CN110198785A

CN110198785A - 用于对流驱动细胞内传递的方法

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Publication number: CN110198785A
Application number: CN201780082166.4A
Authority: CN
Inventors: 托德·萨切克; 亚历山大·阿列谢夫; 安娜刘
Original assignee: Georgia Tech Research Corp
Current assignee: Georgia Tech Research Corp
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2019-09-03
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: EP3538269A4; WO2018089497A1; EP3538269A1; US11198127B2; US20220062904A1; US20190262835A1; CA3082037A1; JP7084393B2; CN110198785B; JP2020503847A

Abstract

本发明用于对流细胞内传递的方法，其实施方式包括向具有压缩表面的微通道提供细胞和分子，其中，所述压缩表面限定高度为平均细胞直径的20％‑80％的压缩间隙；以及设置在压缩表面之间的多个松弛空间；使细胞介质流过微通道，其中，当细胞介质流过微通道时，多个细胞经历对流细胞内传递过程，该过程包括：压缩多个细胞，其中，所述压缩导致多个细胞经历细胞内体积减少(V_减少)；以及将多个细胞通过到第一松弛空间，其中，多个细胞经历体积增加(V_增加)并吸收多个分子中的一部分。

Description

用于对流驱动细胞内传递的方法

相关申请的交叉引用

本申请于2017年11月8日提交，并主张享有于2016年11月8日提交的、名称为“用于压缩并打开孔隙以进入细胞内以进行分子和粒子传递的脊状微通道”的申请号为No.62/419,041的美国临时专利申请的权益，其全部内容和实质通过引用结合到本文中，如下文所述。

联邦政府资助研究声明

本发明是在国家科学基金会授予的第DGE-1650044号以及美国国立卫生研究院(NIH)授予的第IR21CA191243-01A1号政府资助下完成的。政府享有本发明的某些权利。

背景技术

细胞内分子传递在细胞制造应用，尤其是在基因转染和编辑中非常重要。已知的细胞内分子传递方法导致了非常大的大分子(>500kda)向细胞的传递效率非常低，同时也阻止了向细胞核的传递。另外，这些方法还会导致设备阻塞，从而降低此类设备的通量。

细胞可在不改变其体积的情况下显着改变其形状。由于在-10至>1s的时标范围内施加高达85％的明显变形的细胞操作，描述了细胞的变形和形状变化，但没有描述细胞体积的变化。

发明内容

本发明的实施方式包括用于对流细胞内传递的方法，所述方法包括向微通道提供细胞介质和多个分子，所述细胞介质包含多个细胞，且所述微通道包含：第一壁和第二壁，所述壁彼此基本上是平行的，并且所述第一壁具有多个压缩表面，其中，每个压缩表面从所述第一壁向外突出并在所述压缩表面和所述第二壁之间限定一压缩间隙，其中，所述压缩间隙的高度为平均细胞直径的20％至80％；以及设置在压缩表面之间的多个松弛空间；使细胞介质以一定的流速流过微通道，其中当细胞介质流过微通道时，多个细胞经历对流细胞内传递过程，包括：在第一压缩间隙中压缩多个细胞，其中，所述压缩使得多个细胞经历细胞内体积减少(V_减少)；和将所述多个细胞传递到第一松弛空间，其中，所述多个细胞经历体积增加(V增加)并吸收所述多个分子的一部分；以及在出口处收集多个细胞。

本发明的实施方式可包括用于细胞内传递的方法，其包括：将多个细胞和多个分子施加到微通道，所述微通道具有：限定第一压缩间隙的第一正交表面、限定第二压缩间隙的第二正交表面、以及设置在第一和第二正交表面之间的松弛空间；使多个细胞以100至500mm/s的流速流入微通道；在第一正交表面向细胞施加压缩力，其中，所述压缩力使细胞经历第一次体积减少(V_减少1)；使多个细胞通过第一松弛空间，其中，多个细胞承受第一次体积增加(V_增加1)；在第二正交表面向所述细胞施加压缩力，其中，该压缩力使得细胞经历第二次体积减少(V_减少2)；以及在收集点处收集多个细胞，其中，当收集多个细胞时，它们经历第二次体积增加(V_增加2)，其中，当多个细胞经历V_增加1和V_增加2中的至少一个时，它们吸收多个分子中的一部分。

本发明的实施方式可以包括用于细胞内传递的系统，包括微通道，所述微通道包括：第一壁和第二壁，所述壁彼此基本上是平行的，并且所述第一壁具有多个压缩表面，其中，每个压缩表面向外突出到第一壁并在压缩表面和第二壁的表面之间限定压缩间隙，以及设置在压缩表面之间的多个松弛空间；所述细胞介质包含多个细胞和多个分子，细胞介质以一定流速流过所述微通道，其中，当细胞介质流过微通道时，多个细胞经历对流细胞内传递过程，包括：在第一压缩间隙中压缩多个细胞，其中，所述压缩使得多个细胞经历体积减少(V_减少)；将所述多个细胞传递到第一松弛空间，其中，所述多个细胞经历体积增加(V_增加)并吸收所述多个分子的一部分；并且，所述压缩间隙为平均细胞直径的20-80％。

本发明的实施方式包括细胞，其包括多个平均分子量为3kDa至6MDa的大分子，所述细胞通过以下方法形成，该方法包括：向微通道提供细胞介质和多个分子，所述细胞介质包括所述细胞，并且所述微通道包括：第一壁和第二壁，所述壁彼此基本上是平行的，并且所述第一壁具有多个压缩表面，其中，每个压缩表面垂直于所述第一壁突出，并在所述压缩表面和第二壁之间限定一压缩间隙，其中，所述压缩间隙的高度为细胞直径的20-80％，并且所述压缩表面之间设置有多个松弛空间；使所述细胞介质以一定流速流过所述微通道，其中，当细胞介质流过微通道时，所述细胞经历对流的细胞内传递过程，该过程包括：在第一压缩间隙中压缩细胞，其中，该压缩使得细胞经历体积减少(V_减少)；将细胞传递到第一松弛空间，其中，细胞经受体积增加(V_增加)并吸收多个分子中的一部分；以及在出口收集所述细胞。

在一些实施方式中，上述的任何系统或方法的压缩表面可包括相对于微通道的中心流动轴线对角定向的多个脊。在一些实施方式中，脊可相对于微通道的中心轴线形成30°角。在其他实施方式中，脊可相对于微通道的中心轴线形成45°角。在其他实施方式中，脊可相对于微通道的中心轴线形成20°-90°角。在上述的任何系统或方法的实施方式中，所述微通道可包括多个脊，并且多个脊可以在微通道内以人字形图案布置。在一些实施方式中，多个压缩表面可包括1-21个脊。在其他实施方式中，多个压缩表面可包括1-7个脊。

在一些实施方式中，上述任何系统或方法的分子可包括大分子、纳米颗粒、葡聚糖，质粒、mRNA、抗体、微珠或病毒中的至少一种。在一些实施方式中，所述大分子可具有3kDa-6MDa的平均分子量。

在一些实施方式中，上述任何系统或方法的微通道可包括至少一个入口。在一些实施方式中，上述任何系统或方法的多个松弛空间可以为100-300微米。在一些实施方式中，上述任何系统或方法的多个压缩表面基本可以是正交的。在一些实施方式中，多个压缩间隙可以是平均细胞直径的20至80％。

在一些实施方式中，上述任何系统或方法的流速可以为100-500mm/秒。

在一些实施方式中，上述任何系统或方法的V_减少可以是平均细胞体积的5％-30％。在其他实施方式中，V_减少可以是平均细胞体积的25％。在一些实施方式中，上述任何系统或方法的V_减少可以在所述细胞首次遇到压缩表面时测量的约10μs内发生。在一些实施方式中，上述任何系统或方法的V_增加可以是V_减少的25％至100％。在一些实施方式中，大约为100％V_减少的V_增加可以在4-100ms内发生。

附图说明

图1a根据本发明的一种或多种实施方式，示出了在压缩表面下遭受压缩的细胞的横截面图；

图1b根据本发明的一种或多种实施方式，示出了具有多个对角脊的双出口微通道的示意图；

图1c和1d根据本发明的一种或多种实施方式，示出了具有人字形图案布置的脊的各种微通道；

图1e根据本发明的一种或多种实施方式，示出了三出口微通道；

图2根据本发明的一种或多种实施方式，示出了表征设备和细胞体积测量的各种图像和图形表示；

图3根据本发明的一种或多种实施方式，示出了基因表达的比较，表明细胞的活力和完整性不受本发明所公开的系统和方法的影响；

图4a和4b根据本发明的一种或多种实施方式，示出了基于脊间隙、体积变化百分比、流速以及脊间时间来表征分子传递的各种图像和图示；

图5a和5b根据本发明的一种或多种实施方式，分别示出了各种图示，表明细胞内分子传递随着压缩间隙的减小而增加，并且较快的流动条件对应于较低的分子传递；

图6a-6h根据本发明的一种或多种实施方式，示出了研究各种性质，包括分子大小、脊数和流速的各种图示；

图7根据本发明的一种或多种实施方式，示出了包含细胞体积变化的机械模型的建立；

图8根据本发明的一种或多种实施方式，示出了压缩次数对K562细胞松弛时间的影响的图示；

图9根据本发明的一种或多种实施方式，示出了显示了各种分子成功传递至细胞的各种图像以及图示；

图10根据本发明的一种或多种实施方式，示出了使用EGFP质粒转染K562细胞的流式细胞术结果；

图11根据本发明的一种或多种实施方式，示出了将100nm荧光颗粒传递给K562细胞的共聚焦显微镜图像；

图12根据本发明的一种或多种实施方式，示出了显示原代白细胞和EGFP mRNA传递给细胞的图示；

图13a和13b示出了基于对流传递(图13a)和扩散传递(图13b)操作的装置中的各种大分子的细胞内传递的对比图示；

图14a和14b示出了基于对流传递(图14a)和扩散传递(图14b)操作的装置中的流速和输送百分比的对比图示；

图15a和15b示出了基于对流传递(图15a)和扩散传递(图15b)操作的装置中的大分子的细胞内传递的对比图示；

图16a和16b示出了基于对流传递(图16a)和扩散传递(图16b)操作的装置中的葡聚糖的细胞内传递的对比图示。

具体实施方式

尽管对本发明的优选实施方式进行了详细说明，但应理解的是，还可以设想其它实施方式。因此，并不意图将本发明的范围限制在以下描述中所阐述的或在附图中示出的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有其他实施方式并且能够以各种方式实践或实施。而且，在描述优选实施方式时，为清楚起见，将采用特定术语。

还须注意的是，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式的“一”，“一个”和“该”包括其复数指示物，除非上下文另有明确规定。

而且，在描述优选实施方式时，为了清楚起见，将采用术语。旨在每个术语考虑本领域技术人员理解的最广泛的含义，并且包括以类似方式操作以实现类似目的的所有技术等同物。

范围在本文中可以表示为从“约”或“近似”一个特定值和/或到“约”或“近似”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方式包括从一个特定值和/或到另一个特定值。

“包含”或“含有”或“包括”是指至少所指的化合物、元素、颗粒或方法步骤存在于组合物或制品或方法中，但不排除其他化合物、材料、颗粒、方法步骤的存在，即使其他此类化合物、材料、颗粒、方法步骤与所指的具有相同的功能。

还应理解的是，提及一个或多个方法步骤并不排除在明确指出的那些步骤之间存在另外的方法步骤或中间方法步骤。类似地，还应理解，在设备或系统中提及一个或多个组件并不排除在明确指出的那些组件之间存在其它组件或中间组件。

本发明的实施方式可以响应于超快时标下的大幅度变形，实现瞬时(高达30％)细胞体积变化的细胞行为，而不损害细胞活力。已知的用于将分子和/或粒子传递给细胞的细胞内传递方法依赖于分子和/或粒子向细胞的扩散传递，其不依赖于细胞的体积变化。相反，这种扩散传递利用剪切力和/或压缩力以在细胞膜中产生微孔。细胞膜易于进行细胞内传递操作，但为了维持高细胞活力并避免细胞损伤或死亡，这种操作在可传递的分子规模(例如，力的大小，空隙的大小和压缩的数量)以及分子类型(例如，较小的分子传递，而不是高于数百千道尔顿的大分子传递)方面受到限制。另外，在细胞内部和外部之间不存在额外的浓度差异，扩散不会以一种促进细胞内传递的方式发生。没有描述用于获得体积流量以及相应的“对流”体积再吸收的机制。事实上，本领域中预计的是，在没有大量细胞损伤和细胞死亡的情况下，迫使大量体积(例如细胞内的液体，例如细胞质)离开细胞是不可能的。令人惊讶的是，本发明的实施方式可以实现大量体积转移，这可以促进具有高细胞活力的细胞内分子传递的改善。

另外，用于获得扩散传递的已知微流体装置易于堵塞，这是因为需要使用窄收缩以便在高剪切下操作以促进细胞膜孔形成并获得扩散传递。试图利用高剪切力和高流速相结合来减少细胞堵塞，但这会导致细胞损伤和细胞死亡。此外，反复暴露于高剪切力下也可导致细胞损伤和细胞死亡。

本发明的实施方式可以获得明显的体积减少和回收期间的流体转移，导致具有高细胞活力的各种大分子的高通量传递。另外，本发明的实施方式可用于将各种大分子传递至各种不同的细胞类型。本发明的实施方式具有提供更高通量的传递和更少堵塞的益处。而且，本发明的实施方式可以达到相对于用于大分子传递的微注射和纳米针注射使用更少的专用设备来传递分子和/或颗粒。与基于扩散传递的微流体装置相比，本发明的实施方式具有更低的细胞死亡和聚集风险。

本发明的实施方式可包括用于分子的对流细胞内传递的方法、系统和装置。用于对流细胞内传递的方法可包括以下步骤中的一个或多个：1)向微通道提供细胞介质和多个分子，所述细胞介质包含多个细胞；2)使细胞介质以一定流速流过微通道；3)当细胞介质流过微通道时，采用对流细胞内传递过程；4)在第一压缩间隙中压缩所述多个细胞，其中，该压缩导致多个细胞遭受细胞内体积减少(V_减少)；5)在第一正交表面处向细胞施加压缩力，其中，所述压缩力使细胞经历第一次体积减少(V_减少1)；将多个细胞传递到第一松弛空间，其中，多个细胞经历体积增加(V_增加或V_增加1)；6)向细胞施加压缩力，其中，所述压缩力使细胞经历第二次体积减少(V_减少2)；7)在出口处收集多个细胞；8)在出口处收集多个细胞，其中，在收集所述多个细胞时，它们经历第二次体积增加(V_增加2)。

在一些实施方式中，所述用于对流细胞内传递的方法可包括：向微通道提供细胞介质和多个分子，所述细胞介质包含多个细胞；使细胞介质以一定流速流过微通道，其中，当细胞介质流过微通道时，多个细胞经历对流细胞内传递过程，该过程包括：在第一压缩间隙中压缩多个细胞，其中，该压缩导致多个细胞经历细胞内体积减少(V_减少)；以及将多个细胞传递到第一松弛空间，其中，所述多个细胞经历体积增加(V_增加)并吸收所述多个分子中的一部分；以及在出口处收集多个细胞。

在一些实施方式中，所述用于分子的对流细胞内传递的方法可包括：向微通道提供多个细胞；使多个细胞流到微通道；对细胞施加压缩力，其中，该压缩力使细胞经历第一次体积减少(V_减少1)；使多个细胞通过第一松弛空间，其中，多个细胞经历第一次体积增量(V_增加1)；对细胞施加压缩力，其中，该压缩力使细胞经历第二次体积减少(V_减少2)；以及且在出口处收集多个细胞，其中在收集多个细胞时，它们经历第二次体积增加(V_增加2)。

本公开的实施方式还可以包括用于分子的细胞内传递的一种或多种系统。在一些实施方式中，所述系统可包含微通道以及包含多个细胞和多个分子的细胞介质，所述细胞介质以一定流速流过微通道，其中，当所述细胞介质流过微通道，所述多个细胞经历对流细胞内传递过程，该过程包括：在第一压缩间隙中压缩所述多个细胞，其中，该压缩导致所述细胞经历体积减少(V_减少)；将多个细胞传递到第一松弛空间，其中，多个细胞经历体积增加(V_增加)并吸收多个分子中的一部分。

上述任何系统和方法还可包括含有多个平均直径为1nm-150nm的大分子的细胞，该细胞通过上述任何方法或系统形成。在上述任何系统和方法中，可以将多个大分子传递到多个细胞中。多个大分子可具有相同的尺寸或不同的尺寸。例如，多个大分子中的任何分子可以是1nm-100nm，5nm-100nm，10nm-100nm，20nm-100nm，30nm-100nm，40nm-100nm，50nm-100nm，60nm-100nm，75nm-100nm，80nm-100nm，85nm-100nm，90nm-100nm，110nm-120nm。在一些实施方式中，大分子的分子量范围可以是3kDa-6MDa，10kDa-6MDa，15kDa-6MDa，20kDa-6MDa，25kDa-6MDa，30kDa-6kDa，40kDa-6MDa，50kDa-6MDa，60kDa-6MDa，70kDa-6MDa，75kDa-6MDa，80kDa-6MDa，90kDa-6MDa，100kDa-6MDa，250kDa-6MDa，500kDa-6MDa，750kDa-6MDa，1MDa-5MDa，2MDa-4MDa，3MDa。

上述任何系统和方法都可以实现将分子在多种细胞类型中的对流细胞内传递。这些细胞类型可包括但不限于生殖系统的细胞，例如卵母细胞，精子，睾丸间细胞，胚胎干细胞，羊水细胞，胚泡，桑椹胚和受精卵；白细胞，例如外周血白细胞，脾白细胞，淋巴结白细胞，杂交瘤细胞，T细胞(细胞毒素/抑制剂，辅助，记忆，简单和致敏)，B细胞(记忆和简单)，单核细胞，巨噬细胞，粒细胞(嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞)，自然杀伤细胞，自然抑制细胞，胸腺细胞和树突状细胞；造血系统细胞，例如，造血干细胞(CD34+)，原红细胞，正常红细胞，早幼粒细胞，网织红细胞，红细胞，前红细胞，成髓细胞，幼红细胞，巨核细胞，B细胞祖细胞，T细胞祖细胞，胸腺细胞，巨噬细胞，肥大细胞和血小板；基质细胞，例如脂肪细胞，成纤维细胞，外膜网状细胞，内皮细胞，未分化的间充质细胞，上皮细胞，包括鳞状细胞，角膜缘细胞，长方体，柱状，鳞状角质化和鳞状非角化细胞，以及周细胞；例如，骨骼和肌肉组织的细胞，如肌细胞(心脏，横纹肌的和平滑)，成骨细胞，破骨细胞，骨细胞，滑膜细胞，成软骨细胞，软骨细胞，软骨内成纤维细胞和周围成纤维细胞；神经系统的细胞，例如星形胶质细胞(原生质和纤维状)，小胶质细胞，少突胶质细胞和神经元；消化道细胞，如十二指肠壁细胞、产酶细胞、精氨酸细胞、分泌多肽的内分泌细胞(APUD)、胰岛细胞(α，β和δ)、肝细胞和库普弗细胞；皮肤细胞，例如角质形成细胞，朗格汉斯细胞和黑素细胞；垂体和下丘脑的细胞，例如，生长调节细胞，促乳腺激素细胞，促性腺激素细胞，促甲状腺激素细胞，促肾上腺皮质激素细胞和促黑素细胞；肾上腺细胞和其他内分泌腺细胞，例如甲状腺细胞(C细胞和上皮细胞)；肾上腺细胞；和肿瘤细胞。

所述细胞可能是伯基特淋巴瘤细胞，绒毛膜癌细胞，腺癌细胞，非霍奇金B细胞和T细胞淋巴瘤细胞，纤维肉瘤细胞，神经母细胞瘤细胞，浆细胞瘤细胞，横纹肌肉瘤细胞，咽癌细胞，肾腺癌，肝癌细胞，纤维肉瘤细胞，骨髓瘤细胞，骨肉瘤细胞，畸胎瘤细胞，畸胎瘤角质形成细胞，肺癌细胞，结肠腺癌细胞，肺腺瘤细胞，肾癌细胞，直肠腺癌细胞，慢性粒细胞白血病细胞，回盲肠腺癌细胞，毛细胞白血病细胞，急性髓性白血病细胞，结肠癌细胞，盲肠癌和腺癌细胞，白血病-盲肠腺癌细胞，胰腺癌，威尔姆氏肿瘤细胞，前列腺癌细胞，肾淋巴母细胞瘤细胞，膀胱癌细胞，浆细胞瘤细胞，畸胎癌细胞，乳腺癌，子宫颈表皮样癌，卵巢畸胎癌细胞，骨髓瘤细胞，T和B细胞淋巴瘤细胞，卵巢黑色素瘤细胞，宫颈癌细胞，横纹肌肉瘤，肝细胞瘤，甲状腺髓样癌细胞，恶性黑色素瘤细胞，胶质母细胞瘤细胞，浆细胞白血病，子宫内膜腺癌，鳞状细胞癌，胰腺癌，星形细胞瘤，胃腺癌，肺粘液表皮样癌细胞，髓性白血病细胞，EBV转化B细胞，肾细胞腺癌，急性白血病，B细胞浆细胞瘤，急性淋巴细胞白血病，皮肤T淋巴瘤，T细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，HIV+T细胞，成神经管细胞瘤，镰状细胞病的B细胞，急性单核细胞白血病，肾上腺皮质癌，人黑色素瘤细胞和肝细胞癌。

上述任何系统和方法中的多个细胞可包括上述细胞任何或其衍生物。虽然当前描述的系统和方法是根据生物细胞来进行说明的，但应理解，当前公开的这些系统和方法可以使用除生物细胞之外的各种材料来实现，在一些实施方式中，上述系统和方法可以用各种粒子，包括纳米粒子，细胞内探针传感器(例如分子信标和灵光(SmartFlares))，病毒(例如慢病毒)和量子点等来实现。

另外，上述任何系统和方法可包括悬浮在流体，例如细胞介质中的上述任何细胞。所述细胞介质可以是其中悬浮有多个细胞的任何液体，并且其可以包括其他物质，包括碳源(例如葡萄糖)、水、各种盐、氨基酸和氮源(例如牛肉，酵母膏)中的一种或多种。另外，所述细胞介质也可包括其他营养物，例如植物计数琼脂，营养琼脂或胰蛋白酶大豆琼脂。

上述任何系统和方法可包括使细胞和/或细胞介质流过微通道。在上述系统和方法的一些实施方式中，所述微通道可以由第一壁和第二壁限定，所述壁彼此基本上是平行的。所述微通道可包括从第一壁突出的多个压缩表面。在一些实施方式中，多个压缩表面可从第一壁向外并朝向第二壁突出。在一些实施方式中，多个压缩表面可从第二壁向外并朝向第一壁突出。在一些实施方式中，多个压缩表面可以从第一壁和第二壁中的一个向外并朝向第一壁和第二壁中的一个突出。例如，在一些实施方式中，压缩表面可以从所述壁中的一个或两个垂直突出。在其他实施方式中，多个压缩表面可以以一定角度从第一和/或第二壁突出。在一些实施方式中，多个压缩表面可从第一壁和第二壁向外突出。例如，多个压缩表面中的每一个可以从第一壁向外突出朝向从第二壁向外突出的多个第二压缩表面。另外，在上述系统和方法的一些实施方式中，多个压缩表面可以限定多个压缩间隙。在一些实施方式中，多个压缩表面可以是多个正交表面。这样，在一些实施方式中，上述系统和方法的微通道可包括限定第一压缩间隙的第一正交表面；以及限定第二压缩间隙的第二正交表面。

图1a-1e中示出了用于实现上述任何系统和方法的对流细胞内传递的示例性微通道100。上述系统和方法可以包括下面参考图1a-1e描述的一些或所有特征。如图1a所示，所述微通道100可包括第一平面壁110和第二平面壁120。所述第一平面壁110可包括从第一平面壁110向外突出的多个压缩表面130。所述微通道100可包括一个或多个入口140，以用于使多个细胞180和多个粒子190流入微通道100。在一些实施方式中，以及如图1b所示，一个或多个入口140可包括鞘流入口145a，145b，以用于将流体鞘流输送到微通道100中。所述微通道100可包括多个出口150，以用于收集多个细胞180的一部分。

所述微通道可包括多个压缩表面130。在一些实施方式中，多个压缩表面130可包括多个脊，如图1b所示。在一些实施例中，多个压缩表面130可以相对于中心流动轴对角定向，如图1b所示。所述中心流动轴可以位于微通道100的中心部分附近，并包括与通过微通道100的主流平行运行的轴。如图1b所示，在一些实施方式中，多个压缩表面130可以平行于多个脊的每个后续脊延伸。多个压缩表面130可以是直的，但这不是必须的。例如，多个压缩表面130可以是任何形状，包括但不限于矩形，圆柱形，梯形或三角形。在一些实施例中，多个压缩表面可以是正交的。例如，在一些实施例中，多个压缩表面可具有至少一个直角。在一些实施例中，如图1c和2d所示，多个压缩表面130可以形成人字形图案。另外，如本领域技术人员将理解的，所述多个压缩表面可包括至少一个脊，但不必全部是脊。

多个压缩表面130可以在压缩表面130和相对壁120的表面之间限定压缩间隙170。例如，在多个压缩表面130从第一平面壁110突出的实施例中，多个压缩表面130可以在压缩表面130和第二平面壁120上的压缩表面130对面的表面之间限定压缩间隙170。如本文所使用的，表面可包括相对壁的最靠近或最接近部分，例如在壁不具有相应的脊或突起的情况下。在一些实施方式中，所述第二平面壁120可包括多个压缩表面130，并且相对表面可以是例如相对的压缩表面130。因此，压缩间隙170可以被定义为在压缩表面130和第二壁120的表面之间形成的空间，或者在相对壁上的相对的压缩表面之间的空间。在一些实施方式中，相对的脊可以彼此对齐。

虽然参考图1a-1e，虽然微通道的第一和第二壁被描述为是平行的，但它们不是必须的。例如，在上述任何系统和方法中，第一和第二壁基本上可以是平行的。换言之，它们可以轻微的角度朝向彼此或远离彼此，从而使得它们在微通道的长度上汇聚或发散。在一些实施例中，它们可以收敛或发散不止一点。另外，虽然第一壁可以定向在微通道的顶部，而第二壁可以定向在微通道的底部，但是它们不一定要如此布置，并且可以设想第一壁可以定向在微通道的底部而第二壁可以定向在所述微通道的顶部。

根据设备设计，压缩间隙170的尺寸可根据需要增大或减小。在一些实施方式中，压缩间隙170的尺寸可以根据细胞的平均直径来限定。可以理解的是，细胞的直径可以定义为细胞上两个点之间的最大距离。在一些实施例中，压缩间隙的高度可以根据平均细胞直径的百分比来定义。例如，压缩间隙170的高度约为平均细胞直径的约10％-80％，平均细胞直径的约10％-50％，平均细胞直径的约10％-40％，平均细胞直径的约10％-30％，平均细胞直径的约10％-20％，平均细胞直径的约20％-30％，平均细胞直径的约30％-40％，平均细胞直径的约40％-50％，平均细胞直径的约50％-60％。在一些实施方式中，压缩间隙170的高度可以是平均细胞直径的约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、或平均细胞直径的约60％、约65％，约70％、约75％、或约80％。所述平均细胞尺寸可以指流过分选装置的细胞的最大横截面尺寸的平均值，并且可以利用方法计算。在一些实施方式中，平均细胞直径可使用目前已知或后来开发的各种工具测量，包括但不限于光学显微镜，共聚焦显微镜，库尔特计数器和流式细胞术。

如图1a和1b所示，多个压缩表面130可以由松弛空间160分开。松弛空间160可包括在多个压缩表面的第一压缩表面和多个压缩表面的第二压缩表面之间形成的空间或通道的宽度。在一些实施方式中，松弛空间160可以是50-1000微米，50-750微米，50-500微米，50-400微米，50-350微米，100-300微米，100-750微米，100-500微米，100-400微米，100-300微米，100-250微米，或125-250微米。所述松弛空间160可以是至少50微米，至少约100微米，至少125微米，至少150微米，至少250微米或至少300微米。松弛空间160可以高达20微米，高达100微米，高达200微米，高达300微米，高达1000微米、高达750微米，或高达500微米，50-350微米，100-300微米，100至250微米，125-250微米，或至少300微米。

如图1b所示，多个压缩表面130可以包括角度(α)。多个压缩表面130可以以一定角度倾斜以在压缩表面130下方产生流体动力循环，并且可以设计成垂直于流动方向压缩和平移细胞。压缩表面130的角度也可以影响细胞的轨迹。该角度可以根据一个或多个参数而变化，所述参数包括但不限于流过微通道的细胞类型，松弛空间160和流过微通道100的介质的流速。这样，调整角度可以促进细胞沿压缩表面130的迁移。例如，调整角度可以促进死的细胞或受损细胞移动到微通道100的侧面，以防止堵塞所述微通道100。

根据设备设计，可以增大或减小角度。例如，在一些实施方式中，角度可以是20-90度，20-75度，30-60度，30-45度，45-60度，至少30度，至少45度，至少60度，至少75度。每个相应的压缩表面的角度沿微流体装置的长度可以相同或不同。在压缩表面130不是线性的情况下，可以基于与非线性脊线性拟合的线来测量角度。

微通道110中的压缩表面130的数量可以根据需要增加或减少。在一些实施例中，所述微通道110可包括1-100个压缩表面130。在一些实施例中，微通道110可包括至少3个压缩表面130，至少4个压缩表面130，至少5个压缩表面130，至少6个压缩表面130，至少7个压缩表面130，至少8个压缩表面130，至少9个压缩表面130，或至少10个压缩表面130。在一些实施例中，微通道110可包括多达100个压缩表面130，多达75个压缩表面130，多达50个压缩表面130，或多达40个压缩表面130。在一些实施例中，微通道110可包括5-50个压缩表面130，7-40个压缩表面130，或7-21个压缩表面130。在一些实施例中，微通道110可包括约14个压缩表面130。

可以通过厚度来描述多个压缩表面130。所述厚度可以定义为在主流动方向上的压缩表面的线性测量。可以根据需要增加或减少厚度。在一些实施方式中，厚度可为约7-30微米，约7-20微米，约7-18微米，约7-16微米，约-11微米，约7-9微米，约20-30微米，约22-28微米，约24-28微米，约18-21微米，约16-22微米，或约8-11微米。在一些实施方式中，所述厚度可以为至少约9微米，至少约11微米，和至少约16微米。

所述微通道100可具有一个或多个入口140。所述一个或多个入口140可位于微通道100的第一侧壁上。在一些实施方式中，微通道100可具有细胞入口140和鞘流入口145a，145b。在一些实施例中，所述细胞入口可位于第一鞘流入口145a和第二鞘流入口145b之间，或者可被第一鞘流入口145a包围。在一些实施方式中，细胞入口140可以在一个或多个鞘流入口145a，145b的下游，或者可也以与一个或多个鞘流入口145a，145b对齐。鞘流可以使细胞介质的水动力聚焦。一个或多个鞘流入口145a，145b可位于细胞流入口147附近，或细胞流入口147的上游。将细胞富集在入口中可以包括向鞘流入口145a，145b提供鞘液，直到鞘液到达层流，以及随后细胞入口147引入细胞介质。可以通过注射，例如通过注射泵将细胞引入细胞入口147。

所描述的微通道100可以以各种方式构造。在一个示例性但非限制性的实施方式中，所述微通道可以使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)在永久模具上的复制成型来制造。该模具可由光刻胶在直径为4英寸的硅晶片上进行两步光刻图案制作而成。在从模具中移除PDMS之后，可以在PDMS的侧壁上冲压入口和出口孔，并且随后可以将PDMS结合到玻璃基板上以形成微流体通道。另外，在如图1d所示的一些实施例中，所述系统和方法可以包括一个以上的微通道，以允许增加并同时执行上述方法。

多个细胞180可以以一定流速流入微通道100。可以根据需要提高或降低先前描述的任何系统和方法的流速。如本文所使用的，流速可描述为细胞介质在入口或出口处的速度。所述流速可以是约3-1000mm/s，约3-500mm/s，约3-250mm/s，约3-100mm/s，约3-50mm/s，约3-25mm/s。所述流速可以是至少约3mm/s，至少约20mm/s，至少约50mm/s，至少约100mm/s，或至少约500mm/s。所述流速可以是约3mm/s，约20mm/s，约500mm/s或约1000mm/s。基于设计偏好，还可以根据通道的长度和/或松弛空间的尺寸来调节流速。例如，增加通道的长度可以允许更大的流速。在类似尺寸的装置中，增加速度可导致装置内的压力增加。通过增加微通道的长度，可以在允许更高的流速的情况下考虑增加的压力。例如，增大松弛空间可以增加流速，因为更大的空间使得细胞移动更长的距离并且在脊通道中经受二次流动。因此，尽管流速更大，但增大松弛空间可以使得某些细胞增加松弛时间和正横向位移。在一些实施方式中，多个细胞180可以以一定流速流入微通道100。该流速可以是3-1500mm/s。

所述微通道可包括用于收集多个细胞中的一部分的多个出口150a，150b。如图1b所示，一个出口可以收集已经成功地在细胞内传递多个粒子的处理过的细胞183，下文将对此进行更详细的描述。另外，如图lb所示，另一个出口可收集死亡或受损的细胞185。通过具有双出口系统和二次流动模式(例如后续压缩空间之间的松弛空间)，当前描述的系统和方法可以实现高通量的分子传递而没有堵塞系统的风险。在其他实施方式中，微通道100可包括两个或更多个出口。例如，图1e示出了具有一个入口和三个出口150的实施例。在一些实施方式中，微通道100可包括至少两个出口，至少三个出口，至少四个出口或至少五个出口。出口的数量可以是两个，三个，四个或五个。因此，除了分子传递之外，可以预期的是，该系统还可以实现分选功能，例如通过生物力学性质，例如粘弹性，刚度或弹性来进行分选，或通过在细胞粘附实体中涂覆微通道来进行粘附。

上述任何出口可包括孔或腔室，以使它们腔室的方向上合并和/或移液，或直接合并和/或移液到腔室。在其他实施例中，可以通过集成晶片或毛细管进一步将所述出口与其他处理步骤集成，如下所述。另外，在收集细胞后，上述任何系统和方法可以包括使用现在已知或后来发现的任何分析工具，包括但不限于流式细胞术，荧光显微术，功能检测(例如，细胞凋亡，细胞周期，活力，增殖，血管生成)，光谱学，免疫测定和微电镀等来分析细胞的其它步骤。另外，在一些实施方式中，可以用电极计数器和显微镜来分析微通道和细胞。

如前所述，上述任何系统和方法可包括使多个细胞以一定流速流过微通道100。随着细胞流过微通道100，细胞可以经历对流的细胞内传递过程。该过程的特点在于多个细胞被压缩一次或多次，然后是松弛过程。例如，如前所述，所述对流细胞内传递过程可包括：在第一压缩间隙中压缩多个细胞，其中，该压缩导致多个细胞经历细胞内体积减少(V_减少)，以及使多个细胞通过第一松弛空间，其中，所述多个细胞经历体积增加(V_增加)并吸收所述多个分子中的一部分。如本领域技术人员将理解的，根据压缩表面和松弛空间的数量，所述对流细胞内传递过程可以发生一次或多次。

上述任何系统和方法可包括穿过细胞膜的大量体积流动，因为当细胞被压缩表面压缩时，细胞突然承受压缩力，从而使得细胞质大量地从细胞中流出。这种从细胞中流出的现象可以表征为V_减少。在一些实施方式中，可以根据压缩前的初始细胞体积来表征V_减少。压缩前的初始细胞体积可以使用当前已知或以后发现的各种工具进行测量，包括但不限于光学显微镜，共聚焦显微镜，库尔特计数器和流式细胞术。在一实施例中，V_减少可以是细胞初始体积的30％，25％，20％，15％或10％。在一些实施方式中，V_减少可以是细胞初始体积的至少10％，至少15％，至少20％，至少25％或至少30％。将转移回细胞的体积可以表征为V_增加。在上述任何系统和方法中，V_增加可以用V_减少来描述，使得V_增加可以是V_减少的至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少90％或至少100％。在上述任何系统和方法中，V_减少可以发生在至少1微秒，至少2微秒，至少3微秒，至少4微秒，至少5微秒，至少6微秒，至少7微秒，至少8微秒，至少9微秒，至少10微秒，至少15微秒，至少20微秒，至少25微秒，至少30微秒，至少45微秒，至少50微秒。另外，上述任何系统和方法都可以基于压缩表面的数量，使细胞在体积上经历多次减少以及在体积上经历多次增加。在一些实施方式中，细胞可以在1-100ms，4-100ms，10-100ms，15-100ms，20-100ms，25-100ms，30-100ms，40-100毫秒，50-100毫秒，60-100毫秒，75-100毫秒，80-100毫秒，以及90-100毫秒内重新恢复100％V_减少。此外，预计重新获得100％V_减少所花费的时间可能随细胞类型而变化，因此根据细胞类型，时间可能更多或更少。因此，多个单元可以经历V_减少1，V_减少2，V_减少3，V_减少7，V_减少14，V_减少21，直到V_减少N。因此，根据与压缩表面的数量相对应的松弛空间的数量，所述多个细胞可以经历V_增加1，V_增加2，V_增加3，V_增加7，V_增加14，V_增加12直到V_增加N。

另外，上述任何方法中的对流细胞内传递过程可包括细胞外分子的细胞内传递。分子可包含多种实体，包括但不限于粒子，大分子，纳米粒子，葡聚糖，质粒，mRNA或磁珠。

虽然以上实施方式描述了关于微通道内的细胞压缩，但应理解的是，上述任何系统和方法通过包括细胞与壁的惯性接触(包括撞击，推动或以其他方式强迫细胞和壁之间的接触)，具有包括流体或声场在内的非固体力场的快速压缩来获得瞬态体积变化。

实施例

本发明还通过以下实施例进行了描述和说明。然而，在说明书中的任何地方所使用的这些和其他示例仅是说明性的，并且绝不限制本发明或任何示例性术语的范围和含义。同样地，本公开不限于这里描述的任何具体优选实施例。实际上，在阅读本说明书之后，本公开的许多修改和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下做出这样的变化。因此，本发明仅受所附权利要求的条款以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围的限制。

实施例1

方法

装置设计

所述微流体装置设计采用单个大通道中的成角度的脊形式的压缩，以快速处理大量细胞。大通道使得多个细胞能同时在每个脊下通过，而流体动力阻力通过收缩保持细胞的速度，从而使得细胞处理能在多次收缩后也能快速继续。成角度的脊也用作非存活细胞和细胞聚集体的逃逸结构，否则它们会阻塞装置或稀释处理后的细胞群。因此，这种设计即使在局部堵塞的情况下也能有效地发挥作用，并且能够快速自我清除。该装置的多通道设计能在10分钟内成功处理了5000万个细胞而没有堵塞。

微流体通道的制作

将该装置的微流体特征模塑到聚二甲基硅氧烷(PDMS)上，并通过等离子体结合到载玻片上。使用标准的两步光刻法在硅晶片上制造可重复使用的SU-8模具。使用平均松弛细胞直径(14.5±1.5μm)的50-60％的收缩间隙以进行最佳传递，但也研究了平均细胞直径的40-130％的间隙。细胞入口流引导细胞通过收缩，防止细胞优先在脊周围流动而不压缩。为了制造这些装置，将10：1比例的PDMS和交联剂混合并浇筑在SU-8模具上，通过复制模塑形成微流体通道特点。然后将PDMS在真空室中脱气并在60℃下固化6小时。随后将冷却的PDMS从模具中取出，并使用活检穿孔器冲出出口和入口。然后使用等离子体结合器(PDC-32G Harrick)将PDMS结合到经超声处理的载玻片上，然后在60℃的烤箱中保温1小时。冷却后，用1％牛血清白蛋白(BSA)钝化通道，在4℃下进行过夜培养。

细胞培养

在含10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素链霉素的RPMI-1640培养基中培养来自ATCC的K562细胞(CCL-243)。在含10％FBS和1％青霉素链霉素的F-12K培养基中培养PC3前列腺癌细胞(CRL-1435)。将细胞在37℃下与5％CO₂共同培养。使用0.25％胰蛋白酶-EDTA对PC3细胞进行传代。通过密度梯度离心法从供体全血中分离原代白细胞。用Ficoll密度离心培养基将供体全血在700RCF离心10分钟，收集浓缩的白细胞带(血沉棕黄层)。

微流体实验装置

在整个实验过程中，使用含有0.1％BSA、0.04％EDTA和痕量吐温20的DPBS(-/-)组成的细胞流缓冲液来维持单细胞悬浮液。使用纯DPBS(-/-)和不含BSA，EDTA或吐温的无血清RPMI-1640进行的实验，确定这些试剂对分子传递没有明显的影响。分别使用Opti-MEM和无血清RPMI-1640进行转染和RNA探针传递实验。从培养基中分离出细胞，并以～5×10⁶个细胞/mL再悬浮于具有所需浓度的目标分子的缓冲液中。使用注射泵以受控速率将细胞缓冲液悬浮液注入微流体装置中。从出口收集后，用DPBS(-/-)洗涤细胞2次，以除去细胞外的残留分子。

高速视频显微镜

实验在具有高速相机附件(Phantom v7.3，Vision Research)，倒置高视野显微镜(Eclipse Ti，尼康(Nikon))的台上进行。在装置的各个部分处理期间，拍摄高速(～5,000fps)的细胞视频。

细胞体积变化的视频分析

为了测量装置内的细胞体积，从视频数据和基于细胞变形模型的应用体积假设对细胞面积进行了测量。使用自定义的细胞跟踪算法自动跟踪视频中细胞的轨迹和区域，并使用人工测量来验证。对于每个跟踪细胞，该算法识别出可见细胞的所有视频帧，并提取其所占据的像素的位置和数目(区域)。对于每次人工测量，取与最清晰灰度梯度像素相匹配的椭圆来表示最大投影细胞边界。基于已知的脊尺寸校准每个图像的长度尺度，这样就可以将像素数量转换成面积度量。对于每个细胞，测量其进入装置的脊区域之前的面积以确定其未压缩的体积，并确定完全位于每个脊下方的面积，以确定压缩体积。将未受干扰的细胞的体积视为椭圆体，其中椭圆的投影面积围绕主轴旋转，以使得未受干扰的细胞的合理体积最小化。为了进行压缩细胞测量，对压缩细胞区域采用相同的旋转椭球法，并切割等量的帽状体，以表示与脊和通道底部的压缩相交的椭球体的体积。这被认为是压缩细胞的最大合理体积，因为它接近圆柱形壳体，以获得较小的间隙尺寸，并且折叠回到未受干扰的椭圆形壳体，以获得较大的间隙尺寸。

流式细胞术

采用BD Accuri C6流式细胞仪表征荧光靶分子的细胞摄取。以FITC-葡聚糖或GFPRNA或质粒处理的样品用488nm波长的激光激发，并用533/30滤光片检测发射。用488nm激光激发含花青-3的样品，并用585/40滤光片检测。通过用2μMEthD-1溶液34,35染色来测试细胞的存活力。EthD-1染色的细胞在640nm处激发，并用670LP滤器检测。

共聚焦显微镜

使用蔡司(Zeiss)LSM 700对具有四甲基罗丹明(TRITC)-葡聚糖的细胞进行共聚焦显微镜检查，以确定传递的葡聚糖分子的细胞内定位。使用具有40倍水透镜的蔡司(Zeiss)710NLO来对具有cy3质粒和100nm纳米颗粒的K562细胞成像。根据制造商的方案，用DiO膜染色和Hoechst核染色对这些细胞染色。

原子力显微镜

使用MFP-3D AFM与倒置光学显微镜(Nikon Ti)一起对单个细胞在重复压缩过程中的粘性松弛进行了测量，以使AFM探针与每个细胞的中心光学对准。本研究中使用的探针是MLCT-O10-D探针，其标称弹簧常数为0.03N/m。AFM悬臂通过直径为15μm的PMMA微球与细胞相互作用。使用热振动方法对玻璃表面进行悬臂校准。使用Cell-Tak将培养基中的K562细胞粘附到氟玻璃盘的表面上。选择压痕深度为10μm，以模拟由微流体通道中的5μm间隙施加的应变。从作用在探针上的粘性力的衰减过程中提取细胞松弛常数，同时在压缩后保持恒定的压痕2秒。

结果

微流体细胞变形

细胞变形是由微流体流过具有矩形横截面的脊引起的，所述脊在微通道内重复以精确地对细胞施加突然且短暂的压缩。水动力在多个收缩期间中保持较高的细胞速度，而成角度的脊则能移除可能导致闭塞的死细胞和细胞簇。

图2中的(a)处示出了具有对角设置的脊的微流体通道布置的轮廓图。箭头表示细胞流动方向。当细胞遇到矩形脊时，观察到突然的形状变化，因为细胞在脊下压缩以符合小于其直径的间隙(图2中的(a))。细胞压缩时间是通过在测量的细胞速度(～100mm/s)下，细胞与脊的尖锐边缘的卷积(光学轮廓法测定的<1μm)来确定的。

在此期间，观察到细胞垂直压缩达70％，垂直压缩速度约为1m/s。通过高速视频分析法，对矩形脊的急剧变形结构引起的突然形状变化进行了定量分析(图2中的(b))。图2中的(b)示出了在通过脊的多个位置处的单个细胞(以红色标出)的覆盖。

细胞体积变化的测量

使用计算细胞变形模型，结合微流体通道中各个细胞的高速视频的面积分析，对通道中的几个点处的细胞体积的变化进行了评估(图2中的(c))。图2中的(c)示出了装置内单个细胞的图像分析。在压缩前测量K562骨髓瘤细胞面积，然后在每个脊下完全压缩时测量K562骨髓瘤细胞面积(图2中的(ci))。在压缩之前，每个细胞近似为椭圆体，而每个脊下的细胞形状则近似于截短的椭球体，这是由细胞变形模型所确定的(图2中的(cii)，(ciii))。压缩的细胞高度等于脊间隙，其通过轮廓测定法独立测量。由于脊间细胞形状和取向的不确定性，脊间的细胞体积不能从其面积测量中推导出来。

从已知的间隙和模拟的细胞形状，确定压缩前和压缩期间的细胞体积。在各个位置处的细胞面积测量值的叠加显示细微的面积变化，表明来自脊的垂直限制是体积变化的主要原因(图2中(civ)。具有与压缩单元相同体积的球形单元的视图使投影在预压缩细胞上时的体积变化可视化(图2中的(cv))。细胞在第一脊处表现出最显著的体积减小，这是由于从椭圆体到截头椭圆体的形状的突然变化所致。减小微流体装置的间隙尺寸导致预压缩细胞和在第一脊下压缩的细胞之间更大的体积减小更大(图2中的(d))。图2中的(d)显示在第一脊下损失的细胞体积百分比随着装置脊间隙的减小而增加，n>250，比例尺是四分位数范围。在大约8个脊之后，随着后续对平台体积的每一次压缩，细胞体积逐渐减小(图2中的(e))。图2中的(e)示出了在通道中的不同脊位置处的细胞的归一化体积，n≥45，比例尺是标准偏差。

虽然在压缩过程中观察到体积减少高达30％，但细胞很快恢复到其初始大小，对细胞完整性，活力和相关基因表达几乎没有影响。在微流体处理后，在细胞生长速率不变的情况下，成功地进行了细胞培养和扩增。在处理后<30分钟的流式细胞术分析显示，压缩实验对细胞的前向散射测量的影响可忽略不计(图2中(f))。图2中(f)显示流式细胞术前向散射测量显示受装置的影响最小，活力染色显示装置处理导致<5％的细胞死亡，n＝2。与无装置组相比，处理过的细胞的双嵌入剂乙锭均二聚物-1(EthD-1)染色显示<5％的细胞死亡(图2f)。用RT PCR进一步定量分析微通道中的压缩不影响细胞凋亡，细胞骨架和其他信号基因的表达(图3)。关于快速压缩后细胞存活率的单独详细研究，包括凋亡基因的表达，与该观察结果一致。图3显示与细胞活力和完整性相关的基因的表达不受当前描述的系统和方法的影响。RT PCR显示凋亡相关和细胞骨架基因的RNA表达不受微流体处理的影响。表达数据已相对于KRT10归一化。这些结果表明，细胞在短暂的体积减少后，恢复到正常的体积和功能。

通过分子传递表征体积交换

压缩细胞的体积减少表明一部分细胞质从细胞中排出。另一方面，细胞体积恢复需要细胞外液进入细胞。由于视频分析不能评估脊之间的细胞体积，因此通过使用荧光标记的葡聚糖(西格玛-奥尔德里奇(Sigma-Aldrich))作为跟踪分子，通过跨膜流体交换进一步表征了体积交换动力学。在压缩实验之前立即将各种大小的葡聚糖添加到细胞悬浮液中。假设在每次压缩后的细胞松弛将使得细胞外液进入细胞内部以运输分散的荧光分子，并且在连续压缩后，这些分子将部分地保留在细胞内，作为体积交换的标志。

共聚焦成像确定了本发明公开的系统和方法的分子传递是遍及细胞内部的分散，而非内吞传递(图4a)。图4a示出了具有2000kDa TRITC-葡聚糖的单个细胞的共聚焦显微镜图像，其在整个细胞内部具有漫射荧光谱。比例尺为5μm。可以看出，较小的脊间隙的较大压缩能达到荧光分子的较高传递(图4b(i)和图5a)。图4b(i)显示随着细胞通过的脊间隙越小，分子传递越大。图4b中的(ii)显示细胞内分子传递随着压缩间隙的减小而增加。流式细胞术的结果确定了2000kDa FITC-葡聚糖在具有各种脊间隙装置的K562细胞中传递。阴性对照细胞未接触FITC-葡聚糖。荧光信号显示了所测量的体积减少与间隙尺寸的正相关(图4b(ii))。图4b的(ii)显示分子传递随着体积变化的增大而增加。用具有2000kDa FITC-葡聚糖的7脊装置处理K562细胞。测量到的具有较小间隙尺寸(5.6μm)的细胞的传递在测试条件下受到干扰，因为细胞围在脊周围流动而不是穿过脊下方的较小间隙。具有间隙大于K562细胞直径(14.5±1.5μm)的脊不会引起体积变化，并且显示2000kDa葡聚糖大分子的传递较低(图4b(i))，这与利用流体剪切机制诱导膜孔以允许分子扩散传递的的现有研究相一致。

基于体积减少和分子传递之间的相关性，假设改变细胞在连续收缩之间移动时的细胞松弛时间可以影响体积吸收，并因此影响分子传递。通过改变脊间距或流速来控制脊之间的松弛时间。据观察，流速增加将导致传递减少，而脊之间的200μm间距产生了比100μm的间距更高的传递(图4b(iii)和5b)。图4b(iv)显示，较快的流动条件与较低的分子传递相对应。流式细胞术结果确定了2000kDa FITC-葡聚糖以各种流速在K562细胞内的传递，其中装置具有(a)100μm的脊间距以及(b)200μm脊间距。阴性对照细胞未接触FITC-葡聚糖。

因此，尽管流速和脊间距不同，但脊之间松弛时间的增加导致更大的传递(图4b(iv))。还观察到，在脊之间的一定持续时间的细胞松弛(～1ms)后，分子传递显示出了收益递减，表明存在饱和的松弛点(图4b(iv))。如图4(iv)所示，总体趋势表明传递随着脊之间的细胞松弛时间的增加而增加，直到观察到平台期。该结果与扩散传递形成对比，扩散传递随着流速的加快而增加。

对流分子传递的表征

为了进一步证实由于细胞体积变化而发生细胞内传递，对所述方法进行了测试，以确定它们是否受到分子大小的影响。由于扩散速率与分子大小成反比，因此对于较大的大分子来说，扩散传递通常表现出较低的效率。相反，所公开的方法证明了细胞内传递具有高效率(细胞吸收约90％分子)，而与被测试的分子分子量无关(图6a，6b)。该研究使用的从4kDa-2000kDa的等单位体积质量，大致相当于一种小分子药物的分子量(Mw)。这种与分子量无关的传递支持了这样的假设，即由于细胞体积的恢复，分子吸收主要是通过细胞外的物质平流来实现的，而不是通过膜孔的分子扩散。

多个脊的使用极大地增加了体积交换和向细胞的分子传递。观察到脊的数量和分子传递之间的正相关和非线性相关性，对于这些实验条件，其在14脊处饱和(图6c，6d)。还发现最终的分子传递与细胞外浓度呈线性关系(图6e，6f)，表明细胞内和细胞外分子浓度达到饱和。

为了进一步探索所述系统和方法使细胞溶质与细胞外分子浓度达到平衡的假设，用无葡聚糖的缓冲液处理先前的葡聚糖阳性细胞，以将葡聚糖从细胞内除去。首先使用所述系统和方法将2000kDa FITC-葡聚糖传递至K562细胞，然后将这些传递的细胞重悬浮于不含FITC的缓冲液中，并再次在装置中处理，以供去除组使用。结果发现，去除组的平均荧光强度与无装置组相匹配，表明该方法在去除先前传递的分子方面是非常有效(图6g)。这些结果支持了这样的主张：即所述系统和方法实现了分子浓度平衡，并且可以从细胞内部去除未结合的分子，而扩散传递并不能证明具有这样的能力。

为了确定在所述系统和方法期间发生传递的时间尺度，设计实验以分析在装置通道内的细胞压缩的短暂时间(<0.1s)内以及在离开所述装置之后立即发生的相对传递量。通过使K562细胞与目标传递分子2000kDa FITC-葡聚糖一起流过通道，然后通过立即将出口样品稀释到无分子的浴中以抑制通道后传递来确定通道内的传递。在没有靶分子的情况下，使细胞流过通道后隔离通道，然后在离开通道后立即将细胞暴露于富含分子的浴中。在通过通道的<0.1秒期间，分子被传递至超过80％的细胞，而在通过压缩后立即提供葡聚糖时，甚至在出口孔中培养>10分钟之后，仅有约33％的细胞表现出传递。使用无装置对照的10％的阈值来定义用于正传递的荧光的下限(图6h)。主要是在通道内的压缩期间获得的高传递支持所述系统和方法通过在压缩和松弛期间的流体交换来传递大分子。

建立体积交换和分子传递

为了更好地理解体积变化和细胞内传递之间的关系，构建了由于重复体积交换事件导致的分子传递的简单数学模型。该模型假设细胞内部和外部是混合良好且不可压缩的液体。因此，当细胞在脊下被压缩至体积VC时，相应体积的液体离开细胞，从而产生由该类型的细胞内浓度决定的大量靶分子。相反，当细胞恢复失去的体积时，细胞外的任何物种都会以其外部浓度和随时间变化的细胞体积恢复所设定的速度V(t)被吸入(图7中的(a))。细胞荧光强度用于表示模型和实验结果的细胞内分子传递量，假设细胞荧光强度与细胞内分子浓度成比例(图7(a))。

将每次压缩后的细胞体积恢复建模为V(t)＝(V_c-V₀)·e^-t/τ+V₀，其中V₀是细胞的原始(未压缩)体积，V_c是脊下的细胞体积(其中假设与脊的数量无关)，τ是细胞恢复丢失体积的66.7％的时间，以及t是最近一次压缩后经过的时间。具有体积V_c的细胞近似为高度等于脊间隙的截头的球体。基于实验结果(图6h)，假设在细胞离开装置之前，大部分传递在压缩之后立即发生。因此，忽略在最后一个脊之后>1ms后发生的传递。

对于可变松弛模型，松弛时间τ(Z)＝(τ₀-τ_∞)·e^-ζZ+τ_∞是压缩次数(Z)的函数，细胞初始松弛常数(τ₀)以及最终松弛常数(τ_∞)表征多次压缩后的松弛。当适用于分子传递的实验数据时，τ随着脊的数量增加而减小，以衰减常数ζ表示。

为了计算在一定数量的脊之后传递到细胞的分子的量，按顺序考虑每个脊的贡献。然后计算前两个脊之间的细胞体积增加为〖ΔV〗_增加＝V(t＝t__通过,z＝0)-V_c，其中t__通过是细胞在两个脊之间行进所花费的时间，其根据脊间距和流体流速来计算。然后，由前两个脊之间的细胞吸收的分子量表示为[Δη]__得到＝C_0-[AV]__增加，其中C0是分子的外部浓度。当细胞遇到第二个脊时，它被压缩到Vc并且一些分子被迫离开细胞〖Δn〗__减少＝n/V(t＝t__通过,z＝0)·〖ΔV〗__增加，其中，n是当前脊处细胞中分子的总量。然后对每个后续的脊重复该过程(同时递增z)，以确定多次压缩后的细胞内浓度。

为了使模型和实验数据之间的比较，通过对图6d中的实验数据执行非线性回归以估计τ₀,τ_∞和ζ的值。仅使用每个脊的中位荧光强度值(使用来自未接触葡聚糖或本发明公开的系统和方法的对照细胞的数据校正)来产生拟合。通过将实验数据和模型预测值归一化到其最大值，并将模型的预测结果与其他数据集(使用相同参数)进行比较。在归一化之前，图7(c)中的实验数据使用用于回归的相同类型的对照进行校正，以及图7(d)中的实验数据接触葡聚糖且不通过所述装置的对照细胞进行校正。

考虑了一种模型，其中，细胞表现的像Kelvin-Voit粘弹性材料，并在压缩后膨胀以指数的方式接近其原始体积V₀。使用指数函数V(t)＝(V_c-V₀)·e^-t/τ+V₀表示该渐近恢复，其中t是在最近的压缩之后经过的时间(图7中的(a))。假设每个脊的体积交换恒定，其中因子τ是细胞恢复其减少体积的66.7％的时间，与压缩次数无关。然而，确定了来自分子传递实验的结果与每个脊的恒定体积交换不一致(图7(b))。

接下来考虑体积交换随着连续压缩而增加的模型(图7中的(b))。假设松弛时间(τ)随着重复压缩而减小，渐近接近某个最终值。然后以该模型对实验数据进行拟合，得到的(τ)值在多个脊之后由初始值～1s下降到～0.1ms。先前的实验表明，在不同的压缩条件下，细胞的松弛确实可以在>10s的时间尺度和～10μs的速度下发生。通过所描述的系统和方法的实验结果与分子传递模型一致，其中，在所述分子传递模型中，随着脊的数量增加，观察到非线性正相关关系，与源浓度呈线性关系，并且传递需要间隙尺寸的阈值(图7(b)-(d))。图7(b)-(d)示出了在实验中观察到的中值荧光强度(点)与模型预测值(实线)之间的比较。使用原子力显微镜(AFM)进行细胞松弛测量，观察到在多次压缩后细胞形状的恢复确实可以更快地发生(图8)。基于该结果和现有研究，假设多个脊的反复压缩导致细胞生物物理变化，从而加快细胞的变形和恢复。

上述方法在细胞内传递中的应用

所述系统和方法的应用可以解决微流体传递平台的重要限制，特别是那些主要使用扩散运输的微流体传递平台。为了证明使用所述系统和方法作为转染剂的高效传递平台的能力，成功地将以花青-3(Mirus)标记的非编码质粒传递到K562细胞中。用DiO膜染色和Hoechst核染色对细胞进行染色，以观察Cy3-质粒在细胞内的定位(图9(a))。使用共聚焦显微镜观察到质粒能渗透到细胞内部。共聚焦显微镜观察到Cy3-标记的质粒在膜和核染色的整个细胞内部扩散传递。比例尺为5μm。概念转染实验证明在将EGFP mRNA(TriLink)和EGFP质粒(OZ Biosciences)传递至K562细胞后成功诱导EGFP表达(图9(b)和10)。图10显示使用EGFP质粒转染K562细胞的流式细胞术结果。单独用EGFP质粒(OZ Biosciences)转染K562细胞。阴性对照组细胞未接触EGFP质粒。

通过传递SmartFlare活细胞RNA探针(Millipore)以检测K562细胞和附着的PC3前列腺癌细胞中的GAPDH RNA，以测试所述系统和方法在细胞内标记和分析中的潜在应用。传递至PC3细胞与所建立的24小时胞吞作用方法竞争，并且在不到30分钟内完成(图9(c))。重要的是，K562细胞不通过胞吞作用吸收SmartFlare颗粒，说明使用所述系统和方法得到了成功传递(图9(d))。成功传递至PC3和K562细胞证明了该方法对粘附细胞和非粘附细胞的鲁棒。

还成功地将直径为100nm直径荧光珠传递至K562细胞，以证明这种方法能够传递非常大的粒子(图11)。为了解决在细胞工程中的应用，所描述的系统和方法被用来将大分子转染并传递至从全血分离的原发性外周血单核细胞(PBMCs)(图9e和图12)。图11显示100nm荧光颗粒向K562细胞的传递。共聚焦显微镜显示在微流体装置处理后，荧光颗粒(红色)被传递到内部。图12显示了使用EGFP mRNA转染从供体血液分离的原代白细胞的流式细胞术结果。从供体血液中分离原代白细胞，并使用EGFP mRNA(Trilink)机械转染。阴性对照细胞未接触EGFP mRNA。此外，由于成角度的脊的设计可以避免细胞堵塞，所以使用所述系统和方法的处理可以很容易地扩展到多通道，以在10分钟内成功处理5000万个细胞而不会堵塞。多种细胞类型的转染和细胞内标记中的成功，显示出了该平台在一系列细胞工程应用中与既定的传递技术竞争的潜力(表1)。

讨论

通过使用微流体精确地引起快速、短暂、大应变的压缩，阐明了维持细胞完整性、活力和功能的临时细胞体积交换的惊人现象。发现了细胞最初遭受突然的体积减少，然后体积快速恢复行为。另外，发现通过较小的收缩施加的较大应变，引起的体积变化更大。还发现，体积交换的增加需要间隔多个脊，从而使得每个脊之间有足够的时间让细胞恢复减少的体积。这种体积变化和松弛效应是将分子传递给细胞的一种新方法。具体而言，快速压缩驱动的体积减少与细胞松弛一起起作用，以对流地驱动体积和分子进入细胞内部。

这种令人惊讶的细胞行为的物理原因可以通过考虑由脊施加在细胞上的相关力来解释。在具有阶梯形轮廓的脊下的快速惯性压缩相当于对细胞的高速(～1m/s)垂直冲击，以类似液滴飞溅在表面上的方式破坏细胞膜。随后，细胞在脊下方的物理收缩导致动量快速传递到细胞内部的液体，从而将液体体积从细胞中排出。这种压缩的短暂性质导致细胞在快速时间范围内松弛，以在压缩后吸收体积。观察到的快速恢复与细胞质在快速压缩后在短时间尺度(<0.5s)内的快速、多孔弹性恢复行为是一致的。尽管初始体积减少，但细胞骨架调节细胞体积和保留溶质的能力可以解释所述系统和方法对细胞活力的最小影响。

在上述研究中发现，所述系统和方法利用平流主导的分子驱动机制，有效地向多种类型的细胞传递各种分子量和结构的分子，同时保持高活力。所述微流体方法避免了许多与使用化学、病毒或电处理相关的不利于细胞状态变化的抑制性缺陷。用法简单并成功地将一系列与生物相关的大分子传递至各种细胞类型，显示出具有广泛价值的生物医学应用的巨大潜力。

结论

在该研究中，发现了新的细胞行为，其中，多次、快速、高应变的压缩会造成细胞体积变化和松弛，但不影响细胞活力。研究发现该体积交换使得细胞外分子对流进入细胞内部。所描述的系统和方法为微流体分子传递提供了新应用，包括大分子和颗粒的高通量传递。上述系统和方法阐明了一种新的细胞现象，其具有作为用于各种生物技术应用的几乎通用的细胞内传递平台的巨大潜力。

实施例2

所述系统和方法在机制和性能上也与现有的机械扩散作用平台不同。扩散微流体机械加工方法采用渐进收缩，以有利于平滑细胞流动并因此减慢变形的方式将剪应力传递给细胞。压缩在细胞膜上产生剪切力，导致膜穿孔和细胞外分子扩散进入细胞内部。虽然扩散是一种普遍的运输机制，但由于扩散率与分子大小之间的反比关系，其对传递有限制。实际上，微流体机械作用的扩散方法已经表明大分子的传递效率有限。

使用具有10.2微米压缩间隙的微通道将目前描述的系统和方法与扩散传递方法进行比较。

例如，如图13a和13b所示，与目前描述的系统和方法(图13a)的小分子和大分子的相似递送相比，随着分子分子量的增加，扩散传递方的法(图13b)传递途径减少。

另外，如图14a和14b所示，与基于扩散的设计相比，即使流速较低，使用目前描述的系统和方法(图14a)也能实现高传递，而对于基于扩散的设计，其传递随着流速的增大而增加(图14b)。这一点很重要，因为基于扩散的设计依赖于剪切力，当流速增加时，剪切力会导致细胞破坏和细胞死亡。此外，在装置内部发生的传递隔离证明，对于当前公开的系统和方法(图15a)，可以在装置内实现标准方案的90％的传递，而在基于扩散的设计中，传递在膜破坏后发生，如图15b所示。

另外，如图16a所示，所述系统和方法通过重复体积交换和完全去除达到几乎完全均匀化。相反，现有的依赖扩散的设备并没有均匀化，并导致不完全去除，如图16b所示。在这些研究中，使用标准传递方案传递细胞，并在具有0.3mg/mL 2MDa FITC-葡聚糖的装置上运行一次。为了移除，至少一部分传递细胞再次通过一新装置，这次没有葡聚糖。对于装置/对照，细胞接触FITC-葡聚糖而不通过装置。

此外，上述系统和方法包括提高了防堵塞。成角度的脊设计自动快速地分类并去除大细胞聚集体、非活细胞、大细胞和未处理的细胞。

虽然上文公开了若干可能的实施方式，但是本发明的实施方式不限于此。这些示例性实施方式并非旨在穷举或不必要地限制本发明的范围，而是选择和描述这些示例性实施方式以便解释本发明的原理，使得本领域其他技术人员可以实践本发明。实际上，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将通过前面的描述变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。

本发明的实施方式也不限于本文所公开的具体制剂、工艺步骤和材料，因为这些制剂，工艺步骤和材料可以有所不同。此外，这里使用的术语仅用于描述示例性实施方式的目的，并且术语不旨在是限制性的，因为本发明的各种实施方式的范围将仅由所附权利要求及其等同物限制。

根据本公开的原理，具体配置、材料选择以及各种元件的尺寸和形状可根据特定的设计或要求本发明的约束条件：限制设备、系统或方法而变化。根据需要根据本公开原理构造的装置，系统或方法的特定设计规范或约束而变化。这些改变旨在包含在本发明的范围内。因此，当前公开的实施例在所有方面都被认为是说明性而非限制性的，并且本领域技术人员将理解，可以在如所附权利要求中限定的本发明的范围内实现变型和修改。因此，本发明的范围由以下权利要求表示，而不是前面的描述和上面讨论的实施例，并且在其等同物的含义和范围内的所有改变都包含在其中。

Claims

1.一种用于对流细胞内传递的方法，所述方法包括：

向微通道提供细胞介质和多个分子，所述细胞介质包括多个细胞，并且所述微通道包括：

第一壁和第二壁，所述壁彼此基本平行，并且，所述第一壁具有多个压缩表面，其中，每个压缩表面从所述第一壁向外突出，并限定了所述压缩表面与第二壁之间的压缩间隙，其中，所述压缩间隙的高度为平均细胞直径的20％-80％；以及

设置在所述压缩表面之间的多个松弛空间；

细胞介质以一定流速通过所述微通道，其中，当所述细胞介质通过所述微通道时，多个细胞经历对流的细胞内传递过程，该过程包括：

在第一压缩间隙中压缩多个细胞，其中，该压缩导致多个细胞遭受细胞内体积减少(V_减少)；以及

将所述多个细胞传递到第一松弛空间，其中，所述多个细胞经历体积增加(V_增加)，并吸收多个分子中的一部分；以及

在出口收集所述多个细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多个压缩表面包括相对于所述微通道的中心流动轴线对角定向的多个脊。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述多个脊中的至少一个脊相对于所述微通道的中心流动轴线形成30°角。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述多个脊中的至少一个脊相对于所述微通道的中心流动轴线形成45°角。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述多个脊中的至少一个脊相对于所述微通道的中心流动轴线形成20°-90°角。

6.根据权利要求2-5中任意一项所述的方法，其特征在于：所述多个脊在微通道内以人字形图案排列。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于：所述多个分子是大分子、纳米粒子、葡聚糖、质粒、mRNA、抗体、微珠或病毒中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述大分子的平均分子量为3kDa-6MDa。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于：所述微通道包括至少一个入口。

10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其特征在于：所述多个松弛空间的宽度为100-300微米。

11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其特征在于：所述多个压缩表面包括1-21个脊。

12.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其特征在于：所述多个压缩表面包括1-7个脊。

13.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其特征在于：所述多个压缩表面基本上是正交的。

14.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其特征在于：所述流速为100-500mm/s。

15.根据权利要求1-14中任意一项所述的方法，其特征在于：V_减少为平均细胞体积的5％-30％。

16.根据权利要求1-14中任意一项所述的方法，其特征在于：V_减少为平均细胞体积的25％。

17.根据权利要求1-16中任意一项所述的方法，其特征在于：从细胞首次遇到压缩表面开始测量，在约10μs内发生V_减少。

18.根据权利要求1-17中任意一项所述的方法，其特征在于：V_增加为V_减少的25％-100％。

19.根据权利要求1-18中任意一项所述的方法，其特征在于：大约为100％V_减少的V_增加在4-100ms内发生。

20.一种细胞内传递方法，包括：

将多个细胞以及多个分子应用于微通道，其中，所述微通道具有：

限定第一压缩间隙的第一正交表面；

限定第二压缩间隙的第二正交表面；以及

设置在第一和第二正交表面之间的松弛空间；

使所述多个细胞以100-500mm/s的流速流入所述微通道；

在所述第一正交表面向所述细胞施加压缩力，其中，所述压缩力使得所述细胞遭受第一体积减少(V_减少1)；

使所述多个细胞通过第一松弛空间，其中，所述多个细胞经历第一体积增加(V_增加1)；

在所述第二正交表面向所述细胞施加压缩力，其中，该压缩力使得所述细胞遭受第二体积减少(V_减少2)；以及

在收集点收集所述多个细胞，其中，当所述多个细胞被收集时，它们经历第二体积增加(V_增加2)，

其中，当多个细胞经历V_增加1和V_增加2中的至少一个时，它们吸收多个分子中的一部分。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于：所述第一正交表面和第二正交表面中的至少一个包括相对于所述微通道的中心流动轴线对角定向的脊。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述脊相对于所述微通道的中心流动轴线形成30°角。

23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述脊相对于所述微通道的中心流动轴线形成45°角。

24.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述脊相对于所述微通道的中心流动轴线形成20°-90°角。

25.根据权利要求20-24中任意一项所述的方法，其特征在于：所述多个分子是大分子、纳米粒子、葡聚糖、质粒、mRNA、抗体、微珠或病毒中的至少一种。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于：所述大分子的平均分子量为3kDa-6MDa。

27.根据权利要求20-24中任意一项所述的方法，其特征在于：所述大分子的平均尺寸为1nm～100nm。

28.根据权利要求20-27中任意一项所述的方法，其特征在于：所述微通道包括至少一个入口。

29.根据权利要求20-28中任意一项所述的方法，其特征在于：所述松弛空间的宽度为100-300微米。

30.根据权利要求20-29中任意一项所述的方法，其特征在于：所述压缩间隙的高度为平均细胞直径的20％-80％。

31.根据权利要求20-30中任意一项所述的方法，其特征在于：V_减少1和V_减少2中的至少一个为平均细胞体积的5％-30％。

32.根据权利要求20-31中任意一项所述的方法，其特征在于：V_减少1和V_减少2中的至少一个为平均细胞体积的25％。

33.根据权利要求20-32中任意一项所述的方法，其特征在于：从细胞首次遇到压缩表面开始测量，在约10μs内发生V_减少1和V_减少2中的至少一个。

34.根据权利要求20-33中任意一项所述的方法，其特征在于：V_增加1和V_增加2中的至少一个为V_减少1和/或V_增加2的25％-100％。

35.根据权利要求20-34中任意一项所述的方法，其特征在于：大约为100％V_减少1和V_减少2中的至少一个的100％的V_增加在4-100ms内发生。

36.一种用于对流细胞内传递的系统，包括：

微通道，其包括：

第一壁和第二壁，所述壁彼此基本平行，并且，所述第一壁具有多个压缩表面，其中，每个压缩表面向外突出到所述第一壁，并限定了所述压缩表面与第二壁之间的压缩间隙；以及

设置在所述压缩表面之间的多个松弛空间；

包括多个细胞以及多个分子的细胞介质，其中，所述细胞介质以一定流速通过所述微通道，当所述细胞介质通过所述微通道时，多个细胞经历对流的细胞内传递过程，该过程包括：

所述压缩间隙的高度为平均细胞直径的20％-80％。

37.根据权利要求36所述的系统，其特征在于：所述多个压缩表面包括相对于所述微通道的中心流动轴线对角定向的多个脊。

38.根据权利要求37所述的系统，其特征在于：所述多个脊中的至少一个脊相对于所述微通道的中心流动轴线形成30°角。

39.根据权利要求37所述的系统，其特征在于：所述多个脊中的至少一个脊相对于所述微通道的中心流动轴线形成45°角。

40.根据权利要求37所述的系统，其特征在于：所述多个脊中的至少一个脊相对于所述微通道的中心流动轴线形成20°-90°角。

41.根据权利要求36-40中任意一项所述的系统，其特征在于：所述多个脊在微通道内以人字形图案排列。

42.根据权利要求36-41中任意一项所述的系统，其特征在于：所述多个分子是大分子、纳米粒子、葡聚糖、质粒、mRNA、抗体、微珠或病毒中的至少一种。

43.根据权利要求42所述的系统，其特征在于：所述大分子的平均分子量为3kDa-6MDa。

44.根据权利要求36-43中任意一项所述的系统，其特征在于：所述微通道包括至少一个入口。

45.根据权利要求36-44中任意一项所述的系统，其特征在于：所述多个松弛空间的宽度为100-300微米。

46.根据权利要求36-45中任意一项所述的系统，其特征在于：所述多个压缩表面包括1-21个脊。

47.根据权利要求36-46中任意一项所述的系统，其特征在于：所述多个压缩表面包括1-7个脊。

48.根据权利要求36-47中任意一项所述的系统，其特征在于：所述多个压缩表面基本上是正交的。

49.根据权利要求36-48中任意一项所述的系统，其特征在于：所述流速为100-500mm/s。

50.根据权利要求36-49中任意一项所述的系统，其特征在于：V_减少为平均细胞体积的5％-30％。

51.根据权利要求36-50中任意一项所述的系统，其特征在于：V_减少为平均细胞体积的25％。

52.根据权利要求36-51中任意一项所述的系统，其特征在于：从细胞首次遇到压缩表面开始测量，在约10μs内发生V_减少。

53.根据权利要求36-52中任意一项所述的系统，其特征在于：V_增加为V_减少的25％-100％。

54.根据权利要求36-53中任意一项所述的系统，其特征在于：大约为100％V_减少的V_增加在4-100ms内发生。

55.一种细胞，其包括多个具有平均分子量为3kDa-6MDa的大分子，所述细胞由包括以下过程的方法形成：

向微通道提供细胞介质以及多个分子，所述细胞介质包括所述细胞，并且所述微通道包括：

第一壁和第二壁，所述壁彼此基本平行，并且，所述第一壁具有多个压缩表面，其中，每个压缩表面垂直于所述第一壁突出，并限定了所述压缩表面与第二壁之间的压缩间隙，其中，所述压缩间隙的高度为平均细胞直径的20％-80％；以及

设置在所述压缩表面之间的多个松弛空间；

在出口收集所述多个细胞。

56.根据权利要求55所述的细胞，其特征在于：所述多个压缩表面包括相对于所述微通道的中心流动轴线对角定向的多个脊。

57.根据权利要求56所述的细胞，其特征在于：所述多个脊中的至少一个脊相对于所述微通道的中心流动轴线形成30°角。

58.根据权利要求56所述的细胞，其特征在于：所述多个脊中的至少一个脊相对于所述微通道的中心流动轴线形成45°角。

59.根据权利要求56所述的细胞，其特征在于：所述多个脊中的至少一个脊相对于所述微通道的中心流动轴线形成20°-90°角。

60.根据权利要求56-59中任意一项所述的细胞，其特征在于：所述多个脊在微通道内以人字形图案排列。

61.根据权利要求56-60中任意一项所述的细胞，其特征在于：所述多个分子是大分子、纳米粒子、葡聚糖、质粒、mRNA、抗体、微珠或病毒中的至少一种。

62.根据权利要求56-61中任意一项所述的细胞，其特征在于：所述大分子的平均分子量为3kDa-6MDa。

63.根据权利要求56-62中任意一项所述的细胞，其特征在于：所述微通道包括至少一个入口。

64.根据权利要求56-63中任意一项所述的细胞，其特征在于：所述多个松弛空间的宽度为100-300微米。

65.根据权利要求56-64中任意一项所述的细胞，其特征在于：所述多个压缩表面包括1-21个脊。

66.根据权利要求56-64中任意一项所述的细胞，其特征在于：所述多个压缩表面包括1-7个脊。

67.根据权利要求56-66中任意一项所述的细胞，其特征在于：所述多个压缩表面基本上是正交的。

68.根据权利要求56-67中任意一项所述的细胞，其特征在于：所述流速为100-500mm/s。

69.根据权利要求56-68中任意一项所述的细胞，其特征在于：V_减少为平均细胞体积的5％-30％。

70.根据权利要求56-69中任意一项所述的细胞，其特征在于：V_减少为平均细胞体积的25％。

71.根据权利要求56-70中任意一项所述的细胞，其特征在于：从细胞首次遇到压缩表面开始测量，在约10μs内发生V_减少。

72.根据权利要求56-71中任意一项所述的细胞，其特征在于：V_增加为V_减少的25％-100％。

73.根据权利要求56-72中任意一项所述的细胞，其特征在于：大约为100％V_减少的V_增加在4-100ms内发生。