JP2020505317A - 臍帯血移植（ｕｃｂｔ）および増加したガラクトセレブロシダーゼの発現によるクラッベ病の処置 - Google Patents

臍帯血移植（ｕｃｂｔ）および増加したガラクトセレブロシダーゼの発現によるクラッベ病の処置 Download PDF

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Abstract

本出願は、例えば、乳児においてクラッベ病を処置する方法を提供する。そのような方法は、例えば、骨髄アブレーションレジメンを施すことにより、患者を免疫抑制し、臍帯血移植（ＵＣＢＴ）（アロジェニックＵＣＢＴなど）を施し、患者においてガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）の発現を増やす（例えば、遺伝子編集を使用することにより）ことを含むことが可能である。本発明は、例えば、対象においてクラッベ病を処置する方法であって、前記対象を免疫抑制すること、治療有効量の臍帯血を前記対象に投与すること、およびガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）をコードする治療有効量の核酸分子を前記対象に投与することを含む方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１月２０日に出願された米国仮出願第６２／４４８，４３３号の利益を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
分野
本出願は、患者を免疫抑制し、臍帯血移植（ＵＣＢＴ）を提供し、患者においてガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）の発現を増加させる（例えば、ＧＡＬＣを発現するウイルスベクターを使用することにより）ことにより、クラッベ病を処置する方法を提供する。他の遺伝性疾患を処置するための類似の方法も提供される。
背景
クラッベ病は、神経系における正常な髄鞘形成の発達および維持に不可欠な酵素であるガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）の欠損または非存在により引き起こされる希な遺伝性リソソーム蓄積障害である。早期乳児クラッベ病として公知の、最も重篤な型のこの状態を抱えた子供は、生後６ヶ月までに症状を発症し、急速進行性神経変性を経験し、典型的には生後２年までに死亡する。遅発乳児および若年症状を含む、遅発性型のこの疾患を抱えた患者では、著しい身体障害および早期死亡も起きる場合がある。
臍帯血移植（ＵＣＢＴ）を用いた処置は、早期乳児および遅発乳児型のクラッベ病を抱えた個体において認知を保存し寿命を延ばすのに有効となり得る。ＵＣＢＴは神経症状の発症の前に脳変性の進行を停止させるが、罹患患者に著しい運動障害をもたらす末梢神経疾患の徴候を処置するのに有効ではない。
本明細書ではクラッベ病を処置するための方法が提供される。一部の例では、そのような方法は、対象を免疫抑制し、治療有効量の臍帯血を対象に投与すること（例えば、ＵＣＢＴを実施すること）、ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）をコードする治療有効量の核酸分子を対象に投与すること（例えば、ＧＡＬＣ発現を増やすため）を含む。処置を受ける対象は、早期乳児クラッベ病、遅発乳児クラッベ病、または若年型クラッベ病などのいかなる型のクラッベ病を有していてもよい。一部の例では、対象は早期乳児クラッベ病を有し、生後６ヶ月未満のヒト乳児である。一部の例では、対象は、ヒト、ネコ、またはイヌなどの哺乳動物である。
一部の例では、臍帯血は、ＧＡＬＣをコードする核酸分子の少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、または少なくとも９６時間前になど、ＧＡＬＣをコードする核酸分子の前に投与される。一部の例では、臍帯血は対象にアロジェニック（allogenic）である。そのような例では、ＨＬＡ適合ドナーは処置を受ける対象に６つのＨＬＡマーカーのうち少なくとも４つが適合する。一部の例では、対象に少なくとも３×１０７の総有核細胞用量／ｋｇ調整理想体重（ＡＩＢＷ）が投与される。
ＧＡＬＣをコードする核酸は、処置される対象に適合させることが可能である。したがって、例えば、処置される対象がネコの場合、ネコＧＡＬＣコード配列を使用することが可能であり、処置される対象がヒトの場合、ヒトＧＡＬＣコード配列を使用することが可能である。一部の例では、ＧＡＬＣをコードする核酸分子は、配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の例では、核酸分子は、配列番号２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧＡＬＣタンパク質をコードする。ＧＡＬＣをコードする核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結することが可能である。ＧＡＬＣをコードする核酸分子は、例えば、裸のＤＮＡとして直接投与することが可能である、またはプラスミドもしくはウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、例えば、ＡＡＶセロタイプｒｈ．１０などの血液脳関門を通過することが可能なウイルスベクターなどのベクターの一部として投与することが可能である。一部の例では、ＧＡＬＣをコードする核酸分子は静脈内に投与される。一部の例では、ＧＡＬＣをコードする核酸分子は、ウイルスベクターの一部である場合、対象あたり少なくとも２×１０１４ｇｃの用量で投与される。一部の例では、ＧＡＬＣをコードする核酸分子は、ウイルスベクターの一部である場合、少なくとも１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、少なくとも１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、少なくとも１×１０１３ｇｃ／ｋｇまたは少なくとも１×１０１４ｇｃ／ｋｇの用量で投与される。
対象は、ＵＢＣＴ、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子を受ける前に免疫抑制され得る。一部の例では、そのようなステップは、治療有効量のアレムツズマブ、ヒドロキシ尿素、フルダラビン、およびブスルファンを投与することを含む。一部の例では、そのようなステップは、治療有効量のタクロリムスおよびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）などのＧＶＨＤを減少させるための試薬の投与を含む。
クラッベ病を処置するための方法に加えて、本開示は、哺乳動物対象などの対象において遺伝性疾患を処置するための方法を提供する。方法は、遺伝子療法において使用される試薬（例えば、ウイルスベクタータンパク質、または遺伝子療法を施すまで対象によって事前に産生されなかった新しいタンパク質）に対する望まれない免疫応答（例えば、抗体産生）を低減する。いかなる遺伝性障害もそのような方法を用いて処置することが可能である。一部の例では、遺伝子療法は、タンパク質の発現を増加するか、タンパク質の発現を減少させるか、ゲノム配列エラーを修正するか、またはその組合せである。そのような方法は、対象において骨髄をアブレーションすること（例えば、化学療法、放射線、または両方を使用して）、それに続いて治療有効量の造血幹細胞（ＨＳＣ）を対象に投与して対象に新しい免疫系を提供することを含むことが可能である。一部の例では、対象は、ＨＳＣの投与に続いて治療有効量の免疫抑制剤を投与される。ＨＳＣの投与に続いて（対象の免疫系の回復の前であってもよい）、方法は、対象に治療有効量の治療用核酸分子を投与することを含み、核酸分子は遺伝性疾患を修正する（例えば、欠損しているタンパク質を発現することにより）。
本開示の前述ならびに他の目的および特長は、添付の図面を参照して進行する、以下の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。
図１。ヒトＧＡＬＣ（ｈＧＡＬＣ）を発現するＡＡＶｒｈ．１０のゲノム構造。ＡＡＶｒｈ．１０−ｈＧＡＬＣと称されるベクターは、ＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）、ＣＡＧプロモーター、全長ヒトＧＡＬＣ ｃＤＮＡ、およびウサギβ−グロビンポリＡを含有する。ＣＡＧプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーターおよびスプライスドナー、ならびにウサギβ−グロビンスプライスアクセプターから構成される。ＡＡＶ２に基づくゲノムは、ＡＡＶｒｈ．１０カプシドによって偽型化されている。当業者は、全長ヒトＧＡＬＣ ｃＤＮＡを、イヌ、ネコ、マウス、ラット、またはイルカなどの任意の哺乳動物由来の全長ＧＡＬＣ ｃＤＮＡと置き換えることができることを認識するであろう。
図２。ＢＭＴおよび静脈内ＡＡＶｒｈ．１０−ｍＧＡＬＣで処置したｔｗｉｔｃｈｅｒマウスの生存。ＰＮＤ１０でのＡＡＶｒｈ．１０−ｍＧＡＬＣ、ＰＮＤ１０でのＢＭＴ（ブスルファンアブレーション）、またはＰＮＤ１０〜１２でのＢＭＴ（ブスルファンアブレーション）直後のＡＡＶｒｈ．１０−ｍＧＡＬＣで処置したマウスの生存。垂直の青色と緑色の上昇は依然として生存しているマウスを表し、赤色の上昇は分析のために屠殺されたマウスを指す。アステリスクは、胃腸の合併症で死亡したマウスを示す。ＡＡＶｒｈ．１０−ｍＧＡＬＣ単独で処置したマウスの平均生存年齢は約７０〜７５日であったが、一部のマウスははるかに長く生存したことに留意されたい。Rafiら、Mol. Ther.２３巻：１６８１〜９０頁、２０１５年から。
図３Ａ〜３Ｆ。ＢＭＴ＋ＡＡＶで処置したｔｗｉｔｃｈｅｒマウスの末梢神経系の病理学的研究。ＢＭＴ単独またはＢＭＴ＋ＡＡＶで処置したｔｗｉｔｃｈｅｒマウスの坐骨神経からの横断切片を、罹患した未処置のｔｗｉｔｃｈｅｒおよび野生型マウスからの同様の切片と比較する。全てのイメージは、ルクソールファストブルー／過ヨウ素酸シッフで染色したパラフィン切片からである（元の倍率×１，０００）。野生型マウス（ａ）は、正常なミエリン形成を示すが、４２日齢の未処置の罹患（ｔｗｉｔｃｈｅｒ）マウス（ｂ）は、本質的にミエリンを有さず、多くのマクロファージを有する。ＢＭＴ単独で処置した９８日齢のｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｃ）は、本質的に全てのミエリンを喪失し、未処置のｔｗｉｔｃｈｅｒマウスに匹敵する。対照的に、組み合わせたＢＭＴ／ＡＡＶｒｈ１０で処置した異なる年齢のマウスからの坐骨神経（ｄ〜ｆ）は、完全に正常に見えるミエリンを有し、野生型マウスに匹敵する。Rafiら、Mol. Ther.２３巻：１６８１〜９０頁、２０１５年から。
図４。臍帯血移植後のクラッベ病の小児の神経発達の転帰。固有の線は各患者の発育を表す。黒色の線（底部）は、乳児として移植を受けた症候性の患者を表し、色付きの線は、やはり乳児として移植を受けた無症候性の患者を表す。緑色の対角線は、罹患していない小児の典型的な発育を表す。影付きのエリアは、罹患していない小児の典型的な発育におけるばらつきを示す。Escolarら、NEJM、３５２巻：２０６９〜８１頁、２００５年から。
配列表
添付の配列表に収載される核酸およびアミノ酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義される、ヌクレオチド塩基の標準文字略語、およびアミノ酸の３文字コードを使用して示される。それぞれの核酸配列の１つの鎖のみが示されるが、相補鎖は表示された鎖を任意に参照することにより含まれると理解される。配列表は「配列表．ｔｘｔ」（約４０ｋｂ）と名付けられたファイルの形態でＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出されており、このファイルは２０１７年１２月１８日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
配列番号１および２は、それぞれ例示的なヒトＧＡＬＣ核酸およびタンパク質配列（それぞれＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿０００１５３．３およびＮＰ＿０００１４４．２）である。
配列番号３および４は、ＡＡＶｒｈ．１０のカプシドの例示的な核酸およびタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２４３０１５．１およびＡＡＯ８８２０１．１）である。
詳細な説明
他に記述されていない限り、専門用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes VII、Oxford University Press出版、１９９９年；Kendrewら（編）、The Encyclopedia of Molecular Biology、BlackwellScience Ltd.出版、１９９４年；およびRobert A. Meyers（編）、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.出版、１９９５年；ならびに他の類似の参考文献に見ることができる。
本明細書で使用される場合、単数形の「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」とは、文脈が明確に示していない限り、単数および複数の両方を指す。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「核酸分子を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の要素を排除せずに「核酸分子を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。核酸について与えられるありとあらゆる塩基サイズはおおよそであり、他に示されていない限り、説明目的のために提供されることをさらに理解すべきである。本明細書に記載される方法および材料に類似するまたは同等の多くの方法および材料を使用することが可能であるが、特に適切な方法および材料を下に記載する。不一致が生じた場合には、用語の説明を含む、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は説明的なものにすぎず、限定的であることを意図していない。特許出願および特許を含むすべての参考文献、ならびに収載されているＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に関連する配列（２０１７年１月２０日現在で）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示の種々の実施形態の吟味を容易にするため、以下の特定の用語の説明が提供される。
投与：免疫抑制剤、臍帯血、ＨＳＣ、ＧＡＬＣをコードする核酸分子もしくは他の治療用核酸分子、または他の治療剤などの薬剤を、任意の効果的な経路により対象に提供するまたは与えること。例示的な投与経路は、これらに限定されないが、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、クモ膜下腔内、骨内、および静脈内など）、経皮、鼻腔内、ならびに吸入経路を含む。
接触：固体または液体形態を含む、直接的物理的会合に置くこと。接触は、例えば、試料（臍帯血を含有する試料など）に試薬を添加することによりｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏで、または対象に投与することによりｉｎ ｖｉｖｏで起こることが可能である。
有効量：有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な薬剤（免疫抑制剤、臍帯血、ＨＳＣ、ＧＡＬＣをコードする核酸分子または他の治療用核酸分子など）の量のこと。
有効量（治療有効量とも呼ばれる）は、処置を受けている対象および病状、対象の体重および年齢、病状の重症度、投与様式などのうちの１つまたは複数に応じて変動してもよく、有効量は当業者であれば容易に決定することが可能である。有益な治療効果は、診断決定の実施可能性；疾患、症状、障害、または病態の軽快；疾患、症状、障害、または状態の発症を低減するまたは予防すること；および疾患、症状、障害、または病態を一般的に相殺することを含み得る。一実施形態では、１つまたは複数の免疫抑制剤の「有効量」は、白血球を少なくとも９９％（免疫抑制剤の投与無しと比べた場合）低減するなどの、骨髄抑制を達成するのに十分な量である。一実施形態では、臍帯血の「有効量」は、ＲＩＣ ＵＣＢＴ後＋１４〜１５日目の中央値での生着を達成するための、少なくとも５０，０００，０００／ｋｇ、または少なくとも１００，０００，０００／ｋｇなどの少なくとも３×１０７の総有核細胞（ＴＮＣ）／ｋｇ（３０，０００，０００／ｋｇ）レシピエント体重である。一実施形態では、ＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（ＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、Ｔ細胞でのＧＡＬＣの活性および／または発現を増加するのに十分な量である。
一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者の生存時間を増加するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも１．５年、少なくとも２年、少なくとも２．５年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１２年、少なくとも１５年、または少なくとも２０年（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者の生存時間を増やすのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者のＣＮＳおよび／またはＰＮＳの細胞の髄鞘形成を増加するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％（免疫抑制剤）、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者のＣＮＳおよび／またはＰＮＳにおいてマクロファージ浸潤、アストログリオーシス、および／またはＣＤ６８染色を低減するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者において腫瘍を低減するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者の体重を増加するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者において神経発生的機能を増加するまたは改善するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者において早期学習（例えば、ｔｈｅ Ｂａｙｌｅｙ乳児発達スケールまたはＭｕｌｌｅｎスケール（Mullen, E. M. (１９９５年), Mullen Scales ofEarly Learning （AGS版、CirclePines、MN: American Guidance Service Inc.）により評価される）を増加するまたは改善するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者において運動技能（例えば、Ｐｅａｂｏｄｙ運動発達スケールにより評価される）を増加するまたは改善するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者（若年または成人対象など）の行動症状を改善するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者の視力を改善するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者の聴力を増加するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者の（例えば、脳のＭＲＩまたはＣＳＦ開放圧により検出した場合の）白質を増加するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者の（例えば、脳のＭＲＩにより検出した場合の）頭蓋内圧を低減するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者の（例えば、脳のＭＲＩにより検出した場合の）処理時間を低減するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者の（例えば、脳のＭＲＩにより検出した場合の）発作を低減するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者において（例えば、脳のＭＲＩにより検出した場合の）歩行運動、痙攣、摂食能力、細かい運動技能、適応機能、易刺激性、自律神経障害、睡眠、またはそれらの組合せを改善するのに十分な量である。一実施形態では、免疫抑制剤、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子（例えば、ＧＡＬＣをコードするベクター）の「有効量」は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（免疫抑制剤
、臍帯血、およびＧＡＬＣをコードする核酸分子の投与無しと比べた場合）、処置を受けたクラッベ患者において（例えば、脳のＭＲＩにより検出した場合の）ＣＳＦタンパク質のレベルを低減するおよび／または血液／ＣＳＦサイコシンを低減するのに十分な量である。一部の例では、これらの効果の組合せが達成される。
ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）：（例えば、ＯＭＩＭ ６０６８９０）：ガラクトシルセラミダーゼとしても公知であり、ガラクトースをセラミド誘導体から取り除く酵素である（ＥＣ３．２．１．４６）。欠失（例えば、５０２／ｄｅｌ突然変異）、挿入、および点突然変異などのＧＡＬＣにおける突然変異は、クラッベ病に関連している。Ｙ１５８Ｓ突然変異はイヌで観察されており、エクソン４におけるｃＤＮＡ３８７位および３８８位に対応するＡＣの欠失は、アカゲザルで観察されている。
ＧＡＬＣ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベースから公的に入手可能である（例えば、受託番号ＮＰ＿０００１４４．２、ＡＡＨ３６５１８．１、ＮＰ＿００１００３２３８．１、ＸＰ＿０１１２８１７７５．１、ＡＡＢ７１８２３．１、およびＮＰ＿００１０３７７２７．１は例示的ＧＡＬＣタンパク質配列を提供しており、受託番号ＮＭ＿０００１５３．３、ＢＣ０３６５１８．２、ＮＭ＿００１００３２３８．１、ＸＭ＿０１１２８３４７３．１、ＡＨ００５５７３．２、およびＮＭ＿００１０４４２６２．２は例示的ＧＡＬＣ核酸配列を提供している）。当業者であれば、これらのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を有する配列などの、ＧＡＬＣバリアントを含む追加のＧＡＬＣ核酸およびタンパク質配列を同定することが可能である。
造血幹細胞（ＨＳＣ）：すべての血液細胞を生じる幹細胞。したがって、ＨＳＣは、すべての血液系列をｉｎ ｖｉｖｏで永続的に生み出す能力を有する。ＨＳＣは臍帯血および骨髄（ＢＭ）に存在している。一部の例では、ＨＳＣはＣＤ３４を発現する。一部の例では、ＨＳＣは以下のマーカー：
マウスＨＳＣ：ＣＤ３４ｌｏ／−、ＳＣＡ−１＋、Ｆｌｔ−３＋，Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−
ヒトＨＳＣ：ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／−、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、ＣＤ１６６＋、ｌｉｎ−、ＳＬＡＭ分子
を発現する。
増加または減少：は、それぞれ、対照値（治療剤無しを表す値など）からの量の統計的に有意な正または負の変化。増加は、対照値と比べて少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％の増加などの、正の変化である。減少は、対照値と比べて少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の減少などの、負の変化である。一部の例では、減少は、９０％以下、９５％以下、または９９％以下の減少などの、１００％未満である。
単離された：「単離された」生物学的成分（核酸分子またはタンパク質など）は、他の細胞（例えば、ＲＢＣ）と、染色体および染色体外ＤＮＡならびにＲＮＡと，タンパク質などの、その成分が存在する生物の細胞または組織における他の生物学的成分から実質的に分離されている、それから分かたれた形で産生または精製されている。「単離」されている核酸およびタンパク質は、標準精製法により精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞において組換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸およびタンパク質も包含する。
クラッベ病：グロボイド細胞白質ジストロフィーまたはガラクトシルセラミドリピドーシスとしても公知で、神経系の髄鞘を冒す希でしばしば致死的な変性障害である。クラッベ病は、スフィンゴ脂質の機能障害性代謝を伴うので、スフィンゴリピドーシスの一形態である。この状態は常染色体劣性様式で遺伝する。クラッベ病は、ＧＡＬＣ遺伝子（ヒトの場合、第１４染色体上に位置している（１４ｑ３１））の突然変異により引き起こされ、これによりガラクトセレブロシダーゼが欠損する。ヒトに加えて、クラッベ病はネコ、イヌ（ウエスティおよびケアーンテリアなど）、およびイルカで観察されている。
乳児クラッベ病（例えば、患者は生後０〜６ヶ月）の症状は、易刺激性；筋緊張亢進；末梢神経障害；嘔吐および他の摂食困難；成長障害；発育の遅れ；原因不明の発熱；ならびに進行性筋力低下、難聴および視力喪失を含んでいる場合がある。遅発性型は、乳児後半（遅発性乳児、例えば、患者は生後７〜１２ヶ月）、小児期（遅発性、例えば、患者は生後１３ヶ月〜１０歳）、早期思春期または成人期（例えば、患者は１１歳またはそれよりも上）までも症状を現さない場合がある。これらの型の徴候および症状は変わりやすいが、筋力低下および硬直；歩行困難；視力喪失；知的後退；ならびに／または発作を含み得る。
作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列に作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列（ＧＡＬＣコード配列など）の転写または発現に影響を与える場合、そのコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は近接しており、必要に応じて、同じリーディングフレームで２つのタンパク質コード領域を結合させる。
薬学的に許容される担体：本発明において有用である薬学的に許容される担体は従来的である。Remington's Pharmaceutical Sciences、E. W.Martin著、Mack Publishing Co.、Easton、PA、第１５版（１９７５年）は、本明細書で開示されるベクター、血液細胞、核酸分子、または免疫抑制剤などの治療剤の医薬送達に適している組成物および製剤を記載している。
一般に、担体の性質は、用いられている特定の投与様式に依拠することになる。例えば、非経口製剤は通常、ビヒクルとして水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的におよび生理的に許容される流体を含む注射可能な流体を含む。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどの、少量の非毒性補助物質を含有することが可能である。
プロモーター：核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイ。プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合には、ＴＡＴＡエレメントなどの転写の開始部位近くに必要な核酸配列を含む。プロモーターは、任意選択で、転写開始部位から数千塩基対ほども離れて位置することが可能な遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。
プロモーターの例としては、これらに限定されないが、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶエンハンサープロモーター、およびＣＭＶエンハンサー／β-アクチンプロモーターなどが挙げられる。構成的プロモーターも誘導性プロモーターも、本明細書で提供される方法において使用することが可能である（例えば、Bitterら、Methods in Enzymology １５３巻：５１６〜５４４頁、１９８７年参照）。プロモーター依存性遺伝子発現を細胞型特異的、組織特異的にとって制御可能にする、または外部シグナルもしくは薬剤による誘導性にするのに十分であるプロモーターエレメントも含まれ；そのようなエレメントは、遺伝子の５’または３’領域に位置していてもよい。組換えＤＮＡまたは合成技法により産生されるプロモーターも、核酸配列の転写を提供するのに使用することが可能である。
組換え：組換え核酸分子またはタンパク質配列とは、天然には存在しない配列を有する、または他の方法で分離された配列の２つのセグメントの人工的な組合せにより作製される配列を有する核酸分子またはタンパク質配列（例えば、ＧＡＬＣコード配列を含むウイルスベクター）のことである。この人工的な組合せは、化学合成などの型通りの方法により、または核酸の単離されたセグメントの人工的操作により、例えば遺伝子操作技法により、達成することが可能である。同様に、組換えまたはトランスジェニック細胞とは、組換え核酸分子を含有し組換えタンパク質を発現する細胞のことである。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）：ＲＮＡ分子により媒介される転写後遺伝子サイレンシング機構。短いＲＮＡ分子を細胞内に導入すること（二本鎖ＲＮＡなど）により、そのＲＮＡ分子が他の特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に結合し、例えば、ｍＲＮＡがタンパク質を産生するのを妨げることにより、その活性を増加させるまたは減少させることが可能になる。阻害性ＲＮＡ分子の例としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム（ハンマーヘッド型リボザイム、ＶＳリボザイム、またはヘアピンリボザイムなど）、およびアンチセンス分子が挙げられる。ある特定の例では、ＲＮＡｉ分子は、その発現が遺伝性疾患を抱えた対象において不必要に上方調節されている（したがって、その発現を減少させるのが望ましい）遺伝子などの、標的遺伝子に向けられる。一部の例では、ＲＮＡｉ分子は長さが、少なくとも約１９ヌクレオチド（ｎｔ）、例えば、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、または少なくとも２７ｎｔである。
配列同一性：アミノ酸（またはヌクレオチド）配列間の類似性は、配列同一性とも呼ばれる、配列間の類似性に関して表される。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性もしくは相同性）に関して測定されることが多く、パーセンテージが高くなるに従って、２つの配列はそれだけ類似する。ポリペプチドの相同体は、標準法を使用して整列させた場合、比較的高度な配列同一性を有することになる。
比較のための配列の整列方法は公知である。種々のプログラムおよび整列アルゴリズムが、SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math. ２巻：４８２頁、１９８１年；NeedlemanおよびWunsch、J.Mol. Biol. ４８巻：４４３頁、１９７０年；PearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ８５巻：２４４４頁、１９８８年；HigginsおよびSharp、Gene ７３巻：２３７頁、１９８８年；HigginsおよびSharp、CABIOS ５巻：１５１頁、１９８９年；Corpetら、Nucleic Acids Research １６巻：１０８８１頁、１９８８年；ならびにPearsonおよびLipman、Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. ８５巻：２４４４頁、１９８８年に記載されている。Altschulら、Nature Genet. ６巻：１１９頁、１９９４年は、配列整列方法および相同性計算の詳細な考察を提示している。
Ｔｈｅ ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschulら、J. Mol. Biol. ２１５巻：４０３頁、１９９０年）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに接続して使用するため、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）およびインターネット上を含む、いくつかの供給源から利用可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。
天然のＧＡＬＣタンパク質またはコード配列のバリアントは典型的には、デフォルトパラメーターに設定されたＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ２．０、ｇａｐｐｅｄ ｂｌａｓｔｐを使用してアミノ酸配列との完全長整列にわたり計数される、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性の所有によって特徴付けられる。約３０アミノ酸よりも大きなアミノ酸配列の比較では、デフォルトパラメーター（１１のｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔおよび１のｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ）に設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して、Ｂｌａｓｔ２配列機能が用いられる。短いペプチド（約３０アミノ酸よりも少ない）を整列させる場合、整列はデフォルトパラメーター（ｏｐｅｎ ｇａｐ９、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ １ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）に設定されたＰＡＭ３０マトリックスを用いて、Ｂｌａｓｔ２配列機能を使用して実施するべきである。参照配列にさらに大きな類似性を有するタンパク質は、この方法で評価した場合、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性など、より大きなパーセンテージ同一性を示すことになる。配列同一性について全配列未満が比較されている場合、相同体およびバリアントは典型的には、１０〜２０アミノ酸の短い窓にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有することになり、参照配列に対するその類似性に応じて、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有していてもよい。そのような短い窓にわたり配列同一性を決定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。これらの配列同一性範囲は手引きのためだけに提供されるので、提供される範囲から外れる強く重要な相同体が得られる可能性がある。
したがって、本開示の方法を用いて使用することが可能なバリアントＧＡＬＣタンパク質または核酸配列は、配列番号１または２に対して、さらに本明細書に提供されるＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号で示されている配列のいずれかに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有することが可能である。
対象：哺乳動物、例えば、ヒトである。哺乳動物は、これらに限定されないが、マウス、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物、およびペットを含む。一実施形態では、対象は、サルもしくは他の非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イルカ、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシなどの非ヒト哺乳動物対象である。一部の例では、対象は、マウス、ウサギ、またはラットなどの実験動物／生物である。一部の例では、本明細書で開示される方法を使用して処置される対象は、生後６ヶ月未満のヒト乳児である。
一部の例では、対象は、本明細書で開示される方法を使用して処置することが可能な、乳児クラッベ病などのクラッベ病を有する。一部の例では、本明細書で開示される方法を使用して処置される対象は、遺伝性疾患を有するヒト対象である。
治療薬：対象に投与するとある有益な効果を授ける１つまたは複数の分子または化合物。有益な治療効果は、診断決定の実施可能性；疾患、症状、障害、または病態の軽快；疾患、症状、障害、または状態の発症を低減するまたは予防すること；および疾患、症状、障害、または病態を一般的に相殺することを含み得る。
形質導入されたおよび形質転換された：ウイルスまたはベクターは、それが核酸分子を細胞内に移行させた場合、細胞を「形質導入」する。細胞は、核酸の細胞ゲノムへの組込みにより、またはエピソーマル複製により、核酸分子が細胞により安定的に複製される場合、細胞内に形質導入された核酸により「形質転換される」または「トランスフェクトされる」。
化学的方法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション）、物理的方法（例えば、電気穿孔、マイクロインジェクション、微粒子銃）、融合（例えば、リポソーム）、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ウイルスエンベロープ／カプシド−ＤＮＡ複合体）、および組換えウイルスなどのウイルスによる生物学的感染によるなどの、数多くのトランスフェクション法を使用することが可能である（Wolff, J. A.編、Gene Therapeutics、Birkhauser、Boston、USA（１９９４年））。
トランス遺伝子：ベクターにより供給される外来性遺伝子。一例では、トランス遺伝子は、例えば、プロモーター配列に作動可能に連結されたＧＡＬＣコード配列（または、遺伝子、コード配列もしくは阻害ＲＮＡ分子などの他の治療用核酸分子）を含む。
移植：１つの身体またはその身体の部分から別の身体またはその身体の部分への組織もしくは臓器、または細胞（ＨＳＣなど）の移行。「アロジェニック移植」または「異種移植」は１つの個体から別の個体への移植であり、個体は１つまたは複数の遺伝子座に、その２つの個体において配列が同一ではない遺伝子を有する。アロジェニック移植は、遺伝的に異なる同じ種の２つの個体間、または２つの異なる種の個体間で起こり得る。「自家移植」は、同じ個体における１つの位置から別の位置への組織もしくは細胞の移植、または１つの個体から別の個体への組織もしくは細胞の移植であり、その２つの個体は遺伝的に同一である。
処置をする、処置、および療法：症状の緩解、軽減、減少あるいは状態を患者にとってもっと耐えられるものにする、変性もしくは減退の速度の緩徐化、最終変性点の衰弱性を弱める、対象の身体的もしくは精神的健康を改善する、または生存の長さを延ばすなどの、任意の客観的または主観的パラメーターを含む、傷害、病態または状態の減弱または軽快の任意の成功または成功の兆候。処置は、身体検査、血液および他の臨床検査などの結果を含む、客観的または主観的パラメーターにより評価してもよい。一部の例では、開示された方法を用いた処置は、遺伝性疾患を抱えた処置を受けた患者の生存時間を増加させるなどの、遺伝性疾患に関連する症状の数または重症度の減少をもたらす。
一部の例では、開示されている方法を用いて処置すると、処置を受けたクラッベ病患者の生存時間を増やす、処置を受けたクラッベ病患者のＣＮＳおよび／もしくはＰＮＳにおいて細胞の髄鞘形成を増やすもしくは改善する、処置を受けたクラッベ病患者において神経発生機能を増やすもしくは改善する、処置を受けたクラッベ病患者において早期学習（例えば、ＭｕｌｌｅｎもしくはＢａｙｌｅｙスケールにより評価される）を増やすもしくは改善する、処置を受けたクラッベ病患者のＣＮＳおよび／もしくはＰＮＳにおいてマクロファージ浸潤、アストログリオーシス、および／もしくはＣＤ６８発現を低減する、処置を受けたクラッベ病患者において振戦を低減する、処置を受けたクラッベ病患者の体重を増やす、ならびに／または処置を受けたクラッベ病患者において運動技能（例えば、Ｐｅａｂｏｄｙ運動発達スケールにより評価される）を増やすもしくは改善する、処置を受けたクラッベ病患者において摂食を改善する、処置を受けたクラッベ病患者において細かい運動技能を改善する、処置を受けたクラッベ病患者において認知および適応機能を改善する、処置を受けたクラッベ病患者において視力および聴力を改善する、処置を受けたクラッベ病患者において脳ＭＲＩを変化させる、処置を受けたクラッベ病患者において神経伝導を改善する、処置を受けたクラッベ病患者においてＣＳＦタンパク質を低下させる、処置を受けたクラッベ病患者においてサイコシンおよび疾患進行の任意のバイオマーカーを低下させる、処置を受けたクラッベ病患者において発作を減少させる、処置を受けたクラッベ病患者において易刺激性を低減する、処置を受けたクラッベ病患者において睡眠を改善する、処置を受けたクラッベ病患者において頭蓋内圧を改善する、処置を受けたクラッベ病患者において歩行運動を改善する、ならびに処置を受けたクラッベ病患者において行動障害を低減する、などの、クラッベ病に関連する症状の数または重症度を減少させる。一部の例では、これらの効果の組合せが達成される。
臍帯血（ＵＣＢ）：出生後胎盤におよび付着した臍の緒に残っている血液。ＵＣＢは、赤血球、白血球、血漿、血小板および造血幹細胞などの全血に見出される全ての要素を含有する。
に十分な条件下で：所望の活性を可能にする任意の環境を記述するのに使用される語句。一例では、所望の活性は、疾患を処置するのに必要なＧＡＬＣ、または他のタンパク質の増加した発現または活性である。一例では、所望の活性は、例えば、開示された方法を使用して、クラッベ病などの遺伝性疾患（または表１に収載されている他の遺伝性疾患）をｉｎ ｖｉｖｏで処置するまたはその進行を遅くすることである。
ベクター：宿主細胞に導入され、それによって形質転換宿主細胞を産生する核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞でのベクターの複製を可能にする核酸配列を含んでいてもよい。ベクターは、例えば、プロモーター、および／または選択可能マーカー遺伝子、ならびに当技術分野で公知の他の遺伝子エレメントと組み合わせて、ＧＡＬＣコード配列（または他の治療用核酸分子）を含んでいてもよい。ベクターは、細胞を形質導入する、形質転換する、または細胞に感染し、それによって、細胞に固有の核酸および／またはタンパク質以外の核酸および／またはタンパク質を細胞に発現させることが可能である。ベクターは、任意選択で、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティングなどの、核酸の細胞内への進入を達成するのを支援する物質を含む。
概論
クラッベ病（グロボイド細胞白質ジストロフィーとも呼ばれる）は希な遺伝性神経変性障害であり、発生率は１００，０００〜２５０，０００出生に１回と推定される。この疾患はあらゆる人種および民族に見出され、リソソーム酵素であるガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）をコードする遺伝子の突然変異により引き起こされ、この酵素は髄鞘の重要なガラクトリピド成分の正常な異化作用に不可欠である。ＧＡＬＣ活性の欠損により、ある特定のガラクトリピドが蓄積し、このために有髄化グリア細胞が損傷を受け、それによって中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）の炎症、急速脱髄、および進行性の劣化が引き起こされる（Wengerら、（２０１３年）Scriver's The OnlineMetabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (OMMBID)、第１４７章、Krabbe Disease (Globoid Cell Leukodystrophy)）。この疾患の古典的早期乳児型では、患者は、生後最初の６ヶ月で、痙縮、発育遅延、および易刺激性を呈する。白質の喪失により、重篤な運動および精神機能低下を生じ、生後２年までに死亡する。患者のおおよそ１０％が遅発性型の疾患（遅発乳児、若年、または成人）を有し、運動失調、脱力、視力問題、痙性対麻痺、行動障害、および認知症を呈し得る。一部の遺伝子型は、遅発性の重症度がもっと少ない疾患をもたらし、これはおそらく少量の残留ＧＡＬＣ活性と関係している。
ＧＡＬＣ遺伝子において同定された１４７の病因性突然変異のうち、一部は明らかに早期または遅発性疾患に関連している。他の場合、強い遺伝子型−表現型の相互関係はまだ十分に確立されていない。大半の患者は、クラッベ病の家族歴がない限り、既に症候性である場合に診断され、乳児クラッベ病の場合、同じＧＡＬＣ突然変異を共有していれば、発症年齢は類似する。
クラッベ病を抱えた前駆症状および最小症状患者に対する現在の標準治療は、最も一般的には臍帯血移植（ＵＣＢＴ）の形態での造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の施行である。しかし、このアプローチには欠点がある。１つの大きな欠陥は、ＨＳＣＴ単独では、罹患個人の身体障害の主原因である末梢神経疾患の進行を、軽快させるまたは遅らせることが示されていないことである。さらに、処置は疾患の自然な進行を変えはするが、それでも患者はその十代後半に悪化して死亡する（Guptaら、NeuroImage: Clinical. ７巻：７９２〜８頁、２０１４年）。さらに、ＵＣＢＴは、患者がすでに症候性になった後は、運動路への広範な早期の損傷のせいで著しい恩恵をもたらさない。したがって、患者がクラッベ病の徴候または症状を明らかにした後は、効果的な処置は利用できない。
ＵＣＢＴと遺伝子療法の両方を利用してＧＡＬＣの発現を増加させるクラッベ病を処置するための新規の方法が本明細書で提供される。ＧＡＬＣを発現すると、診断と神経系へＧＡＬＣを利用できることとの間の間隔を短縮することにより、ＵＣＢＴ単独と比べた場合よりもよくＣＮＳおよびＰＮＳの髄鞘形成を修正しクラッベ病表現型を軽快させることが可能であると提唱されている。自家臍帯血移植および局所的レンチウイルスベクタートランスフェクションを提唱しているものもいる。これとは対照的に、一部の例では、本発明はアロジェニック（無関係なドナー）臍帯血移植および静脈内アデノ随伴ウイルスベクタートランスフェクションを使用してＧＡＬＣを発現させる。方法は、免疫抑制されている対象において実施し、これによりＧＡＬＣタンパク質に対する抗体の形成を低減するまたは妨げることが可能になる。そのような方法は、末梢神経機能を改善し寿命を延ばすことが可能である。
乳児などの対象においてクラッベ病を処置するための方法が本明細書で提供される。一部の例では、方法は、対象を免疫抑制し（骨髄抑制し）、治療有効量の臍帯血（ＵＣＢ）を対象に投与し、（ＧＡＬＣ）をコードする治療有効量の核酸分子を対象に投与することを含む。
対象を免疫抑制することは、例えば、治療有効量のアレムツズマブ、ヒドロキシ尿素、フルダラビン、およびブスルファンを投与することにより、対象を骨髄抑制するまたは骨髄アブレーションする（myeloablate）ことを含み得る。一部の例では、方法は、治療有効量のタクロリムスおよびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を投与することをさらに含む。
一部の例では、ＵＣＢは、少なくとも６時間前に、少なくとも１２時間前に、少なくとも１日前に、少なくとも２日前に、少なくとも３日前に、少なくとも４日前に、少なくとも５日前に、少なくとも６日前に、または少なくとも７日前になど、ＧＡＬＣをコードする核酸分子の前に投与される。一部の例では、ＵＣＢは対象にアロジェニックであり、例えば、６つのＨＬＡマーカーのうち４、５または６つに適合する。一部の例では、治療有効量のＵＢＣを投与することは、対象に少なくとも３×１０７の総有核細胞用量／ｋｇ調整理想体重（ＡＩＢＷ）を投与することを含む。
一部の例では、ＧＡＬＣをコードする核酸分子は、配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を共有している。一部の例では、核酸分子は、配列番号２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するＧＡＬＣタンパク質をコードする。ＧＡＬＣコード配列は、クラッベ病と関連していることが公知の突然変異を含まない。ＧＡＬＣをコードする核酸分子は、構成的プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結し得る。一例では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである（図１参照）。ＧＡＬＣをコードする核酸分子は、ウイルスベクター、例えば、血液脳関門を通過することが可能なベクターなど、ベクターの一部であり得る。具体的な例では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、例えばＡＶＶセロタイプｒｈ．１０である。一部の例では、ＧＡＬＣをコードする核酸分子は、例えば、対象あたり少なくとも１×１０１１ゲノムコピー（ｇｃ）、少なくとも１×１０１２ｇｃ、少なくとも２×１０１２ｇｃ、少なくとも１×１０１３ｇｃ、少なくとも２×１０１３ｇｃ、または対象あたり少なくとも１×１０１４ｇｃ、例えば、対象あたり２×１０１１ｇｃ、対象あたり２×１０１２ｇｃ、対象あたり２×１０１３ｇｃ、または対象あたり２×１０１４ｇｃの用量で静脈内に投与される。一部の例では、ＧＡＬＣをコードする核酸分子は、例えば、少なくとも１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、少なくとも５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、少なくとも１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、少なくとも５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、少なくとも１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または少なくとも４×１０１３ｇｃ／ｋｇ、例えば、４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、または４×１０１３ｇｃ／ｋｇの用量で静脈内に投与される。一部の例では、ＧＡＬＣをコードする核酸分子は静脈内に投与される。
クラッベ病を処置する方法
乳児などの対象においてクラッベ病を処置するための方法が本明細書で提供される。一部の例では、方法は、対象を免疫抑制し（骨髄抑制し）、治療有効量の臍帯血（ＵＣＢ）を対象に投与し、ＧＡＬＣをコードする治療有効量の核酸分子を対象に投与することを含む（例えば、ＧＡＬＣは、正常なｗｔ ＧＡＬＣ核酸分子などの、クラッベ病に関連する突然変異を含まない）。一部の例では、方法は、自家ドナーからのＵＣＢＴ後に、ＧＡＬＣ遺伝子を保有するＡＶＶセロタイプｒｈ．１０ベクター（ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣ）を静脈内に注入することを含む。そのような処置は、患者の免疫系が再構成し、それによって処置成績を改善する間に、脳および末梢神経において髄鞘形成を改善することにより運動機能低下を停止することが可能である。
対象
処置される対象は、いかなる形態のクラッベ病を抱えたいかなる哺乳動物でも可能である。したがって、早期乳児クラッベ病、遅発乳児クラッベ病、または若年型クラッベ病を抱えたヒト、ネコおよびイヌを、開示された方法を用いて処置することが可能である。一部の例では、対象は早期乳児クラッベ病を有し、生後６ヶ月未満のヒト乳児である。一部の例では、対象は遅発乳児クラッベ病を有し、１歳未満のヒト乳児である。
免疫アブレーション
開示された方法を用いて処置される対象には、免疫系を抑制しおよび／または骨髄を壊滅させるのに使用される処置などの、その免疫系を抑制する処置を施すことが可能である。そのような免疫アブレーションは、ＵＣＢＴの前におよびＧＡＬＣコード配列の投与の前に実施され、これにより望ましくない免疫応答を低減するまたは除去してもよい。したがって、一部の例では、ＵＣＢＴおよびＧＡＬＣコード配列を受ける対象は、骨髄において造血細胞を根絶すると予想される最大投与可能量で与えられ、投与時間から１〜３週間以内に深刻な汎血球減少をもたらす化学療法剤などの、骨髄アブレーションレジメンを前もって受ける、またはレシピエントの骨髄を部分的にアブレーションするが除去はしないと予想される低減した用量の化学療法または全身放射線照射などの、非骨髄アブレーションレジメンを前もって受ける。一部の例では、レシピエント対象は、ＵＣＢＴおよびＧＡＬＣコード配列を受ける前に、Ｔ細胞などのレシピエントの免疫系を枯渇させるまたはアブレーションすることになる療法を受ける。
使用することが可能な化学療法剤の例としては、これらに限定されないが、カルムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、エトポシド、フルダラビン、メルファラン、メトトレキサート、チオテパ、トポテカン、またはそれらの組合せが挙げられる。一例では、対象は、治療有効量のブスルファンを用いて処置される。一例では、対象は、治療有効量のアレムツズマブ、ヒドロキシ尿素、フルダラビン、およびブスルファンを用いて処置される。
一部の例では、本明細書で提供される方法を用いて処置される対象は、例えば、ＵＣＢＴおよびＧＡＬＣコード配列を受ける前に、３〜４日かけて１２００〜１３００センチグレイ（centigray）などの放射線照射を受ける。
一部の例では、免疫アブレーションは、治療有効量のタクロリムス、治療有効量のミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、または両方などの移植片対宿主疾患を低減する薬剤を用いた処置を含む。
免疫アブレーションの成功は、もっぱら宿主Ｔ細胞回復がないことである。すなわち、Ｔ細胞キメリズムが１００％宿主ではない限り、免疫アブレーションは成功する。一部の場合、一部の宿主Ｔ細胞は約５０％で観察されるが、そのＴ細胞は時間と共に低下する。
ＵＣＢＴ
造血幹細胞移植についての命名法は、供給源が種により異なるために変わる。ヒトでは骨髄（ＢＭ）および血縁関係のない臍帯血（ＵＣＢ）を移植のために使用することが可能である。しかし、造血幹細胞の最も迅速な供給源は、兄弟姉妹のドナーがいなければ、保存臍帯血由来である。したがって、ヒトでの手順はＵＣＢＴと呼ぶことが可能である。マウスでは、同系骨髄細胞が利用され、その手順はときにＢＭＴと呼ばれる。
ＵＣＢＴ（またはＢＭＴ）は、成功した免疫アブレーションに続いて、しかし、ＧＡＬＣをコードする核酸分子を投与するより前に実施することが可能である。一部の例では、ＵＣＢＴ（またはＢＭＴ）は、ＧＡＬＣをコードする核酸分子を投与するより１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間前になどの、ＧＡＬＣをコードする核酸分子を投与するより少なくとも６時間前に、ＧＡＬＣをコードする核酸分子を投与するより少なくとも１２時間前に、ＧＡＬＣをコードする核酸分子を投与するより少なくとも１日前に、ＧＡＬＣをコードする核酸分子を投与するより少なくとも２日前に、ＧＡＬＣをコードする核酸分子を投与するより少なくとも３日前に、ＧＡＬＣをコードする核酸分子を投与するより少なくとも４日前に、ＧＡＬＣをコードする核酸分子を投与するより少なくとも５日前に、ＧＡＬＣをコードする核酸分子を投与するより少なくとも６日前に、またはＧＡＬＣをコードする核酸分子を投与するより少なくとも７日前に実施される。一部の例では、ＵＣＢＴ（またはＢＭＴ）は静脈内に投与される。
一部の例では、ＵＣＢ（またはＢＭ）は、対象にアロジェニックである。一部の例では、ドナーは、処置されるクラッベ病対象に対して対立遺伝子レベルＨＬＡ−ＤＲＢ１タイピングとの６つのＨＬＡ適合のうち最小で４つを有し、例えば、６つのＨＬＡマーカーのうち４、５または６つで適合する。
一部の例では、ＵＢＣ（またはＢＭ）は、少なくとも５×１０７／ｋｇ、少なくとも１×１０８／ｋｇ ＡＩＢＷ、または少なくとも３×１０８／ｋｇ ＡＩＢＷなどの、少なくとも２×１０７／ｋｇ、少なくとも３×１０７／ｋｇの総有核細胞（ＴＮＣ）用量で投与される。したがって、一部の例では、ＵＢＣ（またはＢＭ）は、５〜１２×１０７ＴＮＣ／ｋｇまたは２．３〜２５×１０７ＴＮＣ／ｋｇなどの、少なくとも２０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、２５，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、３０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも５０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも６０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも７０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも８０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも９０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも１００，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも１００，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも１２０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも２００，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、または少なくとも２５０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇの投与を含む。
一部の例では、ＵＢＣ（またはＢＭ）は、少なくとも３×１０５／ｋｇ、少なくとも５×１０５／ｋｇ、少なくとも１×１０６／ｋｇ、少なくとも３×１０６／ｋｇ、少なくとも５×１０６／ｋｇ、少なくとも１×１０７／ｋｇ、少なくとも３×１０７／ｋｇ、少なくとも５×１０７／ｋｇ、または少なくとも１×１０８／ｋｇなどの、少なくとも１．５×１０５／ｋｇ、例えば、１〜９×１０５／ｋｇのＣＤ３４＋前駆体用量を含む。
対象は、＋１日目に顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）も投与され、ＡＮＣが≧２，０００になるまで続けることが可能である。一部の例では、Ｇ−ＣＳＦは、少なくとも５ｍｃｇ／ｋｇ／一日量ＩＶもしくはＳＣ、少なくとも１０ｍｃｇ／ｋｇ／一日量ＩＶもしくはＳＣ、または少なくとも１０ｍｃｇ／ｋｇ／一日量ＩＶもしくはＳＣなどの、少なくとも１ｍｃｇ／ｋｇ／一日量ＩＶもしくはＳＣの用量で投与される。
ＧＡＬＣ発現を増加する
機能的ＧＡＬＣをコードする核酸分子は公知であり、具体的な例が本明細書で提供される。一部の例では、使用されるＧＡＬＣの配列は処置を受ける対象に適合する。例えば、対象がヒトである場合、正常な（例えば、クラッベ病に関連している突然変異を含まない配列などの、非突然変異）ヒトＧＡＬＣコード配列を使用することが可能である。
したがって、一部の例では、処置を受けた対象においてＧＡＬＣを発現すると、処置を受けた対象の細胞においてＧＡＬＣタンパク質発現および／または活性が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％増す。一部の例では、処置を受けた対象においてＧＡＬＣを発現すると、対象においてＧＡＬＣ活性（例えば、セラミド誘導体からのガラクトースの除去）が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％増す。例えば、ＧＡＬＣ活性のそのような増加は、脳、脊髄、小脳、および／または末梢神経（坐骨などの）などの、ＣＮＳおよび／またはＰＮＳにおいて観察され得る。一部の例では、対象においてＧＡＬＣを発現すると、対象のＣＮＳおよび／またはＰＮＳにおいて髄鞘形成が、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％増す。一部の例では、これらの効果の組合せが達成される。
一部の例では、ＧＡＬＣコード配列はベクターの一部ではない。一部の例では、ＧＡＬＣコード配列は、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、またはレトロウイルスなどのウイルスベクターなどのベクターの一部である。一部の例では、ＧＡＬＣコード配列の発現は、構成的プロモーターなどのプロモーターにより駆動される。一部の例では、ＧＡＬＣコード配列は、対象の静脈内に導入される。
一部の例では、ＧＡＬＣコード配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）編集、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）編集などの、遺伝子編集法を使用して投与される。
一部の例では、ＧＡＬＣコード配列は、裸の核酸分子として投与される。一部の例では、ＧＡＬＣコード配列は、ベクター（ＡＡＶｒｈ．１０−ｈＧＡＬＣなど）の一部であり、例えば、ベクターの凝集を低減し、血液脳関門の透過を増強するために、５％のソルビトールを有する３８０ｍＭのＰＢＳにおいて製剤化される。
ＧＡＬＣ配列
使用するＧＡＬＣコード配列は、天然のまたはバリアントＧＡＬＣ配列でも可能である。天然のＧＡＬＣ配列は、数種についてのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号により上に提供されている。したがって、一部の例では、対象に導入されるＧＡＬＣをコードする核酸分子（それを含有するベクターなど）は、天然のＧＡＬＣコード配列を含む。一部の例では、対象に導入されるＧＡＬＣをコードする核酸分子（それを含有するベクターなど）は非天然のＧＡＬＣコード配列を含むが、天然のＧＡＬＣタンパク質配列（例えば、変性しているコード配列）をコードする。
一例では、ＧＡＬＣをコードする核酸分子（それを含有するベクターなど）は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号により上に提供されるタンパク質配列のバリアントを含むバリアントＧＡＬＣタンパク質をコードしており、単一挿入、単一欠失、単一置換などの１つまたは複数の突然変異を含有することが可能である。しかし、そのような変形形態は、セラミド誘導体からガラクトースを除去する能力などのタンパク質の機能に悪影響を及ぼさない（例えば、クラッベ病に関連する突然変異を含む）。一部の例では、バリアントＧＡＬＣタンパク質は、１〜２０の挿入、１〜２０の欠失、１〜２０の置換、および／またはそれらの任意の組合せ（例えば、１〜１９の置換と共に単一の挿入）を含む。一部の例では、バリアントＧＡＬＣタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸変化を有する。一部の例では、バリアントＧＡＬＣタンパク質は、１〜８の挿入、１〜１５の欠失、１〜１０の置換、および／またはそれらの任意の組合せ（例えば、１〜１０、１〜５または１〜７のアミノ酸置換と共に１〜１５、１〜４、または１〜５のアミノ酸欠失）を含む。一例では、そのようなバリアントペプチドは、特定部位の突然変異誘発またはＰＣＲなどの、標準手順を使用してペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することにより産生される。
１つのタイプの改変は、類似の生化学的特性を有するアミノ酸残基とのアミノ酸の置換、すなわち、保存的置換（１〜４、１〜８、１〜１０、または１〜２０の保存的置換など、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の保存的置換）を含む。典型的には、保存的置換が、得られたペプチドの活性に及ぼす影響はほとんどないか皆無である。例えば、保存的置換は、任意の天然のＧＡＬＣタンパク質配列におけるアミノ酸置換であり、この置換はタンパク質の天然の機能（セラミド誘導体からガラクトースを除去するなど）に実質的な影響を及ぼさない。アラニンスキャンを使用すれば、ＧＡＬＣタンパク質におけるどのアミノ酸残基がアミノ酸置換に耐え得るかを同定することが可能である。一例では、アラニン、または他の保存的アミノ酸が、１〜４、１〜８、１〜１０、または１〜２０の天然のアミノ酸の代わりに使われる場合、ＧＡＬＣの天然の機能は２５％を超えて変化せず、例えば、２０％以下、例えば、１０％以下、または５％以下である。ＧＡＬＣタンパク質において元のアミノ酸の代わりに用いてもよく、保存的置換と見なされるアミノ酸の例としては、Ａｌａの代わりにＳｅｒ；Ａｒｇの代わりにＬｙｓ、Ｇｌｎ、またはＡｓｎ；Ａｓｎの代わりにＧｌｎまたはＨｉｓ、Ａｓｐの代わりにＧｌｕ；Ｃｙｓの代わりにＳｅｒ；Ｇｌｎの代わりにＡｓｎ；Ｇｌｕの代わりにＡｓｐ；Ｇｌｙの代わりにＰｒｏ；Ｈｉｓの代わりにＡｓｎまたはＧｌｎ；Ｉｌｅの代わりにＬｅｕまたはＶａｌ；Ｌｅｕの代わりにＩｌｅまたはＶａｌ；Ｌｙｓの代わりにＡｒｇまたはＧｌｎ；Ｍｅｔの代わりにＬｅｕまたはＩｌｅ；Ｐｈｅの代わりにＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒ；Ｓｅｒの代わりにＴｈｒ；Ｔｈｒの代わりにＳｅｒ；Ｔｒｐの代わりにＴｙｒ；Ｔｙｒの代わりにＴｒｐまたはＰｈｅ；およびＶａｌの代わりにＩｌｅまたはＬｅｕが挙げられる。
天然のまたはバリアントＧＡＬＣタンパク質をコードする核酸分子は、ベクターに組み込むことが可能である。本明細書に提供されるＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に示される配列との（例えば、配列番号１または２に対して）少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列などの天然のまたはバリアントＧＡＬＣをコードする核酸配列を作製することが可能である。さらに、配列は異なるが同じタンパク質配列をコードする核酸などの、機能的に等価な核酸を含有する種々のクローンを作製することが可能である。一部の例では、そのようなＧＡＬＣコード配列は、宿主細胞での発現のために最適化される。
コード配列におけるサイレント突然変異は、遺伝コードの縮重（すなわち、重複性）から生じ、縮重により１つよりも多いコドンが同じアミノ酸残基をコードすることが可能である。したがって、例えば、ロイシンはＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、またはＴＴＧがコードすることが可能であり；セリンはＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣがコードすることが可能であり；アスパラギンはＡＡＴまたはＡＡＣがコードすることが可能であり；アスパラギン酸はＧＡＴまたはＧＡＣがコードすることが可能であり；システインはＴＧＴまたはＴＧＣがコードすることが可能であり；アラニンはＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、またはＧＣＧがコードすることが可能であり；グルタミンはＣＡＡまたはＣＡＧがコードすることが可能であり；チロシンはＴＡＴまたはＴＡＣがコードすることが可能であり；イソロイシンはＡＴＴ、ＡＴＣ、またはＡＴＡがコードすることが可能である。
特定の種についてのコドン優先度およびコドン使用表を使用すれば、その特定の種のコドン使用優先度を利用するＧＡＬＣタンパク質をコードする単離された核酸分子を操作することが可能になる。例えば、ベクターから発現されるＧＡＬＣタンパク質は、目的の特定の生物（例えば、クラッベ病を抱えた哺乳動物において）により優先的に使用されるコドンを有するように設計することが可能になる。
ＧＡＬＣタンパク質をコードする核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅法（ＴＡＳ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）、およびＱβレプリカーゼ増幅法（ＱＢ）などの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法によりクローニングするまたは増幅することが可能である。多種多様なクローニングおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法を使用することが可能である。さらに、ＧＡＬＣタンパク質をコードする配列をコードする核酸は、クローニング技法により調製することが可能である。適切なクローニングおよび塩配列決定技法、ならびにクローニングを通して当業者を指導するのに十分な使用説明書の例はSambrookら(編)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第２版、１〜３巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ColdSpring、Harbor、N.Y.、１９８９年、およびAusubelら、（１９８７年）「Current Protocols inMolecular Biology」中、John Wiley and Sons、New York、N.Y.に見出される。
ＧＡＬＣタンパク質をコードする核酸配列は、例えば、適切な配列のクローニングを含む任意の適切な方法により、またはNarangら、Meth. Enzymol. ６８巻：９０〜９９頁、１９７９年のホスホトリエステル法；Brownら、Meth. Enzymol. ６８巻：１０９〜１５１頁、１９７９年のホスホジエステル法；Beaucageら、Tetra. Lett. ２２巻：１８５９〜１８６２頁、１９８１年のジエチルホスホロアミダイト（diethylphosphoramidite）法；例えば、Needham-VanDevanterら、Nucl. Acids Res. １２巻：６１５９〜６１６８頁、１９８４年に記載される自動合成装置を使用して、例えば、BeaucageおよびCaruthers、Tetra. Letts. ２２巻（２０号）：１８５９〜１８６２頁、１９８１年に記載される固相ホスホロアミダイトトリエステル法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法などの方法による、直接的な化学合成により、調製することが可能である。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。これは相補配列とのハイブリダイゼーションにより、または鋳型として一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼを用いた重合により、二本鎖ＤＮＡに変換することが可能である。当業者であれば、ＤＮＡの化学合成は一般に約１００塩基の配列に限られるが、より短い配列のライゲーションによりもっと長い配列を得ることができることは認識しているであろう。
一例では、ＧＡＬＣタンパク質は、ＧＡＬＣタンパク質をコードするｃＤＮＡをベクターに挿入することにより調製される。挿入は、タンパク質がインフレームで読まれてタンパク質が産生されるように行うことが可能である。ＧＡＬＣタンパク質をコードする異種核酸配列を含有する組換えベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）を調製するための技法は公知である。
ＧＡＬＣタンパク質の核酸コード配列は、配列の挿入または組込みを可能にするように操作することが可能であり、クラッベ病を抱えた対象において発現させることが可能であるプラスミド、ウイルスまたは他の媒介物を含むがこれらに限定されない発現ベクターに挿入することが可能である。ベクターからコード配列を発現させる方法は公知である。Ｔ細胞において発現し複製することができる生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは公知である。発現ベクターは、Ｔ細胞におけるＧＡＬＣタンパク質コード配列を含有する発現ベクターの移入およびそれに続く複製に必要な追加のエレメントを含有することが可能である。そのようなエレメントの例としては、これらに限定されないが、複製起点およびチミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能マーカー、または抗生物質耐性マーカーが挙げられる。
ＧＡＬＣタンパク質をコードする核酸配列は、プロモーターなどの発現制御配列に作動可能に連結することが可能である。ＧＡＬＣタンパク質コード配列に作動可能に連結された発現制御配列は、ＧＡＬＣタンパク質コード配列の発現が発現制御配列に適合する条件下で達成されるようにライゲートされる。例示的な発現制御配列は、これらに限定されないが、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ＧＡＬＣタンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンについてのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするその遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、および停止コドンを含む。使用可能である発現制御エレメントの例としては、これらに限定されないが、ｌａｃ系、ファージラムダのオペレーターおよびプロモーター領域、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルスまたはＳＶ４０由来のプロモーターが挙げられる。追加の機能的エレメントとしては、これらに限定されないが、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、ならびに宿主細胞においてＧＡＬＣタンパク質をコードする核酸配列の適切な転写およびそれに続く翻訳に必要な他の任意の配列が挙げられる。一例では、プロモーターは、ヒトＣＭＶエンハンサー、ベータアクチンプロモーター、ベータグロビンスプライスアクセプター、またはそれらの組合せ（例えば、図１、ＧＡＧプロモーター参照）。一部の例では、２つまたは３つのプロモーターが使用される。
例示的ウイルスベクター
ＧＡＬＣタンパク質をコードするウイルスベクターを調製することが可能である。使用可能である例示的ウイルスベクターは、これらに限定されないが、ポリオーマ、ＳＶ４０、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、アルファウイルスならびにトリ、マウス、およびヒト起源のレトロウイルスを含む。バキュロウイルス（オウトグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス；ＡｃＭＮＰＶ）ベクターも使用可能である。他の適切なベクターは、オルソポックスベクター、アビポックスベクター、鶏痘ベクター、カプリポックスベクター、スイポックスベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクター、およびポリオウイルスベクターを含む。具体的な例示的ベクターは、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、および高度に弱毒化されたワクシニアウイルス（ＭＶＡ）、アデノウイルス、バキュロウイルスなどのポックスウイルスベクターである。有用なポックスウイルスは、オルソポックス、スイポックス、アビポックス、およびカプリポックスウイルスを含む。オルソポックスはワクシニア、エクトロメリア、およびアライグマポックスを含む。有用なオルソポックスの１つの例はワクシニアである。アビポックスは鶏痘、カナリアポックスおよび鳩痘を含む。カプリポックスは山羊痘および羊痘を含む。一例では、スイポックスはブタポックスである。使用可能な他のウイルスベクターは、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルスなどの他のＤＮＡウイルス、ならびにレトロウイルスおよびポリオなどのＲＮＡウイルスを含む。
一部の例では、ＧＡＬＣコード配列は、例えば、静脈内投与に続いて血液脳関門を透過することができるベクターなどの、ベクターの一部である。そのようなベクターの例としては、ＡＡＶセロタイプＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．１０などのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が挙げられる。アデノ随伴ウイルスセロタイプｒｈ．１０（ＡＡＶ．ｒｈ１０）ベクターは、血液脳関門を部分的に透過し、高度なレベルの広いトランス遺伝子発現をもたらし（Sondhiら、Mol Ther. １５巻（３号）：４８１〜９１頁、２００７年；Deら、Mol Ther. １３巻：６７〜７６頁、２００６年）、静脈内送達に続いてニューロン、アストロサイト、およびグリア細胞を形質導入すると思われる（Zhangら、J. Virol. Methods １７９巻：２７６〜８０頁、２０１１年）。
開示の方法において使用可能な例示的ＡＡＶ．ｒｈ１０カプシドの配列は、配列番号３に提供されている（別の例が、欧州特許第２３４１０６８号の配列番号５９に提供されている）。したがって、一部の例では、使用するＡＡＶ．ｒｈ１０ベクターは、配列番号３に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するか、または配列番号４に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。ＡＡＶ．ｒｈ１０は、ＡＡＶ２遺伝子トランスファーベクター骨格（発現カセットに隣接するＡＡＶ２の逆位末端配列）；ヒトサイトメガロウイルスエンハンサーを有する発現カセット；ニワトリβアクチン由来のプロモーター、スプライスドナー、および左巻きイントロン配列；ウサギβグロビン由来の右巻きイントロン配列およびスプライスアクセプター（このエンハンサー／プロモーター／イントロン配列は「ＣＡＧ」と呼ばれる）を含む。ＣＡＧプロモーターは、ＡＡＶベクターにおいて遺伝子発現を駆動するのに使用される強力な遍在性プロモーターである。ＡＡＶ．ｒｈ１０−ｈＧＡＬＣベクターは、完全長ヒトＧＡＬＣ ｃＤＮＡ；およびウサギβグロビンポリＡ配列（図１）をさらに含む。一本鎖ゲノムは、ＡＡＶセロタイプｒｈ．１０のカプシドにパッケージングされ、ＡＡＶセロタイプｒｈ．１０は元はアカゲザルから単離されたものである（Gaoら、Proc Natl Acad Sci U S A. ９９巻（１８号）：１１８５４〜９頁、２００２年）。当業者であれば、完全長ヒトＧＡＬＣ ｃＤＮＡは、処置を受ける対象に応じて、目的のいかなる哺乳動物由来のＧＡＬＣ ｃＤＮＡとでも交換することが可能であることを認識するであろう。したがって、例えば、クラッベ病について処置されるイヌは、完全長ヒトＧＡＬＣ ｃＤＮＡの代わりに完全長イヌＧＡＬＣ ｃＤＮＡを含むＡＡＶ．ｒｈ１０−ＧＡＬＣベクターを利用することが可能である。ベクター名中の遺伝子略称の前の小文字は、トランス遺伝子の供給源である種を示すのに使用することが可能であり、例えば、ＡＡＶｒｈ．１０−ｍＧＡＬＣ＝マウスｃＤＮＡおよびＡＡＶｒｈ．１０−ｈＧＡＬＣ＝ヒトｃＤＮＡである。
ベクターの一部であることが可能な例示的ＡＡＶ．ｒｈ１０カプシド配列の配列は、配列番号３に提供されている。したがって、一部の例では、使用するＡＡＶ．ｒｈ１０は、配列番号３に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一部の例では、使用するＡＡＶ．ｒｈ１０は、配列番号４に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。
一部の例では、ベクター（ＡＡＶｒｈ．１０−ｈＧＡＬＣなど）は、例えば、ベクターの凝集を低減し、血液脳関門の透過を増強するために、５％のソルビトールを有する３８０ｍＭのＰＢＳにおいて製剤化される。
一部の例では、ＧＡＬＣをコードする核酸分子は、例えば、少なくとも１×１０１１ゲノムコピー（ｇｃ、時にはベクターゲノム（ｖｇ）と呼ばれる）、例えば、少なくとも２×１０１１ｇｃ、１×１０１２ｇｃ、少なくとも２×１０１２ｇｃ、少なくとも１×１０１３ｇｃ、対象あたり少なくとも２×１０１３ｇｃ、または対象あたり少なくとも１×１０１４ｇｃなど、例えば、対象あたり２×１０１１ｇｃ、対象あたり２×１０１２ｇｃ、対象あたり２×１０１３ｇｃ、または対象あたり２×１０１４ｇｃの用量で、静脈内に投与される。一部の例では、ＧＡＬＣをコードする核酸分子は、例えば、少なくとも１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、少なくとも５×１０１１ｇｃ／ｋｇ、少なくとも１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、対象あたり少なくとも５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、少なくとも１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、少なくとも５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または少なくともａ×１０１４ｇｃ／ｋｇ、例えば、４×１０１１ｇｃ／ｋｇ、４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、または４×１０１３ｇｃ／ｋｇの用量で、静脈内に投与される。
血液中のＡＡＶ-カプシド特異的Ｔ細胞などの有害な症状が発症した場合、副腎皮質ステロイドを投与することが可能である（例えば、Nathwaniら、N Engl J Med. ３６５巻（２５号）：２３５７〜６５頁、２０１１年参照）
遺伝子療法に先立つ免疫アブレーションおよび移植
遺伝性突然変異（１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組合せなどの）から生じる疾患を抱えた対象を処置する方法が本明細書で提供される。開示された方法は、遺伝子療法において使用される試薬（ウイルスベクターもしくはその部分、または対象により以前は発現されなかったタンパク質など）に対する免疫応答（例えば、抗体発生）を低減するまたは予防する。そのような方法は、遺伝子療法の成功を高めることが可能である。開示された方法は、対象の骨髄をアブレーションし、患者に造血幹細胞（ＨＳＣ）を移植し（対象に免疫系を再構成することになる）、ＨＳＣ移植後に遺伝子療法を施すことを含む。
一実施形態では、免疫アブレーション剤、ＨＳＣ、および治療用核酸分子をコードする核酸分子（例えば、治療用核酸分子をコードするベクター）の「有効量」とは、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％（免疫アブレーション剤、ＨＳＣ、および治療用核酸分子をコードする核酸分子の無投与と比べた場合）、処置を受けた患者の生存時間を増加するのに十分な量である。一実施形態では、免疫アブレーション剤、ＨＳＣ、および治療用核酸分子をコードする核酸分子（例えば、治療用核酸分子をコードするベクター）の「有効量」とは、例えば、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１年、少なくとも１．５年、少なくとも２年、少なくとも２．５年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１２年、少なくとも１５年、または少なくとも２０年（免疫アブレーション剤、ＨＳＣ、および治療用核酸分子をコードする核酸分子の無投与と比べた場合）、処置を受けた患者の生存時間を増加するのに十分な量である。
一部の例では、免疫アブレーション剤、ＨＳＣ、および治療用核酸分子をコードする核酸分子（例えば、治療用核酸分子をコードするベクター）の「有効量」とは、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％（免疫アブレーション剤、ＨＳＣ、および治療用核酸分子をコードする核酸分子の無投与と比べた場合）、処置を受けた患者において遺伝子療法に対する免疫応答を低減するのに十分な量である。一部の例では、遺伝子療法に対する免疫応答の低減は、治療用タンパク質、ベクター成分、または両方に対する抗体産生をモニタリングすることにより測定される。
したがって、開示された方法は、処置を受けた患者の生存時間を増加する、遺伝子療法に対する免疫応答を低減する、または両方が可能である。
対象
処置される対象は、表１に収載される遺伝性疾患などの任意の遺伝性疾患を抱えた、トリまたは哺乳動物などの任意の脊椎動物であり得る。したがって、遺伝性疾患を抱えたヒト、サル、ネコ、イヌまたは他の家畜対象を、開示された方法で処置することが可能である。一部の例では、対象は生後６ヶ月未満のヒト乳児である。一部の例では、対象は少なくとも１８歳のヒト成人である。
完全または部分的骨髄アブレーション
一部の例では、骨髄移植（ＨＳＣを用いたなど）および遺伝子療法を受ける前に、対象は、骨髄中の造血細胞を根絶する量で骨髄アブレーション療法を受ける。そのような方法は対象の免疫系を抑制し、その骨髄を壊滅させる。この処置により、投与時間から１〜３週間以内に深刻な汎血球減少が生じる。そのような処置を使用すれば、それに続いて施される遺伝子療法に対する免疫反応を低減するまたは除去することが可能になる。一部の例では、化学療法、放射線照射、または両方を使用して、対象の骨髄をアブレーションする。
一部の例では、対象は、治療有効量の全身照射（ＴＢＩ）、化学療法、またはそれらの組合せが施される。使用可能である化学療法剤の例としては、これらに限定されないが、カルムスチン、ブスルファン（Ｂｕ）、カルボプラチン、シクロホスファミド（Ｃｙ）、シトキサン、エトポシド、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、メルファラン、メトトレキサート、チオテパ、およびトポテカンのうちの１つまたは複数が挙げられる。一例では、対象は、治療有効量のブスルファンを用いて処置される。一例では、対象は、治療有効量のアレムツズマブ、ヒドロキシ尿素、フルダラビン、およびブスルファンを用いて処置される。一例では、対象は、治療有効量のアレムツズマブおよびフルダラビン（例えば、０．２〜５ｍｇ／ｋｇ ｉｖアレムツズマブ、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ ｉｖフルダラビン）を用いて処置され、一部の例では、ヒドロキシ尿素（例えば、３０ｍｇ／ｋｇ／日 経口）、Ｂｕ、メルファラン（例えば、７０ｍｇ／ｋｇ／用量 ＩＶ）、チオテパ（例えば、２００ｍｇ／ｋｇ／用量 ＩＶ）またはそれらの組合せをさらに含む。一部の例では、方法は、治療有効量のタクロリムスおよびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を投与することをさらに含む。
一部の例では、処置される対象は、３〜４日間かけて１２００〜１３００センチグレイなどの放射線照射を受ける。一例では、対象は、１６の総用量（１６ｍｇ／ｋｇ）について６時間毎に１ｍｇ／ｋｇの経口Ｂｕ、それに続いて全部で１２０〜２００ｍｇ／ｋｇについて２〜４日のＣｙを投与される。一部の例では、対象は、６分割照射線量の２００ｃＧｙで１２０ｍｇ／ｋｇ Ｃｙを投与される。
骨髄アブレーションの成功は、もっぱら宿主Ｔ細胞回復がないことである。すなわち、Ｔ細胞キメリズムが１００％の宿主ではない限り、骨髄破壊は成功する。一部の場合、一部の宿主Ｔ細胞は約５０％で観察されるが、それは時間と共に低下する。
一部の例では、骨髄移植（ＨＳＣを用いたなど）および遺伝子療法を受ける前に、対象は、骨髄中の造血細胞を低減するが根絶はしない量で、非骨髄アブレーション療法を受ける。したがって、そのような対象は、レシピエントの骨髄を部分的にアブレーションするが除去はしないと予想される減少させた用量の化学療法または全身照射を受けることが可能である。一例では、非骨髄アブレーション処置はブスルファンを使用しないが、代わりにメルファランおよびチオテパを使用する（例えば、NIH clinical trial NCT01962415 (clinicaltrials.gov/show/NCT01962415)に記載されている）。前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の例では、メルファランは７０ｍｇ／ｍ２／用量でＩＶ投与され、チオテパは２００ｍｇ／ｍ２／用量でＩＶ投与を施される。
ＨＳＣの注入
対象が骨髄アブレーション療法を受けた後、対象は、ＨＳＣ（例えば、アロジェニックＨＳＣ）などの、骨髄を再生するために治療有効量の細胞を投与される。そのような方法は、骨髄アブレーション療法に続いて対象の免疫系を再生する。ＨＳＣは、あらゆる血液細胞を生じる幹細胞である。したがって、ＨＳＣはあらゆる血液系統をｉｎ ｖｉｖｏで生み出すことが可能である。ＨＳＣは、臍帯、血液、および骨髄（ＢＭ）に存在している。一部の例では、ＨＳＣはＣＤ３４を発現する。一部の例では、マウスＨＳＣは、ＣＤ３４ｌｏ／−、ＳＣＡ−１＋、Ｆｌｔ−３＋、Ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−である。一部の例では、ヒトＨＳＣはＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／−、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、ＣＤ１６６＋、ｌｉｎ−である。
一部の例では、対象は、骨髄（ＢＭ）、血縁関係のない臍帯血、保存臍帯血、またはＨＳＣ（臍帯、血液（ＰＢＭＣなど）、またはＢＭから得られるものなど）を投与される。移植は、成功した骨髄アブレーションに続いて、しかし、遺伝子療法のための核酸分子の投与の前に実施される。
一部の例では、ＨＳＣを含む移植は、遺伝子療法のための核酸分子の投与の少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月、または少なくとも２ヶ月前になどの、遺伝子療法のための核酸分子の投与の少なくとも６時間前に、遺伝子療法のための核酸分子の投与の少なくとも１２時間前に、例えば、遺伝子療法のための核酸分子の投与の１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間前に実施される。一部の例では、ＨＳＣを含む移植は静脈内に投与される。
一部の例では、ＨＳＣは、対象にアロジェニックである。一部の例では、ドナーは、処置される対象に対して対立遺伝子レベルＨＬＡ−ＤＲＢ１タイピングとの６つのＨＬＡ適合のうち最小で４つを有し、例えば、６ＨＬＡマーカーのうち４、５、または６つで適合する。一部の例では、ＨＳＣは対象にとって自家ＨＳＣである。
一部の例では、対象は、少なくとも５×１０７／ｋｇ、少なくとも１×１０８／ｋｇ ＡＩＢＷ、または少なくとも３×１０８／ｋｇ ＡＩＢＷなどの、少なくとも２×１０７／ｋｇ、少なくとも３×１０７／ｋｇの総有核細胞（ＴＮＣ）用量を受ける。したがって、一部の例では、対象は、５〜１２×１０７ＴＮＣ／ｋｇまたは２．３〜２５×１０７ＴＮＣ／ｋｇなどの、少なくとも２０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、２５，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、３０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも５０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも６０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも７０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも８０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも９０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも１００，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも１００，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも１２０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、少なくとも２００，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇ、または少なくとも２５０，０００，０００ＴＮＣ／ｋｇを投与される。
一部の例では、対象は、少なくとも３×１０５／ｋｇ、少なくとも５×１０５／ｋｇ、少なくとも１×１０６／ｋｇ、少なくとも３×１０６／ｋｇ、少なくとも５×１０６／ｋｇ、少なくとも１×１０７／ｋｇ、少なくとも３×１０７／ｋｇ、少なくとも５×１０７／ｋｇ、または少なくとも１×１０８／ｋｇなどの、少なくとも１．５×１０５／ｋｇ、例えば、１〜３０×１０５／ｋｇ、例えば、１．５〜３０×１０５／ｋｇのＣＤ３４＋前駆体用量を受ける。
対象は、＋１日目に顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）も投与され、ＡＮＣが≧２，０００になるまで続けることが可能である。一部の例では、Ｇ−ＣＳＦは、少なくとも５ｍｃｇ／ｋｇ／一日量ＩＶもしくはＳＣ、少なくとも１０ｍｃｇ／ｋｇ／一日量ＩＶもしくはＳＣ、または少なくとも１０ｍｃｇ／ｋｇ／一日量ＩＶもしくはＳＣなどの、少なくとも１ｍｃｇ／ｋｇ／一日量ＩＶもしくはＳＣの用量で投与される。
一部の例では、移植に続いて、対象は、その免疫系が回復するまで免疫抑制療法を受ける。一部の例では、対象は、カルシニューリン阻害剤（例えば、タクロリムス、シクロスポリンＡ）、グルココルチコイド（例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン）、または細胞分裂阻害剤（例えば、メトトレキセート、アザチオプリン、細胞傷害抗生物質）などの、治療有効量の１つまたは複数の免疫抑制剤を投与される。一部の例では、対象は移植に続いて治療量のシクロホスファミド（cyclophosphamnide）を投与される。
遺伝子治療の投与
免疫アブレーションおよび関連した完全または部分的骨髄アブレーションに続いて、処置された対象の造血系および免疫系を再構築するためにＨＳＣ（例えば、臍帯血または骨髄）が移植され、治療有効量の治療用核酸分子が対象に投与され、ここで核酸分子は遺伝性疾患を修正する。一部の例では、治療用核酸分子は、ＡＡＶベクター（ＡＡＶ．ｒｈ１０など）、アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターの一部である。他の例が本明細書で提供される（参照によりその全ての内容が本明細書に組み込まれるChoudhuryら、Neuropharmacol.１２０巻：６３〜８０頁、２０１７年も参照）。方法は、特定の遺伝子治療法に限定されず、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を利用するものを含む（例えば、参照によりその全ての内容が本明細書に組み込まれるMorganら、Cell Stem Cell ２１巻：５７４〜９０頁、２０１７年；Shimら、Acta Pharma. Sinica ３８巻：７３８〜５３頁、２０１７年を参照）。
遺伝子治療の例には、遺伝子もしくはタンパク質の発現を増加させるか、遺伝子もしくはタンパク質の発現を低下させるか、または遺伝子もしくはタンパク質の配列を修正するために使用される方法および薬剤が含まれる。例えば、遺伝子発現を誘導するために、機能的遺伝子を対象、例えば、正常な機能を欠いている標的細胞または組織に送達することができる。遺伝子発現を低減させるために、短い核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子）を導入して、疾患関連遺伝子をサイレンシングするかまたは妨害することができる。遺伝子編集法を使用して、ゲノムレベルで永久的かつ特異的な校正効果を発揮することができる。
開示された方法で処置することができる疾患には、血液のあらゆる遺伝性疾患（例えば、鎌状赤血球症、原発性免疫不全症）、ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１）、および血液悪性腫瘍またはがんが含まれる。原発性免疫不全症およびそれらの対応する突然変異の例には、Ａｌ−Ｈｅｒｚら（参照によりその全ての内容が本明細書に組み込まれるFrontiers in Immunology、５巻、記事１６２、２０１４年４月２２日）に列挙されるものが含まれる。血液悪性腫瘍またはがんは、血液、骨髄、およびリンパ節に影響を及ぼす腫瘍である。例には、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性単球性白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、および骨髄腫が含まれる。表１は、治療用核酸分子によって標的とされ得る例示的な障害および遺伝子の一覧を提示する。一部の例では、遺伝子編集によって修正し得る突然変異が提示される。
開示された方法を使用することは、表１に列挙された障害のいずれか、または他の公知の遺伝性障害を処置するために使用され得る。処置は、障害の全ての特徴の１００％の除去を必要としないが、そのような特徴の低減であり得る。具体的な例を以下に提供するが、この教示に基づいて、他の障害の症状にも同様に作用し得ることを理解するであろう。例えば、開示された方法は、対象によって発現されないかもしくは発現が低減したタンパク質の発現を増加させるか、対象によって望ましくない形で発現しているかもしくは発現が低減したタンパク質の発現を減少させるか、遺伝性突然変異を修正するか、またはそれらの組合せのために使用することができる。
例えば、開示された方法は、原発性免疫不全症などの血液の遺伝性疾患の望ましくない効果を処置または低減するために使用することができる。
例えば、開示された方法（治療用核酸分子を使用してヘモグロビンのβグロビン鎖の突然変異を修正することができる）は、鎌状赤血球症の望ましくない効果を処置または低減することができる。一例では、治療用核酸分子は、鎌状赤血球症を引き起こすヘモグロビンのβグロビン鎖の突然変異を修正することができる。一例では、開示された方法は、レシピエント対象における鎌状赤血球症の症状（例えば、血中の鎌状赤血球の存在、疼痛、虚血、壊死、貧血、血管閉塞クリーゼ、骨髄無形成クリーゼ、脾臓血球貯留クリーゼ、および溶血クリーゼの１つまたは複数）を低減し、例えば、（治療用核酸分子を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％低減する。一例では、開示された方法は、レシピエント対象における鎌状赤血球の数を減少させ、例えば、（治療用核酸分子を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少させる。
例えば、開示された方法（治療用核酸分子を使用して第Ｖ因子ライデンまたはプロトロンビンの遺伝子の突然変異を修正することができる）は、血栓形成傾向の望ましくない効果を処置または低減することができる。一例では、治療用核酸分子は、血栓形成傾向を生じる第Ｖ因子ライデンまたはプロトロンビンの遺伝子の突然変異を修正することができる。一例では、開示された方法は、レシピエント対象における血栓形成傾向の症状（例えば、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓塞栓症、腫脹、胸痛、動悸などの血栓症の１つまたは複数）を低減し、例えば、（治療用核酸分子を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％低減する。一例では、開示された方法は、レシピエント対象における凝固因子の活性を低下させ、例えば、（治療用核酸分子を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少させる。
例えば、開示された方法（治療用核酸分子を使用してＣＤ４０リガンドの遺伝子の突然変異を修正することができる）は、ＣＤ４０リガンド欠損症の望ましくない効果を処置または低減するために使用することができる。一例では、治療用核酸分子は、ＣＤ４０リガンド欠損症を引き起こすＣＤ４０リガンドの遺伝子の突然変異を修正することができる。一例では、開示された方法は、レシピエント対象におけるＣＤ４０リガンド欠損症の症状（例えば、血清ＩｇＭの上昇、他の免疫グロブリンの低血清レベル、日和見感染症、自己免疫、および悪性腫瘍の１つまたは複数）を低減し、例えば、（治療用核酸分子を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％低減する。一例では、開示された方法は、レシピエント対象におけるＣＤ４０リガンド欠損症の量または活性を増加させ、例えば、（治療用核酸分子を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％増加させる。
例えば、開示された方法（治療用核酸分子を使用してＣＣＲ５活性を低下させることができる）は、ＨＩＶ−１感染症の望ましくない効果を処置または低減するために使用することができる。一例では、治療用核酸分子は、ＣＣＲ５活性を低下させ、例えば、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％低下させることができる。一例では、ＣＣＲ５は、３２ｂｐ欠失を含むよう改変される（ＣＣＲ５Δ３２）。一例では、開示された方法は、レシピエント対象におけるＨＩＶ−１感染症の症状（例えば、熱、大きい圧痛のあるリンパ節、気管の炎症、発疹、頭痛、口腔の痛み、悪心、嘔吐、下痢、末梢神経障害、ギランバレー症候群、体重減少、ウイルス量、ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベル低下、ニューモシスティス肺炎、ＨＩＶ消耗症候群の形態の悪液質、および食道カンジダ症の１つまたは複数）を低減し、例えば、（治療用核酸分子を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％低減する。一例では、開示された方法は、ＨＩＶ感染レシピエント対象におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを増加させ、例えば、（治療用核酸分子を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％、ＣＤ４＋Ｔ細胞を増加させる。
例えば、開示された方法は、遺伝性欠陥から生じる原発性免疫不全症の望ましくない効果を処置または低減するために使用することができる。例えば、開示された方法（治療用核酸分子を使用して上に列挙した遺伝子における突然変異を修正することができるか、または対象において欠失しているか欠陥のある機能性タンパク質を発現することができる）は、原発性免疫不全症の望ましくない効果を処置または低減することができる。一例では、開示された方法は、レシピエント対象における原発性免疫不全症の症状（例えば、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症、寄生虫感染症、リンパ腺腫脹、脾臓肥大、創傷、および体重減少の１つまたは複数）を低減し、例えば、（治療用核酸分子を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％低減する。一例では、開示された方法は、原発性免疫不全症のレシピエント対象における免疫細胞（例えば、ＣＤ８細胞などのＴ細胞）の数を増加させ、例えば、（治療用核酸分子を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％増加させる。一例では、開示された方法は、一定期間にわたって（例えば、１年間にわたって）、原発性免疫不全症のレシピエント対象における感染（例えば、細菌、ウイルス、真菌、またはそれらの組合せ）の数を減少させ、例えば、（治療用核酸分子を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少させる。
例えば、開示された方法は、単一遺伝子障害の望ましくない効果を処置または低減するために使用することができる。例えば、開示された方法（治療用核酸分子を使用して上に列挙した遺伝子における突然変異を修正することができるか、または対象において欠失しているか欠陥のある機能性タンパク質を発現することができる）は、単一遺伝子障害の望ましくない効果を処置または低減することができる。一例では、開示された方法は、レシピエント対象における単一遺伝子障害の症状を低減し、例えば、（治療用核酸分子を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％低減する。一例では、開示された方法は、単一遺伝子障害のレシピエント対象で通常発現していない正常タンパク質の量を増加させ、例えば、（治療用核酸分子を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％増加させる。
例えば、開示された方法は、レシピエント対象における血液学的悪性腫瘍の望ましくない効果を処置または低減するために使用することができる。一例では、開示された方法は、レシピエント対象（例えば、白血病の対象）における異常白血球（例えば、Ｂ細胞）の数を減少させ、例えば、（開示された治療を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％減少させる。一例では、開示された治療の投与は、白血病の望ましくない効果を処置または低減するのに使用することができ、例えば、リンパ腫のサイズ、リンパ腫の体積、リンパ腫の増殖速度、腫瘍の転移を減少させ、例えば、（開示された治療を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％減少させる。一例では、開示された治療の投与は、多発性骨髄腫の望ましくない効果を処置または低減するのに使用することができ、例えば、レシピエント対象における異常形質細胞の数を減少させ、例えば、（開示された治療を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％減少させる。
例えば、開示された方法は、レシピエント対象における遺伝性欠陥から生じる悪性腫瘍の望ましくない効果を処置または低減するために使用することができる。一例では、開示された方法は、レシピエント対象（例えば、上に列挙したがんの対象）におけるがん細胞の数、腫瘍のサイズ、腫瘍の体積、または転移の数を減少させ、例えば、（開示された治療を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％減少させる。一例では、開示された治療の投与は、リンパ腫の望ましくない効果を処置または低減するのに使用することができ、例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍の体積、がんの増殖速度、がんの転移を減少させ、例えば、（開示された治療を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％減少させる。
例えば、開示された方法は、レシピエント対象における遺伝性欠陥から生じる神経疾患の望ましくない効果を処置または低減するために使用することができる。一例では、開示された方法は、レシピエント対象（例えば、上に列挙した神経疾患の対象）における神経機能を増加させ、例えば、（開示された治療を投与しない場合と比較したとき）、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、または少なくとも５００％増加させる。
（実施例１）
クラッベ病のｔｗｉｔｃｈｅｒマウスモデルの処置
この実施例は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に続いてＧＡＬＣ遺伝子を担持するアデノ随伴ウイルスセロタイプｒｈ．１０ベクター（ＡＡＶｒｈ．１０−ｍＧＡＬＣ）を使用する、クラッベ病のｔｗｉｔｃｈｅｒマウスモデルを処置するために使用される方法を記載する（Rafiら、Mol Ther. ２３巻（１１号）：１６８１〜９０頁、２０１５年）。
ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスは、ＧＡＬＣ遺伝子におけるナンセンス突然変異（Ｗ３３９Ｘ）に起因するＧＡＬＣ活性の非存在によって生じる表現型を有する、天然に存在する突然変異系統である。マウスは、発育不全を示し、約２０日齢で振戦を含む異常を発症し、３０〜３５日齢で後肢の脱力が起こり、続いて約４０日齢で消耗および死亡する。この時点で、ヒトの疾患に類似した病理組織学的欠陥（例えば、脱髄および炎症性変化）がＣＮＳおよびＰＮＳに見られる。
マウスは出生後日数（ＰＮＤ）１０で処置したが、これは、この年齢において、それらが標的臨床集団において乳児疾患にさらによく類似するからである。さらに、この戦略により、２×１０１１粒子単位の総用量について、より多い量のウイルス粒子を投与する。放射線照射による骨髄アブレーションの代わりに、ＢＭＴの１日前およびＡＡＶｒｈ．１０−ｍＧＡＬＣ注射の２日前に、ＰＮＤ９においてブスルファン（３０ｍｇ／ｋｇ）による骨髄アブレーションを使用した。
以前の研究は、ＰＮＤ１０でこのベクター単独（ＢＭＴなし）の静脈内注射で処置したｔｗｉｔｃｈｅｒマウスは平均６５〜７５日（未処置マウスの約４０日と比較して）生存し、ＢＭＴ単独（遺伝子治療なし）で処置したマウスは、一部はより長く生存するが、平均６５〜７５日生存することを実証した。
１６匹のマウスを、ＰＮＤ９においてブスルファンを使用して骨髄抑制した後、１日後に骨髄移植（ＢＭＴ）し、次いで２４時間後にＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣの単回静脈内注射をした。それらは異なる時期に移植したので（罹患マウスの入手可能性のため）、この時点でのそれらの年齢は異なる。無関係な原因で非常に若くして死んだ１匹のマウスを除いて、残りは経過良好であり、一部は３００日齢を過ぎて生存していた（図２）。それらは、３００日齢を超えるまで、体重を維持し、体力やバランスを含む正常な行動を示している。
この併用療法で処置した４匹のマウスからの組織を検査した。ＧＡＬＣ酵素活性は、脳、小脳、および脊髄において正常であり、坐骨神経において正常より高かった。肝臓、心臓、筋肉において非常に高いＧＡＬＣ活性が測定された。併用療法の後、全ての神経組織においてミエリン形成の大幅な改善が見られた。坐骨神経は他の処置方法によって修正されないので、この組織における正常なミエリン形成は最も劇的な発見である（図３）。全ての神経組織におけるアストログリオーシスははるかに少なく、ＣＤ６８陽性細胞（活性化マクロファージ）についての染色は、一部のＣＤ６８陽性細胞が見られた脊髄を除く全ての神経組織において正常へと減少した。このデータは、ＢＭＴとそれに続くＡＡＶｒｈ．１０−ｍＧＡＬＣの単回静脈内注射が、いずれかの処置単独よりも良好な転帰をもたらすことを示している。ＡＡＶｒｈ．１０が、脳、小脳、脊髄、および坐骨神経に十分なＧＡＬＣ活性を供給し、ＢＭＴがこの疾患に見られる炎症を制御するのを助けると考えられる。
したがって、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）直後のＡＡＶｒｈ．１０−ｍＧＡＬＣの静脈内注入は、ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスにおいて疾患進行を急速に停止させた。この併用処置は、いずれかの処置単独よりも良好な転帰をもたらした。ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣは脳、脊髄、および末梢神経にＧＡＬＣ活性を急速に供給し、ＨＳＣＴはクラッベ病に見られる炎症を制御する。
（実施例２）
投与のタイミング
この実施例は、ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスにおいて３つの時点：出生後日数（ＰＮＤ）１１、１５、および２０で、ＨＳＣＴ後に注入された静脈内ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣの有効性を比較するために使用され得る方法を記載する。
以前の研究では、マウスにＨＳＣＴの１日後および化学療法の２日後にＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣを与えた。しかしながら、これほどＨＳＣＴに近い時点でのＡＡＶｒｈ．１０注入はヒトにおいて行われていない。したがって、ドナー細胞のホーミングおよび再増殖が起こっているはずである数日後（移植後約１４日）にＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣを投与した場合に同様の効果が達成できるかどうか決定する。同系移植マウスにおける完全な造血再増殖は、ＨＳＣＴ後１０日以内に起こり（Sadelainら、J. Immunol.１４４巻：１７２９〜３６頁、１９９０年）、したがって、ＨＳＣＴの有効性は、ＰＮＤ１１、１５、および２０でのＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣの静脈内注入が後に続く、ＰＮＤ１０で実施される。
無作為に４つの群に割り当てられた４６匹のマウスに、３０ｍｇ／ｋｇのブスルファンの腹腔内注射の１日後に、ＰＮＤ１０で同系ＨＳＣＴを与える。３〜５×１０７細胞を０．２ｍｌの滅菌無血清ＤＭＥＭに懸濁し、次いで、ＩＰ投与する。４群のうちの３群（各群ｎ＝１０）に、ＨＳＣＴ後１、５、または１０日目（ＰＮＤ１１、１５、２０）で、ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣの一用量を与える。ＨＳＣＴのみで処置された第４の群（ｎ＝１６マウス）は、対照としての役割を果たす。主要評価項目は、１５０日目までの生存期間ならびにＰＮＤ６０およびＰＮＤ９０での体重である（生存マウスの全体的な健康状態を評価するため）。屠殺したマウスから、脳組織（皮質、小脳、脳幹）、肝臓、心臓、骨格筋、脾臓、および坐骨神経を収集し、酵素活性アッセイおよび免疫組織化学によって評価するときのＧＡＬＣ分布を比較する。
（実施例３）
ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣの投薬
この実施例は、長期生存のためのｔｗｉｔｃｈｅｒマウスにおけるＨＳＣＴ後の静脈内ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣの最小の投薬を確立するために使用され得る方法を記載する。
ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣの最小有効用量（すなわち、統計的に有意な生存率の改善をもたらす最小用量）を決定する。４×１０１３ゲノムコピー（ｇｃ）／ｋｇの静脈内ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣ用量が、検査した最大用量である。最小用量は２桁低く、４×１０１１ｇｃ／ｋｇであり、これもまたヒト対象によく適応する。中間用量は４×１０１２ｇｃ／ｋｇであり、これは、ヒト新生児に対する約２×１０１３ｇｃの総用量に対応する。ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスにおける最大試験用量が他の用量よりも長い生存期間をもたらす場合、より高い用量を試験することができる。
実施例２と同様に、４群のマウスに、３０ｍｇ／ｋｇのブスルファンの腹腔内注射の１日後に、ＰＮＤ１０で同系ＨＳＣＴを与える。実施例２で決定した最適な日に、４群のうち３群（各群ｎ＝１０）を、４×１０１３、４×１０１２、または４×１０１１ｇｃ／ｋｇの一用量のＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣで静脈内処置する。ＨＳＣＴのみで処置した第４の群（ｎ＝１６マウス）は、対照としての役割を果たす。主要評価項目は、１５０日目までの生存期間ならびにＰＮＤ６０およびＰＮＤ９０での体重である。
（実施例４）
イヌにおけるクラッベ病の処置
この実施例は、マウスにおいて確立された最適なタイミングおよび最小有効用量を使用して、免疫アブレーション化学療法、ＨＳＣＴ、およびＨＳＣＴ後の静脈内ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣ注入を使用してクラッベ病のイヌモデルを処置するために使用し得る方法を記載する。
ＧＡＬＣ突然変異に関してヘテロ接合性のイヌは、ペンシルバニア大学の獣医学部で樹立された。放射線照射は、クラッベ病のイヌにおける免疫アブレーション法として伝統的に使用されてきたが、この方法は、現在ヒトで使用されているコンディショニングレジメンを反映していない。化学療法に基づく方法はイヌで試験されていたが、これはクラッベ病のイヌにおけるＨＳＣＴ前の化学療法に基づくコンディショニングを検査する最初のものとなる。
イヌのために開発されたがこれまでにクラッベ病のイヌで試験されていない化学療法に基づくレジメンを使用して、２匹のイヌが移植される。（ヒトでの処置を模倣するために）イヌにシクロスポリンを３０日間与え、次いでブスルファンレジメンの開始前に２週間、約３０ｍｇ／ｋｇ／日で経口ヒドロキシ尿素を与える。ＨＳＣＴ前の−３および−２日に、イヌに、５ｍｇ／ｋｇ／日のブスルファン（９ｍＬの生理食塩水に希釈した１ｍＬのブスルファン）を１時間にわたってシリンジポンプによる静脈内投与で与える。主要評価項目は、通常の血球数で２４週間を超えた生存期間であり、この場合、放射線照射なしの移植が成功したとみなされる。２４週間生存している全てのイヌを、病理組織学的研究のために屠殺する。
イヌを無作為に次の群の１つに割り当てる：未処置（ｎ＝２）、ＨＳＣＴのみ（ｎ＝３）、またはＨＳＣＴ＋ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣ（ｎ＝３）。ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣ処置の用量およびタイミングは、マウスにおける結果（実施例２および３）に基づく。処置イヌ対未処置イヌの転帰を１２週間目に比較し、処置群の転帰（ＨＳＣＴのみ対ＨＳＣＴ＋ＡＡＶｒｈ．１０−ＧＡＬＣ）を２４週間目に比較する。
主要評価項目には、拡散テンソルイメージングおよび異方性比率測定を使用する神経伝導速度ならびに脳のＭＲＩの結果が含まれる。調査転帰は、運動失調症および振戦の発症を含む。移植後の生存を検査するが、２４週で依然として生存している全てのイヌは、病理組織学的研究ならびに酵素活性アッセイおよび免疫組織化学によるＧＡＬＣ分布の評価のために、脳組織（皮質、小脳、脳幹）、頸髄、末梢神経（感覚、運動、自律神経）、肝臓、腎臓、心臓、大腿四頭筋、性腺、脾臓、小腸および大腸、副腎、ならびに皮膚を収集するために屠殺する。
（実施例５）
ラットにおけるクラッベ病の処置
この実施例は、ラットで実施される毒性研究を記載する。静脈内ＡＡＶをＵＣＢＴの１日後に免疫アブレーションラットに送達する。新しい免疫系は正常なＧＡＬＣ酵素を有し、したがって、ナイーブな患者のようにはＧＡＬＣ酵素に反応しないはずである。
毒性研究はＦｉｓｃｈｅｒ４３３ラットで実施する。骨髄ドナーとしてＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの使用により、ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスで使用されている自家ＢＭＴ（実施例１を参照）とは対照的に、真のアロジェニックＢＭＴが得られる。小げっ歯類を使用することにより、群あたり各性別のｎ＝５が可能になり、マウスと比較してこのラットのより大きいサイズにより、屠殺時に１匹の動物からの、全血球算定および血清化学試験に十分な血液の収集がより容易になる。離乳ラット（２１日齢）を、免疫抑制、ＢＭＴ、およびＡＡＶ投与のための広範な取り扱いの必要性のために使用する。
処置群の概要を表２に示す。ヒトまたはラットを対象としたＡＡＶｒｈ．１０−ｈＧＡＬＣベクターを使用する。ヒトＧＡＬＣ遺伝子をラット（それらは免疫抑制されるが）で使用するため、免疫原性の可能性がある。凝集を最小限にし、血液脳関門の浸透を最大限にするために、ベクターを、ヒトを対象とした５％ソルビトールを含む３８０ｍＭのＰＢＳ中に製剤化する。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含むＢＭＴ単独に起因する合併症の可能性が存在する。したがって、陰性対照群およびＡＡＶｒｈ．１０−ｈＧＡＬＣの代わりにＢＭＴ＋ビヒクルで処置した群を検査する。さらに、静脈内ＡＡＶの有害効果はＢＭＴによって増強され得、したがって、ＡＡＶ単独を与えている群を検査する。
使用するベクターのロット出荷基準を表３に示す。全てのベクターはアリコートで−６０℃以下において保存し、使用する日に解凍する。
静脈内注射による４×１０１３ｇｃ／ｋｇのＡＡＶｒｈ．１０−ｍＧＡＬＣの標的用量を使用する。ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスに２×１０１１ｇｃを与えたが、これは約４×１０１３ｇｃ／ｋｇ体重に相当する。クラッベ病と新たに診断された５ｋｇの乳児の場合、これは合計２×１０１４ｇｃに解釈される。
４×１０１３ｇｃ／ｋｇの標的ヒト用量に基づいて、ラットをＡ）標的用量；Ｂ）０．１×標的用量、およびＣ）達成可能な最大用量で評価する。注射量が２００μｌであり、高純度のベクターを２×１０１３ｇｃ／ｍｌで提供することができ、ラットが４０ｇである場合には、達成可能な最大用量は２×１０１４ｇｃ／ｋｇである。
ラットは、７、３０、および１８０日目で屠殺する。注入の７日後に、ＡＡＶｒｈ．１０−ｈＧＡＬＣの注入に起因する任意の能動的な感染が明らかになり得；３０日目で免疫系は完全に再構成され、任意の抗ＡＡＶまたは抗導入遺伝子の反応が明らかになり；１８０日目で、長期的な効果が明らかになる。このより長い時点は、新生マウスへのＡＡＶの静脈内注射後の肝癌の可能性に関連する。
（実施例６）
ヒトにおけるクラッベ病の処置
この実施例は、乳児クラッベ病の乳児における静脈内遺伝子治療（ＡＡＶｒｈ．１０−ｈＧＡＬＣ）と無関係のＵＣＢＴとの併用処置の安全性および臨床転帰を評価するための非盲検第Ｉ／ＩＩａ相研究を記載する。疾患関連の転帰パラメーターには、一連の標準化された神経発達試験（認知および運動技能を含む）、脳ＭＲＩ、神経伝導研究、および腰椎穿刺の結果が含まれ、これらはベースライン、処置の１００日後、およびその後の３ヶ月毎での全部で５回の来院で実施される。この期間は赤ん坊における急速な脳成長の時期を表すので、この間隔は必要である。正式な研究期間終了後、少なくとも５年間は年１回の経過観察が実施される。
サンプルサイズ（８人の患者）は、疾患の希少性に基づいて、ロジステックおよび実際上の考慮事項に従って選択された。サンプルサイズは小さいが、これは希少な疾患に典型的である。幸いなことに、臨床的に関心のある効果の大きさは、対象間のばらつきと比較して大きい。早期に診断されたクラッベ病患者の処置に関する以前の研究は、集団の効果の大きさの標準偏差が１．５〜２．０であることを示唆する。１群あたり４人の対象は少ないサンプルであるが、研究はクラッベ病群と典型的な発達を示す対照小児との間の１．２５の標準偏差の差を検出するための優れた能力（８０％）を有する。成功した処置と自然な疾患進行との間には、１．２５を超える標準偏差の差が予想される。しかしながら、対象間のばらつきをより正確に推定するために、この研究では長期的なデータを収集し、それをブートストラップ分析で分析する。
８人の患者を、２つの用量のコホートに分割する（表４）。４人の患者が最低のベクター用量でＡＡＶｒｈ．１０−ｈＧＡＬＣ／ＵＣＢＴを受け、その後、より高用量のコホート中の４人のさらなる患者が受ける。最初の群には、標準的な強度減少コンディショニング化学療法レジメンおよび無関係のＵＣＢＴを与える（下記のとおり）。ＵＣＢＴの翌日に、適格な赤ん坊に、ヒトＧＡＬＣ ｃＤＮＡを発現するＡＡＶｒｈ．１０の１回静脈内注射を与え、彼らが輸血非依存性になり、生着され、安定とみなされるまで病院に留まる。ＡＡＶｒｈ．１０−ｈＧＡＬＣを受けていない患者に基づいて、これは少なくとも４週間かかり、したがって、ベクター関連の有害事象の最も可能性が高いとき、遺伝子導入直後の期間中に、移植単位で対象を毎日モニタリングする。約３０〜６０日目に、患者を退院させ、その後週に１回追跡する。その後３ヶ月の間隔で、対象を総合評価に供する（表５）。群Ａの最初の対象は、その後の対象を登録する前に３ヶ月間追跡する。
重度の免疫抑制対象における静脈内ＡＡＶ媒介遺伝子治療の使用についての先例はなく、したがって、この第Ｉ／ＩＩａ相研究は主に安全性に焦点を当てる。結果として、研究は同時対照群なしで実施する。しかしながら、同一のパラメーターを用いる標準プロトコールを使用して前向きに評価された既知の乳児クラッベ病患者は、未処置の患者（ｎ＝７９）とＵＣＢＴで処置された患者（ｎ＝５４）の両方において疾患の予想された経過を示す。これらの既存のデータは、転帰パラメーターにおける予想される時間依存的変化、およびそのような尺度の標準偏差を決定するのに十分である。これにより、併用療法で処置された患者における疾患進行の正式な統計的評価が可能になる。
性別、人種、民族に関係なく、８人の患者を登録する。選択基準は以下のとおりである：
１． ベースライン来院の後、乳児クラッベ病の確定診断、白血球におけるガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬＣ）活性が０．２０ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇタンパク質未満、および２つの病原性ＧＡＬＣ突然変異。
２． スクリーニング時の年齢：１日〜１２ヶ月。
３． ニューロイメージング、神経伝導研究、または聴覚脳幹誘発電位の異常
４． 無関係のＵＣＢＴに適している。
５． 臨床プロトコールに従うことができる親および／または法定後見人。
除外基準は以下のとおりである：
１． 以前のＨＳＣＴの履歴。
２． 臨床的に重要な既知の心血管疾患、肝疾患、肺疾患、腎疾患、または他の病状の存在。
３． 主要な先天異常の存在。
４． 能動的なサイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヘルペスウイルス、もしくはアデノウイルスの能動的な感染の徴候、または病歴を含む、スクリーニングでの異常な血液試験。
５． ＰＩの見解による、研究への参加が不可能になる任意の他の病状、重篤な併発する病気、または酌量すべき状況。
６． 研究登録前３０日以内の任意の治験薬の使用または臨床的検討を含む別の研究に現在登録されていること。
７． 患者の親および／または法定後見人が、研究の性質、範囲、および起こり得る結果を理解することができない。
８． ＰＩによって決定されるとき、患者が、プロトコールに従うことができない（すなわち、経過観察評価に戻ることができない、またはそうでなければ試験を完了することができない）。
免疫抑制および臍帯血移植
６人のＨＬＡ適合ドナーのうちの４〜６人からの臍帯血移植は、症状がでる前のまたは最低限の症状のあるクラッベ病の標準治療と考えられている。患者は、移植に関連した罹患率および死亡率を減少させる、毒性が低減されたコンディショニングレジメンを受ける。この化学療法レジメンのバックボーンは骨髄アブレーションの用量のブスルファンであり、これはクラッベ病および他の多くの非悪性障害のための標準治療として使用されている。さらに、ブスルファンは、ほとんどの遺伝子治療治験で選択されている化学療法剤である。患者は、ＧＶＨＤ予防のためのタクロリムスおよびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）とともに、アレムツズマブ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ヒドロキシ尿素（３０ｍｇ／ｋｇ／日）、フルダラビン（１ｍｇ／ｋｇ／日×４日）、ブスルファン（約４ｍｇ／ｋｇ／日×３日）を受ける。
ブスルファンを、治療薬モニタリングおよび用量調整を伴って、約１２ｍｇ／ｋｇで３日間かけて投与し、標的の定常状態濃度８５０ｍｇ／ｄｌを達成する。より低いブスルファン曝露は、特に臍帯血移植片では移植片不全をもたらす可能性があり、注入されたＣＤ３４＋前駆細胞用量および総有核細胞用量は骨髄移植片より約１ｌｏｇ低い。
患者に免疫抑制薬を与え、これには移植の２日前に開始する静脈内タクロリムス（約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日で開始）および静脈内ＭＭＦが含まれる。本発明者らの標準的なレジメンとして、ＭＭＦ（４５ｍｇ／ｋｇ／日で開始し、３つの用量に分ける）は、最初の２８日間与え、次いでグレード２〜４のＧＶＨＤの非存在下で急速に減少させる。許容される場合、経口投薬への変換を３〜４週間後に行う。タクロリムス（またはその代替のシクロスポリンＡ）を、移植後最初の３〜４ヶ月間継続し、次いでＧＶＨＤの非存在下で患者に２〜３ヶ月間にわたってこれを停止する。免疫抑制療法の安全性モニタリングには、最初の３〜４週間は毎日、その後は、タクロリムスが中止されるまで臨床的に必要であれば実施される血液試験が含まれる。安全性血液試験には：全血球算定／白血球百分率検査／網状赤血球、総合代謝パネル、およびタクロリムスレベルが含まれる。患者は、標準的な移植プロトコールに従って有害事象についてモニタリングされ続ける。
移植後に、以下を評価する：
１． ＣＢＣ−０日目から好中球生着まで週３回、次いで２８日目まで週２回、そして１２週目まで週１回。網状赤血球算定は、ＣＢＣとともに週１回実施される。
２． 基本的な代謝パネルおよび肝機能検査−２８日目まで週２回、次いで１２週目まで週１回。
３． アデノウイルス−アレムツズマブ投与後＋５０日目または移植後退院のいずれか早いほうまで週２回の血液ＰＣＲ、次いで１００日目まで週１回。
４． ＣＭＶ：以前にウイルスに曝露していないもの−１００日目まで週１回の血液ＰＣＲ；ＣＭＶ曝露の疑いがある／証明されたもの：アレムツズマブ投与後＋５０日目または移植後退院のいずれか早いほうまで週２回の血液ＰＣＲ、次いで１００日目まで週１回。
５． ＥＢＶ ＰＣＲ−アレムツズマブ投与後１００日目まで２週に１回。
６． ＧＶＨＤ等級化−１００日目まで週１回
さらなる詳細を表６に提示する。
静脈アクセス−長期の中心静脈アクセスは、水分補給、化学療法、完全非経口栄養法、血液製剤の輸血、抗生物質、血液検査採血などのために全ての患者に必要となる。２つのダブルルーメンカテーテル（例えば、Ｂｒｏｖｉａｃ）が好ましいが、トリプルルーメンカテーテルが許容され得る。
輸血依存性貧血患者：
輸血−サラセミア患者に対しては１２ｇ／ｄＬを超える目標ヘモグロビン、および鎌状赤血球症患者に対しては９〜１２ｇ／ｄＬの目標に、移植前の最低４週間、患者に輸血する。
キレート化−慢性的に輸血療法を受けていて、鉄過剰（１０００ｎｇ／ｍＬを超えるフェリチン）の証拠がある患者は、移植前の最低４週間、デスフェラール ２０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日のＳＣまたは夜間１２時間にわたるＩＶ持続注入または経口デフェラシロクス（Ｅｘｊａｄｅ）のいずれかでキレート化を受ける。
移植準備レジメン
ヒドロキシ尿素は、最も近い丸剤サイズに丸めて、３０ｍｇ／ｋｇの単回１日用量で経口で与える。５ｍｃｇ／ｋｇ（最大３００ｍｃｇ）のＰＲＮ Ｇ−ＣＳＦの使用は、７５０細胞未満のＡＮＣに推奨される。Ｇ−ＣＳＦの使用にもかかわらず、ＡＮＣが５００細胞／μＬ未満に低下する場合、ヒドロキシ尿素が保持される。
アレムツズマブは現在の施設のガイドラインに従ってＩＶで与える。アレムツズマブの単回用量は、−１０日目または−９日目に０．５ｍｇ／ｋｇ／用量で与える。施設のガイドラインに従って適切な前投薬を与える。患者がアレムツズマブ注入中または注入後に３８．５℃を超える熱を有する場合、血液培養物を抜き取り、抗生物質の適用範囲を追加する。
フルダラビンは、−９〜−５日目に、毎日１時間×５の用量にわたって３０ｍｇ／ｍ２／用量（または１ｍｇ／ｋｇ／用量のいずれか低いほう）の用量でＩＶで与える。
薬物の投与
調整理想体重（ＡＩＢＷ）を、理想体重（ＩＢＷ）の１２５％を超える体重の肥満患者に使用する。キログラム単位のＩＢＷ計算（ＣＨＰ小児薬物療法ハンドブックより）小児（１〜２歳）：６０インチ未満：ＩＢＷ＝（身長２［ｃｍ単位］×１．６５）／１０００；６０インチ超：男性：ＩＢＷ＝３９＋（２．２７×５フィートを超えるインチ単位の身長）、女性：ＩＢＷ＝４２．２＋（２．２７×５フィートを超えるインチ単位の身長）。実際の体重（ＡＢＷ）からの調整ＩＢＷ（ＡＩＢＷ）の計算：ＡＩＢＷ＝ＩＢＷ＋［（０．２５）×（ＡＢＷ−ＩＢＷ）］
臍帯血の選択と注入
利用可能な最善のユニットは、ＨＬＡ（対立遺伝子レベルＨＬＡ−ＤＲＢ１タイピングによる６つのうち最低４つのＨＬＡの一致）、総有核細胞用量（最低３．０×１０７／ｋｇ ＡＩＢＷ）、ＣＤ３４＋前駆体用量（最低１．５×１０５／ｋｇ ＡＩＢＷ）、および効力に影響を与える他の要素（遺伝性酵素欠損症患者の酵素活性など）に基づいて選択する。ＵＣＢユニットは解凍し、希釈してまたは希釈せずに注入する。解凍した臍帯血または生きている無関係のドナー骨髄移植片の５％以下を０日目に再凍結し、後日注入する。移植片対宿主病のリスクを減らすために、全ての製品を放射線照射する。さらに、全ての製品はＣＭＶについて安全であり（ＣＭＶを含有し得る白血球は除去されている）、濾過して赤血球および白血球を枯渇させ、ＨＬＡ抗体形成の発生率を低下させる。患者は赤血球および血小板の輸血を受ける。
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、５ｍｃｇ／ｋｇ／用量の、１日１回のＩＶまたはＳＣを＋１日目に開始し、ＡＮＣが２，０００以上になるまで続ける。その後、Ｇ−ＣＳＦの用量調整中止を個々の患者の状態に基づいて決定する。完全非経口栄養法（ＴＰＮ）およびイントラリピッドによる静脈内栄養補給は、経口摂取が大幅に減少した場合開始し、経口摂取が改善したら、医師の判断で漸減／中止する。肝機能、タンパク質／アルブミン、およびトリグリセリドレベルは、ＩＶ栄養補給中、注意深くモニタリングする。
ＧＶＨＤ
予防のために、患者はＧＶＨＤ予防のためのタクロリムスおよびミコフェノール酸（ＭＭＦ／ｃｅｌｌｃｅｐｔ）を受ける。ＩＶタクロリムスの持続注入またはＱ１２ｈ投薬を−２日目に開始し、患者がＰＯ摂取を許容したら経口に変換することができる。ＬＣ／ＭＳ法を用いて１２〜１５ｎｇ／ｍｌの定常状態レベルを目標として、持続注入時のタクロリムスレベルを週に少なくとも３回モニタリングする。Ｑ１２ｈの断続的投薬の場合、レベルを通して標的は、８〜１０ｎｇ／ｍｌの間である。ミコフェノール酸（１５ｍｇ／ｋｇ／用量）を、−２日目から開始して２８日目まで２時間かけて８時間毎にＩＶで与え、グレード２〜４の急性ＧＶＨＤの非存在下で、次の週にかけて停止する。毒性、または能動的なウイルス感染および／もしくはリンパ球回復の遅延が懸念される場合、ＭＭＦの早期停止またはタクロリムスのより低い標的範囲となる場合がある。
急性ＧＶＨＤの診断および処置は、現在のＢＭＴ ＣＴＮガイドラインを反映した現在の施設のガイドラインに基づく。慢性ＧＶＨＤの診断は、臨床的および／または病理組織学的データならびに現在の標準的な診断基準に基づく。
感染
コンディショニングの前に、全ての患者はいかなる皮膚または粘膜感染も受けていない必要がある。禁忌でない限り、脳、副鼻腔、胸部、腹部、および骨盤のＣＴスキャンを、潜伏感染をスクリーニングするために移植前に行い、禁忌である場合には、代替的なイメージングを実施する。全ての患者はグルコン酸クロルヘキシジン浴（ｈｉｂｉｃｌｅｎｓ）を受ける。特に麻酔薬を服用している場合は、患者の便秘をモニタリングし、示されるように糞便軟化剤を開始する。全ての患者は、ＨＥＰＡ濾過を有する個室に収容する。
患者は（スルファ薬にアレルギーがない限り）、スルファメトキサゾール−トリメトプリム（バクトリム）によるＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ（ｃａｒｉｎｉｉ）ｊｉｒｏｖｅｃｉ肺炎（ＰＣＰ）予防薬を受け、これはコンディショニング中に開始する。臨床的に禁忌でない限り、ペンタミジンまたは適切な代替物は、免疫再構成が起こるまで（全身ステロイドの非存在下で３００細胞／ｍｍ３を超えるＣＤ４＋Ｔ細胞）＋２８日目に開始する。ペンタミジンは経口バクトリムまたは代替経口ＰＣＰ予防薬に変更することができる。
感染もしくは曝露および／または水痘感染の病歴に起因する陽性のＨＳＶおよび／またはＶＺＶ血清学を有する患者は、アシクロビルＩＶを受ける。ＰＯ摂取を許容する場合、アシクロビルは経口に変更することができる。患者がガンシクロビル、ホスカルネット、またはシドフォビルを受けている場合、併用アプローチが適切でない限りアシクロビルも与える必要はない。全身性ステロイドおよび臨床的に有意なレベルの他の全身性免疫抑制剤の非存在下で、ＣＤ４＋Ｔ細胞が２５０細胞／ｍｍ３を超えるまで予防薬を継続する。これらの薬物の有害効果によって中止が正当なものとならない限り、予防薬が移植後６ヶ月の前に中止されることは予期されていない。
ＨＳＶ／ＶＺＶ予防薬は、例えば、陰性のＨＳＶ／ＶＺＶのＰＣＲを伴うＩＶＩＧの使用に起因する陽性の血清学的検査、陰性のＨＳＶ／ＶＺＶのＰＣＲを伴う、６ヶ月未満の患者における母性ＩｇＧの移入に起因する陽性の血清学的検査、または免疫化に起因する陽性の血清学的検査など、以前のＨＳＶ／ＶＺＶ感染または曝露の臨床的証拠がないことを条件として、以下の患者には必要とされない。
登録時にＨＳＶ／ＶＺＶウイルス血症であるか、または移植前にウイルス血症を発症している患者を処置することができる。
唾液、尿、または他の部位にＣＭＶの陽性の血清学的検査または検出可能なウイルスを有するが検出可能なウイルス血症を有さない患者は、コンディショニング中の−１２日目から−２日目までの維持投薬時（典型的に毎日５ｍｇ／ｋｇをＩＶ）にガンシクロビルまたは他のＣＭＶ特異的療法を、その後、＋１日目に開始して＋１００日目まで、８時間毎に腎不全のための用量調整を伴うアシクロビルの５００ｍｇ／ｍ２をＩＶで受ける。毎日のホスカルネット（９０ｍｇ／ｋｇ／日）で代用することができる。移植前ＣＭＶウイルス血症の患者は、臍帯血注入前および注入中に適切な抗ＣＭＶ療法を受けることができる。ＣＭＶ予防薬は、例えば、陰性のＣＭＶのＰＣＲを伴う、ＩＶＩＧの使用に起因する陽性の血清学的検査、または陰性の、ＣＭＶの血液ＰＣＲもしくは他の唾液もしくは尿で実施される診断研究を伴う、６ヶ月未満の患者における母性ＩｇＧの移入に起因する陽性の血清学的検査など、以前のＣＭＶ感染または曝露の臨床的証拠がないことを条件として、以下の患者には必要とされない。
患者は、臨床的に適切な用量およびスケジュールで＋１日目から真菌予防薬を受ける。予防薬は、最初にカスポファンギンを含み、続いて退院して外来患者となる前に、治療レベルを目標に設定したボリコナゾールに移行する。
患者は、以下のスケジュールに従って一般的な免疫予防薬としてＩＶＩＧを受ける：
−１５日目から移植後＋５５日目：２週間毎
移植後＋５５日目以降：血清ＩｇＧレベルを２〜３週間に１回モニタリングし、ＩｇＧが７５０ｍｇ／ｄＬを超えるように保持するためにＩＶＩＧを補給する。ＩｇＧ補給は、ＩｇＡレベルが正常になり、ＣＤ４ Ｔ細胞計数が２００／μＬを超えるまで続ける。
患者は、臨床的に適切な用量のレボフロキサシンまたは適切な代替物による細菌の予防を受け、スケジュールは医師の裁量で開始しそして生着まで継続する。これは好中球減少症熱の状況で広域抗生物質の開始時に維持される。
患者は、アレムツズマブの後に開始して、ＣＭＶのＰＣＲで毎週モニタリングし、臨床的に必要であるときにはさらにモニタリングする。処置は、任意の値および／または記録されたＣＭＶ疾患の確認された陽性定量的ＰＣＲを有する患者において開始する。第一選択療法は、ガンシクロビル５ｍｇ／ｋｇ／用量をＩＶで１２時間毎に１４日間、またはＣＭＶのＰＣＲが陰性もしくは許容可能なレベルに低下するまで、あるいは患者の臨床症状が回復するまでのいずれか長いほうからなる。維持療法は、患者が顕著に免疫抑制されたままである場合、１４日間またはそれよりも長い毎日のガンシクロビル５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶからなる。ガンシクロビル耐性および第二選択療法は、１０〜１４日後に臨床的改善がない患者、またはＰＣＲ力価が高いままであるかもしくは増加している場合に考慮されるべきである。骨髄抑制および腎機能障害の副作用について患者を注意深くモニタリングする必要がある。ホスカルネットまたはシドフォビルは、生着の前に、または臨床的に必要とされる場合に使用され得る。
新たな発熱（３８．５℃以上×１または３８℃以上×２（２時間以内に検温）と定義される）を有する患者は、徹底的な身体検査および全ての中央カテーテルポートから得られた血液培養を受けるべきである。追加の試験は臨床的に必要とされる場合であるが、胸部Ｘ線または他のイメージング研究、尿培養、咽頭または口腔培養、ウイルス研究（鼻咽頭スワブ）、および分子研究（ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫウイルスなど）を含み得る。血液培養は、継続的な発熱を伴うときに２４時間毎に、臨床的変化があればより頻繁に、繰り返さす。経験的な広域抗生物質は、培養物が得られた直後に開始する。第一選択の抗生物質は、ピペラシリン−タゾバクタム７５ｍｇ／ｋｇ／用量（ピペラシリンとして、３０００ｍｇ最大用量）のＩＶで６時間毎、およびバンコマイシン１５ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＶで６〜８時間毎を含む。バンコマイシントラフレベルは、８〜１２ｍｇ／Ｌを目標として頻繁にモニタリングする。ペニシリンまたはバンコマイシンに対するアレルギーのある患者には、適切な代用を行うことができる。抗生物質は臨床応答および細菌性病原体の同定に基づいて調整する。経験的な抗真菌療法（カビを範囲に含む）は、３日を超えて熱があるままである患者に考慮される。抗生物質は、最低３日間、発熱が解消し、ＡＮＣが５００を超えるまで続ける。
ＶＯＤの予防と管理
患者は静脈閉塞性疾患（ＶＯＤ）の予防のために低用量ヘパリンを受ける。これは、−９日目から＋２８日目、または退院するまで、１００単位／ｋｇ／２４時間の持続注入として与える。ウルソジオールは、高ビリルビン血症、痛みを伴う肝腫大、腹水、体液貯留のある患者にＶＯＤが疑われる可能性があるので、ベースライン近くで投与する。一般的な処置措置には、注意深いモニタリングおよび体液不均衡の補正が含まれる。適切な用量のループ利尿薬は必要に応じてＱ６〜１２ｈ推奨されている。重度のＶＯＤはデフィブロチドで処置することができる。
生着の評価と移植片不全の管理：定義（IBMTR Manual forClinical Research Professionals、２００３年に従う）：好中球の生着 − 異なる日に試験された３日連続で０．５×１０３／μＬ以上の好中球；血小板の生着 − 過去７日間の血小板輸血なしの２０，０００／μＬ以上の血小板数；ドナー細胞の生着 − ＋２８日目の５０％以上のドナー細胞；移植片不全 − 一次的不全は、最低１週間離れた２つの研究で、＋４２日目までに好中球の生着がないこと（上記のとおり）または、＋１００日目までに末梢血もしくは骨髄における１０％未満のドナー細胞として定義される。二次的不全は、生着が以前に（上記の基準に従って）達成された後の生着の喪失として定義される。
約＋４１〜４４日目までに好中球の生着の証拠がない患者では、キメリズムを評価するために骨髄穿刺および生検を実施する。移植片不全の一般的な評価には、キメリズム、細胞遺伝学などに対する骨髄穿刺および生検が含まれ；必要な場合、他の研究に加えてＣＭＶ、ＥＢＶ、パルボウイルス、およびＨＨＶ−６を含む微生物研究（骨髄および血液）；ならびにキメリズムのための末梢血が含まれる。
移植片不全／拒絶の初期の処置には、増殖因子によるサポートおよび骨髄抑制薬物治療の中止が含まれる。その後の移植は、ドナー生着の証拠がない、または血球減少症に関連した重大な影響を伴う患者で検討される。蓄えておいたドナーのＵＣＢアリコートの注入が適切であり得る。
ベクター投与
ＡＡＶｒｈ．１０−ｈＧＡＬＣ用量は、上記の動物での有効性および安全性研究の結果に依存する。マウスからヒトへのスケールアップは、体重１キログラムあたりの同一のゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）に基づく。ＵＣＢＴの１日後に最大用量約４×１０１３ｇｃ／ｋｇを与える。この標的用量の０．２５×で開始し、その後に標的用量が続く、それぞれｎ＝４の対象を有する２つの用量コホートを使用する。
臨床グレードのベクターは、ＧＭＰ準拠のクリーンルーム施設で製造され、表３に記載されているようにロット出荷試験を受ける。（例えば、ＧＡＬＣ酵素活性についてアッセイすることによって）ベクターが臨床研究の持続期間にわたって安定であることを確実にするためにベクターをモニタリングする。
ベクターは、ＵＣＢＴを管理するために存在する中心線を通じた緩衝化等張食塩水中の必要用量のプッシュ（１ｍｌ／分）として投与する。これは１０ｍｌの注入の可能性が高い。
経過観察
個々の患者の評価は表７に示されるように実施する。さらなる患者の評価は、ベースライン来院の後、約３、６、９、および１２ヶ月で実施する。
来院１−ベースライン評価（ＰＲＥ−ＵＣＢＴ）
以下のデータをベースライン時に全ての患者について収集する：
１． 患者のイニシャル、生年月日、および固有の患者ＩＤ番号。
２． 人口統計情報。
３． 以前の診断、病気、薬物治療、手順、および手術を含む重要な病歴。
４． 以前に実施された場合、以下の臨床調査の結果：脳ＭＲＩ、神経伝導研究、ならびにクラッベ病の診断のための遺伝学的および／または生化学的試験。ベースライン試験は、親／法定後見人が研究に参加するためのインフォームドコンセントに署名してから３ヶ月以内に実施される場合に有効である。
５． 以下の検査は、ベースライン来院時に実施する：脳ＭＲＩ、脊髄穿刺、神経伝導研究、ならびに視覚および聴覚検査。
６． 現在の全ての薬物治療および投与頻度のリスト。
７． バイタルサイン（血圧、脈拍、身長、体重、および頭囲）を含む身体および神経学的検査。
８． 任意の他の家族がクラッベ病と診断されたのか、または疾患の臨床的な徴候および症状がある（しかし、診断されていない）のかを確認するために、親および／または法定後見人に患者の家族歴（一等親近親者）について質問する。
９． Ｍｕｌｌｅｎ早期学習スケールおよびＰｅａｂｏｄｙ運動発達スケールの結果。
１０． タンパク質および白血球数ならびにＧＡＬＣ活性に関するベースライン脳脊髄液（ＣＳＦ）の収集。残りは将来のバイオマーカー評価のために保管される。
１１． 臨床化学のためのベースライン採血ならびに抗ＡＡＶ抗体およびＧＡＬＣ活性の測定。
１２． ＡＡＶｒｈ．１０およびＧＡＬＣに対するＴ細胞応答を測定するためのベースライン採血。
１３． ベクター排出分析（血液、糞便、尿、および唾液）のための試料のベースライン収集。
神経発達評価は１日目に実施する。医療／診断検査は２日目に実施する。
１日目 神経発達評価
１． 病歴および併発病の再調査
２． 現在の全ての薬物治療および投与頻度のリスト
３． 聴覚訓練士による聴力検査。
４． バイタルサイン（血圧、脈拍、身長、体重、および頭囲）を含む身体および神経学的検査
５． Ｍｕｌｌｅｎ早期学習スケールおよびＰｅａｂｏｄｙ運動発達スケールの適用
２日目 医療診断試験
１． 脳ＭＲＩ
２． 脊椎穿刺
３． 神経伝導速度研究
４． 採血
５． 尿、糞便、および唾液の収集
３日目 ＵＣＢＴの評価およびＵＣＢＴの準備。ベクターは、ＵＣＢＴに対して＋１日目に注射する。
ベクター投与後１、２、４、および８週目に、試料収集を以下のように実施する：
１． 臨床化学、抗ＡＡＶ中和抗体検出、ベクター排出分析、およびＧＡＬＣ活性のための採血
２． ベクター排出分析のための尿、便、および唾液の収集
来院２（ＵＣＢＴおよびＡＡＶｒｈ．１０−ｈＧＡＬＣ後９０±５日目）
来院は２日かけて実施され、以下を含む：
１日目 神経発達評価
１． 中間の病歴および併発病の再調査
２． 前回の来院以降の、現在の全ての薬物治療および投与頻度のリスト
３． 視力および聴覚検査（聴覚訓練士による）
４． バイタルサイン（血圧、脈拍、身長、体重、および頭囲）を含む身体および神経学的検査
５． Ｍｕｌｌｅｎ早期学習スケールおよびＰｅａｂｏｄｙ運動発達スケールの適用
２日目 医療診断試験
１． 脳ＭＲＩ
２． 脊椎穿刺
３． 神経伝導研究
４． 血液試料を使用する臨床化学アッセイ
５． ＥＬＩＳＰＯＴを使用した抗ＡＡＶおよび抗ＧＡＬＣのＴ細胞応答のための採血
来院３（１８０日±１ヶ月）
来院は２日かけて実施され、以下を含む：
１日目 神経発達評価
１． 中間の病歴および併発病の再調査
２． 前回の来院以降の、現在の全ての薬物治療および投与頻度のリスト
３． 視力および聴覚検査（聴覚訓練士による）
４． バイタルサイン（血圧、脈拍、身長、体重、および頭囲）を含む身体検査および神経学的検査
５． Ｍｕｌｌｅｎ早期学習スケールおよびＰｅａｂｏｄｙ運動発達スケールの適用
２日目 医療診断試験
１． 脳ＭＲＩ
２． 脊椎穿刺
３． 神経伝導研究
４． 血液試料を使用する臨床化学アッセイ
５． ＥＬＩＳＰＯＴによる抗ＡＡＶおよび抗ＧＡＬＣのＴ細胞応答のための採血
来院４（２７０日±１ヶ月）
この来院は２日かけて実施され、以下を含む：
１日目 神経発達評価
１． 中間の病歴および併発病の再調査
２． 前回の来院以降の、現在の全ての薬物治療および投与頻度のリスト
３． 視力および聴覚検査（聴覚訓練士による）
４． バイタルサイン（血圧、脈拍、身長、体重、および頭囲）を含む身体および神経学的検査
５． Ｍｕｌｌｅｎ早期学習スケールおよびＰｅａｂｏｄｙ運動発達スケールの適用
２日目 医療診断試験
１． 脳ＭＲＩ
２． 脊椎穿刺
３． 神経伝導研究
４． 血液試料を使用する臨床化学アッセイ
５． ＥＬＩＳＰＯＴによる抗ＡＡＶおよび抗ＧＡＬＣのＴ細胞応答のための採血
５．５．５ 来院５（３６０日±１ヶ月）
来院は２日かけて実施され、以下を含む：
１日目 神経発達評価
１． 中間の病歴および併発病の再調査
２． 前回の来院以降の、現在の全ての薬物治療および投与頻度のリスト
３． 視力および聴覚検査（聴覚訓練士による）
４． バイタルサイン（血圧、脈拍、身長、体重、および頭囲）を含む身体および神経学的検査
５． Ｍｕｌｌｅｎ早期学習スケールおよびＰｅａｂｏｄｙ運動発達スケールの適用
２日目 医療診断試験
１． 脳ＭＲＩ
２． 脊椎穿刺
３． 神経伝導研究
４． 血液試料を使用する臨床化学アッセイ
５． ＥＬＩＳＰＯＴによる抗ＡＡＶおよび抗ＧＡＬＣのＴ細胞応答のための採血
評価方法の詳細
身体および神経学的検査。完全な身体検査（全身外観、皮膚、頭、目、耳、鼻、咽頭、リンパ節、心臓、肺、腹部、四肢／関節、および臀部の評価を含む）は、ベースラインフェーズ中に１回、および表７に指定された時間に実施する。身長または長さ（ｃｍ、標準的な測定台に仰向け）、体重（ｋｇ、濡れている場合は靴またはおむつなしで、可能な限り最軽量の衣類を着用）、および頭囲（ｃｍ、標準後頭部）を測定する。これらを自然歴データと比較し、潜在的な有害効果と処置の有効性を評価する。
拡張された神経学的検査には、筋緊張および反射ならびに神経発達機能の評価が含まれる。
バイタルサイン。収縮期および拡張期血圧（ｍｍ Ｈｇ）と心拍数（拍／分）を測定する。
脳脊髄液バイオマーカー。症状がでる前のクラッベ病患者でＣＳＦタンパク質レベルの増加が検出され、腰椎穿刺を受けた２５人の小児のうち２３人（９２％）がＣＳＦタンパク質の上昇を示した（Escolarら、N Engl J Med.３５２巻（２０号）：２０６９〜８１頁、２００５年）。この例では、ミエリンの完全性のバイオマーカーを評価するためにＣＳＦを収集する。さらに、細胞計数、タンパク質決定、グルコース、アルブミン、およびＩｇＧを含む慣例的なＣＳＦ分析を実施する。血液脳関門の無傷性は、ＣＳＦのＩｇＧ濃度と血清アルブミン濃度の関係を評価することによって決定する。アルブミン指数（ＡＱ）は、血液脳関門の透過性を評価するために推定することができる（ＡＱ＝ＣＳＦアルブミン／血清アルブミン×１００）。髄腔内ＩｇＧ産生は、ＣＳＦのＩｇＧ／血清アルブミン比を測定することによって計算し、これは０．２７ｍｇ／ｄｌ未満であるべきである。ＩｇＧ指数は、ＣＳＦのＩｇＧと血清アルブミンの積の血清ＩｇＧとＣＳＦアルブミンの積に対する比である。ＩｇＧ指数の増加（０．７０ｍｇ／ｄｌを超える）は、ＣＮＳにおける免疫グロブリン合成の増加を反映しており、ＣＮＳにおける感染性および炎症性障害を反映していると考えられる。ＣＳＦのＧＡＬＣ活性も評価する。
ベクター排出。ベクター投与後の血液、尿、糞便、および唾液中のベクターの存在は、ｑＰＣＲによって評価する。
安全性臨床検査。収集した血液に対する臨床化学アッセイを慣例的に実施し、あらゆる起こり得る有害効果をモニタリングする。肝臓酵素（アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ）は、ＧＡＬＣ過剰発現および／または細胞傷害性Ｔ細胞応答に起因する起こり得る肝臓毒性のためにモニタリングする。
免疫応答。ＡＡＶｒｈ．１０およびＧＡＬＣに対するＴ細胞応答を測定するために、ベースライン時および注射後３ヶ月毎に全血を収集する。注射後１、２、４、および８週目、ならびに３、６、９、および１２ヶ月目に、血漿または血清を分析してＡＡＶｒｈ．１０に対する抗体の生成をモニタリングする。
脳ＭＲＩ。各患者はＭＲＩ（すなわち、脳の拡散テンソルイメージング）を受ける。脳のＭＲＩは現在、クラッベ病患者におけるミエリン疾患を評価するための最良の代用構造マーカーをもたらす（Escolarら、Am J Neuroradiol.３０巻（５号）：１０１７〜２１頁、２００９年）。無関係のＵＣＢＴを受けたクラッベ病患者の疾患進行をモニタリングするために特別に開発された修正Ｌｏｅｓスコアリングシステムを使用して、対照小児とクラッベ病患者の両方の脳ＭＲＩを経験豊富な神経放射線医が視覚的にスコア化する（Provenzaleら、Ann N Y Acad Sci.１０６４巻：２２０〜９頁、２００５年、Provenzaleら、Am J Roentgenol.１９２巻（１号）：５９〜６５頁、２００９年）。近年、拡散テンソルイメージングは、発達中の脳の白質病理を検査し、脱髄状態の赤ん坊の軸索構造とミエリン形成の両方を評価するために選択すべきモダリティとなっている（Escolarら、Am J Neuroradiol.３０巻（５号）：１０１７〜２１頁、２００９年、Guptaら、Neuroimage Clin.２６巻；７号：７９２〜８頁、２０１４年）。トラクトグラフィーによる拡散テンソルイメージングを使用して、年齢および性別の対応する対照と比較するとき、ミエリン破壊を定量化し、標準偏差で測定することができる。
神経伝導速度研究（感覚および運動神経）。クラッベ病の赤ん坊は、疾患進行の初期に末梢神経障害を有し、そして神経伝導速度は、疾患が進行するにつれて悪化し（Escolarら、N Engl J Med.３５２巻（２０号）：２０６９〜８１頁、２００５年；Escolarら、Pediatrics、１１８巻（３号）：ｅ８７９〜８９頁、２００６年）、筋肉の衰弱をもたらす。クラッベ病の豊富な経験を有する神経生理学者がこの試験を実施する。
神経伝導速度（ＮＣＶ）、振幅（ＡＭＰ）、および遠位潜時（ＤＬ）の研究は、従来の技術によって実施する。運動神経について、ＮＣＶ、ＡＭＰ、およびＤＬを、正中神経および腓骨神経で測定する。これらの神経のいずれにおいても関連するシグナルがベースラインで生成され得ない場合、尺骨神経、脛骨神経、またはその両方もベースラインで評価される。腕の１つの神経および脚の１つの神経を、繰り返し評価のために利用可能な応答に基づいて選択する。感覚神経については、ＤＬ、ＮＣＶ、およびＡＭＰを、正中神経と腓腹神経で測定する。
神経発達機能。神経発達評価およびクラッベ病の長期的研究におけるそれらの使用は広く公表されている（Escolarら、N Engl J Med.３５２巻（２０号）：２０６９〜８１頁、２００５年；Escolarら、Pediatrics、１１８巻（３号）：ｅ８７９〜８９頁、２００６年；Escolarら、Lysosomal Storage Dis.６巻（３号）：７１〜９頁、２００６年；Martinら、Acta Paediatr Suppl.９７巻（４５７号）：６９〜７５頁、２００７年）。クラッベ病患者における認知、言語、および運動の発達の標準化された尺度と正常な対照のそれとを反映するように、特定の評価ツールを選択した。
成長速度。身長、体重、および頭囲を測定して成長速度を評価する。体格指数は、体重と身長に基づいて計算する。
Ｍｕｌｌｅｎ早期学習スケール。Ｍｕｌｌｅｎスケールは６８ヶ月齢までの乳児や小児に適用することができる。Ｔスコア、パーセンタイル順位、および年齢に応じたスコアは、４つのスケール（視覚受容、微細運動、表現言語、および受容言語）について別々に計算できる。幼児の非言語能力レベルの評価は、全体的な発達を推定するために重要である。乳児および小児の臨床評価の訓練を受けた精神測定医が試験を実施する。年齢に応じたスコアは、時間経過に伴う発達を追跡し、試験間で比較するために使用する。
Ｐｅａｂｏｄｙ運動発達スケール。Ｐｅａｂｏｄｙスケールは、いくつかの項目の定量的および定性的能力の両方を捉え、小児の疾患が進行するにつれて、または回復中に運動パターンの変化に対する感度を高める。図４は、上述のツールを使用して無関係のＵＣＢＴで処置された個々の患者の軌跡の例を示す（Escolarら、N Engl J Med.３５２巻（２０号）：２０６９〜８１頁、２００５年）。図４は、無関係の臍帯血を移植し、上述のツールを用いて試験した個々の患者の軌跡の例である。色付きの線は、無症候性または最低限の症候性の患者の発達を示す。黒色の線は重大な症状の後に移植された患者を表す。症候性の患者の軌跡は、未処置の患者の軌跡と類似する。
本開示の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮して、例示された実施形態は本発明の単なる例であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって規定される。したがって、本発明者らはこれらの特許請求の範囲の範囲および精神の範囲内に入る全てのものが本発明者らの発明であると主張する。

Claims (20)

  1. 対象においてクラッベ病を処置する方法であって、
    前記対象を免疫抑制すること、
    治療有効量の臍帯血を前記対象に投与すること、および
    ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）をコードする治療有効量の核酸分子を前記対象に投与すること
    を含む方法。
  2. ＧＡＬＣをコードする前記核酸分子が、配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記核酸分子が、配列番号２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を含むＧＡＬＣタンパク質をコードする、請求項１または２に記載の方法。
  4. ＧＡＬＣをコードする前記核酸分子が、プロモーターに作動可能に連結している、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. ＧＡＬＣをコードする前記核酸分子が静脈内に投与される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. ＧＡＬＣをコードする前記核酸分子がベクターの一部である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記アデノ随伴ベクターがＡＡＶセロタイプｒｈ．１０である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ウイルスベクターが、対象あたり少なくとも２×１０１３ｇｃ、または対象あたり少なくとも２×１０１４ｇｃの用量で投与される、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記臍帯血が、ＧＡＬＣをコードする前記核酸分子の前に投与される、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記臍帯血が、ＧＡＬＣをコードする前記核酸分子の１日前に投与される、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
  13. 前記臍帯血が前記対象にアロジェニックである、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
  14. 治療有効量の臍帯血の投与が、前記対象に少なくとも３×１０７／ｋｇの総有核細胞用量を投与することを含む、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記対象を免疫抑制することが、治療有効量のアレムツズマブ、ヒドロキシ尿素、フルダラビン、およびブスルファンを投与することを含む、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記対象を免疫抑制することが、治療有効量のタクロリムスおよびミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）を投与することをさらに含む、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記クラッベ病が乳児クラッベ病である、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
  18. 対象において遺伝性疾患を処置する方法であって、
    前記対象において骨髄を部分的にまたは完全にアブレーションすること、
    前記対象に治療有効量の造血幹細胞（ＨＳＣ）を投与すること、および
    前記対象に治療有効量の治療用核酸分子を投与すること
    を含み、前記核酸分子が前記遺伝性疾患を修正する、方法。
  19. 骨髄を部分的にまたは完全にアブレーションすることが、前記対象に治療量の化学療法、放射線照射、または両方を施すことを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＨＳＣの投与に続いて、前記対象に治療有効量の免疫抑制剤を投与することをさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
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