JP2020503847A - 対流駆動細胞内輸送のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
2017年11月8日に出願された本出願は、「分子および粒子の輸送のために細胞を圧縮して細胞内への小孔を開く隆起付微小流路(Ridged Microchannels for Compressing and Opening Pores Into cells for Molecular and Particle Delivery)」という名称の、2016年11月8日に出願された米国仮特許出願第62/419,041号に基づく優先権を主張するものであり、その内容および本質の全体が、以下に完全に記載されているかのように、参照により本明細書に援用される。
本発明は、全米科学財団によって授与された補助金番号DGE−1650044、およびNIHによって授与された補助金番号IR21CA191243−01A1のもと、政府の助成を受けて成されたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
方法
装置設計
微小流体装置の設計では、多くの細胞を素早く処理するために、単一の大きい流路内の傾斜した隆起の形態である狭窄部を用いた。大きい流路によって、狭窄部を通過する細胞の速度を流体力学的抵抗力によって維持しつつ、多数の細胞が各隆起の下を同時に通過する事が可能になり、多くの狭窄部の後でも、細胞の処理をすぐに続けることができた。傾斜した隆起は、生育不能細胞および細胞凝集体用の回避機構としても働き、そうでなければ、装置が詰まるか、または処理済細胞集団が希釈されたであろう。したがって、この設計は、局所的な詰まりがあったとしても効果的に機能し、すばやく自然にきれいになった。本装置の複数流路設計は、詰まることなく、10分で5千万個の細胞を処理することに成功した。
本装置の微小流体機能は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)上に成形され、ガラス基板にプラズマ接着された。標準的な二段階フォトリソグラフィを用いて、シリコンウエハ上に再利用可能なSU−8鋳型を作成した。緩和状態の細胞の平均径(14.5±1.5μm)の50〜60%の狭窄間隙を、最適な輸送用に用いたが、平均細胞径の40〜130%の間隙についても検討した。細胞注入口からの流れは、狭窄部を通過するように細胞を誘導し、細胞が圧縮されることなく優先的に隆起の周囲を流れるのを防止した。本装置を製造するために、PDMSと架橋剤とを10:1の比率で混合し、SU−8鋳型に流し込んで、レプリカ成形によって微小流体流路機能を形成した。その後、真空容器でPDMSを脱気し、60℃で6時間硬化させた。次に、冷却したPDMSを鋳型から取り外し、生検パンチを用いて排出口および注入口を打ち抜いた。次に、プラズマ接着機(PDC−32G、ハリック社(Harrick))を用いて、超音波処理したガラススライドにPDMSを接着し、60℃の乾燥器中で1時間置いた。冷却後、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて、4℃で一晩インキュベートして、流路の不動態化を行った。
ATCCから入手したK562細胞(CCL−243)を、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したRPMI−1640中で培養した。PC3前立腺癌細胞(CRL−1435)を、10%FBSおよび1%ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したF−12K中で培養した。37℃、5%CO2で、細胞を培養した。PC3細胞は、0.25%トリプシン−EDTAを用いて継代した。密度勾配遠心分離によって、プライマリー白血球を全ドナー血液から単離した。全ドナー血液を、フィコール(Ficoll)密度遠心分離媒体と共に、700RCFで10分間遠心分離し、濃縮された白血球帯(バフィコート)を回収した。
0.1%BSA、0.04%EDTA、および微量のトゥイーン(Tween)20を添加したDPBS(−/−)からなる細胞流入緩衝液を用いて、実験を通して単一細胞懸濁液を維持した。BSA、EDTA、およびトゥイーンを含まない純粋なDPBS(−/−)および無血清RPMI−1640を用いて行った実験によって、これらの試薬が分子輸送に対して観察可能な影響を与えないということを確認した。Opti−MEMおよび無血清RPMI−1640を、トランスフェクションおよびRNAプローブの輸送実験にそれぞれ用いた。培地から細胞を単離し、任意濃度の標的分子と共に、約5×106個/mLの濃度で緩衝液に再懸濁した。細胞−緩衝液の懸濁液を、シリンジポンプを用いて速度を制御しながら微小流体装置に注入した。排出口から回収した後、DPBS(−/−)を用いて細胞を2回洗浄し、細胞の外側に残った分子を除去した。
高速カメラアタッチメント(ファントム(Phantom)v7.3、ビジョン・リサーチ社(Vision Research))を取り付けた倒立明視野顕微鏡(エクリプス(Eclipse)Ti、ニコン社(Nikon))のステージ上で、実験を行った。処理中、装置の様々な部分において、細胞の高速ビデオ(〜5,000fps)を撮影した。
装置内で細胞の体積を測定するために、ビデオデータから細胞の面積を測定し、細胞変形モデルに基づく体積仮説を適用した。照合に用いた手動測定と共に、カスタム細胞追跡アルゴリズムを用いて、細胞の軌跡および面積をビデオにおいて自動で追跡した。追跡した各細胞について、アルゴリズムによって、細胞が見られるビデオフレームをすべて確認し、それが占める位置およびピクセル数(面積)を抽出した。各手動測定において、細胞の最大投影境界を表す最も鮮やかなグレースケール強度勾配のピクセルに合致する楕円を選択した。各画像の長さスケールを、公知の隆起寸法に基づいて較正し、これによって、ピクセル数の面積への変換を可能にした。各細胞について、装置の隆起領域に進入する前の細胞の面積を測定して、未圧縮の体積を求め、各隆起の下に完全に入った時の面積を測定して、圧縮体積を求めた。乱れていない細胞の体積を、楕円形の投影領域を長軸周りに回転させた楕円体として得、これによって、乱れていない細胞について合理的な最小の体積を得た。圧縮された細胞の測定値を得るために、隆起および流路底の制約部と交差する楕円体の体積を表す圧縮された細胞の面積および同等に減少させた頂部に同様の回転楕円体手順を適用した。これは、間隙がより小さい場合には円柱状に近づき、間隙がより大きい場合には乱れていない楕円体状へと戻るため、圧縮された細胞について合理的な最大体積とみなされた。
BDアキュリ(Accuri)C6フローサイトメーターを用いて、蛍光標的分子の細胞取り込みの特徴を調べた。FITC−デキストランまたはGFP RNAもしくはGFPプラスミドで処理した試料を、波長488nmのレーザーで励起し、533/30フィルターを用いて発光を検出した。シアニン−3で処理した試料を、488nmのレーザーで励起し、585/40フィルターによって検出した。2μMのEthD−1溶液34、35を用いた染色によって、細胞の生存率を検討した。EthD−1で染色した細胞を640nmで励起し、670LPフィルターを用いて検出した。
ツァイス(Zeiss)LSM700を用いて、テトラメチルローダミン(TRITC)−デキストランを用いた細胞の共焦点顕微鏡法を行い、輸送されたデキストラン分子の分子内局在性を確認した。40X水レンズを装着したツァイス710NLOを用いて、Cy3−プラスミドおよび100nmナノ粒子を含むK562細胞を撮像した。製造者のプロトコルに従い、これらの細胞をDiOによる膜染色およびヘキスト(Hoechst)による核染色によって染色した。
倒立光学顕微鏡(ニコンTi)を組み合わせてMFP−3D AFMを用いて、AFMプローブを視覚的に各細胞の中心に合わせることによって、圧縮を繰り返した際の各細胞の粘性緩和を測定した。この検討において用いたプローブは、公称ばね定数が0.03N/mのMLCT−O10−Dプローブである。AFMの片持ち梁は、直径15μmのPMMA微小球を介して細胞と相互作用した。ガラス表面に対して熱振動法を行うことによって、片持ち梁の較正を行った。培地中のK562細胞は、セルタック(Cell-Tak)を用いて、ガラス製フルオロディッシュ(Fluorodish)の表面に接着された。10μmとなるように圧入の深さを選択して、微小流体流路の5μmの間隙によって加えられるひずみをシミュレートした。圧縮後、2秒間、均一な圧入を維持しつつ、プローブに作用する粘性力の減衰から、細胞の緩和定数を得た。
微小流体的細胞変形
急激かつ短時間、細胞を正確に圧縮するように微小流路内に繰り返された、断面矩形状の隆起を通過する微小流体流によって、細胞が変形した。流体力によって、複数の狭窄部を通過する際の細胞速度が高く維持されたが、一方で、傾斜した隆起によって、詰まりの原因となる死細胞および細胞集団が除去された。
微小流体流路内の各細胞の高速ビデオによる面積分析と組み合わせて、コンピュータによる細胞変形モデルを用いて、流路内の何点かにおいて、細胞体積の変化を評価した(図2(c))。図2(c)は、装置内における単一細胞の画像分析を示す。圧縮前と、その後、各隆起の下に全体が押し込められた際とに、K562骨髄腫細胞の面積測定を行った(図2(ci))。圧縮前、各細胞を楕円体に近似したが、各隆起の下における細胞の形状は、細胞変形モデルによって求めたように、切頭楕円体に近似された(図2(cii)、図2(ciii))。圧縮された細胞の高さは、外形測定によって他と関係なく測定された隆起間隙と等しかった。隆起間における細胞の形状および向きが不確実であるため、隆起間における細胞の体積は、その面積測定から推定することはできない。
圧縮された細胞の体積減少は、サイトゾルの一部が細胞内部から放出されたことを示していた。一方、細胞体積の回復には、細胞外の流体が細胞へ入ることが必要となる。ビデオ分析では、隆起間における細胞体積の評価をすることはできないので、蛍光ラベルされたデキストラン(シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldrich))を追跡分子として用いて、膜内外の流体輸送によって、体積交換の動力学の特性をさらに決定してもよい。圧縮実験の直前に、様々なサイズのデキストランを細胞懸濁液に添加した。各圧縮後の細胞の緩和によって、分散した蛍光分子を輸送しつつ細胞外の流体が細胞内部へ入り、分子は、連続した圧縮後に細胞内部に部分的に残存して、体積交換の指標となると仮定した。
細胞内輸送が細胞の体積変化によって起こることをさらに確認するために、本方法を検討して分子サイズに影響を受けるかを確かめた。拡散速度は、分子サイズに反比例するので、拡散による輸送では、典型的には、より大きい高分子に対する効率はより低くなる。対照的に、上述した方法では、検討した範囲においては、分子サイズにかかわらず、細胞内輸送の効率が高い(細胞の90%以上が分子を取り込む)ことが証明された(図6a、図6b)。この検討では、おおよそ小分子薬剤の分子量(MW)である4kDaから2000kDaにわたり、体積あたりの質量が等しい分子を用いた。このサイズに依存しない輸送は、分子の取り込みが、膜小孔を通る分子拡散ではなく、主に、細胞の体積回復による細胞外からの物質の移流によって実現されているという仮説を支持するものであった。
体積変化と細胞内輸送との関係をより理解するために、体積交換事象が繰り返されることによる分子輸送の単純な数学的モデルを構築した。このモデルでは、細胞内部および細胞外部は、よく混合された非圧縮性の液体であると仮定する。したがって、隆起の下で細胞が体積VCまで圧縮されると、それに相当する体積の液体が細胞から流出して、標的分子の細胞内濃度で決まる質量分、その分子種が運び出される。逆に、細胞が減少した分の体積を回復する場合は、細胞外の分子種が、その細胞外濃度および時間依存的な細胞の体積回復V(t)で決まる速度で、取り込まれる(図7(a))。細胞の蛍光強度は、細胞内の分子濃度に比例すると仮定して、モデルおよび実験結果における細胞内分子輸送の量を表すのに、細胞の蛍光強度を用いた(図7(a))。
上述したシステムおよび方法を適用することによって、微小流体輸送プラットフォーム、特に、拡散による輸送を主に利用するプラットフォームの重大な制限に対処することができる。トランスフェクション試薬のための非常に効率のよい輸送プラットフォームとして、上述したシステムおよび方法を利用することの可能性を証明するために、シアニン−3(マイラス社(Mirus))ラベルされた非コードプラスミドのK562細胞への輸送を成功させた。細胞を、DiOによる膜染色およびヘキストによる核染色によって染色し、Cy3−プラスミドの細胞内局在を視覚化した(図9(a))。共焦点顕微鏡法を用いて、プラスミドが細胞内部へ入っていることが示された。共焦点顕微鏡法では、膜染色および核染色によって、Cy3−ラベルされたプラスミドが、細胞内部全体に拡散により輸送されたことが示された。スケールバーは5μmである。概念実証トランスフェクション実験では、EGFP mRNA(トリリンク社(TriLink))およびEGFPプラスミド(オズ・バイオサイエンス社(OZ Biosciences))をK562細胞へ輸送した後に、EGFPの発現を誘導することに成功した(図9(b)および図10)。図10は、EGFPプラスミドを用いてトランスフェクションを行ったK562細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。機械的伝播のみを用いて、EGFPプラスミド(オズ・バイオサイエンス社)によるK562細胞のトランスフェクションを行った。ネガティブコントロールの細胞は、EGFPプラスミドへの曝露は行わなかった。
急速で短時間の大きいひずみ圧縮を正確に誘導するために微小流体技術を用いることで、細胞の完全性、生存率、および機能が維持される一過性の細胞体積交換という驚くべき現象が明らかになった。最初、急に体積が減少し、その後、急速に体積を回復するという細胞の挙動が見出された。さらに、より小さい狭窄部によって加えられるより大きいひずみによって、誘導される体積変化がより大きいものになるということが見出された。また、体積交換の増大には、細胞が各隆起間において減少した体積を回復する時間が十分なものとなるように間隔を空けて配置された複数の隆起が必要とされるということもわかった。体積変化および緩和のこのような効果を、細胞に分子を輸送する新しい手法として用いた。具体的には、急速な圧縮による体積の減少は、細胞の緩和と併用されて、対流によって体積および分子を細胞内部へもたらすように作用する。
本研究では、複数回の急速で大きいひずみ圧縮によって、細胞の生存率に影響を及ぼすことなく、細胞の体積変化および緩和が生じるという細胞の新規の挙動が見出された。このような体積交換によって、細胞外分子が、対流によって細胞内部へ移動するということがわかった。上述したシステムおよび方法によって、処理能力の高い巨大高分子および粒子の輸送を含む、微小流による分子輸送への新規の応用が可能となる。様々な生物工学的用途向けのほぼ普遍的な細胞内輸送プラットフォームとして機能する大きな可能性を秘めた新規の細胞現象が、上述したシステムおよび方法によって明らかになった。
上述したシステムおよび方法は、機構および能力の両方において、現在の拡散性機械的穿孔プラットフォームとは異なるものであることも示された。拡散性微小流機械的穿孔法は、段階的な狭窄部を用いて、滑らかな細胞流れを容易にし、ひいては、よりゆっくりとした変形を容易にする様式で、細胞に剪断応力を付加した。圧縮によって細胞膜上に剪断力が生じ、これによって、膜穿孔および細胞外分子の細胞内への拡散が起こる。拡散は、普遍的な輸送機構であるが、拡散率と分子サイズとの反比例的関係のために、輸送に制約がかかる。実際に、拡散的手法による微小流機械的穿孔では、巨大高分子の輸送効率が限定されることが示された。
Claims (73)
- 対流による細胞内輸送のための方法であって、
複数の細胞を含む細胞培地および複数の分子を微小流路に供給するステップを含み、
該微小流路は、
互いに対して実質的に平面状に広がる第1の壁および第2の壁であって、該第1の壁は、複数の圧縮面を有していて、各圧縮面は該第1の壁から外方に突出し、該圧縮面と該第2の壁との間に圧縮間隙を規定しており、該圧縮間隙の高さは、平均細胞径の20〜80%である、第1の壁および第2の壁、ならびに
前記圧縮面の間に配置された複数の緩和空間、を含み、
前記細胞培地を、ある流速で前記微小流路に流すステップであって、前記細胞培地が前記微小流路を流れる際に、前記複数の細胞が、対流による細胞内輸送プロセスによる処理を受け、該プロセスは、
第1の圧縮間隙において前記複数の細胞を圧縮し、該圧縮によって、該複数の細胞の細胞内体積の減少(Vloss)が起こる工程、および
前記複数の細胞を第1の緩和空間まで通過させ、そこで該複数の細胞が体積を増加させ(Vgain)、前記複数の分子の一部を吸収する工程を含む、ステップと、
排出口において前記複数の細胞を回収するステップと、を含む、方法。 - 前記複数の圧縮面は、前記微小流路の中心流路軸に対して斜め方向を向いた複数の隆起を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の隆起のうちの少なくとも1つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して30度である、請求項2に記載の方法。
- 前記複数の隆起のうちの少なくとも1つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して45度である、請求項2に記載の方法。
- 前記複数の隆起のうちの少なくとも1つの隆起が形成する隆起角度は、前記微小流路の中心軸に対して20〜90度である、請求項2に記載の方法。
- 前記複数の隆起は、前記微小流路内において、山形様式で配置される、請求項2〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の分子は、高分子、ナノ粒子、デキストラン、プラスミド、mRNA、抗体、ビーズ、またはウイルスのうちの少なくとも1種である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記高分子の平均サイズは、3kDa〜6MDaである、請求項7に記載の方法。
- 前記微小流路は、注入口を少なくとも1つ含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の緩和空間の幅は、100〜300ミクロンである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の圧縮面は、隆起を1〜21個含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の圧縮面は、隆起を1〜7個含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の圧縮面は、実質的に直交している、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記流速は、100〜500mm/秒である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- Vlossは、平均細胞体積の5%〜30%である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- Vlossは、平均細胞体積の25%である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- Vlossは、前記細胞が最初に圧縮面に衝突してから測定を始めて約10マイクロ秒で生じる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- Vgainは、Vlossの25%〜100%である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- VgainがVlossの約100%となるのは、4〜100ミリ秒後である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞内輸送のための方法であって、
複数の細胞および複数の分子を微小流路に適用するステップを含み、
該微小流路は、
第1の圧縮間隙を規定する第1の直交面、
第2の圧縮間隙を規定する第2の直交面、および
前記第1の直交面と第2の直交面との間に配置される緩和空間、を含み、
前記複数の細胞を、100〜500mm/秒の流速で前記微小流路に流すステップと、
前記第1の直交面において、前記細胞に圧縮力を加えるステップであって、該圧縮力によって、該細胞の第1の体積の減少(Vloss1)を起こす、ステップと、
前記複数の細胞を第1の緩和空間に通すステップであって、該複数の細胞の第1の体積の増加(Vgain1)を起こす、ステップと、
前記第2の直交面において、前記細胞に圧縮力を加えるステップであって、該圧縮力によって、該細胞の第2の体積の減少(Vloss2)を起こす、ステップと、
回収地点において前記複数の細胞を回収するステップであって、該複数の細胞を回収した際に、該細胞の第2の体積の増加(Vgain2)を起こす、ステップと、を含み、
Vgain1およびVgain2のうちの少なくとも一方が生じる際に、前記複数の細胞は、前記複数の分子の一部を吸収する、方法。 - 前記第1の直交面および第2の直交面のうちの少なくとも一方は、前記微小流路の中心流路軸に対して斜め方向を向いた隆起を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記微小流路の中心軸に対して前記隆起が形成する角度は、30度である、請求項21に記載の方法。
- 前記微小流路の中心軸に対して前記隆起が形成する角度は、45度である、請求項21に記載の方法。
- 前記微小流路の中心軸に対して前記隆起が形成する角度は、20〜90度である、請求項21に記載の方法。
- 前記複数の分子は、高分子、ナノ粒子、デキストラン、プラスミド、mRNA、抗体、ビーズ、またはウイルスのうちの少なくとも1種である、請求項20〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記高分子の平均サイズは、3kDa〜6MDaである、請求項25に記載の方法。
- 前記高分子の平均サイズは、1nm〜100nmである、請求項20〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微小流路は、注入口を少なくとも1つ含む、請求項20〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記緩和空間の幅は、100〜300ミクロンである、請求項20〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記圧縮間隙の高さは、平均細胞径の20〜80%である、請求項20〜29のいずれか1項に記載の方法。
- Vloss1およびVloss2の少なくとも一方は、平均細胞体積の5%〜30%である、請求項20〜30のいずれか1項に記載の方法。
- Vloss1およびVloss2の少なくとも一方は、平均細胞体積の25%である、請求項20〜31のいずれか1項に記載の方法。
- Vloss1およびVloss2の少なくとも一方は、前記細胞が最初に圧縮面に衝突してから測定を始めて約10マイクロ秒後で生じる、請求項20〜32のいずれか1項に記載の方法。
- Vgain1およびVgain2のうちの少なくとも一方は、Vloss1および/またはVloss2の25%〜100%である、請求項20〜33のいずれか1項に記載の方法。
- VgainがVloss1およびVloss2の少なくとも一方の約100%となるのは、4〜100ミリ秒後である、請求項20〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞内輸送のためのシステムであって、
微小流路であって、
互いに対して実質的に平面状に広がる第1の壁および第2の壁であって、該第1の壁は、複数の圧縮面を有していて、各圧縮面は該第1の壁から外方に突出し、該圧縮面と該第2の壁の表面との間に圧縮間隙を規定している、第1の壁および第2の壁、ならびに
前記圧縮面の間に配置された複数の緩和空間、を含む、微小流路と、
複数の細胞および複数の分子を含む細胞培地であって、該細胞培地は、ある流速で前記微小流路を流れ、該細胞培地が該微小流路を流れる際に、該複数の細胞が、対流による細胞内輸送プロセスによる処理を受け、該プロセスは、
第1の圧縮間隙において前記複数の細胞を圧縮し、該圧縮によって、該細胞の体積の減少(Vloss)が起こる工程、および
前記複数の細胞を第1の緩和空間まで通過させ、そこで該複数の細胞が体積を増加させ(Vgain)、前記複数の分子の一部を吸収する工程、を含む、細胞培地と、を含み、
前記圧縮間隙の高さは、平均細胞径の20〜80%である、システム。 - 前記複数の圧縮面は、前記微小流路の中心流路軸に対して斜め方向を向いた複数の隆起を含む、請求項36に記載のシステム。
- 前記複数の隆起のうちの少なくとも1つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して30度である、請求項37に記載のシステム。
- 前記複数の隆起のうちの少なくとも1つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して45度である、請求項37に記載のシステム。
- 前記複数の隆起のうちの少なくとも1つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して20〜90度である、請求項37に記載のシステム。
- 前記複数の隆起は、前記微小流路内において、山形様式で配置される、請求項36〜40のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記複数の分子は、高分子、ナノ粒子、デキストラン、プラスミド、mRNA、抗体、ビーズ、またはウイルスのうちの少なくとも1種である、請求項36〜41のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記高分子の平均サイズは、3kDa〜6MDaである、請求項42に記載のシステム。
- 前記微小流路は、注入口を少なくとも1つ含む、請求項36〜43のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記複数の緩和空間の幅は、100〜300ミクロンである、請求項36〜44のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記複数の圧縮面は、隆起を1〜21個含む、請求項36〜45のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記複数の圧縮面は、隆起を7〜14個含む、請求項36〜46のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記複数の圧縮面は、実質的に直交している、請求項36〜47のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記流速は、100〜500mm/秒である、請求項36〜48のいずれか1項に記載のシステム。
- Vlossは、平均細胞体積の5%〜30%である、請求項36〜49のいずれか1項に記載のシステム。
- Vlossは、平均細胞体積の25%である、請求項36〜50のいずれか1項に記載のシステム。
- Vlossは、前記細胞が最初に圧縮面に衝突してから測定を始めて約10マイクロ秒で生じる、請求項36〜51のいずれか1項に記載のシステム。
- Vgainは、Vlossの25%〜100%である、請求項36〜52のいずれか1項に記載のシステム。
- VgainがVlossの約100%となるのは、4〜100ミリ秒後である、請求項36〜53のいずれか1項に記載のシステム。
- 平均径が3kDa〜6MDaである複数の高分子を含む細胞であって、該細胞は、
細胞培地および複数の分子を微小流路に供給するステップであって、該細胞培地は、前記細胞を含み、該微小流路は、
互いに対して実質的に平面状に広がる第1の壁および第2の壁であって、該第1の壁は、複数の圧縮面を有していて、各圧縮面は該第1の壁から垂直に突出し、該圧縮面と該第2の壁との間に圧縮間隙を規定しており、該圧縮間隙の高さは、平均細胞径の20〜80%である、第1の壁および第2の壁、ならびに
前記圧縮面の間に配置された複数の緩和空間、を含む、ステップと、
前記細胞培地を、ある流速で前記微小流路に流すステップであって、前記細胞培地が前記微小流路を流れる際に、前記細胞が、対流による細胞内輸送プロセスによる処理を受け、該プロセスは、
第1の圧縮間隙において前記細胞を圧縮し、該圧縮によって、該複数の細胞の体積の減少が起こる(Vloss)工程、および
前記細胞を第1の緩和空間まで通過させ、そこで該細胞が体積を増加させ(Vgain)、前記複数の分子の一部を吸収する工程を含む、ステップと、
排出口において前記細胞を回収するステップと、を含むプロセスによって形成される、細胞。 - 前記複数の圧縮面は、前記微小流路の中心流路軸に対して斜め方向を向いた複数の隆起を含む、請求項55に記載の細胞。
- 前記複数の隆起のうちの少なくとも1つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して30度である、請求項56に記載の細胞。
- 前記複数の隆起のうちの少なくとも1つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して45度である、請求項56に記載の細胞。
- 前記複数の隆起のうちの少なくとも1つの隆起が形成する角度は、前記微小流路の中心軸に対して20〜90度である、請求項56に記載の細胞。
- 前記複数の隆起は、前記微小流路内において、山形様式で配置される、請求項56〜59のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記複数の分子は、高分子、ナノ粒子、デキストラン、プラスミド、mRNA、抗体、ビーズ、またはウイルスのうちの少なくとも1種である、請求項56〜60のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記高分子の平均サイズは、3kDa〜6MDaである、請求項56〜61のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記微小流路は、注入口を少なくとも1つ含む、請求項56〜62のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記複数の緩和空間の幅は、100〜300ミクロンである、請求項56〜63のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記複数の圧縮面は、隆起を1〜21個含む、請求項56〜64のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記複数の圧縮面は、隆起を1〜7個含む、請求項56〜64のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記複数の圧縮面は、実質的に直交している、請求項56〜66のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記流速は、100〜500mm/秒である、請求項56〜67のいずれか1項に記載の細胞。
- Vlossは、平均細胞体積の5%〜30%である、請求項56〜68のいずれか1項に記載の細胞。
- Vlossは、平均細胞体積の25%である、請求項56〜69のいずれか1項に記載の細胞。
- Vlossは、前記細胞が最初に圧縮面に衝突してから測定を始めて約10マイクロ秒で生じる、請求項56〜70のいずれか1項に記載の細胞。
- Vgainは、Vlossの25%〜100%である、請求項56〜71のいずれか1項に記載の細胞。
- VgainがVlossの約100%となるのは、4〜100ミリ秒後である、請求項56〜72のいずれか1項に記載の細胞。
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