JP2020501157A - 耐久性のある酵素ベースのバイオセンサーおよび滴下堆積固定化のための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】液体試料におけるバイオマーカーの濃度を決定するための改善された貯蔵寿命を有するセンサーが提供される。センサーは電気化学的検出によって機能し、例えばバイオマーカーに特有の電子移動反応を触媒する酵素などの生体分子の使用を必要とする。センサーは、バイオリンカーとして4級アンモニウム化合物の使用を要する。さらに、安定性の改良のために生体分子の架橋を要する。
Description
本発明は、液体試料におけるバイオマーカーの濃度を決定するための改善された寿命を有するセンサー、および前記センサーに利用される滴下堆積固定化方法に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、2016年12月9日出願の米国特許仮出願番号62/432,513、名称「滴下堆積固定化プロセスによって可能になった耐久性のある酵素ベースのバイオセンサープラットホーム」の優先権を主張し、その全部を参照して本願明細書に組み入れる。
本出願は、2016年12月9日出願の米国特許仮出願番号62/432,513、名称「滴下堆積固定化プロセスによって可能になった耐久性のある酵素ベースのバイオセンサープラットホーム」の優先権を主張し、その全部を参照して本願明細書に組み入れる。
成功したヘルスケアシステムは、継続的に低コストでより多くの人々により良い健康を提供する。リアルタイムのポイントオブケア(POC)検査は、効果的な疾病管理と適切な治療的介入において援助し得る。この点に関して、癌について患者をスクリーニングするための指示流体として唾液を使用する非侵襲的方法を開発するための努力が進行中である。Wong,J Calif Dent Assoc, 2006, 2006. 34(4): p. 303-8; Wong, J Am Dent Assoc, 2006, 137(3): p. 313-21; and Castagnola,ら,Acta Otorhinolaryngologica Italica, 2011, 31(6): p. 347-357を参照されたい。慢性疾患管理の分野では、痛み、感染の危険性、瘢痕化のないリアルタイムの健康状態を単純かつ迅速に測定する方法を患者に提供するためのバイオマーカー監視技術が開発されており、これらすべてがプロセスをストレスのないものとする。この目的のために開発されたバイオセンサーは、生体分子を電気化学的検出と組み合わせて、小分子、タンパク質、ホルモン、および抗原を含む被検体を測定する。Zhang W, Sensing and Biosensing Research,2015, 4: p. 96-102; Du Y, Biosensors, 2016, 6(1): p. 10; Du, Journal of Diabetes Science and Technology, 2016, 10(6): 1344-1352; Zhang W, Sensing and Biosensing Research, 2015, 4: p. 23-29; and Malonら., Biomed Res Int, vol. 2014, Article ID 962903を参照されたい。
しかしながら、被検体の検出のために酵素を使用するこれらのバイオセンサーの多くは貯蔵寿命が短い。これは信頼性のある疾患検出/監視装置としてのそれらの使用を制限する。
個人の健康および/または疾患の診断をリアルタイムで評価することができる頑強な装置が必要とされている。
個人の健康および/または疾患の診断をリアルタイムで評価することができる頑強な装置が必要とされている。
本技術は、酵素などの架橋生体分子を含有する電気化学装置に基づく頑強で安定なバイオセンサーを提供する。装置の作用電極は、生体分子を含有する機能化コーティングで被覆されたナノ材料センサー素子の層を備えている。バイオセンサーは高感度であり、液体試料中の被検体またはバイオマーカーの特異的な検出および定量化が可能である。バイオセンサーは典型的には1年以上の貯蔵安定性を有する。
本技術の一態様は、液体試料中のバイオマーカーの濃度を決定するためのセンサーである。センサーは以下を含む:絶縁性および半導電性基板、少なくとも1つの作用電極、対電極、および基準電極、ならびに液体試料中のバイオマーカー濃度の決定中に、液体試料を含有するための基板の表面上の試料配置エリア。作用電極、対電極、および基準電極のそれぞれは、試料配置エリア内の基板上に堆積された導電性金属層を含む。作用電極は、試料配置エリア内において複数のセンサー素子で被覆されている。センサー素子は、4級アンモニウム化合物、複数の金属ナノ粒子、バイオマーカーに特異的な電子移動反応を触媒する架橋酵素を含む機能化コーティングで機能化される。作用電極、対電極、および基準電極は、電流測定回路に接続されている。センサーは作用電極への電子移動を測定する。電流測定回路の出力電圧は、試料配置エリアに堆積した液体試料中のバイオマーカーの濃度と相関する。
本技術の他の態様は、液体試料中のバイオマーカーの濃度を決定する方法である。この方法は以下のステップを含む:(a)上記のセンサーを準備する。(b)センサーの試料配置エリアへ液体試料を導入する。(c)センサーの電気出力から液体試料中の前記濃度を決定する。
本技術のさらに別の態様は、上記のセンサーおよび信号調整および/またはセンサーからの電気信号を処理する分析装置を含有するバイオマーカー分析システムである。
本技術のまた別の態様は、上記の共通基板を共有する複数のセンサーを含むバイオマーカーセンサーアレイである。
本技術の別の態様は、バイオマーカーセンサーを製作する方法である。当該方法は、(a)絶縁基板の表面上に1つ以上の作用電極、基準電極、および対電極を微細加工することで、電極のそれぞれは、基板上のサンプル配置エリアと接触し、(b)作用電極上に複数のセンサー素子を堆積させること、(c)1つまたは複数の機能化層を含む機能化コーティングをセンサー素子上に堆積させることで、各機能化コーティングは、第4級アンモニウム化合物、複数の金属ナノ粒子、バイオマーカーに特異的な電子移動反応を触媒する酵素を含み、ならびに(d)機能化コーティングに架橋剤を適用して酵素を架橋する工程を含有する。
さらに別の本技術の態様は、真空ゲルボックスなどの真空貯蔵容器中に備えられた上記センサーを含有するキットである。
当該技術は、以下の実施態様のリストによってさらにまとめられ得る。
1.液体試料におけるバイオマーカーの濃度決定のためのセンサーであって、前記センサーは、
絶縁性または半導電性基板、
少なくとも1つの作用電極、対電極、および基準電極、ならびに
液体試料中のバイオマーカーの濃度決定中に液体試料を含有するための前記基板表面上の試料配置エリアを備え、
前記作用電極、対電極、および基準電極の各々は、試料配置エリアにおける前記基板の上に堆積させた導電性金属層を含み、
前記作用電極は試料配置エリア内で複数のセンサー素子で被覆されていて、
前記センサー素子は、第4級アンモニウム化合物、複数の金属ナノ粒子、前記バイオマーカーに特有の電子移動反応を触媒する架橋酵素を含む機能化コーティングで機能化されていて、
前記作用電極、対電極および基準電極は電流測定回路に接続され、
前記センサーは前記作用電極への電子移動を測定し、ならびに
前記電流測定回路の出力電圧は、試料配置エリアに堆積された液体試料中のバイオマーカーの濃度と相関している。
1.液体試料におけるバイオマーカーの濃度決定のためのセンサーであって、前記センサーは、
絶縁性または半導電性基板、
少なくとも1つの作用電極、対電極、および基準電極、ならびに
液体試料中のバイオマーカーの濃度決定中に液体試料を含有するための前記基板表面上の試料配置エリアを備え、
前記作用電極、対電極、および基準電極の各々は、試料配置エリアにおける前記基板の上に堆積させた導電性金属層を含み、
前記作用電極は試料配置エリア内で複数のセンサー素子で被覆されていて、
前記センサー素子は、第4級アンモニウム化合物、複数の金属ナノ粒子、前記バイオマーカーに特有の電子移動反応を触媒する架橋酵素を含む機能化コーティングで機能化されていて、
前記作用電極、対電極および基準電極は電流測定回路に接続され、
前記センサーは前記作用電極への電子移動を測定し、ならびに
前記電流測定回路の出力電圧は、試料配置エリアに堆積された液体試料中のバイオマーカーの濃度と相関している。
2.基板が、シリコン、ガラス、紙、アルミナ、セラミック、非導電性ポリマー、およびそれらの組合せからなる群から選択される材料を含む、実施態様1に記載のセンサー。
3.作用電極が、金、白金、グラファイト、炭素、イリジウム、銀、銀/塩化銀、銅、ビスマス、チタン、アンチモン、クロム、ニッケル、スズ、アルミニウム、モリブデン、鉛、タンタル、タングステン、鋼、およびそれらの組合わせからなる群から選択される1以上の材料を含む、実施態様1または2に記載のセンサー。
4.センサー素子が、単層カーボンナノチューブ(SWNT)、二層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ、グラファイト、グラフェン、カーボンナノ繊維、カーボンナノワイヤ、カーボンナノロッド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される材料を含む、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
5.機能化コーティングがポリカチオン性ポリマーを含有しない、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
6.4級アンモニウム化合物が、約C2〜約C16の鎖長を有するアルキル鎖を含む、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
7.4級アンモニウム化合物が、塩化物または臭化物塩である、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
8.4級アンモニウム化合物が、臭化テトラエチルアンモニウム、臭化テトラプロピルアンモニウム、臭化テトラブチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、アルキル鎖長がC12〜C16の塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、およびアルキル鎖長がC8〜C10の塩化ジアルキルジメチルアンモニウムからなる群から選択される、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
9.複数の金属ナノ粒子が、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、銀ナノ粒子、銅ナノ粒子、パラジウムナノ粒子、ルテニウムナノ粒子、レニウムナノ粒子、およびそれらの組合せからなる群から選択される、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
10.酵素がホモ二官能性またはヘテロ二官能性架橋剤を使用して架橋される、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
11.酵素が、グルタルアルデヒド、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、N−ヒドロキシコハク酸イミド、N−ヒドロキシスルホコハク酸イミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、アジプイミド酸ジメチル、スベルイミド酸ジメチル、およびそれらの組合せからなる群から選択される試薬によって架橋される、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
12.機能化センサー素子を被覆する保護膜をさらに含む、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
13.保護膜が、ナフィオン、ポリ(ジアリルジメチルアンモニウム)クロリド、卵殻膜、ヒドロゲル、ウシ血清アルブミン、脂質二重層を含む、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
14.少なくとも約9ヶ月の貯蔵寿命を持つ、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
15.少なくとも約1年の貯蔵寿命を持つ、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
16.使い捨てデバイスまたは再利用可能のデバイスとして配置された、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
17.酵素がグルコースオキシダーゼおよびバイオマーカーがグルコースである、先行する実施態様のいずれかに記載のセンサー。
18.5μMまでの下限濃度にてグルコースを検出可能の実施態様17のセンサー。
19.応答時間が30秒以下である実施態様17または18のセンサー。
20.少なくとも4.8mA・s/Mの感度を有する実施態様17〜19のいずれかに記載のセンサー。
21.唾液中のグルコース濃度の決定のために配置された実施態様17〜20のいずれかに記載のセンサー。
22.液体試料中のバイオマーカーの濃度を決定する方法であって、該方法は以下の工程を含む:
(a)実施態様1〜21のいずれかのセンサーを準備すること、
(b)センサーの試料配置エリアに液体試料を導入すること、そして
(c)センサーの電気出力から液体試料中の濃度を決定すること。
23.以下の工程をさらに含む実施態様22に記載の方法:
(d)工程(b)で導入した液体試料を除去すること、
(e)センサーの試料配置エリアに新しい液体試料を導入すること、そして
(f)センサーの電気出力から新しい液体試料中の新しいバイオマーカー濃度を決定すること。
(a)実施態様1〜21のいずれかのセンサーを準備すること、
(b)センサーの試料配置エリアに液体試料を導入すること、そして
(c)センサーの電気出力から液体試料中の濃度を決定すること。
23.以下の工程をさらに含む実施態様22に記載の方法:
(d)工程(b)で導入した液体試料を除去すること、
(e)センサーの試料配置エリアに新しい液体試料を導入すること、そして
(f)センサーの電気出力から新しい液体試料中の新しいバイオマーカー濃度を決定すること。
24.酵素がグルコースオキシダーゼであり、測定されるバイオマーカーがグルコースであり、そして液体試料が糖尿病を患っているか、糖尿病を患っている疑いがあるかまたは健康である対象からのものである、実施態様22または23に記載の方法。
25.液体試料が唾液である、実施態様22〜24のいずれかに記載の方法。
26.以下を備えるバイオマーカー分析システム:
実施態様1〜21のいずれかに記載のセンサー、
センサーからの電気信号を処理する信号調整、および/または分析装置。
実施態様1〜21のいずれかに記載のセンサー、
センサーからの電気信号を処理する信号調整、および/または分析装置。
27.無線信号を遠隔の受信機および/またはデータ処理装置に送信するための送信装置をさらに含み、無線信号は液体試料中のバイオマーカー濃度に関する情報、信号調整、および/または分析装置から得られた情報を搬送する、実施態様26に記載のバイオマーカー分析システム。
28.液体試料中のバイオマーカー濃度に関連するデータを蓄積するためのメモリ装置をさらに含み、該データは異なる時間にまたは異なる液体試料から得られる、実施態様26または27に記載のバイオマーカー分析システム。
29.液体試料を化学的または物理的に処理し、処理した試料を装置の試料配置エリアに送達するための装置をさらに含む、実施態様26〜28のいずれかに記載のバイオマーカー分析システム。
30.共通基板を共有する実施態様1〜21のいずれかの複数のセンサーを含むバイオマーカーセンサーアレイ。
31.バイオマーカーセンサーを製作する方法であって、以下の工程を含む:
(a)絶縁性基板の表面上に1つ以上の作用電極、基準電極、および対電極を微細加工することで、各電極は基板上のサンプル配置エリアと接触する。
(b)作用電極上に複数のセンサー素子を堆積すること。
(c)センサー素子上に1つ以上の機能化層を含む機能化コーティングを堆積することで、各機能化層は、4級アンモニウム化合物、複数の金属ナノ粒子、バイオマーカーに特異的な電子移動反応を触媒する酵素を含む。そして
(d)架橋剤を機能化コーティングに適用することによって酵素を架橋すること。
(a)絶縁性基板の表面上に1つ以上の作用電極、基準電極、および対電極を微細加工することで、各電極は基板上のサンプル配置エリアと接触する。
(b)作用電極上に複数のセンサー素子を堆積すること。
(c)センサー素子上に1つ以上の機能化層を含む機能化コーティングを堆積することで、各機能化層は、4級アンモニウム化合物、複数の金属ナノ粒子、バイオマーカーに特異的な電子移動反応を触媒する酵素を含む。そして
(d)架橋剤を機能化コーティングに適用することによって酵素を架橋すること。
32.架橋剤が機能化コーティングの最上部に適用されるか、または架橋剤が1つ以上の機能化層のうちの1つ以上に含まれることによって適用される、実施態様31に記載の方法。
33.第4級アンモニウム化合物、金属ナノ粒子、および酵素を含む溶液または懸濁液の滴下堆積によってサブ層を堆積させることによって1つ以上の機能化層を堆積させる、実施態様31または32に記載の方法。
34.前記1つ以上の機能化層が、前記4級アンモニウム化合物、前記金属ナノ粒子、および前記酵素を含む単一懸濁液の滴下堆積によって堆積される、実施態様31または32に記載の方法。
35.単一懸濁液がホモ二官能性またはヘテロ二官能性架橋剤をさらに含む、実施態様31〜34のいずれかに記載の方法。
36.酵素が、グルタルアルデヒド、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、N−ヒドロキシコハク酸イミド、N−ヒドロキシスルホコハク酸イミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、アジプイミド酸ジメチル、スベルイミド酸ジメチル、およびそれらの組合せからなる群から選択される試薬によって架橋される、実施態様31〜35のいずれかの方法。
37.機能化層の上にセンサー保護膜を堆積させることをさらに含む、実施態様31〜36のいずれかの方法。
38.センサー素子を、電極上にセンサー素子の懸濁液を堆積させることを含む自己組織化プロセスによって作用電極上に堆積させる、実施態様31〜37のいずれかの方法。
39.真空貯蔵容器内に実施態様1〜21のいずれかのセンサー、または実施態様26〜29のいずれかのバイオマーカー分析システム、または実施態様30のバイオマーカーセンサーアレイを含むキット。
本明細書に記載の技術は、以前のバイオセンサーと比較して延びた貯蔵寿命を有する生体分子ベースのバイオセンサーを用いたバイオマーカーの検出に関する。好ましい実施態様において、バイオセンサーは、検出されるバイオマーカーに特異的な電子移動反応を触媒する酵素の使用に依存する。他の実施態様において、バイオマーカーは、酵素以外の生体分子、例えば非酵素タンパク質、抗体、アプタマー、脂質、ヌクレオチド、細菌、およびそれらの組み合わせを使用して検出される。
グルコースオキシダーゼを使用するものなどの以前の酵素ベースのバイオセンサーは、その設計に使用される酵素が不安定であることが主な理由で、しばしば1ヶ月未満、またはほんの数日間続く短い貯蔵寿命を有することに悩まされている。これは酵素ベースのバイオセンサーの臨床使用を制限する。Gibson, T. D. Biosensors: The Stability Problem, Analusis, 1999, 27(7): p. 630-638を参照されたい。この欠点は、本技術に従って製造されたバイオセンサーによって克服される。この技術は、(i)安定性を向上させるための酵素(または他の生体分子)の架橋、および(ii)貯蔵寿命を向上させ、および感度を向上させるための4級アンモニウム化合物の使用を必要とする。
本明細書中で使用される場合、「貯蔵寿命」とは、一般に初期活量の50%未満、例えば30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、2%未満、または1%未満、例えば、感度(被検体の検出下限)、応答性(すなわち、所与の被検体濃度に対する電圧出力)、または信号対雑音比が失われる期間を言う。貯蔵寿命は、室温、冷蔵庫温度(約4℃)、冷凍庫温度、真空下、または周囲条件下(室温および大気圧)のような貯蔵条件の関数として測定および特定することができる。一般に、貯蔵寿命は室温および真空下で特定されている。
本明細書に記載のバイオセンサーは、例えば、基板またはチップ上に3電極または4電極電気化学セルを含むことができる。好ましくは、各バイオセンサーは3つの電極、すなわち作用電極、対電極、および基準電極を含有する。作用電極上に堆積した成分に酵素が付着している。目的の被検体を含有する試料液体、例えばグルコースがセンサーに滴下されると、3つの電極すべてに接触する。存在する被検体の量は、電流測定法を用いて測定される。電極の幾何学的形状および相対面積は、試験に使用される試料の体積について最良の結果が得られるように好ましくは最適化される。試料容量は、数ナノリットルから数ミリリットル以上の範囲であり得る。
バイオセンサーを構築するために、作用電極は、単層カーボンナノチューブ(SWNT)または通常、導電性または半導体である他のナノ素子などのナノ材料の層で被覆されている。適切な方法は、国際公開第2014/110,492号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ナノ素子の層は、本明細書では「センサー素子」と呼ばれ、なぜなら、これらのナノ素子は、デバイスの生体分子センサーのための導電性の大表面積接触を提供するからである。次に、機能化コーティングがセンサー素子上に形成される。機能化層(単数または複数)は、層ごとの組み立て方法によるか、または機能化コーティングの必要な成分のすべてを含有する単一層の滴下堆積によるかのいずれかで付加することができる。機能化層の成分は、4級アンモニウム化合物などの「バイオリンカー」、金属ナノ粒子、および好ましくは金属ナノ粒子に吸着される酵素(または他の生体分子)を含む。架橋剤は、酵素の添加後に各層に、またはコーティングの最上層もしくは上面にのみ添加され、機能化コーティング内で酵素を架橋する。架橋剤が最後のサブ層として添加される場合、それはその下の層を貫通してそれらの層中で酵素(または他の生体分子)の架橋を引き起こし得る。図1を参照されたい。
好ましくは、本技術において、電極被覆としてのまたは機能化コーティング内のポリアリルアミン(PAA)、キトサン、ならびにカチオン性ポリマーの使用は、回避される。
多層フィルムのアセンブリに使用されるバイオリンカーは、好ましくは4級アンモニウム化合物である。一般に、これらの化合物は、抗菌剤(Jenny A. L, Macromolecules, 2009, 42(22): p. 8573-8586; Lichter, et al., Macromolecules, 2009, 42: p. 8573-86. )、ナノ粒子安定剤(Petkova, et al., Nanoscale Research Letters, 2012, 7(1):287)、Nafion改質剤(Moore, et al., Biomacromolecules, 2004, 5(4): p. 1241-1247; Meredith, et al., Jove-Journal of Visualized Experiments, 2012 (65))、またはカチオン性界面活性剤(Zhou, et al., Journal of Materials Chemistry, 2004, 14(14): p. 2311-2316)として役立つことが知られている。本明細書に記載のバイオセンサーにおいては、これらの化合物は貯蔵寿命の延長および感度の向上をもたらす。
本技術は、その活量がバイオセンサーの機能化のために依存している酵素(または他の生体分子)の架橋を必要とする。タンパク質架橋は、タンパク質構造および機能の研究、タンパク質の固相支持体への固定、免疫原、免疫毒素、および他の共役タンパク質試薬の調製を含む多くの目的、ならびにタンパク質の三次構造および四次構造の安定化に用いられてきた。本技術では、バイオセンサーが長期の貯蔵寿命を有するように、架橋を用いてタンパク質の構造を安定化させる。タンパク質を架橋するためのいくつかの方法が知られている(Double-Do Protein Cross-Linkers, Handbook & Selection Guide, Archived, 12/7/2017; およびThermo Scientific Crosslinking Technical Handbook, Archived, 12/7/2017;を参照)。架橋剤で標的とされ得る官能基の中には、第一級アミン、カルボキシル、スルフヒドリル、炭水化物およびカルボン酸がある。タンパク質分子はこれらの官能基の多くを有するため、架橋剤を使用して容易に共役化することができる。架橋度を最適化するように注意しなければならない。少なすぎると、センサーの貯蔵寿命が短くなることがあり、多すぎると、酵素または他の生体分子は変性し、その活量および/または特異性を失い得る。
架橋剤は、それらの反応性基の数および類似性に基づいて2つの群:同じ2つの反応性末端を有するホモ二官能性架橋剤、および2つの異なる反応性部分を有するヘテロ二官能性架橋剤に分けることができる。ホモ二官能性架橋剤は一段階反応で使用されるが、ヘテロ二官能性架橋剤は二つの逐次反応を必要とする。前者は使用の容易さを与え、そして後者は架橋方法に対するより大きな制御を与える。好ましい架橋剤は、ホモ二官能性架橋剤であるグルタルアルデヒド(図1参照)またはグルタルアルデヒドポリマーである。1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、ジシクロヘキシルカルボジイミド、アジプイミド酸ジメチル、およびスベルイミド酸ジメチルが、使用され得る他の試薬の例である。
本技術の滴下被覆堆積プロセスと組み合わされた酵素架橋は、酵素ベースのバイオセンサーの安定性における有意な改善をもたらす。いかなる理論または作用機序によっても制限されることなく、安定化は、イオン交換による迅速なタンパク質吸着、それに続くグルタルアルデヒド上のアルデヒド(−CHO)基と酵素上のアミノ(−NH2)基との間の化学的相互作用が関与すると考えられる( Zucca and Sanjust, Methods and Mechanisms. Molecules, 2014, 19(9): p. 14139-14194 and Ismail, I A and Wu, W. H. 1992, US5116729 A)。グルタルアルデヒドは、その小さいサイズ(約1nm3; Castagnola, et al., Acta Otorhinolaryngologica Italica, 2011, 31(6): p. 347-357)のために架橋剤として有利であり、それは酵素分子の内部への浸透を可能にする。架橋は、タンパク質骨格とポリマー鎖との間の共有結合、イオン相互作用、および超分子相互作用を可能にすることによってタンパク質安定化に寄与する。それは、再折りたたみを防止しながら、吸着された生物反応性酵素を安定化させるための簡単で迅速な方法を提供する。
作用電極を被覆するための多層フィルムを製造するための交互積層法の例を図1に示す。この例では、各層は第4級アンモニウム化合物バイオリンカー、金属ナノ粒子および表面に架橋酵素が吸着された金属ナノ粒子のサブ層からなる。架橋はグルタルアルデヒドを用いて行われる。センサー素子としてSWNTで被覆された電極の場合、SWNT上の負電荷は静電引力によって第4級アンモニウム化合物と相互作用する。金属ナノ粒子(NP)は、ファンデルワールス力または他の非共有相互作用を介して、4級アンモニウム(QA)化合物および選択した生体分子(例えば、酵素)と会合すると考えられている。QA−NP−酵素単位層を数回繰り返して多層コーティングを形成することができる。最良の感知性能を達成するように層の数を調整することができる。例えば、QA−NP−酵素単位は単層として使用することができ、または2〜10層、または2〜5層、または3〜5層、または3〜6層、または4〜6層、または4〜7層、または5〜8層を形成するために繰り返すことができる。
単一のチップ上に複数の同一または非同一のセンサーを含めることができ、それによって測定を多重形式または内部の確証を可能にする形式で実施することができる。
センサー素子ナノ材料は、金属と半導電性のナノ材料の混合物であり得るか、または均質な金属性または半導電性のナノ材料であり得る。ナノ材料は、非常に大きな面積対体積比を提供し、そして有用な電気的性質を有する。本技術によるセンサーは電気化学的機構によって動作し、それによって特定の被検体/バイオマーカーの存在は作用電極への電子移動をもたらし、生じるセンサーを流れる電流を測定することによって識別および定量化され得る。電流測定法を用いて、電流を出力電圧に変えることができる。この特徴は、被検体の存在下でSWNTの電気抵抗の変化を生じさせる他の種類のセンサーよりもセンサーをより正確かつ信頼できるものにする。電子移動反応を触媒することができる酵素以外の生体分子の使用により、作用電極へのまたは作用電極からの電子移動が起こり、次に作用電極に接続された電流測定回路によって検出することができるように、印加電圧などの検出条件を選択することができると考えられる。
電極材料は、例えば、これらに限定されないが、金、白金、イリジウム、銀、銀/塩化銀、銅、アルミニウム、クロム、または他の導電性金属もしくは他の導電性材料を含むかまたはそれらからなることができる。バイオセンサーと共に使用するための酵素は、天然起源のものまたは組換え生産されたものであり得る。さらに、それらは天然起源であるか、または突然変異体もしくは遺伝子操作されたアミノ酸配列を有することができる。グルコースの検出には、グルコースに特異的な電子移動反応を触媒するグルコースオキシダーゼを酵素として使用することができる。グルコースオキシダーゼは天然の供給源から単離することができ、例えばアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)の細胞、または細菌細胞、酵母もしくは真菌細胞、または哺乳動物細胞のような形質転換または形質移入宿主細胞中で組換え的に産生される。グルコースオキシダーゼを用いたグルコースの検出において、関与する反応は酸化反応である。
センサーは、作用電極を通過する電子を追跡し、その結果生じる電流を測定することによって試料液中のバイオマーカーのレベルを検出し、これは電流測定検出回路によって検出され、出力電圧の変化として表される。電子または反応生成物が電極に到達するための経路は、拡散、酵素からの直接電子移動、または機構の組み合わせを含むさまざまな機構によるものであり得る。
感知性能は、バイオ分子または多孔質フィルムあるいは膜を含むさまざまな材料で被覆電極を変性することによってさらに向上し得る。
本技術によるバイオセンサーは、センサーからの電気信号を処理する信号調整および/または分析装置をさらに含むセンサーシステムの一部であり得る。センサーシステムは、処理済みまたは未処理の体液を試料として使用し得る。試料流体の処理は、例えば、センサー表面を被覆する半透膜を通過させることによって達成することができる。あるいは、使用を容易にするために、センサーシステムは、センサー要素を体液、例えば口内の唾液と直接接触させることを可能にする。一実施態様において、センサーシステムは、例えば、マイクロフルイディクスベースのシステムとすることができる内蔵濾過機構を含む。特定の実施態様において、センサーシステムは、信号調整器およびマイクロコントローラを含むグルコース計として役立つ。該システムは、一連の電流測定を行い、例えば選択された範囲または条件を示す数値ディスプレイ、グラフィックディスプレイ、ダイヤルインジケータ、またはカラーベースのディスプレイを使用して、各測定からのグルコース濃度を出力信号または値として表示することができる。任意選択で、センサーシステムは、測定された唾液グルコースレベルに対応する推定等価血糖レベルを計算し表示することができる。
上記のシステムは単一チップ上で実施することができ、その上にサンプル液の一滴が適用される。チップまたはセンサーは、読み取りの間にサンプルを洗い流すかまたは単純に移動させて、一回使用(すなわち使い捨て)または繰り返し使用するように設計することができる。それは、家庭内および24時間体制の個人のために、グルコースなどの疾患関連バイオマーカーのリアルタイムの非侵襲性のモニタリングに使用することができる。継続的または定期的なモニタリングを通じて、傾向、規模、期間、およびバイオマーカーレベルの頻度などの追加の一時的な情報を取得することができ、それによって疾患のより良い、より正確な評価および個人の全体的な健康状態のためのデータの追跡を可能にする。例えば、グルコースモニタリングの場合、センサーシステムは、異常なまたは極端なグルコースレベルについて警報を作動させることができ、それによって厳密な血糖管理を維持しようとするときに看護作業負荷を減少させる。グルコースモニタリングに関しても、そのようなシステムは、人工膵臓またはインスリンポンプなどのインスリン送達システムにおける自動フィードバック制御インスリン送達を容易にすることができる。
本技術に従って作製されたバイオセンサーの一実施態様において、臭化テトラブチルアンモニウムをバイオリンカーとして使用し、グルタルアルデヒド架橋グルコースオキシダーゼをグルコース検出のための酵素として使用された。バイオセンサーは、5〜500μMの範囲内で非常に正確であり、4.82mA・s/Mの良好な感度、5μMの低い検出限界、および30秒の応答時間を有することが観察された。図4を参照されたい。バイオセンサーは1年以上の貯蔵寿命を示した。図3を参照されたい。このような耐久性のあるバイオセンサーは、POC応用だけでなく家庭での使用にも適している。
本明細書で使用されるとき、「から本質的になる(consisting essentially of)」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップの包含を可能にする。特に組成物の成分の説明または装置の要素の説明における「含む(comprising)」という用語の本明細書における任意の記載は、「から本質的になる(consisting essentially of)」または「からなる(consisting of)」と交換することができる。
Claims (25)
- 液体試料におけるバイオマーカーの濃度決定のためのセンサーであって、前記センサーは、
絶縁性または半導電性基板、
少なくとも1つの作用電極、対電極、および基準電極、ならびに
液体試料中のバイオマーカーの濃度決定中に液体試料を含有するための前記基板表面上の試料配置エリアを備え、
前記作用電極、対電極、および基準電極の各々は、試料配置エリアにおける前記基板の上に堆積させた導電性金属層を含み、
前記作用電極は試料配置エリア内で複数のセンサー素子で被覆されていて、
前記センサー素子は、第4級アンモニウム化合物、複数の金属ナノ粒子、前記バイオマーカーに特有の電子移動反応を触媒する架橋酵素を含む機能化コーティングで機能化されていて、
前記作用電極、対電極および基準電極は電流測定回路に接続され、
前記センサーは前記作用電極への電子移動を測定し、ならびに
前記電流測定回路の出力電圧は、試料配置エリアに堆積された液体試料中のバイオマーカーの濃度と相関している、
前記センサー。 - 前記センサー素子が、単層カーボンナノチューブ(SWNT)、二層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ、グラファイト、グラフェン、カーボンナノ繊維、カーボンナノワイヤ、カーボンナノロッド、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される材料を含む、請求項1に記載のセンサー。
- 前記機能化コーティングがポリカチオン性ポリマーを含有しない、請求項1に記載のセンサー。
- 前記第4級アンモニウム化合物が約C2〜約C16の鎖長を有するアルキル鎖を含む、請求項1に記載のセンサー。
- 前記4級アンモニウム化合物が塩化物または臭化物塩である、請求項1に記載のセンサー。
- 前記4級アンモニウム化合物が、臭化テトラエチルアンモニウム、臭化テトラプロピルアンモニウム、臭化テトラブチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンズアルコニウム、C12〜C16のアルキル鎖長を有する塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、ならびにC8〜C10のアルキル鎖長を有する塩化ジアルキルジメチルアンモニウムからなる群から選択される、請求項1に記載のセンサー。
- 前記酵素が、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性架橋剤を使用して架橋される、請求項1に記載のセンサー。
- 前記酵素が、グルタルアルデヒド、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、N−ヒドロキシコハク酸イミド、N−ヒドロキシスルホコハク酸イミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、アジプイミド酸ジメチル、スベルイミド酸ジメチル、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される試薬によって架橋される、請求項1に記載のセンサー。
- 機能化センサー素子を覆う保護膜をさらに含む、請求項1に記載のセンサー。
- 少なくとも約9ヶ月の貯蔵寿命を持つ請求項1に記載のセンサー。
- 前記酵素がグルコースオキシダーゼで、前記バイオマーカーがグルコースである、請求項1に記載のセンサー。
- 5μMまでの最低濃度におけるグルコースを検出できる請求項11に記載のセンサー。
- 唾液中のグルコース濃度の決定用に配置された請求項11に記載のセンサー。
- 液体試料中のバイオマーカーの濃度を決定する方法であって、前記方法は、
(a)請求項1に記載のセンサーを準備すること、
(b)前記センサーの前記試料配置エリアへ液体試料を導入すること、および
(c)前記センサーの電気出力から前記液体試料中の前記濃度を決定すること、
の工程を含む。 - (d)工程(b)において導入された液体試料を除去すること、
(e)前記センサーの前記試料配置エリアへ新たな液体試料を導入すること、および
(f)前記センサーの電気出力から前記新たな液体試料中の新たなバイオマーカーの濃度を決定すること、
の工程をさらに含む、請求項14に記載の方法。 - 前記液体試料が唾液である、請求項14に記載の方法。
- 請求項1に記載のセンサー、
前記センサーからの電気信号を処理する信号調整および/または分析デバイス、
を含むバイオマーカー分析システム。 - 共通基板を共有する請求項1に記載の複数のセンサーを含むバイオマーカーセンサーアレイ。
- バイオマーカーセンサーを製作する方法で、
(a)絶縁基板の表面上に1つ以上の作用電極、基準電極、および対電極を微細加工することで、前記電極のそれぞれは、基板上のサンプル配置エリアと接触し、
(b)前記作用電極上に複数のセンサー素子を堆積させること、
(c)1つまたは複数の機能化層を含む機能化コーティングをセンサー素子上に堆積させることで、各機能化層は、4級アンモニウム化合物、複数の金属ナノ粒子、バイオマーカーに特異的な電子移動反応を触媒する酵素を含み、ならびに
(d)機能化コーティングに架橋剤を適用して前記酵素を架橋すること、
を含む前記方法。 - 前記架橋剤が前記機能化コーティングの最上部に適用されるか、または前記架橋剤が1つ以上の機能化層のうちの1つ以上に含まれることによって適用される、請求項19に記載の方法。
- 前記4級アンモニウム化合物、前記金属ナノ粒子、および前記酵素を含む溶液または懸濁液の滴下堆積によってサブ層を堆積させることで前記1つまたは複数の機能化層を堆積させる、請求項19に記載の方法。
- 前記1つ以上の機能化層が、前記4級アンモニウム化合物、前記金属ナノ粒子、および前記酵素を含む単一懸濁液の滴下堆積によって堆積される、請求項19に記載の方法。
- 前記単一懸濁液が、さらにホモ二官能性またはヘテロ二官能性架橋剤を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記センサー素子が、センサー素子の懸濁液を前記作用電極上に堆積させることを含む自己組織化プロセスによって前記作用電極上に堆積される、請求項19に記載の方法。
- 真空貯蔵容器中にある請求項1に記載のセンサーを含むキット。
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