o evento adverso, por exemplo, mortalidade, do indivíduo. Em particular, os exemplos anexos demonstram que o nível de proADM está estatisticamente associado ao evento adverso, por exemplo, mortalidade, ocorrendo dentro de cerca de 28 dias, dentro de cerca de 7 dias ou dentro de cerca de 3 dias; consultar, por exemplo, as Tabelas 2 e 3. Particularmente, os exemplos anexados documentam que o nível de proADM é indicativo do evento adverso, por exemplo, mortalidade, ocorrendo dentro de 28 dias ou ocorrendo dentro de 7 dias; ver, por exemplo, as Tabelas 2 e 3.
[0021 ] Além disso, é documentado nos exemplos anexos que a previsão é melhorada se for determinada uma combinação dos níveis dos marcadores. Em particular, a determinação do nível de pelo menos uma histona adicionalmente ao nível de proADM melhorou ainda mais o
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9/150 prognóstico do evento adverso, por exemplo, mortalidade; consultar as tabelas 1 a 3. É documentado nos exemplos anexos que a determinação de um nível de outro marcador e/ou parâmetro adicionalmente ao nível de pelo menos uma histona ou de proADM melhora ainda mais a previsão do evento adverso, por exemplo, mortalidade; consultar as tabelas ilustrativas 1 a 3. Por exemplo, é demonstrado nos exemplos anexos que a determinação de uma pontuação clínica também melhora a previsão com base no nível de proADM ou histonas. Além disso, a determinação do nível de um biomarcador, como a aldolase B, melhora a previsão com base no nível de proADM ou histonas. Consequentemente, a invenção também se refere a um método que compreende a determinação do nível de um outro marcador e/ou parâmetro, isto é, o uso de painéis de marcadores.
[0022] A presente invenção tem, entre outras, as seguintes vantagens sobre os métodos convencionais: os métodos da invenção e os kits são rápidos, objetivos, fáceis de usar e precisos para a previsão de um evento adverso: Os métodos e kits da invenção referem-se a marcadores que são facilmente mensuráveis na rotina em hospitais porque os níveis de histonas e de proADM podem ser determinados em amostras de sangue rotineiramente obtidas ou outros fluidos biológicos obtidos a partir de um indivíduo. Adicionalmente, a determinação dos níveis das histonas ou proADM é muito rápida. Consequentemente, os métodos e os kits da invenção são adequados para uma avaliação rápida e diagnóstico e prognóstico de um evento adverso, por exemplo, mortalidade. Assim, a determinação rápida também é adequada para uma decisão de tratamento rápido, evitando ou reduzindo o risco de ocorrência do evento adverso. Além disso, devido ao resultado simples de uma medição de biomarcador como um valor específico, não há viés subjetivo da equipe médica ao usar esse método ou os kits da invenção. Desse modo, a reprodutibilidade é melhorada em comparação com a
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10/150 pontuação subjetiva para parâmetros fisiológicos como, por exemplo, empregada na pontuação SOFA. O nível da histona ou da proADM também pode ser combinado com outro marcador (ou marcadores) e/ou parâmetro (ou parâmetros), por exemplo, pontuações clínicas, coma pontuação SOFA, a fim de melhorar ainda mais a previsão e adaptar a análise às sensibilidades e especificidades para avaliar o estado geral de pacientes doentes críticos.
[0023] Consequentemente, os métodos e kits fornecidos no presente documento são vantajosos no diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso que ocorra, por exemplo, mortalidade/morte de um indivíduo.
[0024] Conforme documentado no presente documento acima e nos exemplos anexos, verificou-se surpreendentemente que o nível de histonas e o nível de proADM se correlacionam com um evento adverso, tal como mortalidade, em indivíduos. Consequentemente, a invenção se refere a métodos e kits para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco do evento adverso, particularmente mortalidade, de um indivíduo. Além disso, a invenção se refere a métodos e kits para monitoramento, orientação terapêutica e/ou controle de terapia de indivíduos, em que o nível de pelo menos uma histona e/ou de proADM é indicativo do evento adverso, particularmente mortalidade. As definições fornecidas acima e abaixo no presente documento também se aplicam a esses aspectos.
[0025] Em particular, a invenção se refere a um modo para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso, particularmente mortalidade, de um indivíduo, em que o dito modo compreende [0026] (i) determinar um nível de pelo menos uma histona em uma amostra do dito indivíduo, e em que o dito nível de pelo menos uma histona é indicativo do dito evento adverso, particularmente mortalidade,
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11/150 do dito indivíduo; e/ou [0027] (ii) determinar um nível de pró-adrenomedulina (proADM) em uma amostra do dito indivíduo, e em que o dito nível de proADM é indicativo do dito evento adverso, particularmente mortalidade, do dito indivíduo.
[0028] Conforme usado no presente documento, o termo determinar o nível de pelo menos uma histona ou similares se refere à determinação de um nível de uma histona ou um fragmento da mesma em uma amostra do indivíduo ou à determinação de um nível de mais do que uma histona ou seus fragmentos na amostra do indivíduo. Particularmente, determinar o nível de pelo menos uma histona pode se referir à determinação de um nível de histona na amostra do indivíduo, em que preferencialmente a histona é selecionada a partir do grupo que consiste em histona H2B, H4, H2A e H3. Particularmente, o nível da histona H2B é determinado. Além disso, determinar o nível de pelo menos uma histona pode se referir à determinação de um nível de uma histona na amostra do indivíduo, em que é particularmente determinado o nível da histona H4. Adicionalmente, determinar o nível de pelo menos uma histona pode se referir a determinar um nível de duas histonas na amostra do indivíduo, em que de preferência os níveis das histonas H2B e H4 são determinados. Além disso, determinar o nível de pelo menos uma histona pode se referir à determinação de um nível de três histonas na amostra do indivíduo, em que preferencialmente os níveis das histonas H2B, H4 e H2A são determinados. Além disso, determinar o nível de pelo menos uma histona pode se referir à determinação de um nível de quatro histonas na amostra do indivíduo, em que preferencialmente os níveis das histonas H2B, H4, H2A e H3 são determinados. [0029] Consequentemente, no contexto da presente invenção, determinar o nível de pelo menos uma histona pode se referir a determinar um nível de histona H2B, um nível de histona H4, um nível de histona
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H2A e/ou um nível de histona H3.
[0030] Em particular, o termo determinar o nível de pelo menos uma histona ou similar pode se referir a determinar um nível de uma histona na amostra do indivíduo. Consequentemente, a invenção também se refere a um método para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco, estratificação de risco e/ou monitoramento de um evento adverso de um indivíduo, em que o dito método compreende determinar um nível de histona ou de um fragmento da mesma em uma amostra do dito indivíduo e em que o dito nível de uma histona ou o dito fragmento da mesma é indicativo do dito evento adverso, particularmente mortalidade.
[0031] Conforme usado no presente documento, histona ou proteína de histona ou proteínas de histonas se refere à histona (ou histonas) canônica, tais como H1, H2A, H2B, H3 ou H4, bem como variante (ou variantes) de histona, tal como H3.3, H2A.Z etc. ou fragmento (ou fragmentos) das mesmas. As histonas formam a partícula de octâmero em torno da qual o DNA é envolvido para montar a estrutura da cromatina (Luger, Nature. 18 de setembro de 1997; 389 (6648): 251 a 260). Por exemplo, as proteínas de histonas H2A, H2B, H3 e H4 (duas de cada) formam um octâmero que é envolvido por 165 pares de bases de DNA para formar a subunidade fundamental da cromatina, o nucleossoma. As histonas também são detectadas fora do núcleo em múltiplos processos fisiopatológicos (documento n° WO 2009/061918). A presença de histonas extracelulares foi descrita no sangue de pacientes que sofrem de diferentes etiologias que envolvem processos inflamatórios. A liberação de histona de células imunes ativadas pode ser mediada por armadilhas extracelulares. Neutrófilos ativados, como um mecanismo final de controle e limpeza de uma infecção podem liberar fibras extracelulares chamadas de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) (Brinkmann V., et al. Science 2004; 303 (5663): p. 1.532 a
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1.535). Outros mecanismos pelos quais as histonas podem ser liberadas na corrente sanguínea do paciente incluem apoptose, necrose, piroptose ou necroptose das células.
[0032] Em particular, a pelo menos uma histona é selecionada a partir do grupo que consiste em H2B, H4, H2A e H3. Consequentemente, o nível da histona a ser determinado nos métodos e kits da invenção é particularmente um nível das histonas H2B, H4, H2A e/ou H3. As sequências das histonas são conhecidas pelos indivíduos versados na técnica. Sequências exemplificativas das histonas são dadas nas SEQ ID NOs: 1 a 4. A sequência de aminoácidos exemplificativa da histona H4 é fornecida na SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos exemplificativa da histona H2A é fornecida na SEQ ID NO: 2. A sequência exemplificativa de aminoácidos da histona H3 dada na SEQ ID NO:
3. A sequência exemplificativa de aminoácidos da histona H2B é fornecida na SEQ ID NO: 4. Particularmente, a pelo menos uma histona é selecionada a partir do grupo que consiste em H2B, H4, H2A e H3. Mais particularmente, a pelo menos uma histona é selecionada a partir do grupo que consiste em H2B, H4 e H2A. Mais particularmente, a pelo menos uma histona é H2B e H4. Mais particularmente, a pelo menos uma histona é H2B ou H4.
[0033] Entende-se que determinar o nível de pelo menos uma histona ou similar se refere à determinação do nível de pelo menos uma histona ou um fragmento da mesma pelo menos uma histona na amostra. Em particular, o nível das histonas H2B, H4, H2A e/ou H4 é determinado na amostra. Consequentemente, a pelo menos uma histona determinada na amostra pode ser uma histona livre ou pelo menos uma histona determinada na amostra pode ocorrer e pode ser montada em um complexo macromolecular, por exemplo, no octâmero, nucleossoma e/ou NETs. Consequentemente, o nível de pelo menos uma histona na
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14/150 amostra pode compreender o nível de proteína de histona livre e/ou proteína de histona montada em um complexo macromolecular.
[0034] Em aspectos particulares da invenção, um nível de uma histona ou um fragmento da mesma pode ser determinado na amostra que não é montada em um complexo macromolecular, tal como um nucleossoma, octâmero ou uma armadilha extracelular de neutrófilos (NET). Tal histona (ou histonas) é denominada no presente documento de histona (ou histonas) livre. Consequentemente, o nível de pelo menos uma histona pode ser particularmente um nível de pelo menos uma histona livre. [0035] O nível de tais histonas livres pode ser determinado pela detecção de sequências de aminoácidos ou epítopos estruturais de histonas que não estão acessíveis em um complexo macromolecular estequiométrico montado, como um mononucleossoma ou um octâmero. Em tais estruturas, determinadas regiões das histonas são cobertas e são, portanto, estericamente inacessíveis, conforme mostrado para as armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), (Brinkmann V., et al, Science 303 (5663):. p. 1.532 a 1.535, 2004). Além disso, no octâmero ou no nucleossoma, as regiões das histonas também participam de interações intramoleculares, assim como entre as histonas individuais. Consequentemente, a região/peptídeo/epítopo da histona que é determinada no contexto da invenção pode determinar se a histona é uma histona livre ou uma histona que é montada em um complexo macromolecular. Por exemplo, em um método baseado em imunoensaios, os anticorpos usados podem não detectar histonas, por exemplo, H4, quando são parte do núcleo octamérico dos nucleossomas, uma vez que os epítopos são estruturalmente inacessíveis. A seguir, são exemplificadas regiões/peptídeos/epítopos da histona que podem ser empregados para determinar uma histona livre. Por exemplo, regiões/peptídeos/epítopos da cauda terminal N ou terminal C das histonas podem ser empregados para determinar as histonas independentemente de estarem montadas
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15/150 no complexo macromolecular ou serem histonas livres de acordo com a presente invenção.
[0036] Entende-se que a determinação de histonas pode incluir proteínas histonas modificadas pós-tradução. Consequentemente, as modificações pós-tradução podem compreender desacetilação ou acetilação, fosforilação, metilação, ubiquitilação e citrulinação de aminoácidos. [0037] Estequiométrico nesse contexto se refere a complexos intactos, por exemplo, um mononucleossoma ou um octâmero. Proteínas de histonas livres também podem compreender histonas não ligadas à cromatina. Por exemplo, proteínas de histonas livres podem também compreender proteínas de histonas individuais ou complexos de histona não octaméricos. As histonas livres podem (por exemplo, transitoriamente) ser ligadas a histonas individuais, por exemplo, as histonas podem formar homo ou heterodímeros. As histonas livres podem também formar homo ou heterotetrâmeros. O homo ou heterotetrâmero pode consistir em quatro moléculas de histonas, por exemplo, H2A, H2B, H3 e/ou H4. Um heterotetrâmero típico é formado por dois heterodímeros, em que cada heterodímero consiste em H3 e H4. É também compreendido no presente documento que um heterotetrâmero pode ser formado por H2A e H2B. É considerado também no presente documento que um heterotetrâmero pode ser formado por um heterodímero que consiste em H3 e H4 e um heterodímero que consiste em H2A e H2B. Portanto, as histonas livres são denominadas no presente documento e podem ser proteínas histonas monoméricas, heterodiméricas ou tetraméricas que não são montadas em um complexo macromolecular (estequiométrico) que consiste no octâmero de histona ligado ao ácido nucleico, por exemplo, um nucleossoma. Além disso, as histonas livres podem também estar ligadas a ácidos nucleicos, e em que as referidas histonas livres não são montadas em um complexo macromolecular (estequio
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16/150 métrico), por exemplo, um nucleossoma intacto. De preferência, a histona (ou histonas) livre estão essencialmente isentas de ácidos nucleicos.
[0038] O fragmento de pelo menos uma histona pode ter qualquer comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50 ou 100 aminoácidos, desde que o fragmento permita a determinação inequívoca do nível da histona particular. O fragmento de pelo menos uma histona se refere a um fragmento independente das histonas, por exemplo, das histonas H2B, H4, H2A e H3. Vários fragmentos exemplares das histonas são revelados no presente documento abaixo que são adequados para determinar o nível da histona na amostra do indivíduo. É compreendido também no presente documento que o nível das histonas pode ser determinado pela determinação de um fragmento que abrange a cauda terminal N ou terminal C das histonas. Além disso, a histona ou o fragmento do mesmo a ser determinado no contexto da presente invenção também pode ser modificado, por exemplo, por modificação pós-traducional. Modificações pós-traducionais exemplificativas podem ser acetilação, citrulinação, desacetilação, metilação, desmetilação, desiminação, isomerização, fosforilação e ubiquitinação.
[0039] Conforme usado no presente documento, o termo pró-adrenomedulina ou proADM se refere à pró-adrenomedulina ou um fragmento da mesma, particularmente MR-proADM. Entende-se que determinar o nível de proADM ou similar se refere à determinação de proADM ou de um fragmento da mesma. O fragmento pode ter qualquer comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50 ou 100 aminoácidos, desde que o fragmento permita a determinação inequívoca do nível do proADM. Em particular, aspectos preferenciais da invenção, determinar o nível de proADM se refere à determinação do nível de pró-adrenomedulina mesoregional (MR-proADM). O MRproADM é um fragmento do proADM. O peptideo adrenomedulina
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17/150 (ADM) foi revelado como um peptídeo hipotensivo que compreende 52 aminoácidos que haviam sido isolados de um fenocromocitoma humano (Kitamura et al., 1993). A adrenomedulina (ADM) é codificada como um peptídeo precursor que compreende 185 aminoácidos (pré-proadrenomedilina ou pré-proADM). Uma sequência de aminoácidos exemplificativa de ADM é dada na SEQ ID NO: 5. A ADM compreende as posições 95 a 146 da sequência de aminoácidos pré-proADM e é um produto de splicing da mesma. Pró-adrenomedulina (proADM) se refere a pré-proADM sem a sequência de sinal (aminoácidos 1 a 21), isto é, aos resíduos de aminoácidos 22 a 285 de pré-proADM. Pró-adrenomedulina mesoregional (MR-proADM) se refere aos aminoácidos 42 a 95 da pré-proADM. Uma sequência de aminoácidos exemplificativa de MR-proADM é dada na SEQ ID NO: 6. É também proposto no presente documento que um peptídeo e fragmento do mesmo de pré-proADM ou MR-proADM podem ser usados para os métodos descritos no presente documento. Por exemplo, o peptídeo ou o fragmento do mesmo pode compreender os aminoácidos 22 a 41 de pré-proADM (peptídeo PAMP) ou aminoácidos 95 a 146 de pré-proADM (adrenomedulina madura). Um fragmento do terminal C da proADM (aminoácidos 153 a 185 da preproADM) é denominado adrenotensina. Os fragmentos dos peptídeos proADM ou fragmentos de MR-proADM podem compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 5, 10, 20, 30 ou mais aminoácidos. Consequentemente, o fragmento de proADM pode, por exemplo, ser selecionado a partir do grupo que consiste em MR-proADM, PAMP, adrenotensina e adrenomedulina madura, preferencialmente no presente documento o fragmento é MR-proADM.
[0040] É proposto também no presente documento que os polipeptídeos podem ser determinados, os quais têm uma identidade de sequência com proADM ou com pelo menos uma histona. Por exemplo,
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18/150 os polipeptídeos podem ser determinados nos métodos e kits da invenção que têm pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5 ou 6, ou respectivamente com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, em que os valores mais altos de identidade de sequência são preferenciais. De acordo com a presente invenção, os termos identidade de sequência, homologia ou homologia percentual ou idêntica ou identidade em porcentagem ou identidade percentual no contexto de duas ou mais sequências de aminoácidos se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou que têm uma porcentagem especificada de aminoácidos que são iguais, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima sobre a janela de comparação (preferencialmente em todo o comprimento), ou sobre uma região designada medida com o uso de um algoritmo de comparação de sequências como conhecido na técnica, ou por alinhamento manual e inspeção visual. Sequências que têm, por exemplo, 70% a 90% ou mais (preferencialmente 95% ou mais) de identidade de sequência podem ser consideradas como substancialmente idênticas. Tal definição também se aplica ao complemento de uma sequência de teste. De preferência, a identidade descrita existe em uma região que tem pelo menos cerca de 10 a cerca de 15 aminoácidos de comprimento, com mais preferência, em uma região que tem pelo menos cerca de 20 a cerca de 35 aminoácidos de comprimento, com mais preferência ao longo de todo o comprimento. Os versados na técnica saberão determinar a porcentagem de identidade entre sequências com o uso, por exemplo, de algoritmos como os baseados no programa de computador CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4.673 a 4680) ou FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237 a 245), conforme conhecido na técnica.
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19/150 [0041] Conforme usado no presente documento, o nível do marcador se refere à quantidade da entidade molecular do marcador na amostra. Em outras palavras, a concentração do marcador é determinada na amostra. Por exemplo, a concentração de proADM ou de um fragmento da mesma, de preferência MR-proADM e/ou a concentração das histonas H2B, H4, H3 e/ou H2A ou fragmento (ou fragmentos) da mesma é determinada na amostra do indivíduo.
[0042] Conforme usado no presente documento, o termo nível de pelo menos uma histona se refere à quantidade da entidade molecular da pelo menos histona, por exemplo, a quantidade de H2B, H4, H2A e/ou H3, ou um fragmento da mesma em uma amostra que é obtida a partir do indivíduo. Em outras palavras, a concentração da pelo menos uma proteína histona ou fragmento da mesma é determinada na amostra.
[0043] Conforme usado no presente documento, o termo nível do marcador pró-adrenomedulina (proADM) ou o nível do marcador próadrenomedulina (proADM) ou fragmento da mesma se refere à quantidade da entidade molecular do marcador pró-adrenomedulina ou seus fragmentos em uma amostra que é obtido a partir de um indivíduo. Em outras palavras, a concentração do marcador é determinada na amostra. Assim, o termo nível do marcador pró-adrenomedulina mesoregional (MR-proADM) se refere à quantidade da entidade molecular do marcador pró-adrenomedulina mesoregional (MR-proADM) na amostra que é obtida de um indivíduo. Conforme descrito acima, é proposto também no presente documento que um fragmento de pró-adrenomedulina (proADM), preferencialmente MR-proADM, pode ser detectado e quantificado. Além disso, fragmentos de MR-proADM podem ser detectados e quantificados. Métodos adequados para determinar o nível de proADM ou um fragmento do mesmo (de preferência MR-proADM) ou para determinar o nível de pelo menos uma histona ou fragmento da mesma
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20/150 são descritos no presente documento abaixo.
[0044] Conforme usado no presente documento, o evento adverso significa uma condição/estado de saúde do indivíduo que é ou será uma ameaça à vida. Consequentemente, o evento adverso se refere a uma deterioração crítica da condição/estado de saúde do indivíduo em comparação com uma condição de saúde anterior do mesmo indivíduo, por exemplo, diagnosticado e confirmado, por exemplo, cerca de 28 dias, 14 dias, 7 dias, 3 dias, 1 dia, 12 horas, 5 horas, 1 hora ou menos antes da deterioração; ou em comparação com o estado de saúde de indivíduos que sofrem de (a) doença (ou doenças) similar ou condição (ou condições) médica, ou seja, a progressão da doença (ou doenças) ou distúrbio (ou distúrbios) médico é ou se torna uma ameaça à vida no indivíduo testado. O evento adverso também pode se referir a uma deterioração crítica da condição/estado de saúde do indivíduo em comparação com a condição de saúde de indivíduos saudáveis. Entende-se no presente documento que uma deterioração crítica da condição/estado de saúde, uma condição/estado de ameaça à vida do indivíduo ou progressão ameaçadora da vida pode significar que o indivíduo está em risco de morrer, isto é, o resultado fatal do indivíduo é provável. Uma deterioração crítica, condição/estado crítico de saúde ou condição/estado de saúde que ameaça à vida pode ser avaliado/diagnosticado por pontuações clínicas, por exemplo, a pontuação SOFA. Por exemplo, uma pontuação SOFA acima de 14 indica um estado de saúde muito grave, indicando um estado crítico de saúde do indivíduo. Uma pontuação SOFA entre 0 e 6 indica um estado de saúde menos grave e uma pontuação SOFA de 7 a 14 indica um estado de saúde grave. Por exemplo, o estado de saúde do indivíduo pode deteriorar-se criticamente devido à disfunção orgânica, disfunção de múltiplos órgãos, (a) doença (ou doenças) ou distúrbio (ou distúrbios) médico, como uma infecção. Con
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21/150 sequentemente, o termo evento adverso pode se referir a uma disfunção de órgão, disfunção de múltiplos órgãos, uma doença ou condição médica, como uma infecção, que é ou será uma ameaça à vida. Por exemplo, disfunção de órgãos ou disfunção de múltiplos órgãos pode levar à tal deterioração crítica e, portanto, o termo evento adverso também pode se referir à disfunção de órgãos ou disfunção de múltiplos órgãos, particularmente falência de órgãos ou falência múltipla de órgãos. Por exemplo, uma doença ou distúrbio médico pode levar à tal deterioração crítica e, portanto, o termo evento adverso também pode se referir a (a) doença (ou doenças) ou distúrbio (ou distúrbios) médico, em que a dita doença (ou doenças) ou distúrbio (ou distúrbios) médico pode significar doença (ou doenças) ou distúrbio (ou distúrbios) médico que ameaçam a vida. O indivíduo também pode sofrer de (a) doença (ou doenças) e/ou distúrbio (ou distúrbios) médico e o evento adverso em tal cenário é a condição quando a progressão da(s) doença (ou doenças) ou distúrbio (ou distúrbios) médico se torna ameaça à vida, isto é, o evento adverso também pode se referir a uma progressão da doença ou do distúrbio que ameace a vida. Uma doença ou distúrbio pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em doença respiratória, infecção do trato urinário, uma resposta inflamatória relacionada com etiologias infecciosas e não infecciosas, síndrome da resposta inflamatória cística (SIRS), sepse, sepse grave, choque séptico, falha de órgão (ou órgãos), doença cardiovascular, doença hematológica, coagulação disseminada, diabetes mellitus, malignidade, doença hepática, doença renal, imunodepressão, infecção viral, infecção fúngica, infecção bacteriana, infecção bacteriana gram-negativa, infecção bacteriana gram-positiva, infecção abdominal e imunossupressão. A doença também pode ser (uma) infecção (ou infecções). Em aspectos particulares, o indivíduo sofre de uma infecção viral, infecção fúngica, infecção bacteriana, infecção bacteriana gram-negativa e/ou infecção bacteriana gram-positiva. A
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22/150 doença respiratória também pode se referir a uma infecção respiratória (como Pneumonia Adquirida na Comunidade (PAC) ou infecções do trato respiratório inferior (ITRI)). Em um aspecto muito particular, o indivíduo sofre de uma infecção fúngica.
[0045] Conforme usado no presente documento, o termo indivíduo imunossuprimido se refere a um indivíduo com um sistema imunitário suprimido em comparação com pelo menos um indivíduo saudável. Tal imunossuprimido pode sofrer por causa do vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou pode ser um indivíduo submetido à radioterapia e/ou que está recebendo fármacos imunossupressores.
[0046] De preferência, os indivíduos sofrem de sepse grave ou choque séptico, de preferência baseados na definição do SEPSIS-2 pela Conferência de Consenso do American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine.
[0047] Em aspectos particulares da invenção, o evento adverso é a mortalidade. Em outras palavras, o evento adverso é a morte do indivíduo em aspectos particulares da invenção. Assim, o termo evento adverso significa particularmente mortalidade ou morte. Conforme usado no presente documento, mortalidade significa que o indivíduo morre, isto é, o resultado fatal. Consequentemente, os métodos e kits da invenção determinam/preveem se o indivíduo morrerá e/ou se o indivíduo está em risco de morrer.
[0048] Conforme usado no presente documento, o termo geral disfunção orgânica também pode significar que mais de um órgão tem uma disfunção, isto é, pode também se relacionar com disfunções orgânicas, a menos que indicado de outra forma. O termo disfunção orgânica ou disfunções orgânicas se refere a uma afecção no indivíduo em que um órgão ou mais de um órgão não desempenha sua função normal em comparação com um órgão não afetado, como por exemplo o órgão (ou órgãos) de pelo menos um indivíduo saudável. Por exemplo,
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23/150 o órgão (ou órgãos) pode ter uma atividade reduzida ou o órgão (ou órgãos) pode estar anormalmente ativo no indivíduo com a disfunção orgânica em comparação com um órgão (ou órgãos) de pelo menos um indivíduo saudável. De preferência, o órgão (ou órgãos) com disfunção (ou disfunções) de órgão pode ter uma redução ou aumento na atividade de pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100% ou 200% em comparação com o órgão (ou órgãos) não afetado, por exemplo, de pelo menos um indivíduo saudável. Em particular, a disfunção (ou disfunções) orgânica pode resultar em falha do órgão (ou órgãos). Consequentemente, disfunção (ou disfunções) orgânica pode preferencialmente se referir também à falência de órgão (ou órgãos). Falha de órgão (ou órgãos) se refere à disfunção (ou disfunções) de órgãos a um grau tal que a homeostase normal não pode ser mantida, por exemplo, sem intervenção clínica externa. A falha de órgão (ou órgãos) também pode se referir à disfunção de órgão (ou órgãos) de tal forma que a homeostase normal do órgão (ou órgãos) não possa ser mantida, por exemplo, sem intervenção clínica externa. Falha do órgão (ou órgãos) pode também se referir a (uma) disfunção de órgão (ou órgãos) a um grau tal que a homeostase normal do indivíduo não pode ser mantida, por exemplo, sem intervenção clínica externa. Em aspectos particulares da invenção, a disfunção orgânica é uma falha de órgãos ou pelo menos a falha de um órgão. O termo geral falência de órgãos também pode significar que mais de um órgão tem uma falha, isto é, também pode se relacionar a falhas de órgãos, a menos que indicado de outra forma. Entende-se no presente documento que as disfunções orgânicas também podem ser denominadas disfunção de múltiplos órgãos. É compreendido no presente documento que as falhas nos órgãos também podem ser denominadas falência múltipla de órgãos. Disfunções de órgãos ou falhas de órgãos exemplificativas são choque circulatório, falha hematológica, falha hepática, falha neurológica, falha renal,
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24/150 falha respiratória e acidose metabólica. Consequentemente, no contexto da invenção, a disfunção de órgão ou a pelo menos uma disfunção pode ser preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em choque circulatório, falha hematológica, falha hepática, falha neurológica, falha renal, falha respiratória e acidose metabólica. Entende-se no presente documento que o indivíduo pode também ter mais do que uma disfunção de órgão ou falhas que são, por exemplo, uma combinação de duas, três, quatro disfunções de órgãos selecionadas a partir do grupo que consiste em choque circulatório, falha hematológica, falha hepática, falha neurológica, falha renal, falha respiratória e acidose metabólica.
[0049] Em aspectos particulares da invenção, o nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM, particularmente MR-proADM, é indicativo do dito evento adverso ocorrendo dentro de cerca de 28 dias. Conforme usado no presente documento, o termo o evento adverso que ocorre dentro significa que o indivíduo provavelmente, irá ou está experimentando/vivenciando/ sofrendo com o evento adverso dentro daquele período de tempo particular.
[0050] Conforme usado no presente documento, o termo evento adverso não ocorre significa que o evento não acontece, por exemplo, dentro de 28 dias. Por exemplo, a morte do indivíduo não ocorre dentro desse intervalo de tempo. Consequentemente, isso indica que o indivíduo sobrevive, por exemplo, dentro de cerca de 28 dias.
[0051] O nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM, particularmente MR-proADM, é também indicativo do dito evento adverso ocorrer dentro de 28 dias, cerca de 25 dias, cerca de 20 dias, cerca de 15 dias, cerca de 14 dias, cerca de 13 dias, cerca de 12 dias, cerca de 11 dias, cerca de 10 dias, cerca de 9 dias, cerca de 8 dias, cerca de 7 dias, cerca de 6 dias, cerca de 5 dias, cerca de 4 dias, cerca de 3 dias, cerca de 2 dias ou cerca de 1 dia. O nível de pelo menos uma
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25/150 histona e/ou o nível de proADM, particularmente MR-proADM, também pode ser indicativo do dito evento adverso ocorrer dentro de 14 dias. Particularmente, o nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM, particularmente MR-proADM, pode também ser indicativo do dito evento adverso ocorrer dentro de 7 dias. Particularmente, o nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM, particularmente MR-proADM, pode também ser indicativo do dito evento adverso ocorrer dentro de 3 dias.
[0052] Em aspectos preferenciais particulares da invenção, o nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM, particularmente MR-proADM, é indicativo de mortalidade do indivíduo que ocorre dentro de cerca de 28 dias. O nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM, particularmente MR-proADM, também pode ser indicativo de mortalidade que ocorre dentro de 28 dias, cerca de 25 dias, cerca de 20 dias, cerca de 15 dias, cerca de 14 dias, cerca de 13 dias, cerca de 12 dias, cerca de 11 dias, cerca de 10 dias, cerca de 9 dias, cerca de 8 dias, cerca de 7 dias, cerca de 6 dias, cerca de 5 dias, cerca de 4 dias, cerca de 3 dias, cerca de 2 dias ou cerca de 1 dia. O nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM, particularmente MR-proADM, também pode ser indicativo de mortalidade que ocorre dentro de 14 dias. Particularmente, o nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM, particularmente MR-proADM, também pode ser indicativo de mortalidade que ocorre dentro de 7 dias. Particularmente, o nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM, particularmente MR-proADM, também pode ser indicativo de mortalidade que ocorre dentro de 3 dias.
[0053] Em aspectos preferenciais da invenção, o dito nível de MRproADM do dito indivíduo é indicativo do evento adverso, particularmente mortalidade, do dito indivíduo que ocorre dentro de cerca de 28 dias ou que ocorre dentro de cerca de 7 dias.
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26/150 [0054] Em aspectos particulares da invenção, o nível de pelo menos uma histona é indicativo do evento adverso, particularmente mortalidade, que ocorre dentro de cerca de 7 ou, preferencialmente dentro de cerca de 3 dias. Particularmente, o nível de H2B é indicativo do evento adverso que ocorre dentro de cerca de 7 ou preferencialmente dentro de cerca de 3 dias.
[0055] Em aspectos particulares da invenção, o nível de pelo menos uma histona é indicativo do evento adverso, particularmente mortalidade, que ocorre dentro de cerca de 7 ou, preferencialmente dentro de cerca de 3 dias. Particularmente, o nível de H4 é indicativo do evento adverso que ocorre dentro de cerca de 7 ou preferencialmente dentro de cerca de 3 dias.
[0056] Em aspectos particulares da invenção, o nível de pelo menos uma histona e o nível de proADM são indicativos do evento adverso, particularmente mortalidade, do dito indivíduo que ocorre dentro de 28 dias.
[0057] O termo indicativo do dito evento adverso significa que o indivíduo tem ou provavelmente irá experimentar/vivenciar/sofrer do dito evento adverso, por exemplo, mortalidade. Portanto, o nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM do indivíduo indica o evento adverso, por exemplo, mortalidade do indivíduo.
[0058] O método da invenção também se refere a um método, em que um nível de pelo menos uma histona é determinado em uma amostra de um indivíduo, em que o dito nível de pelo menos uma histona é comparado com um nível de referência de pelo menos uma histona e em que o dito nível de pelo menos uma histona é indicativo do dito evento adverso.
[0059] De preferência, a invenção também se refere a um método, em que um nível de pró-adrenomedulina (proADM), particularmente MR-proADM, é determinado em uma amostra de um indivíduo, em que
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27/150 o dito nível de proADM, particularmente MR-proADM, é comparado com um nível de referência de proADM e em que o dito nível de proADM, particularmente MR-proADM, é indicativo do dito evento adverso.
[0060] O método também se refere a um método, em que um nível de pelo menos uma histona é determinado e em que um nível de próadrenomedulina (proADM), particularmente MR-proADM, é determinado em uma amostra de um indivíduo, em que o dito nível de pelo menos uma histona é comparado com um nível de referência de pelo menos uma histona, e em que o dito nível de proADM é comparado com um nível de referência de proADM e em que o dito evento adverso no dito indivíduo é identificado com base na etapa de comparação.
[0061 ] Conforme usado no presente documento, o termo é comparado com um nível de referência de pelo menos uma histona ou variantes gramaticais dos mesmos significa que o nível de pelo menos uma histona do indivíduo é comparado com um nível de referência de pelo menos uma histona. Assim, um nível da histona do indivíduo é comparado a um nível de referência correspondente da mesma histona. Por exemplo, o nível da histona H2B determinado na amostra do indivíduo é comparado com um nível de referência de histona H2B. Isso se aplica após devidas alterações às outras histonas. O nível de referência de pelo menos uma histona é particularmente um nível de histona H2B, um nível de histona H4, um nível de histona H2A e/ou um nível de histona H3.
[0062] Conforme usado no presente documento, o termo é comparado com um nível de referência de proADM ou suas variantes gramaticais significa que o nível da proADM do indivíduo é comparado com um nível de referência do proADM. Se for determinado um nível de (um) fragmento (ou fragmentos) da pelo menos uma histona e/ou do proADM, o nível de referência também pode ser um nível do fragmento (ou fragmentos) correspondente.
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28/150 [0063] Conforme usado no presente documento, o nível de referência pode refletir um nível normal do marcador correspondente que é indicativo de nenhum evento adverso em aspectos preferenciais da invenção. Consequentemente, tal nível de referência reflete um nível normal do marcador correspondente que não indica uma condição de ameaça à vida ou particularmente morte/mortalidade do indivíduo. Consequentemente, o nível de referência pode ser um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM de pelo menos um indivíduo de referência e em que o indivíduo (ou indivíduos) de referência não tem evento adverso dentro de 28 dias, de preferência dentro de cerca de 14 dias, mais preferencialmente dentro de cerca de 7 dias ou particularmente preferencialmente dentro de cerca de 3 dias.
[0064] O nível de referência pode representar o nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM de um grupo de indivíduos saudáveis (por exemplo, uma coorte). Consequentemente, o nível de referência é de preferência um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM, particularmente MR-proADM de indivíduos saudáveis. Um indivíduo saudável é um indivíduo sem doença e/ou distúrbio diagnosticado (e confirmado). Os indivíduos saudáveis podem, de preferência, ter órgãos normalmente funcionais, isto é nenhuma disfunção (ou disfunções) de órgão ou nenhuma falha (ou falhas) de órgão e/ou nenhuma doença (ou doenças) diagnosticada tal como aquelas descritas acima. Consequentemente, o nível (ou níveis) de referência pode ser um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM que é determinado em amostras de indivíduos saudáveis. Os indivíduos de referência ou indivíduos saudáveis são no presente documento preferencialmente definidos como um grupo de indivíduos ou um grupo de indivíduos saudáveis, por exemplo, um coorte de indivíduos. Os indivíduos de referência saudáveis não apresentam disfunção de órgãos ou falência de órgãos. Consequentemente, o nível de referência pode ser um nível de
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29/150 pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM de indivíduos sem disfunção de órgãos ou sem falência de órgãos. Consequentemente, o nível de referência pode ser um nível que indique ausência de disfunção ou falência de órgãos.
[0065] Em modalidades preferenciais, o nível de referência de proADM (preferencialmente MR-proADM no presente documento) de cerca de 0,7 nmol/l a cerca de 2,0 nmol/l. Em modalidades mais preferenciais, o nível de referência de proADM é de cerca de 0,8 nmol/l a cerca de 1,9 nmol/l. Em modalidades mais preferenciais, o nível de referência de proADM é de cerca de 0,9 nmol/l a cerca de 1,8 nmol/l. Em modalidades mais preferenciais, o nível de referência de proADM é de cerca de 0,88 nmol/l a cerca de 1,79 nmol/l. Em modalidades mais preferenciais, o nível de referência de proADM é de cerca de 0,9 nmol/l ou cerca de 1,8 nmol/l. Nas modalidades mais preferenciais, o nível de referência de proADM é de cerca de 0,88 nmol/l ou cerca de 1,79 nmol/l. O nível de referência aplicado depende da especificidade e sensibilidade desejadas para a previsão, ou seja, um limiar mais baixo como cerca de 0,9 nmol/l (de preferência 0,88 nmol/l) proADM (de preferência MR-proADM) identificará de forma fiável indivíduos que não estão submetidos ao evento adverso (particularmente mortalidade, ou seja, identificar especificamente os sobreviventes dentro do período de 28 dias).
[0066] Em modalidades particulares, um nível de proADM do indivíduo que é (i) menor ou igual ao nível de referência de proADM (por exemplo, cerca de 0,9 nmol/l a 1,8 nmol/l) é indicativo de que o evento adverso, particularmente mortalidade, não ocorre dentro de 28 dias; ou (ii) superior ao nível de referência da proADM (por exemplo, cerca de 0,9 nmol/l a 1,8 nmol/l) é indicativo de que o evento adverso, particularmente a mortalidade, ocorre ou ocorrerá em 28 dias.
[0067] A sensibilidade e especificidade dos métodos fornecidos de
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30/150 pendem de mais do que apenas a qualidade analítica do teste. A sensibilidade e a especificidade também dependem da definição do que constitui um resultado anormal (por exemplo, mortalidade) ou normal. A distribuição dos níveis de pelo menos uma histona e/ou de proADM, preferencialmente o nível de MR-proADM para indivíduos com e sem o evento adverso pode se sobrepor. Sob tais condições, um teste não distingue absolutamente o estado normal de um estado disfuncional com 100% de precisão. O indivíduo versado na técnica está ciente do fato de que a condição por si de um indivíduo ou pelo menos um outro marcador e/ou parâmetro do indivíduo pode auxiliar na interpretação dos dados e que essa informação adicional permite um prognóstico mais confiável nas áreas de sobreposição. A condição em si pode se referir à condição geral de saúde do indivíduo. A condição geral de saúde de um indivíduo pode influenciar a decisão de qual nível de referência selecionar. Os exemplos anexos documentam quais os níveis de referência que se mostraram mais adequados para a condição particular. Com esse conhecimento, o nível de referência pode ser adaptado.
[0068] Por exemplo, o nível de referência apropriado pode depender do estado de saúde geral do indivíduo. O estado de saúde geral pode ser determinado com base na pontuação SOFA. Por exemplo, o nível de referência de proADM de cerca de 1,8 nmol/l pode ser usado para indivíduos menos gravemente doentes, por exemplo, indivíduos com uma pontuação SOFA < 6. O nível de referência de proADM de cerca de 3,2 nmol/l pode ser usado para indivíduos com doença moderadamente grave, por exemplo, indivíduos com uma pontuação SOFA de 7 a 12. O nível de referência da proADM de cerca de 5,5 nmol/l pode ser usado para indivíduos gravemente doentes, por exemplo, indivíduos com uma pontuação SOFA > 13.
[0069] Em modalidades preferenciais, o nível de referência de proADM pode ser de cerca de 1,8 nmol/l se a pontuação SOFA do indivíduo
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31/150 for 6, o nível de referência de proADM pode ser de cerca de 3,2 nmol/l se a pontuação SOFA do indivíduo for de 7 a 12; ou o nível de referência de proADM pode ser de cerca de 5,6 nmol/l se a pontuação SOFA do indivíduo for > 13. Nos aspectos mais preferenciais, o nível de referência de proADM pode ser de cerca de 1,8 nmol/l se a pontuação SOFA do indivíduo for < 6, ou o nível de referência de proADM pode ser de cerca de 3,2 nmol/l se a pontuação SOFA do indivíduo for entre 7 e 12.
[0070] Consequentemente, o nível de referência apropriado pode ser selecionado com a determinação do nível (ou níveis) de pelo menos mais um marcador e/ou parâmetro (por exemplo, sexo, grupo e idade). Os níveis de pelo menos outro marcador e/ou parâmetro também podem ser comparados com níveis de referência, em que valores/níveis similares ou idênticos do dito pelo menos outro marcador e/ou parâmetro do indivíduo comparados com os níveis correspondentes do dito pelo menos um outro marcador e/ou parâmetro dos referidos níveis de referência indicam que o risco de o indivíduo experimentar/vivenciar/sofrer um evento adverso é diminuído e/ou em que níveis/valores superiores ou inferiores do dito pelo menos um marcador adicional e/ou parâmetro comparado com os níveis correspondentes do dito pelo menos um marcador e/ou parâmetro adicional dos referidos níveis de referência indicam que o risco de experimentar/vivenciar/sofrer um evento adverso é aumentado.
[0071] Além disso, os testes ROC, como descritos abaixo e nos exemplos anexos podem ser usados para selecionar o nível de referência apropriado que fornece a previsão mais adequada.
[0072] O nível de referência apropriado também pode ser influenciado pela doença/distúrbio do qual o indivíduo sofre. Por exemplo, os exemplos anexos mostram que os indivíduos que sofrem de uma infecção fúngica apresentam os níveis mais elevados de proADM. Consequentemente, se um indivíduo sofre de uma infecção fúngica, o nível de
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32/150 referência de proADM pode ser de 5,6 nmol/l.
[0073] Além disso, o nível de referência também pode ser um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM de pelo menos um indivíduo de referência, em que o dito indivíduo (ou indivíduos) sofre de uma doença e/ou distúrbio médico e em que a progressão da doença ou distúrbio não é uma ameaça à vida. Em outras palavras, o nível de referência pode também ser um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM de pelo menos um indivíduo de referência, em que o dito indivíduo (ou indivíduos) sofre de uma doença e/ou distúrbio médico e em que o evento adverso, particularmente a mortalidade, não ocorre dentro de 28 dias, 7 dias ou 3 dias.
[0074] Além disso, o nível de referência pode também ser um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM de pelo menos um indivíduo de referência, em que o dito indivíduo (ou indivíduos) de referência sofre de uma doença e/ou distúrbio médico e uma infecção (tal como sepse ou distúrbios sépticos), e em que o evento adverso, particularmente a mortalidade, não ocorre no prazo de 28 dias, 7 dias ou 3 dias. Em outras palavras, o evento adverso do indivíduo de referência não ocorre em 28 dias, 7 dias ou 3 dias. Particularmente, o indivíduo de referência sofre da mesma doença ou afecção/distúrbio médico que o indivíduo a ser testado.
[0075] Além disso, o nível de referência também pode ser um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM de pelo menos um indivíduo de referência, em que o dito indivíduo (ou indivíduos) de referência sofre de uma doença e/ou distúrbio médico e não de uma infecção e em que o evento adverso, particularmente a mortalidade, não ocorre no prazo de 28 dias, 7 dias ou 3 dias.
[0076] Além disso, o nível de referência também pode ser um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM de pelo menos um indivíduo de referência e em que o dito indivíduo (ou indivíduos) de
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33/150 referência sofre de uma doença e/ou distúrbio médico incluindo SIRS, em que o dito indivíduo (ou indivíduos) não sofre de uma infecção, e em que o evento adverso, particularmente a mortalidade, não ocorre dentro de 28 dias, 7 dias ou 3 dias.
[0077] Conforme usado no presente documento, o pelo menos um indivíduo de referência se refere a mais do que um indivíduo de referência. Particularmente, o pelo menos um indivíduo de referência é um grupo ou um coorte de indivíduos de referência. Como descrito abaixo, os meios e métodos são descritos para determinar os níveis dos marcadores, por exemplo, em referência.
[0078] O nível de referência, tal como usado no presente documento, é tipicamente um nível predeterminado, isto é, foi determinado antecipadamente como uma referência para o uso posterior no ponto de atendimento, por exemplo, UTI ou ED.
[0079] Em aspectos preferenciais da invenção, o evento adverso é a mortalidade. Nesses aspectos, o nível de referência também pode ser o nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM de pelo menos um indivíduo de referência, em que o indivíduo (ou indivíduos) de referência não morre em 28 dias aproximadamente, dentro de cerca de 14 dias, dentro de aproximadamente 7 dias ou dentro de aproximadamente 3 dias. Além disso, nesses aspectos, o nível de referência pode também ser um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM de pelo menos um indivíduo de referência, em que o dito indivíduo (ou indivíduos) sofre de uma doença e/ou distúrbio médico e em que o indivíduo (ou indivíduos) de referência não morre dentro de 28 dias, dentro de cerca de 14 dias, dentro de cerca de 7 dias ou dentro de cerca de 3 dias. Adicionalmente, nesses aspectos, o nível de referência pode também ser um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM de pelo menos um indivíduo de referência, em que o dito indivíduo (ou indivíduos) sofre de uma doença e/ou distúrbio médico e uma
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34/150 infecção e em que o indivíduo (ou indivíduos) de referência não morre dentro de 28 dias, dentro de cerca de 14 dias, dentro de cerca de 7 dias ou dentro de cerca de 3 dias. Ademais, nesses aspectos, o nível de referência pode também ser um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM de pelo menos um indivíduo de referência, em que o dito indivíduo (ou indivíduos) sofre de uma doença e/ou distúrbio médico e não de uma infecção e em que o indivíduo (ou indivíduos) de referência não morre dentro de 28 dias, dentro de cerca de 14 dias, dentro de cerca de 7 dias ou dentro de cerca de 3 dias. Além disso, nesses aspectos, o nível de referência pode também ser um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM de pelo menos um indivíduo de referência e em que o dito indivíduo (ou indivíduos) sofre de uma doença e/ou distúrbio médico incluindo SIRS, em que o dito indivíduo (ou indivíduos) não sofre de uma infecção e em que o indivíduo (ou indivíduos) de referência não morre dentro de cerca de 28 dias, dentro de cerca de 14 dias, dentro de cerca de 7 dias ou dentro de cerca de 3 dias.
[0080] Como documentado no presente documento, um nível aumentado de pelo menos uma histona (ou um aumento no nível de pelo menos uma histona) e/ou um nível aumentado de proADM (ou um aumento no nível de proADM), particularmente MR-proADM em comparação com o nível de referência é indicativo de um evento adverso, particularmente a mortalidade. Em particular, o evento adverso ocorre dentro de 28 dias, 7 dias ou 3 dias, conforme descrito acima. Consequentemente, o dito nível de pelo menos uma histona e/ou o dito nível de proADM que indica o dito evento adverso pode ser um nível aumentado em comparação com um nível de referência.
[0081] Consequentemente, o método da invenção inclui um método que compreende a determinação de um nível de pelo menos uma histona em uma amostra do dito indivíduo e em que um nível aumentado
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35/150 da dita pelo menos uma histona do dito indivíduo em comparação com um nível de referência de pelo menos uma histona é indicativa do dito evento adverso, particularmente mortalidade, do dito indivíduo.
[0082] Além disso, a invenção inclui um método que compreende a determinação de um nível de proADM, particularmente MR-proADM, em uma amostra do dito indivíduo, e em que um nível aumentado do dito proADM, particularmente MR-proADM, do dito indivíduo em comparação com um nível de referência do dito proADM, particularmente MRproADM, é indicativo do dito evento adverso, particularmente mortalidade do dito indivíduo.
[0083] Além disso, a invenção inclui um método que compreende a determinação de um nível de proADM, particularmente MR-proADM, em uma amostra do dito indivíduo e em que um nível aumentado de proADM, particularmente MR-proADM, em comparação com o nível de referência de proADM, particularmente MR-proADM é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo, em que, de preferência, o dito evento adverso ocorre dentro de cerca de 28 dias; ou em que um nível decrescido ou um nível equivalente de proADM, particularmente MR-proADM, em comparação com o nível de referência de proADM, particularmente MR-proADM é indicativo de que o dito evento adverso do dito indivíduo não ocorre, preferencialmente em cerca de 28 dias.
[0084] Além disso, a invenção inclui um método que compreende determinar um nível de pelo menos uma histona em uma amostra do dito indivíduo e determinar um nível de proADM, particularmente MRproADM, em uma amostra do dito indivíduo, e em que um nível aumentado do dito pelo menos uma histona do dito indivíduo e um nível aumentado do dito proADM, particularmente MR-proADM, do dito indivíduo em comparação com um nível de referência de pelo menos uma histona e um nível de referência do dito proADM, particularmente MRproADM são indicativos dos referidos efeitos adversos, particularmente
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36/150 mortalidade, do dito indivíduo.
[0085] A invenção também se refere a um método que compreende [0086] (i) determinar um nível de pelo menos uma histona em uma amostra do dito indivíduo, [0087] em que o dito nível de pelo menos uma histona é comparado com um nível de referência de pelo menos uma histona, [0088] e em que um nível aumentado da dita pelo menos uma histona do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência de pelo menos uma histona é indicativo do dito evento adverso no dito indivíduo; e/ou [0089] (ii) determinar um nível de pró-adrenomedulina (proADM) em uma amostra do dito indivíduo, [0090] em que o dito nível de proADM é comparado com um nível de referência de proADM [0091] e em que um nível aumentado da dita proADM do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência de proADM é indicativo do dito evento adverso no dito indivíduo.
[0092] Em outras palavras, a invenção também se refere a um método que compreende [0093] (i) determinar um nível de pelo menos uma histona em uma amostra de um indivíduo, [0094] em que o dito nível de pelo menos uma histona é comparado com um nível de referência de pelo menos uma histona, [0095] e em que um aumento no nível de pelo menos uma histona em comparação com o nível de referência de pelo menos uma histona é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo; e/ou [0096] (ii) determinar um nível de pró-adrenomedulina (proADM) em uma amostra do dito indivíduo, [0097] em que o dito nível de proADM é comparado com um nível de referência de proADM,
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37/150 [0098] e em que um aumento no nível de proADM em comparação com o nível de referência de proADM é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo.
[0099] A invenção também pode se referir a um método que compreende [0100] (i) determinar um nível de pelo menos uma histona em uma amostra do dito indivíduo, [0101 ] em que o dito nível de pelo menos uma histona é comparado com um nível de referência de pelo menos uma histona do mesmo indivíduo obtida a partir da análise prévia, [0102] e em que um aumento no nível de pelo menos uma histona em comparação com o dito nível de referência de pelo menos uma histona é indicativo do dito evento adverso no dito indivíduo; e/ou [0103] (ii) determinar um nível de pró-adrenomedulina (proADM) em uma amostra do dito indivíduo, [0104] em que o dito nível de proADM é comparado com um nível de referência de proADM do mesmo indivíduo obtido a partir de análise prévia, [0105] e em que um aumento no nível de proADM em comparação com o dito nível de referência de proADM é indicativo do dito evento adverso no dito indivíduo.
[0106] Conforme usado no presente documento, obtido a partir de análise prévia se refere a uma determinação do nível de marcador na amostra do mesmo indivíduo em um momento anterior, por exemplo, 28 dias, 7 dias, 6 dias, 5 dias, 4 dias, 3 dias, 2 dias ou 1 dia antes da análise seguinte e em que em tais aspectos o dito nível anteriormente determinado do marcador é considerado como o nível de referência.
[0107] Conforme usado no presente documento, o termo aumento no nível de (o) marcador significa que o nível do marcador é aumen
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38/150 tado, isto é, se refere a um nível aumentado do marcador. Consequentemente, o termo aumento no nível de (o) marcador é no presente documento usado indistintamente com o termo nível aumentado de (o) marcador. Um nível aumentado do marcador ou um aumento no nível do marcador do indivíduo significa que o nível do marcador é pelo menos cerca de 15%, de preferência pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 25%, ou ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 30% superior ao nível de referência do marcador.
[0108] No contexto da invenção, o termo aumento no nível de pelo menos uma histona em comparação com o nível de referência ou similar usado alternadamente no presente documento com o termo nível aumentado de pelo menos uma histona do dito indivíduo quando comparado ao dito nível de referência ou o termo nível aumentado de pelo menos uma histona em comparação com o dito nível de referência ou similar. Tais termos significam que o nível de pelo menos uma histona, por exemplo, o nível de H2B, o nível de H4, o nível de H2A e/ou o nível de H3, do indivíduo é de pelo menos cerca de 15%, de preferência pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 25%, com mais preferência pelo menos cerca de 30%, com mais preferência pelo menos 40%, com mais preferência pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 60%, com mais preferência pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80%, com mais preferência pelo menos cerca de 90%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 100% acima do nível de referência de pelo menos uma histona. Em outras palavras, nos aspectos mais preferenciais, o nível aumentado da dita pelo menos uma histona (ou o aumento do nível) pode ser cerca de duas vezes superior ao dito nível de referência de pelo menos uma histona. Um aumento do nível em cerca de duas vezes aumenta o risco do evento adverso, por exemplo, mortalidade. Por exemplo, uma razão
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39/150 de risco de 1,45 de H4, conforme documentado na tabela 1, significa que o risco de um evento adverso aumenta em 45%. Portanto, tais valores são também uma indicação de uma forte correlação e ótimos marcadores para o diagnóstico.
[0109] Conforme usado no presente documento, o termo aumento no nível de proADM em comparação com o nível de referência ou similar é usado no presente documento indistintamente com o termo nível aumentado da proADM do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência ou o termo aumento do nível da proADM em relação ao dito nível de referência ou similar. Tais termos significam que o nível de proADM, particularmente o nível de MR-proADM, do indivíduo é de pelo menos cerca de 10%, preferencialmente pelo menos cerca de 15%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 25%, ou ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 30%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 40%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 50%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 60%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80% preferencialmente pelo menos cerca de 90%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 100% superior ao nível de referência de proADM, particularmente MR-proADM. Em outras palavras, nos aspectos mais preferenciais, o nível aumentado da dita proADM pode ser cerca de duas vezes superior ao dito nível de referência de proADM.
[0110] Conforme usado no presente documento, o termo diminuição do nível de proADM em comparação com o nível de referência ou similar é no presente documento usado indistintamente com o termo nível decrescente da proADM do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência ou o termo diminuição do nível da proADM em relação ao dito nível de referência ou similar. Tais termos significam
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40/150 que o nível de proADM, particularmente o nível de MR-proADM, do indivíduo pelo menos cerca de 10%, preferencialmente pelo menos cerca de 15%, com mais preferência pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 25%, ou ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 30%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 40%, com mais preferência pelo menos cerca de 50%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 60%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80% mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 100% inferior ao nível de referência de proADM, particularmente MR-proADM. Em outras palavras, nos aspectos mais preferenciais, o nível diminuído da dita proADM pode ser cerca do dobro do dito nível de referência de proADM.
[0111] O termo equivalente também inclui o nível em que o nível pode ser similar ao nível de referência. Consequentemente, o termo equivalente se refere a um nível de proADM do indivíduo que é de +/10%, de preferência +/- 5%, mais preferencialmente +/- 2% ou mais preferencialmente o mesmo ou idêntico em comparação com ao nível de referência do proADM.
[0112] Conforme usado no presente documento, o termo diminuição no nível ou um nível igual de proADM em comparação com o nível de referência significa que o nível de proADM, particularmente o nível de MR-proADM, do indivíduo é +/-10%, +/- 5%, +/- 2% ou o mesmo ou idêntico comparado com o nível de referência ou é pelo menos cerca de 10%, de preferência pelo menos cerca de 20%, com mais preferência pelo menos cerca de 25%, ou ainda com mais preferência pelo menos cerca de 30%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 40%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 50%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 60%, mais preferencialmente pelo menos cerca de
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70%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80%, com mais preferência pelo menos cerca de 90%, com mais preferência pelo menos cerca de 100% inferior ao nível de referência de proADM, particularmente MR-proADM.
[0113] Entende-se no presente documento que os níveis de referência e os níveis de marcadores determinados (isto é, os níveis que são determinados para o indivíduo em particular no local de tratamento, por exemplo, UTI ou ED) podem variar dependendo do ensaio/método pelo qual os níveis são determinados. Por exemplo, o nível de referência e o nível determinado de marcadores determinados por métodos baseados em espectrometria de massa podem ser diferentes dos respectivos níveis determinados por imunoensaios. Os exemplos anexos demonstram que os níveis dos marcadores podem ser determinados por vários métodos, por exemplo, métodos baseados em imunoensaios e espectrometria de massa. Os níveis de referência podem ser aperfeiçoados por métodos estatísticos como exemplificado nos exemplos anexos, tais como a análise de regressão de Cox. Razões de risco também podem ser calculadas. Por exemplo, e como exemplificado nos exemplos anexos, Razões de risco superiores a 0 (HR>0) indicam um prognóstico pior, isto é, que o evento adverso provavelmente ocorre e Razões de risco menores do que 0 indicam um bom prognóstico, ou seja, que o evento adverso provavelmente não ocorrerá. Consequentemente, a pessoa versada na técnica está ciente de como determinar os níveis de referência. Por exemplo, os níveis (incluindo os níveis de referência) podem ser determinados por um imunoensaio, por exemplo, determinando o nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM, por exemplo MR-proADM, em amostras de indivíduos (ou indivíduos de referência).
[0114] Em certos aspectos da invenção, o nível de referência de
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42/150 pelo menos uma histona pode ser de cerca de 100 ng/ml, mais preferencialmente de cerca de 90 ng/ml, mais preferencialmente de cerca de 80 ng/ml, mais preferencialmente de cerca de 70 ng/ml, com mais preferência cerca de 60 ng/ml, mais preferencialmente cerca de 50 ng/ml, mais preferencialmente cerca de 45 ng/ml, mais preferencialmente cerca de 40 ng/ml, ou mais preferencialmente cerca de 35 ng/ml. Em certos aspectos da invenção, o nível de referência de pelo menos uma histona pode ser de cerca de 10 ng/ml, mais preferencialmente de cerca de 15 ng/ml, com mais preferência de cerca de 20 ng/ml, com mais preferência de cerca de 25 ng/ml, com mais preferência cerca de 30 ng/ml, ou mais preferencialmente cerca de 35 ng/ml.
[0115] Em certos aspectos da invenção, o nível de referência de pelo menos uma histona pode ser de cerca de 10 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 10 ng/ml a cerca de 90 ng/ml, com mais preferência cerca de 10 ng/ml a cerca de 60 ng/ml, mais preferencialmente cerca de 10 ng/ml a cerca de 40 ng/ml, mais preferencialmente cerca de 15 ng/ml a cerca de 40 ng/ml, ou mais preferencialmente cerca de 20 ng/ml a cerca de 40 ng/ml.
[0116] Em certos aspectos da invenção, o nível de referência de proADM pode ser de cerca de 4 nmol/l, com mais preferência cerca de 5 nmol/l, com mais preferência cerca de 7 nmol/l, com mais preferência cerca de 8 nmol/l, com mais preferência cerca de 9 nmol/l ou particularmente de preferência cerca de 6 nmol/l.
[0117] Além disso, os níveis (incluindo níveis de referência) podem ser determinados por métodos baseados em espectrometria de massa, tais como métodos que determinam a quantificação relativa ou determinam a quantificação absoluta da proteína ou fragmento da mesma de interesse.
[0118] A quantificação relativa rSRM pode ser alcançada ao:
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43/150 [0119] 1. Determinar a presença aumentada ou diminuída da proteína alvo comparando a área do pico de assinatura SRM (monitoramento da reação selecionada) de um dado fragmento alvo detectado na amostra com a mesma área do pico de assinatura SRM do fragmento alvo em pelo menos uma segunda, terceira, quarta ou mais amostras biológicas.
[0120] 2. Determinar a presença aumentada ou diminuída de proteína alvo comparando a área de pico de assinatura de SRM de um dado peptideo alvo detectado na amostra a áreas de pico de assinatura SRM desenvolvidas a partir de peptídeos de outras proteínas, em outras amostras derivadas de fontes biológicas diferentes e separadas, em que a comparação da área de pico de assinatura SRM entre as duas amostras para um fragmento peptídico é normalizada, por exemplo, para a quantidade de proteína analisada em cada amostra.
[0121] 3. Determinar a presença aumentada ou diminuída da proteína alvo comparando a área de pico de assinatura de SRM para um dado peptideo alvo com as áreas de pico de assinatura de SRM de outros fragmento peptídicos derivadas de diferentes proteínas dentro da mesma amostra biológica para normalizar os níveis alterados de proteínas de histonas a níveis de outras proteínas que não alteram seus níveis de expressão sob várias condições celulares.
[0122] 4. Esses ensaios podem ser aplicados a fragmentos peptídicos não modificados e a fragmentos peptídicos modificados das proteínas alvo, em que as modificações incluem, mas não estão limitadas a fosforilação e/ou glicosilação, acetilação, metilação (mono, di, tri), citrulinização, ubiquitinilação, e quando os níveis relativos de peptídeos modificados são determinados da mesma maneira da determinação das quantidades relativas de peptídeos não modificados.
[0123] A quantificação absoluta de um dado peptideo pode ser obtida ao:
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44/150 [0124] 1. Comparar a área do pico de assinatura de SRM/MRM para um dado fragmento peptídico das proteínas alvo em uma amostra biológica individual à área de pico de assinatura de SRM/MRM de um padrão de fragmento peptídico interno adicionado ao lisado de proteína da amostra biológica. O padrão interno pode ser uma versão sintética marcada do fragmento peptídico da proteína alvo que está sendo interrogada ou a proteína recombinante marcada. Esse padrão é adicionado a uma amostra em quantidades conhecidas previamente (obrigatório para a proteína recombinante) ou após a digestão, e a área do pico de assinatura SRM/MRM pode ser determinada tanto para o padrão de fragmento peptídico interno quanto para o fragmento peptídico nativo na amostra biológica separadamente, seguido da comparação de ambas as áreas de pico. Isso pode ser aplicado a fragmentos peptídicos não modificados e fragmento peptídicos modificados, em que as modificações incluem, mas não estão limitadas à fosforilação e/ou glicosilação, acetilação, metilação (por exemplo, mono-, di- ou tri- metilação), citrulinização, ubiquitinilação e quando os níveis absolutos de peptídeos modificados podem ser determinados da mesma maneira que a determinação dos níveis absolutos de peptídeos não modificados.
[0125] 2. Os peptídeos também podem ser quantificados usando curvas de calibração externas. A abordagem de curva normal usa uma quantidade constante de um peptídeo pesado como um padrão interno e uma quantidade variável de peptídeo sintético leve adicionado na amostra. Uma matriz representativa similar à das amostras de teste precisa ser usada para construir curvas padrão para contabilizar um efeito de matriz. Além disso, o método da curva reversa contorna a questão do analito endógeno na matriz, onde uma quantidade constante de peptídeo leve é adicionada ao analito endógeno para criar um padrão interno e quantidades variáveis de peptídeo pesado são adicionadas para criar um conjunto de padrões de concentração. As amostras de teste a
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45/150 serem comparadas com as curvas normais ou reversas são misturadas com a mesma quantidade de peptídeo padrão que o padrão interno adicionado na matriz usada para criar a curva de calibração.
[0126] Consequentemente, a pessoa versada na técnica está ciente de como determinar os níveis dos marcadores e, em particular, os níveis de referência apropriados, como também é exemplificado nos exemplos anexos.
[0127] Os métodos e kits da presente invenção podem também compreender a determinação de pelo menos mais um marcador e/ou parâmetro em adição a pelo menos uma histona e/ou proADM.
[0128] Conforme usado no presente documento, um parâmetro é uma característica, recurso ou fator mensurável que pode ajudar na definição de um sistema particular. Um parâmetro é um elemento importante para avaliações relacionadas à saúde e à fisiologia, como risco de doença/distúrbio/condição clínica, preferencialmente um evento adverso. Além disso, um parâmetro é definido como uma característica que é objetivamente medido e avaliado como um indicador de processos biológicos normais, processos patogênicos ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica. Um parâmetro exemplificativo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste na pontuação da Avaliação da Fisiologia Aguda e Saúde Crônica (pontuações APACHE l-IV), pontuação da avaliação de falha sequencial de órgão (pontuação SAPS l-lll), pontuação da avaliação de falha sequencial de órgãos (pontuação SOFA), pontuação rápida de SOFA (qSOFA), pontuação fisiológica aguda simplificada II (pontuação SAPSII), modelo de probabilidade de mortalidade (MPM l-lll), pontuação de disfunção de múltiplos órgãos (MODS), sistema de pontuação de intervenção terapêutica (TISS), nove equivalentes de pontuação de uso de mão de obra de enfermagem (NEMS), Federação Mundial de Sociedades Neurocirúrgicas (WFNS) e
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Escala de Coma de Glasgow (GCS), pontuação de gravidade da pneumonia CURB-65, índice de gravidade da Pneumonia (PSI), idade, gênero, história familiar, etnia, peso corporal, índice de massa corporal (IMC), laudo cistoscópico, contagem de leucócitos, tomografia computadorizada, pressão arterial, frequência cardíaca, tratamento anti-hipertensivo, ingestão de líquidos, sibilos, temperatura corporal, presença de diabetes mellitus e hábitos tabágicos atuais.
[0129] Conforme usado no presente documento, termos como marcador, substituto, marcador de prognóstico, fator ou biomarcador ou marcador biológico são usados de forma intercambiável e se referem a marcadores biológicos mensuráveis e quantificáveis (por exemplo, concentração de proteína ou enzima específica ou um fragmento das mesmas, concentração de hormônio específica ou de um fragmento do mesmo ou presença de substâncias biológicas ou fragmentos das mesmas) que servem como índices para avaliações relacionadas com a saúde e fisiologia, tal como um risco de doença/distúrbio/condição clínica, de preferência um evento adverso. Um marcador é definido como uma característica que pode ser objetivamente medida e avaliada como um indicador de processos biológicos normais, processos patogênicos ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica. Os biomarcadores podem ser medidos em uma amostra (como teste de sangue, plasma, urina ou tecido). O pelo menos um marcador adicional do dito indivíduo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em procalcitonina, calcitonina, Endotelina-1 (ET-1), Arginina Vasopressina (AVP), Peptídeo Natriurético Atrial (ANP), Lipocalina Associada a Gelatinase de Neutrófilos (NGAL), Troponina, Peptídeo Natriurético Cerebral (BNP), Proteína C-Reativa (CRP), Proteína de Pedra Pancreática (PSP), Receptor Desencadeador Expresso em Células Mieloides 1 (TREM1), lnterleucina-6 (IL-6), lnterleucina-1, lnterleucina-24
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47/150 (IL-24) outras ILs, Presepsina (sCD14-ST), Proteína de Ligação a Lipopolissacarídeos (LBP), Alfa-1-Antitripsina, Metaloproteinase de Matriz 2 (MMP2), Metaloproteinase de Matriz 9 (MMP9), Metaloproteinase de Matriz 7 (MMP9), Cromogranina A, proteína S100A, proteína S100B e fator de necrose tumoral a (TNFa) ou fragmento dos mesmos.
[0130] Em aspectos particulares da invenção, o pelo menos um outro marcador e/ou parâmetro do dito indivíduo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um nível de aldolase B na dita amostra, um nível de copeptina na dita amostra, um nível de proendotelina 1 na dita amostra, um nível de lactato na dita amostra, um nível de procalcitonina (PCT) na dita amostra, a pontuação de avaliação de falha de órgãos sequencial (pontuação SOFA) do dito indivíduo, a pontuação fisiológica aguda simplificada (pontuação SAPSII), pontuação da Avaliação de Fisiologia Aguda e Saúde Crônica II (APACHE II) do dito indivíduo e um nível da tirosina quinase 1 solúvel (sFlt-1) na dita amostra.
[0131] Em certos aspectos da invenção, pelo menos um outro marcador e/ou parâmetro do dito indivíduo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em procalcitonina, calcitonina, Endotelina-1 (ET-1), Arginina Vasopressina (AVP), peptídeo Natriúrico Atrial (ANP), Lipocalina Associada a Gelatinase de Neutrófilos (NGAL), Troponina, Peptídeo Natriurético Cerebral (BNP), Proteína C-Reativa (CRP), Proteína de Pedra Pancreática (PSP), Receptor Desencadeador Expressado em Células Mieloides 1 (TREM1), lnterleucina-6 (IL-6), lnterleucina-1, Interleucina-24 (IL-24) outras ILs, Presepsina (sCD14-ST), Proteína de Ligação a Lipopolissacarídeos (LBP), Alfa-1-Antitripsina, Metaloproteinase de Matriz 2 (MMP2), Metaloproteinase de Matriz 9 (MMP9), Matriz Metaloproteinase 7 (MMP7), Cromogranina A, proteína S100A, proteína S100B, Fator de Necrose Tumoral α (TNFa), idade, gênero, história familiar, etnia, peso corporal, índice de massa corporal (IMC), relatório cistoscópico, contagem de leucócitos, tomografia computadorizada,
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48/150 pressão arterial, frequência cardíaca, tratamento anti-hipertensivo, ingestão de líquido, sibilância, temperatura corporal, presença de diabetes mellitus, hábitos tabagísticos atuais, pontuação da Avaliação da Fisiologia Aguda e Saúde Crônica (pontuações APACHE l-IV), pontuação da Fisiologia Aguda Simplificada (pontuação SAPS l-lll), pontuação da Avaliação de Falha de Órgão Sequencial (pontuação SOFA), modelo de probabilidade de mortalidade (MPM l-lll), pontuação de disfunção de múltiplos órgãos (MODS), sistema de pontuação de intervenção terapêutica (TISS), nove equivalentes de pontuação de uso de mão de obra (NEMS), classificação da Federação Mundial de Sociedades Neurocirúrgicas (WFNS) e Escala de Coma de Glasgow (GCS).
[0132] Conforme usado no presente documento, Aldolase B se refere a aldolase B de frutose-bifosfato ou aldolase do tipo de fígado que é uma das três isoenzimas (A, B e C) da enzima aldolase de 1,6-bisfosfato de frutose de classe I. O nível de Aldolase B na amostra do indivíduo pode ser determinado por métodos baseados em espectrometria de massa.
[0133] Copeptina também é denominada CT-proAVP ou porção terminal C da vasopressina. A vasopressina é um poderoso vasoconstritor. O nível de proAVP-CT pode ser medido no plasma ou soro de um indivíduo por imunoensaios como descrito abaixo.
[0134] Conforme usado no presente documento, lactato se refere à concentração máxima de lactato medida no sangue. Normalmente, a concentração de lactato é avaliada diariamente ou até mais vezes. A concentração de lactato no sangue pode ser determinada por métodos espectrofotométricos de lactato oxidase.
[0135] Conforme usado no presente documento, procalcitonina ou PCT se refere a resíduos de aminoácido integral de peptideo 1 a 116, 2 a 116, 3 a 116 ou fragmentos dos mesmos. Assim, o comprimento dos
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49/150 fragmentos de procalcitonina é de pelo menos 12 aminoácidos, de preferência mais de 50 aminoácidos, mais preferencialmente mais de 110 aminoácidos. A PCT pode compreender modificações pós-traducionais, tais como glicosilação, liposidação ou derivatização. A procalcitonina é um precursor da calcitonina e da katacalcina. Assim, em condições normais, os níveis de PCT na circulação são muito baixos (< cerca de 0,05 ng/ml). O nível de PCT na amostra do indivíduo pode ser determinado por imunoensaios como descrito abaixo.
[0136] Conforme usado no presente documento, a pontuação de avaliação de falha de órgão sequencial ou pontuação SOFA é uma pontuação usada para rastrear o estado de um paciente durante a permanência em uma unidade de terapia intensiva (UTI) ou no Departamento de Emergência (DE). A pontuação SOFA é um sistema de pontuação para determinar a extensão da função de órgão de uma pessoa ou a taxa de falha. A pontuação se baseia em seis diferentes pontuações, uma para o sistema respiratório, cardiovascular, hepático, de coagulação, renal e neurológico. Tanto a pontuação média quanto a mais alta do SOFA são indicadores do resultado. Um aumento na pontuação SOFA durante as primeiras 24 a 48 horas na UTI ou ED prevê uma taxa de mortalidade de pelo menos 50% até 95%. Pontuações menores que 9 resultam em uma mortalidade preditiva de 33%, enquanto acima de 14 podem estar próximos ou acima de 95%.
[0137] Conforme usado no presente documento, SAPS II ou Pontuação de Fisiologia Aguda Simplificada II se refere a um sistema para classificar a gravidade de uma doença ou distúrbio (consultar Le Gall JR et al., A new Simplified Acute Physiology Score (SAPS II) based on a European/North American multicenter study. JAMA. 1993; 270 (24): 2.957 a 2.963. A pontuação SAPS II é composta por 12 variáveis fisiológicas e 3 variáveis relacionadas à doença. A pontuação é calculada a partir de 12 medidas fisiológicas de rotina, informações sobre estado de
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50/150 saúde anterior e algumas informações obtidas na admissão na UTI ou na emergência. A pontuação SAPS II pode ser determinada a qualquer momento, preferencialmente, no dia 2. A pior medida é definida como a medida que se correlaciona com o maior número de pontos. A pontuação do SAPS II varia de 0 a 163 pontos. O sistema de classificação inclui os seguintes parâmetros: Idade, Frequência Cardíaca, Pressão Arterial Sistólica, Temperatura, Escala de Coma de Glasgow, Ventilação Mecânica ou CPAP, PaO2, FiO2, Saída de Urina, Nitrogênio Ureico Sanguíneo, Sódio, Potássio, Bicarbonate, Bilirrubina, doenças crônicas e tipo de internação. Existe uma relação sigmoidal entre a mortalidade e a pontuação total do SAPS II. A mortalidade de um indivíduo é de 10% em uma pontuação SAPSII de 29 pontos, a mortalidade é de 25% em uma pontuação SAPSII de 40 pontos, a mortalidade é de 50% em uma pontuação SAPSII de 52 pontos, a mortalidade é de 75% em um SAPSII pontuação de 64 pontos, a mortalidade é de 90% em uma pontuação SAPSII de 77 pontos (Le Gall loc. cit.).
[0138] Conforme usado no presente documento, APACHE II ou Avaliação de Fisiologia Aguda e Saúde Crônica II é um sistema de pontuação de classificação de gravidade da doença (Knaus et al., 1985). Pode ser aplicado dentro de 24 horas após a admissão de um paciente em uma unidade de terapia intensiva (UTI) ou no Departamento de Emergência (DE) e pode ser determinado com base em 12 parâmetros fisiológicos diferentes.
[0139] Conforme usado no presente documento, a pontuação SOFA rápida ou pontuação qSOFA é um sistema de pontuação que indica uma disfunção de órgão do paciente ou risco de mortalidade. A pontuação é baseada em três critérios: 1) uma alteração no estado mental, 2) uma diminuição na pressão arterial sistólica de menos de 100 mm Hg, 3) uma frequência respiratória superior a 22 respirações por minuto. Pacientes com duas ou mais dessas condições estão em maior risco de
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51/150 ter uma disfunção orgânica ou morrer.
[0140] Conforme usado no presente documento, Tirosina quinase 1 tipo fms solúvel ou sFlt-1 é uma proteína tirosina quinase que desativa as proteínas que causam o crescimento dos vasos sanguíneos. Flt1 solúvel (sFlt-1) é uma variante de splicing do receptor 1 de VEGF (Flt1) que é produzido por uma variedade de tecidos. O nível de sFLT1 na amostra do indivíduo pode ser determinado por ensaios e imunoensaios baseados em espectrometria de massa.
[0141] Conforme usado no presente documento, a pontuação CURB-65 (Lim et al., 2003) se refere aos seguintes fatores de risco do indivíduo:
[0142] - Confusão de novo início (definido como uma pontuação abreviada do teste mental (AMTS) (Hodkinson, 1972) de 8 ou menos), [0143] - Nitrogênio ureico no sangue superior a 7 mmol/l (19 mg/dl), [0144] - Frequência respiratória de 30 respirações por minuto ou mais, [0145] - Pressão arterial menor que 90 mmHg pressão arterial sistólica ou diastólica 60 mmHg ou menos, [0146] - Idade 65 anos ou mais.
[0147] Cada fator de risco soma um ponto para uma pontuação máxima de 5.
[0148] Conforme usado no presente documento, o índice de Gravidade de Pneumonia (PSI) se refere a uma regra de previsão clínica para o cálculo da probabilidade de morbidade e mortalidade entre pacientes com pneumonia adquirida na comunidade (Fine et al., 1997).
[0149] Os métodos ou kits da invenção podem compreender a determinação do nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM e um nível de um outro marcador e/ou parâmetro como descrito acima. [0150] Em aspectos preferenciais, os ditos métodos ou os kits da invenção podem compreender a determinação do dito nível de proADM
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52/150 e da dita pontuação SOFA. Além disso, os ditos métodos ou os kits da invenção podem compreender a determinação do dito nível de proADM, a dita pontuação SOFA e o dito nível de lactato do dito indivíduo.
[0151] Os métodos e os kits usados da presente invenção podem também compreender a determinação de pelo menos um parâmetro adicional, tal como a pontuação SAPS II, pontuação SOFA e/ou pontuação APACHE II. Por exemplo, o método pode compreender a determinação do nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM na amostra do indivíduo e a pontuação SAPS II do indivíduo. Preferencialmente, o método compreende a determinação do dito nível de pelo menos uma histona na dita amostra do dito indivíduo e a dita pontuação SAPSII do dito indivíduo. O nível de pelo menos uma histona e a pontuação SAPSII podem ser indicativos do evento adverso, particularmente mortalidade, do dito indivíduo ocorrendo dentro de 28 dias.
[0152] De preferência, o método compreende a determinação do nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo e da dita pontuação SAPSII do dito indivíduo. O nível de proADM e a pontuação SAPSII podem ser indicativos do evento adverso, particularmente mortalidade, do dito indivíduo ocorrendo dentro de 28 dias ou dentro de 7 dias.
[0153] Além disso, o método pode compreender a determinação do nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM na amostra do indivíduo e a pontuação SOFA do indivíduo.
[0154] Além disso, o método pode compreender a determinação do nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM na amostra do indivíduo e o nível de PCT na amostra do indivíduo. Além disso, o método pode compreender a determinação do nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM na amostra do indivíduo e o nível de aldolase B na amostra do indivíduo.
[0155] Conforme usado no presente documento, o indivíduo (ou paciente) pode ser um vertebrado. No contexto da presente invenção,
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53/150 o termo indivíduo inclui seres humanos e animais, particularmente mamíferos, e outros organismos. Assim, os métodos fornecidos no presente documento são aplicáveis a indivíduos humanos e animais. Consequentemente, o dito indivíduo pode ser um animal tal como um camundongo, rato, hamster, coelho, porquinho da índia, furão, gato, cão, galinha, ovelha, espécies bovinas, cavalo, camelo ou primata. De preferência, o indivíduo é um mamífero. Mais preferencialmente, o indivíduo é humano.
[0156] O método fornecido no presente documento pode ser usado em qualquer indivíduo que seja um indivíduo saudável ou um indivíduo que sofra de qualquer doença (ou doenças) ou distúrbio (ou distúrbios). Em aspectos preferenciais, o indivíduo sofre de uma doença, distúrbio ou condição médica. O indivíduo a ser testado pode ser um paciente doente crítico, de preferência em que o dito indivíduo seja admitido em uma unidade de terapia intensiva. Conforme usado no presente documento, doença crítica significa que o indivíduo ou paciente está em uma situação de risco de vida.
[0157] O indivíduo ou o indivíduo (ou indivíduos) de referência pode sofrer de uma doença ou condição/distúrbio médico e em que a dita doença ou condição/distúrbio médico pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em doença respiratória, infecção do trato urinário, uma resposta inflamatória relacionada com infecção e etiologia não infecciosa, síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS), sepse, sepse grave, choque séptico, falência (ou falências) de órgãos, doença cardiovascular, diabetes mellitus, malignidade (ou malignidades), doença hepática, doença renal, imunodepressão, infecção viral, infecção fúngica, infecção bacteriana, infecção bacteriana gram-negativa, infecção bacteriana gram-positiva e imunossupressão. No presente documento, o método da invenção baseado na detecção do nível de proADMM (particularmente o nível MR-proADM) é particularmente útil para
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54/150 a previsão do evento adverso em indivíduos que sofrem de uma infecção fúngica. É também particularmente útil para indivíduos que sofrem de uma infecção do trato respiratório, particularmente do trato respiratório inferior.
[0158] O indivíduo pode também sofrer de uma infecção que se segue a um defeito no osso e/ou no tecido, por exemplo, uma fratura do osso.
[0159] Além disso, o indivíduo também pode ser eleito para cirurgia. Isso significa que o indivíduo será submetido a cirurgia. Essa cirurgia pode estar ligada à doença e/ou distúrbio sendo a razão ou um sintoma para a admissão no hospital.
[0160] Particularmente, o indivíduo sofre de doença respiratória, infecção do trato urinário e/ou malignidade (malignidades).
[0161] Inflamação sistemática no contexto da invenção preferencialmente se refere a uma condição caracterizada por uma liberação de citocinas pró-inflamatórias e um sistema imune inato ativado que pode ser causado por fatores biológicos, fatores químicos ou por fatores genéticos. Inflamação sistêmica grave pode levar à falha de órgãos e à morte.
[0162] SIRS no contexto da invenção é uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica sem sinais de infecção. Inclui, mas não se limita a mais de uma das seguintes manifestações clínicas: (1) uma temperatura corporal superior a 38 °C ou inferior a 36 °C; (2) frequência cardíaca maior que 90 batimentos por minuto; (3) taquipneia, manifestada por uma frequência respiratória maior que 20 ciclos por minuto, ou hiperventilação, como indicado por uma PaCO2 menor que 32 mmHg; e (4) uma alteração na contagem de glóbulos brancos, como uma contagem superior a 12.000/mm3, uma contagem inferior a 4.000/mm3, ou a presença de mais de 10% de neutrófilos imaturos (Bone et al., CHEST 101 (6): 1.644 a 1.655, 1992).
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55/150 [0163] Sepse no contexto da invenção se refere a uma resposta sistêmica à infecção. Alternativamente, a sepse pode ser vista como a combinação de SIRS com um processo infeccioso confirmado ou uma infecção. Sepse pode ser caracterizada como síndrome clínica definida pela presença de ambas as infecções e uma resposta inflamatória sistêmica (Levy MM et al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference). Crit Care Med. abril de 2003; 31(4):1.250 a 1.256). O termo sepse usado no presente documento inclui, mas não se limita a sepse, sepse grave, choque séptico. Sepse grave, nesse contexto, significa sepse associada à disfunção de órgãos, anormalidade na hipoperfusão ou hipotensão induzida pela sepse. As anormalidades de hipoperfusão incluem acidose láctica, oligúria e alteração aguda do estado mental. A hipotensão induzida pela sepse é definida pela presença de uma pressão arterial sistólica menor que cerca de 90 mm Hg ou sua redução em cerca de 40 mmHg ou mais da linha de base na ausência de outras causas de hipotensão (por exemplo, choque cardiogênico). Choque séptico é definido como sepse grave com persistente hipotensão induzida pela sepse, apesar da ressuscitação fluídica adequada, juntamente com a presença de anormalidades de hipoperfusão ou disfunção de órgãos (Bone et al., CHEST 101 (6): 1.644 a 1.655, 1992).
[0164] O termo sepse também inclui sepse grave ou choque séptico com base na definição do SEPSIS-2 (Bone et al., 2009). O termo sepse também inclui assuntos que se enquadram na definição do SEPSIS-3 (Singer et al., 2016).
[0165] O termo sepse usado neste artigo se refere a todos os estágios possíveis no desenvolvimento da sepse.
[0166] Conforme usado no presente documento, infecção dentro do âmbito da invenção significa um processo patológico causado pela
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56/150 invasão de tecido ou fluido normalmente estéril por microrganismos patogênicos ou potencialmente patogênicos e se refere à infecção (ou infecções) por bactérias, vírus, fungos e/ou parasitas. Consequentemente, a infecção pode ser uma infecção bacteriana, infecção viral e/ou infecção fúngica. A infecção pode ser uma infecção local ou sistêmica. Além disso, o indivíduo que sofre de uma infecção pode sofrer mais de uma fonte (ou fontes) de infecção simultaneamente. Por exemplo, o indivíduo que sofre de uma infecção pode sofrer de uma infecção bacteriana e infecção viral; de uma infecção viral e infecção fúngica; de uma infecção bacteriana e fúngica, e de uma infecção bacteriana, infecção fúngica e infecção viral.
[0167] Particularmente, o indivíduo sofre de sepse. Além disso, o indivíduo pode preferencialmente sofrer de uma doença respiratória, de preferência uma infecção do trato respiratório inferior. Conforme usado no presente documento, a doença respiratória compreende condições patológicas que afetam os órgãos e tecidos que tornam possível as trocas gasosas em organismos superiores e inclui também condições do trato respiratório superior, traqueia, brônquios, bronquíolos, alvéolos, pleura e cavidade pleural e os nervos e músculos da respiração.
[0168] Particularmente, nos métodos e kits da invenção, o nível de pelo menos uma histona na dita amostra do dito indivíduo que sofre da dita doença respiratória é indicativo do evento adverso, particularmente a mortalidade ocorrendo dentro de 7 dias.
[0169] Particularmente, nos métodos e kits da invenção, o indivíduo sofre de uma infecção do trato urinário e em que o dito nível de pelo menos uma histona na dita amostra do dito indivíduo que sofre da dita infecção do trato urinário é indicativo do evento adverso, particularmente mortalidade ocorrendo dentro de 28 dias.
[0170] Particularmente, nos métodos e kits da invenção, o indivíduo sofre de uma malignidade e em que o dito nível de pelo menos uma
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57/150 histona na dita amostra do dito indivíduo que sofre da dita malignidade é indicativo do evento adverso, particularmente mortalidade, que ocorre dentro de 7 dias.
[0171] Conforme usado no presente documento, o termo amostra é uma amostra biológica que é obtida do indivíduo. Amostra, conforme usado no presente documento, pode, por exemplo, se referir a uma amostra de fluido corporal ou tecido obtido com a finalidade de diagnóstico, prognóstico ou avaliação de um assunto de interesse, tal como um paciente. De preferência, a amostra é uma amostra de um fluido corporal, tal como sangue, soro, plasma, fluido cerebrospinal, urina, saliva, expectoração e derrames pleurais. Particularmente, a amostra é sangue, plasma sanguíneo, soro sanguíneo ou urina. As amostras podem ser processadas (pré-tratadas), tal como por procedimentos de fraccionamento ou purificação, por exemplo, separação de sangue total em componentes de soro ou plasma. Tais pré-tratamentos podem também incluir, mas não estão limitados à diluição, filtração, centrifugação, concentração, sedimentação, precipitação ou diálise. Os pré-tratamentos podem também incluir a adição de substâncias químicas ou bioquímicas à solução, tais como ácidos, bases, tampões, sais, solventes, corantes reativos, detergentes, emulsionantes, quelantes. De preferência, a amostra é uma amostra de sangue, mais preferencialmente uma amostra de soro ou uma amostra de plasma.
[0172] Plasma no contexto da presente invenção é o sobrenadante virtualmente isento de células de sangue contendo anticoagulante obtido após centrifugação. Anticoagulantes exemplificativos incluem compostos de ligação a íons de cálcio, tais como inibidores de EDTA ou citrato e trombina, tais como heparinatos ou hirudina. O plasma isento de células pode ser obtido por centrifugação do sangue anticoagulado (por exemplo, citratado, EDTA ou sangue heparinizado), por exemplo, durante pelo menos 15 minutos de 2.000 a 3.000 g.
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58/150 [0173] Soro no contexto da presente invenção é a fração líquida de sangue total que é coletada após o sangue ter sido deixado coagular. Quando o sangue coagulado (sangue com coágulos) é centrifugado, o soro pode ser obtido como sobrenadante.
[0174] Conforme usado no presente documento, urina é um produto líquido do corpo secretado pelos rins através de um processo chamado micção (ou urina) e excretado através da uretra.
[0175] Como descrito acima, o nível de pelo menos uma histona e/ou de proADM é determinado na amostra do indivíduo. A pessoa versada na técnica está ciente dos métodos/ensaios que podem ser usados para determinar o nível de biomarcadores em uma amostra.
[0176] Como descrito acima, o nível de pelo menos uma histona é determinado, particularmente, o nível (ou níveis) das histonas H2B, H4, H2A e/ou H3 é determinado. Particularmente, a histona ou o fragmento de histona pode ser determinado. Tais fragmentos são exemplificados no presente documento abaixo.
[0177] Tal histona ou fragmento da mesma pode também representar uma histona livre. Por exemplo, os métodos, kits e anticorpos da presente invenção podem particularmente detectar peptídeos ou epítopos de histonas livres. Tais trechos de aminoácidos são também referidos no presente documento como regiões centrais ou partes das histonas. A seguir, são descritos peptídeos ou epítopos que também podem ser empregados para detectar histonas livres com o uso de métodos fornecidos no presente documento.
[0178] Em particular, a pelo menos uma histona pode ser histona H4 e em que pelo menos um peptídeo da sequência abrangendo os resíduos de aminoácidos 22 a 102 da histona H4 de acordo com a SEQ ID NO: 1 é determinado. Particularmente, a pelo menos uma histona é a histona H4 e em que pelo menos um peptídeo da sequência é determinado selecionado a partir do grupo que consiste em uma sequência
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59/150 de aminoácidos que abrange os resíduos 60 a 67 da SEQ ID NO: 1, resíduos 46 a 56 da SEQ ID NO: 1, resíduos 67 a 78 da SEQ ID NO: 1, resíduos 22 a 30 da SEQ ID NO: 1, resíduos 67 a 78 da SEQ ID NO: 1, resíduos 92 a 102 da SEQ ID NO: 1, resíduos 22 a 34 da SEQ ID NO: 1, resíduos 46 a 102 da SEQ ID NO: 1, resíduos 46 a 55 da SEQ ID NO: 1, resíduos 80 a 91 da SEQ ID NO: 1, resíduos 24 a 35 da SEQ ID NO: 1 e resíduos 68 a 77 da SEQ ID NO: 1. Por exemplo, dois peptídeos podem ser determinados.
[0179] Particularmente, a pelo menos uma histona é a histona H4 e em que os peptídeos são determinados de uma sequência de aminoácidos que abrange os resíduos 46 a 56 da SEQ ID NO: 1 e os resíduos 67 a 78 da SEQ ID NO: 1.
[0180] Além disso, a pelo menos uma histona é a histona H2A e em que pelo menos um peptídeo da sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 20 a 118 da histona H2A de acordo com a SEQ ID NO: 2 é determinado. Em particular, a pelo menos uma histona é a histona H2A e em que pelo menos um peptídeo da sequência é determinado selecionado a partir do grupo que consiste em uma sequência de aminoácidos que abrange os resíduos 21 a 53 da SEQ ID NO: 2, resíduos 21 a 29 da SEQ ID NO: 2, resíduos 30 a 53 da SEQ ID NO: 2, resíduos 120 a 129 da SEQ ID NO: 2, resíduos 21 a 29 da SEQ ID NO: 2, resíduos 82 a 88 da SEQ ID NO: 2, resíduos 89 a 95 da SEQ ID NO: 2 e resíduos 100 a 118 da SEQ ID NO: 2.
[0181] Além disso, a pelo menos uma histona é histona H3 e em que pelo menos um peptídeo da sequência abrange os resíduos de aminoácidos 27 a 62 da histona H3 de acordo com a SEQ ID NO: 3 é determinado. Além disso, a pelo menos uma histona é a histona H3 e em que pelo menos um peptídeo da sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 27 a 37 da SEQ ID NO: 3 e/ou que abrange os resíduos de aminoácidos 52 a 62 da SEQ ID NO: 3 é determinado.
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60/150 [0182] Além disso, a pelo menos uma histona é uma histona H2B e em que pelo menos um peptideo da sequência que abrange os resíduos de aminoácido 41 a 69 da histona H2B de acordo com a SEQ ID NO: 4 é determinado.
[0183] Além disso, a pelo menos uma histona é a histona H2A e em que pelo menos um peptideo ou um fragmento da mesma é selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 7, 8, 9 e 10 é determinado.
[0184] Além disso, a pelo menos uma histona é a histona H4 e em que pelo menos um peptideo ou um fragmento selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15 e 16 é determinado.
[0185] É compreendido no presente documento que um, dois, três, quatro ou mais peptídeos podem ser determinados.
[0186] O nível dos marcadores, por exemplo, a pelo menos uma histona ou fragmento da mesma e/ou a proADM ou o fragmento da mesma pode ser determinado por qualquer ensaio que determine confiavelmente a concentração do marcador. Particularmente, espectrometria de massa (MS) e/ou imunoensaios podem ser empregues como exemplificado nos exemplos anexos. Conforme usado no presente documento, um imunoensaio é um teste bioquímico que mede a presença ou concentração de uma macromolécula/polipeptídeo em uma solução através do uso de um anticorpo ou fragmento de ligação de anticorpo ou imunoglobulina.
[0187] Alternativamente, em vez de anticorpos, outras moléculas de captura ou estruturas moleculares que especifica e/ou seletivamente reconhecem sequências de histona, epítopos de histona e conformações estruturais de histonas podem ser englobadas pelo escopo da presente invenção. No presente documento, o termo moléculas de captura ou estruturas moleculares compreende moléculas que podem ser usadas
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61/150 para ligar moléculas alvo ou moléculas de interesse, isto é, analitos (por exemplo, histona (ou histonas) e/ou proADM), a partir de uma amostra. As moléculas de captura devem, desse modo, ter uma forma adequada, tanto espacialmente quanto em termos de características superficiais, tais como carga de superfície, hidrofobicidade, hidrofilicidade, presença ou ausência de doadores e/ou aceitadores de Lewis para ligar especificamente as moléculas alvo ou moléculas de interesse. Desse modo, a ligação pode, por exemplo, ser mediada por interações iônicas, van-derWaals, pi-pi, sigma-pi, interações hidrofóbicas ou de hidrogênio ou uma combinação de duas ou mais interações ou interações covalentes acima mencionadas entre as moléculas de captura ou arcabouço ou estrutura molecular e as moléculas alvo ou moléculas de interesse. No contexto da presente invenção, moléculas de captura ou estruturas moleculares podem, por exemplo, ser selecionadas a partir do grupo que consiste em uma molécula de ácido nucléico, uma molécula de carboidrato, uma molécula de PNA, uma proteína, um peptídeo e uma glicoproteína. As moléculas de captura ou estruturas moleculares incluem, por exemplo, aptâmeros, DARpins (Proteínas de Repetição Anquirina Projetadas), Afímeros e similares.
[0188] Conforme usado no presente documento, o termo anticorpo se refere a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina (Ig), isto é, moléculas que contém um local de ligação ao antígeno que se liga especificamente (reage imunologicamente com) um antígeno. De acordo com a invenção, os anticorpos podem ser monoclonais, bem como anticorpos policlonais. Particularmente, são usados anticorpos que se ligam especificamente a pelo menos uma histona e/ou que se ligam especificamente a proADM. Considera-se que um anticorpo é específico se a sua afinidade com a molécula de interesse, por exemplo, pelo menos uma histona e/ou proADM, ou o fragmento da mesma é pelo menos 50 vezes
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62/150 maior, preferencialmente 100 vezes maior, mais preferencialmente pelo menos 1.000 vezes maior do que com outras moléculas compreendidas em uma amostra que contém a molécula de interesse. É bem conhecido na técnica como desenvolver e selecionar anticorpos com uma dada especificidade. No contexto da invenção, os anticorpos monoclonais são preferenciais. O anticorpo ou o fragmento de ligação ao anticorpo se liga especificamente aos marcadores no presente documento definidos ou aos fragmentos dos mesmos. Em particular, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao anticorpo se liga aos peptídeos definidos no presente documento da pelo menos uma proteína de histona. Assim, os peptídeos definidos no presente documento também podem ser epítopos aos quais os anticorpos se ligam especificamente. Além disso, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao anticorpo é usado nos métodos e kits da invenção que se ligam especificamente ao proADM, particularmente ao MR-proADM. Os imunoensaios exemplificativos podem ser imunoensaios de luminescência (LIA), rádio-imunoensaio (RIA), imunoensaios de quimioluminescência e fluorescência, imunoensaio enzimático (EIA), imunoensaios ligados a enzima (ELISA), arranjos de grânulos baseados em luminescência, arranjos baseados em grânulos magnéticos, ensaios de microarranjos proteicos, formatos de teste rápido, teste de criptografia rara. Além disso, podem ser usados ensaios adequados para testes no local de tratamento e formatos de teste rápido, tais como, por exemplo, testes de tira de cromatografia imunitária. [0189] Em certos aspectos da invenção, o método é um método para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo, em que o dito método compreende [0190] (i) obter uma amostra do indivíduo;
[0191] (ii) detectar um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de pró-adrenomedulina (proADM) na amostra do dito indivíduo por
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63/150 contato da amostra com (a) anticorpo (ou anticorpos) ou fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo (ou derivados) específico para um epítopo da dita histona e/ou do dita proADM e detectar a ligação entre o anticorpo (ou anticorpos) ou o fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno ou derivado (ou derivados) do mesmos e a dita pelo menos uma histona e/ou dita proADM; e [0192] (iii) em que o dito nível de pelo menos uma histona e/ou o dito nível de pró-adrenomedulina (proADM) é/são indicativo de do dito evento adverso do dito indivíduo.
[0193] Em certos aspectos da invenção, o método é um imunoensaio que compreende as etapas de:
[0194] a) colocar a amostra em contato com [0195] (i) um primeiro anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo específico para um primeiro epítopo de uma histona ou de proADM, e [0196] (ii) um segundo anticorpo ou um fragmento do mesmo ou derivado do mesmo específico para um segundo epítopo da histona ou da proADM; e [0197] b) detectar a ligação do primeiro e segundo anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno ou derivados dos mesmos à histona ou à proADM.
[0198] De preferência, um dos anticorpos pode ser marcado e o outro anticorpo pode ser ligado a uma fase sólida ou pode ser ligado seletivamente a uma fase sólida. Em um aspecto particularmente preferencial do ensaio, um dos anticorpos é marcado enquanto o outro está ligado a uma fase sólida ou pode ser ligado seletivamente a uma fase sólida. O primeiro anticorpo e o segundo anticorpo podem estar presentes dispersos em uma mistura reacional líquida e em que um primeiro componente de marcação que é parte de um sistema de marcação ba
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64/150 seado na extinção ou amplificação por fluorescência ou quimioluminescência está ligado ao primeiro anticorpo e um segundo componente de marcação do dito sistema de marcação está ligado ao segundo anticorpo de modo que, após a ligação de ambos os anticorpos à dita pelo menos uma histona e/ou ao dita proADM a ser detectado, um sinal mensurável que permite a detecção dos complexos em sanduíche resultantes na solução de medição é gerado. O sistema de marcação pode compreender um criptato ou quelato de terras raras em combinação com um corante fluorescente ou quimioluminescente, em particular do tipo cianina.
[0199] Em uma modalidade preferencial, o método é executado como imunoensaio sanduíche heterogêneo, em que um dos anticorpos é imobilizado em uma fase sólida escolhida arbitrariamente, por exemplo, as paredes de tubos de ensaio revestidos (por exemplo, tubos de ensaio de poliestirol; tubos revestidos; CT) ou placas de microtítulo, por exemplo compostas de poliestirol, ou a partículas, tais como por exemplo, partículas magnéticas, em que o outro anticorpo tem um grupo que se assemelha a um marcador detectável ou que permite a ligação seletiva a uma etiqueta e que serve para detecção das estruturas em sanduíche formadas. É também possível uma imobilização temporariamente retardada ou subsequente com o uso de fases sólidas adequadas.
[0200] O método de acordo com a presente invenção pode além disso ser concretizado como um método homogêneo, em que os complexos em sanduíche formados pelo anticorpo/anticorpos e o marcador, por exemplo, a histona ou a proADM ou um fragmento da mesma, que é para ser detectado, permanecem suspensos na fase líquida. Nesse caso, é preferível que quando são usados dois anticorpos, ambos os anticorpos sejam marcados com partes de um sistema de detecção, o que leva à geração de um sinal ou desencadeamento de um sinal, se
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65/150 ambos os anticorpos estiverem integrados em um único sanduíche. Tais técnicas devem ser incorporadas em particular como métodos de detecção de aprimoramento ou arrefecimento brusco de fluorescência. Um aspecto particularmente preferencial se refere ao uso de reagentes de detecção que devem ser usados em pares como, por exemplo, os que são descritos nos documentos n° US 4 882 733 A, EP-B1 0 180 492 ou EP-B1 0 539 477 e na técnica anterior citada nos mesmos. Desse modo, tornam-se possíveis as medições em que apenas produtos de reação que compreendem ambos os componentes de marcação em um único complexo imunitário diretamente na mistura reacional são detectados. Por exemplo, tais tecnologias são oferecidas sob as marcas TRACE® (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) ou KRYPTOR®, implementando os ensinamentos dos pedidos citados acima. Portanto, em aspectos preferenciais particulares, é usado um dispositivo de diagnóstico para realizar o método fornecido no presente documento. Por exemplo, o nível da histona ou proADM ou um fragmento da mesma e/ou o nível de qualquer outro marcador do método fornecido no presente documento é determinado. Em aspectos preferenciais particulares, o dispositivo de diagnóstico é o KRYPTOR®.
[0201] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem preferencialmente usar um primeiro anticorpo e/ou um segundo anticorpo ou fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo (ou derivados) específico para o epítopo (ou epítopos) de pelo menos uma histona e/ou do proADM. Exemplos de peptídeos são descritos no presente documento abaixo e acima que podem ser adequados para a determinação do nível de proADM e/ou de pelo menos uma histona.
[0202] Por exemplo, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem preferencialmente usar um primeiro anticorpo e/ou um segundo anticorpo ou fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno
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66/150 ou derivado do mesmo (ou derivados) específico para o epítopo (ou epítopos) da histona H4, em que o primeiro epítopo e/ou segundo epítopo são epítopos da histona H4 presentes na sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 22 a 102 da SEQ ID NO: 1.
[0203] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem usar um primeiro anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo que é específico para um epítopo da histona H4 presente na sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 46 a 56 da SEQ ID NO: 1 e um segundo anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo que é específico para um epítopo da histona H4 presente na sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 67 a 78 da SEQ ID NO: 1.
[0204] Por exemplo, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem preferencialmente usar um primeiro anticorpo e/ou um segundo anticorpo ou fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno ou derivado (ou derivados) dos mesmos que é específico para (um) epítopo (ou apítopos) de histona H2B, em que o primeiro epítopo e/ou segundo epítopo são epítopos da histona H2B presentes na sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 41 a 69 da SEQ ID NO: 4.
[0205] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem preferencialmente usar um primeiro anticorpo e/ou um segundo anticorpo ou fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno ou derivado (ou derivados) do mesmo que é específico para (um) epítopo (ou epítopos) de histona H2A, em que o primeiro epítopo e/ou segundo epítopo são epítopos da histona H2A presentes na sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 20 a 118 da SEQ ID NO: 2.
[0206] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem usar um primeiro anticorpo e/ou um segundo anticorpo ou fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno ou derivado (ou derivados) do mesmo sendo específico para (um) epítopo (ou epítopos) da
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67/150 histona H2A, em que o primeiro epitopo e/ou segundo epitopo são epítopos da histona H2A presentes na sequência que abrange os resíduos de aminoácido 21 a 53, 20 a 118 ou 120 a 129 da SEQ ID NO: 2.
[0207] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem usar um primeiro anticorpo e/ou um segundo anticorpo ou fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno ou derivado (ou derivados) do m esmo que é específico para (um) epitopo (ou epítopos) da histona H3, em que o primeiro epitopo e/ou segundo epitopo são epítopos da histona H3 presentes na sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 27 a 62 da SEQ ID NO: 3.
[0208] Mais preferencialmente, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem usar um primeiro anticorpo e/ou um segundo anticorpo ou fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno ou derivado (ou derivados) do mesmo específico para (um) epitopo (ou epítopos) da histona H4, em que o epitopo (ou epítopos) é/são selecionado a partir do grupo que consiste em uma sequência de aminoácidos que abrange os resíduos 22 a 30 da SEQ ID NO: 1, resíduos 46 a 56 da SEQ ID NO: 1, resíduos 67 a 78 da SEQ ID NO: 1, resíduos 92 a 102 da SEQ ID NO: 1, resíduos 22 a 34 da SEQ ID NO: 1 e resíduos 46 a 102 da SEQ ID NO: 1.
[0209] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem usar um primeiro anticorpo e/ou um segundo anticorpo ou fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno ou derivado (ou derivados) do mesmo que é específico para (um) epitopo (ou epítopos) da histona H2A, em que o epitopo (ou epítopos) é/são selecionado a partir do grupo que consiste em uma sequência de aminoácidos que abrange os resíduos 21 a 53 da SEQ ID NO: 2, resíduos 21 a 29 da SEQ ID NO: 2, resíduos 30 a 53 da SEQ ID NO: 2 e resíduos 120 a 129 da SEQ ID NO: 2.
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68/150 [0210] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem usar um primeiro anticorpo e/ou um segundo anticorpo ou fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno ou derivado (ou derivados) do mesmo que é específico para o epítopo (ou epítopos) da histona H2B que abrange os resíduos 41. para 69 da SEQ ID NO: 4.
[0211] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem usar um primeiro anticorpo e/ou um segundo anticorpo ou fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno ou derivado (ou derivados) do mesmo que é específico para (um) epítopo (ou epítopos) da histona H3 que abrange os resíduos 27 a 37 da SEQ ID NO: 3 e/ou abrangendo os resíduos 52 a 62 da SEQ ID NO: 3.
[0212] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem usar um primeiro anticorpo e/ou o segundo anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno ou um derivado do mesmo que é específico para um epítopo da histona H2A presente na sequência que abrange os resíduos de aminoácido 21 a 53 e/ou 120 a 129 da sequência H2A de histona representada pela SEQ ID NO: 2.
[0213] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem usar um primeiro anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo que é específico para um epítopo da histona H4 presente na sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 22 a 102 da SEQ ID NO: 1 e um segundo anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo que é específico para um epítopo de uma histona livre H2A, H2B ou, de preferência, H3.
[0214] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem usar um primeiro anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo que é específico para um epítopo da histona H2B presente na sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 41 a 69 da SEQ ID NO: 4 e um segundo anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo que é específico para um
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69/150 epitopo de uma histona livre H2A, H4 ou H3.
[0215] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem usar um primeiro anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo que é específico para um epitopo da histona H2B presente na sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 20 a 118 da SEQ ID NO: 2 e um segundo anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo que é específico para um epitopo de uma histona livre H2B, H4 ou H3.
[0216] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem usar um primeiro anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo que é específico para um epitopo da histona H2B presente na sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 27 a 62 da SEQ ID NO: 3 e um segundo anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo que é específico para um epitopo de uma histona livre H2B, H4 ou H2A.
[0217] Além disso, os métodos de imunoensaio da presente invenção podem usar um primeiro anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou um derivado do mesmo que é específico para um epitopo da histona H2A presente na sequência que abrange os resíduos de aminoácido 21 a 53, 120 a 129 ou 20 a 118 da SEQ ID NO: 2 e um segundo anticorpo, um fragmento de ligação ao antígeno ou um derivado do mesmo que é específico para um epitopo de uma histona livre H3, H4 ou, de preferência, H2B.
[0218] A invenção se refere ainda a um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo que é específico para um epitopo de uma proteína histona ou um fragmento do mesmo, conforme detalhado acima. Anticorpos exemplificativos que são empregados com sucesso para detectar histonas ou proADM, de preferência MR-proADM, são mostrados nos exemplos em anexo. A presente invenção se
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70/150 refere, portanto, a um anticorpo (ou anticorpos), (um) fragmento (ou fragmentos) de ligação ao antígeno ou derivado (ou derivados) do mesmo que é específico para um epítopo de histona H2B, H4, H2A, H3 e/ou proADM, preferencialmente MR-proADM. Epitopos ou peptídeos exemplificativos aos quais os anticorpos se ligam especificamente são documentados no presente documento acima e abaixo.
[0219] O nível do marcador, por exemplo, pelo menos uma histona e/ou proADM, também pode ser determinado por uma análise baseada em espectrometria de massa (MS) como descrito nos exemplos anexos. Tal método pode compreender a detecção da presença, quantidade ou concentração de um ou mais fragmentos peptídicos modificados ou não modificados de, por exemplo, proADM e/ou a histona na dita amostra biológica ou uma digestão proteica (por exemplo, digestão tríptica) da dita amostra e, opcionalmente, separação da amostra com métodos cromatográficos e com a submissão a amostra preparada e opcionalmente separada à análise de MS. Por exemplo, podem ser usados monitoramento da reação selecionada (SRM), monitoramento de múltiplas reações (MRM) ou monitoramento da reação paralela (PRM) na análise de MS, particularmente para determinar as quantidades de pelo menos um peptídeo de histona. No presente documento, o termo espectrometria de massa ou MS se refere a uma técnica analítica para identificar compostos pela sua massa. A fim de melhorar as capacidades de correção de massa e determinação de massa da espectrometria de massa, as amostras podem ser processadas antes da análise de MS. Consequentemente, a invenção se refere a métodos de detecção de MS que podem ser combinados com tecnologias de imunoenriquecimento, métodos relacionados com a preparação de amostras e/ou modos cromatográficos, de preferência com cromatografia líquida (LC), com mais preferência com cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) ou ultra
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71/150 cromatografia líquida de alta eficiência (UHPLC). Os métodos de preparação de amostras compreendem técnicas para análise, fraccionamento, digestão da amostra em peptídeos, depleção, enriquecimento, diálise, dessalinização, alquilação e/ou redução de peptídeos. No entanto, essas etapas são opcionais. A detecção seletiva de íons analitos pode ser conduzida com espectrometria de massa em tandem (MS/MS). A espectrometria de massa em tandem é caracterizada pela etapa de seleção de massa (conforme usado no presente documento, o termo seleção de massa denota isolamento de íons que tem m/z especificado ou faixa estreita de m/zs), seguido por fragmentação dos íons selecionados e análise de massa dos íons (fragmento) de produto resultante.
[0220] A pessoa versada na técnica está ciente de como quantificar o nível de um marcador na amostra por métodos de espectrometria de massa. Por exemplo, a quantificação relativa rSRM ou quantificação absoluta pode ser empregada conforme descrito acima.
[0221] Conforme usado no presente documento, o diagnóstico no contexto da presente invenção se refere ao reconhecimento e detecção (precoce) do evento adverso, particularmente mortalidade, em um indivíduo e pode também compreender diagnóstico diferencial. Também a avaliação da gravidade do evento adverso pode ser englobada pelo termo diagnóstico. Por exemplo, a avaliação de quão crítica é a condição e quão provável é a ocorrência do evento adverso. Adicionalmente, o diagnóstico significa que o momento pode ser previsto quando ocorre o evento adverso no indivíduo, por exemplo, em pelo menos 28, 7 ou 3 dias.
[0222] Prognóstico se refere à previsão de um resultado ou um risco específico para um indivíduo de experimentar/vivenciar/sofrer de um evento adverso, particularmente mortalidade. Isso também pode in
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72/150 cluir uma estimativa da chance de recuperação ou a chance de um resultado adverso para o dito indivíduo.
[0223] A invenção também se refere a métodos e kits para monitoramento, orientação terapêutica e/ou controle de terapia de indivíduos, sendo que o método compreende [0224] (i) determinar um nível de pelo menos uma histona em uma amostra do dito indivíduo, e em que o dito nível de pelo menos uma histona é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo; e/ou [0225] (ii) determinar um nível de pró-adrenomedulina (proADM) em uma amostra do dito indivíduo, e em que o dito nível de proADM é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo.
[0226] Os métodos e kits da invenção também podem ser usados para monitoramento. Monitoramento se refere ao acompanhamento de uma doença ou condição médica já diagnosticada, por exemplo, para analisar a progressão da doença ou condição médica ou a influência de um tratamento específico na progressão e prever o resultado adverso, por exemplo, uma condição de saúde de ameaça à vida ou mesmo mortalidade.
[0227] O termo controle de terapia no contexto da presente invenção se refere ao monitoramento e/ou ajuste de um tratamento terapêutico do indivíduo. O ajuste de um tratamento terapêutico pode também incluir a decisão em relação ao indivíduo ser adicionalmente tratado conforme feito anteriormente ou o tratamento ser adaptado. Por exemplo, o ajuste do tratamento terapêutico pode estar relacionado ao indivíduo ser mantido na UTI ou ED ou ser liberado.
[0228] Na presente invenção, os termos avaliação de risco e estratificação de risco se referem ao agrupamento de indivíduos em diferentes grupos de risco de acordo com seu prognóstico adicional. A avaliação de risco também se refere à estratificação para aplicação de medidas preventivas e/ou terapêuticas.
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73/150 [0229] Conforme usado no presente documento, o termo orientação terapêutica se refere à aplicação de certas terapias ou intervenções médicas com base no valor de um ou mais biomarcadores e/ou parâmetros clínicos e/ou pontuações clínicas.
[0230] Os métodos da presente invenção podem em parte ser implementados por computador. Por exemplo, a etapa de comparar o nível detectado de um marcador, por exemplo, o nível proADM e/ou um nível histônico, com um nível de referência, pode ser realizada em um sistema de computador. No sistema informático, o nível determinado do marcador (ou marcadores) pode ser combinado com outros níveis de marcadores e/ou parâmetros do indivíduo, a fim de calcular uma pontuação que seja indicativa do diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco. Por exemplo, os valores determinados podem ser inseridos (manualmente por um profissional de saúde ou automaticamente a partir do dispositivo (ou dispositivos) em que o respectivo nível (ou níveis) do marcador foi determinado) no sistema do computador. O sistema de computador pode estar diretamente no ponto de atendimento (por exemplo, UTI ou ED) ou pode estar em um local remoto conectado por meio de uma rede de computadores (por exemplo, pela Internet). Normalmente, o sistema de computador armazena os valores (por exemplo, nível do marcador ou parâmetros como idade, pressão arterial, peso, sexo, etc.) em um meio legível por computador e calcula a pontuação com base em níveis de referência ou valores de referência pré-definidos e/ou pré-armazenados. A pontuação resultante será exibida e/ou impressa para o usuário (normalmente um profissional de saúde, como um médico). Alternativa ou adicionalmente, o prognóstico, diagnóstico, avaliação ou estratificação associados serão exibidos e/ou impressos para o usuário (normalmente um profissional de saúde, tal como um médico).
[0231 ] Portanto, a presente invenção em um outro aspecto se refere
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74/150 a um sistema para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso no indivíduo, sendo que o mesmo compreende [0232] (i) um analisador de amostra para determinar o nível de proADM e/ou histona na amostra de um indivíduo (e, opcionalmente, níveis adicionais de marcadores); e [0233] (ii) um subsistema de computador programado para calcular o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso no indivíduo, tipicamente baseado na comparação do nível (ou níveis) determinado com (um) nível (ou níveis) de referência.
[0234] O subsistema de computador pode combinar o nível (ou níveis) de marcador detectado com outro nível (ou níveis) e/ou parâmetro (ou parâmetros) conforme descrito no presente documento. A saída do dispositivo pode ser uma pontuação ou diretamente o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso no indivíduo.
[0235] Em um aspecto relacionado, a invenção se refere a um produto de programa de computador incorporado em um meio legível por computador que, quando executado em um computador, executa etapas que compreendem determinar o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso em uma indivíduo com base no nível determinado de proADM e/ou histona na amostra do indivíduo. Tipicamente, essa etapa se baseia na comparação do nível (ou níveis) determinado com (um) nível (ou níveis) de referência, conforme descrito no presente documento.
[0236] A invenção se refere ainda a kits, ao uso dos kits e métodos em que tais kits são usados. A invenção se refere a kits para a realização dos métodos acima e abaixo fornecidos. As definições fornecidas
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75/150 no presente documento, por exemplo, fornecidas em relação aos métodos, também se aplicam aos kits da invenção. Em particular, a invenção se refere a kits para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco, em que o dito kit compreende [0237] (i) reagentes de detecção para determinar o dito nível de pelo menos uma histona na dita amostra do dito indivíduo, e [0238] dados de referência que incluem o dito nível de referência de pelo menos uma histona e em que um nível aumentado da dita pelo menos uma histona na dita amostra do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência de pelo menos uma histona é indicativo de um evento adverso do dito indivíduo; e/ou [0239] (ii) reagentes de detecção para determinar o dito nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo, e [0240] dados de referência que incluem o dito nível de referência do proADM, e [0241 ] em que um nível aumentado da dita proADM na dita amostra do dito indivíduo, em comparação com o dito nível de referência de proADM, é indicativo de um evento adverso do dito indivíduo.
[0242] Além disso, a invenção se refere preferencialmente a um kit e seu uso para realizar o método da invenção, em que o dito kit compreende reagentes de detecção para determinar o dito nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo e dados de referência incluindo o dito nível de referência de proADM, e em que um aumento no nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência de proADM é indicativo de um evento adverso do dito indivíduo.
[0243] Além disso, a invenção se refere preferencialmente a um kit e seu uso para realizar o método da invenção, em que o dito kit compreende reagentes de detecção para determinar o dito nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo e dados de referência que inclui o dito
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76/150 nível de referência de proADM, e em que uma diminuição no nível de proADM ou um nível similar de proADM na dita amostra do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência de proADM indica que um evento adverso do dito indivíduo não ocorre em cerca de 28 dias.
[0244] A invenção também se refere a um kit e o uso do mesmo para diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo, [0245] (i) em que o nível de pelo menos uma histona é determinado na amostra do indivíduo, [0246] em que o nível de pelo menos uma histona é comparado com o nível de referência de pelo menos uma histona, e [0247] em que o evento adverso do dito indivíduo é identificado com base na comparação do nível de pelo menos uma histona determinada na amostra e o nível de referência de pelo menos uma histona; e/ou [0248] (ii) em que o nível de proADM é determinado na amostra do indivíduo, [0249] em que o nível de proADM é comparado com o nível de referência de proADM, e [0250] em que o evento adverso do indivíduo é identificado com base na comparação do nível de proADM determinado na amostra e no nível de referência do proADM.
[0251] A invenção também se refere ao kit e seu uso para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo, [0252] (i) em que o kit compreende reagentes de detecção para determinar um nível de pelo menos uma histona na amostra de um indivíduo e [0253] em que o nível de pelo menos uma histona é indicativo do evento adverso dos referidos indivíduos; e/ou
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77/150 [0254] (ii) em que o kit compreende reagentes de detecção para determinar um nível de proADM na amostra de um indivíduo, e [0255] em que o dito nível da dita proADM é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo.
[0256] Conforme usado no presente documento, dados de referência compreendem nível (ou níveis) de referência de pelo menos uma histona e/ou de proADM, particularmente MR-proADM. Os níveis de pelo menos uma histona e/ou de proADM na amostra do indivíduo podem ser comparados com os níveis de referência compreendidos nos dados de referência do kit. Um nível aumentado do marcador (ou marcadores) determinado é indicativo do evento adverso, particularmente mortalidade. Um nível diminuído ou um nível igual do marcador (ou marcadores) determinado indica que o evento adverso não ocorre, particularmente mortalidade. Os níveis de referência são descritos no presente documento acima. Os dados de referência também podem incluir uma amostra de referência à qual o nível de pelo menos uma histona e/ou o nível de proADM é comparado. Os dados de referência também podem incluir um manual de instruções sobre como usar os kits da invenção.
[0257] Conforme usado no presente documento, o reagente de detecção ou similares são reagentes que são adequados para determinar o marcador (ou marcadores) descrito, por exemplo, pelo menos uma histona e/ou proADM. Tais reagentes de detecção exemplificativos são, por exemplo, ligantes, por exemplo, anticorpos ou fragmentos dos mesmos, que se ligam especificamente ao peptídeo ou epítopos do marcador (ou marcadores) descrito no presente documento. Tais ligantes podem ser usados em imunoensaios como descrito acima. Outros reagentes que são usados nos imunoensaios para determinar o nível do marcador (ou marcadores) podem também estar incluídos no kit e são considerados no presente documento como reagentes de detecção. Os reagentes de detecção também podem estar relacionados a reagentes
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78/150 que são usados para detectar os marcadores ou fragmentos dos mesmos por métodos baseados em MS. Tal reagente de detecção pode, assim, também ser reagentes, por exemplo, enzimas, produtos químicos, tampões, etc., que são usados para preparar a amostra para a análise de MS. Um espectrômetro de massa também pode ser considerado como um reagente de detecção. Os reagentes de detecção de acordo com a invenção também pode ser solução (ou soluções) de calibragem, por exemplo, que pode ser empregada para determinar e comparar o nível do marcador (ou marcadores).
[0258] As definições e explicações dadas também se aplicam após devidas alterações aos seguintes itens. A presente invenção também se refere aos seguintes itens:
[0259] 1. Um método para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo, em que o dito método compreende [0260] (i) determinar um nível de pelo menos uma histona em uma amostra do dito indivíduo, e em que o dito nível de pelo menos uma histona é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo; e/ou [0261 ] (ii) determinar um nível de pró-adrenomedulina (proADM) em uma amostra do dito indivíduo, e em que o dito nível de proADM é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo.
[0262] 2. O método do item 1, em que o dito evento adverso ocorre no prazo de 28 dias ou em que o dito evento adverso não ocorre no prazo de 28 dias.
[0263] 3. O método do item 1 ou 2, em que [0264] (i1) o dito nível de pelo menos uma histona é comparada com um nível de referência de pelo menos uma histona; e/ou [0265] (ii1) dito nível de proADM é comparado com um nível de referência de proADM; e
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79/150 [0266] (iii) em que o dito evento adverso do dito indivíduo é identificado com base na comparação no passo (i1) e/ou (ii1), respectivamente.
[0267] 4. O método de qualquer um dos itens 1 a 3, em que [0268] (i) um aumento do nível de pelo menos uma histona, em comparação com o nível de referência de pelo menos uma histona é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo; e/ou [0269] (ii) um aumento no nível de proADM, em comparação com o nível de referência de proADM é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo, em que preferencialmente o dito evento adverso ocorre dentro de cerca de 28 dias, ou [0270] uma diminuição no nível ou em um nível igual da dita proADM do dito indivíduo, em comparação com o dito nível de referência do dito proADM, é indicativa de que o evento adverso não ocorre, de preferência dentro de cerca de 28 dias.
[0271] 5. O método de qualquer um dos itens 1 a 4, em que o dito evento adverso é selecionado a partir do grupo que consiste em mortalidade, disfunção orgânica, disfunção de múltiplos órgãos e uma doença ou distúrbio médico, como uma infecção.
[0272] 6. O método de qualquer um dos itens 1 a 5, em que o dito evento adverso é a mortalidade.
[0273] 7. O método de qualquer um dos itens 3 a 6, em que o nível de referência de proADM é de cerca de 0,9 nmol/l a cerca de 1,8 nmol/l. [0274] 8. O método de qualquer um dos itens 1 a 7, em que [0275] (i) o aumento do nível da dita pelo menos uma histona é cerca de duas vezes tão grande quanto o dito nível de referência de pelo menos uma histona; e/ou [0276] (ii) o aumento do nível da dita proADM é cerca de duas vezes maior do que o dito nível de referência da proADM.
[0277] 9. O método de qualquer um dos itens 3 a 8, em que o dito
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80/150 nível de referência de pelo menos uma histona e/ou o nível de referência de proADM é/são um nível de pelo menos uma histona e/ou um nível de proADM de pelo menos um indivíduo de referência.
[0278] 10. O método de qualquer um dos itens 3 a 9, em que o indivíduo (ou indivíduos) de referência é/são indivíduo (ou indivíduos) saudável e/ou indivíduo (ou indivíduos) que não tem (têm) evento adverso. [0279] 11.0 método de qualquer um dos itens 3 a 10, em que o dito nível de referência de pelo menos uma histona e/ou o nível de referência de proADM é um nível de pelo menos uma histona e/ou de proADM que é/são obtida de análise prévia do dito indivíduo.
[0280] 12. O método de qualquer um dos itens 1 a 11, em que a dita proADM é pró-adrenomedulina mesoregional (MR-proADM).
[0281 ] 13. O método de qualquer um dos itens 1 a 12, em que o dito nível de proADM do dito indivíduo é indicativo do dito evento adverso, preferencialmente mortalidade, do dito indivíduo que ocorre dentro de 28 dias.
[0282] 14. O método de qualquer um dos itens 1 a 13, em que o dito nível de proADM do dito indivíduo é indicativo do dito evento adverso, preferencialmente mortalidade, do dito indivíduo que ocorre dentro de 7 dias.
[0283] 15. O método de qualquer um dos itens 1 a 14, em que a dita pelo menos uma histona é histona H2B, histona H2A, histona H3 e/ou histona H4.
[0284] 16. O método de qualquer um dos itens 1 a 15, em que a dita pelo menos uma histona é histona H2B.
[0285] 17. O método de qualquer um dos itens 1 a 16, em que o dito nível de pelo menos uma histona do dito indivíduo é indicativo do dito evento adverso, de preferência mortalidade, do dito indivíduo que ocorre dentro de 7 dias ou dentro de 3 dias.
[0286] 18. O método de qualquer um dos itens 1 a 17, em que o dito
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81/150 método compreende ainda a determinação de pelo menos um marcador e/ou parâmetro do dito indivíduo selecionado a partir do grupo que consiste em um nível de lactato na dita amostra, um nível de pelo menos uma histona, um nível de aldolase B na dita amostra, um nível de copeptina na dita amostra, um nível de lactato na dita amostra, um nível de procalcitonina (PCT) na dita amostra, a pontuação de avaliação de falha de órgãos sequencial (pontuação SOFA) do dito indivíduo, a pontuação fisiológica aguda simplificada (pontuação SAPSII), pontuação da Avaliação da Fisiologia Aguda e Saúde Crônica II (APACHE II) do dito indivíduo e um nível da tirosina quinase 1 solúvel (sFlt-1) na dita amostra.
[0287] 19. O método de qualquer um dos itens 1 a 18, em que adicionalmente, a pontuação de avaliação de falha de órgão sequencial (pontuação SOFA) do dito indivíduo é determinada.
[0288] 20. O método de qualquer um dos itens 3 a 19, em que [0289] o nível de referência da proADM é de cerca de 1,8 nmol/l, se a pontuação do SOFA do indivíduo for < 6;
[0290] o nível de referência da proADM é de cerca de 3,2 nmol/l, se a pontuação SOFA do indivíduo for de 7 a 12; ou [0291] o nível de referência da proADM é de cerca de 5,5 nmol/l se a pontuação SOFA do indivíduo for > 13.
[0292] 21. O método de qualquer um dos itens 1 a 20, em que [0293] uma diminuição no nível ou em um nível igual de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 1,8 nmol/l e uma pontuação de SOFA de 6 do dito indivíduo indicam que o dito evento adverso não ocorre;
[0294] uma diminuição no nível ou em um nível igual de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 3,2 nmol/l e uma pontuação SOFA de 7 a 12 do dito indivíduo são indicativos de que o dito evento adverso não ocorre; ou
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82/150 [0295] uma diminuição no nível ou em um nível igual de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 5,6 nmol/l e uma pontuação SOFA de 13 do dito indivíduo indicam que o dito evento adverso não ocorre; e [0296] em que, de preferência, o dito evento adverso não ocorre dentro de cerca de 28 dias.
[0297] 22. O método de qualquer um dos itens 1 a 20, em que [0298] um aumento no nível de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é cerca de 1,8 nmol/l e uma pontuação SOFA de 6 do dito indivíduo são indicativos do dito evento adverso do dito indivíduo;
[0299] um aumento no nível de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 3,2 nmol/l e uma pontuação SOFA de 7 a 12 do dito indivíduo são indicativos do dito evento adverso do dito indivíduo; ou [0300] um aumento no nível de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é cerca de 5,6 nmol/l e uma pontuação SOFA de > 13 do dito indivíduo são indicativos do dito evento adverso do dito indivíduo, [0301] em que, de preferência, o dito evento adverso ocorre dentro de cerca de 28 dias.
[0302] 23. O método de qualquer um dos itens 19 a 23, em que a pontuação de SOFA do dito indivíduo é aumentada com base no nível de proADM do dito indivíduo, e em que o dito índice de SOFA modificado é indicativo do dito evento adverso.
[0303] 24. O método do item 23, em que a pontuação SOFA do indivíduo é aumentado em um se o indivíduo tiver um nível proADM maior que cerca de 1,8 nmol/l.
[0304] 25. O método de qualquer um dos itens 1 a 24, em que o dito método compreende a determinação do dito nível de pelo menos uma
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83/150 histona e o dito nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo. [0305] 26. O método do item 25, em que o dito nível de pelo menos uma histona e o dito nível de proADM são indicativos do dito evento adverso, de preferência mortalidade, do dito indivíduo que ocorre dentro de 28 dias.
[0306] 27. O método de qualquer um dos itens 1 a 26, em que o dito método compreende a determinação do dito nível de pelo menos uma histona na dita amostra do dito indivíduo e a dita pontuação SAPSII do dito indivíduo.
[0307] 28. O método do item 27, em que o dito nível de pelo menos uma histona e a dita pontuação SAPSII são indicativos do dito evento adverso, de preferência mortalidade, do dito indivíduo que ocorre dentro de 28 dias.
[0308] 29. O método de qualquer um dos itens 1 a 28, em que o dito método compreende a determinação do dito nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo e a dita pontuação SAPSII do dito indivíduo.
[0309] 30. O método do item 29, em que o dito nível de proADM e a dita pontuação de SAPSII são indicativos do dito evento adverso, de preferência mortalidade, do dito indivíduo que ocorre dentro de 28 dias ou no prazo de 7 dias.
[0310] 31. O método de qualquer um dos itens 1 a 30, em que o dito método compreende a determinação do dito nível de proADM, o dito índice de SOFA e o dito nível de lactato do dito indivíduo.
[0311 ] 32. O método de qualquer um dos itens 1 a 31, em que o dito indivíduo sofre de uma doença ou condição médica.
[0312] 33. O método de qualquer um dos itens 1 a 32, em que o dito indivíduo é um doente crítico, preferencialmente em que o dito indivíduo é admitido em uma unidade de terapia intensiva.
[0313] 34. O método de qualquer um dos itens 1 a 33, em que o dito indivíduo sofre de uma doença ou condição médica e em que a dita
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84/150 doença ou condição médica é selecionada a partir do grupo que consiste em doença respiratória, infecção do trato urinário, uma resposta inflamatória relacionada com etiologias infecciosas e não infecciosas, síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS), sepse, sepse grave, choque séptico, falência de órgãos, doença cardiovascular, diabetes mellitus, malignidade, doença hepática, doença renal, imunodepressão, infecção viral, infecção fúngica, infecção bacteriana, infecção bacteriana gram-negativa, infecção bacteriana gram-positiva e imunossupressão.
[0314] 35. O método de qualquer um dos itens 1 a 34, em que o dito indivíduo sofre de sepse.
[0315] 36. O método de qualquer um dos itens 1 a 35, em que o dito indivíduo é um indivíduo imunossuprimido, tal como um indivíduo que sofre do vírus da imunodeficiência humana (HIV), um indivíduo submetido à radioterapia e/ou um indivíduo que recebe fármacos imunossupressores [0316] 37. O método de qualquer um dos itens 1 a 36, em que o dito indivíduo sofre de uma doença respiratória, de preferência uma infecção do trato respiratório inferior.
[0317] 38. O método do item 37, em que o dito nível de pelo menos uma histona na dita amostra do dito indivíduo que sofre da dita doença respiratória é indicativo de que a mortalidade ocorre dentro de 7 dias. [0318] 39. O método de qualquer um dos itens 1 a 38, em que o dito indivíduo sofre de uma infecção do trato urinário [0319] 40. O método do item 39, em que o dito nível de pelo menos uma histona na dita amostra do dito indivíduo que sofre da dita infecção do trato urinário é indicativo de que a mortalidade ocorre dentro de 28 dias.
[0320] 41. O método de qualquer um dos itens 1 a 40, em que o dito indivíduo sofre de uma malignidade.
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85/150 [0321 ] 42. O método do item 41, em que o dito nível de pelo menos uma histona na dita amostra do dito indivíduo que sofre da dita malignidade é indicativo de que a mortalidade ocorre dentro de 7 dias.
[0322] 43. O método de qualquer um dos itens 1 a 42, em que o nível do marcador ou do parâmetro é determinado durante cerca de 12 horas de admissão do dito indivíduo.
[0323] 44. O método de qualquer um dos itens 1 a 43, em que a dita amostra é um fluido corporal, sangue, plasma sanguíneo, soro sanguíneo ou urina.
[0324] 45. O método de qualquer um dos itens 1 a 44, em que o dito nível de pelo menos uma histona e/ou de proADM é determinado com o uso de um método selecionado a partir do grupo que consiste em espectrometria de massa (EM), imunoensaio de luminescência (LIA), rádio-imunoensaio (RIA), imunoensaios de quimiluminescência e fluorescência, imunoensaio de enzima (EIA), imunoensaios ligados a enzima (ELISA), matrizes de esferas baseadas em luminescência, matrizes baseadas em esferas magnéticas, ensaios de microarranjos de proteína, formatos de teste rápido e ensaio de criptato raro.
[0325] 46. O método do item 45, em que o método é um imunoensaio e em que o ensaio é realizado em fase homogênea ou em fase heterogênea.
[0326] 47. O método do item 45 ou 46, em que o método é um imunoensaio que compreende as etapas de:
[0327] a) colocar a amostra em contato com [0328] (i) um primeiro anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno ou derivado do mesmo específico para um primeiro epítopo de uma histona ou proADM, e [0329] (ii) um segundo anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno ou derivado do mesmo específico para um segundo epítopo da histona ou proADM; e
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86/150 [0330] b) detectar a ligação do primeiro e segundo anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno ou derivados dos mesmos à dita primeira histona ou à proADM.
[0331] 48. O método do item 47, em que um dos primeiros ou segundos anticorpos é marcado e o outro anticorpo é ligado a, ou é capaz de ser seletivamente ligado a uma fase sólida.
[0332] 49. O método do item 47 ou 48, em que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo estão presentes dispersos em uma mistura reacional líquida e em que um primeiro componente de marcação que faz parte de um sistema de marcação baseado na extinção ou amplificação por fluorescência ou quimioluminescência está ligado ao primeiro anticorpo, e um segundo componente de marcação do dito sistema de marcação está ligado ao segundo anticorpo de modo que, após a ligação de ambos os anticorpos à dita pelo menos uma histona ou à dita proADM a ser detectada é gerado um sinal mensurável que permite a detecção dos complexos em sanduíche resultantes na solução de medição.
[0333] 50. O método do item 49, em que o sistema de marcação compreende um criptato ou quelato de terras raras em combinação com um corante fluorescente ou quimioluminescente, em particular do tipo cianina.
[0334] 51. O método do item 45, em que o método de análise MS é o monitoramento de reação (SRM), monitoramento de reação múltipla (MRM) ou monitoramento de reação paralela (PRM).
[0335] 52. O método de qualquer um dos itens 1 a 51, em que a dita pelo menos uma histona é histona H4 e em que pelo menos um peptídeo da sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 22 a 102 da histona H4 de acordo com a SEQ ID NO: 1 é determinado.
[0336] 53. O método de qualquer um dos itens 1 a 52, em que a dita
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87/150 pelo menos uma histona é histona H4 e em que pelo menos um peptídeo da sequência é determinado selecionado a partir do grupo que consiste em uma sequência de aminoácidos que abrange os resíduos 47 a 59 da SEQ ID NO: 1, resíduos 68 a 79 da SEQ ID NO: 1, resíduos 60 a 67 da SEQ ID NO: 1, resíduos 22 a 30 da SEQ ID NO: 1, resíduos 67 a 78 da SEQ ID NO: 1, resíduos 92 a 102 da SEQ ID NO: 1, resíduos 22 a 34 da SEQ ID NO: 1, resíduos 46 a 102 da SEQ ID NO: 1, resíduos 46 a 55 da SEQ ID NO: 1, resíduos 80 a 91 da SEQ ID NO: 1, resíduos 24 a 35 da SEQ ID NO: 1 e resíduos 68 a 77 da SEQ ID NO: 1.
[0337] 54. O método de qualquer um dos itens 1 a 53, em que a dita pelo menos uma histona é histona H2A e em que pelo menos um peptídeo da sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 20 a 118 da histona H2A de acordo com a SEQ ID NO: 2 é determinado.
[0338] 55. O método de qualquer um dos itens 1 a 54, em que a dita pelo menos uma histona é histona H2A e em que pelo menos um peptídeo da sequência é determinado selecionado a partir do grupo que consiste em uma sequência de aminoácidos que abrange os resíduos 21 a 53 da SEQ ID NO: 2, resíduos 21 a 29 da SEQ ID NO: 2, resíduos 30 a 53 da SEQ ID NO: 2, resíduos 120 a 129 da SEQ ID NO: 2, resíduos 21 a 29 da SEQ ID NO: 2, resíduos 82 a 88 da SEQ ID NO: 2, resíduos 89 a 95 da SEQ ID NO: 2 e resíduos 100 a 118 da SEQ ID NO: 2.
[0339] 56. O método de qualquer um dos itens 1 a 55, em que a dita pelo menos uma histona é histona H3 e em que pelo menos um peptídeo da sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 27 a 62 da histona H3 de acordo com a SEQ ID NO: 3 é determinado.
[0340] 57. O método de qualquer um dos itens 1 a 56, em que a dita pelo menos uma histona é histona H3 e em que pelo menos um peptídeo da sequência que abrange os resíduos de aminoácidos 27 a 37 da SEQ ID NO: 3 e/ou que abrange os resíduos de aminoácidos 52 a 62 da SEQ ID NO: 3 é determinado.
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88/150 [0341 ] 58. O método de qualquer um dos itens 1 a 57, em que a dita pelo menos uma histona é histona H2B e em que pelo menos um peptideo da sequência que abrange os resíduos de aminoácido 41 a 69 da histona H2B de acordo com a SEQ ID NO: 4 é determinado.
[0342] 59. O método de qualquer um dos itens 1 a 59, em que a dita pelo menos uma histona é histona H2A e em que pelo menos um peptideo ou um fragmento do mesmo é determinado selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 7, 8, 9 e 10 é determinado.
[0343] 60. O método de qualquer um dos itens 1 a 59, em que a dita pelo menos uma histona é a histona H4 e em que pelo menos um peptideo ou um fragmento do mesmo é selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15 e 16 é determinado.
[0344] 61. Um kit para executar o método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 60, em que o dito kit compreende [0345] (i) reagentes de detecção para determinar o dito nível de pelo menos uma histona na dita amostra do dito indivíduo, e [0346] dados de referência que incluem o dito nível de referência de pelo menos uma histona e em que um aumento no nível de pelo menos uma histona na dita amostra do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência de pelo menos uma histona é indicativo de um evento adverso do dito indivíduo; e/ou [0347] (ii) reagentes de detecção para determinar o dito nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo, e [0348] dados de referência que incluem o dito nível de referência do proADM, e [0349] em que um aumento no nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência de proADM é indicativo de um evento adverso do dito indivíduo.
[0350] 62. Um kit para executar o método de acordo com qualquer
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89/150 um dos itens 1 a 29, em que o dito kit compreende reagentes de detecção para determinar o dito nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo e dados de referência incluindo o dito nível de referência de proADM e em que uma diminuição do nível de proADM ou um nível similar de proADM na dita amostra do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência de proADM é indicativo de que um evento adverso do dito indivíduo não ocorre, de preferência dentro de cerca de 28 dias. [0351 ] 63. Uso do kit conforme item 61 ou 62 no método de qualquer um dos itens 1 a 60.
[0352] 64. Uso do kit de acordo com o item 63 para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo, [0353] (i) em que o dito nível de pelo menos uma histona é determinado na dita amostra do dito indivíduo, [0354] em que o dito nível da dita pelo menos uma histona é comparado com o dito nível de referência de pelo menos uma histona, e [0355] em que o dito evento adverso do dito indivíduo é identificado com base na comparação do dito nível de pelo menos uma histona determinado na dita amostra e o dito nível de referência de pelo menos uma histona; e/ou [0356] (ii) em que o dito nível de proADM é determinado na dita amostra do dito indivíduo, [0357] em que o dito nível de proADM é comparado com o dito nível de referência de proADM, e [0358] em que o dito evento adverso do dito indivíduo é identificado com base na comparação do dito nível de proADM determinado na dita amostra e no dito nível de referência de proADM.
[0359] 65. Uso de um kit para diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo,
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90/150 [0360] (i) em que o dito kit compreende reagentes de detecção para determinar um nível de pelo menos uma histona em uma amostra de um indivíduo e [0361] em que o dito nível de pelo menos uma histona é indicativo do dito evento adverso dos ditos indivíduos; e/ou [0362] (ii) em que o dito kit compreende os reagentes de detecção para determinar um nível de proADM em uma amostra de um indivíduo, e [0363] em que o dito nível da dita proADM é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo.
[0364] A presente invenção também se refere aos seguintes itens em modalidades preferidas:
[0365] 1. Um método para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo, em que o dito método compreende [0366] determinar um nível de pró-adrenomedulina (proADM) em uma amostra do dito indivíduo e em que o dito nível de proADM é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo.
[0367] 2. O método do item 1, em que [0368] o dito nível de proADM é comparado a um nível de referência de proADM; e [0369] em que o dito evento adverso do dito indivíduo é identificado com base na comparação.
[0370] 3. O método do item 1 ou 2, [0371] em que uma diminuição no nível ou em um nível inferior ou em um nível igual da dita proADM do dito indivíduo, em comparação com o dito nível de referência do dito proADM, indicativa de que o evento adverso não ocorre, de preferência dentro de cerca de 28 dias; ou [0372] em que um aumento no nível de proADM ou nível superior de proADM em comparação com o nível de referência de proADM é
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91/150 indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo, em que, de preferência, o dito evento adverso ocorre em cerca de 28 dias.
[0373] 4. O método de qualquer um dos itens 1 a 3, em que o nível de referência de proADM é de cerca de 0,7 nmol/l a cerca de 2,0 nmol/l, de preferência cerca de 0,8 nmol/l a cerca de 1,9 nmol/l.
[0374] 5. O método de qualquer um dos itens 1 a 4, em que o dito evento adverso é a mortalidade.
[0375] 6. O método do item 5, em que um nível de proADM acima de cerca de 0,9 nmol/l, de preferência, acima de cerca de 1,9 nmol/l, com mais preferência, acima de cerca de 2,0 nmol/l indicativo de n sobrevivência do indivíduo dentro de cerca de 28 dias.
[0376] 7. O método de qualquer um dos itens 1 ou 2, em que um nível de proADM abaixo de cerca de 1,0 nmol/l, de preferência abaixo de cerca de 0,9 nmol/l, com mais preferência abaixo de cerca de 0,88 nmol/l é indicativo para o indivíduo sobreviver dentro de cerca de 28 dias.
[0377] 8. O método de qualquer um dos itens 1 a 7, em que adicionalmente, a pontuação de avaliação de falha de órgão sequencial (pontuação SOFA) do dito indivíduo é determinada.
[0378] 9. O método de qualquer um dos itens 2 a 5, em que [0379] o nível de referência de proADM é de cerca de 1,8 nmol/l para indivíduos com sintomas correspondentes a uma pontuação SOFA de < 6;
[0380] o nível de referência de proADM é de cerca de 3,2 nmol/l para indivíduos com sintomas correspondentes a uma pontuação SOFA de 7 a 12; ou [0381] o nível de referência de proADM é de cerca de 5,5 nmol/l para indivíduos com sintomas correspondentes a uma pontuação SOFA > 13.
[0382] 10. O método de qualquer um dos itens 1 a 5 ou 9, em que [0383] uma diminuição no nível ou em um nível igual de proADM do
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92/150 dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 1,8 nmol/l e uma pontuação de SOFA de 6 do dito indivíduo indicam que o dito evento adverso não ocorre;
[0384] uma diminuição no nível ou em um nível igual de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 3,2 nmol/l e uma pontuação SOFA de 7 a 12 do dito indivíduo são indicativos de que o dito evento adverso não ocorre; ou [0385] uma diminuição no nível ou em um nível igual de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 5,6 nmol/l e uma pontuação SOFA de 13 do dito indivíduo indicam que o dito evento adverso não ocorre; e [0386] em que, de preferência, o dito evento adverso não ocorre dentro de cerca de 28 dias.
[0387] 11.0 método de qualquer um dos itens 1 a 5 ou 9, em que [0388] um aumento no nível de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é cerca de 1,8 nmol/l e uma pontuação SOFA de 6 do dito indivíduo são indicativos do dito evento adverso do dito indivíduo;
[0389] um aumento no nível de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 3,2 nmol/l e uma pontuação SOFA de 7 a 12 do dito indivíduo são indicativos do dito evento adverso do dito indivíduo; ou [0390] um aumento no nível de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é cerca de 5,6 nmol/l e uma pontuação SOFA de > 13 do dito indivíduo são indicativos do dito evento adverso do dito indivíduo, [0391] em que, de preferência, o dito evento adverso ocorre dentro de cerca de 28 dias.
[0392] 12. O método de qualquer um dos itens 8 a 11, em que a pontuação de SOFA do dito indivíduo é aumentada com base no nível
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93/150 de proADM do dito indivíduo, e em que o dito índice de SOFA modificado é indicativo do dito evento adverso.
[0393] 13. O método do item 12, em que a pontuação SOFA do indivíduo é aumentado em um se o indivíduo tiver um nível proADM maior que cerca de 1,8 nmol/l.
[0394] 14. O método de qualquer um dos itens 3 a 5 e 9 a 13, em que o aumento no nível da dita proADM é cerca de duas vezes maior do que o dito nível de referência do proADM.
[0395] 15. O método de qualquer um dos itens 1 a 14, em que dita proADM é pró-adrenomedulina mesoregional (MR-proADM) ou ADM maduro.
[0396] 16. O método de qualquer um dos itens 1 a 15, em que o dito nível de proADM do dito indivíduo é indicativo do dito evento adverso, preferencialmente mortalidade, do dito indivíduo que ocorre dentro de 28 dias.
[0397] 17. O método de qualquer um dos itens 1 a 16, em que o dito método compreende ainda a determinação de pelo menos um marcador e/ou parâmetro do dito indivíduo selecionado a partir do grupo que consiste em um nível de pelo menos uma histona, um nível de procalcitonina (PCT) na dita amostra, a pontuação fisiológica aguda simplificada (pontuação SAPSII), a pontuação da Avaliação da Fisiologia Aguda e Saúde Crônica II (APACHE II) do dito indivíduo, a pontuação do índice de gravidade da Pneumonia (PSI) do dito indivíduo e a pontuação CURB-65 do dito indivíduo.
[0398] 18. O método do item 17, em que o nível do marcador ou do parâmetro é determinado durante cerca de 12 horas de admissão do dito indivíduo.
[0399] 19. O método de qualquer um dos itens 1 a 18, em que o nível de proADM é determinado durante cerca de 12 h de admissão do dito indivíduo.
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94/150 [0400] 20. O método de qualquer um dos itens 1 a 19, em que o dito método compreende a determinação do dito nível de proADM e da pontuação SOFA do dito indivíduo.
[0401 ] 21.0 método de qualquer um dos itens 1 a 20, em que o dito indivíduo sofre de uma doença ou condição médica.
[0402] 22. O método de qualquer um dos itens 1 a 21, em que o dito indivíduo é um paciente doente crítico, de preferência em que o dito indivíduo é admitido em uma unidade de terapia intensiva ou em um serviço de emergência, de preferência o dito indivíduo é admitido em uma unidade de terapia intensiva.
[0403] 23. O método de qualquer um dos itens 1 a 22, em que o dito indivíduo sofre de uma doença ou condição médica e em que a dita doença ou condição médica é selecionada a partir do grupo que consiste em doença respiratória, infecção do trato urinário, uma resposta inflamatória relacionada com etiologias infecciosas e não infecciosas, síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS), sepse, sepse grave, choque séptico, falência de órgãos, doença cardiovascular, diabetes mellitus, malignidade, doença hepática, doença renal, imunodepressão, infecção viral, infecção fúngica, infecção bacteriana, infecção bacteriana gram-negativa, infecção bacteriana gram-positiva e imunossupressão.
[0404] 24. O método de qualquer um dos itens 1 a 23, em que o dito indivíduo sofre de sepse.
[0405] 25. O método de qualquer um dos itens 1 a 24, em que o dito indivíduo é um indivíduo imunossuprimido, tal como um indivíduo que sofre do vírus da imunodeficiência humana (HIV), um indivíduo submetido a radioterapia e/ou um indivíduo a receber fármacos imunossupressoras.
[0406] 26. O método de qualquer um dos itens 1 a 25, em que a dita amostra é um fluido corporal, sangue, plasma sanguíneo, soro sanguíneo ou urina.
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95/150 [0407] 27. O método de qualquer um dos itens 1 a 26, em que o dito nível de proADM é determinado usando um método selecionado a partir do grupo que consiste em espectrometria de massa (EM), imunoensaio de luminescência (LIA), rádio-imunoensaio (RIA), imunoensaios de quimiluminescência e fluorescência, imunoensaio enzimático (EIA), imunoensaios ligados a enzima (ELISA), matrizes de esferas baseadas em luminescência, matrizes baseadas em esferas magnéticas, ensaios de microarranjos de proteína, formatos de teste rápido e ensaio de criptografia raro.
[0408] 28. O método do item 27, em que o método é um imunoensaio e em que o ensaio é realizado em fase homogênea ou em fase heterogênea.
[0409] 29. O método do item 28, em que o método é um imunoensaio que compreende as etapas de:
[0410] a) colocar a amostra em contato com [0411] (i) um primeiro anticorpo ou um fragmento do mesmo de ligação ao antígeno ou derivado específicos para um primeiro epítopo do proADM, e [0412] (ii) um segundo anticorpo ou um fragmento do mesmo ou derivado específicos para um segundo epítopo de proADM de ligação ao antígeno; e [0413] b) detectar a ligação do primeiro e segundo anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno ou seus derivados ao proADM.
[0414] 30. O método do item 29, em que um dos primeiros ou segundos anticorpos é marcado e o outro anticorpo é ligado a, ou é capaz de ser seletivamente ligado a uma fase sólida.
[0415] 31. O método do item 29 ou 30, em que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo estão presentes dispersos em uma mistura reacional líquida e em que um primeiro componente de marcação que faz parte de um sistema de marcação baseado na extinção ou amplificação
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96/150 por fluorescência ou quimioluminescência está ligado ao primeiro anticorpo e um segundo componente de marcação o dito sistema de marcação está ligado ao segundo anticorpo, de modo que, após a ligação de ambos os anticorpos ao dita proADM a ser detectado, é gerado um sinal mensurável que permite a detecção dos complexos em sanduíche resultantes na solução de medição.
[0416] 32. O método do item 31, em que o sistema de marcação compreende um criptato ou quelato de terras raras em combinação com um corante fluorescente ou quimioluminescente, em particular do tipo cianina.
[0417] 33. Um kit para executar o método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 32, em que o dito kit compreende reagentes de detecção para determinar o dito nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo e dados de referência incluindo o dito nível de referência de proADM e em que um aumento no nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência de a proADM é indicativo de um evento adverso do dito assunto.
[0418] 34. Um kit para realizar o método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 32, em que o dito kit compreende reagentes de detecção para determinar o dito nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo e dados de referência incluindo o dito nível de referência de proADM e em que uma diminuição do nível de proADM ou um nível similar de proADM na dita amostra do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência de proADM é indicativo de que um evento adverso do dito indivíduo não ocorre em cerca de 28 dias.
[0419] 35. Uso do kit conforme item 33 ou 34 no método de qualquer um dos itens 1 a 29.
[0420] 36. Uso do kit de acordo com o item 33 ou 34 para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo,
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97/150 [0421] em que o dito nível de proADM é determinado na dita amostra do dito indivíduo, [0422] em que o dito nível de proADM é comparado com o dito nível de referência de proADM, e [0423] em que o dito evento adverso do dito indivíduo é identificado com base na comparação do dito nível de proADM determinado na dita amostra e no dito nível de referência de proADM.
[0424] 37. Uso de um kit para diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo, [0425] em que o dito kit compreende reagentes de detecção para determinar um nível de proADM em uma amostra de um indivíduo e [0426] em que o dito nível da dita proADM é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo.
[0427] 38. O método de qualquer um dos itens 2 a 32, em que essa comparação é realizada em um sistema de computador.
[0428] 39. O método dos itens 1 a 32, em que o valor determinado de proADM é usado no cálculo de uma pontuação indicativa do dito diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso no indivíduo.
[0429] 40. O método do item 40, em que adicionalmente pelo menos um outro marcador e/ou parâmetro do indivíduo é usado para o cálculo da dita pontuação.
[0430] 41. O método do item 40, em que o pelo menos um marcador adicional e/ou parâmetro do dito indivíduo é selecionado a partir do grupo que consiste em um nível de pelo menos uma histona, um nível de procalcitonina (PCT) na dita amostra, a pontuação fisiológica aguda simplificada (pontuação SAPSII), a pontuação da Avaliação da Fisiologia Aguda e Saúde Crônica II (APACHE II) do dito indivíduo, a pontuação do índice de Gravidade de Pneumonia (PSI) do dito indivíduo e a pontuação CURB-65 do dito indivíduo.
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98/150 [0431] Conforme usado no presente documento, os termos que compreende e que inclui ou variantes gramaticais dos mesmos são para serem considerados como especificando pelo menos as características, números inteiros, etapas ou componentes citados, mas não excluem a adição de uma ou mais características, números inteiros, etapas, componentes ou grupos adicionais dos mesmos. Esse termo engloba os termos que consiste em e que consiste essencialmente em que são entendidos como especificação apenas a característica, números inteiros, etapas ou componentes declarados, o que exclui quaisquer recursos adicionais.
[0432] Assim, os termos que compreende/que inclui/que tem significam que qualquer componente adicional (ou características, números inteiros, etapas e similares) pode/poderia estar presente.
[0433] O termo que consiste em significa que nenhum componente adicional (ou característica, números inteiros, etapas e similares) está presente.
[0434] O termo que consiste essencialmente em ou variantes gramaticais do mesmo quando usado no presente documento deve ser considerado como especificação das características, números inteiros, etapas ou componentes citados, mas não exclui a adição de uma ou mais características, números inteiros, etapas, componentes ou grupos adicionais dos mesmos, mas apenas se as características, números inteiros, etapas, componentes ou grupos adicionais dos mesmos não alterarem materialmente as características básicas e inovadoras da composição, dispositivo ou método reivindicado.
[0435] Assim, o termo que consiste essencialmente em significa que aqueles componentes adicionais específicos (ou características, números inteiros, etapas e similares) podem estar presentes, nomeadamente aqueles que não afetam materialmente as características essenciais da composição, dispositivo ou método. Em outras palavras, o
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99/150 termo que consiste essencialmente em (que pode ser indistintamente usado no presente documento com o termo que compreende substancialmente) permite a presença de outros componentes na composição, dispositivo ou método para além dos componentes obrigatórios (ou características, números inteiros, etapas similares), desde que as características essenciais do dispositivo ou método não sejam materialmente afetadas pela presença de outros componentes.
[0436] O termo método se refere a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa, incluindo, mas não se limitando a maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos ou desenvolvidos de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por profissionais das técnicas químicas, biológicas e biofísicas.
[0437] O termo cerca de se refere, de preferência, a ± 10% do valor numérico indicado, com mais preferência a ± 5% do valor numérico indicado e, em particular, ao valor numérico exato indicado.
[0438] Conforme usado no presente documento, o termo cerca de se refere a ± 10% do valor numérico indicado, e em particular de ± 5% do valor numérico indicado. Sempre que o termo cerca de é usado, uma referência específica ao valor numérico exato indicado também é incluída. Se o termo cerca de é usado em conexão com um parâmetro que é quantificado em números inteiros, como o número de nucleotideos em um determinado ácido nucléico, os números correspondentes a ± 10% ou ± 5% do valor numérico indicado são para serem arredondados para o número inteiro mais próximo. Por exemplo, a expressão cerca de 25 aminoácidos se refere à faixa de 23 a 28 aminoácidos, em particular a faixa de 24 a 26 aminoácidos, e de preferência se refere ao valor específico de 25 aminoácidos.
[0439] A sensibilidade e especificidade de um teste diagnóstico e/ou prognóstico depende de mais do que apenas a qualidade analítica do
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100/150 teste, elas também dependem da definição do que constitui um resultado anormal. Na prática, as curvas da Característica de Operação do Receptor (curvas COR) são tipicamente calculadas plotando o valor de uma variável versus sua frequência relativa em populações normais (ou seja, aparentemente saudáveis, sem distúrbio ou condição pré-natal) e doença, por exemplo indivíduos experimentando/vivenciando/sofrendo de um evento adverso, por exemplo, mortalidade. Para qualquer marcador em particular (como MR-proADM), uma distribuição de níveis de marcadores para indivíduos com e sem doença/condição provavelmente se sobreporá. Sob tais condições, um teste não distingue absolutamente normal de doença com 100% de precisão e a área de sobreposição pode indicar onde o teste não consegue distinguir normal de doença. Um limiar é selecionado abaixo do qual o teste é considerado anormal e acima do qual o teste é considerado normal, abaixo ou acima do qual o teste indica uma condição específica, por exemplo, o evento anormal. A área sob a curva COR é uma medida da probabilidade de a medição percebida permitir a identificação correta de uma condição. As curvas COR podem ser usadas mesmo quando os resultados do teste não fornecem necessariamente um número preciso. Contanto que se possa classificar os resultados, pode-se criar uma curva COR. Por exemplo, os resultados de um teste em amostras de doença (ou evento adverso) podem ser classificados de acordo com o grau (por exemplo, 1 = baixo, 2 = normal e 3 = alto). Essa classificação pode ser correlacionada com os resultados na população normal e uma curva COR criada. Esses métodos são bem conhecidos na técnica; consultar, por exemplo, Hanley et al. 1982. Radiologia 143: 29 a 36. De um modo preferencial, um limiar selecionado para proporcionar uma área de curva COR superior a cerca de 0,5, com mais preferência superior a cerca de 0,7, ainda com mais preferência superior a cerca de 0,8, ainda com mais preferência superior a cerca de 0,85 e com mais preferência superior a
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101/150 cerca de 0,9. O termo cerca de nesse contexto se refere a +/- 5% de uma determinada medida.
[0440] O eixo geométrico horizontal da curva COR representa (1especificidade), o que aumenta com a taxa de falsos positivos. O eixo geométrico vertical da curva representa a sensibilidade, o que aumenta com a taxa de verdadeiros positivos. Assim, para um determinado ponto de corte selecionado, o valor de (1-especificidade) pode ser determinado e uma sensibilidade correspondente pode ser obtida. A área sob a curva COR é uma medida da probabilidade de que o nível do marcador medido permitirá a identificação correta do evento adverso, particularmente a mortalidade. Assim, a área sob a curva COR pode ser usada para determinar a eficácia do teste.
[0441] Em outras modalidades, uma razão de probabilidade positiva, razão de probabilidade negativa, razão de probabilidade ou razão de risco é usada como medida da capacidade de um teste de prever risco ou diagnosticar um distúrbio ou condição (resultado adverso), ou seja, grupo doente. No caso de uma razão de probabilidade positiva, um valor de 1 indica que um resultado positivo é igualmente provável entre os indivíduos nos grupos doentes e controle; um valor maior que 1 indica que um resultado positivo é mais provável no grupo doente; e um valor menor que 1 indica que um resultado positivo é mais provável no grupo de controle. No caso de uma razão de probabilidade negativa, um valor de 1 indica que um resultado negativo é igualmente provável entre os indivíduos nos grupos doentes e controle; um valor maior que 1 indica que um resultado negativo é mais provável no grupo de teste; e um valor menor que 1 indica que um resultado negativo é mais provável no grupo de controle.
[0442] No caso de uma razão de probabilidade, um valor de 1 indica que um resultado positivo é igualmente provável entre os indivíduos nos
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102/150 grupos doentes e controle; um valor maior que 1 indica que um resultado positivo é mais provável no grupo doente; e um valor menor que 1 indica que um resultado positivo é mais provável no grupo de controle. [0443] No caso de uma razão de risco, um valor de 1 indica que o risco relativo de um ponto final (por exemplo, morte) é igual em ambos os grupos doentes e controle; um valor maior que 1 indica que o risco é maior no grupo doente; e um valor menor que 1 indica que o risco é maior no grupo de controle.
[0444] A pessoa versada na técnica compreenderá que associar um indicador de diagnóstico ou prognóstico, ou a um risco diagnóstico ou prognóstico de um resultado clínico futuro é uma análise estatística. Por exemplo, um nível de marcador inferior a X pode indicar que um paciente tem maior probabilidade de sofrer um evento/resultado adverso do que pacientes com um nível maior ou igual a X, conforme determinado por um nível de significância estatística. Além disso, uma mudança na concentração de marcadores dos níveis basais pode ser um reflexo do prognóstico do paciente, e o grau de mudança no nível dos marcadores pode estar relacionado à gravidade dos eventos adversos. A significância estatística é frequentemente determinada pela comparação de duas ou mais populações e pela determinação de um intervalo de confiança e/ou um valor p; consultar, por exemplo, Dowdy e Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1983. Intervalos de confiança preferenciais da invenção são 90%, 95%, 97,5%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% e 99,99%, enquanto os valores de p preferenciais são 0,1,0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, e 0,0001.
[0445] Salvo indicado em contrário, foram usados métodos estabelecidos de tecnologia de genes recombinantes conforme descrito, por exemplo, em Sambrook, Russell Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001) que é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.
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103/150 [0446] A presente invenção é ainda descrita a título de referência às seguintes figuras não limitantes.
[0447] Figura 1: Análise de Kaplan Meier para previsão de mortalidade aos 28 dias [0448] Figura 2: Análise AUROC para identificar não sobreviventes aos 28 dias (coorte inteiro) [0449] Figura 3: Análise AUROC para identificar não sobreviventes aos 28 dias, dependendo dos níveis de biomarcadores nos três grupos de gravidade.
[0450] Figura 4: Análise AUROC para identificar não sobreviventes aos 28 dias com base na pontuação SOFA.
[0451] A presente invenção é ainda descrita a título de referência aos seguintes exemplos não limitantes.
EXEMPLO 1 MÉTODOS: POPULAÇÃO DE ESTUDO [0452] Duzentos e trinta e sete pacientes criticamente doentes internados em unidade de terapia intensiva do Centro Hospitalar Universitário (CHU) de Dijon Bourgogne a partir de 1o de junho de 2013 até ο dia 14 de junho 2014 foram consecutivamente incluídos no estudo clínico. Pacientes com menos de 18 anos foram excluídos. O estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional local. Antes da inscrição, o consentimento informado por escrito foi obtido dos próprios pacientes ou do parente mais próximo do paciente. Todos os pacientes apresentaram um amplo espectro de doenças, incluindo doença cardiovascular, diabetes mellitus, malignidade, doença respiratória, doença hepática, doença renal e imunodepressão e foram monitorados até a alta ou morte no hospital. Com base na revisão retrospectiva de prontuários, exames de imagem e microbiologia, dois médicos independentes
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104/150 classificaram os pacientes no dia da internação como não-sepse (síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) ou ausência de SIRS), sepse grave ou choque séptico segundo critérios de padronização internacional (Bone, Balk et al. 1992). Uma amostra de sangue foi coletada no dia da admissão, ou seja, durante as primeiras 24 horas. Dados demográficos e clínicos básicos que incluem história médica, resultados de exame físico, análises sanguíneas de rotina (por exemplo, hemocultures), investigações diagnosticas não laboratoriais (por exemplo, critérios SIRS, critérios de falha de órgãos), intervenções terapêuticas (ventilação mecânica (VM), vasopressores e terapia renal substitutiva (TRS)), bem como parâmetros de resultados (por exemplo, tempo de internação, mortalidade por todas as causas) foram registrados. A pontuação de avaliação de falha do órgão sequencial (SOFA), com base em seis parâmetros de órgãos e a pontuação de fisiologia aguda simplificada (SAPS II), com base em 17 variáveis principalmente de fisiologia, foram calculados na admissão (Le Gall, Lemeshow et al. 1993; Vincent, Moreno et al., 1996).
BIOMARCADORES [0453] Os níveis de lactato sérico foram medidos por ensaio colorimétrico usando o analisador de módulo e501 da Roche Diagnostics, Meylan, França. O limite de referência para o lactato foi de 0,5 a 2,2 mmol/l.
[0454] Os níveis de MR-proADM (pró-adrenomedulina central), copeptina e PCT (procalcitonina) foram determinados em amostras de plasma por meio de ensaios ultrassensíveis, como o analisador de acesso aleatório KRYPTOR (Thermo Scientific B R A H M S). Os níveis de histona H2A, H2B, H3 e H4, bem como o nível de Aldolase B, foram determinados nas amostras de plasma, por exemplo, através de monitoramento da reação selecionada ou ensaios de monitoramento de reaPetição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 113/174
105/150 ções múltiplas (SRM/MRM) como descrito a seguir. Peptídeos específicos derivados dos marcadores foram medidos por tecnologia LCMS/MS (espectrômetro de massa Quantiva TSQ (MS); ThermoFisher Scientific). As sequências peptídicas e os seus íons de fragmentação identificados, denominados Transições, para cada peptídeo foram considerados substitutos úteis para monitorar os níveis de proteínas marcadores em uma amostra de sangue. A otimização foi feita em peptídeos sintéticos que podem ser marcados isotopicamente pesados. Os melhores peptídeos em relação ao sinal para o ruído foram selecionados. Tempo de retenção ideal e pelo menos 4 melhores transições foram criadas para cada peptídeo.
QUANTIFICAÇÃO DE MS EXEMPLIFICATIVA E ESCOLHA DE PEPTÍDEOS E TRANSIÇÕES [0455] Foram adicionados 5 ul de cada amostra de plasma clínico a 20 ul de Ureia 8 M/n-propanol a 2,5%/Tris 300 mM/DTT 10 mM pH 8,5 e incubadas a 37 °C durante uma hora. Foi adicionado ácido iodoacético 500 mM preparado em bicarbonato de amônio 1 M a cada cavidade de amostra e incubado no escuro à temperatura ambiente durante uma hora. Foram adicionados 113 ul de Tris 50 mM/CaCI2 5 mM pH 8,0 a cada cavidade. A tripsina (Thermo Fisher Scientific) foi reidratada com 150 ul de ácido acético 25 mM adicionado com uma razão de 1:10 (teor de proteína total:protease) e incubada a 37 °C durante 20 horas. A digestão foi finalmente bruscamente arrefecida com o adicional de 2 ul de ácido fórmico. Glucagon (1 ng/μΙ) e peptídeos pesados padrão foram então adicionados antes da injeção.
[0456] Os ensaios de SRM foram desenvolvidos em um espectrômetro de massa triplo quadrupolo TSQ Quantiva acoplado com HPLC Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific). Separações de fase reversa foram realizadas em um gradiente linear de 20 min de 5 a 40% B, com um tempo total de 40 min (Solvente A: Água 0,2% FA, Solvente B: ACN
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0,2% FA). A taxa de fluxo durante o gradiente linear foi ajustada para 240 μΙ/min. O volume total de injeção foi de 160 μ\ para todas as amostras e pontos na curva. Uma coluna Accucore aQ de 150 mm x 2,1 mm (ThermoFisher Scientific) foi executada a uma temperatura de 50 °C.
[0457] A otimização foi realizada em peptídeos sintéticos fortemente marcados com a incorporação de arginina ou lisina marcadas com 13C- e 15N- (ThermoFisher Scientific ou New England Peptide). Parâmetros individuais do instrumento, tais como energia de colisão, lente do tubo e tempo de permanência foram testados automaticamente para cada transição. Após múltiplas iterações, a lista otimizada de peptídeos e transições (ou seja, sinal de intensidade mais alta e menor sobreposição com outras transições) e os tempos de retenção correspondentes foram finalizados com pelo menos quatro transições de fragmento por peptídeo escolhido.
[0458] Os peptídeos foram identificados por luz de coeluição e transições marcadas como pesadas na separação cromatográfica. Os programas Pinpoint (Thermo Fisher Scientific) e Skyline (MacCoss Lab) foram usados para o alinhamento temporal, quantificação relativa das transições e quantificação proteica direcionada.
[0459] As quantificações relativas e absolutas dos marcadores foram realizadas com o emprego dos métodos exemplificativos como descrito a seguir.
QUANTIFICAÇÃO RELATIVA:
[0460] 1. Determinar a presença aumentada ou diminuída do marcador através da comparação da área de pico de assinatura de SRM de um dado peptídeo detectado em amostra biológica com a mesma área de pico de assinatura de SRM do mesmo fragmento peptídico em pelo menos uma segunda, terceira, quarta ou mais amostras biológicas.
[0461] 2. Determinar a presença aumentada ou diminuída do marcador através da comparação da área de pico de assinatura de SRM de
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107/150 um dado peptideo detectado em uma amostra biológica a áreas de pico de assinatura de SRM desenvolvidas a partir de fragmentos peptídicos de outras proteínas, em outras amostras derivadas de fontes biológicas diferentes e separadas, em que a comparação de área de pico de assinatura SRM entre as 2 amostras para um fragmento peptídico é normalizada para a quantidade de proteína analisada em cada amostra. [0462] 3. Determinar a presença aumentada ou diminuída do marcador através da comparação da área de pico de assinatura de SRM para um dado peptideo com as áreas de pico de assinatura de SRM de outros fragmentos peptídicos derivados de diferentes proteínas dentro da mesma amostra biológica para normalizar os níveis de mudança do fabricante para níveis de outras proteínas que não alteram seus níveis de expressão sob várias condições celulares.
[0463] 4. Esses ensaios foram aplicados a fragmentos peptídicos não modificados e a fragmentos peptídicos modificados, por exemplo, a proteína de histonas, em que as modificações incluíram, mas não se limitam à fosforilação e/ou glicosilação, acetilação, metilação (mono, di, tri), citrulinização, ubiquitinização e em que os níveis relativos de peptídeos modificados foram determinados da mesma maneira que determinar quantidades relativas de peptídeos não modificados. QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA DE UM DETERMINADO PEPTIDEO: [0464] A comparação da área de pico de assinatura de SRM/MRM para um dado fragmento de peptideo do marcador em uma amostra biológica individual com a área de pico de assinatura de SRM/MRM de um padrão de fragmento peptídico interno adicionado ao lisado a partir da amostra biológica.
[0465] O padrão interno era uma versão sintética marcada do fragmento peptídico da proteína marcadora que estava a ser interrogada ou a proteína recombinante marcada. Esse padrão foi adicionado a uma amostra em quantidades conhecidas antes ou depois da digestão e a
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108/150 área de pico de assinatura de SRM/MRM foi determinada para o padrão de fragmento peptídico interno e o fragmento de fragmento nativo na amostra biológica separadamente, seguida pela comparação de ambas as áreas de pico.
[0466] Tal ensaio foi aplicado a fragmentos peptídicos não modificados e fragmentos peptídicos modificados, em que as modificações incluíram, mas não estão limitadas à fosforilação e/ou glicosilação, acetilação, metilação (mono, di, tri), citrulinização, ubiquitinização, e onde os níveis absolutos dos peptídeos modificados foram determinados da mesma maneira que a determinação dos níveis absolutos de peptídeos não modificados.
[0467] A histona H4 também foi medida por um imunoensaio. O Imunoensaio de Histona H4 (H4 IA) consiste em um anticorpo monoclonal (mAb) de camundongo criado contra um peptídeo sintético (aminoácidos 46 a 56 da SEQ ID NO: 1) acoplado a Micropheres MagPlex-C (Luminex, Austin Texas), e um anticorpo policlonal de ovelha biotinilado (pAb) produzido contra um peptídeo sintético (aminoácidos 67 a 78 da SEQ ID NO 1). Foi usado um peptídeo sintético (aminoácidos 46 a 102 da SEQ ID NO: 1) como material padrão. As amostras foram medidas em um MAgPix com xPonent 4.2 System (Luminex, Austin Texas). Os dados foram analisados com o uso de regressão logística de 5 parâmetros do JMP-12 (software estatístico SAS, Reino Unido).
ANÁLISE ESTATÍSTICA [0468] Todas as análises foram realizadas com o uso do software R 3.0.2.
[0469] Os dados são expressos como mediana e intervalo interquartil [IQR] entre parênteses.
[0470] Como todos os biomarcadores analisados mostram distribuições altamente desviadas para direita, valores foram transformados com log w antes da inclusão em modelos de regressão, a fim de diminuir
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109/150 o impacto de valores extremos no modelo de ajuste.
[0471] Os valores abaixo do limite de quantificação (LoQ) foram substituídos por um pequeno valor abaixo de LoQ. Os valores ausentes não foram substituídos. Cada modelo inclui todos os pacientes com dados completos em relação a todas as variáveis do modelo.
[0472] Valores de P < 0,05 foram considerados significativos.
[0473] Para as análises de sobrevida, o acompanhamento foi censurado aos 3, 7 ou 28 dias após a admissão na UTI (período máximo de acompanhamento (FUP)), conforme apropriado. Os pacientes perderam o acompanhamento antes que a FUP avaliada (ou seja, devido à alta precoce ou a mudança para uma enfermaria diferente) fosse censurada no dia de sua última visita na UTI. Pacientes vivos na FUP máxima foram censurados nesse dia. Para variáveis de resultado dependente do tempo foram usados modelos de regressão de Cox. Os resultados apresentados são o teste da Razão de Probabilidade-χ2 (LR χ2 e valor p), índice C (Harrel) e taxas de risco padronizadas (HR). As taxas de risco citadas no presente documento se referem a uma alteração de duas vezes no nível dos biomarcadores (quartil superior vs. quartil inferior de biomarcadores). Nos modelos ajustados, as variáveis de ajuste foram incluídas no modelo para determinar o efeito adicional dos biomarcadores no desempenho do modelo.
RESULTADOS:
[0474] A população do estudo foi composta por 237 pacientes. Dois pacientes (um paciente sem SIRS, um paciente com sepse) tiveram que ser excluídos das análises devido à documentação conflitante dos dados de mortalidade. Cento e setenta e dois pacientes (73%) apresentaram sepse grave ou choque séptico, 15 pacientes (6%) com SIRS e 49 pacientes (21 %) sem SIRS. A idade média foi de 67 [59 a 77 anos] anos. A maioria dos pacientes era do sexo masculino (60%). As afecções sub
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110/150 jacentes mais frequentes foram doenças cardio vasculares (35%), diabetes mellitus (31%) e neoplasias malignas (27%), seguida por doença respiratória (16%), hepatopatia (12%), doença renal (12%) e imunodepressão (7 %). O local mais frequente de infecção foi o trato respiratório inferior (46%) e o trato urinário (45%). A pontuação SAPS II (56 [40 a 69 pontos] pontos) e a pontuação SOFA (9 [6 a 12 pontos] pontos) foram aumentados na admissão. As falhas de órgãos foram mais frequentemente falha respiratória (61%), choque circulatório (56%) e falha renal (41%). Assim, muitos pacientes necessitaram de VM (78%), vasopressores (68%) e TRS (37%) durante a permanência na UTI. Todas as causas de mortalidade na UTI foram de 32%, a duração média da permanência na UTI foi de 5,4 [2,5 a 10,6] dias.
[0475] Analisamos a curto prazo (por exemplo, no dia 3 e 7, ou seja, 3 dias e 7 dias) e a longo prazo (no dia 28, ou seja, 28 dias) a mortalidade em todos os 235 pacientes gravemente enfermos com o uso de modelos de regressão de Cox uni e bivariados ajustados para idade e sexo. Vinte e três pacientes (10%) morreram no dia 3, 49 pacientes (21 %) morreram no dia 7 e 74 pacientes (32%) morreram no dia 28 após a admissão na UTI. Além disso, a mortalidade foi analisada em subpopulações de pacientes com infecção do trato respiratório inferior, infecção do trato urinário (ITU) e neoplasias com o uso de modelos de regressão univariada de Cox ajustados por idade e sexo. Vinte e sete pacientes (25%) de 109 pacientes com infecção do trato respiratório inferior morreram no 7o dia, 34 pacientes (36%) de 94 pacientes com ITU haviam morrido no dia 28 e 16 pacientes (25%) de 64 pacientes com malignidades morreu no dia 7 após a admissão na UTI. O poder de cada modelo de regressão de Cox para discriminar sobreviventes de não sobreviventes é refletido pelo índice C que varia de 0 a 1 com melhores modelos de regressão de Cox preditivos que resultam em um índice C próximo a 1. Além disso, a HR é calculada com a HR>0 que indica pior
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111/150 prognóstico e a HR <0 que indica um efeito protetor da variável.
[0476] Entre todas as variáveis analisadas, a pontuação SAPS II na admissão na UTI mostra a melhor previsão em 3 dias (índice C 0,876, HR por IQR 8,42), 7 dias (índice C 0,809, HR por IQR 5,15) e 28 dias (índice C 0,776, HR por IQR 4,19) mortalidade, seguida pela pontuação SOFA na admissão na UTI na previsão de 3 dias (índice C 0,866, HR por IQR 6,68) e mortalidade em 7 dias (índice C 0,778, HR por IQR 3,82) em todos os 235 pacientes gravemente enfermos (Tabela 1 à Tabela 3). Resultados similares são obtidos no subgrupo de pacientes com sepse e para prever a mortalidade em 7 dias em pacientes gravemente enfermos com infecção do trato respiratório inferior para a pontuação SAPS II (índice C 0,773, HR por IQR 3,47) (Tabela 4).
[0477] Em comparação, MR-proADM discrimina melhor os sobreviventes e não sobreviventes entre todos os biomarcadores no dia 7 (índice C 0,769, HR por IQR 4,53) e no dia 28 (índice C 0, 765, HR por IQR 4,86) após a internação na UTI em todos os pacientes críticos (Tabela 2, Tabela 3). É superior à pontuação SOFA na previsão de 28 dias de mortalidade em todos os pacientes críticos (Tabela 3). Resultados similares são obtidos no subgrupo de pacientes com sepse. Na análise bivariada, o MR-proADM melhora o desempenho do SAPS II ou SOFA para previsão de mortalidade em 7 dias (índice C 0,832 para o modelo combinado de SAPS II e MR-proADM comparado ao índice C 0,809 para o SAPS II) e o desempenho do SAPS II para previsão de mortalidade em 28 dias (índice C 0,810 para modelo combinado de SAPS II e MR-proADM comparado ao índice C 0,776 para SAPS II isolado) em todos os pacientes críticos (Tabela 2, Tabela 3). Não há melhor valor prognóstico em um modelo combinado de SAPS II ou SOFA e MR-proADM para preverá mortalidade em 3 dias nesses pacientes (Tabela 1). [0478] Em comparação com outros biomarcadores e pontuações, PCT (por exemplo, índice C 0,689, HR por IQR 1,90 para previsão de
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112/150 dias de mortalidade em todos os pacientes gravemente doentes) e aldolase B (por exemplo, índice C 0,667, HR por IQR 1,47 para previsão de 28 dias de mortalidade em todos os pacientes gravemente enfermos) na admissão na UTI mostram associação moderada com mortalidade em todos os pacientes críticos ou seus subgrupos (por exemplo, Tabela 1). Entretanto, em um modelo de regressão de Cox bivariado, PCT melhora o valor prognóstico do SAPS II ou SOFA para prever mortalidade de 28 dias em todos os pacientes graves (por exemplo, modelo combinado de SAPS II e PCT resulta em um índice C de 0,786 comparado a 0,776 para SAPS II na análise univariada) (por exemplo Tabela 3). Além disso, um modelo de regressão de Cox bivariado incluindo aldolase B melhora a associação de MR-proADM com mortalidade em 7 dias em todos os pacientes críticos (modelo combinado de MR-proADM e aldolase B com um índice C de 0,780 comparado ao modelo univariado de MR-proADM com um índice C de 0,769) (Tabela 2). A previsão não foi melhorada pela PCT ou aldolase B para SAPS II, MR-proADM ou histonas em outras análises de mortalidade (Tabela 1 a Tabela 3).
[0479] Os níveis das histonas H2A, H2B, H3 e H4 na admissão na UTI estiveram fortemente associados a 3 dias (por exemplo, índice H2B C 0,793, HR por IQR 2,76), 7 dias (por exemplo, índice H2B C 0,768, HR por IQR 2,40) e 28 dia (por exemplo, H2B índice C 0,752, HR por IQR 2,40) mortalidade em todos os pacientes críticos (Tabela 1 a Tabela
3). Resultados similares são obtidos no subgrupo de pacientes com sepse. Entre todas as histonas, H2B apresenta o melhor desempenho, seguido por H4, H2A e H3 (Tabela 1 a Tabela 6). Comparando o desempenho das histonas H2A, H2B, H3 e H4 com outros biomarcadores, existe um valor prognóstico marcante das histonas para mortalidade a curto prazo (3 e 7 dias), ou seja, enquanto ο H2B pode ser inferior ao MR-proADM na previsão de 28 dias mortalidade (MR-proADM C índice
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0,765 versus H2B C índice 0,752). H2B e MR-proADM estão comparativamente associados com mortalidade em 7 dias (índice C de H2B 0,793 versus índice C de MR-proADM 0,786) e H2B é superior a MRproADM para previsão de mortalidade em 3 dias (índice C de H2B 0,768 versus índice C de MR-proADM 0,769) em todos os pacientes críticos (Tabela 1 a Tabela 3).
[0480] Nos modelos bivariados de regressão de Cox, as histonas H2A, H2B, H3 e H4 melhoram o desempenho do SAPS II ou SOFA (por exemplo, índice C de modelo combinado de H2B e SAPS II é 0,811 comparado ao índice C do modelo univariado do SAPS II que é 0,776 para previsão de 28 dias de mortalidade) e MR-proADM (índice C do modelo combinado de H2B e MR-proADM é 0,795 comparado ao índice C do modelo univariado de MR-proADM de 0,765 para previsão de 28 dias de mortalidade) (Tabela 1 a Tabela 3). Em pacientes criticamente enfermos com infecção das vias aéreas inferiores, H2A, H2B, H3 e H4 na admissão na UTI são os melhores preditores de mortalidade em 7 dias entre os biomarcadores (por exemplo, índice C de H2B 0,785, HR por IQR 2,56) (Tabela 4). Em pacientes gravemente enfermos com histonas de ITU, H2A, H2B, H3 e H4 são os mais fortes associados à mortalidade em 28 dias entre todas as variáveis admitidas na UTI (por exemplo, índice C de H2B é 0,764, HR por IQR 2,52) (Tabela 5). Histonas H2A, H2B, H3 e H4 na admissão na UTI mostram associação mais forte com mortalidade em 7 dias (por exemplo, índice C de H2B é 0,815, HR por IQR 4,79) entre todas as variáveis em pacientes críticos admitidos na UTI com malignidades (Tabela 6).
TABELA 1: ANÁLISE DE REGRESSÃO DE COX UNI E BIVARIADA PARA MORTALIDADE EM 3 DIAS EM TODOS OS PACIENTES CRÍTICOS [0481] Vinte e quatro pacientes de um número total (n) de 235 pacientes gravemente doentes morreram no dia 3 após a admissão na UTI
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114/150 (eventos). Pontuações ou biomarcadores medidos na admissão na UTI estão incluídos nos modelos. Todos os modelos univariáveis ou bivariados são ajustados para idade e sexo. Os graus de liberdade (df) refletem o número de variáveis e ajustes incluídos. Os resultados exibidos são de teste de razão de probabilidade-χ2 (L.R. χ2 e valor p), o índice C (Harrel) e razões padronizadas de risco (HR), mais o intervalo de confiança de 95% (Cl), quer por faixa interquartil (IQR) ou Mudança 2 vezes. (SAPS II: pontuação fisiológica aguda simplificada II; SOFA: avaliação de falência de órgãos sequencial; MR-proADM: pró-adrenomedulina mesoregional; PCT: procalcitonina; Histonas representadas por histona H2A, H2B, H3 e H4; H4 também foi mensurado por um imunoensaio (IA)).
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TABELA 1
Modelo N Eventos L.R. χ2 df valor p índice C HR [IC 95%] por... ... IQR ... Mudança 2 vezes
SAPS II 235 24 55,11 3 < 0,001 0,876 8,42 [4,38 a 16,19]
SOFA 235 24 41,78 3 < 0,001 0,866 6,68 [3,33 a 13,39]
H2B 235 24 29,31 3 < 0,001 0,793 2,76 [1,77 a 4,29] 1,47 [1,24 a 1,73]
H4 235 24 28,24 3 < 0,001 0,786 2,70 [1,72 a 4,25] 1,45 [1,23 a 1,72]
H2A 235 24 28,14 3 < 0,001 0,787 2,45 [1,63 a 3,66] 1,45 [1,23 a 1,72]
H4 ΙΑ 228 23 26,61 3 < 0,001 0,779 14,35 [3,26 a 63,19] 1,39 [1,16 a 1,66]
MR-proADM 235 24 24,99 3 < 0,001 0,786 4,82 [2,08 a 11,18] 2,05 [1,40 a 3,01]
H3 235 24 19,68 3 < 0,001 0,740 3,45 [1,54 a 7,70] 1,23 [1,08 a 1,41]
Aldolase B 235 24 14,65 3 0,002 0,721 1,65 [1,05 a 2,59] 1,16 [1,02 a 1,32]
PCT 235 24 12,08 3 0,007 0,705 1,49 [0,85 a 2,62] 1,09 [0,97 a 1,23]
H2B + SAPS II 235 24 61,95 4 < 0,001 0,885
H4 + SAPS II 235 24 61,83 4 < 0,001 0,884
H2A + SAPS II 235 24 61,70 4 < 0,001 0,884
115/150
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 124/174
Modelo N Eventos L.R. χ2 df valor p índice C HR [IC 95%] por... ... IQR ... Mudança 2 vezes
H4 IA + SAPS II 228 23 61,51 4 < 0,001 0,898
H3 + SAPS II 235 24 57,02 4 < 0,001 0,878
MR-proADM + SAPS II 235 24 56,79 4 < 0,001 0,884
PCT + SAPS II 234 24 55,10 4 < 0,001 0,875
Aldolase B + SAPS II 234 24 54,97 4 < 0,001 0,876
MR-proADM + H2B 235 24 36,15 4 < 0,001 0,828
H4 IA + SOFA 228 23 50,05 4 < 0,001 0,887
H2B + SOFA 235 24 47,98 4 < 0,001 0,876
H4 + SOFA 235 24 47,56 4 < 0,001 0,876
H2A + SOFA 235 24 47,30 4 < 0,001 0,874
H3 + SOFA 235 24 43,63 4 < 0,001 0,863
MR-proADM + SOFA 235 24 42,27 4 < 0,001 0,872
PCT + SOFA 234 24 42,04 4 < 0,001 0,866
Aldolase B + SOFA 234 24 41,60 4 < 0,001 0,865
116/150
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 125/174
Modelo N Eventos L.R. χ2 df valor p índice C HR [IC 95%] por... ... IQR ... Mudança 2 vezes
MR-proADM + H4 235 24 35,29 4 < 0,001 0,826
MR-proADM + H2A 235 24 35,16 4 < 0,001 0,825
MR-proADM + H4 IA 228 23 32,60 4 < 0,001 0,809
MR-proADM + H3 235 24 29,15 4 < 0,001 0,806
H2B + Aldolase B 234 24 31,35 4 < 0,001 0,799
PCT + H2B 234 24 29,29 4 < 0,001 0,791
117/150
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 126/174
118/150
TABELA 2: ANÁLISE DE REGRESSÃO DE COX UNI E BIVARIADA PARA MORTALIDADE DE SETE DIAS EM TODOS OS PACIENTES CRITICAMENTE DOENTES [0482] Quarenta e nove pacientes de um número total (n) de 235 pacientes gravemente doentes morreram no dia 7 após a admissão na UTI (eventos). Pontuações ou biomarcadores medidos na admissão na UTI estão incluídos nos modelos. Todos os modelos univariáveis ou bivariados são ajustados para idade e sexo. Os graus de liberdade (df) refletem o número de variáveis e ajustes incluídos. Os resultados exibidos são de teste de razão de probabilidade-χ2 (L.R. χ2 e valor p), o índice C (Harrel) e razões padronizadas de risco (HR), mais o intervalo de confiança de 95% (Cl), quer por faixa interquartil (IQR)ou Mudança 2 vezes. (SAPS II: pontuação fisiológica aguda simplificada II; SOFA: avaliação de falha orgânica sequencial MR-proADM: pró-adrenomedulina mesoregional; PCT: procalcitonina; Histonas são representadas por histona H2A, H2B, H3 e H4; H4 também foram medidos por um imunoensaio (IA)).
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 127/174
TABELA 2
Modelo N Eventos LRz2 df valor p índice C HR [IC 95%] por... ... IQR ... Mudança 2 vezes
SAPS II 235 49 68,07 3 < 0,001 0,809 5,15 [3,26 a 8,13]
SOFA 235 49 50,64 3 < 0,001 0,778 3,82 [2,39 a 6,09]
MR-proADM 235 49 45,88 3 < 0,001 0,769 4,53 [2,55 a 8,04] 1,99 [1,53 a 2,59]
H2B 235 49 45,33 3 < 0,001 0,768 2,40 [1,76 a 3,28] 1,39 [1,24 a 1,57]
H4 235 49 42,81 3 < 0,001 0,761 2,32 [1,68 a 3,18] 1,37 [1,22 a 1,55]
H2A 235 49 40,91 3 < 0,001 0,755 2,09 [1,57 a 2,78] 1,36 [1,21 a 1,54]
H3 235 49 38,22 3 < 0,001 0,742 3,62 [2,07 a 6,34] 1,24 [1,13 a 1,37]
H4 IA 228 48 35,98 3 < 0,001 0,741 5,57 [2,40 a 12,96] 1,23 [1,11 a 1,37]
Aldolase B 235 49 26,66 3 < 0,001 0,697 1,69 [1,22 a 2,33] 1,17 [1,06 a 1,28]
PCT 235 49 23,57 3 < 0,001 0,698 1,66 [1,12 a 2,46] 1,12 [1,02 a 1,22]
H2B + SAPS II 235 49 83,39 4 < 0,001 0,839
H4 + SAPS II 235 49 82,29 4 < 0,001 0,834
H2A + SAPS II 235 49 80,74 4 < 0,001 0,830
H3 + SAPS II 235 49 79,27 4 < 0,001 0,835
119/150
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 128/174
Modelo N Eventos LRz2 df valor p índice C HR [IC 95%] por... ... IQR ... Mudança 2 vezes
MR-proADM + SAPS II 235 49 76,75 4 < 0,001 0,832
H4 IA + SAPS II 228 48 75,64 4 < 0,001 0,834
Aldolase Β + SAPS II 234 49 70,32 4 < 0,001 0,809
PCT + SAPS II 234 49 68,47 4 < 0,001 0,811
H2B + SOFA 235 49 61,45 4 < 0,001 0,810
H4 + SOFA 235 49 60,08 4 < 0,001 0,804
H4 IA + SOFA 228 48 59,58 4 < 0,001 0,803
MR-proADM + H2B 235 49 59,50 4 < 0,001 0,804
H2A + SOFA 235 49 58,66 4 < 0,001 0,800
H3 + SOFA 235 49 58,44 4 < 0,001 0,800
MR-proADM + H4 235 49 57,83 4 < 0,001 0,801
MR-proADM + SOFA 235 49 57,26 4 < 0,001 0,800
MR-proADM + H2A 235 49 56,25 4 < 0,001 0,796
MR-proADM + H3 235 49 55,10 4 < 0,001 0,795
MR-proADM + H4 IA 228 48 52,66 4 < 0,001 0,780
120/150
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 129/174
Modelo N Eventos LRz2 df valor p índice C HR [IC 95%] por... ... IQR ... Mudança 2 vezes
Aldolase B + SOFA 234 49 51,39 4 < 0,001 0,781
PCT + SOFA 234 49 50,77 4 < 0,001 0,778
MR-proADM + Aldolase B 234 49 49,84 4 < 0,001 0,780
PCT + H2B 234 49 46,55 4 < 0,001 0,769
MR-proADM + PCT 234 49 46,37 4 < 0,001 0,768
H2B + Aldolase B 234 49 46,13 4 < 0,001 0,765
121/150
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 130/174
122/150
TABELA 3: ANÁLISE DE REGRESSÃO DE COX UNI E BIVARIADA PARA A MORTALIDADE DE 28 DIAS EM TODOS OS PACIENTES CRITICAMENTE DOENTES [0483] Setenta e quatro pacientes de um número total (n) de 235 pacientes gravemente doentes morreram no dia 3 após a admissão na UTI (eventos). Pontuações ou biomarcadores medidos na admissão na UTI estão incluídos nos modelos. Todos os modelos univariáveis ou bivariados são ajustados para idade e sexo. Os graus de liberdade (df) refletem o número de variáveis e ajustes incluídos. Os resultados exibidos são de teste de razão de probabilidade-χ2 (L.R. χ2 e valor p), o índice C (Harrel) e razões padronizadas de risco (HR), mais o intervalo de confiança de 95% (Cl), quer por faixa interquartil (IQR)ou Mudança 2 vezes. (SAPS II: pontuação fisiológico agudo simplificado II; SOFA: avaliação de falha orgânica sequencial MR-proADM: pró-adrenomedulina mesoregional; PCT: procalcitonina; Histonas são representadas por histona H2A, H2B, H3 e H4; H4 também foi mensurado por um imunoensaio (IA))
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 131/174
TABELA 3
Modelo N Eventos LRz2 df valor p índice C HR [IC 95%] por... ... IQR ... Mudança 2 vezes
SAPS II 235 74 76,19 3 < 0,001 0,776 4,19 [2,89 a 6,07]
MR-proADM 235 74 66,81 3 < 0,001 0,765 4,86 [3,05 a 7,73] 2,06 [1,66 a 2,54]
SOFA 235 74 59,04 3 < 0,001 0,753 3,33 [2,27 a 4,88]
H2B 235 74 58,04 3 < 0,001 0,752 2,40 [1,84 a 3,11] 1,39 [1,26 a 1,54]
H4 235 74 53,89 3 < 0,001 0,742 2,28 [1,75 a 2,99] 1,37 [1,23 a 1,51]
H2A 235 74 53,09 3 < 0,001 0,742 2,11 [1,66 a 2,70] 1,37 [1,24 a 1,52]
H4 IA 228 70 48,71 3 < 0,001 0,734 6,04 [2,97 a 12,27] 1,25 [1,14 a 1,36]
H3 235 74 45,95 3 < 0,001 0,720 3,33 [2,10 a 5,29] 1,22 [1,13 a 1,32]
PCT 235 74 33,87 3 < 0,001 0,689 1,90 [1,37 a 2,64] 1,15 [1,07 a 1,24]
Aldolase B 235 74 25,91 3 < 0,001 0,667 1,47 [1,11 a 1,95] 1,12 [1,03 a 1,22]
H2B + SAPS II 235 74 100,75 4 < 0,001 0,811
H4 + SAPS II 235 74 98,37 4 < 0,001 0,806
H2A + SAPS II 235 74 97,64 4 < 0,001 0,805
123/150
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 132/174
Modelo N Eventos LRz2 df valor p índice C HR [IC 95%] por... ... IQR ... Mudança 2 vezes
MR-proADM + SAPS II 235 74 97,47 4 < 0,001 0,810
H3 + SAPS II 235 74 93,05 4 < 0,001 0,801
H4 ΙΑ + SAPS II 228 70 90,73 4 < 0,001 0,804
MR-proADM + H2B 235 74 83,70 4 < 0,001 0,795
PCT + SAPS II 234 74 81,63 4 < 0,001 0,786
MR-proADM + H4 235 74 81,25 4 < 0,001 0,792
MRproADM + H2A 235 74 80,39 4 < 0,001 0,789
H2B + SOFA 235 74 77,41 4 < 0,001 0,785
MR-proADM + SOFA 235 74 77,32 4 < 0,001 0,783
Aldolase B + SAPS II 234 74 77,24 4 < 0,001 0,774
MR-proADM + H3 235 74 76,68 4 < 0,001 0,786
MR-proADM + H4 IA 228 70 76,13 4 < 0,001 0,784
H4 + SOFA 235 74 74,89 4 < 0,001 0,778
H2A + SOFA 235 74 74,08 4 < 0,001 0,776
124/150
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 133/174
Modelo N Eventos LRz2 df valor p índice C HR [IC 95%] por... ... IQR ... Mudança 2 vezes
H4 IA + SOFA 228 70 72,78 4 < 0,001 0,778
H3 + SOFA 235 74 71,09 4 < 0,001 0,770
MR-proADM + Aldolase B 234 74 68,19 4 < 0,001 0,771
MR-proADM + PCT 234 74 66,57 4 < 0,001 0,766
PCT + SOFA 234 74 62,80 4 < 0,001 0,756
PCT + H2B 234 74 62,73 4 < 0,001 0,757
H2B + Aldolase B 234 74 62,54 4 < 0,001 0,753
Aldolase B + SOFA 234 74 59,13 4 < 0,001 0,753
125/150
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 134/174
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TABELA 4: ANÁLISE DE REGRESSÃO DE COX UNI VARIADA PARA SETE DIAS DE MORTALIDADE EM PACIENTES CRITICAMENTE DOENTES COM INFECÇÃO DO TRATO RESPIRATÓRIO INFERIOR [0484] Vinte e sete pacientes de um número total (n) de 109 pacientes gravemente enfermos com infecção do trato respiratório inferior morreram no dia 7 após a admissão na UTI (eventos). Pontuações ou biomarcadores medidos na admissão na UTI estão incluídos nos modelos. Todos os modelos univariáveis ou bivariados são ajustados para idade e sexo. Os graus de liberdade (df) refletem o número de variáveis e ajustes incluídos. Os resultados exibidos são de teste de razão de probabilidade-χ2 (L.R. χ2 e valor p), o índice C (Harrel) e razões padronizadas de risco (HR), mais o intervalo de confiança de 95% (Cl), quer por faixa interquartil (IQR) ou Mudança 2 vezes. (SAPS II: pontuação fisiológica aguda simplificada II; SOFA: avaliação de falência de órgãos sequencial MR-proADM: pró-adrenomedulina mesoregional; PCT: procalcitonina; As histonas são representadas pelas histonas H2A, H2B, H3 e H4 também foram medidas por um imunoensaio (IA))
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 135/174
TABELA 4
Modelo N Eventos LRz2 df valor p índice C HR [IC 95%] por... ... IQR ... Mudança 2 vezes
SAPS II 109 27 29,14 3 < 0,001 0,773 3,47 [1,86 a 6,49]
H2B 109 27 27,70 3 < 0,001 0,785 2,56 [1,59 a 4,12] 1,39 [1,18 a 1,64]
H4 109 27 26,36 3 < 0,001 0,778 2,39 [1,49 a 3,84] 1,36 [1,15 a 1,61]
H2A 109 27 25,40 3 < 0,001 0,774 2,16 [1,40 a 3,33] 1,35 [1,14 a 1,60]
H4 IA 105 26 22,06 3 < 0,001 0,752 5,64 [1,66 a 19,13] 1,23 [1,06 a 1,41]
SOFA 109 27 21,84 3 < 0,001 0,742 2,72 [1,38 a 5,36] 1,05 [1,02 a 1,09]
MR-proADM 109 27 21,54 3 < 0,001 0,752 2,86 [1,37 a 5,94] 1,67 [1,17 a 2,39]
H3 109 27 21,48 3 < 0,001 0,760 2,89 [1,36 a 6,13] 1,19 [1,05 a 1,35]
Aldolase B 109 27 17,16 3 0,001 0,721 1,49 [1,00 a 2,22] 1,14 [1,00 a 1,29]
PCT 109 27 14,81 3 0,002 0,716 1,47 [0,77 a 2,80] 1,08 [0,95 a 1,22]
127/150
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 136/174
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TABELA 5: ANÁLISE DE REGRESSÃO DE COX UNIVARIADA PARA A MORTALIDADE 28 DIAS EM PACIENTES CRITICAMENTE DOENTES COM INFECÇÃO DO TRATO URINÁRIO [0485] Trinta e quatro pacientes de um número total (n) de 94 pacientes gravemente enfermos com infecção do trato urinário morreram no dia 28 após a admissão na UTI (eventos). Pontuações ou biomarcadores medidos na admissão na UTI estão incluídos nos modelos. Todos os modelos univariáveis ou bivariados são ajustados para idade e sexo. Os graus de liberdade (df) refletem o número de variáveis e ajustes incluídos. Os resultados exibidos são de teste de razão de probabilidadeχ2 (L.R. χ2 e valor p), o índice C (Harrel) e razões padronizadas de risco (HR), mais o intervalo de confiança de 95% (Cl), quer por faixa interquartil (IQR) ou Mudança 2 vezes. (SAPS II: pontuação fisiológico agudo simplificado II; SOFA: avaliação de falha orgânica sequencial MR-proADM: pró-adrenomedulina mesoregional; PCT: procalcitonina; Histonas são representadas por histona H2A, H2B, H3 e H4; H4 também foi mensurado por um imunoensaio (IA))
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 137/174
TABELA 5
Modelo N Eventos LRx2 df valor p índice C HR[IC 95%] por... ... IQR ... Mudança 2 vezes
H2B 94 34 25,79 3 < 0,001 0,764 2,52 [1,75 a 3,65] 1,39 [1,22 a 1,59]
H4 94 34 25,46 3 < 0,001 0,761 2,47 [1,70 a 3,60] 1,38 [1,21 a 1,58]
H3 94 34 24,98 3 < 0,001 0,756 4,52 [2,34 a 8,75] 1,29 [1,15 a 1,44]
H2A 94 34 24,65 3 < 0,001 0,759 2,32 [1,64 a 3,28] 1,39 [1,21 a 1,59]
SAPS II 94 34 23,69 3 < 0,001 0,737 3,00 [1,85 a 4,89]
H4 IA 90 31 22,52 3 < 0,001 0,751 8,43 [2,79 a 25,45] 1,29 [1,13a 1,47]
SOFA 94 34 16,07 3 0,001 0,696 2,28 [1,39 a 3,76] 1,05 [1,02 a 1,08]
MR-proADM 94 34 14,93 3 0,002 0,689 2,28 [1,36 a 3,81] 1,65 [1,21 a 2,25]
Aldolase B 94 34 11,96 3 0,008 0,679 1,82 [1,19 a 2,78] 1,18 [1,05a 1,33]
PCT 94 34 5,54 3 0,136 0,594 1,30 [0,74 a 2,29] 1,05 [0,94 a 1,17]
129/150
Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 138/174
130/150
TABELA 6: ANÁLISE DE REGRESSÃO DE COX UNI VARIADA PARA SETE DIAS DE MORTALIDADE EM PACIENTES CRITICAMENTE DOENTES COM MALIGNIDADES [0486] Dezesseis pacientes de um número total (n) de 64 pacientes graves com malignidades morreram no dia 7 após a admissão na UTI (eventos). Pontuações ou biomarcadores medidos na admissão na UTI estão incluídos nos modelos. Todos os modelos univariáveis ou bivariados são ajustados para idade e sexo. Os graus de liberdade (df) refletem o número de variáveis e ajustes incluídos. Os resultados exibidos são de teste de razão de probabilidade-χ2 (L.R. χ2 e valor p), o índice C (Harrel) e razões padronizadas de risco (HR), mais o intervalo de confiança de 95% (Cl), quer por faixa interquartil (IQR) ou Mudança 2 vezes. (SAPS II: pontuação fisiológica aguda simplificada II; SOFA: avaliação de falha de órgãos sequencial MR-proADM: pró-adrenomedulina mesoregional; PCT: procalcitonina; As histonas são representadas pelas histonas H2A, H2B, H3 e H4. H4 também foi medido por um imunoensaio (IA))
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TABELA 6
Modelo N Eventos LRx2 df valor p índiceC HR [IC 95%] por... ... IQR ... Mudança 2 vezes
H2B 64 16 22,32 3 < 0,001 0,815 4,79 [2,44 a 9,43] 1,60 [1,31 a 1,96]
H2A 64 16 22,28 3 < 0,001 0,811 4,35 [2,31 a 8,20] 1,61 [1,31 a 1,98]
H4 64 16 21,99 3 < 0,001 0,812 4,53 [2,33 a 8,81] 1,60 [1,30 a 1,97]
H4 IA 61 16 21,95 3 < 0,001 0,803 5,52 [2,24 a 13,58] 1,64 [1,26 a 2,13]
H3 64 16 17,59 3 0,001 0,767 7,95 [2,70 a 23,45] 1,40 [1,17 a 1,67]
SAPS II 64 16 15,16 3 0,002 0,755 4,76 [1,99 a 11,38] 1,02 [1,01 a 1,03]
MR-proADM 64 16 10,20 3 0,017 0,737 3,15 [1,38 a 7,17] 1,88 [1,20 a 2,96]
SOFA 64 16 9,84 3 0,020 0,722 3,36 [1,42 a 7,95] 1,06 [1,02a 1,11]
Aldolase B 64 16 7,30 3 0,063 0,644 2,05 [1,15 a 3,64] 1,25 [1,05 a 1,50]
PCT 64 16 4,75 3 0,191 0,661 1,95 [0,92 a 4,14] 1,15 [0,98 a 1,34]
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EXEMPLO 2: PRECISÃO SUPERIOR DE PRÓ-ADRENOMEDULINA PARA PREVISÃO DE MORTALIDADE NA SEPSE COM NÍVEIS VARIÁVEIS DE GRAVIDADE DA DOENÇA [0487] Antecedentes: o uso de novos biomarcadores de sepse tem aumentado nos últimos anos. No entanto, seu valor prognóstico em relação à gravidade da doença não foi explorado. No presente trabalho, foi examinada a capacidade da pró-adrenomedulina média-regional (MR-proADM) em prever mortalidade em pacientes com sepse com diferentes graus de falência de órgãos, comparada à procalcitonina, proteína C-reativa e lactato.
[0488] Métodos: trata-se de uma coorte observacional de prospective de dois centros que incluiu pacientes com sepse grave ou choque séptico admitidos na UTI. Os biomarcadores plasmáticos foram medidos durante as primeiras 12 horas de internação. A associação entre biomarcadores e mortalidade em 28 dias foi avaliada por meio de análise de regressão de Cox e curvas de Kaplan-Meier. Os pacientes foram divididos em três grupos conforme avaliado pela pontuação da Avaliação de Falha de Órgãos Sequencial (SOFA). A precisão dos biomarcadores para mortalidade foi determinada por área sob a análise da curva de características de operação do receptor (AUROC).
[0489] Resultados: 326 pacientes com sepse grave (21,7%) ou choque séptico (79,3%) foram incluídos com uma taxa de mortalidade de 28 dias de 31,0%. Somente MR-proADM e lactato foram associados à mortalidade na análise multivariada: razão de risco (HR): 8,5 vs. 3,4 (p <0,001). MR-proADM mostrou o melhor AUROC para previsão de mortalidade em 28 dias na análise em toda o coorte (AUROC [IC 95%]: 0,79 [0,74 a 0,84]) (p < 0,001). Quando os pacientes foram estratifiçados pelo grau de falência de órgãos, MR-proADM foi o único biomarcador a prever mortalidade em todos os grupos de gravidade (SOFA < 6, SOFA = 7 a 12 e SOFA > 13), AUROC [IC 95%] de 0,75 [0,61 a 0,88], 0,74
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133/150 [0,66 a 0,83] e 0,73 [0,59 a 0,86], respectivamente (p <0,05). Todos os pacientes com concentrações de MR-proADM < 0,88 nmol/l sobreviveram até 28 dias. Em pacientes com SOFA < 6, a adição de MR-proADM à pontuação SOFA aumentou a habilidade do SOFA em identificar nãosobreviventes, AUROC [IC 95%]: 0,70 [0,58 a 0,82] e 0,77 [0,66 a 0,88] respectivamente (p <0,05 para ambos).
[0490] Conclusões: O desempenho dos biomarcadores prognósticos na sepse é altamente influenciado pela gravidade da doença. A precisão do MR-proADM para prever a mortalidade não é afetada pelo grau de falência de órgãos. Em consequência, é um bom candidato na identificação precoce de pacientes com sepse com gravidade moderada da doença, mas em risco de mortalidade.
ANTECEDENTES [0491] Sepse continua a ser a principal causa de morte em pacientes de unidade de terapia intensiva (UTI), apesar das melhorias no tratamento hemodinâmico e antibiótico precoce. Na Europa, a ocorrência de sepse em pacientes com doença aguda resulta em uma taxa de mortalidade na UTI que varia entre 27% e 54%, dependendo da gravidade [1], Nos Estados Unidos, o Center para Controle de Doença estima que 500.000 pessoas desenvolvem sepse e 200.000 morrem a cada ano [2] [3], O pronto diagnóstico e avaliação de pacientes com sepse de alto risco é, portanto, altamente desejável, pois aumenta a possibilidade de iniciar tratamentos precoces e específicos. Assim, os pontuações de gravidade clínica, como a pontuação de Avaliação de Falha de Órgãos Sequenciais (SOFA) podem desempenhar um papel crítico [4], No entanto, o uso isolado desses sistemas de pontuação para orientar a tomada de decisões na sepse tem sido fortemente criticado [5], Uma ferramenta de avaliação padronizada para a identificação precoce de pacientes com sepse na admissão com uma série de níveis de gravidade
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134/150 seria de grande valor para auxiliar na tomada de decisão clínica e otimizar o uso de recursos de cuidados de saúde. Nesse sentido, vários biomarcadores prognósticos têm sido propostos no campo da sepse nas últimas décadas - muito mais do que em outras doenças. A maioria dessas moléculas são hormônios, citocinas ou proteínas circulantes relacionados à inflamação ou o sistema de coagulação e podem exigir um tempo considerável, esforço e custos para serem medidos [6], [0492] A adrenomedulina (ADM) é um peptideo que pode atuar como hormônio e é produzido por múltiplos tecidos durante o estresse fisiológico e infeccioso com variadas funções fisiológicas, incluindo atividade vasodilatadora, anti-inflamatória e antimicrobiana, que é reforçada por sua regulação e modulação de atividade complementar [7], Assim, a ADM é considerada uma hormocina caracterizada por um comportamento similar ao hormônio em condições não inflamatórias quando é produzida apenas por células endócrinas e por um comportamento similar à citocina na sepse quando é hiperexpressa de maneira ubíqua. Além disso, a ADM exógena demonstrou reduzir a lesão pulmonar aguda, a permeabilidade vascular e a morte em modelos animais de sepse; enquanto a superexpressão endógena similarmente melhora a lesão da sepse [8] [9], A medição da ADM circulante é complicada por uma rápida degradação e eliminação da circulação, e é ainda mais ocultada por uma proteína de ligação (fator de complemento H), que impede sua detecção por imunoensaio padrão. O fragmento mesoregional de pró-adrenomedulina (MR-proADM) que compreende os aminoácidos 45 a 92 é mais estável e reflete diretamente os níveis do peptideo ADM ativo rapidamente degradado [10], O aumento das concentrações de MR-proADM foi identificado no plasma de pacientes com pneumonia adquirida na comunidade (PAC) e são amplamente usados na avaliação do risco e gravidade da condição [11] [12] [13], No entanto, há poucos dados disponíveis para pacientes com sepse grave e choque séptico.
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Além disso, a influência da gravidade da doença no desempenho de biomarcadores prognósticos na sepse ainda não foi adequadamente estudada.
[0493] Nesse estudo, objetivamos avaliar a capacidade dos níveis de MR-proADM em prever 28 dias de mortalidade em pacientes com sepse, comparados a outros biomarcadores padrão (procalcitonina (PCT), proteína C-reativa (PCR) e lactato) em três diferentes níveis de gravidade da doença, conforme medido pela pontuação SOFA.
MÉTODOS [0494] Pacientes, critérios de inclusão e exclusão: o presente estudo foi um coorte observational de prospectiva de pacientes recrutados consecutivamente de duas unidades de terapia intensiva (UTI) na Espanha e na França. Pacientes adultos com idade > 18 anos e internados na UTI de abril de 2013 a janeiro de 2016 foram inscritos até 12 horas após o preenchimento dos critérios para sepse grave ou choque séptico com base na definição do SEPSIS-2 do American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference [14], Os pacientes inscritos também tiveram pontuação SOFA > 2 e, portanto, preencheram os critérios para a nova definição do SEPSIS3 para sepse [15], Pacientes com infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e aqueles submetidos a radioterapia ou recebendo fármacos imunossupressores, incluindo quimioterapia ou esteroides sistêmicos, nos últimos 3 meses antes da admissão na UTI foram considerados imunossuprimidos. Os critérios de exclusão foram idade <18 anos, a presença de gravidez, a ausência de uma amostra de sangue disponível para o perfil biomarcador nas primeiras 12 horas após a admissão na UTI ou a falta de consentimento informado. Dados clínicos registrados a partir dos registros médicos incluíam dados demográficos, comorbidades, laboratórios, microbiologia e níveis de biomarcadores. A
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136/150 gravidade da doença foi avaliada na admissão, calculando-se a pontuação da Avaliação de Falha de Órgãos Sequencial (SOFA). AVALIAÇÃO DE BIOMARCADORES [0495] Amostras de plasma para perfilamento de biomarcadores foram coletadas o mais próximo possível do momento da admissão na UTI e sempre dentro das primeiras 12 horas. A medição MR-proADM do plasma foi realizada pela tecnologia TRACE (Emissão de Criptograma Amplificado Resolvido no Tempo) com o uso de um novo imunoensaio em sanduíche (Analisador Kryptor Compact Plus, BRAHMS, Hennigsdorf, Alemanha); limite de detecção 0,05 nmol/l. A medição de PCT foi realizada por imunoensaio de eletroquimioluminescência (ECLIA) em um analisador de química (Cobas 6000, Roche Diagnostics, Meylan, França); limite de detecção 0,02 ng/ml. A PCR e o lactato séricos foram medidos por ensaio imunoturbidimétrico e colorimétrico intensificado por partículas, respectivamente (e501 Module Analyzer, Roche Diagnostics, Meylan, França); limite de detecção 0,15 mg/dl e 0,2 mmol/l, respectivamente.
ANÁLISE ESTATÍSTICA [0496] As diferenças nas características demográficas e clínicas entre sobreviventes e não sobreviventes foram avaliadas com o uso do teste do χ2 para variáveis categóricas. O teste t de Student ou o teste U de Mann-Whitney foram usados, respectivamente, para comparar variáveis contínuas com base na presença ou ausência de distribuição normal. A associação entre biomarcadores e o risco de mortalidade foi avaliada pela análise de regressão de Cox ajustada por variáveis de confusão. O tempo foi suspenso aos 28 dias após a admissão na UTI. As primeiras 24 horas de internação na UTI foram consideradas como dia 1 na análise. Variáveis com p <0,05 na análise de regressão univariada foram incluídas na análise multivariada. Os biomarcadores foram transformados em log para atingir uma distribuição normal. O impacto dos
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137/150 biomarcadores no tempo médio de sobrevivência foi avaliado usando as curvas de Kaplan-Meier e o teste log-rank de Mantel-Haenszel. Similar à análise de regressão de Cox, o tempo foi censurado aos 28 dias após a admissão na UTI. A exatidão e os valores preditivos dos biomarcadores para mortalidade foram avaliados pelo cálculo da área sob a curva de características de operação do receptor (AUROC). Os pacientes foram distribuídos em três grupos, dependendo da gravidade da doença avaliada pela pontuação SOFA, com o uso de dois pontos de corte prédefinidos, um com sensibilidade próxima a 90% e outro com especificidade próxima a 90% para detectar não sobreviventes aos 28 dias (Figura 4). Os dados foram analisados usando o software IBM SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, III).
RESULTADOS [0497] Características do paciente e concentrações de biomarcadores: Trezentos e vinte e seis pacientes (326) com sepse grave (21,7%) ou choque séptico (79,3%) foram incluídos com 28 dias de mortalidade de 25,5% e 34,9% em Valladolid e Dijon, respectivamente, e uma taxa de mortalidade geral de 31,0% em ambos os locais (Tabela 7). A idade média foi de 65 anos e 54,3% dos pacientes eram do sexo masculino. Comparados aos sobreviventes, os não sobreviventes eram mais velhos e apresentavam maiores pontuações de SOFA e um aumento na incidência de choque séptico, ventilação mecânica, terapia renal substitutiva, neoplasia, doença cardiovascular, falha renal crônica, imunossupressão e doença respiratória (todos p <0,05). A fonte mais comum de infecção foi de origem respiratória e urológica, independentemente do resultado. As taxas de mortalidade dependendo da fonte de infecção foram as seguintes: 37,2% em pacientes com infecção respiratória, 32,4% naqueles com infecção urológica, 28,6% em pacientes com infecção abdominal, 35,5% naqueles com bacteremia primária ou se
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138/150 cundária e 25,6% naqueles pacientes com uma infecção de outra origem. Em relação à identificação microbiológica, tanto os sobreviventes quanto os não sobreviventes apresentaram uma presença equilibrada de agentes patogênicos Gram -, Gram + e vírus. Infecções fúngicas foram mais frequentes em não sobreviventes. A causa mais comum de morte foi síndrome de disfunção de múltiplos órgãos (n = 58; 57,4%), seguida de choque refratário (n = 9; 8,9%) e hipoxemia refratária (n = 8; 7,9%). Uma limitação do esforço terapêutico foi aplicada a 21 pacientes. As concentrações de MR-proADM, PCT e lactato foram todas significativamente elevadas em pacientes não sobreviventes em comparação com os sobreviventes (todos p < 0,01), enquanto os níveis de PCR permaneceram similares nos dois grupos. Os níveis de MR-proADM dependendo da fonte da infecção foram os seguintes [mediana (intervalo interquartílico)]: infecção respiratória [3,6 nmol/l (5,6)], infecção urológica [4,6 nmol/l (5,4)], infecção abdominal [4,9 nmol/l (6,5)], bacteriemia [3,8 nmol/l (5,1)] e [3,5 nmol/l (5,8)] em infecções de outra origem. Os níveis de MR-proADM dependendo do micróbio infectante foram [mediana (intervalo interquartílico)]: infecção fúngica [6,1 nmol/l (5,6)], bactérias Gram - [4,9 nmol/l (5,9)], bactérias Gram + [4,1 nmol/l (6,2)] ou vírus [1,2 nmol/l (3,4)].
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TABELA 7. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DOS PACIENTES: OS DADOS SÃO APRESENTADOS COMO MÉDIA (DP) OU MEDIANA (IQR), CONFORME APROPRIADO. VALORES EXPRESSOS EM PORCENTAGENS (%) INDICAM A PROPORÇÃO DE SOBREVIVENTES E NÃO-SOBREVIVENTES EM 28 DIAS PARA VARIÁVEIS ESPECÍFICAS.
Sobreviventesn « 225 Não sobreviventes n » 101 Total n « 326 j
Pacientes de Valladolid (n,%) 102 (45,3%) 35 (34,7%) 137 0,071
Pacientes de Dijon (n,%) 123 (54,7%) 66 (65,3%) 189
Sexo Masculino (n,%) 133 (59,1%) 68 (67,3%) 201 (61,4%) 0,098
Idade (anos) (média, SD) 63 (14) 69 (12) 65,4 (14) < 0,001
SOFA (média, SD) 8 (3,4) 11 (3,5) 9 (3,7) < 0,001
Choque séptico (n,%) 152 (67,5%) 87 (86,1%) 239 (73,3%) 0,020
Ventilação mecânica (n,%) 150 (66,7%) 89 (88,1%) 239 (73,3%) < 0,001
RRT (n,%) 40 (17,7%) 45 (44,6%) 85 (26,2%) < 0,001
Internação na UTI (dias) (média, DP) 12,9 (18) 7,7 (6,7) 11,2 (15,6) 0,012
Neoplasia (n,%) 47 (21%) 35 (34,7%) 82 (25,2%) 0,007
Diabetes (n,%) 58 (25,8%) 29 (28,7%) 87 (26,7%) 0,330
DPOC (n,%) 33 (14,7%) 16 (15,8%) 49 (15%) 0,450
Doença cardiovascular (n,%) 56 (25%) 41 (40,6%) 97 (29,8%) 0,030
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Sobreviventesn « 225 Não sobreviventes n » 101 Total n « 326 j
Falha Renal Crônica (n,%) 16 (7,1%) 16 (15,8%) 32 (9,8%) 0,014
Imunossupressão (n,%) 21 (9,3%) 25 (24,8%) 46 (14,1%) < 0,001
Infecção respiratória (n,%) 98 (43,6%) 58 (57,4%) 156 (48%) 0,014
Infecção urológica (n,%) 75 (33,3%) 36 (35,6%) 111 (34%) 0,380
Infecção abdominal (n,%) 25 (11,1%) 10 (9,9%) 35 (10,7%) 0,450
Outra infecção (n,%) 32 (14%) 11 (10,9%) 43 (13%) 0,40
Bacteremia primária ou secundária (n,%) 69 (30,7%) 38 (37,6%) 107 (32,8%) 0,130
Bactérias Gram - (n,%) 62 (27,6%) 28 (27,7%) 90 (27,6%) 0,975
Bactérias Gram + (n,%) 47 (20,9%) 22 (21,8%) 69 (21,2%) 0,855
Fungos (n,%) 3 (1,3%) 5 (5%) 8 (2,5%) 0,050
Vírus (n,%) 15 (6,7%) 5 (5%) 20 (6,1%) 0,550
MR-proADM (nmol/l) (mediana, IQR) 2,68 (3,56) 7,44 (6,84) 3,62 (5,6) < 0,001
Lactato (mmol/l) (mediana, IQR) 2,00 (1,54) 3,60 (5,53) 2,12 (2,28) < 0,001
PCR (mg/dl) (mediana, IQR) 147,8 (193,6) 163,0 (181,9) 155,0 (189) 0,200
PCT (ng/ml) (mediana, IQR) 2,9 (17,5) 5,8 (36,7) 3,54 (27,5) 0,001
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ANÁLISE DE SOBREVIVÊNCIA [0498] MR-proADM, PCT e lactato mostraram uma associação significativa com a mortalidade na análise de regressão de Cox univariada (Tabela 8). Após o ajuste para fatores de confusão e comparado à PCT, PCR e lactato, MR-proADM apresentou a mais forte associação independente com o risco de mortalidade (razão de risco: 8,5; intervalo de confiança de 95%: 4,2 a 17,4; p <0,001) (Tabela 8). Além disso, a análise de Kaplan Meier mostrou que nenhum paciente com valor de MRproADM < 0,88 nmol/l faleceu nos primeiros 28 dias após a admissão na UTI (Figura 1). Esse ponto de corte foi selecionado uma vez que forneceu uma sensibilidade de 100% na identificação de não sobreviventes no AUROC (Figura 2).
TABELA 8. ANÁLISE DE REGRESSÃO DE COX UNI E MULTIVARIADA PARA PREVISÃO DE MORTALIDADE AOS 28 DIAS APÓS A ADMISSÃO NA UTI.
Univariada Multivariada
HR (IC 95%) P HR (IC 95%) P
MR-proADM 11,2 (6,3 a 19,8) < 0,001 8,5 (4,2 a 17,4) < 0,001
Lactato 3,8 (2,6 a 5,5) < 0,001 3,4 (2,0 a 5,8) < 0,001
CRP 1,3 (0,8 a 1,9) 0,266 - -
PCT 1,4 (1,2 a 1,8) 0,001 1,1 (0,9 a 1,4) 0,326
SOFA 1,2 (1,2 a 1,3) < 0,001 1,2 (1,1 a 1,3) < 0,001
[0499] As variáveis de ajuste foram: idade, choque séptico, doença cardiovascular, imunossupressão, falha renal crônica, neoplasia, fonte respiratória de infecção, terapia renal substitutiva, hospital (Valladolid/Dijon), presença de infecção fúngica, limitação do esforço terapêutico A INFLUÊNCIA DA GRAVIDADE DA DOENÇA NO DESEMPENHO DOS BIOMARCADORES [0500] O MR-proADM apresentou a melhor AUROC para previsão
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142/150 de mortalidade aos 28 dias na análise em toda o coorte, até melhor que a da pontuação SOFA (Figura 2). Quando os pacientes foram estratificados pelo grau de falência de órgãos, MR-proADM foi o único biomarcador capaz de discriminar os não sobreviventes dos sobreviventes aos 28 dias naqueles pacientes com o menor grau de gravidade da doença (pontuação SOFA < 6), (AUROC [95% de intervalo de confiança (IC 95%):]: 0,75 [0,61 a 0,88]), (p = 0,006) (Figura 3). Nos pacientes moderadamente graves (pontuação SOFA 7 a 12), o MR-proADM apresentou AUROC maior do que o observado com o lactato (0,74 [0,66 a 0,83] vs. 0,61 [0,52 a 0,71], respectivamente) (Figura 3). Nos pacientes mais graves (pontuação SOFA > 13), MR-proADM e lactato apresentaram AUROC similar (0,73 [0,59 a 0,86] vs. 0,72 [0,59 a 0,86], respectivamente) (Figura 3). CRP e PCT não foram preditivos de mortalidade de 28 dias em qualquer grupo de gravidade com base na pontuação SOFA.
[0501] Os valores limiares (corte) do MR-proADM para identificar não sobreviventes foram aqueles que apresentaram maior especificidade daqueles com sensibilidade pré-fixada de pelo menos 0,80. Para pacientes com pontuação SOFA <6, 7a12e>13, o ponto de corte MR-proADM foi de 1,79, 3,25 e 5,58 nmol/l, respectivamente (Tabela 9). TABELA 9. CORTE DE MR-PROADM (NMOL/L) COM A MAIS ALTA PRECISÃO PARA PREVER MORTALIDADE EM 28 DIAS COM BASE NA PONTUAÇÃO SOFA. PPV - VALOR PREDITIVO POSITIVO, NPV VALOR PREDITIVO NEGATIVO, + LR — RAZÃO DE PROBABILIDADE POSITIVA, - LR — RAZÃO DE PROBABILIDADE.
Corte Sensibilidade Especifici- PPV NPV * LR - LR
SOFA < 6 1,79 83,0 61,0 23,8 96,2 2,14 0,27
SOFA 7 a 12 3,25 83,0 52,0 43,4 87,0 1,74 0,33
SOFA > 13 5,58 83,8 60,0 75,6 71,4 2,09 0,27
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143/150 [0502] O tempo de permanência na UTI em cada grupo de gravidade foi [média (DP)]: SOFA <6:11,0 dias (18,3); SOFA 7 a 12: 12,4 dias (16,0); SOFA > 13: 8,4 dias (7,6). As taxas de mortalidade para cada grupo de gravidade 12,8%, 30,6% e 59,7%, respectivamente. MR-PROADM MELHORA A PREVISÃO DE MORTALIDADE EM PACIENTES MENOS GRAVES [0503] Foi avaliada a combinação de MR-proADM e SOFA para previsão de mortalidade, de modo que pacientes com concentrações de MR-proADM> 1,79 nmol/l foram considerados como tendo um aumento de 1 ponto na pontuação SOFA. Em pacientes com SOFA < 6, a pontuação SOFA modificado por MR-proADM (ADM-SOFA) mostrou uma habilidade aumentada para identificar não sobreviventes comparados ao SOFA sozinho, AUROC [95% Cl]: SOFA 0,70 [0,58 a 0,82] e ADMSOFA 0,77 [0,66 a 0,88],
DISCUSSÃO [0504] A gravidade na sepse depende da extensão da falência de órgãos, conforme avaliado pela pontuação SOFA que por sua vez está diretamente associada ao risco de mortalidade [15], No entanto, o surgimento de um número crescente de biomarcadores pode fornecer um novo caminho para melhorar a precisão do prognóstico de maneira simples e rápida. Nesse sentido, nosso estudo sugere que o MR-proADM pode ser um biomarcador promissor. No entanto, estudos anteriores avaliando o papel prognóstico do MR-proADM na sepse forneceram resultados conflitantes. Christ-Crain et al constatou que MR-proADM resultou em uma AUROC de 0,81 para detectar a mortalidade na UTI em um grupo de 53 pacientes com sepse [16], Em contraste, Suberviola et al constatou um valor limitado de MR-proADM para prever mortalidade hospitalar em 137 pacientes com sepse com AUROC de 0,62 [17], No entanto, Marino etal mostrou que, em 101 pacientes com sepse, sepse
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144/150 grave ou de choque séptico, adrenomedulina plasmática estava fortemente associada à gravidade da doença, condição vasopressora e mortalidade em 28 dias [18], Esses resultados divergentes sobre o papel prognóstico da MR-proADM podem ser explicados pelas diferenças nas características do paciente, gravidade da doença, fonte infecciosa, cirúrgica vs. médica e amostras pequenas nos vários estudos.
[0505] No presente estudo, demonstramos pela primeira vez que o desempenho dos biomarcadores na previsão da mortalidade na sepse depende fortemente do grau de falência de órgãos na admissão à UTI. A estratificação dos pacientes com base na pontuação SOFA nos permitiu demonstrar que MR-proADM foi o único biomarcador capaz de identificar não-sobreviventes em todos os grupos de gravidade. Isso é particularmente importante para os pacientes menos graves (pontuação SOFA < 6), uma vez que esse grupo representa a apresentação mais precoce no curso clínico da sepse e/ou a forma menos grave dessa doença no ambiente da UTI. Assim, o MR-proADM pode ser um bom candidato para ser incorporado em um protocolo de gerenciamento precoce da sepse, pois podería fornecer um valor prognóstico rápido e ajudar a orientar intervenções diagnosticas e decisões de tratamento, assemelhando-se ao papel da troponina no infarto do miocárdio ou dímero d na embolia pulmonar. O valor de corte do MR-proADM identificado para esse grupo de pacientes (1,79 nmol/l) podería ser muito útil em relação a isso. Esse ponto de corte é capaz de detectar mortalidade com boa sensibilidade e alto valor preditivo negativo. Finalmente, o MR-proADM podería ajudar a estratificar pacientes em estudos clínicos que examinam novas terapias para sepse.
[0506] MR-proADM apresentou maiores valores preditivos para o risco de mortalidade do que outros biomarcadores mais comumente usados, incluindo o lactato, em pacientes com um grau intermediário de falência de órgãos (pontuação SOFA 7 a 12). Em contraste, tanto o MR
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145/150 proADM quanto o lactato tiveram desempenho similar nos pacientes mais graves (SOFA > 13). Portanto, nossos resultados confirmam a importância de considerar o grau de falência de órgãos ao projetar estudos para a descoberta de biomarcadores prognósticos na sepse.
[0507] A avaliação da falência de órgãos pelo uso da pontuação SOFA foi recentemente proposta pelo consenso do SEPSIS-3 para identificar pacientes de alto risco com suspeita de infecção [15], Nossos resultados mostram que um valor MR-proADM positivo pode melhorar a capacidade do SOFA em prever mortalidade na sepse. Curiosamente, uma combinação de MR-proADM com pontuações clínicas, tais como PSI ou CURB-65 também teve um desempenho melhor do que as pontuações clínicas sozinho em doentes com pneumonia adquirida na comunidade (PAC) ou infecções do trato respiratório inferior (ITRI) [12] [19] [20] [21], Como resultado, o MR-proADM podería ser usado como uma ferramenta confiável de estratificação de risco com a capacidade de prever a mortalidade ou eventos adversos e orientar as decisões clínicas. Recomenda-se, portanto, mais estudos clínicos que avaliem estratégias combinando o MR-proADM com outras pontuações de gravidade clássicas e/ou biomarcadores para melhorar o reconhecimento e o prognóstico da sepse [22] [23], [0508] Finalmente, foi observado que um valor de MR-proADM menor que 0,88 nmol/l pode permitir descartar a mortalidade nos 28 dias após a admissão na UTI. Esse ponto de corte pode ser especialmente útil para orientar decisões clínicas precoces, quando os sinais clínicos de falência evidente de órgãos ainda não são aparentes.
[0509] O monitoramento de MR-proADM ao longo do tempo pode ilustrar ainda mais uma tendência temporal que pode indicar o sucesso de tratamentos e terapias específicas e, consequentemente, aumentar o valor preditivo do resultado [25], Finalmente, em nosso coorte, os níveis de MR-proADM diferiram ligeiramente dependendo da origem da
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146/150 infecção. Infecções fúngicas induziram os mais altos níveis de MR-proADM, enquanto a infecção viral induziu o menor. Isso provavelmente está relacionado ao fato de que as infecções fúngicas resultaram em maior gravidade da doença (pontuação SOFA mediana de 12 vs. 9 pontos em pacientes sem infecção fúngica), enquanto infecções virais resultaram em uma gravidade mais leve da doença (SOFA 6,5 média vs. 9 pontos em pacientes sem infecção viral).
CONCLUSÕES [0510] Nossos resultados demonstram que o desempenho dos biomarcadores na determinação do risco de mortalidade na sepse é influenciado pela gravidade da doença. Em pacientes com gravidade moderada, MR-proADM superou outros biomarcadores padrão. Como consequência, MR-proADM pode auxiliar na identificação precoce de pacientes com sepse, exigindo internação urgente na UTI, bem como facilitando o manejo clínico subsequente desses pacientes.
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ADM: Adrenomedulina
MR-proADM: Pró-adrenomedulina mesoregional
PCR: Proteína C-reativa
PCT: Procalcitonina
SOFA: pontuação de Avaliação da Falha de Órgão Sequencial
IC: intervalo de confiança
AUROC: Área Sob Características de Operação do Receptor
PPV: Valor Preditivo Positivo
NPV: Valor Preditivo Negativo
LR: Razão de probabilidade
HR: Razão de risco
PSI: índice de Gravidade de Pneumonia
RRT: Terapia Renal de Reposição
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Todas as referências citadas no presente documento são totalmente incorporadas por referência.
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Claims (39)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para o diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o método compreende determinar um nível de proadrenomedulina (proADM) em uma amostra do dito indivíduo, e em que o dito nível de proADM é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo, em que o dito nível de proADM é comparado a um nível de referência de proADM; e em que o dito evento adverso do dito indivíduo é identificado com base na comparação (a) em que o nível de referência de proADM é de cerca de 0,7 nmol/l a cerca de 2,0 nmol/l, ou (b) em que (i) o nível de referência de proADM é de cerca de 1,8 nmol/l para indivíduos com sintomas correspondentes a uma pontuação de < 6 na avaliação da falha de órgão sequencial (SOFA);
    (ii) o nível de referência de proADM é de cerca de 3,2 nmol/l para indivíduos com sintomas correspondentes a uma pontuação SOFA de 7 a 12; ou (iii) o nível de referência de proADM é de cerca de 5,5 nmol/l para indivíduos com sintomas correspondentes a uma pontuação SOFA > 13.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1(a), caracterizado pelo fato de que uma diminuição no nível ou em um nível inferior ou em um nível igual do dito proADM do dito indivíduo, em comparação com o dito nível de referência do dito proADM é indicativa de que o evento adverso não ocorre, de preferência em até cerca de 28 dias; ou em que um aumento no nível de proADM ou nível superior
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    2/9 de proADM em comparação com o nível de referência de proADM é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo, em que, de preferência, o dito evento adverso ocorre em até cerca de 28 dias.
  3. 3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1(a) ou 2, caracterizado pelo fato de que o nível de referência do proADM é de cerca de 0,8 nmol/l a cerca de 1,9 nmol/l.
  4. 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1(a), 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o dito evento adverso é a mortalidade.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que um nível de proADM acima de cerca de 0,9 nmol/l, de preferência, acima de cerca de 1,9 nmol/l, com mais preferência, acima de cerca de 2,0 nmol/l, é indicativo da não sobrevivência do indivíduo em até cerca de 28 dias.
  6. 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1(a) ou 2, caracterizado pelo fato de que um nível de proADM abaixo de cerca de 1,0 nmol/l, de preferência, abaixo de cerca de 0,9 nmol/l, com mais preferência, abaixo de cerca de 0,88 nmol/l, é indicativo da sobrevivência do indivíduo em até cerca de 28 dias.
  7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que ainda, a pontuação de avaliação de falha de órgão sequencial (pontuação SOFA) do dito indivíduo é determinada.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 1(b), caracterizado pelo fato de que uma diminuição no nível ou em um nível igual de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 1,8 nmol/l, e uma pontuação de SOFA < 6 do dito indivíduo indicam que o dito evento adverso não ocorre;
    uma diminuição no nível ou um nível igual de proADM do dito
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    3/9 indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 3,2 nmol/l e uma pontuação SOFA de 7 a 12 do dito indivíduo são indicativos de que o dito evento adverso não ocorre; ou uma diminuição no nível ou um nível igual de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 5,6 nmol/l e uma pontuação SOFA > 13 do dito indivíduo indicam que o dito evento adverso nâo ocorre; e em que, de preferência, o dito evento adverso não ocorre em até cerca de 28 dias.
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 1(b), caracterizado pelo fato de que um aumento no nível de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 1,8 nmol/l e uma pontuação SOFA < 6 do dito indivíduo são indicativos do dito evento adverso do dito indivíduo;
    um aumento no nível de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 3,2 nmol/l e uma pontuação SOFA de 7 a 12 do dito indivíduo são indicativos do dito evento adverso do dito indivíduo; ou um aumento no nível de proADM do dito indivíduo em comparação com o nível de referência de proADM que é de cerca de 5,6 nmol/l e uma pontuação SOFA > 13 do dito indivíduo são indicativos do dito evento adverso do dito indivíduo, em que, de preferência, o dito evento adverso ocorre em até cerca de 28 dias.
  10. 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a pontuação SOFA do dito indivíduo é aumentada com base no nível de proADM do dito indivíduo, em que a dita pontuação SOFA modificada é indicativa do dito evento adverso.
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  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a pontuação SOFA modificada do indivíduo é aumentada em um se o indivíduo tiver um nível de proADM maior que cerca de 1,8 nmol/l.
  12. 12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o aumento no nível do dito proADM é cerca de duas vezes maior do que o dito nível de referência do proADM.
  13. 13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o dito proADM é proadrenomedulina midregional (MR-proADM) ou ADM maduro.
  14. 14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o dito nível de proADM do dito indivíduo é indicativo do dito evento adverso, de preferência mortalidade, do dito indivíduo que ocorre em até 28 dias.
  15. 15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende ainda a determinação de pelo menos um marcador e/ou parâmetro do dito indivíduo selecionado do grupo que consiste em um nível de pelo menos uma histona, um nível de procalcitonina (PCT) na dita amostra, a pontuação fisiológica aguda simplificada (pontuação SAPSII), a pontuação SOFA rápida (qSOFA), a pontuação de Fisiologia Aguda e Avaliação de Saúde Crônica II (APACHE II) do dito indivíduo, a pontuação do índice de Gravidade de Pneumonia (PSI) do dito indivíduo e a pontuação CURB-65 do dito indivíduo.
  16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o nível do marcador ou do parâmetro é determinado durante cerca de 12 horas de admissão do dito indivíduo.
  17. 17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o nível de proADM é determinado
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    5/9 durante cerca de 12 h de admissão do dito indivíduo,
  18. 18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende a determinação do dito nível de proADM e da pontuação SOFA do dito indivíduo.
  19. 19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo sofre de uma doença ou afecção médica.
  20. 20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo é um paciente criticamente doente, de preferência, em que o dito indivíduo é admitido em uma unidade de cuidados intensivos ou em um serviço de emergência, de preferência, o dito indivíduo é admitido em uma unidade de cuidados intensivos.
  21. 21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo sofre de uma doença ou afecção médica e em que a dita doença ou afecção médica é selecionada do grupo que consiste em doença respiratória, infecção do trato urinário, uma resposta inflamatória relacionada com etiologias infecciosas e não infecciosas, síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS), sepse, sepse grave, choque séptico, falência de órgãos, doença cardiovascular, diabetes mellitus, malignidade, doença hepática, doença renal, imunodepressão, infecção viral, infecção fúngica, infecção bacteriana, infecção bacteriana gram-negativa, infecção bacteriana gram-positiva e imunossupressâo.
  22. 22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo sofre de sepse.
  23. 23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo é um indivíduo
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    6/9 imunossuprimido, como um indivíduo que sofre do vírus da imunodeficiência humana (HiV), um indivíduo submetido a radioterapia e/ou um indivíduo a receber fármacos imunossupressores.
  24. 24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a dita amostra é um fluido corporal, sangue, plasma sanguíneo, soro sanguíneo ou urina.
  25. 25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o dito nível de proADM é determinado com uso de um método selecionado do grupo que consiste em espectrometria de massa (MS), imunoensaio de luminescência (LIA), radioimunoensaio (RIA), imunoensaios de quimiluminescência e fluorescência, imunoensaio enzimático (EIA), imunoensaios ligados a enzima (ELISA), matrizes de esferas baseadas em luminescência, matrizes baseadas em esferas magnéticas, ensaios de micromatrizes de proteína, formatos de teste rápido e ensaio de criptografia raro.
  26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o método é um imunoensaio e em que o ensaio é realizado em fase homogênea ou em fase heterogênea.
  27. 27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o método é um imunoensaio que compreende as etapas de:
    a) colocar a amostra em contato com (I) um primeiro anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo específico para um primeiro epitopo de proADM, e (ii) um segundo anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno ou derivado do mesmo específico para um segundo epitopo de proADM; e
    b) detectar a ligação do primeiro e do segundo anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno ou derivados do mesmo ao proADM.
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  28. 28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um dentre o primeiro ou o segundo anticorpos é marcado e o outro anticorpo é ligado a, ou é capaz de ser seletivamente ligado a uma fase sólida.
  29. 29. Método, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo estão presentes de forma dispersa em uma mistura de reação líquida, e em que um primeiro componente de marcação que faz parte de um sistema de marcação com base na extinção ou amplificação por fluorescência ou quimiluminescência está ligado ao primeiro anticorpo, e um segundo componente de marcação do dito sistema de marcação está ligado ao segundo anticorpo, de modo que, após a ligação de ambos os anticorpos ao dito proADM a ser detectado, é gerado um sinal mensurável que permite a detecção dos complexos em sanduíche resultantes na solução de medição.
  30. 30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o sistema de marcação compreende um criptato ou quelato de terras raras em combinação com um corante fluorescente ou quimiluminescente, em particular do tipo cianina.
  31. 31. Kit para realizar o método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que o dito kit compreende reagentes de detecção para determinar o dito nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo e dados de referência incluindo o dito nível de referência de proADM, e em que um aumento no nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência de proADM é indicativo de um evento adverso do dito indivíduo.
  32. 32. Kit para realizar o método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que o dito kit
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    8/9 compreende reagentes de detecção para determinar o dito nível de proADM na dita amostra do dito indivíduo e dados de referência incluindo o dito nível de referência de proADM, e em que uma diminuição do nível de proADM ou um nível similar de proADM na dita amostra do dito indivíduo em comparação com o dito nível de referência de proADM é indicativo de que um evento adverso do dito indivíduo não ocorre em até cerca de 28 dias.
  33. 33. Uso do kit, como definido na reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que é no método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 27.
  34. 34. Uso do kit, como definido na reivindicação 31 ou 32, para o diagnóstico, prognóstico, avaliação do risco, e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o dito nível de proADM é determinado na dita amostra do dito indivíduo, em que o dito nível de proADM é comparado com o dito nível de referência de proADM, e em que o dito evento adverso do dito indivíduo é identificado com base na comparação do dito nível de proADM determinado na dita amostra e no dito nívei de referência de proADM.
  35. 35. Uso de um kit para diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso de um indivíduo caracterizado pelo fato de que o dito kit compreende reagentes de detecção para determinar um nível de proADM em uma amostra de um indivíduo e em que o dito nível do dito proADM é indicativo do dito evento adverso do dito indivíduo.
  36. 36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que essa comparação é realizada em
    Petição 870190087665, de 06/09/2019, pág. 167/174
    9/9 um sistema de computador.
  37. 37. Método, de acordo com a reivindicação 1 a 30, caracterizado pelo fato de que o valor determinado de proADM é utilizado no cálculo de uma pontuação indicativa do dito diagnóstico, prognóstico, avaliação de risco e/ou estratificação de risco de um evento adverso no indivíduo.
  38. 38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que ainda, pelo menos um outro marcador e/ou parâmetro do indivíduo é utilizado para o cálculo da dita pontuação.
  39. 39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um marcador adicional e/ou parâmetro do dito indivíduo é selecionado do grupo que consiste em um nível de pelo menos uma histona, um nível de procalcitonina (PCT) na dita amostra, a pontuação fisiológica aguda simplificada (pontuação SAPSII), a pontuação SOFA rápida (qSOFA), a pontuação de Fisiologia Aguda e Avaliação de Saúde Crônica II (APACHE II) do dito indivíduo, a pontuação do índice de Gravidade de Pneumonia (PSI) do dito indivíduo e a pontuação CURB-65 do dito indivíduo.
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